JP2011522210A - ポリペプチドを絶対定量化するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ポリペプチドを絶対定量化するための方法に関する。

Description

本発明は、ポリペプチドの絶対定量化に関する。

基礎生物学から臨床診断学および公衆衛生調査に及ぶ種々の分野において、複雑な生体試料中のタンパク質の特異的で正確な定量化は、依然としてよくある挑戦的な問題のままである。多くのタンパク質バイオマーカーの場合、この問題は、免疫学的技術により解決されている。しかしながら、免疫学的手法の成功は、高度に特異的で高度に親和性である抗体の強力な産生および検証に依存している。最近は抗体アレイを設計するための努力がなされているが［２０］、免疫学的方法を多重分析に適応させることには依然として制限がある。実際、いくつかのタンパク質アッセイの同時最適化は、ほとんど不可能である［２１］。代替として、ＭＳに基づくプロテオミクスの能力を利用して、プロテオーム全体にわたる定量化を可能にすることができる。

質量分析法（ＭＳ）は、プロテオミクスの成熟に大きく寄与している［１］。今や、１時間の時間枠で何百ものタンパク質を特徴付けし、試料対中のタンパク質存在量を比較することが可能である。次の最前線は、正確な絶対定量化にある。無標識の分光法的計数手法［２、３］は、少なからぬ興味を引き付けているが、ロバストな絶対定量方法は、典型的には、標的タンパク質（複数可）に由来する特異的タンパク質分解性ペプチドの同位体標識相同体を用いて内部標準化が達成される［５、６］同位体希釈原理を利用する［４］。絶対定量化（ＡＱＵＡ）ペプチド戦略では、ＭＳ分析前に既知量で試料にスパイクされる化学的に合成された同位体標識ペプチドが使用される［５〜８］。高度に純粋な合成同位体標識ペプチドが市販されていることは、ＡＱＵＡペプチド戦略を非常に魅力的にしている。この方法論を使用して、神経ペプチド［２３］の定量化、またはリンペプチド標準物質を用いたタンパク質リン酸化［５〜７］の定量化に成功している。しかしながら、同位体標識ペプチドの個別的な化学合成、精製、および定量化は、ＡＱＵＡ定量化をかなり高額なものにする。このため、目的タンパク質は、単一ＡＱＵＡペプチドを用いて定量化されることが多い［２４、２５］。

最近、トリプシン消化前に試料にスパイクすることができる標準ペプチドの人工コンカテマー（ＱＣＡＴ）の合成および代謝的標識化が導入され、定量化されたタンパク質の数が拡大した［９、１０］。ＱＣＡＴおよび関連ポリＳＩＳポリタンパク質は、タンパク質の多重絶対定量化のための洗練された中間戦略として開発された。ＱＣＡＴの構築により、１回の実験で、いくつか（１００まで）のペプチドを並行して産生および定量化することが可能になる。単一タンパク質を表わすいくつかのマーカーペプチドが含まれていてもよい。いったん起想されれば、無限量の同位体標識ペプチド標準物質を繰り返して産生するために、ＱＣＡＴ遺伝子を使用することは簡単にできる。興味深いことには、タンパク質発現により、１５残基より長いペプチドまたは化学的に反応性の高い残基を含有するペプチドなどの、化学的方法により産成することが難しいペプチドの合成が可能になる。Ｂｅｙｎｏｎら［９］によると、ＱＣＡＴタンパク質は、特に、複合物内のタンパク質の化学量論比の評価に適しているはずである。

ＡＱＵＡおよびＱＣＡＴ戦略は、同位体標識ペプチドおよびその未標識等価物が、ＬＣ−ＭＳ分析の逆相クロマトグラフィーステップにおいて同一のクロマトグラフィー特性をもつことを利用する。

ＡＱＵＡおよびＱＣＡＴ手法は、生体試料中のタンパク質の定量的測定を著しく前進させたが、本発明者らは、そのような標準物質の使用が著しいバイアスを招く場合があることを発見した。ＡＱＵＡペプチドおよびＱＣＡＴ構築体を用いた較正は、以下の制限を被る：（ｉ）ＭＳ分析前に必要なタンパク質分解ステップの実際的効率を考慮できないこと；（ｉｉ）生体試料に対処する場合に必要であることが多い試料前分画と不適合であること［１１］；（ｉｉｉ）タンパク質配列カバー率が不十分で、定量化の統計的信頼性が制限されること。

したがって、ポリペプチドを絶対定量化するための正確な方法を開発する必要性が依然として存在する。

この目的を遂行するにあたり、本発明者らは、試料中の標的ポリペプチドを定量化するための方法であって、
（ａ）分析する試料を準備するステップと、
（ｂ）前記標的ポリペプチドの既知量の同位体標識相同体を試料に添加し、それにより、スパイクされた試料を得るステップと、
（ｃ）スパイクされた試料をプロテアーゼ活性で処理して、複数のタンパク質分解性ペプチドを得るステップと、
（ｄ）質量分析法（ＭＳ）により、ステップｃ）で得られたタンパク質分解性ペプチドを分析するステップと、
（ｅ）対応する未標識タンパク質分解性ペプチドに対する、同位体標識タンパク質分解性ペプチドの比率を決定するステップと、
ｆ）この比率および同位体標識相同体の既知量から、試料中の標的ポリペプチドの量を算出するステップと
を含む方法を提唱する。

この方法の根底にある原理は、標的ポリペプチドの同位体標識相同体が、内部標準物質として使用されるということである。標準物質として使用される同位体標識相同体の濃度がそれ自体正確に定量化されれば、既知量で添加された内部標準物質に準拠することにより、質量分析中の相対的シグナル強度の決定を、標的ポリペプチドの絶対量に変換することができる。

ＱＣＡＴコンカテマーの設計、産生、および分析を示す図である。 １Ａは、ブドウ球菌スーパー抗原性毒素用の安定同位体標識ペプチド標準物質を生成するために設計したＱＣＡＴコンカテマーを記載している。この人工タンパク質は、Ｂｅｙｎｏｎらの戦略に従って構築した［９］。本研究で標的とした毒素は、ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１である。これら２つの毒素の各々について、３つのトリプシンマーカーペプチドに対応する３つのペプチド配列が、ＱＣＡＴコンカテマーに含まれていた（ＳＥＡについてはペプチドＰ１〜Ｐ３、およびＴＳＳＴについてはＰ７〜Ｐ９）。本発明者らは、他のブドウ球菌エンテロトキシンの定量化用に８つのペプチド標準物質も添加した。本研究では、これらの補完標準物質ペプチドは、定量化に使用しなかった。定量化ペプチド（ＱＰ）を、Ｂｅｙｎｏｎらの設計に従って構築体に導入した。しかしながら、固有のシステイン残基に基づくこの標識の定量化は、タンパク質間のジススルフィド（ｄｉｓｓｕｌｆｉｄｅ）形成のため、信頼性が乏しいことが判明した。したがって、本発明者らは、よりロバストなＡＡＡ定量化を志向した。精製用ヘキサヒスチジン標識の精製および切断の後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＱＣＡＴの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査した（１Ｂ）。最終的に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（１Ｃ）またはｎａｎｏＬＣ−ＱＴＯＦを使用して、１３個の標準ペプチドを、純粋ＱＣＡＴタンパク質の消化物中で帰属することができた。 ＡＱＵＡペプチドを使用した、飲料水試料中のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１ブドウ球菌毒素の定量化を示す図である。 可変量のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１を飲料水に希釈し、トリプシンを有する溶液中で消化した。消化後に、既知量の［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ］−ロイシン（^＊）ＡＱＵＡペプチド標準物質を添加し、試料をｎａｎｏＬＣ−ＭＳで分析した。未標識／標識ペプチドダブレット（Δｍ＝７Ｄａ）に由来する抽出イオンクロマトグラムシグナルを積分し、それらの比率を使用して添加した天然毒素の量を推定した。毒素の推定量を添加量に対してプロットすることにより、ＳＥＡ（２Ａ）およびＴＳＳＴ−１（２Ｂ）滴定曲線を取得した。表示されているのは、各滴定で考察されたマーカーペプチドである。各データポイントは、３回の分析的重複測定の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 前消化または共消化されたＱＣＡＴ標準物質の比較使用を示す図である。 可変量のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１を飲料水試料にスパイクし、ＱＣＡＴコンカテマーを較正標準物質として使用した。汚染水試料を、ＱＣＡＴと別々に（◆）、またはＱＣＡＴと同時に（▲）のいずれかで、トリプシンを有する溶液中で消化した。本発明者らは、ここに、マーカーペプチドＹＮＬＹＮＳＤＶＦＤＧＫを用いて取得されたＳＥＡ滴定曲線を示す。同様のデータが、マーカーペプチドＮＶＴＶＱＥＬＤＬＱＡＲ、ＱＮＴＶＰＬＥＴＶＫ、およびＬＰＴＰＩＥＬＰＬＫで観察された。各データポイントは、３回の分析的重複測定の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 ＱＣＡＴを使用した、飲料水試料中のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１の定量化を示す図である。 飲料水試料を、異なる量のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１で汚染した。ＱＣＡＴコンカテマーを試料に添加し、毒素を有する溶液中で共消化した。ＱＣＡＴ消化により産生されたペプチドを、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析の較正標準物質として使用した。３つのマーカーペプチド（上述のとおり）によりＳＥＡ（４Ａ）の滴定が可能であり、１つのペプチドによりＴＳＳＴ−１（４Ｂ）の滴定が可能であった。各データポイントは、３回の分析的重複測定の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 ＰＳＡＱ標準物質を使用した、飲料水試料中のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１の定量化を示す図である。 可変量のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１を飲料水試料にスパイクした。ＰＳＡＱ全長毒素標準物質を較正基準として添加した。トリプシンを有する溶液中で汚染水試料を消化した。ＰＳＡＱ毒素消化により産生されたペプチドを、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析の定量化基準として使用した。ＳＥＡ（５Ａ）およびＴＳＳＴ−１（５Ｂ）を、それぞれ３つまたは２つのマーカーペプチド（表示されている）を用いて滴定した。各データポイントは、３回の分析的重複測定の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 尿試料中のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１の定量化用のＡＱＵＡペプチド、ＱＣＡＴコンカテマー、およびＰＳＡＱ標準物質の比較を示す図である。 尿試料を、異なる量のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１で汚染した。３つのタイプの標準物質：ＡＱＵＡペプチド、ＱＣＡＴコンカテマー、およびＰＳＡＱ毒素を毒素定量化のために使用した。これらの標準物質を、分析工程の様々な段階で試料に添加した（６Ａ）。ＳＥＡ（ペプチドＮＶＴＶＱＥＬＤＬＱＡＲ）（６Ｂ）およびＴＳＳＴ−１（ペプチドＬＰＴＰＩＥＬＰＬＫ）（６Ｃ）の滴定について、３つの同位体希釈法の比較が報告されている。各データポイントは、３回の分析的重複測定の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。 ＱＣＡＴアミノ酸配列および関連ＤＮＡ配列を示す図である。 同位体標識ＱＣＡＴコンカテマーのｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析を示す図である。 ブドウ球菌食中毒発生の原因とみなされたココパール（ｃｏｃｏ ｐｅａｒｌ）中のブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）のＰＳＡＱ検出および定量化を示す図である。 ２００６年のフランスにおける食中毒発生に関与したココパールは、フランス食品安全局（Ｆｒｅｎｃｈ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ）により収集された。ココパール試料（２５ｇ）をホモジナイズし、遠心分離にかけ、上清をポリエチレングリコールに対して透析することにより濃縮した。ＥＬＩＳＡ法またはＰＳＡＱ法を同時に使用して、抽出物を検査した。ＭＳ分析に関しては、濃縮抽出物を、１００ｎｇのＳＥＡ ＰＳＡＱ標準物質でスパイクし、免疫濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびトリプシン消化に供した。タンパク質分解性ペプチドをｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析で分析した。２対のプロテオタイプペプチドは、内在性ＳＥＡの存在を特異的に示し、定量化を可能にした（ペプチドＮＶＴＶＱＥＬＤＬＱＡＲを用いて取得された典型的な生データが示されている）。 ホスホ−ＰＳＡＱ法の模式図である。 記号（Ｐ）は、ペプチドＰｅｐ２のセリン、トレオニン、またはチロシンのリン酸化を表わす。簡潔性のために、本発明者らは、ペプチドＰｅｐ２の部分的なリン酸化の場合をこの模式図では示さなかった。これは、Ｐｅｐ２と関連するＭＳシグナルの部分的な除去に結びつくであろう。 グリコ−ＰＳＡＱ法の模式図である。 ＰＳＡＱ戦略を使用した、血清試料中のブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）の絶対定量化を示す図である。

