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JP2012082210A - Ａｄａｍｔｓ１３活性検定用抗体及び活性検定方法 - Google Patents

Ａｄａｍｔｓ１３活性検定用抗体及び活性検定方法 Download PDF

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JP2012082210A
JP2012082210A JP2011264811A JP2011264811A JP2012082210A JP 2012082210 A JP2012082210 A JP 2012082210A JP 2011264811 A JP2011264811 A JP 2011264811A JP 2011264811 A JP2011264811 A JP 2011264811A JP 2012082210 A JP2012082210 A JP 2012082210A
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Seiji Kato
誠司 加藤
Hisahide Hiura
久英 日裏
Yoshihiro Fujimura
吉博 藤村
Masanori Matsumoto
雅則 松本
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Alfresa Pharma Corp
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Abstract

【課題】フォンヴィルブランド因子（ＶＷＦ）切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）活性を測定するために有用な抗体、とりわけモノクローナル抗体とＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定法を提供する。
【解決手段】基質であるＶＷＦや基質となりうるＶＷＦの部分ペプチドにＡＤＡＭＴＳ１３を作用させたときに生じる、特定のアミノ酸配列を含む抗原決定部位に対して特異的反応性を有し、完全なＶＷＦ分子とは特異的反応性を有しないモノクローナル抗体。および、当該抗体を用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定法。
【選択図】なし

Description

本発明はフォンヴィルブランド因子（以下「ＶＷＦ」ともいう。）又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、ＶＷＦ切断酵素（以下「ＡＤＡＭＴＳ１３」ともいう。）を作用させたときに生じる抗原決定部位に対して特異的反応性（結合性）を有し、ＡＤＡＭＴＳ１３が作用していない前記ＶＷＦ又は前記ペプチドとは有意な特異的反応性を有しない抗体、とりわけモノクローナル抗体、およびその製造方法、ならびにそれらの用途に関するものである。
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願２００５‐０３６６１２号および特願２００５‐１５７５３０号からの優先権を請求する。
血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura; ＴＴＰ）は、血小板減少、溶血性貧血、動揺性精神神経障害などを特徴とする症候群である。かつては約８０％の患者が３ヶ月以内に死亡する予後不良の疾患であった。現在では血漿交換によって、予後が大幅に改善されるようになっている。
最近、ＴＴＰの病因としてＶＷＦ切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性低下が報告された。すなわち、後天性のＴＴＰは、ＶＷＦ切断酵素に対するＩｇＧ型インヒビターが産生されることによって酵素活性が低下することが原因であることが明らかにされた（非特許文献１及び２）。また先天的なＴＴＰであるUpshaw-Schulman症候群（ＵＳＳ）では、遺伝的にＶＷＦ切断酵素が欠損していることが判明した（非特許文献３）。このＶＷＦ切断酵素をコードする遺伝子は、ＡＤＡＭＴＳ１３であることが判明した（非特許文献４及び５）。
ＡＤＡＭＴＳ１３は亜鉛型メタロプロテアーゼで、ＶＷＦサブユニットのTyr842‐Met843結合を特異的に切断する。この酵素活性の測定は、ＶＷＦを基質として生じたＶＷＦフラグメントの検出を電気泳動法で行うＶＷＦマルチマー解析により行われている。この方法は、ＡＤＭＡＴＳ１３活性を正確に測定できるという利点はあるが、操作が煩雑であるため、とりわけ簡便な測定法の開発が望まれていた。
非特許文献６〜８によれば、ＡＤＡＭＴＳ１３の基質であるＶＷＦのＡ２ドメイン又はその一部を用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定法が報告されている。これらは天然の基質ではなく、遺伝子組換えにより大腸菌に発現させた基質である。上記測定法ではこれらの基質が、血漿試料中のＡＤＡＭＴＳ１３により分解されることを利用して、電気泳動ウエスタンブロットによる基質分子の分子量の検定、および基質と酵素の反応後の未分解残存基質の免疫学的測定によるＡＤＡＭＴＳ１３活性の検出、測定を行っている。しかし、これらの方法では、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性と得られるシグナル強度が逆相関し、いわゆる検量線が負の傾きをとるため、臨床的に重要な５％以下の低値領域での感度および再現性が得られず、課題となっていた。
これらの課題を改善する方法として、消光性蛍光基質を用いた血漿ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定法が報告されている（非特許文献９）。この方法は、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性の増加に伴って蛍光強度が増加する正の傾きをしめす検量線を有する。しかし、化学合成した特殊な高価な基質を用いて、蛍光計を用いてレートアッセイしなければならないため、一般の臨床検査の検査室で用いるには課題があった。
New Engl. J. Med. 339, 1578-1584, 1998 New Engl. J. Med. 339, 1585-1594, 1988 J. Hematol. 74, 101-108, 2001 J Biochem. 130, 475-480, 2001 J. Biol. Chem. 276, 41059-41063, 2001 Blood, 103, 607-612, 2004 J. Thromb. Haemost. 2, 485-491, 2004 Thromb Haemost. 91, 806-811, 2004 日本血栓止血学会誌, 15, 421, 2004
本発明の目的は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するために有用な抗体を提供することである。さらに具体的には、本発明の目的は、基質であるＶＷＦまたは基質となりうるＶＷＦの部分ペプチドがＡＤＡＭＴＳ１３により水解されて生成するペプチドに、親和性を有する抗体の提供、ならびに当該抗体の用途を提供することであり、当該抗体をモノクローナル抗体として提供することである。また、本発明の別の目的は、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供することである。
本発明者らは、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定法を鋭意研究した結果、ＶＷＦまたは基質となりうるＶＷＦの部分ペプチドにおいてＡＤＡＭＴＳ１３により特異的に切断される切断部位に対してＮ末端側のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチドを、抗原として用いることによって、ＡＤＡＭＴＳ１３により基質が切断されて生じる抗原決定部位を特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることに成功し、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を確立し、さらに当該モノクローナル抗体の用途を見出した。
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
１．フォンヴィルブランド因子（ＶＷＦ）又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、ＶＷＦ切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）を作用させたときに生じる抗原決定部位に対して反応性を有し、ＶＷＦ又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドとは有意な反応性を有しない抗体。
２．ＶＷＦ又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、ＡＤＡＭＴＳ１３を作用させたときに生じる抗原決定部位は、前記ＶＷＦ又は前記ペプチドがＡＤＡＭＴＳ１３により切断されたときに生じる抗原決定部位である、前項第１項に記載の抗体。
３．前記抗原決定部位が、ＶＷＦ又は前記ペプチドがＡＤＡＭＴＳ１３により切断された切断部位おいて新たに生じたＮ末端側のペプチド断片又はＣ末端側のペプチド断片に存在する、前項第１項または第２項に記載の抗体。
４．配列表の配列番号２に記載のペプチドに対して反応性を有する、前項第１項〜第３項のいずれか１項に記載の抗体。
５．配列表の配列番号２に記載のペプチドのＣ末端より少なくとも４個のアミノ酸残基を含む領域に対して反応性を有する、前項第１項〜第４項のいずれか１項に記載の抗体。
