JP2012041271A

JP2012041271A - 血栓形成を抑制する作用を有する組成物

Info

Publication number: JP2012041271A
Application number: JP2010180781A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Eto; 浩之江藤; Satoshi Nishimura; 智西村; Hiromitsu Nakauchi; 啓光中内; Yoichiro Iwakura; 洋一郎岩倉
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2010-08-12
Filing date: 2010-08-12
Publication date: 2012-03-01

Abstract

【課題】血栓形成を抑制する作用を有する組成物を提供すること。
【解決手段】炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物を含有することを特徴とする血栓形成を抑制する作用を有する組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、血栓形成を抑制する作用を有する組成物に関し、より詳しくは炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物を含有することを特徴とする血栓形成を抑制する作用を有する組成物に関する。

生体内において血栓形成の原因となる多細胞プロセスは、個々の血小板及びそれらの形態の変化を同定できるほどに十分な高い解像度をもって直接可視化できる技術が無かったため、未だ十分に理解されていない。部検又は吸引によって得られた急性冠症候群患者（非特許文献１）の血栓の組織学的解析によって、血栓の発達においては、血小板、白血球、フォンヴィレブランド因子（ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ）及び組織因子が存在していることが明らかになっている（非特許文献２〜３）。しかしながら、血栓塊の正確な性状を得る為の多細胞構造は損なわれており、そして生体内の血栓形成中の血小板の動態についてはほとんど解明されていない。

また、血栓形成に関しては、二段階説、すなわち、円盤状血小板が高せん断条件下で成長中の血栓に組み込まれている間に、活性化血小板は低せん断条件下で形態を変化させることによって血栓形成を調節するという説が提唱されているが（非特許文献４）、生体内において、円盤状血小板がどのように形成中の血栓に取り込まれるのかは不明である。

また、血小板は、炎症、血栓形成、ホメオスタシス及びアテローム発生の間の重要なつながりを示す因子として考えられており（非特許文献５〜６）、炎症は、白血球、内皮細胞、及び血小板の間の相互作用によって特徴づけられている（非特許文献７）。例えば、活性化血小板において炎症性サイトカインの１種であるＩＬ−１βが発現しており（非特許文献８）、ＩＬ−１αもＩＬ−１β同様に血小板において発現していることが報告されている（非特許文献９）。また、ＩＬ−１β ｐｒｅ−ｍＲＮＡは巨核球の細胞質に存在し、断片化によって放出した血小板自身もＩＬ−１β ｐｒｅ−ｍＲＮＡを保持しており（非特許文献１０）、炎症反応状態に血小板自体の産生するＩＬ−１βが関与することが推測されている。さらには、ＩＬ−１βの合成を介して炎症シグナルを調節していることも既に示されている（非特許文献１１）。また、炎症性サイトカインの１種であるＩＬ−６は、血小板産生のサイトカインとしても知られており（非特許文献１２）、さらには、血小板血栓が形成された以降に活性化する凝固系において、ＩＬ−６はトロンビンの産生を亢進させることが知られており、かかる産生亢進を介して、血小板の活性化を二次的に促進する事などが示されてきている（非特許文献１３）。

しかしながら、炎症性サイトカインによるシグナル伝達と血小板が関与する血栓形成との関連の詳細、特に瞬間的な発生を特徴とする円盤状血小板による血小板血栓の形成及び血管内皮細胞への接着に関しては未だ明らかになっていない。

Ｎｉｓｈｉｈｉｒａ，Ｋ．，ｅｔａｌ、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｔｈｒｏｍｂｉｉｎｌａｔｅｄｒｕｇ−ｅｌｕｔｉｎｇｓｔｅｎｔｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓｖｅｒｓｕｓｄｅｎｏｖｏａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．」、ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ（電子版）、２００９年１１月２４日Ｈｏｓｈｉｂａ，Ｙ．，ｅｔａｌ、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２００６年、４巻、１１４−１２０ページＹａｍａｓｈｉｔａ，Ａ．，ｅｔａｌ、ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ、２００６年、９７巻、２６−２８ページＪａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．、Ｂｌｏｏｄ、２００７年、１０９巻、５０８７−５０９５ページＲｕｇｇｅｒｉ，Ｚ．Ｍ．、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、２００２年、８巻、１２２７−１２３４ページＧａｗａｚ，Ｍ．，ｅｔａｌ、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００５年、１１５巻、３３７８−３３８４ページＷａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｄ．，ｅｔａｌ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄＶａｓｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、２００３年、２３巻、２１３１−２１３７ページＨａｗｒｙｌｏｗｉｃｚ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔａｌ、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８９年、１４３巻、４０１５−４０１８ページＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｐ．，ｅｔａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年、１１５巻、１７号、３６３２−３６３９ページＤｅｎｉｓＭＭ．，ｅｔａｌ、Ｃｅｌｌ、２００５年８月１２日、１２２巻、３号、３７９−３９１ページＬｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｓ．，ｅｔａｌ．、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、２００１年、１５４巻、４８５−４９０ページＡｓａｎｏ，Ｓ．，ｅｔａｌ、Ｂｌｏｏｄ、１９９０年、７５巻、１６０２−１６０５ページＫｅｒｒ，Ｒ．，ｅｔａｌ、ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２００１年１０月、１１５巻、１号、３−１２ページ

本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体内における血栓形成の機序を分子レベルで解明し、見出された血栓形成に関与する分子を標的として、臨床的には瞬間的に発症して血管閉塞まで引き起こすような血栓形成を抑制することを可能とする組成物を提供することにある。

