JP2011518175A - 骨形成タンパク質の産生増進法 - Google Patents

Abstract

組換えタンパク質産生を改善するための方法およびプロセスを提供する。該方法は、増殖因子、特に、ＢＭＰ−２などの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むＴＧＦ−βスーパーファミリーの増殖因子の産生に有用である。鉄が少なくとも２．２５μＭの濃度で存在し、そしてピリドキサールが存在している場合、ピリドキサールが培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５％未満を構成する培地中で、適切な宿主細胞を培養する。

Description

[0001]本出願は、本明細書にその全体が援用される、２００８年４月１７日出願の米国仮出願第６１／０４５，６４３号のより早い出願日の利益を主張する。
[0002]本発明は組換えタンパク質産生の分野に関する。特に、本発明は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むペプチド増殖因子を産生する方法に関する。

[0003]トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーは、生理学的に重要な増殖制御および形態形成特性を所持する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：１３３−１４６（１９９４）； Ｈｏｏｄｌｅｓｓら， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２８：２３５−２７２（１９９８））。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、増殖および分化因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである（Ｒｏｓｅｎら， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：９１９−９２８（２００２））。ＢＭＰが存在する最初の証拠のいくつかは、脱ミネラル化された骨が、筋肉内に移植された際に新しい骨を誘導する能力を有することであった（Ｕｒｉｓｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ １５０：８９３−９９（１９６５））。ＢＭＰは、続いて、脱ミネラル化骨より生化学的に精製され（Ｗａｎｇら， ＰＮＡＳ ８５：９４８４−９４８８（１９８８））、そして精製されたタンパク質のペプチド断片から設計された放射標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによってクローニングされた（Ｗｏｚｎｅｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１５２８−１５３４（１９８８））。クローニングされたＢＭＰは、組換え的に発現されてきており、そしてその機能を保持する。例えば骨などの天然供給源からの生化学的精製には、困難、純度の欠如、および低収量がつきものであるため、ＢＭＰは、典型的には、組換え的に産生される。

Ｋｉｎｇｓｌｅｙら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：１３３−１４６（１９９４） Ｈｏｏｄｌｅｓｓら， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２８：２３５−２７２（１９９８） Ｒｏｓｅｎら， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：９１９−９２８（２００２） Ｕｒｉｓｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ １５０：８９３−９９（１９６５） Ｗａｎｇら， ＰＮＡＳ ８５：９４８４−９４８８（１９８８） Ｗｏｚｎｅｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１５２８−１５３４（１９８８）

[0004]ＢＭＰ−２および関連タンパク質ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１としても知られる）、ＢＭＰ−８（ＯＰ−２としても知られる）、ＢＭＰ−９、およびＢＭＰ−１０は、骨および軟骨組織の増殖および修復を仲介することが知られる。ＢＭＰ−２は、現在、開口し、そして癒合していない骨折の治療に、脊椎固定術に（ＩＮＦＵＳＥ^ＴＭ医療機器の一部として）、そして歯科矯正適応症に、臨床的に使用されている。この重要な療法剤の入手可能性およびコストは、部分的に、その産生に用いられる哺乳動物細胞培養の力価に支配される。しかし、「実験室規模」の適切な細胞力価を生じる培養条件は、これらのタンパク質に関する需要増大を満たすのに必要な大量製造規模にはスケールアップ不能である。したがって、産生中の細胞力価を増加させることによって、ＢＭＰ−２などの組換えタンパク質を産生する方法であって、そして製造規模で使用するのに適した前記方法に関する必要性が存在する。

[0005]本発明は、高い宿主細胞力価を補助して、タンパク質収量の増加を生じることによって、製造規模で組換えタンパク質を産生する方法を提供する。本発明は、部分的に、微量金属が補充された、定義された培地が、製造規模でのバッチ−リフィード（ｂａｔｃｈ−ｒｅｆｅｅｄ）・プロセスによってバイオリアクター系において培養されるＣＨＯ細胞のより高い採取細胞力価を補助するという発見に基づく。金属の補充がない場合、同じ培地は、小規模（実験室規模）バイオリアクターでの増殖を補助したが、製造規模バイオリアクターへの「スケールアップ」には失敗した。力価一貫性は、培地中のピリドキサールをピリドキシンと交換した場合にさらに改善された。