６．配列表の配列番号２に記載のペプチドに対して反応性を有し、配列表の配列番号３〜８に記載のいずれか１項のペプチドに対して有意な反応性を有しない前項第１項〜第５項のいずれか１項に記載の抗体。
７．配列表の配列番号２に記載のペプチドに対する反応性が、ヒト血漿より精製したＶＷＦに対する反応性よりも少なくとも５倍大きい、前項第１項〜第６項のいずれか１項に記載の抗体。
８．配列表の配列番号２に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号１に記載の配列を含むペプチドに対する反応性よりも少なくとも３倍大きい、前項第１項〜第７項のいずれか１項に記載の抗体。
９．配列表の配列番号２に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号８に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも５倍大きい、前項第１項〜第８項のいずれか１項に記載の抗体。
１０．配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチドを免疫原として得られる、前項第１項〜第９項のいずれか１項に記載の抗体。
１１．配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として得られる、前項第１項〜第１０項のいずれか１項に記載の抗体。
１２．配列表の配列番号１０に記載のペプチドに対して反応性を有する、前項第１項〜第３項のいずれか１項に記載の抗体。
１３．配列表の配列番号１０に記載のペプチドのＮ末端より少なくとも４個のアミノ酸残基を含む領域に対して反応性を有する、前項第１項〜第３項および第１２項のいずれか１項に記載の抗体。
１４．配列表の配列番号１０に記載のペプチドに対して反応性を有し、配列表の配列番号２〜９に記載のいずれか１のペプチドに対して有意な反応性を有しない、前項第１項〜第３項、第１２項、および第１３項のいずれか１項に記載の抗体。
１５．配列表の配列番号１０に記載のペプチドに対する反応性が、ヒト血漿より精製したＶＷＦに対する反応性よりも少なくとも５倍大きい、前項第１項〜第３項および第１２項〜第１４項のいずれか１項に記載の抗体。
１６．配列表の配列番号１０に記載のペプチドに対する反応性が、配列表の配列番号１に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも３倍大きい、前項第１項〜第３項および第１２項〜第１５項のいずれか１項に記載の抗体。
１７．配列表の配列番号１０に記載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号８及び１１に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも５倍大きい、前項第１項〜第３項および第１２項〜第１６項のいずれか１項に記載の抗体。
１８．配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列をＮ末端に有するペプチドを免疫原として得られる、前項第１項〜第３項および第１２項〜第１７項のいずれか１項に記載の抗体。
１９．配列表の配列番号１０に記載のペプチドを免疫原として得られる、前項第１項〜第３項および第１２項〜第１８項のいずれか１項に記載の抗体。
２０．モノクローナル抗体である前項第１項〜第１９項のいずれか１項に記載の抗体。
２１．寄託番号がＦＥＲＭ ＢＰ‐１０４８０又はＦＥＲＭ ＢＰ‐１０４７９であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、前項第１項〜第１１項のいずれか１項に記載の抗体。
２２．前項第２０項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
２３．寄託番号がＦＥＲＭ ＢＰ‐１０４８０又はＦＥＲＭ ＢＰ‐１０４７９である前項第２２項に記載のハイブリドーマ。
２４．ＡＤＡＭＴＳ１３により切断されうる基質ペプチドを、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を検定しようとする検体と反応させる工程、及び該工程の反応生成物に前項第１項〜第２１項のいずれか１項に記載の少なくとも１種の抗体を反応させる工程を含む、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定方法。
２５．配列表の配列番号１に記載の配列を含むペプチドとＡＤＡＭＴＳ１３活性を検定しようとする検体とを反応させる工程、及び該工程の反応生成物に前項第１項〜第２１項のいずれか１項に記載の少なくとも１種の抗体を反応させる工程を含む試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定方法。
２６．ＶＷＦとＡＤＡＭＴＳ１３活性を検定しようとする検体とを反応させる工程、及び該工程の反応生成物に前項第１項〜第２１項のいずれか１項に記載の少なくとも１種の抗体を反応させる工程を含む試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定方法。
２７．前記抗体が標識物質で標識されている、前項第２４項〜第２６項のいずれか１項に記載の試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定方法。
２８．前記抗体が固相担体に固定化されている、前項第２４項〜第２７項のいずれか１項に記載の試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定方法。
２９．前記抗体が水不溶性の粒子に担持されている、前項第２４項〜第２８項のいずれか１項に記載の試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定方法。
３０．前項第２４項〜第２９項のいずれか１項に記載の方法によって、微小血管障害性疾患を検査する方法。
３１．前項第１項〜第２１項のいずれか１項に記載の抗体を含む、試薬またはキット。
本発明の抗体は、ＶＷＦ又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドにＡＤＡＭＴＳ１３を作用させたときに生じる抗原決定部位を特異的に認識する抗体である。そして当該抗体は、ＡＤＡＭＴＳ１３が作用していない前記ＶＷＦ又は前記ペプチドとは有意な特異的反応性を有しないものである。当該抗体を用いることにより、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性の測定および検定が可能になる。即ち、本発明の抗体を用いることにより、（１）サンドイッチ免疫測定法によるＡＤＡＭＴＳ１３活性の迅速、簡便な測定、（２）粒子標識免疫測定法によるＡＤＡＭＴＳ１３活性の迅速、簡便な測定が可能となり、従って本発明は（３）これらの成果に基づく治療薬、診断薬等の開発等に大きな意義を持つ。また、本発明の抗体は、モノクローン化された融合細胞により安定して産生されることから、産業上の利用価値も高い。
本発明のモノクローナル抗体を２次抗体として用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性測定の検量線とＵＳＳ例の測定結果を示した図である。（実施例７および８） 本発明のモノクローナル抗体を固相に用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性測定の検量線を示した図である。（実施例９）
本発明において、抗体とは、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもを含む。モノクローナル抗体とは、公知の方法で調製されたモノクローン化された融合細胞より産生される抗体である。本発明の抗体には、全抗体分子または抗体活性を有する抗体分子の一部画分も含まれる。本発明の抗体を作製するために免疫原として用いる抗原は、本発明の課題を解決しうるものであれば特に限定されるものではないが、好適にはペプチドが用いられ、当該ペプチドにはキャリアー蛋白質に結合されているものも含まれる。なお、本明細書において「ペプチド」とは、２以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを示す。
ＡＤＡＭＴＳ１３は亜鉛型メタロプロテアーゼであって、ＶＷＦ分子の1065番目のチロシン（Tyr1605）と1606番目のメチオニン（Met1606）の間の結合に該当する結合を、特異的に切断する。ＶＷＦが切断されることにより、アミノ酸配列上に新たなＣ末端とＮ末端が生じる。その結果、新たな抗原決定部位が生じる可能性がある。その抗原決定部位を認識する抗体を作製すれば、切断されたＶＷＦに特異的に結合しうる抗体が得られることが予想される。本発明における抗体は、新たに生じるＮ末端側又はＣ末端側のペプチドのいずれかに生じた抗原決定部位に特異的反応性を有するものであれば、特に限定されるものではない。非特許文献６によれば、ＡＤＡＭＴＳ１３は、ＶＷＦ分子の1459番目のAspから1668番目のArgまでのペプチドを基質として、特異的にTyr1605‐Met1606の結合を切断することが報告されている。なかでも、1596番目のAspから1668番目のArgまでの７３個のアミノ酸からなるペプチド（以下「ＶＷＦ７３」ともいう。配列表の配列番号１で示されるペプチド）が、効率よくＡＤＡＭＴＳ１３による水解を受けることが、上記文献には示されている。配列表の配列番号１に示されるペプチドからなるＶＷＦ７３にＡＤＡＭＴＳ１３が働くと、10番目のTyrと11番目のMetの間が水解され、切断部位に対してＮ末端側の１０個のアミノ酸からなるペプチドが遊離する。このＮ末端側の１０個のアミノ酸からなるペプチドは、以下「Ｎ‐１０ペプチド」ともいい、配列表の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