本発明者らは、血栓形成の開始から血管閉塞に至る血小板の動態を一細胞レベルで明らかにするため、生体内の血栓形成を評価することができ、ハイスループットな解析が可能な直接可視化手法を独自に開発した。次いで、この手法を用い、生体内における血栓形成の機序を分子レベルで解明すべく鋭意研究を重ねた。その結果、本発明者らは、血栓の誘発及び成長、特に、血小板の取り込み（初期の血管内皮細胞への付着）において、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１），インターロイキン−６（ＩＬ−６）等による炎症性サイトカインシグナルが瞬間的な円盤状血小板血栓の形成に必要不可欠であることを見出した。これら知見に基づき、本発明者らは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物が、血栓形成を抑制するための組成物として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物を含有することを特徴とする血栓形成を抑制する作用を有する組成物。
（２）前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、及びＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも一つの生体分子であることを特徴とする（１）に記載の血栓形成を抑制する作用を有する組成物。

これまでの血栓症に対する医薬は、形成された血栓の安定化を阻害するという視点で開発がなされてきたが、本発明の組成物によれば、血栓が形成される段階を抑制する作用、特に円盤状血小板による血小板血栓の形成及び血管内皮細胞への接着を抑制する作用を有する。従って、本発明の組成物は、特に、血栓症を含む血栓形成に起因する疾患に対する予防剤として優れた効果を発揮することが可能である。また、血栓形成を予防するために日常的に摂取する飲食品として、あるいは、研究目的で血栓形成を抑制するための試薬としても、優れた効果を発揮することが可能である。

通常状態における血管及び血球を示す顕微鏡写真である。レーザー傷害後の血栓形成の過程を示す顕微鏡写真である。右列は左列中の四角で囲まれた部分を拡大した写真である。レーザー傷害後の血栓形成過程、並びに抗ＧＰＩｂ−β抗体により染色された血小板の動態を示す顕微鏡写真である。右列は左列中の四角で囲まれた部分を拡大した写真である。抗ＧＰＩｂ−β抗体が血小板の血管壁への付着に影響を与えないことを示すグラフ図である。抗ＧＰＩｂ−β抗体が血栓形成に影響を与えないことを示すグラフ図である。レーザー傷害から血管閉塞に至るまでの過程、並びにアクリヂンオレンジにより染色された白血球及び血小板の動態を示す顕微鏡写真である。レーザー傷害後のイソレクチンにより染色された血管内皮細胞を示す顕微鏡写真である。レーザー傷害後の血管内におけるＲＯＳの産生を示す顕微鏡写真である。下段はＡＰＦにより検出されたＲＯＳを示し、中段は蛍光デキストランによって染色された赤血球を示し、上段は中段と下段とを重ね合わせたものである。ＴＮＦ−α欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔において、レーザー傷害から１０秒の間に血管壁に付着した血小板数を示すグラフ図である。レーザー傷害後にＴＮＦ−α欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔に生じた血栓内における血小板数の経時変化を示すグラフ図である。レーザー傷害後のＴＮＦ−α欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔の血管内におけるＲＯＳの産生を示す顕微鏡写真である。上から２段目は野生型同腹仔におけるＲＯＳの産生を示し、上から１段目は野生型同腹仔における蛍光デキストランによって染色された赤血球とＲＯＳの産生（上から２段目）とを重ね合わせたものである。また、下から１段目はＴＮＦ−α欠損マウスにおけるＲＯＳの産生を示し、下から２段目はＴＮＦ−α欠損マウスにおける蛍光デキストランによって染色された赤血球とＲＯＳの産生（下から１段目）とを重ね合わせたものである。ＴＮＦ−Ｒ１欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔において、レーザー傷害から１０秒の間に血管壁に付着した血小板数を示すグラフ図である。レーザー傷害後にＴＮＦ−Ｒ１欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔に生じた血栓内における血小板数の経時変化を示すグラフ図である。レーザー傷害後のＴＮＦ−Ｒ１欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔の血栓形成の過程を示す顕微鏡写真である。ＩＬ−１欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔において、レーザー傷害から１０秒の間に血管壁に付着した血小板数を示すグラフ図である。レーザー傷害後にＩＬ−１欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔に生じた血栓内における血小板数の経時変化を示すグラフ図である。レーザー傷害後のＩＬ−１欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔の血栓形成の過程を示す顕微鏡写真である。レーザー傷害後のＩＬ−１ＲＡ欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔の血栓形成の過程を示す顕微鏡写真である。ＩＬ−１ＲＡ欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔において、レーザー傷害から１０秒の間に血管壁に付着した血小板数を示すグラフ図である。レーザー傷害後にＩＬ−１ＲＡ欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔に生じた血栓内における血小板数の経時変化を示すグラフ図である。レーザー傷害後のＩＬ−6欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔の血栓形成の過程を示す顕微鏡写真である。ＩＬ−6欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔において、レーザー傷害から１０秒の間に血管壁に付着した血小板数を示すグラフ図である。レーザー傷害後にＩＬ−６欠損マウス及びそれらの野生型同腹仔に生じた血栓内における血小板数の経時変化を示すグラフ図である。

本発明は、炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物を含有することを特徴とする血栓形成を抑制する作用を有する組成物を提供する。

本発明において、「炎症性サイトカイン」とは、生体内における様々な炎症症状を引き起こす因子として関与するサイトカインを意味する。本発明において機能を抑制する対象となる炎症性サイトカインとしては、その機能の抑制により、血栓形成を抑制しうるものであれば特に制限はなく、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、及びＩＬ−６が挙げられる。