[0006]したがって、１つの側面において、本発明は、組換えタンパク質発現法であって、鉄が少なくとも約２．２５μＭの濃度で存在し、そしてピリドキサールが存在している場合、ピリドキサールが培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５％未満を構成する、定義された培地中で、関心対象のタンパク質をコードする核酸を含む適切な宿主細胞を培養し、そして関心対象のタンパク質を回収する工程を含む。いくつかの態様において、鉄は少なくとも約５μＭの濃度で存在する。培地は少なくとも約１０ｎＭの濃度の銅および少なくとも約２μＭの濃度の亜鉛をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、ピリドキサールが培地中に存在している場合、ピリドキサールは約１５μＭ未満の濃度で存在する。特定の態様において、ピリドキサールが存在している場合、ピリドキサールは、約１５μＭ未満の濃度で存在し、そして培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５％未満を構成する。いくつかの態様において、ピリドキサールが培地中に存在している場合、ピリドキサールは、約１５μＭ未満の濃度で存在するか、または培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５％未満を構成する。

[0007]いくつかの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。特定の態様において、関心対象のタンパク質は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー、例えばＢＭＰ、例えばＢＭＰ−２である。

[0008]特定の態様において、培地は、少なくとも約１５μＭの総濃度のビタミンＢ６を含有する。いくつかの態様において、ピリドキサールは、培地中に存在している場合、培地中のビタミンＢ６の総モル濃度の約５５％以下を構成する。より詳細な態様において、ビタミンＢ６は、約１．２未満のピリドキサール対ピリドキシン比を有する。さらにより詳細な態様において、培地はピリドキサールをまったく含有しない。

[0009]特定の態様において、本発明は、ＢＭＰ−２産生法であって、少なくとも約２．５μＭの濃度の鉄および少なくとも約１５μＭの濃度のビタミンＢ６を含み、そしてピリドキサールが存在している場合、ピリドキサールが培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５％未満を構成する培地中で、ＢＭＰ−２タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む適切な宿主細胞を培養し、そして次いで、ＢＭＰ−２タンパク質を回収する工程を含む、前記方法を提供する。

[0010]いくつかの態様において、培地はまた、少なくとも約２０ｍＭの総濃度のアミノ酸も含有してもよい。培地は、少なくとも約０．５ｍＭの濃度のＬ−システインを含有してもよい。特定の態様において、培地はまた、約０．３ｍＭ以下の濃度のＬ−グルタミン酸も含有する。

[0011]特定の態様において、培地はまた、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌの濃度のポリアニオン性化合物、例えばデキストラン硫酸も含有してもよい。いくつかの態様において、培地は、約２６０〜３８０ｍＯｓｍの間の初期モル浸透圧濃度を有してもよい。

[0012]特定の態様において、本発明の方法は、バッチ・リフィード・プロセス中で増殖する細胞を培養するのに適している。特定の態様において、少なくとも約３Ｌの容量の攪拌タンクバイオリアクター中で細胞を増殖させる。さらにより詳細な態様において、培養温度は、本質的に一定に維持する。いくつかの態様において、本発明の方法は、少なくとも約４．０ｘ１０^６細胞／ｍＬの採取細胞密度を補助する培地を使用する。

[0013]したがって、１つの側面において、本発明は、ＢＭＰ−２産生のためのプロセスまたは方法であって、少なくとも約２．５μＭの濃度の鉄、少なくとも約２０ｍＭの総濃度のアミノ酸、少なくとも０．５ｍＭの濃度のＬ−システイン、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌの濃度のデキストラン硫酸、および少なくとも約１５μＭの濃度のビタミンＢ６を含み、そしてピリドキサールが存在している場合、ピリドキサールが培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５％未満を構成する培地中で、ＢＭＰ−２タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有するＣＨＯ細胞を培養し；そして次いで、ＢＭＰ−２タンパク質を回収する工程を含む、前記方法を提供する。特定の態様において、培地は、少なくとも約１０ｎＭの濃度の銅をさらに含んでもよい。さらにより詳細な態様において、培地は、少なくとも約０．２μＭの濃度の亜鉛をさらに含んでもよい。

[0014]いくつかの態様において、本発明は、ＢＭＰ−２を産生する方法であって、少なくとも約２．５μＭの濃度の鉄および少なくとも約１５μＭの濃度のビタミンＢ６を含み、そしてピリドキサールが存在している場合、ピリドキサールが培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５％未満を構成する培地中で、ＢＭＰ−２タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む適切な宿主細胞を培養し、そして次いで、ＢＭＰ−２タンパク質を回収する工程を含む、前記方法を提供する。

[0015]いくつかの態様において、本発明の任意の方法は、関心対象のタンパク質、例えばＢＭＰ−２を精製するかまたは単離する工程をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、精製または単離タンパク質を、例えば薬剤として配合してもよい。特定の態様において、精製は、１以上のカラムクロマトグラフィー精製、例えばブチルセファロースカラム精製を含む。