本発明は、試料中の標的ポリペプチドを定量化するための方法であって、
（ａ）分析する試料を準備することと、
（ｂ）前記標的ポリペプチドの既知量の同位体標識相同体を試料に添加し、それにより、スパイクされた試料を得るステップと、
（ｃ）スパイクされた試料をプロテアーゼ活性で処理して、複数のタンパク質分解性ペプチドを得るステップと、
（ｄ）質量分析法（ＭＳ）により、ステップｃ）で得られたタンパク質分解性ペプチドを分析するステップと、
（ｅ）対応する未標識タンパク質分解性ペプチドに対する、同位体標識タンパク質分解性ペプチドの比率を決定するステップと、
ｆ）この比率および同位体標識相同体の既知量から、試料中の標的ポリペプチドの量を算出するステップとを含む方法
を提供する。

「標的ポリペプチド」という用語は、定量化されるポリペプチドを指す。

「ポリペプチドの同位体標識相同体」という表現は、その化学構造（つまり一次構造）が、同位体の存在を除いて、非標識ポリペプチドと同一か、または密接に関連しているか（例えば、アイソフォームまたは変異体、特に少なくとも９０％のアミノ酸同一性または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する変異体）のいずれかであるポリペプチドを指す。

典型的には、同位体標識相同体は、水素、窒素、酸素、炭素、または硫黄の同位体で標識することができる。好適な同位体には、これらに限定されないが、^２Ｈ、^１３Ｃ、^ｌ５Ｎ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、または^３４Ｓが含まれる。例えば、相同体ポリペプチドは、^１３Ｃおよび／または^ｌ５Ｎで均一に標識されていてもよい。好ましい実施形態では、特定の種類のアミノ酸がすべて標識されていてもよい。例えば、トリプシンがタンパク質分解酵素として使用される場合、［^１３Ｃおよび／または^１５Ｎ］−リシン残基および／または［^１５Ｎおよび／または^１３Ｃ］−アルギニン残基を標識化前駆物質として使用することができる。

代謝的な同位体組み込みは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのｉｎ ｖｉｖｏ発現により実現することができる［９、１０、２７］。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏでは、同位体標識前駆物質の代謝（代謝スクランブリング（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ））は、標識化収率の低減、およびタンパク質の異なるアミノ酸への標識の分散（標識スクランブリング（ｌａｂｅｌ ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ））に帰着する場合がある［２７］。

好ましい実施形態では、同位体組み込みは、無細胞抽出物の使用により実現することができる。無細胞抽出物のアミノ酸代謝は非常に限定されているため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの同位体標識化は、高い同位体組み込み収率（９５％超）を可能にし、スクランブリング（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）を無視することができる［１９、２８］。他のｉｎ ｖｉｖｏ標識化に対して無細胞系が有利である別の点は、標的タンパク質の排他的な標識化である。さらに、この技術は、特に毒性タンパク質合成に好適であり、生物学的災害および健康被害を管理するのに重要であり得る実験の閉じ込めを可能にする。

本明細書中に使用される場合、「プロテアーゼ活性」とは、ポリペプチドのアミド結合を切断する活性である。この活性は、プロテアーゼなどの酵素または化学薬品により実施することができる。好適なプロテアーゼには、これらに限定されないが、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、ヘプシン、ＳＣＣＥ、ＴＡＤＧ１２、ＴＡＤＧ１４など）；メタロプロテアーゼ（例えば、ＰＵＭＰ−１など）；キモトリプシン；カテプシン；ペプシン；エラスターゼ；プロナーゼ；Ａｒｇ−Ｃ；Ａｓｐ−Ｎ；Ｇｌｕ−Ｃ；Ｌｙｓ−Ｃ；カルボキシペプチダーゼＡ、Ｂ、および／またはＣ；ディスパーゼ；サーモリシン；ならびにジンジパインなどのシステインプロテアーゼなどの１つまたは複数が含まれる。プロテアーゼは、細胞から単離してもよく、または組換え技術により取得してもよい。ＣＮＢｒなどのプロテアーゼ活性を有する化学薬品も使用することができる。

「タンパク質分解性ペプチド」は、ポリペプチドのタンパク質分解後に取得されるペプチドを指す。

「同位体標識タンパク質分解性ペプチド」および「対応する未標識タンパク質分解性ペプチド」は、１つまたは複数の同位体標識の存在を除いて同一の化学構造を有する１対のペプチドを指す。

本発明による方法は、プロテオミクス、生体試料中のバイオマーカーの検出、ワクチンおよび他のバイオ産物の製造における品質管理、生物学的災害および健康被害の管理、食物および水の管理などの、非常に多様な分野で使用することができる。

典型的には、標的ポリペプチドは、生体液中に生理学的または病理学的に存在するバイオマーカー、タンパク質、またはそれらの断片（例えば、プロインスリンまたはインスリン）、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、植物タンパク質、酵母タンパク質、カビタンパク質、真菌タンパク質、動物タンパク質、または毒素、特にブドウ球菌スーパー抗原性毒素などのスーパー抗原性毒素であってもよい。

典型的には、標的ポリペプチドのサイズは、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、または１００ｋＤａより大きくてもよい。

本発明による方法を実施できる試料の例は、生体液（血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、涙液など）、組織および細胞ホモジネート、細胞培養上清、水、食物、生物収集液、ならびに上記の物質に由来する任意の生化学的画分であってもよい。生物収集液とは、空気試料またはガス試料中に存在し得る粒子を収集するために使用される液体である。

本発明による方法は、複数の標的ポリペプチドの同時定量化も可能にすることができる。この場合、既知量のいくつかの異なる同位体標識相同体を、分析する試料に添加する。それにより、標的ポリペプチドの多重検出および定量化を実施することができる。

本発明は、同位体標識ポリペプチドのライブラリーにも関する。

典型的には、本発明によるライブラリーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれより多くの同位体標識ポリペプチドを含有することができる。

本発明の好ましい実施形態では、ライブラリーの同位体標識ポリペプチドはすべて、同じプロテアーゼに感受性があり、前記プロテアーゼによりいったん消化されたライブラリーの同位体標識ポリペプチドから、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる。

本発明は、同位体標識ポリペプチドのライブラリーおよびプロテアーゼを別々の構成要素として含むキットにも関する。

本発明の好ましい実施形態では、プロテアーゼによりいったん消化されたライブラリーの同位体標識ポリペプチドから、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる。

応用する分野に依存して、同位体標識ポリペプチドの特異的ライブラリーを設計することができる。これらの特異的ライブラリーは、例えば、ヒト、動物、または細胞および組織などのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおける薬物効能および薬物毒性の評価、治療用タンパク質の薬物動態学的特徴（例えば、吸収、分布、代謝、排出）に関する研究、患者の疾患の診断または予後、スポーツ選手およびウマのドーピング剤の検出および同定、水、空気、および生体液または食物などの有機マトリックス中の病原体、毒素、またはアレルゲンの検出および同定を容易にすることができる。

本発明の実施形態は、ライブラリーの同位体標識ポリペプチドが、ヒト、動物、またはｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおける薬物効能または薬物毒性のバイオマーカーである同位体標識ポリペプチドのライブラリーに関する。

典型的には、ライブラリーの前記同位体標識ポリペプチドは、肝毒性、腎毒性、肺毒性、心毒性、および／または神経毒性に関するバイオマーカーであってもよい。

本発明の実施形態は、ライブラリーの同位体標識ポリペプチドが治療用タンパク質である、同位体標識ポリペプチドのライブラリーに関する。

典型的には、前記治療用タンパク質は、治療用抗体、ワクチン抗原、および免疫治療用アレルゲンからなる群から選択されてもよい。

本発明の実施形態は、ライブラリーの同位体標識ポリペプチドが１つまたは複数の疾患の診断または予後バイオマーカーである同位体標識ポリペプチドのライブラリーに関する。

典型的には、前記１つまたは複数の疾患は、心臓疾患、癌疾患、代謝疾患、神経疾患、免疫疾患、および感染症からなる群から選択されてもよい。

本発明の実施形態は、ライブラリーの同位体標識ポリペプチドが、スポーツ選手またはウマなどの動物のドーピングの直接的または間接的バイオマーカーである同位体標識ポリペプチドのライブラリーに関する。

典型的には、前記ドーピングバイオマーカーは、エリトロポエチンまたはその類似体、抗血管新生因子、成長ホルモン関連ポリペプチド、インスリン類似体、およびインスリン様成長因子からなる群から選択されてもよい。