ＴＮＦ−αは、ＮＦ−ｋＢシグナルの制御に働き、炎症シグナルを惹起する因子として知られている（「ＳａｖｅｓＴａｙ，ｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０年７月８日、４６６巻、２６７−２７２ページ」等参照）。典型的には、ヒトＴＮＦ−αは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０００５８５．２（Ｎｏ．ＮＭ＿０００５９４．２）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、マウスＴＮＦ−αは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０３８７２１．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０１３６９３．２）で特定される蛋白質（遺伝子）である。

ＩＬ−１は、血小板と炎症とアテローム発生等との関連性を示唆する因子としても知られている（「ＢｏｉｌａｒｄＥ．，ｅｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０年１月２９日、３２７巻、５９６５号、５８０−５８３ページ」、「ＫｕｌｋａｒｎｉＳＥ．，ｅｔａｌ、Ｂｌｏｏｄ、２００７年９月１５日、１１０巻、６号、１８７９−１８８６ページ」、「ＰｉｌｌｉｔｔｅｒｉＤ．，ｅｔａｌ、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、２００７年３月、１８巻、２号、１１９−１２７ページ」、非特許文献８〜１１等参照）。本発明におけるＩＬ−１には、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βが含まれる。また、典型的には、ヒトＩＬ−１αは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０００５６６．３（Ｎｏ．ＮＭ＿０００５７５．３）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、マウスＩＬ−１αは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０３４６８４．２（Ｎｏ．ＮＭ＿０１０５５４．４）で特定される蛋白質（遺伝子）である。さらに、典型的には、ヒトＩＬ−１βは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０００５６７．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０００５７６．２）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、マウスＩＬ−１βは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０３２３８７．１（Ｎｏ．ＮＭ＿００８３６１．３）で特定される蛋白質（遺伝子）である。

また、ＩＬ−６も、炎症性サイトカインとして広く知られており，慢性関節リューマチの増悪、動脈硬化病変を合併する心血管系疾患（特に冠動脈疾患の発症）において、重要な役割を担っている事などが示唆されている（「ＹｕｄｋｉｎＪＳ．，ｅｔａｌ、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、２０００年２月、１４８巻、２０９−２１４」、「Ｓｈｅｎｈａｒ−ＴｓａｒｆａｔｙＳ．，ｅｔａｌ、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｊｏｕｒｎａｌｏｆＳｔｒｏｋｅ、２０１０年２月、５巻、１号、１６−２０ページ」等参照）。典型的には、ヒトＩＬ−６は、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０００５９１．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０００６００．２）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、マウスＩＬ−６は、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿１１２４４５．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０３１１６８．１）で特定される蛋白質（遺伝子）である。

しかしながら、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明において機能を抑制する対象となる「炎症性サイトカイン」には、このような天然の変異体も含まれる。

なお、これらの炎症性サイトカインに関しては、冠動脈のプラーク破裂やびらん（ｅｒｏｓｉｏｎ）などによる冠動脈閉塞の最初の機構において，動脈硬化病変を基盤とする血管平滑筋やマクロファージ産生のサイトカイン（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅ）として、ＩＬ−６、ＩＬ−１、及びＴＮＦ−αが連動して作用することが示唆され、また、冠動脈疾患患者に対してのカテーテルを介したステント挿入治療後にＩＬ−１βとともにＩＬ−６の血中濃度が上昇することでステント血栓症（金属であるステントを挿入した後の冠動脈の再閉塞）がおきうること（ＳａｒｄｅｌｌａＧ．，ｅｔａｌ、ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、１１７巻、６号、６５９−６６４ページ）も知られている。

本発明における「炎症性サイトカインの機能の抑制」には、機能の完全な抑制（阻害）および部分的な抑制の双方が含まれる。また、炎症性サイトカインの活性の抑制および発現の抑制の双方が含まれる。炎症性サイトカインの活性の抑制は、炎症性サイトカインを標的とする分子、炎症性サイトカインの受容体を標的とする分子、および炎症性サイトカインのシグナル伝達に関与するその他の蛋白質を標的とする分子、のいずれによって達成されてもよい。また、炎症性サイトカインの発現の抑制は、転写における抑制および翻訳における抑制のいずれによって達成されてもよい。

炎症性サイトカインの機能を抑制するために標的とするＴＮＦ−αの受容体としては、例えば、１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、ＴＮＦＲ１）が挙げられる。典型的には、ヒトＴＮＦＲ１として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿００１０５６．１（Ｎｏ．ＮＭ＿００１０６５．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、マウスＴＮＦＲ１としては、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０３５７３９．２（Ｎｏ．ＮＭ＿０１１６０９．３）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。

また、ＩＬ−１の受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩＬ−１Ｒ）としては、典型的には、ヒトＩＬ−１Ｒとして、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０００８６８．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０００８７７．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、マウスＩＬ−１Ｒとしては、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０３２３８８．１（Ｎｏ．ＮＭ＿００８３６２．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。

さらに、ＩＬ−６の受容体としては、膜結合型ＩＬ−６受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩＬ−６Ｒ）や可溶性ＩＬ−６受容体（ｓｏｌｕｂｌｅＩＬ−６ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｓＩＬ−６Ｒ）が挙げられ、典型的には、ヒトＩＬ−６Ｒとして、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０００５５６．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０００５６５．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、マウスＩＬ−６Ｒとしては、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＰ＿０３４６８９．２（Ｎｏ．ＮＭ＿０１０５５９．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。

しかしながら、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明において、炎症性サイトカインの機能を抑制するために標的とする受容体には、このような天然の変異体も含まれる。