[0016]別の側面において、本発明は、本発明の任意の方法によって産生される産物を提供する。いくつかの態様において、産物を用いて、例えば骨増殖、生成、治癒、または修復を促進することによって、骨組織の欠陥、傷害、疾患、または障害を有する患者、例えば哺乳動物、例えばヒトを治療するか、または治療するための薬剤を調製してもよい。

[0017]別の側面において、本発明は、本明細書に実質的に記載するような細胞培地を提供する。特定の態様において、細胞培地は、表３および４に記載するものに実質的に類似である。

[0018]図１は、３Ｌおよび１６０Ｌバイオリアクター中のバッチ・リフィード・プロセスにおける、長期に渡る細胞密度のプロットである。 [0019]図２は、補充した鉄および銅を含む、および含まない培地中で増殖させた細胞に関する１６０Ｌバイオリアクター中のバッチ・リフィード・プロセスにおける、長期に渡る細胞密度のプロットである。 [0020]図３は、鉄および銅を補充した培地中で増殖させた細胞に関する、１６０Ｌバイオリアクター中のバッチ・リフィード・プロセスにおける、長期に渡る生存細胞密度のプロットである。 [0021]図４は、異なる培地および異なる金属濃度で、フラスコ中で増殖させた細胞の増殖速度を示す、一連の棒グラフである。 [0022]図５は、異なる培地および異なる鉄濃度で、培養ディッシュ中で増殖させた細胞の増殖速度を示す、一連の棒グラフである。 [0023]図６は、本発明の方法にしたがって増殖させた細胞の２５００Ｌバイオリアクター中のバッチ・リフィード・プロセスにおける、長期に渡る採取細胞密度のプロットである。点線は、以前のプロセスの平均採取密度を示す。 [0024]図７は、図６に記載する培養に関する、長期に渡るｒｈＢＭＰ−２採取力価のプロットである。点線は、以前のプロセスの平均ｒｈＢＭＰ−２標準化採取力価を示す。

[0025]鉄、銅、および亜鉛が補充され、デキストラン硫酸もまた含有し、ビタミンＢ６が培地中に少なくとも１５μＭの濃度で存在し、そしてビタミンＢ６中のピリドキサール対ピリドキシン比が１．２未満である培地中で、ＢＭＰ−２発現細胞を培養することによって、製造規模で、一貫した高密度の培養を達成可能であることが発見された。

培地
[0026]本発明の方法で使用するのに適した培地は、典型的には、培養細胞の増殖を補助するのに必要な栄養素を含有し、これには、ビタミン、ミネラル、脂肪酸、アミノ酸、炭素供給源（例えばデキストロース）、および場合によって、例えばインスリンおよびトランスフェリンを含む増殖培地、または抗生物質が含まれる。いくつかの態様において、培地は、基礎培地、例えばダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＨａｍのＦ−１２、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地、またはその組み合わせを含む。

[0027]特定の態様において、培地は、化学的に定義された培地であり、すなわち血清不含である。本出願において、別に示さない限り、培地中の構成要素濃度は、出発濃度であり、すなわち、培養細胞に適用される前の、新鮮な培地中のその構成要素の濃度であると理解されるものとする。当該技術分野に知られるように、特定の構成要素の濃度は、細胞が代謝プロセスを経るにつれて、または自発的な化学反応を通じて、変化するであろう。

[0038]いくつかの態様において、培地は、約２．２５、５、５．５、８、１０、１２、１４、１５、２０、２５、３０μＭ、またはそれより高い濃度の鉄を含む。より詳細な態様において、鉄は約５μＭの濃度で存在する。さらにより詳細な態様において、鉄は約５．５μＭの濃度で存在する。いくつかの態様において、鉄は約５．５〜１５μＭの間の濃度で存在する。本出願において、何らかのパラメーターを記載するすべての数字の境界、例えば「少なくとも」、「未満」、または「より多い」に関して、説明はまた、列挙する値が境界となったいかなる範囲も、必然的に記載する。