本発明の実施形態は、ライブラリーの同位体標識ポリペプチドが１つまたは複数の病原体のバイオマーカーである同位体標識ポリペプチドのライブラリーに関する。

典型的には、前記１つまたは複数の病原体は、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、またはレジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）に属する細菌などの病原性細菌；ＨＩＶまたはヘルペスウイルスなどの病原性ウイルス；プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）またはトキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）に属する寄生虫などの寄生虫；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する真菌などの病原性真菌；およびプリオンからなる群から選択されてもよい。

本発明の実施形態は、ライブラリーの同位体標識ポリペプチドが毒素である同位体標識ポリペプチドのライブラリーに関する。典型的には、前記毒素は、ブドウ球菌毒素、連鎖球菌毒素、志賀毒素、ボツリヌス毒素、およびリシンからなる群から選択されてもよい。

本発明の実施形態は、ライブラリーの同位体標識ポリペプチドがアレルゲンである同位体標識ポリペプチドのライブラリーに関する。典型的には、前記アレルゲンは、食物アレルゲン、植物アレルゲン、および昆虫刺傷アレルゲンからなる群から選択されてもよい。

本発明のさらなる実施形態は、本発明による同位体標識ポリペプチドのライブラリーを含有する試料収集デバイスに関する。

典型的には、前記試料収集デバイスは、バイアルまたはチューブであってもよい。

分析する試料が本発明による試料収集デバイスに導入される際に、既知量の同位体標識タンパク質が試料に添加される。これにより、試料の初期標準化が可能になり、分析の正確さが増加される。

収集デバイスには、１つもしくは複数の抗凝固剤または１つもしくは複数の保存剤も含有されていてよい。

収集デバイスには、マトリックスも含有されていてよい。

典型的には、マトリックスは、本発明による同位体標識ポリペプチドのライブラリーを含んでいてもよい。ライブラリーの同位体標識ポリペプチドは、試料が本発明による収集デバイスに導入される際に、マトリックスから放出されてもよい。

好適なマトリックスの例は、ゲル、コロイド、２相系、フィルター、または膜である。

本発明の好ましい実施形態では、マトリックスは分離ゲルである。

典型的には、細胞構成要素および無細胞構成要素を有する試料を含有する収集デバイスを遠心分離すると、分離ゲルにより、体液などの試料の細胞画分および無細胞画分の分離が可能になる。ライブラリーの同位体標識ポリペプチドは、分離ゲル内のそれらの初期位置に依存して（ゲル分離器の上方または下方）、細胞画分または無細胞画分のいずれかに遊離される。

標的または非標的質量分析手法は、本発明による方法に好適である。これらの手法には、これらに限定されないが、ＤＤＡ（データ依存分析（Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ））、ＡＭＴ（精密質量および時間標識（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ ａｎｄ Ｔｉｍｅ Ｔａｇ））、ＳＲＭ（単一反応モニタリング（Ｓｉｎｇｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ））、ＭＲＭ（多反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ））、およびｓＭＲＭ（スケジュールＭＲＭ（ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ ＭＲＭ））が含まれる。

ＭＲＭ分析モードを使用して、高度に特異的で高感度の検出ならびに正確な定量化が取得された。

使用される質量分析計に関しては、任意の質量分析計（飛行時間型、四重極型、線形四重極イオントラップを含むイオントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴型、およびオービトラップ型など）を、任意のイオン化源（ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩなど）および任意選択的には任意のイオン断片化法（インソース断片化、衡突誘起解離、電子移動解離、電子捕獲解離、赤外多光子解離、黒体赤外放射解離、表面誘起解離など）と組み合わせることができる。

質量分析技術は、ＨＰＬＣ、ｎａｎｏＬＣ（１Ｄまたは２Ｄ）、キャピラリー電気泳動などのクロマトグラフィーと併用することができる。

さらなる実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）とステップ（ｄ）の間に１つまたは複数の分画ステップを含む。分画ステップの例は、質量分析法による標的ポリペプチド定量化の感度、精度、正確さ、および信頼性を向上させるすべての生化学的処理（試料脱複雑化、特定タンパク質の濃縮、電気泳動、または酵素処理など）である。分画ステップの具体的な例は、タンパク質捕獲（化学親和性および免疫親和性）、免疫除去、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは２Ｄ−ＰＡＧＥ、フリーフロー電気泳動、クロマトグラフィー（サイズ排除、イオン交換、疎水性）、クロマトフォーカシング、等電点電気泳動、複合対角線クロマトグラフィー（ＣＯＦＲＡＤＩＣ）、イコライザー技術（Ｂｉｏｒａｄ社製）である。

免疫捕捉および免疫除去を使用して、高度に特異的で高感度の検出ならびに正確な定量化が得られた。

好ましい実施形態では、標的ポリペプチドおよびその同位体標識相同体は、標的ポリペプチドとその同位体標識相同体の間のあらゆる酸化状態の違いを回避するために、（１）還元およびアルキル化されているか、または（２）Ｈ_２Ｏ_２などの酸化剤により酸化されている。したがって、質量分析は単純化される。典型的には、本発明による方法は、ステップ（ｂ）とステップ（ｄ）の間に、スパイクされた試料が還元およびアルキル化されるか、または酸化される追加的ステップを含むことができる。

標的ポリペプチドおよびその同位体標識相同体は、同じ調製アーチファクトの影響を受けるため、それらの比率は、アミノ酸酸化または誤切断などの調製アーチファクトにより変更されるべきでない。したがって、本発明は、メチオニンおよび／またはシステインを含有するポリペプチド、およびプロテアーゼで消化するのが難しいモチーフをそれらの末端に提示しているポリペプチドなどの、酸化または誤切断を起こしやすいポリペプチドの定量化に適応する。

標的ポリペプチドが、追加的な官能基、例えばグリコシル基またはホスホリル基などの翻訳後修飾を担持している場合、ＰＧＮａｓｅまたはホスファターゼなどの特異的酵素を使用して、同位体標識相同体を添加する前または添加直後に、前記翻訳後修飾を取り除くことができる。このステップにより、標的の精密な定量化を妨げ得る翻訳後修飾により導入される不均質性が除去される。

あるいは、同位体標識相同体が、標的ポリペプチドと同じ翻訳後修飾を担持してもよい。例えば、グリコシル化、ユビキチン化、またはリン酸化などの修飾の場合、同位体標識相同体のリン酸化またはユビキチン化またはグリコシル化の戦略を開発してもよい。この場合、分析により、翻訳後修飾形態の標的ポリペプチドを排他的に定量化することが可能になる。

本発明のさらなる実施形態は、試料中の標的ポリペプチドを定量化するための方法であって、前記標的ポリペプチドが１つまたは複数の翻訳後修飾を担持し、前記方法が、ステップ（ａ）とステップ（ｃ）の間に、前記標的ポリペプチドの前記１つまたは複数の翻訳後修飾を取り除く追加的ステップを含み、前記同位体標識相同体が、前記標的ポリペプチドの前記１つまたは複数の翻訳後修飾を取り除くステップにより取得されたポリペプチドの同位体標識相同体である方法に関する。

標的ポリペプチドが異なる形態（つまり、１つまたは複数の翻訳後修飾を有する状態および有さない状態）で試料中に存在する場合、異なる形態の標的ポリペプチドの定量化を可能にするために、標的ポリペプチドの翻訳後修飾を取り除くステップを有する本発明の方法および有さない本発明の方法を組み合わせることができる。

典型的には、２つの質量分析が実施される。２つの質量分析は、任意の順序で実施することができる。

一方の分析は、標的ポリペプチドの修飾をまったく除去せずに、未修飾標的ポリペプチドの同位体標識相同体でスパイクされた試料に対して実施される。この分析により、未修飾形態の標的ポリペプチドを排他的に定量化することが可能になる。

もう一方の分析は、標的ポリペプチドの翻訳後修飾が取り除かれた試料に対して実施され、この試料は、標的ポリペプチドの翻訳後修飾を取り除くステップにより取得されたポリペプチドの同位体標識相同体でスパイクされている。この分析により、修飾形態および未修飾形態の標的ポリペプチドの両方を定量化することが可能になる。

これら２つの分析結果を比較することにより、修飾形態および未修飾形態の標的ポリペプチドの相対量を推定することができ、それにより、各形態の標的ポリペプチドの量を決定することができる。実施例４および５は、この方法の例示である。

好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）で使用されるプロテアーゼによりいったん消化された同位体標識相同体から、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる。「単一同位体標識タンパク質分解性ペプチド」とは、単一のアミノ酸残基が同位体で標識されているペプチドを指す。例えば、［^１３Ｃおよび／または^１５Ｎ］−リシン残基および［^１５Ｎおよび／または^１３Ｃ］−アルギニン残基を、標識化前駆物質として使用することができる。この選択的標識化により、トリプシンによる消化後、単一標識トリプシンペプチドが導かれ、一定の質量オフセットにより特徴付けられる同位体ペプチド対の帰属が非常に単純化される。

本発明のさらなる実施形態は、同位体標識ポリペプチドおよびプロテアーゼを別々の構成要素として含むキットに関する。このキットは、本発明による方法を用いてポリペプチドを定量化するために使用することができる。好ましい実施形態では、プロテアーゼによりいったん消化された同位体標識ポリペプチドから、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる。例えば、本発明によるキットは、以下を含むことができる：
− ［^１３Ｃおよび／または^１５Ｎ］−リシンおよび／または［^１５Ｎおよび／または^１３Ｃ］−アルギニン標識ポリペプチドならびにトリプシン。

− ［^１３Ｃおよび／または^１５Ｎ］−リシン標識ポリペプチドおよびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ。

キットは、同位体標識ポリペプチド、またはプロテアーゼによる同位体標識ポリペプチドの消化により取得されたタンパク質分解性ペプチドを認識する抗体も含んでいてよい。

典型的には、同位体標識ポリペプチドを認識する抗体は、本発明による方法のステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間で実施される免疫親和性分離ステップなどの分画ステップにおいて使用することができる。それらは、標的ポリペプチドおよびその同位体標識相同体の両方を認識する。

プロテアーゼによる同位体標識ポリペプチドの消化により取得されたタンパク質分解性ポリペプチドを認識する抗体は、本発明による方法のステップ（ｃ）とステップ（ｄ）の間で実施される免疫親和性分離ステップなどの分画ステップにおいて使用することができる。それらは、同位体標識および非標識タンパク質分解性ペプチドの両方を認識する。