炎症性サイトカインのシグナル伝達に関与するその他の蛋白質としては、ＴＮＦ−αに関しては、例えば、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ又はＡＤＡＭ１７とも称する）が挙げられる。なお、ＴＮＦ−α変換酵素は、膜型蛋白質として産生されるＴＮＦα前駆体をシェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）することによって、ＴＮＦαの活性化を誘引する因子として知られている（「ＢｒｉｌｌＡ．，ｅｔａｌ、ＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈ、２００９年、１０月１日、８４巻、１号、１３７−１４４ページ」、「ＭｕｒｔｈｙＡ．，ｅｔａｌ、ＥｃｔｏｄｏｍａｉｎｓｈｅｄｄｉｎｇｏｆＥＧＦＲｌｉｇａｎｄｓａｎｄＴＮＦＲ１ｄｉｃｔａｔｅｓｈｅｐａｔｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｄｕｒｉｎｇｆｕｌｍｉｎａｎｔｈｅｐａｔｉｔｉｓｉｎｍｉｃｅ．、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（電子版）、２０１０年７月１２日」、「ＫｉｌｌｏｃｋＤＪ．，ｅｔａｌ、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ、２０１０年５月１３日、４２８巻、２号、２９３−３０４ページ」、「ＣｈａｌａｒｉｓＡ．，ｅｔａｌ、ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ、２０１０年２月、１８０３巻、２号、２３４−２４５ページ」等参照）。

また、ＩＬ−１に関しては、例えば、ＩＬ−１のシグナル伝達に関与する下流の分子として知られている、ＩＬ−ＲＡｃＰ（ＩＬ−１ｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｃｅｓｓｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＹＤ８８（ｍｙｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｉｍａｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｇｅｎｅ８８）、ＩＲＡＫ４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ４）、ＴＲＡＦ６（ｔｕｍｏｒｅｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆａｃｔｏｒ６）が挙げられる（ＷｅｂｅｒＡ．，ｅｔａｌ、ＳｃｉｅｎｃｅＳｉｇｎａｌｉｎｇ、２０１０年１月１９日、１０５巻、３号、ｃｍ１参照）。

また、ＩＬ−６に関しては、例えば、ＩＬ−６のシグナル伝達に関与する下流の分子として知られている、ｇｐ１３０、ＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｄｕｃｅｒａｎｄａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ３）、ＳＨＰ−２（Ｓｒｃｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎ２−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−２）が挙げられる。

本発明における「炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物」の１つの態様は、抗体である。本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。

また、本発明の抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および、これら抗体の機能的断片が含まれる。抗体の機能的断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体などが挙げられる。

本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。

抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（前記炎症性サイトカインなど）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法等によって作製することができる。

キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平７−１９４３８４号公報、特許３２３８０４９号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。

ヒト化抗体は、例えば、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）することにより作製することができる（例えば、特許２９１２６１８号、特許２８２８３４０号公報、特許３０６８５０７号公報、欧州特許２３９４００号公報、欧州特許１２５０２３号公報、国際公開９０／０７８６１号公報、国際公開９６／０２５７６号公報参照）。

ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用して作製することができる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９２）、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：６５−９３（１９９５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７（２０００）、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。

本発明において用いる抗体には、望ましい活性（炎症性サイトカインの機能を抑制する活性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加および／または挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域およびＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。

また、抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数、位置、種類を変化させるなどの抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入または欠失などの公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３号公報、特許４３６８５３０号公報、特許４２９０４２３号公報、米国特許第５０４７３３５号公報、米国特許第５５１０２６１号公報、米国特許第５２７８２９９号公報、国際公開第９９／５４３４２号公報）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明において用いる抗体は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。

本発明において用いられる炎症性サイトカインの機能を抑制する抗体としては、例えば、インフリキシマブ(セントコア社製）、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ・ｐｅｇｏｌ（ＵＣＢ社製）、ゴリムマブ(セントコア社製）といった抗ＴＮＦ−α抗体、トシリズマブ（中外製薬社製）等の抗ＩＬ−６Ｒ抗体を適宜選択して用いることができる。

本発明における「炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物」の他の態様は、内因性の炎症性サイトカインに対してドミナントネガティブの形質を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドとしては、内在性の炎症性サイトカインの機能を抑制する作用を有する、これら炎症性サイトカインの変異体や欠失体が挙げられる。例えば、ＴＮＦαに関しては、エタネルセプト（ワイス社製、可溶性ＴＮＦ−α受容体）、ＷＰ９ＱＹ（Ｗ９）ペプチド（ＴＮＦ−α受容体の部分ペプチド変異体）が挙げられ、ＩＬ−１に関しては、ＩＬ−１ＲＡ（インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（典型的には、ヒトＩＬ−１ＲＡとして、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮＰ＿７７６２１５．１（Ｎｏ．ＮＭ＿１７３８４３．１）で示される蛋白質（遺伝子）、マウスＩＬ−１ＲＡとしては、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮＰ＿１１２４４４．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０３１１６７．３）で示される蛋白質（遺伝子））が挙げられる。このようなドミナントネガティブ体は、組換えＤＮＡ法、化学合成等によって作製することができる。

本発明における「炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物」の他の態様は、ＲＮＡ干渉により、炎症性サイトカインの機能を抑制する分子である。例えば、標的遺伝子（炎症性サイトカインをコードする遺伝子、炎症性サイトカインの受容体をコードする遺伝子、あるいは炎症性サイトカインのシグナル伝達に関与するその他のタンパク質をコードする遺伝子）の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）または該ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡが挙げられる。

ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）のいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスＤＮＡと、該ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスＤＮＡを含み、該アンチセンスＤＮＡおよび該センスＤＮＡより、それぞれアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させることができる。また、これらのアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡよりｄｓＲＮＡを作製することができる。

ｄｓＲＮＡの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを発現させる場合がある。同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入する構成である。

また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスＤＮＡとセンスＤＮＡとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスＲＮＡコード鎖とセンスＲＮＡコード鎖とが対となった一つの二本鎖ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとを発現し得るようにプロモーターを対向して備える。この場合には、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ａ（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。