[0029]培地は、銅および亜鉛を含む他の金属を含有してもよい。銅は、少なくとも約５、１０、１２、１５、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０ｎＭ、またはそれより多い濃度で存在してもよい。特定の態様において、銅は、少なくとも約１０ｎＭの濃度で存在する。さらにより詳細な態様において、銅は、約７４μＭの濃度で存在する。培地はまた、少なくとも約０．１、０．２、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０μＭ、またはそれより多いの濃度の亜鉛を含有してもよい。特定の態様において、亜鉛は、約４．２μＭの濃度で存在する。いくつかの態様において、培地は、上述のように鉄および銅を含有し、例えば鉄は、少なくとも約２．２５、５、５．５、８、１０、１２、１４、１５、２０、２５、３０μＭの濃度で存在し、そして銅は、少なくとも約５、１０、１２、１５、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０ｎＭの濃度で存在する。特定の態様において、培地は、上述のように鉄、銅、および亜鉛を含有する。したがって、いくつかの態様において、培地は、約２．５μＭ〜１５μＭの間の濃度の鉄、約１０ｎＭ〜１５０ｎＭの間の濃度の銅、および約２．１μＭ〜８．４μＭの間の濃度の亜鉛を含む。より詳細な態様において、培地は、少なくとも約５μＭの濃度の鉄、少なくとも約１０ｎＭの濃度の銅、および少なくとも約２μＭの濃度の亜鉛を含む。

[0030]本発明の方法で使用するための培地は、例えばバッチ・リフィード培養中の、一貫した高採取細胞密度を補助する。いくつかの態様において、本発明の方法で使用するための培地は、少なくとも約１．０ｘ１０^６、１．５ｘ１０^６、２．０ｘ１０^６、２．５ｘ１０^６、３．０ｘ１０^６、３．５ｘ１０^６、４．０ｘ１０^６、４．１ｘ１０^６、４．２ｘ１０^６、４．３ｘ１０^６、４．５ｘ１０^６、４．８ｘ１０^６、５．０ｘ１０^６、５．５ｘ１０^６、６．０ｘ１０^６、６．５ｘ１０^６、７．０ｘ１０^６、７．５ｘ１０^６、８．０ｘ１０^６、８．５ｘ１０^６、９．０ｘ１０^６、９．５ｘ１０^６細胞／ｍＬ、またはそれより多くの採取密度を補助する。より詳細な態様において、培地は、約４．０ｘ１０^６〜７．０ｘ１０^６細胞／ｍＬの採取密度を補助する。特定の態様において、これらの採取密度を達成するため、細胞を、約０．０３７ｘ１０^６、０．０７５ｘ１０^６、０．１５ｘ１０^６、０．３ｘ１０^６、０．６ｘ１０^６、１．２ｘ１０^６、または２．４ｘ１０^６細胞／ｍＬ、あるいはそれより高い密度未満の密度で植え付ける。特定の態様において、細胞を約０．６ｘ１０^６細胞／ｍＬの密度で植え付ける。

[0031]いくつかの態様において、培地には、ビタミンＢ６が含まれ、ビタミンＢ６は、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン５’−リン酸、ピリドキサール５’−リン酸、ピリドキサミン５’−リン酸、およびその組み合わせを含む、細胞培養中で使用するのに適したいくつかの型で存在することが知られる。いくつかの態様において、培地は、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキシン５’−リン酸、ピリドキサミン５’−リン酸、およびその組み合わより選択される、少なくとも１つのビタミンＢ６を含有する。いくつかの態様において、ビタミンＢ６は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０μＭ、またはそれより高い総濃度で培地中に存在する。特定の態様において、ビタミンＢ６は、少なくとも約１０μＭの濃度で存在する。さらにより詳細な態様において、ビタミンＢ６は、約３０μＭの濃度で存在する。特定の態様において、ピリドキサールは、存在する場合、培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．１％以下を構成する。いくつかの態様において、培地中に存在する場合、ピリドキサールは、約２０、１５、１０、８、６、５、４、３、２、１μＭ未満の濃度で存在する。いくつかの態様において、培地は、０〜１．２の間のピリドキサール対ピリドキシン比を有する。より詳細な態様において、培地中のピリドキサール対ピリドキシン比は１．２未満、例えば約１．１、１．０、０．９、０．７、０．５、０．４、０．３、または０．１未満である。さらにより詳細な態様において、培地は本質的にピリドキサールをまったく含有しない。

[0032]本発明の方法で使用するための培地は、典型的には、培養細胞の増殖および関心対象のタンパク質の産生を補助するアミノ酸を提供するであろう。いくつかの態様において、アミノ酸は、例えば表３または４に記載するように、定義される比率で培地中に存在しうる。当該技術分野に知られるように、タンパク質調製物の加水分解産物（例えばペプトン、バクトペプトン、トリプトン、カゼイン加水分解産物、またはソイトン大豆加水分解産物）をアミノ酸供給源として使用してもよい。いくつかの態様において、定義される比率のアミノ酸を含有する培地に、定義されないタンパク質加水分解産物を補充してもよい。あるいは、いくつかの態様において、定義されない加水分解産物が、アミノ酸の主な供給源として働く。加水分解産物がアミノ酸の主な供給源である特定の態様において、必要に応じて１以上の特定のアミノ酸を培地に補充してもよい。いくつかの態様において、培地は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０ｍＭ、またはそれより高い総アミノ酸濃度を有する。特定の態様において、培地の総アミノ酸含量は、少なくとも約２０ｍＭである。さらにより詳細な態様において、総アミノ酸濃度は約３０ｍＭである。