上記Ｎ‐１０ペプチドを免疫原として用いることにより、フォンヴィルブランド因子（ＶＷＦ）又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに、ＶＷＦ切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）を作用させたときに生じる抗原決定部位に対して特異的反応性を有し、ＡＤＡＭＴＳ１３の作用を受けていないＶＷＦまたは前記ペプチドとは有意な特異的反応性を有しない、本発明の抗体を得ることができた。本明細書においては、ＡＤＡＭＴＳ１３の作用をうけておらず、切断されていないＶＷＦ又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを、まとめて「完全なＶＷＦ分子」ともいう。また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ１３の水解を受けうるものであればよく、７３個〜２０５０個のアミノ酸からなり、好ましくは７３個〜２１０個、より好ましくは配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（アミノ酸数７３個）である。
かくして得られた本発明の抗体は、ＶＷＦ又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドにＡＤＡＭＴＳ１３を作用させたときに生じる抗原決定部位を認識する抗体であり、かつ完全なＶＷＦ分子とは有意な反応性を有しないものである。
かかる抗原決定部位の一例として、配列番号１に記載のペプチドがＡＤＡＭＴＳにより水解された際に生じるＮ末端側のペプチド断片（配列番号２のペプチド）にできる抗原決定部位が挙げられる。Ｎ末端側の抗原決定部位は、Ｃ末端にチロシン（Tyr）が存在することを必須とする。また、配列番号２のＮ末端のアミノ酸が１つ少ないペプチドは抗原性を有するが、２つ少ないぺプチドは抗原性を有しないことから、上記Ｎ末端側の抗原決定部位は、少なくとも９個のアミノ酸からなる折れ曲がり構造のようなものと推測される。
また、「有意な反応性を有しない」とは、完全なＶＷＦ分子とは有意な結合性を有さないため、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等の公知の免疫化学的手法により分析したときに、バックグランドの信号（抗体を含まない場合の信号、若しくは分析対象物に無関係な抗体により得られる信号）と比して同等程度の信号しか得られないものをいう。
本発明の該抗体は、(a)該抗体をマイクロプレートウエルに固相化した配列表の配列番号２に記載のペプチド及びヒト血漿より精製したＶＷＦとそれぞれ反応させたとき、配列表の配列番号２に記載のペプチドに対する反応性がヒト血漿より精製したＶＷＦに対する反応性よりも少なくとも５倍大きいという性質、(b)該抗体をマイクロプレートウエルに固相化した配列表の配列番号２に記載のペプチド及び配列表の配列番号１に記載の配列を含むペプチドとそれぞれ反応させたとき、配列表の配列番号２に記載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号１に記載の配列を含むペプチドに対する反応性よりも少なくとも３倍大きいという性質、(c)該抗体をマイクロプレートウエルに固相化した配列表の配列番号２に記載のペプチド及び配列表の配列番号８に記載のペプチドとそれぞれ反応させたとき、配列表の配列番号２に記載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号８に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも５倍大きいという性質の少なくとも１以上の性質を有することが好ましい。あるいは、本発明の該抗体は、(d)該抗体を、マイクロプレートウエルに固相化した配列表の配列番号１０に記載のペプチド及びヒト血漿より精製したＶＷＦとそれぞれ反応させたとき、配列表の配列番号１０に記載のペプチドに対する反応性がヒト血漿より精製したＶＷＦに対する反応性よりも少なくとも５倍大きいという性質、(e)該抗体を、マイクロプレートウエルに固相化した配列表の配列番号１０に記載のペプチド及び配列表の配列番号１に記載のペプチドとそれぞれ反応させたとき、配列表の配列番号１０に記載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号１に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも３倍大きいという性質、(f)該抗体をマイクロプレートウエルに固相化した配列表の配列番号１０に記載のペプチド及び配列表の配列番号８及び１１に記載のペプチドとそれぞれ反応させたとき、配列表の配列番号１０に記載のペプチドに対する反応性が配列表の配列番号８及び１１に記載のペプチドに対する反応性よりも少なくとも５倍大きいという性質のいずれか１以上を有することが好ましい。これら(a)〜(f)の性質は、後述する実施例５〜８の方法を用いて確認することが可能である。
本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、当該モノクローナル抗体は、当分野で通常実施されている方法により調製される。即ち、抗原（例えば、Ｎ‐１０ペプチド）に特異的に親和性を有する抗体産生細胞を、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、各蛋白質に特異的な抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
抗原としては、例えばＮ‐１０ペプチド全体を用いることができるが、少なくともＣ末端にチロシン（Tyr）を含み、かつ抗原性を保持する限り、Ｎ−１０ペプチドに１〜数個のアミノ酸の欠失や置換、若しくは付加といった変更がなされていてもよい。抗原決定部位は少なくとも４個以上、好ましくは９個以上のアミノ酸からなるものと考えられる。あるいは、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として用いることもでき、少なくとも当該ペプチドのＮ末端の４個のアミノ酸を含み、かつ抗原性を保持している限り、抗原ペプチドのアミノ酸配列は、１〜数個のアミノ酸の欠失や置換、若しくは付加といった変更がなされていてもよい。
当該抗原は選択した部分的なアミノ酸配列に基づいて合成あるいは遺伝子工学的手法によって調製することができる。感作抗原として、得られたペプチド抗原を、直接リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の適当な緩衝液中に溶解、あるいは懸濁したものを用いることも可能であるが、より強い抗原性を得るために、アルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン等の適当なキャリヤータンパク質に架橋して用いることが好ましい。抗原溶液は、通常、抗原物質の量として約５０〜５００μｇ／ｍｌの濃度に調製すればよい。該抗原を免疫感作させる動物としては、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示される。好ましくはマウス、より好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスである。このとき、被免疫動物の抗原への応答性を高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投与することができる。本発明において用いられるアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Bordetella pertussisvaccine）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫時にＦＣＡ、追加免疫時にＦＩＡを使用する組み合わせが特に好ましい。
免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュバント混合の有無等により、注射部位、スケジュールなどを適宜変化させることができる。例えば、被免疫動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗原溶液０．０５〜１ｍｌ（抗原物質１０〜２００μｇ）を腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫から約４〜１４日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。該抗原溶液をアジュバントを使用せずに投与する場合には、抗原量を多くして腹腔内注射してもよい。抗体価は追加免疫の約５〜６日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の抗体アッセイに準じ、当分野で通常行われる方法で行うことができる。最終免疫より約３〜５日後に、該免疫動物から脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。
骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒト等由来のものが使用される。例えばマウスミエローマＰ３Ｘ６３‐Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３‐Ａｇ８‐Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１‐Ａｇ４、ＳＰ２／０‐Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３‐Ａｇ８・６５３等が例示されるが、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。骨髄腫細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギまたはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を１〜１０：１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウエルプレート中に播種して培養を続ける。