また、異なるベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットとをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させる構成である。

なお、上記ｄｓＲＮＡは、当業者であればそれぞれの鎖を化学合成して調製することも可能である。

本発明に用いるｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味する。標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はない。ｄｓＲＮＡの鎖長は、例えば、１５〜４９塩基対であり、好適には１５〜３５塩基対であり、さらに好適には２１〜３０塩基対である。

ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムにより決定することができる。

本発明における「炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物」の他の態様は、標的遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）や標的遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ（リボザイム）をコードするＤＮＡである。

上記の炎症性サイトカインの機能を抑制する核酸分子は、公知の形質転換技術、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター法などの方法により、宿主動物細胞に導入することができる。

本発明における「炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物」の他の態様は、炎症性サイトカインの機能を抑制する合成低分子化合物であり、例えば、ＴＮＦ−α変換酵素の
酵素活性を阻害する化合物であるＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３が挙げられる。

本発明の組成物は、医薬組成物、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。

本発明の組成物は、血栓形成を抑制する作用、円盤状血小板による血小板血栓の形成及び血管内皮細胞への接着を抑制する作用を有するため、血栓形成に起因する疾患、例えば、アテローム性動脈硬化、心原性血栓塞栓症、静脈血栓塞栓症、動脈血栓症、並びに、慢性炎症を来すメタボリックシンドローム、癌、持続性の腸炎、神経疾患といった動脈血栓症等が認められる疾患などの予防のために投与される医薬組成物として、また、血栓形成の予防のために（上記疾患の予防を含む）、日常的に摂取される飲食品として好適に用いることができる。

本発明における組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤などとして、経口的または非経口的に使用することができる。

これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。

本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、血栓形成に起因する疾患の予防に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。

本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、食品添加物、あるいは動物用飼料であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。飲食品の具体例としては、食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリンなどの油分を含む製品；スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、機能性飲料等の液状食品；飯類、麺類、パン類等の炭水化物含有食品；ハム、ソーセージ等の畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛等の水産加工食品；漬物等の野菜加工食品；ゼリー、ヨーグルト等の半固形状食品；みそ、発酵飲料等の発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓等の各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープ等のレトルト製品；インスタントスープ，インスタントみそ汁等のインスタント食品や電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられるが、これらに制限されない。

本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、血栓形成の抑制のために有効な１種もしくは２種以上の成分を添加してもよい。また、血栓形成の抑制以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。

本発明の組成物を投与または摂取する場合、その投与量または摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの本発明の組成物の投与量または摂取量は、一般に、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明は、このように、本発明の組成物を対象に投与もしくは摂取させることを特徴とする、対象における血栓形成を抑制する方法をも提供するものである。また、本発明の組成物を対象に投与することを特徴とする、対象における血栓形成に起因する疾患の予防の方法をも提供するものである。

本発明の組成物の製品（医薬品、飲食品、試薬）またはその説明書は、血栓形成を抑制するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。血栓形成を予防するために用いられる旨の表示においては、本発明の組成物を投与もしくは摂取することにより血栓形成が抑制される機序についての情報を含むことができる。機序としては、例えば、血栓形成初期において、血小板の血管内皮への付着を抑制すること、に関する情報が挙げられる。また、血栓形成を抑制するために用いられる旨の表示においては、血栓形成に起因する疾患の予防のために用いられること、に関する情報を含むことができる。

以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

なお、本実施例で用いた実験動物及び試薬は以下のようにして用意した。

＜実験動物及び試薬＞
１２週齢雄野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスはチャールズリバー研究所から購入した。また、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−受容体、ＩＬ−１α／β、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、及びＩＬ−６の各々の欠損マウス、並びにそれらのコントロール同腹仔は「Ｈｏｒａｉ，Ｒ．，ｅｔａｌ．、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ、１９９８年、１８７巻、１４６３−１４７５ページ」、「Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．，ｅｔａｌ．、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１９９７年、７７巻、６４７−６５８ページ」、「Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｋ．，ｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ、７３巻、１９９３年、４５７−４６７ページ」、「ＫｏｐｆＭ．，ｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９４年３月２４日、３６８巻、６４６９号、３３９−４２ページ」に記載のものを各々用意した。なお、全ての動物及び組み換えＤＮＡ実験は動物実験委員会によって承認を受けたものである。そして、全ての試薬は、特に断りのない限り、シグマ−アルドリッチ社製のものを用いた。

また、本実施例において、前記実験動物及び試薬を用いて、下記の通りに実験動物の体内に血栓を形成させ、その過程を生体顕微鏡で観察した。さらに、得られた観察結果の画像解析又は統計解析は下記の通りに行った。

＜生体顕微鏡検査及び血栓形成＞
生きているマウスの腸間膜の微小循環における血栓形成を視覚的に解析するため、従来の手法を改変して発展させた可視化技術による生体レーザー傷害手法を用いた（「Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００８年２月１日、１１８巻、２号、７１０−７２１ページ」、「Ｔａｋｉｚａｗａ，Ｈ．，ｅｔａｌ．、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１０年１月４日、１２０巻、１号、１７９−１９０ページ」参照）。すなわち、ウレタン注射（１．５ｇ／ｋｇ）によって麻酔した後、腸間膜を露出することなく観察するために雄マウスに小切開を施した。そして、細胞動態を可視化するために、ＦＩＴＣ（２０ｍｇ／ｋｇ体重）又はテキサス−レッド−デキストラン（蛍光標識デキストラン）（２０ｍｇ／ｋｇ体重）を注入した。また、レーザー照射時にＲＯＳ（活性酸素種）を産生させるため、ヘマトポルフィリン（１．８ｍｇ／ｇ）を注入した。結果、マウスをこのように処理することにより、血球動態及び血栓産生は、レーザー励起及びＲＯＳ産生（波長４８８ｎｍ、３０ｍＷ出力）の間、可視化されることになる。さらに、かかる可視化に関するシークエンシャル画像は、回転ディスク共焦点顕微鏡（横河電機株式会社製、ＣＳＵ−Ｘ１）及びＥＭ（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ）−ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ、Ａｎｄｏｒ社製）、又は共鳴スキャンシステム付共焦点レーザー顕微鏡システム（Ａ１Ｒシステム、ニコン社製、３０フレーム／秒、２０〜６０秒間）を用いて、２０〜４０秒間、１０〜３０フレーム／秒で撮影することにより得た。なお、横河電機システムにおいて用いた励起波長は４０８、４８８及び５６８ｎｍであり、ニコンシステムにおいて用いた４０５、４８８及び５６１ｎｍであった。