下記において、後述の実施例ならびに図面により本発明を例示する。

要約
本研究において、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された同位体標識全長タンパク質を絶対定量化のための標準物質として使用する革新的な戦略（ＰＳＡＱ）を提示する。それらのタンパク質標準物質は、標的タンパク質の生化学的特性と完全に一致するため、分析する試料に直接添加することができ、前分画された複雑な試料中であってもタンパク質の非常に正確な定量化を可能にする。バイオマーカーを正確に絶対定量化するための本発明者らのＰＳＡＱ方法論の能力は、公衆衛生が目的とする典型的なバイオマーカーとしての黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）スーパー抗原性毒素で汚染した水および尿試料の両方で実証された。ＰＳＡＱ方法論で得られた結果を、ＡＱＵＡペプチド戦略およびＱＣＡＴ戦略で得られた結果と比較した。

略語
ＡＡＡ：アミノ酸分析
ＡＭＴ：精密質量および時間標識
ＡＱＵＡ：絶対定量化
ＤＤＡ：データ依存分析
ＥＳＩ：エレクトロスプレー
ＭＡＬＤＩ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化法
ＭＲＭ：多反応モニタリング
ＰＳＡＱ：タンパク質標準物質絶対定量化
ＱＣＡＴ：絶対定量化用の標準ペプチドのコンカテマー
ＳＥＡ：ブドウ球菌エンテロトキシンＡ
ＳＥＢ：ブドウ球菌エンテロトキシンＢ
ＳＥＧ：ブドウ球菌エンテロトキシンＧ
ＳＥＩ：ブドウ球菌エンテロトキシンＩ
ＳＥＭ：ブドウ球菌エンテロトキシンＭ
ＳＥＮ：ブドウ球菌エンテロトキシンＮ
ＳＥＯ：ブドウ球菌エンテロトキシンＯ
ＳＲＭ：単一反応モニタリング
ｓＭＲＭ：スケジュールＭＲＭ
ＴＳＳＴ−１：毒素性ショック症候群毒素−１

実験手順
化学薬品および試薬
ＡＱＵＡ（商標）［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ］Ｌ−ロイシン標識ペプチドは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社（Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）により合成された。これらのペプチドは、供給者によってアミノ酸分析（ＡＡＡ）により定量化されていた。組換えブドウ球菌エンテロトキシンＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１は、Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｓａｒａｓｏｔａ、フロリダ州、米国）から購入した。低吸着性チューブ（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ社製、Ｂｒｕｍａｔｈ、フランス）中で、定量化標準物質および市販毒素の希釈を系統的に実施した。

同位体標識ＱＣＡＴコンカテマーの合成、精製、および定量化
図１に示されているようにＱＣＡＴタンパク質を設計した。手短かに言えば、８つのブドウ球菌スーパー抗原性毒素（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＴＳＳＴ−１、ＳＥＧ、ＳＥＩ、ＳＥＭ、ＳＥＮ、およびＳＥＯ）由来のトリプシンペプチドを、ブドウ球菌スーパー抗原間のそれらの配列固有性およびｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析におけるそれらの検出性に従って選択した。これらのペプチド配列を人工ＱＣＡＴタンパク質に連結し、逆翻訳して、対応する人工ＱＣＡＴ遺伝子を設計した（より詳細には、参考文献９を参照されたい）。ＱＣＡＴ遺伝子を、順方向鎖および逆方向鎖を包含する５３個の５’リン酸化オリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社製）から合成した（図７を参照）。合成ＱＣＡＴ遺伝子を、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製、フランクフルト、ドイツ）を用いたリガーゼ連鎖反応により構築し、表ＩＩに表示されているプライマーを使用して、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製、Ｍｅｙｌａｎ、フランス）を用いて増幅した。増幅されたＱＣＡＴ遺伝子を精製し、ＮｃｏＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）およびＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化し、Ｃ末端ヘキサヒスチジン精製用標識を提供するｐＩＶＥＸ２．３ｄベクター（Ｒｏｃｈｅ社製）に挿入した。ライゲーションは、迅速ＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用して達成した。その結果生じたプラスミドを、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、アムステルダム、オランダ）にクローニングし、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社製、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を使用して精製した。最後に、本発明者らは、それを組換えタンパク質合成に使用する前に、ＱＣＡＴ構築体配列を検査した（Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ社、Ｍｅｙｌａｎ、フランス）。ＱＣＡＴタンパク質産生は、以下の改変を施した製造業者の説明書に従って、ＲＴＳ ５００ ＰｒｏｔｅｏＭａｓｔｅｒ大腸菌ＨＹキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施した：本発明者らは、提供されていたアミノ酸混合物の代りにＲＴＳアミノ酸サンプラーキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用し、本発明者らは、Ｌ−リシンおよびＬ−アルギニンを同位体標識［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_２］Ｌ−リシンおよび［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_４］Ｌ−アルギニン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、Ａｎｄｏｖｅｒ、マサチューセッツ州、米国）に置換した。［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_２］Ｌ−リシンおよび［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_４］Ｌ−アルギニンの同位体濃縮度は、９８％^１３Ｃおよび９８％^１５Ｎであった。ＱＣＡＴタンパク質は、析出した形態で効率的に産生され、６Ｎのグアニジンに可溶化した。ＱＣＡＴ精製を、６Ｎのグアニジン中で２０ｍＭ〜２５０ｍＭイミダゾール勾配を使用して、ニッケル親和性カラム（Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）で実施した。精製後、ＱＣＡＴを、純水および１％ＳＤＳ、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５に対して連続して透析した。Ｂｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸アナライザー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製、ケンブリッジ、英国）を用いて、ＡＡＡによりＱＣＡＴ定量化を実施した。ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析およびｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析により、ＱＣＡＴ一次構造および同位体標識化をさらに評価した（図８）。

同位体標識ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１ ＰＳＡＱ標準物質の合成、精製、および定量化
フランス国立ブドウ球菌リファレンスセンター（Ｆｒｅｎｃｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）の菌株コレクションから、ＳＥＡまたはＴＳＳＴ−１遺伝子を担持する２つの黄色ブドウ球菌株を選択した。同位体標識ＳＥＢ標準物質は、その生成が公式に制限されているため合成しなかった。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、ゲノムＤＮＡを調製した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、表ＩＩに記載されている。ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１ ＰＣＲ断片を精製し、ＫｓｐＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）およびＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化し、Ｎ末端の切断可能なヘキサヒスチジン精製用タグを提供するｐＩＶＥＸ２．４ｄ発現ベクター（Ｒｏｃｈｅ社製）にクローニングした。本発明者らのＰＳＡＱ戦略は、各毒素とそのＰＳＡＱ標準物質との間の生化学的等価性に依存する。したがって、本発明者らは、Ｎ末端の切断可能なタグの恩恵を行使して、無細胞合成により産生されたタンパク質に報告されている限定Ｎ末端不均質性のポリッシングを可能にした［１６］。ＱＣＡＴについて上述したように、これらの構築体を、Ｘｌ１ｂｌｕｅにクローニングし、精製し、配列決定して、［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ］Ｌ−リシンおよび［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ］Ｌ−アルギニンの存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成に使用した。同位体標識ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１は、可溶性形態で容易に産生され、イミダゾール勾配を使用してニッケル親和性カラム（Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で精製した。製造業者の説明書に従って、ビオチン化第Ｘａ因子（第Ｘａ因子除去キット、Ｒｏｃｈｅ社製）により、各同位体標識タンパク質のＮ末端ヘキサヒスチジンタグを切断した。ストレプトアビジンをコーティングしたビーズおよびＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂の混合物を使用して、その結果生じたヘキサヒスチジンタグペプチドおよびビオチン化第Ｘａ因子の両方を単一ステップで取り除いた。これらの同位体標識ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１をＡＡＡにより定量化した。ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析により、タンパク質の一次構造および標識化効率を確認した［データ非表示］。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ品質管理
本実験室で産生した組換えＰＳＡＱタンパク質ならびに購入したＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１はすべて、Ｉｍｐｅｒｉａｌタンパク質染色およびＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色（Ｂｉｏｒａｄ社製、Ｍａｒｎｅｓ−ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、フランス）の両方を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を検査した。市販毒素の量は少量過ぎてＡＡＡ分析ができず、市販ＴＳＳＴ−１毒素は、正確なＡＡＡ定量化を妨げる著しい汚染を示していた。したがって、市販毒素は、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥで、本発明者らのＡＡＡ較正ＰＳＡＱ標準物質と比較することにより系統的に定量化した［１７］。ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ蛍光をＴｙｐｈｏｏｎ９４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で走査した（レーザー ５３２ｎｍ、フィルター ６１０ＢＰ３０）。

質量分析のための水試料調製およびトリプシン消化
飲料水試料を、５つの異なる量のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１市販毒素で汚染した。各試料を、各々９つの１２０μｌ等量に分割した。各試料の３つの等量（分析的重複測定）に、規定量のＱＣＡＴまたはＰＳＡＱ毒素標準物質のいずれかをスパイクした。配列決定等級の修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を１：２のプロテアーゼ対毒素比率で使用した２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３の溶液中で、終夜３７℃でトリプシン消化を実施した。試料を真空遠心分離により乾燥し、５％のＡＣＮ、０．２％のギ酸中に再可溶化した。ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析の前に、規定量のＡＱＵＡペプチドを、ＱＣＡＴ標準物質もＰＳＡＱ標準物質も含有しない等量に添加した。

質量分析のための尿試料調製およびトリプシン消化
３０歳の健康な女性から尿を収集し、４つの異なる量のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１市販毒素で汚染した。各試料を、各々９つの１００μｌ等量に分割した。各試料の３つの等量（分析的重複測定）を、規定量のＰＳＡＱ毒素標準物質で汚染した（図６Ａ）。各１００μｌ等量を、製造業者の説明書に従って５μｌのＳｔｒａｔａｃｌｅａｎ樹脂（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に吸着させた。上清を除去した後、樹脂に吸着したタンパク質を、２％ＳＤＳおよび５％β−メルカプトエタノールを含有する１０μｌの解重合緩衝液に直接溶出した。この段階で、ＰＳＡＱ標準物質を欠く試料の半分に、制御された量のＱＣＡＴ標準物質をロードした（図６Ａ）。９５℃で５分間の熱変性ステップの後で、試料を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、フランス）から購入したプレキャストＮｏｖｅｘ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（４〜１２％アクリルアミド勾配）に添加した。２００Ｖで３０分間ゲルを流し、３０％エタノール−７．５％酢酸中で３０分間固定し、Ｂｉｏｓａｆｅクマシーブルー（Ｂｉｏｒａｄ社製）で染色した。毒素およびＱＣＡＴを包含するゲルの２５ｋＤａ領域のタンパク質バンドを切り出し、２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３中で１５分間、その後同じ緩衝液（２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３）中の５０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮで１５分間インキュベートするサイクルを繰り返すことにより脱染した。真空遠心分離により乾燥した後、ゲル片を酸化溶液（７％Ｈ_２Ｏ_２）で１５分間インキュベートした［１８］。その後、１００％ＡＣＮで脱水する前に、ゲル片を、ＨＰＬＣ等級水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で１５分間洗浄した。ゲル内消化を、２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３中の１：２のトリプシン対タンパク質比率（配列決定等級の修飾トリプシン、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用して終夜３７℃で実施した。以下の溶液中：５０％ＡＣＮ、次いで５％ギ酸、最後には１００％ＡＣＮで受動拡散を使用して、ペプチドをゲルから抽出した。抽出物を真空遠心分離により乾燥し、ペプチドを５％ＡＣＮ、０．２％ギ酸中に再可溶化した。ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析の前に、制御された量のＡＱＵＡペプチドを、ＰＳＡＱまたはＱＣＡＴ標準物質でスパイクされていなかった試料に添加した（図６Ａ）。