融合操作後の細胞を選択培地で培養して、ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株が死滅し、融合細胞のみが増殖し得る培地であり、通常ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジン（ＨＡＴ）培地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換することによって開始し、さらに２、３日毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することにより行う。顕微鏡観察によりコロニーが生育しているウエルを確認する。
生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを確認するには、培養上清を採取して抗体アッセイを行えばよい。例えば抗原にＮ‐１０ペプチドを用いた場合、固相化したＮ‐１０ペプチドに該上清を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵素、ＲＩ等で標識した二次抗体（抗グロブリン、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ血清等）を反応させることにより、抗体価を測定することができる。このようにして適切な抗体を産生しているウエルを得る。そして、同時に固相化した配列表の配列番号８に記載のペプチド（以下「Ｎ‐１５ぺプチド」ともいう）にも該上清を加えて反応させ、同様に測定する。Ｎ‐１０ペプチドのシグナルとＮ‐１５ペプチドのシグナルを比較し、前者のシグナルが後者のシグナルよりも少なくとも１０倍大きいものを選択する。さらに、限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いた方法等により単一クローンを分離する。例えば、限界希釈法の場合、ハイブリドーマコロニーを１細胞／ウエル前後となるように培地で段階希釈し、培養することにより、目的とするモノクローナル抗体を産生するクローンを単離することができる。得られた抗体産生ハイブリドーマは、約１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはグリセリン等の凍結保護剤の共存下に凍結させて、−７０〜−１９６℃で保存すると約半年〜半永久的に保存可能である。細胞は用時３７℃前後の恒温槽中で急速融解して使用する。凍結保護剤の細胞毒性が残存しないようによく洗浄してから使用するのが望ましい。
上記の方法で得られる本発明のモノクローナル抗体は、具体的には、例えばマウス由来かつＩｇＧクラス又はＩｇＭクラスのモノクローナル抗体であって、「ＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１１６」及び「ＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１４６」と命名されたものである。ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマを一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体のクラスを市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなどを用いて分析することにより調べることができる。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、モノクローナル抗体ＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１１６およびＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１４６を産生するハイブリドーマＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１１６株およびＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１４６株は、本発明者らによって新たに分離され、具体的には、ブタペスト条約に基づく国際寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００５年３月２９日付けで国内寄託され、寄託番号としてＦＥＲＭ Ｐ‐２０４８３およびＦＥＲＭ Ｐ‐２０４８２が付され、その後、国際寄託されて受託番号としてＦＥＲＭ ＢＰ‐１０４７９およびＦＥＲＭ ＢＰ‐１０４８０が付されている。
モノクローナル抗体の取得は、その必要量やハイブリドーマの性状等によってマウス腹水から取得するか、細胞培養によるかを、適宜選択できる。マウス腹腔内で増殖可能なハイブリドーマは腹水から数ｍｇ／ｍｌの高濃度で得ることができる。インビボで増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から取得すればよい。細胞培養によれば、抗体産生量はインビボより低いが、腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点がある。
マウス腹腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（２，６，１０，１４‐テトラメチルペンタデカン）等の免疫抑制作用を有する物質を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ、ハイブリドーマ（約１０６個以上）を移植し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスを使用することが好ましい。
一方、細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、高密度培養方法またはスピンナーフラスコ培養方法などの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し、抗体を含有する培養上清を得る。血清には、他の抗体やアルブミン等の夾雑物が含まれ、抗体精製に不便な点が多いので、培養液への添加は少なくすることが望ましい。
腹水、培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法等を応用することで、容易に達成される。さらに、本発明の抗モノクローナル抗体が、マウスＩｇＧ抗体である場合には、プロテインＡ結合担体あるいは抗マウスイムノグロブリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することが可能であり、簡便である。
本発明の新規抗体を用いて試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を迅速に測定することが可能である。該測定には、ＡＤＡＭＴＳ１３の天然の基質であるＶＷＦを用いることも可能である。また、配列表の配列番号１に表されたアミノ酸配列を含む７３個〜２０５０個のアミノ酸からなるペプチド、好ましくは７３個〜２１０個のアミノ酸からなるペプチド、さらに好ましくは配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド（ＶＷＦ７３）を基質として用いることができる。このような基質は遺伝子工学の手法を用いて、基質分子のＮ末端に例えばグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグをつけて発現、調製することが好ましい（以下「ＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質」ともいう。）。また、ＶＷＦ７３のＮ末端に酵素標識したもの、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でＮ末端を標識したＶＷＦ７３基質を用いることができる。ＨＲＰ標識されたＶＷＦ７３基質の調製は、ＶＷＦ７３ペプチドのＮ末端にアミノ酸を数個加え、そのうち１アミノ酸をシステイン（Cys）に変異させて、そのCysを介してＨＲＰ標識することにより行うことができる（J. Thromb. Haemost., 4, 129-136, 2006）。以下、これらの基質として用いるために調製したＶＷＦ７３を、まとめて「ＶＷＦ７３基質」ということもある。
当該基質をＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定しようとする試料と一定時間反応させ、酵素基質反応混合液中に生成する生成物（例えば、ＶＷＦ７３基質を用いた場合はＮ‐１０ペプチド）を含む画分を測定する。測定法は、本発明の抗体を用いる限り、限定されない。該方法には、通常当分野で行われる各種のイムノアッセイが利用され得る。該方法は、酵素基質反応混合液と本発明の抗体とを反応させ、形成される免疫複合体を測定する工程を含むものであれば特に限定されず、沈降反応もしくは凝集反応を光学的に検出する免疫比濁法、または分別検出の容易な物質で標識した抗体を用いる標識化免疫測定法などを用いることができる。