また、ＲＯＳ産生を検出するために、マウスに蛍光指示薬２−［６−（４'−ａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｏｘｙ−３Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−３−ｏｎ−９−ｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ（ＡＰＦ（ＡｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、積水メディカル株式会社製）０．８ｍｇ／ｋｇを投与した。さらに、内皮細胞層を可視化するために、蛍光標識（ＦＩＴＣ結合）ＩＢ_４（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ由来のイソレクチンＢ_４、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）２．０ｍｇ／ｋｇを投与した。また、血小板の動態を特異的に可視化するために、蛍光標識された抗ＧＰＩｂ−β抗体（Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８ａｎｔｉ−ＧＰＩｂβ、ＥｍｆｒｅｔＡＮＡＬＹＴＩＣＳ社製）０．２ｍｇ／ｋｇを、可視化試験１５分前に静脈内に投与した。さらに、白血球及び内皮細胞の核を可視化するために、ヘキスト３３３４２（インビトロジェン社製）２．５ｍｇ／ｋｇを投与した。

また、このように蛍光色素（又は指示薬）で染色した試料から、回転ディスク共焦点顕微鏡ＣＳＵ−Ｘ１を用いて、緑色シグナル及び赤色シグナルを同時に得るために、ＣＳＵ−Ｘ１のセカンドポート及びＥＭ−ＣＣＤカメラｉＸｏｎ一対を用いた。すなわち、試料をＡｒ−Ｋｒレーザー（４８８ｎｍ及び５６８ｎｍ）によって励起させ、発生したシグナルはダイクロイックミラーを用いて検出し、赤色及び緑色のシグナルはセカンド５６５ｎｍダイクロイックミラーによって分離し、さらに、５１０−ｎｍバンド−パスバリアフィルターを用いて緑色シグナルを検出し、一方、６００−ｎｍロングパスフィルターを用いて赤色シグナルを検出した。

＜画像解析＞
血小板の動態を定量化するために、前記の通りにして得られたシークエンシャル画像を次のように解析した。すなわち、レーザー傷害から１０秒後に、内皮との断続的な相互作用を示したものを付着血小板と定義し、また、血栓の発達を定量化するために、血栓内の血小板数は、ＩＱソフトウェア（Ａｎｄｏｒ社製）を用いて、盲検観察者達によって測定した。

＜統計解析＞
実験動物とコントロール動物との差は両側（２−ｔａｉｌｅｄ）スチューデントｔ検定によって解析し、Ｐ値＜０．０５を有意としてみなした。

また、実施例において用いた血小板機能評価システム（レーザー傷害モデル）について、その観察例を挙げながら、以下において説明する。

＜血小板機能評価システム（レーザー傷害モデル）＞
まず、前述のレーザー誘起反応と、高速共焦点システムに基づく生体内イメージング手法とを組み合わせた生体イメージングによる血小板機能評価システムを用いて、通常条件下における血小板等の動態を確認した。すなわち、白血球、血小板、及び赤血球を、各々ヘキスト３３３４２、蛍光標識された抗ＧＰＩｂ−β抗体、及び蛍光標識デキストランを用いて染色することにより、生体内におけるこれらの動態を可視化した。得られた結果を図１に示す。なお図１中、緑色の（緑色の矢印で示されている）部位は抗ＧＰＩｂ−β抗体で染色された血小板を示し、赤色の（赤色の矢印で示されている）部位は蛍光標識デキストランで染色された赤血球を示し、青色の（青色の矢印で示されている）部位はヘキスト３３３４２で染色された白血球の核を示し、橙色の矢印で示されている部位はヘキスト３３３４２で染色された血管内皮細胞の核を示す。また図１中の数字は観察時間（０〜１０秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示している。図１に示した結果から明らかなように、本評価システムは血管内おける血小板等の動態を単一血球レベルで観察することができることが確認された。

次に、へマトポルフィリンにレーザーを照射して産生されたＲＯＳによって腸間膜の毛細血管を損傷させ、その後に続く血栓形成の過程を観察した。得られた結果を図２に示す。なお、図２中の数字は観察時間（レーザー照射後０〜１６秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図２に示した結果から明らかなように、前記レーザー傷害に引き続いて、血小板が最初に血管壁に付着し、その後、最終的に血管が赤血球及び／又は白血球からなる栓によって塞がれるまでずっと血小板はその数を増やし積み上がり（ｐｉｌｌｉｎｇｕｐ）、血流は遅くなっていくことが確認された。なお、本評価システムを用いてテストした血管の９０．５±２．４％（ｎ＝動物５匹から得た５０血管）において血管の閉塞が確認され、再現性の高さも実証された。さらに、発達中の血栓内において、血小板は円盤状の形態を保ったまま、細胞外マトリックスではなく、血管の内皮壁に付着しているということが明らかになった。