ｎａｎｏＬＣ−ＭＳおよびｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
質量分析は、ＱＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ社製、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国）に接続されているｎａｎｏＬＣ装置で実施した。手短かに言えば、ペプチド消化物を、まず３００μｍ×５ｍｍのＰｅｐＭａｐ Ｃ１８プレカラム（ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ−Ｄｉｏｎｅｘ社製、サニーベール、カリフォルニア州、米国）で濃縮した。次いで、ペプチド消化物を、Ｃ１８カラム（７５μｍ×１５０ｍｍ）（ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ−Ｄｉｏｎｅｘ社製）に通し、１０％ＡＣＮ、０．１％ギ酸から８０％ＡＣＮ、０．０８％ギ酸までの勾配を用いて溶出した（実行時間６０分、流速２００ｎｌ／分）。半値全幅が９，０００〜１１，０００の分解能を有する陽イオンエレクトロスプレーイオン化モードで、質量分析計を操作した。ＭＳ／ＭＳにはデータ依存分析を使用した（各サイクルにおいて最も豊富な３つのイオン）：２分間の動的排除を用いた１ｓ質量分析法（ｍ／ｚ ４００〜１，６００）および最大４ｓＭＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ ５０〜２，０００、連続モード）。ＭＳ／ＭＳ生データを、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．０ソフトウェア（平滑化 ３／２ Ｓａｖｉｔｚｋｙ Ｇｏｌａｙ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用して処理した。その結果生じたＭＳ／ＭＳデータセットから、本実験室のＭＡＳＣＯＴサーバー（バージョン２．０）（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ロンドン、英国）を使用して、ペプチド同定を達成した。定量化は、ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．０ソフトウェアを用いて、特定の質量（±０．１Ｄａ）を抽出することにより得られた再構成クロマトグラムの未標識／標識ペプチド対のピークを積分した後で、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳデータから手動で行った。定量化に考慮した最小信号雑音比は、１５：１であった。

結果
市販毒素溶液の評価
商業的に供給されたＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１の量を、ＡＡＡにより事前に定量化した本発明者らの同位体標識毒素標準物質と比較して再評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、市販ＴＳＳＴ−１は、より高分子量のタンパク質でわずかに汚染されており、市販ＳＥＡ毒素は、本発明者らのＳＥＡ ＰＳＡＱ標準物質と同じ程度に純粋であったことが明らかになった。しかしながら、２つの異なるバッチで試験した場合、市販ＳＥＡおよびＴＳＳＴ毒素の公表濃度は、本発明者らのＡＡＡ較正ＰＳＡＱ標準物質と比較すると、一貫して過大評価されていた。したがって、これらの市販毒素の量を、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥで系統的に再評価した［１７］。

ブドウ球菌スーパー抗原性毒素マーカーペプチドの選択
ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１組換えブドウ球菌毒素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびトリプシンを用いたゲル内消化に供した。ペプチド消化物を、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびｎａｎｏＬＣ−ＭＳにより分析した。特異的トリプシンペプチド（マーカーペプチド）を、２つの毒素の各々について選択した（表Ｉ）。マーカーペプチドを、ブドウ球菌スーパー抗原間のそれらの配列固有性およびＭＳ分析におけるそれらの最適な検出性により選択した。これらのマーカーペプチドのうちの３つ（表Ｉの太字）を、１つの［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ］Ｌ−ロイシンを有するＡＱＵＡペプチドとして合成した（質量増加は７Ｄａ）。

同位体標識ＡＱＵＡペプチドを使用した、飲料水中のブドウ球菌スーパー抗原性毒素の定量化
規定量の市販ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１ブドウ球菌毒素を、飲料水に添加した。トリプシン消化を溶液中で実施した。ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析の前に、既知量のＡＱＵＡペプチドをペプチド消化物に添加した。選択した３つの未標識／標識ペプチド対（表Ｉを参照）の場合、Δｍ＝７Ｄａの質量で分離されたピークダブレット（［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ］Ｌ−ロイシンペプチド）が、ＭＳ調査で観察された。これらのピークダブレットの各々を積分して、天然ペプチド（質量ｍ）およびその対応する標識ＡＱＵＡ標準物質（質量ｍ＋Δｍ）の合計イオンシグナルを決定した。これらのシグナルの比率は、添加量に対してプロットされた推定天然毒素量の直接的算出を可能にした（図２）。理想的には、１００％の回収率が観察されるはずだった。取得されたＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１滴定曲線は、５０から７５０ｐｇに及ぶ毒素の添加量では線形であった。イオンシグナル飽和の結果、これらの値を超える線形性からの逸脱が起こった。正確さおよび精度の測定を、それぞれ、滴定曲線の傾き値およびデータの標準平均誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）値により評価した。ＡＱＵＡペプチド標準化は、高度に精密な定量化戦略である（図２）。しかしながら、正確さに関しては、ＳＥＡを標的とする２つのＡＱＵＡペプチド間に重大な相違が観察された（ＹＮＬＹＮＳＤＶＦＤＧＫペプチドの場合は傾き値＝１．３７およびＮＶＴＶＱＥＬＤＱＡＲペプチドの場合は傾き値＝０．４４）（図２Ａ）。３つの考え得るバイアスがそのような結果を説明することができる：ｉ）ＡＱＵＡペプチドは、ＡＡＡを使用して供給者により定量化され、凍結乾燥されて取得されており、供給者独自のガイドラインに従って再可溶化された。しかしながら、定量的再可溶化を当たり前のことと考えるべきでなく、ＡＡＡによる再可溶化ペプチドのその後評価は、提供されているよりさらに多くの物質を必要とするだろう。ｉｉ）ＡＱＵＡ標準物質は、試料にそれらを添加する前に高度に希釈しなければならない。それらの物理化学的特性に依存するが、純粋ペプチドの希釈は、バイアルへの吸着によりペプチドの重大な喪失に結びつく場合がある。ｉｉｉ）ＡＱＵＡペプチドを用いる標準化は、プロテアーゼ消化ステップの収率を考慮していない。このステップは、タンパク質分解に対する各タンパク質の内在的感受性のため、タンパク質間に可変性を導入する。加えて、試料間の可変性は、消化条件（試料緩衝液の組成、トリプシンの量、インキュベーション中の温度など）からも生じる場合がある。バイアルへの標準ペプチドの吸着または不完全な可溶化は両方とも、真の標準物質濃度の過大評価および結果的には標的タンパク質の過大評価に結びつく。したがって、ＡＱＵＡペプチドＹＮＬＹＮＳＤＶＦＤＧＫ（傾き値＝１．３７）によりもたらされたＳＥＡ存在量の３７％過大評価は、不完全な再可溶化および／またはこの標準ペプチドがバイアルに部分的に吸着したことに起因した可能性が高い。反対に、ペプチドＮＶＴＶＱＥＬＤＱＡＲおよびＬＰＴＰＩＥＬＰＬＫは、トリプシン消化により効率的に産生されず、したがって、ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１存在量（それぞれ、傾き値＝０．４４および０．５４）の重大な過小評価に結びついた可能性がある。これは、ＡＱＵＡペプチド戦略の主要な制限を強調する：この戦略は、天然タンパク質に由来する様々なペプチドの実際の消化収率を考慮していない。実際、この欠点は、タンパク質分解に耐性であることが知られているブドウ球菌スーパー抗原性毒素などのタンパク質の場合、特に問題である［１３］。

同位体標識ＱＣＡＴタンパク質を使用した、飲料水中のブドウ球菌スーパー抗原性毒素の定量化
本発明者らは、ブドウ球菌スーパー抗原性毒素マーカーペプチド（ＱＣＡＴ）の同位体標識コンカテマーを設計および産生した（図１Ａおよび１Ｂ）。本発明者らは、ＡＱＵＡ標準物質として以前に選択されたペプチドをすべて、この構築体に含めた。各毒素用に複数のペプチド標準物質が存在することは、定量化ロバストネスの向上を目的としていた。ＱＣＡＴを消化および分析した際、理論的に産生される１４個のマーカーペプチドのうち、１１個がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により検出され（図１Ｃ）、１３個がｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析で観察された［データ非表示］。残りのペプチド（ペプチドＰ１１、図１Ａ）は、恐らくその高い疎水性のため、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析では観察されなかった。

［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_２］−リシンおよび［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_４］−アルギニンの存在下におけるＱＣＡＴの無細胞発現は、以前の報告と一致して［１９］、高率の同位体標識組み込みをもたらした。純粋同位体標識ＱＣＡＴのｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析により、９８％を超える同位体純度が示された（図８）。さらに、［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_２］−リシンおよび［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_４］−アルギニン標識化は、定量化に必要なＬＣ−ＭＳデータの処理を大きく単純化するトリプシン切断後に、アルギニルおよびリジルペプチドの一定の質量増加に結びついた。したがって、選択されたマーカーペプチドの各々について（表Ｉ）、８Ｄａ（［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_２］−リシン標識ペプチド）または１０Ｄａ［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_４］−アルギニン標識ペプチド）の質量により分離されたピークダブレットを調査した。標識ペプチドシグナルに対する未標識の比率は、添加量に対してプロットされた推定天然毒素量の直接的算出を可能にした（図３および４）。