[0033]アミノ酸の比率および個々のアミノ酸濃度を調整して、例えば、細胞増殖率、細胞の代謝プロフィール、産生される組換えタンパク質中のアミノ酸の比率に応じて宿主細胞の代謝必要条件を提供するか、または産生される組換えタンパク質の品質を改善することも可能である。例えば、ＣＨＯ細胞で産生される、システイニル化された解離可能二量体または遊離（ｆｒｅｅ）スルフィドリル二量体中にあるｒｈＢＭＰ−２の比率は、例えば米国特許第５，８３０，７６１号に開示されるように、培地中のＬ−システインおよびＬ−グルタミン酸の濃度によって影響を受ける。したがって、いくつかの態様において、培地は、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ｍＭまたはそれより高い濃度でＬ−システインを含む。例えば、特定の態様において、培地は、約０．２〜４．０ｍＭの濃度のＬ−システインを含む。より詳細な態様において、培地は、約０．５〜４．０ｍＭの濃度のＬ−システインを含む。さらにより詳細な態様において、培地は、約０．７〜３．０ｍＭの濃度のＬ−システインを含む。いくつかの態様において、Ｌ−グルタミン酸は、少なくとも約０．０２３、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ｍＭ、またはそれより高い濃度で培地中に存在する。特定の態様において、培地は、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ｍＭまたはそれより高い濃度のＬ−システイン、および最大で約０．０２３、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ｍＭの濃度のＬ−グルタミン酸を含む。より詳細な態様において、Ｌ−システインは、少なくとも約０．５ｍＭの濃度で培地中に存在し、そしてＬ−グルタミン酸は、最大で約０．３ｍＭの濃度で培地中に存在する。さらにより詳細な態様において、Ｌ−システインは、約０．７〜３．０ｍＭの濃度で培地中に存在し、そしてＬ−グルタミン酸は、最大で約０．２ｍＭの濃度で培地中に存在する。

[0034]培地は、ポリアニオン性剤をさらに含んでもよい。依存するわけではないが、ポリアニオン性剤が、分泌される組換えタンパク質上のヘパリン分子様結合ドメイン、例えば成熟（タンパク質分解的に切断された）ｈＢＭＰ−２単量体または二量体のＮ末端、との結合に関して、細胞の細胞表面上の部分と競合すると理論づけられる。分泌タンパク質が細胞表面に結合した場合、溶液中のタンパク質収量が減少する。細胞表面上のこれらの要素と競合することによって、ポリアニオン性剤は、培地中の遊離（細胞と会合していない）タンパク質の濃度を増加させる。ポリアニオン性剤の例には、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ペントサン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘクスウロナル（ｈｅｘｕｒｏｎａｌ）−ヘキソサミノグリカン硫酸、イノシトール六硫酸、およびスクロース八硫酸が含まれる。特定の態様において、ポリアニオン性剤は、マイクロモルまたはナノモルの親和性で、成熟ｈＢＭＰ−２単量体のＮ末端に結合可能である。いくつかの態様において、ポリアニオン性剤は、少なくとも約１％、５％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、５０％、またはそれより多くがスルホン化されている、スルホン化天然ポリマー、例えばグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）またはその誘導体である。いくつかの態様において、ポリアニオン性剤は、少なくとも約１、５、１０、２０、５０、７５、１００、２００、４００、６００、８００、１，０００ｍｇ／Ｌ、またはそれより高い濃度で存在する。

[0035]特定の態様において、ポリアニオン性剤は、デキストラン硫酸である。より詳細な態様において、デキストラン硫酸は、約５，０００〜５００，０００ｇ／モルの間の分子量を有する。さらにより詳細な態様において、デキストラン硫酸は、約７，０００ｇ／モルの分子量を有する。いくつかの態様において、デキストラン硫酸は、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。より詳細な態様において、デキストラン硫酸は約４００ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。ｒｈＢＭＰ−２を産生するための培地中のデキストラン硫酸の使用は、米国特許第５，３１８，８９８号および第５，５１６，６５４号にさらに記載される。