標識化免疫測定法には、免疫複合体の検出のための標識としてＲＩを用いるラジオイムノアッセイ、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼ等の酵素を用いるエンザイムイムノアッセイ、蛍光物質を用いる蛍光イムノアッセイなどが含まれる。標識する対象によって、検出すべき抗体を直接標識する直接法、検出すべき抗体の抗体つまり二次抗体を標識する間接法などを用いることができる。間接法を用いる場合、例えば、本発明の抗体がマウスＩｇＧモノクローナル抗体である場合、二次抗体としては例えば抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体等を使用すればよい。該二次抗体の調製法、並びに抗体の蛍光物質、ＲＩおよび酵素等による標識は、当分野で慣用の方法を用いて行うことができる。また、当該測定法にビオチン‐アビジン（又はストレプトアビジン）の反応を利用する方法も可能であり、高い感度が要求される測定の場合には好ましく採用される。当該方法としては、例えばビオチンで標識した本発明の抗体と蛍光物質等で標識したストレプトアビジンとを組み合わせて用いるものが挙げられる。本発明の抗体のビオチンでの標識、ストレプトアビジンの蛍光物質等での標識は、当分野で通常行われる方法を用いて行うことができ、例えば蛍光物質等で標識したストレプトアビジンは商業的にも入手可能である。
本発明において、ポリクローナル抗体は次のようにして調製することができる。モノクローナル抗体と同様の抗原を用いて、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラット、マウス等の動物に免疫し、抗血清を得る。一般に得られた抗血清中には、非特異反応を引き起こす抗体が含まれているため、ヒト血清、ヒトＶＷＦ、ＶＷＦ７３等の非特異反応の原因となりうる物質で吸収操作を行うことにより特異性をあげる。また、使用した免疫原によるアフィニティー精製によって、特異性の高い、本発明の目的に合致する抗体を得ることも可能である。得られた抗体は、モノクローナル抗体の場合と同様に、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定に用いることができる。
本発明の抗体を用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定方法の具体例を以下に説明する。ここでは、本発明の抗体として、Ｎ‐１０ペプチドを免疫原に用いて得られたモノクローナル抗体（以下「抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体」ともいう）、基質として前述のＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質を用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定法を開示するが、抗体は本発明の抗体であれば良く、基質はＡＤＡＭＴＳ１３に水解されうるペプチドであればよく、特に上記のものに限定されるものではない。
１、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗ＧＳＴ抗体を固相化しておき、固相上にＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質を予め固定化する。その固相と反応用緩衝液及び検体を反応後、抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を反応させ、固相上の抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
２、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗ＧＳＴ抗体を固相化しておき、固相上にＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質を予め固定化する。その固相と反応用緩衝液、検体及び抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を同時に反応させ、固相上の抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
３、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗ＧＳＴ抗体を固相化した抗ＧＳＴ固相に、ＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液及び検体を反応させた後、抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を反応させ、固相上の抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
４、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗ＧＳＴ抗体を固相化した抗ＧＳＴ固相に、ＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液、検体及び抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を同時に反応させ、固相上の抗モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
５、試験管等の容器中でＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液及び検体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定化した抗ＧＳＴ抗体と反応させ、次いで抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を反応させ、固相上に結合した抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体量を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
６、試験管等の容器中でＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液、検体及び抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定化した抗ＧＳＴ抗体と反応させ、固相上に結合した抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体量を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
７、試験管等の容器中でＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液及び検体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定化した抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体と反応させ、次いで抗ＧＳＴ抗体を反応させ、固相上に結合した抗ＧＳＴ抗体量を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗ＧＳＴ抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
８、試験管等の容器中でＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液、検体及び抗ＧＳＴ抗体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定化した抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体と反応させ、固相上に結合した抗ＧＳＴ抗体量を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗ＧＳＴ抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。
９、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を固相化した抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体固相に、ＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液及び検体を同時に反応させた後、次いで抗ＧＳＴ抗体を反応させ、固相上に結合した抗ＧＳＴ抗体量を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗ＧＳＴ抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。また、抗ＧＳＴ抗体とＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質を予め反応させておくことも本測定方法の例において可能である。
１０、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を固相化した抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体固相に、ＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液、検体及び抗ＧＳＴ抗体を同時に反応させた後、固相上に結合した抗ＧＳＴ抗体量を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗ＧＳＴ抗体を公知の標識物質で標識しておくことが好適である。また、抗ＧＳＴ抗体とＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質を予め反応させておくことも本測定方法の例において可能である。