本発明者らは、事前のＡＱＵＡ滴定から、トリプシン消化効率が定量化の正確さに影響を及ぼしたことを示した。タンパク質分解に対するタンパク質の内在的感受性および消化の実験条件は、主要な影響パラメータを構成する場合がある。タンパク質分解条件の役割を明白にする試みでは、ＱＣＡＴキメラタンパク質を用いて２つの実験を設計した。第１の実験では、ＱＣＡＴを別々に消化し、その結果生じた消化物を標準ペプチドの混合物として使用して、毒素消化物を較正した。第２の実験では、既知量のＱＣＡＴを飲料水試料に添加し、毒素と共に共消化した。図３に示されているように、ＱＣＡＴ標準物質を別々に消化した場合、不良な線形性および高いｓ．ｅ．ｍ．が取得された。これらの結果は、線形であり再現性のある定量化のためには、標準物質を標的タンパク質と共消化することが有利であることを強調する。

したがって、飲料水中のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１の定量化を目的としたその後の実験では、ＱＣＡＴ標準物質を人為的に汚染した試料と共に共消化した。６つのマーカーペプチドをｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析で観察することができたが、それらはまったく異なるＭＳ検出性を示した。定量化感度を増強するために、本発明者らは、最も良好なｎａｎｏＬＣ−ＭＳシグナル（イオンシグナル強度、ｎａｎｏＬＣピーク形）をもたらす４つのマーカーペプチドに着目した（ＳＥＡの場合はＮＶＴＶＱＥＬＤＬＱＡＲ、ＱＮＴＶＰＬＥＴＶＫ、ＹＮＬＹＮＳＤＶＦＤＧＫ、およびＴＳＳＴ−１の場合はＬＰＴＰＩＥＬＰＬＫ）。２つのＡＱＵＡペプチド、ＹＮＬＹＮＳＤＶＦＤＧＫおよびＮＶＴＶＱＥＬＤＬＱＡＲを用いて取得されたＳＥＡ滴定とは対照的に、３つのＱＣＡＴ産生ＳＥＡペプチド標準物質は、限定的な分散を表わしたに過ぎなかった（図２Ａおよび図４Ａを比較されたい）。このより高度な一貫性は、ＱＣＡＴ構築体においてペプチド標準物質が等化学量論的に提示されていることに起因する。しかしながら、ＱＣＡＴ定量化は、２倍を超えるＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１の過小評価に結びついた（図４Ａおよび４Ｂ）。ブドウ球菌エンテロトキシンは、プロテアーゼ感受性に乏しいと考えられており［１３］、ＱＣＡＴコンカテマーは、トリプシン消化に対して高度に感受性があると報告されているため［９］、この過小評価の簡単明瞭な理論的根拠は、毒素およびＱＣＡＴタンパク質間での異なる消化速度を想定することである。

同位体標識ＰＳＡＱ標準物質を使用した、飲料水中のブドウ球菌スーパー抗原性毒素の定量化
規定量の市販ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１毒素を飲料水試料に添加した。これらの試料を、既知量のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１ ＰＳＡＱ標準物質でスパイクした。［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_２］−リシンおよび［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_４］−アルギニンの、これらの無細胞発現標準物質への組み込み収率は、９８％を超えていた［データ非表示］。ＱＣＡＴについて記載したように、水試料を溶液中で消化し、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳデータを分析した。図５に示されているように、ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１ ＰＳＡＱ標準物質は、それぞれ、３つおよび２つの未標識／標識マーカーペプチド対を用いた定量化を可能にした。これは、ＴＳＳＴ−１の配列カバー率の増加を表わした。ＰＳＡＱ標準物質を用いた較正は、高度に精密であり、測定の正確さを向上させた。ＳＥＡに関して、３つの標準ペプチドを使用して取得された結果は、高度に一貫していたが、わずかに過大評価されていた（傾き値は１．２６から１．４２に及ぶ）。これは、希釈工程中にＳＥＡ ＰＳＡＱ標準物質がバイアルに部分的に吸着したことに起因する可能性が高い。ＴＳＳＴ−１の場合には、２つの標準ペプチド、ＬＰＴＰＩＥＬＰＬＫおよびＱＬＡＩＳＴＬＤＦＥＩＲは両方とも、８１％の回収率を可能にした（傾き値＝０．８１）。

前分画された尿中のブドウ球菌スーパー抗原性毒素の定量化
最後の実験群では、本発明者らは、ブドウ球菌性毒素性ショック症候群に最も頻繁に関与する毒素であるＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１でヒト尿試料を汚染した［１３、１４］。汚染された試料を、Ｓｔｒａｔａｃｌｅａｎ樹脂で前分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより脱複雑化し、トリプシンでゲル内消化した。これらの試料を、ＰＳＡＱ毒素、またはＱＣＡＴコンカテマー、またはＡＱＵＡペプチドのいずれかでスパイクした（図６Ａ）。既知量のＰＳＡＱ標準物質を、尿試料に直接添加した。ＱＣＡＴ標準物質に関して、本発明者らは、その分子量を標的毒素の分子量（２４ｋＤａ）に調整することにより、以前に記載されているＱＣＡＴ概念［９］を改良し、その結果：（ｉ）ＱＣＡＴ標準物質は、電気泳動ゲル内で毒素標的と共に移動し、（ｉｉ）ＱＣＡＴ標準物質は、ゲル内で毒素と共に共消化され、（ｉｉｉ）ＱＣＡＴおよび毒素タンパク質分解により産生されたペプチドは、ゲルから同時に抽出される。ＱＣＡＴを２４ｋＤａに調整することは、他のブドウ球菌スーパー抗原性毒素用の定量化標準物質として潜在的に有用な追加的なペプチドの組み込みにより達成した（図１、本研究で定量化されなかった他の毒素を参照されたい）。ＱＣＡＴ構築体は、１％ＳＤＳに可溶化したため、Ｓｔｒａｔａｃｌｅａｎ樹脂で捕獲することができなかった。結果的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ直前にＱＣＡＴ構築体を試料に導入した。そのサイズにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分画ステップ後にそれらを添加することが強いられるＡＱＵＡペプチド標準物質を、以前に記載されているように［６］、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析直前に試料へ添加した。

飲料水試料中のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１の検出および定量化と比較すると、ＰＳＡＱ標準物質が使用された場合でさえ、尿試料中ではより低い配列カバー率が取得された。実際のところ、尿タンパク質により生成されたバックグラウンドが高かったため、マーカーペプチドＱＮＴＶＰＬＥＴＶＫおよびＹＮＬＹＮＳＤＶＦＤＧＫの検出が妨げられた。飲料水中では、ＳＥＡの場合は７．７ｐＭ（信号雑音比７５：１）およびＴＳＳＴ−１の場合は３．８ｐＭ（信号対雑音１５：１）まで、それぞれ毒素を定量化した。対照的に、尿中の定量化感度は、タンパク質複雑性が高いことにより、ＳＥＡの場合は０．４ｎＭ（信号雑音比３５：１）およびＴＳＳＴ−１の場合は１．３ｎＭ（信号雑音比２０：１）に制限された。図６は、添加量と比較した、異なる標準物質を用いて取得されたＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１量の推定を示す。ＡＱＵＡおよびＱＣＡＴ標準化は両方とも、尿中の毒素量を大幅に過小評価した。これは、分析工程の後期でこれらの標準物質を添加したことによる（図６Ａ）。このことは、これらの戦略の主要な限界：試料前分画とこれらが適合しないことを強調する。対照的に、ＰＳＡＱは、この複雑なマトリックス中の毒素の正確な推定を可能にした唯一の定量化戦略であった（ＳＥＡマーカーペプチドＮＶＴＶＱＥＬＤＬＱＡＲおよびＴＳＳＴ−１マーカーペプチドＬＰＴＰＩＥＬＰＬＫの場合、それぞれ、傾き値＝１．０５および１．０８）（図６Ｂおよび６Ｃ）。

考察
ＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１毒素に関して、２つのＡＱＵＡペプチドがそれらの量を著しく過小評価した（図２）。そのような観察は、ペプチド標準物質を使用する際に考慮されていないトリプシン消化効率の可変性に起因する可能性が最も高い。したがって、本発明者らのデータを考慮すると、ＡＱＵＡを、ペプチドミクス用の精巧な定量化戦略と考えることができる［２３］。しかしながら、タンパク質を正確に定量化するためには、本発明者らは、この戦略が、低複雑性試料と、トリプシン消化効率が特徴付けられている標的タンパク質とに制限されるべきであると考える。ＡＱＵＡペプチドとは対照的に、ＱＣＡＴ定量化は、同一タンパク質の異なるマーカーペプチド間でより一貫した結果をもたらした（図４）。ＱＣＡＴは、標的と共消化された際に、消化条件により誘導されたプロテアーゼ活性の可変性を補正することも可能にした（図３）。しかしながら、本質的にはタンパク質分解の感受性が異なるため、ＱＣＡＴ標準物質は、それにもかかわらず毒素の過小評価を招いた（図４）。最後に、ＰＳＡＱ戦略は、飲料水中の毒素定量化について、ペプチド間の一貫性および正確さの両方の点から、ＡＱＵＡおよびＱＣＡＴ手法に対する著しい優位性を実証した（図５）。ＳＥＡ存在量が２６から４２％過大評価されるのは、希釈工程（スパイク前の終濃度：１０ｎＭ）中にＳＥＡ ＰＳＡＱ標準物質がバイアルに吸着することに起因する可能性がある。したがって、尿試料中のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１滴定の両方について、優れた正確さが観察された（図６Ｂおよび６Ｃ）。飲料水試料と比較すると、尿試料をスパイクするために使用されたＰＳＡＱ標準物質溶液は、よりいっそう濃縮されており（２００ｎＭ）、バイアルへのタンパク質吸着が防止された可能性がある。ＱＣＡＴおよびＡＱＵＡ戦略の両方の場合、任意の所与のタンパク質の定量化に使用するのに最も良好なペプチド（複数可）の選択は、経験に裏付けられた推測に基づくことが非常に多い。生物学的マトリックスおよび前分画戦略に応じて、単一の標準ペプチドを選択することは不適当であり得る（例えば、標準ペプチドが他の支配的なペプチドにより抑制される場合）。ＰＳＡＱ戦略は、最大のタンパク質カバー率を可能にし、これらの考え得る問題を回避し、標的のよりロバストな定量化を提供する。ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＨｕｎｔｅｒが小型タンパク質について示唆しているように［１０］、良好なペプチドリポーターを見出すのが困難であることから、トリプシンを、ペプチド消化用の異なるプロテアーゼと交換することを強いられる場合がある。長期にわたる研究では、ＱＣＡＴまたはＡＱＵＡ標準物質は、定量化標準物質の選択を凍結する一方で、ＰＳＡＱ戦略は代替的ペプチド標準物質への道を切り開く。