[0036]培地を操作して、培地の特定のパラメーター、例えばｐＨ、溶解Ｏ_２、またはモル浸透圧濃度を維持してもよい。いくつかの態様において、特定のモル浸透圧濃度範囲内に培地を維持する。他の態様において、培地を特定の出発モル浸透圧濃度に調整する。特定の態様において、培地の出発モル浸透圧濃度は、約２６０〜３８０ｍＯｓｍの間である。より詳細な態様において、出発モル浸透圧濃度は、約２８０〜３６０ｍＯｓｍの間である。

[0037]特定の態様において、培地は、少なくとも約２．５μＭの濃度の鉄、少なくとも約１０ｎＭの濃度の銅、少なくとも約２０ｍＭの総濃度のアミノ酸、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌの濃度のデキストラン硫酸、および少なくとも約１５μＭの濃度のビタミンＢ６を含み、ビタミンＢ６は約１．２未満のピリドキサール対ピリドキシン比を有する。より詳細な態様において、培地は、少なくとも約０．２μＭの濃度の亜鉛をさらに含む。非常に詳細な態様において、本発明で使用するための培地は、表３および表４に記載され、すなわち培地Ａ１、Ａ２、Ｂ１、またはＢ２である。さらにより詳細な態様において、培地はＢ２である。特定の態様において、培地は、Ｂ２に実質的に類似である。「実質的に類似」によって、培地の構成要素がいずれも、表４中の培地Ｂ２のものよりも、約０．１、０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、または３．０倍より多くは異ならない（すなわち増加せずまたは減少しない）濃度で存在することを意味する。

[0038]いくつかの態様において、定義されない構成要素の使用は許容されうる可能性もあり、そして培地に最大約０．１、０．５、１、５、１０％またはそれより多くのウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充してもよい。しかし、血清は、哺乳動物細胞培養に広く用いられるものの、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ９１−９９（１９９４）中に論じられるように、その使用に関連するいくつかの問題がある。例えば、血清は、多くの定義されない構成要素を含有し、そしてしたがって、化学的に定義されない。実際、血清の組成物は、ロット間で異なり、このため、標準化が困難である。さらに、血清は、増殖阻害因子を含有し、この結果、増殖が最適以下となる可能性もある。最後に、血清は、ウイルスまたは他の病原体を含有する可能性もあり、このため、産生および規制認可の両方がより困難である。したがって、本発明の方法で使用するには、血清不含培地が好ましい。

タンパク質
[0039]本発明によって提供する方法を用いて、多様なタンパク質が産生可能である。特定の態様において、タンパク質は増殖因子である。特定の態様において、増殖因子は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。より詳細な態様において、ＴＧＦ−βファミリーメンバーは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）である。

[0040]ＢＭＰは、非常に相同なタンパク質ファミリーであり、そしてさらにより高いレベルの相同性に基づいて、サブグループに分けられる。いくつかの重要なサブグループには：ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４；ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７；ならびにＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびＭＰ−５２が含まれる。特に、ＢＭＰは、ＢＭＰ活性に必要な、タンパク質のカルボキシ末端領域中のシステイン残基の同定パターンを共有する。特定の態様において、本発明の方法によって作製されるタンパク質は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、およびＭＰ−５２であり、その組み合わせおよびヘテロ二量体も含まれる。典型的には、ＢＭＰは、ジスルフィド連結二量体分子を指す。特定の態様において、ＢＭＰは単量体であってもよい。いくつかの態様において、ＢＭＰへの言及には、既知のＢＭＰの成熟（プロドメインを欠く）領域の配列に、アミノ酸レベルで、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％またはそれよりも同一であり、そして生物学的活性（例えば骨、軟骨、または靱帯／腱様組織形成活性）を保持する配列が含まれる。いくつかの態様において、ＢＭＰは、既知のＢＭＰ配列に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれより多いアミノ酸置換を含んでもよい。ＢＭＰは、当該技術分野に知られ、そしてヒト、ネコ、ニワトリ、チンパンジー、ウシ、イヌ、ヤギ、ウマ、マカク、マウス、ブタ、ウサギ、ラット、およびヒツジなどの哺乳動物を含む、多様な種より同定されてきている。例えばタンパク質および核酸配列、ならびに産生法を含むＢＭＰの説明は、以下の刊行物中に見出されうる：ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７（例えば、米国特許第５，０１３，６４９号；第５，１１６，７３８号；第５，１０６，７４８号；第５，１８７，０７６号；および第５，１４１，９０５に開示される）、ＢＭＰ−８（ＰＣＴ ＷＯ ９１／１８０９８に開示される）、ＢＭＰ−９（ＰＣＴ ＷＯ ９３／００４３２に開示される）、ＢＭＰ−１０（ＰＣＴ ＷＯ ９４／２６８９３に開示される）、ＢＭＰ−１１（ＰＣＴ ＷＯ ９４／２６８９２に開示される）、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３（ＰＣＴ ＷＯ ９５／１６０３５に開示される）、ＢＭＰ−１５（米国特許第５，６３５，３７２号に開示される）、ＢＭＰ−１６（米国特許第６，３３１，６１２号に開示される）、ＭＰ−５２（ＰＣＴ ＷＯ ９３／１６０９９に開示される）、ならびにＢＭＰ−１７およびＢＭＰ−１８（米国特許第６，０２７，９１７号に開示される）。これらのタンパク質への言及は、限定されるわけではないが、欠失突然変異体、挿入突然変異体、および置換突然変異体を含む、変異体、アレル変異体、断片および突然変異体ＢＭＰを含むことが理解されなければならない。特に、任意の特定のＢＭＰへの言及は、少なくとも１、３、５、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、またはそれより多くの残基が成熟タンパク質のＮ末端から除去されている、Ｎ末端一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）断片を含むことが理解されなければならない。