１１、抗ＧＳＴ抗体を金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子等の肉眼的又は物理的検出可能な微粒子に固定化し、その上にＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質を反応させ、さらに反応用緩衝液と検体を加え、酵素反応を行う。その後、抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を固定化したろ紙、メンブラン等の多孔性担体に反応液を導き、多孔性担体上に捕獲される金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子等の粒子を検出することによって、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を固定化したろ紙、メンブラン等の多孔性担体に反応液を導く方法には、公知のラテラルフロー法又はフロースルー法が好適に選択される。
１２、公知のエバネッセント波光学検出に適した反応容器を固相担体として用い、上記４と同様に操作し、抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体をエバネッセント波検出に適した蛍光団で標識したものを用いると、エバネッセント波検出によるＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定が可能となる。さらにこの場合、経時的にエバネッセント波の強度を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性をレートアッセイすることも可能である。この方法を用いれば、洗浄操作やＢ／Ｆ分離操作を必要とせずに、ホジニアスアッセイが可能である。
１３、抗ＧＳＴ抗体を金コロイド粒子またはラテックス粒子等に固定化し、その上にＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質を反応させ、さらに反応用緩衝液と検体を加え酵素反応を行う。その後、抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を反応液に加え、粒子の凝集反応を惹起させ、その凝集を光学的または肉眼的に検出することによって、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。
１４、試験管等の容器中でＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液及び検体を反応させた後、その反応混合液に抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を固定化した金コロイド粒子またはラテックス粒子を加えて反応させ、その後抗ＧＳＴ抗体、好適には抗ＧＳＴモノクローナル抗体を反応液に加え、粒子の凝集反応を惹起させ、その凝集を光学的または肉眼的に検出することによって、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。
１５、ヒトまたは動物のＶＷＦを基質として検体を反応させた後、反応液をゲル電気泳動で分離し、本発明の抗体を反応させてＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。
１６、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗ＶＷＦ抗体を固相化しておき、固相上にＶＷＦを予め固定化する。その固相と反応用緩衝液及び検体を反応後、抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を反応させ、固相上の抗モノクローナル抗体の量を測定することにより、検体中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。
本発明の抗体を用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定方法のさらなる具体例として、以下の方法を挙げることができる。本発明の抗体として、抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を用い、基質としては前述したＨＲＰでＮ末端を標識したＶＷＦ７３基質を用いるが、これらに限定されるものではない。
１、試験管等の容器中でＨＲＰ標識ＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液、検体を反応させた後、その反応混合液を、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に予め固定化した抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体と反応させ、洗浄後、固相上のＨＲＰ活性を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。
２、マイクロタイタープレート、チューブ又は磁性粒子等の固相担体に抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を固相化した抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体固相に、ＨＲＰ標識したＶＷＦ７３基質、反応用緩衝液、及び検体を同時に反応させ、洗浄後、固相上のＨＲＰ活性を測定することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能である。
配列表の配列番号１０に記載のペプチドに対して特異的反応性を有する抗体を用いる場合には、上記の抗ＧＳＴ抗体に代えて抗Ｈｉｓタグ抗体を用いることにより、同様にして実施することができる。また、ＧＳＴ及びＨｉｓタグに代えて、異なるタグを用いた場合にはそれぞれのタグに特異的に結合しうる結合体を用いることで、前記方法が実施可能である。
本発明の測定方法により測定される検体は特に制限はなく、血液が一般的であるが、当該測定は、細胞、組織レベルで測定可能である他、当該細胞、組織からの抽出物等の試料を検体として用いても測定可能である。これらの測定方法は通常当分野で行われている方法を適用し得る。
さらに本発明の新規抗体を試薬またはキットに含めることができる。ここでいう試薬またはキットには、例えば試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定用試薬またはキット、臨床検査試薬またはキットが挙げられる。ここで用いる抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもを指し、本発明の目的を達成しうるものであれば限定されるものではない。
本発明の抗体は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性測定による臨床検査にも適用され、本発明は当該検査の方法にも及ぶ。適用される臨床検査は、血栓性血小板減少紫斑症（ＴＴＰ）、溶血性尿毒症候群（ＨＵＳ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、脳梗塞、慢性肝疾患、悪性腫瘍、ＨＩＶ、心筋梗塞、自己免疫疾患、妊娠合併症、急性腎不全等の微小血管障害性疾患の病状進展のリスクファクターの検査に適用されうる。
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するための試薬またはキット、および上述の検査用の試薬またはキットにも及ぶ。これらの試薬またはキットは、本発明の抗体を含み、所望により基質となりうるＶＷＦもしくはペプチドを含む。試薬またはキットには、前記のＡＤＡＭＴＳ１３の基質および基質の水解生成物であるＮ‐１０ペプチドを含む画分を、本発明の抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を用いて免疫学的測定するのに適したものを適宜選択して含めることができる。例えばＥＩＡ法であれば、抗体を固相化したマイクロプレートや磁性粒子等の固相試薬、標識抗体試薬、酵素基質試薬、標準液、洗浄液等を適宜組み合わせてキット化することが可能である。
本発明には、例えばＮ‐１０ペプチド（ＶＷＦまたはＶＷＦ７３が切断されて生じるＮ末端側の部位を有するペプチド）を用いた抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体、およびこれらを用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定法、および試薬もしくはキットのみならず、ＡＤＡＭＴＳ１３により基質ＶＷＦまたはＶＷＦ７３が切断されて新たに生じるＣ末端側の部位（切断後のＣ末端側のペプチドにおいてはＮ末端近傍の部位）に対する抗体も含まれる。より具体的には、配列表の配列番号１０で示されたペプチドに対する抗体、あるいは配列表の配列番号１２で示された配列をＮ末端側に含むペプチドに対する抗体で、完全長のＶＷＦやＶＷＦ７３とは実質的に有意な反応を示さない抗体、これらの抗体を用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定法、およびこれらの抗体を含む試薬もしくはキットも含まれる。
（実施例１）
ハイブリドーマおよび抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体の作製
ハイブリドーマの作製方法
（１）マウス：７〜８週令の近交系ＢＡＬＢ／ｃ系マウス雌を、動物飼育チェンバー内（２３±１℃、湿度７０％）で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
（２）免疫抗原：化学合成した配列表の配列番号２で示されたＮ‐１０ペプチドをＫＬＨに化学結合させたものをＮ‐１０ペプチド抗原として用いた。