ＰＳＡＱ戦略は、前分画および消化収率が統合される可能性があるため、生体液中のバイオマーカーの定量分析にとってこの上なく魅力的である。この向上は、Ｓｔｒａｔａｃｌｅａｎ樹脂捕獲およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ前分画後に、複雑な試料（例えば尿）中のＳＥＡおよびＴＳＳＴ−１毒素を比較定量化することにより実証された。飲料水試料と比較して、尿試料のタンパク質複雑性は、いくつかの毒素マーカーペプチドのＭＳ検出を妨げる高バックグラウンドおよびイオン化競合性を生み出した。残りのマーカーを用いると、ＡＱＵＡおよびＱＣＡＴは両方とも、毒素量を大幅に過小評価した。ＡＱＵＡ戦略がタンパク質標的を過小評価する傾向は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ前分画後に大幅に悪化した。このことは、ＱＣＡＴを毒素標的と共に電気泳動および共消化すること、ならびに標識／未標識ペプチドをゲルから同時抽出することを可能にする本発明者らのＳＤＳ−ＰＡＧＥ適合的設計にもかかわらず、ＱＣＡＴにも当てはまった。最終的に、ＰＳＡＱ標準物質だけが、この前分画プロトコール後に信頼性のある定量化をもたらした。最も強力なＭＳ技術を用いる場合でさえ、脱複雑化することは、中程度から低存在量のタンパク質の定量化前の必須ステップとして出現することが多い［１０、１１］。実際、ＡＱＵＡ定量化は、前分画したタンパク質試料で実現されることが多い［６、２１］。本研究で例示されているように、これらの前分画ステップによる標的タンパク質回収の収率に関する不確実性は、ＰＳＡＱ標準物質を使用すると効率的に補正される重大な定量化バイアスを導入する場合がある。このことは、ＡＱＵＡおよびＱＣＡＴ手法に優るＰＳＡＱ戦略の主要な利点を構成する。

結論として、本発明者らは、生体液などの複雑な試料中のバイオマーカー絶対定量化のための既存手法に優る本発明者らのＰＳＡＱ戦略の利点を実証した。ＭＳ分析の高感度を考慮すれば、単回の中規模発現実験により、数千の定量化分析のために十分な量の所与のＰＳＡＱ標準物質が提供される。さらに、必要であればいつでも、定量的蛍光検出と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの簡単な品質管理を実施することができる。

ＰＳＡＱ戦略を使用した、血清試料中のブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）の絶対定量化。

（血清試料をＳＥＡで汚染し、規定量のＰＳＡＱ標準物質（同位体標識ＳＥＡ）でスパイクした。試料は、ＭＡＲＳスピンカートリッジ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して、６つの最も豊富なタンパク質を除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。トリプシンでゲル内消化した後、ペプチドを抽出し、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳを使用して分析した（図１２Ａ）。ＳＥＡ定量化を、未標識／標識ペプチド対（ＱＮＴＶＰＬＥＴＶＫおよびＮＶＴＶＱＥＬＤＬＱＡＲペプチド対）の抽出イオンクロマトグラムから導出した。考慮したプロテオタイプペプチド対の両方について、血清試料中のＳＥＡ推定量を、スパイクした量に対してプロットした（図１２Ｂ）。

ブドウ球菌食中毒発生の調査を向上させるためのタンパク質標準物質の絶対定量化（ＰＳＡＱ）
要約
ブドウ球菌エンテロトキシンは、食物媒介性疾患の主要な原因物質である。リスク評価または食中毒発生調査のために食物残余物中でそれらを検出することには、包括的な免疫学的ツールの欠如という難点がある。本研究では、本発明者らは、免疫捕捉と、同位体標識エンテロトキシンをＭＳに基づく分析の内部標準物質として使用するＰＳＡＱ戦略との組合せが、食物マトリックス中のこれらの汚染物質を特異的に同定および定量化するために有力であることを実証する。この手法は、ブドウ球菌食中毒発生の解明を著しく向上させる。

本発明者らは、汚染された食物試料中の微量ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、食中毒の主要物質の検出および絶対定量化のために、ＰＳＡＱ戦略と免疫捕捉とを組み合わせた。

ブドウ球菌食中毒（ＳＦＰ）は、黄色ブドウ球菌株により食物中で事前形成されたブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）の摂取に起因する一般的な食物媒介性疾患である。合衆国において、ＳＥは、毎年１８５，０００件の食中毒の原因である。フランスにおいては、ブドウ球菌エンテロトキシンは、サルモネラに次ぐ食物媒介性疾患の２番目の原因を示している。現在まで、１９種のブドウ球菌エンテロトキシンおよび関連毒素（「エンテロトキシン様」タンパク質）が記載されている。ＳＦＰに関与した食物から単離された菌株は、主にＳＥＡ、より少ない程度にＳＥＤ、ＳＥＢ、およびＳＥＣを産生する。しかしながら、多数のＳＥおよび関連毒素に対する特異的な診断ツールが欠如しているため、多くのＳＦＰ発生は未解明のままである。ＳＦＰは、食物消費後の１から８時間の間に生じる胃腸炎により臨床的に特徴付けられる。ＳＥが食物残余物中で検出される場合、ＳＦＰの生物学的診断は決定的である。ＳＥの検出は、古典的には免疫学的技術（ＥＬＩＳＡ）を使用して実施される［Ｈｅｎｎｅｋｉｎｎｅら、Ｊ ＡＯＡＣ Ｉｎｔ ２００７年、第９０巻、７５６〜７６４頁］。しかしながら、ＳＥの免疫学的検出は、重要な欠点を示す。まず、ＳＥ間の配列および構造が高度に相同的であるため、ごく少数の特異的抗体しか利用可能ではない。次に、食物マトリックスの複雑性により、多くの場合非特異的反応が起こる［Ｈｅｎｎｅｋｉｎｎｅら、Ｊ ＡＯＡＣ Ｉｎｔ ２００７年、第９０巻、７５６〜７６４頁］。最後に、周知のＩｇＧ結合性ブドウ球菌プロテインＡは、ＳＥと共に食物中に共分泌され、アッセイに干渉する場合がある。結果的に、市販のキットは、５つのエンテロトキシン（ＳＥＡからＳＥＥ）の検出にのみ利用可能であり、複雑な食物マトリックス分析には、感度、特異性、および適合性の点から重大な制限を被っている。

したがって、本発明者らは、ＳＦＰ発生を特徴付けるために、ＥＬＩＳＡの代替としてＰＳＡＱ法の可能性を調査した。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）増殖およびブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）産生のリスクが高いことを示すため、半硬質牛乳チーズをモデルとして最初に選択した。チーズモデルは、フランス国立農業研究所（Ｆｒｅｎｃｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｊｏｕｙ ｅｎ Ｊｏｓａｓ、フランス）の「乳酸菌および日和見病原体」実験室で製造された。ＳＥＡ産生黄色ブドウ球菌株を、加工前の牛乳に接種した。乳製品管理の公式手順に従って、１個のチーズ（２５ｇ）をホモジナイズし、カゼインを除去し、抽出物をポリエチレングリコールに対する透析により濃縮した（より詳細には、参考文献Ｈｅｎｎｅｋｉｎｎｅら、Ｊ ＡＯＡＣ Ｉｎｔ ２００７年、第９０巻、７５６〜７６４頁を参照されたい）。この抽出物を、参照用の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、または本発明者らのＭＳに基づくＰＳＡＱ法を使用して、同時に調査した。ＰＳＡＱ分析の場合、［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_２］Ｌ−リシンおよび［^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_４］Ｌ−アルギニンで同位体標識した１００ｎｇのＳＥＡ ＰＳＡＱ標準物質で、チーズ抽出物をスパイクした。スパイクされたチーズ抽出物を、５つのエンテロトキシン（ＳＥＡからＳＥＥ）を捕獲するように設計された免疫親和性カラム（Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、リヨン、フランス）に通した。溶出液を収集し、短時間のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。内在性エンテロトキシンおよびその同位体標識対応物を含有する、ゲルの２５〜３０ｋＤａ領域を切り出し、トリプシンでの消化に供した。タンパク質分解性ペプチドを抽出し、ＱＴｏＦ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ社製、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国）を使用したｎａｎｏＬＣ−ＭＳで分析した。免疫親和性カラムは大きな範囲のエンテロトキシン捕獲を可能にする一方で、ＭＳ分析は、各タンパク質に固有なペプチド（つまりプロテオタイプペプチド）の同定によりエンテロトキシンの高度に特異的な帰属を可能にする。１つのそのようなプロテオタイプペプチド（ペプチドＮＶＴＶＱＥＬＤＬＱＡＲ）がチーズ試料中で検出され、内在性ＳＥＡの存在を特異的に示した。内在性／標識ペプチド抽出イオンクロマトグラムの積分ピークを比較することにより、定量化を実施した（ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア、Ｗａｔｅｒｓ社製）。内在性ＳＥＡは、チーズ１グラム当たり２．５±０．２ｎｇで検出され（ｎ＝３）、ＥＬＩＳＡ推定と一致した（２．９±０．３ｎｇ／ｇ；ｎ＝３）。

この概念証明を越えるために、本発明者らは、同じＰＳＡＱ戦略を適用して、天然に汚染されている食物マトリックスを調査した。２００６年のフランスにおける食中毒発生（１１人の患者が宣言された）に関与した中国のデザート（ココパール）は、フランス食品安全局（ＡＦＳＳＡ）により収集された。この試料から、ＡＦＳＳＡは、ＳＥＡをコードする遺伝子を担持する黄色ブドウ球菌株を単離した。タンパク質レベルでＳＥＡの存在を確認するために、ココパール試料（２５ｇ）をホモジナイズし、遠心分離にかけ、上清をポリエチレングリコールに対する透析により濃縮した。ＥＬＩＳＡ法またはＰＳＡＱ法を同時に使用して、抽出物を検査した。ＭＳ分析の前に、抽出物を、１００ｎｇのＳＥＡ ＰＳＡＱ標準物質でスパイクし、免疫濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびトリプシン消化に供した。タンパク質分解性ペプチドを、Ｑ−ＴｏＦを用いたｎａｎｏＬＣ−ＭＳ分析で分析した（図９）。２つのプロテオタイプペプチドが、内在性ＳＥＡ（ペプチドＹＮＬＹＮＳＤＶＦＤＧＫおよびＮＶＴＶＱＥＬＤＬＱＡＲ）の存在を特異的に示した。これらのペプチドを使用すると、ＳＥＡは、食物１グラム当たり１．４７±０．０５ｎｇまで定量化された（ｎ＝３）。この結果は、同一試料から取得された１．３±０．２ｎｇ／ｇ（ｎ＝３）のＥＬＩＳＡ推定と一致し、公表されている症状とも一致した（Ｉｋｅｄａら Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００５年、第７１巻、２７９３〜２７９５頁によると、毒素用量＝４０ｎｇ）。