さらに、レーザー傷害後における血栓内の細胞集団をより明確にするために、血小板を特異的に同定する蛍光標識抗ＧＰＩｂβ抗体の存在下において、血栓形成プロトコールに従って実験を前記同様に行った。得られた結果を図３に示す。なお図３中、赤色の部位は抗ＧＰＩｂ−β抗体で染色された血小板を示し、緑色の部位は蛍光標識デキストランで染色された赤血球を示す。また図３中の数字は観察時間（レーザー照射後０〜２０秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図３に示した結果から明らかなように、血栓内のその殆どが血小板から構成されていることが確認され、血栓内の９２．８±１．１％が血小板であることが明らかになった（ｎ＝動物５匹から得た３０血管）。

なお、これらの実験に用いた抗ＧＰＩｂβ抗体の濃度（０．２ｍｇ／ｋｇ）は、レーザー照射後最初の１０秒間又は血栓発達中の２０秒間における血小板の血管壁への付着に有意な影響を与えないことは確認している（図４及び図５参照）。また、アクリヂンオレンジダイを用いて白血球及び血小板を追跡することにより、閉塞された血管内における血栓に白血球が存在していることも確認している（図６参照）。なお図４中、縦軸はレーザー照射後最初の１０秒間に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を、更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示し、「ｎｓ」は抗ＧＰＩｂ−β抗体の添加の有無によって血小板の血管壁への付着に有意な差が生じていないことを示す。また図５中、縦軸は血栓内の血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示し、「ｎｓ」は抗ＧＰＩｂ−β抗体の添加の有無によって血小板の血管壁への付着に有意な差が生じていないことを示す。さらに図６中、赤色の部位はアクリヂンオレンジで染色された白血球及び血小板を示し、赤色の矢印で示されている部位は血管閉塞部を示し、緑色の部位は蛍光標識デキストランで染色された赤血球を示す。また図６中の数字は観察時間（レーザー照射後０〜２０秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。

また、本評価システム（レーザー傷害モデル）においては、血管の内皮細胞層は破綻しており、血小板を直接活性化させるコラーゲン（細胞外マトリックス）が露出していることも考えられるため、内皮細胞をＧｒｉｆｆｏｎｉａｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ由来の蛍光標識ＩＢ_４（イソレクチン）で染色し、レーザー傷害後の内皮細胞層を経時観察した。得られた結果を図７に示す。なお図７中、赤色の部位は蛍光標識ＩＢ_４で染色された内皮細胞を示し、緑色の部位はデキストランで染色された赤血球を示す。また図７中の数字は観察時間（レーザー照射後０〜１６秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図７に示した結果から明らかなように、レーザー照射後に蛍光色素の溢出がなかったことから、無傷の内皮上において血栓は発達していることが確認された。

さらに、本評価システム（レーザー傷害モデル）を用いて、血栓形成はどのように開始されるのかを解析すべく、ＡＰＦ（ＡｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を用いて、先ずはレーザー傷害後の血管内におけるＲＯＳ産生を可視化した。得られた結果を図８に示す。なお図８中、赤色（又は白色）の部位はＡＰＦにより検出されたＲＯＳ産生（蓄積）部位を示し、緑色の部位はデキストランで染色された赤血球を示す。また図８中の数字は観察時間（レーザー照射後０秒及び２０秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図８に示した結果から明らかなように、調べたレーザー傷害後の血管全てにおいて、ＲＯＳの蓄積が確認された。

（実施例１）ＴＮＦ−α欠損マウスにおける血栓形成の評価
そこで、ＲＯＳ産生を促すことが知られているＴＮＦ−α（「Ｙａｚｄａｎｐａｎａｈ，Ｂ．，ｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、４６０巻、１１５９−１１６３ページ」参照）と血栓形成との関連性を調べるために、血小板機能評価システム（レーザー傷害モデル）を用いて、ＴＮＦ−α欠損マウス（ＴＮＦ−αノックアウトマウス（ＴＮＦα（−／−）））における血小板の初期の付着及び血栓成長等を評価した。得られた結果を図９〜１１に示す。なお図９中、縦軸は、ＴＮＦ−αノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔におけるレーザー傷害後の１０秒間に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。また図１０中、縦軸は、ＴＮＦ−αノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔における、レーザー傷害から０秒、１０秒、２０秒後の血栓内における血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに、図９及び１０中のアスタリスクは統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。また図１１中、赤色（又は白色）の部位はＡＰＦにより検出されたＲＯＳ産生（蓄積）部位を示し、緑色の部位はデキストランで染色された赤血球を示し、数字は観察時間（レーザー照射後０秒及び２０秒）を示す。さらに図１１中、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図９〜１１に示した結果から明らかなように、ＴＮＦ−α欠損マウスにおいて、レーザー照射後の血管壁への血小板の初期の付着及び血栓成長は顕著に減じており、ＲＯＳ産生も減少していることが明らかになった。

（実施例２）ＴＮＦ−Ｒ１欠損マウスにおける血栓形成の評価
次に、ＴＮＦ−αの受容体である１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ１、ＴＮＦ−Ｒ１）の欠損マウス（ＴＮＦ−Ｒ１ノックアウトマウス（ＴＮＦ−Ｒ１（−／−）））における血小板の初期の付着及び血栓成長を評価した。得られた結果を図１２〜１４に示す。なお図１２中、縦軸は、ＴＮＦ−Ｒ１ノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔におけるレーザー傷害後の１０秒間に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を、更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。また図１３中、縦軸は、ＴＮＦ−Ｒ１ノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔における、レーザー傷害から０秒、１０秒、２０秒後の血栓内における血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに、図１２及び１３中のアスタリスクは統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。また図１４中、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図１２〜１４に示した結果から明らかなように、ＴＮＦ−Ｒ１欠損マウスにおいても、レーザー照射後の血管壁への血小板の初期の付着及び血栓成長は顕著に減じており、実施例１に記載の結果と併せて、ＴＮＦ−α及びその受容体が介する炎症性サイトカインシグナルは、血小板の初期の付着及び血栓成長に必須の要素であることが明らかとなった。