（３）免疫方法：Ｎ‐１０ペプチド抗原を１００μｇ／０．５ｍｌとなる様にＰＢＳで調製し、同量（０．５ｍｌ）のフロイント完全アジュバント（Freund's complete adjuvant）（Ｄｉｆｃｏ社製）を混合して乳化した。この乳化状の抗原を７週令の４匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に１匹あたり２００μｌ投与した。さらに２週間毎に、ＧＥＲＢＵＶＡＮＴ（ＧＥＲＢＵ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ，ＧｍｂＨ，Ｄ‐６９０１ Ｇｕｉｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ製）で１００μｇ／ｍｌとなるように調製した上記抗原を、マウスあたり２０μｇずつ４回投与した。さらに１ヶ月後、ＧＥＲＢＵＶＡＮＴで１００μｇ／ｍｌとなるように調製した上記抗原を同様に追加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体価の高いマウスはさらに２週間後にＰＢＳで１００μｇ／ｍｌに調製したＮ‐１０ペプチド抗原を、マウス尾静脈より注射して最終免疫とした。尚、抗体価の測定は、当該抗原で免疫したマウスの血清を用いて、後述のスクリーニングの方法に準じて行った。
（４）細胞融合：最終免疫から３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスの摘脾を行い、ＤＭＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の浮遊液を作製した。ついで、細胞数を算定し、１．９×１０８個の脾細胞を得た。細胞融合は、２‐アミノ‐６‐メルカプトプリン（６‐チオグアニン［2-amino-6-mercaptopurine］）耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス由来骨髄腫培養細胞株（Ｐ３‐Ｘ６３‐Ａｇ８・６５３、以下Ｘ６３細胞ともいう）を親細胞株として用いた。Ｘ６３細胞は、牛胎児血清（fetal calf serum: ＦＣＳ）１０％を含むＤＭＥＭ培養液（５μｇ／ｍｌ、６‐チオグアニン含有）で継代培養し、細胞融合の３日前より６‐チオグアニンを含有しない１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培養液でさらに培養し、対数増殖期の細胞を用いた。Ｘ６３細胞の細胞数を算定し、１．９×１０８個の生細胞を得た。ＤＭＥＭ培養液で、ポリエチレングリコール‐１５００が５０（ｗ／ｖ）％濃度となるように溶解し、上記の脾細胞とＸ６３細胞の比が１：１となるように混合し、公知の方法（ケラーとミルスタイン共著，Nature, 第256 巻,495-497頁, 1975年, Eur. J.Immunol. 第6巻, 511-519頁, 1976年）に準じて細胞融合を行った。その後、１０％ＦＣＳおよび５％ブリクローン（Ａｒｃｈｐｏｒｔ社製）を添加したＤＭＥＭ培養液に、１×１０−４Ｍのヒポキサンチン、４×１０−７Ｍのアメソプテリン、および１．６×１０−５Ｍのチミジンを含有するＨＡＴ選択液を加え、脾細胞が２．０×１０６個／ｍｌとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液の１００μｌを、９６ウエルのマイクロタイタープレートの各ウエルに分注した後、ＣＯ２無菌培養器において温度３７℃、湿度１００％、５％のＣＯ２条件下で培養を行った。培養開始後、３日目にＨＡＴ培地１００μｌを各ウエルに加え、その後３日おきに半分量のＨＡＴ培地を交換しながら培養を行った。２〜３週間後に、目的の抗ＡＤＡＭＴＳ１３モノクローナル抗体を産生するクローンを、ＡＤＡＭＴＳ１３抗原を固相に吸着させたマイクロプレートを用いたエライザ法による、後述のスクリーニングによって検索した。
（５）スクリーニング：上記ハイブリドーマ細胞の培養上清を用いて、Ｎ‐１０ペプチド固相化エライザプレート及びＮ‐１５ペプチドとの反応により選択した。尚、精製ＶＷＦ及びＶＷＦ７３固相化エライザプレートに反応する非特異反応性クローンを除去し、Ｎ‐１０ペプチドに特異的に反応するクローンを選別した。Ｎ‐１０ペプチドを２μｇ／ｍｌの濃度に調製し、各々、１ウエル当たり１００μｌずつマイクロタイタープレートに添加し、一晩吸着させた後、Ｔｗｅｅｎ‐２０を０．０５％含むリン酸緩衝液（以下洗浄液と略す）で５回洗浄し、さらに１０％ブロックエース（商品名）を含むリン酸緩衝液でブロッキングしＮ‐１０ペプチド固相化プレートを調製した。上記で得られたハイブリドーマ細胞系の培養上清１００μｌを、当該固相化プレートに添加し、３７℃で６０分間反応させた後、洗浄液で５回洗浄し、さらにホースラディッシュペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略す）標識した抗マウスイムノグロブリン抗体（ヤギ由来）を３７℃で６０分反応させた。この反応の後、洗浄液で４回洗浄し、基質液（ｏ‐フェニレンジアミン０．４ｍｇ／ｍｌ及び０．０２％Ｈ２Ｏ２を含む）を３７℃で１５分間反応させた後、この反応を２Ｎ硫酸で停止させ、主波長４９２ｎｍでエライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。Ｎ‐１０ペプチドを固相化したエライザプレートに特異的に反応するハイブリドーマ細胞系を選別した後、限界希釈法によりクローニングし、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ‐１０４８０およびＦＥＲＭ ＢＰ‐１０４７９のハイブリドーマより、それぞれ抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体、ＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１４６およびＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１１６（以下、それぞれ「Ｎ１０‐１４６」および「Ｎ１０‐１１６」と略すこともある）を得た。
（実施例２）
特異性の確認：Ｎ‐１０ペプチド及びＮ‐１５ペプチドを２μｇ／ｍｌの濃度に調製し、各々、１ウエル当たり１００μｌずつマイクロタイタープレートに添加し、一晩吸着させた後、Ｔｗｅｅｎ‐２０を０．０５％含むリン酸緩衝液（以下「洗浄液」と略す）で５回洗浄し、さらに１０％ブロックエース（商品名）を含むリン酸緩衝液でブロッキングしＮ‐１０ペプチド固相化プレート及びＮ‐１５ペプチド固相化プレートを調製した。各クローンの培養上清１００μｌを各固相プレートに添加し、３７℃で６０分間反応させた後、洗浄液で５回洗浄し、さらにホースラディッシュペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と略す）で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体（ヤギ由来）を３７℃で６０分反応させた。この反応の後、洗浄液で４回洗浄し、基質液（ｏ‐フェニレンジアミン０．４ｍｇ／ｍｌ及び０．０２％Ｈ２Ｏ２を含む）を３７℃で１５分間反応させた後、この反応を２Ｎ硫酸で停止させ、主波長４９２ｎｍでエライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。
その結果を表１に示した。
Ｎ‐１５ペプチド固相で得られた吸光度はいずれも０．００であり、一方Ｎ‐１０ペプチド固相で得られた吸光度は０．５以上を示した（表１）。
従って、本発明のモノクローナル抗体は、Ｎ‐１０ペプチドのＣ末端近傍を特異的に認識する抗体であることが判った。
（実施例３）
マウスイムノグロブリンサブクラスの同定：上記クローニングにより単一クローンとして得られたハイブリドーマ細胞系の産生するモノクローナル抗体について、マウスイムノグロブリンサブクラスを決定した。マウスイムノグロブリンサブクラスの同定には、各ハイブリドーマ細胞系の培養上清を用い、セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）社製Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔを用いた。その結果、クローンＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１１６及びＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１４６は共にＩｇＧ２であることが判った。
（実施例４）
マウスモノクローナル抗体の機能の確認：公知の方法により大腸菌で発現させたＶＷＦ７３ペプチドのＮ末端側にＧＳＴをタグとして融合させ、さらにＣ末端側にヒスチジン６残基（Ｈｉｓタグ）を有するＡＤＡＭＴＳ１３活性測定用基質（ＧＳＴ‐ＶＷＦ７３基質）、１μｇ／ｍｌ、１００μｌを抗ＧＳＴ抗体（ヤギ由来、ポリクローナル抗体）を固定化したマイクロタイタープレートに予め反応させ、固相化した基質に対して正常ヒト血漿３０μｌを加えて３７℃で１時間反応させた。反応液は、ＡＤＡＭＴＳ１３が金属酵素であり、活性発現には２価金属を必要とすることから、２０ｍＭ塩化バリウムを含む５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ＝８）１００μｌを用いた。盲検用反応液は２０ｍＭ塩化バリウムに代えて、２０ｍＭＥＤＴＡを含む５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ＝８）を用いた。反応終了後、酵素基質反応混合液を除去、洗浄し、抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体（クローン、ＶＷＦ‐ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｂ Ｎ１０‐１４６、以下「Ｎ１０‐１４６」と略す）を３７℃で１時間反応させた。洗浄して抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を除去した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識した抗マウスイムノグロブリン抗体（ヤギ）を３７℃で１時間反応させ、洗浄後、オルトフェニレンジアミン‐過酸化水素を反応させ、反応終了後、１Ｍ硫酸で反応を停止した。波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