[0041]本発明の特定の態様において、ＢＭＰはＢＭＰ−２である。いくつかの態様において、ＢＭＰ−２はヒトＢＭＰ−２（ｈＢＭＰ−２）である。さらにより詳細な態様において、ｈＢＭＰ−２は成熟ｈＢＭＰ−２（すなわちＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ ００１１９１のＱ２８３−Ｒ３９６）であり、そして骨および／または軟骨形成活性を所持する。特定の態様において、ｈＢＭＰ−２は、成熟ｈＢＭＰ−２（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ ００１１９１のＱ２８３−Ｒ３９６）に、アミノ酸レベルで、少なくとも約８８、８９、９０、９２、９４、９５、９６、９８、９９、９９．９％同一である。したがって、いくつかの態様において、成熟ｈＢＭＰ−２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸置換を含有する。いくつかの態様において、産生されるＢＭＰ−２は、二量体である。いくつかの態様において、産生されるＢＭＰ−２は単量体である。特定の態様において、ＢＭＰ−２は、二量体タンパク質の少なくとも１つのサブユニットのＮ末端から、少なくとも１、３、５、７、９、１０、１１、１２、１３、またはそれより多い残基のＮ末端一部切除を有する。ＢＭＰ−２活性に関するアッセイが当該技術分野に知られ、そして例えば米国特許第５，０１３，６４９号に開示される。

[0042]ＢＭＰ−２は、多くの種で同定されてきている。例えば、いくつかの種由来のＢＭＰ−２に関して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ） Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤを列挙する表１を参照されたい。これらのＧｅｎｅＩＤを用いて、例えば、ユニフォームリソースロケータ（ＵＲＬ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅで見出されうる、ＮＣＢＩワールド−ワイドウェブポータルで、公的に入手可能な注釈付きｍＲＮＡまたはタンパク質配列を回収してもよい。例えば、ヒトＢＭＰ−２のＧｅｎｅＩＤを用いて、以下の参照配列： ＮＭ ００１２００．２（ｍＲＮＡ）およびＮＰ ００１１９１．１（タンパク質）を回収してもよい。同様にマウスに関して、回収可能なＢＭＰ−２参照配列には、ＮＭ ００７５５３．２（ｍＲＮＡ）およびＮＰ ０３１５７９．２（タンパク質）が含まれる。例えばゲノム遺伝子座、ゲノム配列、機能上の注釈、アレル変異体、ならびに参照ｍＲＮＡおよびタンパク質配列を含む、本出願で言及するＧｅｎｅＩＤに関連するすべての情報は、その全体が本明細書に援用される。すべての参照配列もまた、ｍＲＮＡのエクソン境界、または例えばタンパク質の成熟領域を定義するタンパク質の構造的特徴などの、配列の注釈付きの特徴を含めて、その全体が本明細書に援用される。