（実施例３）ＩＬ−１欠損マウスにおける血栓形成の評価
また、炎症性サイトカインと血小板という観点からは、活性化血小板において炎症性サイトカインの１種であるＩＬ−１βが発現しており（非特許文献８）、ＩＬ−１αもＩＬ−１β同様に血小板において発現していることが報告されている（非特許文献９）。さらに、ＩＬ−１β ｐｒｅ−ｍＲＮＡは巨核球の細胞質に存在し、断片化によって放出した血小板自身もＩＬ−１β ｐｒｅ−ｍＲＮＡを保持しており（非特許文献１０）、炎症反応状態に血小板自体の産生するＩＬ−１βが関与することが推測されている。また、さらには、ＩＬ−１βの合成を介して炎症シグナルを調節していることも既に示されている（非特許文献１１）。そこで、ＩＬ−１と血栓形成との関連性を調べるために、本評価システムを用いて、ＩＬ−１欠損マウス（ＩＬ１α／βダブルノックアウトマウス（ＩＬ１α／β（−／−）））における血小板の初期の付着及び血栓成長を評価した。得られた結果を図１５〜１７に示す。なお図１５中、縦軸は、ＩＬ１α／βノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔におけるレーザー傷害後の１０秒間に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を、更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。また図１６中、縦軸は、ＩＬ１α／βノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔における、レーザー傷害から０秒、１０秒、２０秒後の血栓内における血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに、図１５及び１６中のアスタリスクは統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。また図１７中、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示し、数字は観察時間（レーザー照射後０秒及び２０秒）を示す。図１５〜１７に示した結果から明らかなように、ＩＬ−１欠損マウスにおいて、血栓成長における血小板の内皮細胞への初期の付着が減少していることが明らかになった。

（実施例４）ＩＬ−１ＲＡ欠損マウスにおける血栓形成の評価
さらに、ＩＬ−１α又はβとＩＬ−１受容体との結合を競合的に阻害し、ＩＬ−１活性を抑制する因子として知られている、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）の欠損マウス（ＩＬ−１ＲＡノックアウトマウス（ＩＬ−１ＲＡ（−／−）））における血栓成長等を評価した。得られた結果を図１８〜２０に示す。なお図１８中、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示し、数字は観察時間（レーザー照射後０秒、８秒、及び２０秒）を示す。また図１９中、縦軸は、ＩＬ−１ＲＡノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔におけるレーザー傷害後の１０秒間に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を、更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。また図２０中、縦軸は、ＩＬ−１ＲＡノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔における、レーザー傷害から０秒、１０秒、２０秒後の血栓内における血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに、図１９及び２０中のアスタリスクは統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。図１８〜２０に示した結果から明らかなように、ＩＬ−１ＲＡ欠損マウスにおいては、レーザー傷害後の、血管壁上への血小板の初期の付着及び血栓の発達が亢進しており、実施例３に記載の結果と併せて、ＩＬ−１は、ＴＮＦ−α同様、生体内の血栓形成において必須であることが明らかとなり、また、ＩＬ−１ＲＡは血栓形成を抑制する作用を有する物質であることが実証された。

（実施例５）ＩＬ−６欠損マウスにおける血栓形成の評価
また、ＩＬ−６と血栓形成との関連性を調べるために、本評価システムを用いて、ＩＬ−６欠損マウス（ＩＬ−６ノックアウトマウス（ＩＬ−６（−／−）））における血小板の初期の付着及び血栓成長を評価した。得られた結果を図２１〜２３に示す。なお図２１中、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示し、数字は観察時間（レーザー照射後０秒及び２０秒）を示す。また図２２中、縦軸は、ＩＬ−６ノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔におけるレーザー傷害から１０秒後に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を、更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに図２３中、縦軸は、ＩＬ−６ノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔における、レーザー傷害から０秒、１０秒、２０秒後の血栓内における血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに、図２２及び２３中のアスタリスクは統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。図２１〜２３に示した結果から明らかなように、ＩＬ−６欠損マウスにおいては、レーザー傷害後の、血管壁上への血小板の初期の付着及び血栓の発達が抑制されており、ＩＬ−６は血栓形成を促進する作用を有する物質であることが明らかになった。

従って、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６といった炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物（例えば、実施例４に記載のＩＬ−１ＲＡ）を生体に投与することにより、血管壁への血小板の初期の付着及び血栓成長を阻害し、生体内における血栓形成を抑制することが可能となる。

以上説明したように、本発明によれば、血管壁への血小板の初期の付着及び血栓成長を阻害し、血栓形成を抑制することが可能となる。したがって、本発明の炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物は血栓形成を抑制する点において優れているため、医薬品として用いる場合には、血栓形成に起因する疾患、例えば、アテローム性動脈硬化、動脈血栓症、心原性血栓塞栓症、静脈血栓塞栓症の予防において特に有用である。また、血栓形成を予防するために日常的に摂取する飲食品として、あるいは、研究目的で血栓形成を抑制するための試薬としても有用である。

Claims

炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物を含有することを特徴とする血栓形成を抑制する作用を有する組成物。
前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、及びＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも一つの生体分子であることを特徴とする請求項１に記載の血栓形成を抑制する作用を有する組成物。