その結果を表２に示した。
対照として用いたクローンＮ１５ＡｂではＡＤＡＭＴＳ１３による酵素反応が進行している塩化バリウム含有反応液での吸光度と、反応が進行していないＥＤＴＡ含有反応液での吸光度がほぼ等しく、ＡＤＡＭＴＳ１３による酵素反応により生成するＮ‐１０ペプチドをＶＷＦ７３基質と分別して測定できないことがわかった。一方、本発明の抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体（Ｎ１０‐１４６）では、ＡＤＡＭＴＳ１３による酵素反応が進行している塩化バリウム含有反応液での吸光度は、酵素反応が起きていないＥＤＴＡ含有反応液での吸光度のいずれも約１４倍から６３倍を示し、さらにＥＤＴＡ含有反応液での吸光度はいずれのクローンでも０．２以下であった（表２）。これらのことから、本発明の抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体はＶＷＦ７３基質との反応性が極微小であり、基質がＡＤＡＭＴＳ１３により酵素的に水解されて生じるＮ‐１０ペプチドと、非常に高い特異性を有して反応することが判った。従って、本発明の抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を用いることにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能であることが明らかになった。
（実施例５）
配列表の配列番号２〜８に示した７種類の各ペプチド（各々、Ｎ‐１０ペプチド、Ｎ‐６ペプチド、Ｎ‐８ペプチド、Ｎ‐１１ペプチド、Ｎ‐９ペプチド、Ｎ‐１３ペプチド、Ｎ‐１５ペプチド）を１μｇ／ｍｌの濃度でマイクロタイタープレートのウエルに１００μｌずつ分注し、２〜８℃で一夜放置後、洗浄、ブロッキングして各ペプチド固相を調製した。各ペプチド固相に西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体（Ｎ１０‐１４６）を反応させ、抗Ｎ１０‐モノクローナル抗体と各ペプチドの反応性を調べた。
その結果を表３に示した。
Ｎ‐１０モノクローナル抗体はＮ‐１０ペプチドとのみ反応性を示し、他のいずれのペプチドとも有意な反応性を示さなかった。従って、本発明のＮ‐１０モノクローナル抗体はＮ‐１０ペプチドに特異的で、しかも、Ｎ‐１０ペプチドのＣ末端のチロシンを含む領域に特異的であることが判った。
（実施例６）
上記の結果をさらに確認するために、各ペプチドを１５．６、３１．３、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度でＨＲＰ標識抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体（Ｎ１０‐１４６）と予め反応させた後、Ｎ‐１０ペプチド固相と反応させた。
その結果を表４に示した。
Ｎ‐１０ペプチドを除いて、いずれのペプチドも抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体のＮ‐１０ペプチド固相への反応を阻害することは無かった。従って、本発明の抗Ｎ１０‐モノクローナル抗体はＮ‐１０ペプチドに特異的で、しかも、Ｎ‐１０ペプチドのＣ末端のチロシンを含む領域に特異的であることがより確かめられた。
（実施例７）
正常ヒト血漿を、５６℃で３０分間熱処理したヒト血漿（加熱血漿）で×１、×２、×４、×８、×１６、×３２、×６４倍希釈した試料及び加熱血漿を検体とした他は実施例４と同様に操作し、正常ヒト血漿の×１を、１００％のＡＤＡＭＴＳ１３活性としてＡＤＡＭＴＳ１３活性測定の検量線を作成した。
その結果を、図１に示す。Ｘ軸はＡＤＡＭＴＳ１３活性（％）を示し、Ｙ軸は４９２ｎｍの吸光度を示す。Ｎｏ．１１６は、抗Ｎ−１０モノクローナル抗体のＮ１０‐１１６を用いて測定を行った結果を示す。吸光度は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性に比例して上昇することが確認され、本発明の方法によりＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定することが可能であることが判った。
（実施例８）
実施例４と同様に操作してＡＤＡＭＴＳ１３活性の検量線を作成すると同時に、先天性ＡＤＡＭＴＳ１３欠損症（ＵＳＳ例）の血漿中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定した。
その結果、ＵＳＳ例のＡＤＡＭＴＳ１３活性は１％以下と算出された（図１の矢印）。この結果はＶＷＦマルチマー解析の結果とよく一致していた。従って、本発明の方法により、ＡＤＭＴＳ１３活性を特異的に測定できることが判り、臨床検査に有用であることが明らかになった。
（実施例９）
本発明の抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体（Ｎ１０‐１４６）を１μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌずつマイクロタイタープレートの各ウエルに分注し一夜放置して、抗Ｎ‐１０抗体固相を調製した。試験管にＶＷＦ７３基質（１μｇ／ｍｌ）の１００μｌと、１０μｌ被検血漿（実施例７と同様に正常ヒト血漿を加熱血漿で希釈して調製）とをとり、３７℃で１時間反応させた後、５０ｍＭ ＥＤＴＡを２０μｌずつ加え反応を停止させた。反応物１００μｌを抗Ｎ‐１０抗体固相と室温で１時間反応させ、洗浄後ＨＲＰ標識抗ＧＳＴ抗体（ヤギ由来）を１時間反応させた。酵素反応により生じた吸光度を測定した。正常ヒト血漿の×１を、１００％の被検血漿濃度（ＡＤＡＭＴＳ１３活性）とした。
得られた吸光度と被検血漿濃度（ＡＤＡＭＴＳ１３活性）との関係を図２に示した。Ｘ軸は被検血漿濃度（ＡＤＡＭＴＳ１３活性）（％）を示し、Ｙ軸は４９２ｎｍの吸光度を示す。この結果、本発明の抗体を固相に用いることによって、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を特異的に測定できることがわかった。
本発明の抗Ｎ‐１０モノクローナル抗体を用いることにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定、検査が可能になり、それらの成果に基づく治療薬、診断薬等の開発に利用できる。

Claims (9)

  1. 配列番号２に記載のアミノ酸配列においてＮ末端のアミノ酸が１つ少ないアミノ酸配列を抗原決定部位として認識する抗体であって、ヒト血漿より精製したＶＷＦには反応性を有さない、抗体。
  2. 前記抗体が配列番号３〜８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドには反応性を有さない、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体と、配列番号３〜８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのいずれかと反応させた後、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと反応させた場合に、前記抗体の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する反応性が阻害されない、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 前記抗体と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよびヒト血漿より精製したＶＷＦとをそれぞれ反応させたときに、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する反応性が、ヒト血漿より精製したＶＷＦに対する反応性よりも少なくとも５倍大きい、請求項１〜３のいずれか１に記載の抗体。
  5. 前記抗体と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとをそれぞれ反応させたときに、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する反応性が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する反応性よりも少なくとも３倍大きい、請求項１〜４のいずれか１に記載の抗体。
  6. 前記抗体と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとをそれぞれ反応させたときに、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する反応性が、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対する反応性よりも少なくとも５倍大きい、請求項１〜５のいずれか１に記載の抗体。
  7. 配列番号２に記載のアミノ酸配列においてＮ末端のアミノ酸が２つ少ないアミノ酸配列からなるペプチドには反応性を有さない、請求項１〜６のいずれか１に記載の抗体。
  8. ＶＷＦまたは配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を検定しようとする試料と反応させる工程、および該工程の反応生成物に請求項１〜７のいずれか１に記載の少なくとも１種の抗体を反応させる工程を含む、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定方法。
  9. 請求項１〜７のいずれか１に記載の抗体を含む、ＡＤＡＭＴＳ１３活性測定用の試薬またはキット。
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