本研究において、本発明者らは、食物マトリックス中のブドウ球菌エンテロトキシンＡを特異的に検出および定量化するために、ＰＳＡＱ戦略の能力を利用した。同位体希釈原理をＰＳＡＱ標準物質と共に使用することにより、正確な定量化が可能になる。したがって、ＰＳＡＱ分析および確立されているＥＬＩＳＡは、類似した推定をもたらし、同様の感度を示した。そのうえ、ＰＳＡＱ方法論は、プロテオタイプペプチド検出に関連して比類のない検出特異性を示した。したがって、この方法論は、他のＳＥに対して容易に拡張することができ、イムノアッセイの魅力的な代替法を代表する。

ＥＬＩＳＡ推定と関連した比較を実施するために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ検査用に調製したポリエチレングリコール濃縮食物抽出物中に、ＰＳＡＱ標準物質をスパイクしなければならなかった。しかしながら、ＥＬＩＳＡ手法とは対照的に、ＰＳＡＱ標準物質は、分析工程の一番初めで食物ホモジネートに添加することができ、抽出／濃縮手順中の最終的なエンテロトキシン喪失を評価することが可能である。この簡単な改変により、食物中の毒素定量化の正確さはさらに増加するだろう。

本実験は、Ｑ−ＴｏＦ質量分析計で実施し、確立されている市販ＥＬＩＳＡキットの感度限界に匹敵する感度限界をもたらした。しかしながら、ＭＳ分析にトリプル四重極装置で多反応モニタリング（ＭＲＭ）法を使用すると、検出感度が少なくとも１０倍さらに低くなると予測される。この分析モードは、同定および定量化の配列カバー率も増加させるはずである。

現在、本発明者らは、ＳＦＰ調査に特化したＰＳＡＱ標準物質ライブラリーを構成するために、一群の同位体標識全長ＳＥを合成中である。これらのエンテロトキシンＰＳＡＱ標準物質は、天然に汚染されている試料中に同時にスパイクされるだろう。免疫捕捉の後、それらにより、原因とみなされているエンテロトキシン（複数可）の多重検出および定量化が可能になろう。

結論として、ＰＳＡＱ戦略は、既存の免疫学的ツールで解明されていないＳＦＰ発生を調査する理想的な代替方法論を代表する。これにより、あまり特徴付けられていないブドウ球菌エンテロトキシンの消化病原性の評価が可能になる。

タンパク質リン酸化を定量化するための「ホスホ−ＰＳＡＱ」戦略。

ある戦略は、ＰＳＡＱ戦略を、翻訳後修飾（ＰＴＭ）、例えばリン酸化を示すタンパク質の定量化に適応することを可能にすることができる。リン酸化が不安定性であること、および従来の質量分析法ではリン酸化ペプチドの検出が不良であることの両方の理由で、ホスホ−プロテオミクスは、ホスホ−ペプチド濃縮および特化した質量分析戦略のための特定のプロトコールを必要とする場合がある。典型的には、ＬＣ−ＭＲＭ（多反応モニタリング）を使用することができる。ＰＳＡＱを用いて、本発明者らは、所与のタンパク質の様々なＭＳ観察可能ペプチドの絶対濃度を推定することができる。リン酸化（またはより一般的には任意のＰＴＭ）の非存在下では、これらのペプチドはすべて、等モル濃度のはずである（図１０）。翻訳後修飾は、この等化学量論的な分布に変化を導入するだろう。この変化は、任意のペプチド修飾に起因する場合がある。したがって、全リン酸化のホスファターゼ抑制後に、ペプチド分布を第２のＭＳで分析すると、リン酸化の存在を確認／無効にすることができる。この方法は、標的タンパク質中のリン酸化ペプチドの発見および定量化の両方を可能にする。ホスファターゼ処理をＨ_２ ^１８Ｏの存在下で実行すると、この方法は、リン酸化アミノ酸残基の精密な同定をも可能にすることができる。

「グリコ−ＰＳＡＱ」：グリコシル化タンパク質の定量化へのＰＳＡＱの適応
多くのタンパク質、とりわけ、確立された潜在的なバイオマーカーは、グリコシル化されている。これは、癌バイオマーカー癌胎児抗原（ＣＥＡ）または前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の場合に当てはまる。本発明者らは、ＰＳＡＱ定量化をグリコシル化タンパク質に適応させるための戦略を起想した。生体試料では、所与のタンパク質のグリコシル化は、多くの場合不均質である。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察される、グリコシル化タンパク質バンドのブロードニングにより十分に例示される。タンパク質グリコシル化の生化学的不均質性は、異なってグリコシル化されたタンパク質がＬＣ−ＭＳ分析に先立つ生化学的ステップで不均質集団として振る舞えば、ＬＣ−ＭＳ定量化を台無しにする場合がある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明白に証拠付けられるため、タンパク質の酵素的脱グリコシル化は、均質性を回復するための良好な方法である。さらに、リソソーム内タンパク質の例から、グリコシル化が、プロテアーゼ攻撃に対する良好な防御であることを理解できる。これにより、トリプシン消化効率に対する影響も異なる場合がある。したがって、本発明者らは、ＰＧＮａｓｅ−Ｆのような効率的なＮ−グリコシダーゼを用いた生体物質の処理を、グリコシル化タンパク質に特化したＰＳＡＱ定量化プロトコールの実験フローチャートの初期に含めるべきであると考える。しかしながら、この脱グリコシル化ステップは、潜在的に３つの制限を導入する：ｉ）定量化には、所与のタンパク質の特異的脱グリコシル化収率を評価すべきであり、ｉｉ）ＰＧＮａｓｅ−Ｆ脱グリコシル化は、Ｎ−グリコシル化アスパラギンをアスパラギン酸に転換する。この点は、特化したＰＳＡＱを設計する際に考慮するべきであるが、ｉｉｉ）脱グリコシル化は、一般的に、タンパク質の総合的な水溶性を減少させる。これは、適切な可溶化緩衝液の選択により修正することができる。定量化するグリコシル化タンパク質を考慮し、これらの制限を考慮に入れて、以下のワークフローを有利に確立することができる：報告されている公知のＮ−グリコシル化点で、アスパラギンをアスパラギン酸に置換して、ＰＳＡＱ標準物質を設計する。このＰＳＡＱ標準物質および広範に脱グリコシル化された天然タンパク質を使用して、脱グリコシル化ペプチドの絶対量を、そのタンパク質の他の未グリコシル化ペプチドの絶対量と比較する。脱グリコシル化が完全であれば、ペプチドはすべて等モルであるはずである（図１１を参照）。

参考文献
本出願の全体にわたって、種々の参考文献は、本発明が関する現況技術を記載している。これらの参考文献の開示は、これにより参照によって本開示に組み込まれる。

Claims (19)

1. 試料中の標的ポリペプチドを定量化するための方法であって、
   （ａ）分析する試料を準備するステップと、
   （ｂ）前記標的ポリペプチドの既知量の同位体標識相同体を前記試料に添加し、それにより、スパイクされた試料を得るステップと、
   （ｃ）前記スパイクされた試料をプロテアーゼ活性で処理して、複数のタンパク質分解性ペプチドを得るステップと、
   （ｄ）質量分析法（ＭＳ）により、ステップｃ）で得られた前記タンパク質分解性ペプチドを分析するステップと、
   （ｅ）対応する未標識タンパク質分解性ペプチドに対する、同位体標識タンパク質分解性ペプチドの比率を決定するステップと、
   ｆ）前記比率および前記同位体標識相同体の既知量から、前記試料中の前記標的ポリペプチドの量を算出するステップと
   を含む方法。
2. 前記同位体標識相同体が、無細胞抽出物の使用により同位体標識される、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ｃ）がプロテアーゼにより実施される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記標的ポリペプチドが、バイオマーカー、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、植物タンパク質、酵母タンパク質、カビタンパク質、真菌タンパク質、動物タンパク質、または毒素である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
5. 前記標的ポリペプチドがスーパー抗原性毒素である、請求項４に記載の方法。
6. 前記試料が、生体液、組織ホモジネート、細胞ホモジネート、細胞培養上清、水、食物、または生物収集液から取得される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
7. ステップ（ｂ）とステップ（ｄ）の間に１つまたは複数の分画ステップを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
8. 前記標的ポリペプチドおよびその同位体標識相同体が、前記標的ポリペプチドとその同位体標識相同体の間の酸化状態の違いを回避するために、還元およびアルキル化されているか、または酸化剤により酸化されている、前記請求項のいずれかに記載の方法。
9. 前記標的ポリペプチドが１つまたは複数の翻訳後修飾を担持し、前記方法が、ステップ（ａ）とステップ（ｃ）の間に、前記標的ポリペプチドの前記１つまたは複数の翻訳後修飾を取り除く追加的ステップを含み、前記同位体標識相同体が、前記標的ポリペプチドの前記１つまたは複数の翻訳後修飾を取り除く前記ステップにより取得されたポリペプチドの同位体標識相同体である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
10. ステップ（ｃ）で使用される前記プロテアーゼによりいったん消化された前記同位体標識相同体から、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
11. 同位体標識ポリペプチドおよびプロテアーゼを別々の構成要素として含むキット。
12. 前記プロテアーゼによりいったん消化された前記同位体標識ポリペプチドから、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる、請求項１１に記載のキット。
13. 前記同位体標識ポリペプチドまたは前記プロテアーゼによる前記同位体標識ポリペプチドの消化により取得されたタンパク質分解性ペプチドを認識する抗体をさらに含む、請求項１１または１２に記載のキット。
14. 同位体標識ポリペプチドのライブラリー。
15. 前記ライブラリーの前記同位体標識ポリペプチドがすべて、同じプロテアーゼにより切断可能であり、前記プロテアーゼによりいったん消化された前記ライブラリーの前記同位体標識ポリペプチドから、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる、請求項１４に記載のライブラリー。
16. 同位体標識ポリペプチドのライブラリーおよびプロテアーゼを別々の構成要素として含むキット。
17. 前記プロテアーゼによりいったん消化された前記ライブラリーの前記同位体標識ポリペプチドから、単一同位体標識タンパク質分解性ペプチドが導かれる、請求項１６に記載のキット。
18. 請求項１４または１５に記載の同位体標識ポリペプチドのライブラリーを含有する試料収集デバイス。
19. 請求項１４または１５に記載の同位体標識ポリペプチドのライブラリーを含むマトリックスを含有する、請求項１８に記載の収集デバイス。

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