単離および使用
[0043]当該技術分野に知られるように、ＢＭＰ−２などの骨形成タンパク質は、タンパク質に基づく療法として有用である。したがって、本発明の方法は、培養から回収されるタンパク質の精製または単離の工程をさらに含んでもよい。ＢＭＰ−２は、当該技術分野に知られる多様な手段によって精製可能である。特定の態様において、精製は、１以上のカラムクロマトグラフィー精製、例えばブチルセファロース樹脂精製を含む。より詳細な態様において、ブチルセファロースカラムは、ＣＮＢｒ活性化セファロース、例えばセファロース４Ｂにカップリングしたブチルアミンの樹脂を含む。いくつかの態様において、精製はヘパリン様樹脂、例えばＣＥＬＬＵＦＩＮＥ^ＴＭスルフェート樹脂上のカラム精製工程をさらに含んでもよい。例えば、ＢＭＰ−２を含有する培養細胞からの馴化培地をヘパリン様樹脂含有カラムに適用してもよく、ＢＭＰ−２を含有する溶出物をカラムから得て、そして次いで、ブチルセファロースカラムなどの第二のカラムに適用する。例えば、本明細書に援用される国際公報第ＷＯ ９９／３１１２０号、特にその３〜７ページに記載されるように、さらなる精製が可能である。

[0044]精製後、本発明の方法の産物をさらに、例えば薬剤として配合してもよい。ＢＭＰの薬学的キャリアーの一般的な概説には、例えば、ＳｅｅｈｅｒｍａｎおよびＷｏｚｎｅｙ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． １６（３）：３２９−４５（２００５）または米国特許第５，３８５，８８７号を参照されたい。本発明の方法の産物を用いて、例えば骨増殖、生成、治癒、または修復を促進することによって、骨組織の欠陥、傷害、疾患、または障害を治療するか、または治療するための薬剤を調製してもよい。

細胞
[0045]非常に多様な細胞を用いて、本発明によって提供する方法によって組換えタンパク質を産生してもよい。関心対象のタンパク質、例えばＢＭＰを発現する組換えＤＮＡで形質転換可能である任意の細胞を、本発明の方法で使用可能である。細胞は、線形動物、蠕虫（ｗｏｒｍ）、昆虫、両生類、または哺乳類を含む多様な種、例えば、ヒト、霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、またはげっ歯類供給源由来であってもよい。特定の態様において、細胞はヒトまたはげっ歯類由来である。より詳細な態様において、細胞はハムスター由来である。

[0046]本発明の方法で使用するのに適した細胞株は、当該技術分野に周知であり、そして広く入手可能である。Ａｍｅｒｉｃａ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサスなどの預託機関から、多くの適切な細胞株が得られうる。本発明に適した細胞株には、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞、ＦＲｈＬ−２細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳＯ細胞、ＴＭ４細胞、ＣＶ１細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ細胞、Ｖｅｒｏ−７６細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、または２９３細胞が含まれる。特定の態様において、細胞は、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞、または２９３細胞である。より詳細な態様において、細胞はＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ細胞を、細胞力価および／またはタンパク質収量が増加するよう修飾してもよい。いくつかの態様において、ＣＨＯ細胞はジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ；マウスＧｅｎｅＩＤ １３３６１）発現が減少していても、またはまったく発現していなくてもよく、例えばＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲの低形質（機能減少）、ヌル（非機能）、またはドミナントネガティブ（ヌルであり、そして酵素の機能型を阻害する）アレルに関してヘテロ接合性またはホモ接合性であってもよく、そして関心対象のタンパク質を機能ＤＨＦＲ遺伝子を含有する構築物中で同時トランスフェクションしてもよい。

バイオリアクターおよび条件
[0047]本発明の方法で使用するための細胞を、例えば、ＷａｒｎｏｃｋおよびＡｌ−Ｒｕｂｅｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４５：１−１２（２００６）で論じられるように、当該技術分野に知られる任意の手段によって培養してもよい。典型的には、細胞をバイオリアクター中で増殖させる。バイオリアクターは任意のサイズであってもよい。いくつかの態様において、バイオリアクターは、少なくとも約１Ｌ； ３Ｌ； ２０Ｌ； ４０Ｌ； ８０Ｌ； １００Ｌ； １６０Ｌ； １，９００Ｌ； ２，５００Ｌ； １２，０００Ｌ； ２０，０００Ｌ； ４０，０００Ｌ、またはそれより大きい。バイオリアクターは、懸濁物（すなわち係留独立増殖）中の、または支持体上に係留された細胞の増殖を補助しうる。係留依存性増殖には、例えば大きい表面積対体積比を提供する、マイクロキャリアの使用が含まれてもよい。

[0048]本発明の特定の態様において、懸濁物中で、すなわち、係留表面を伴わずに、細胞を増殖させる。係留独立増殖の様式は当該技術分野に周知であり、そして例えば、攪拌タンクバイオリアクターおよびエアリフトバイオリアクター中での増殖を含む。特定の態様において、バイオリアクターは攪拌タンクバイオリアクターである。特定のバイオリアクター中で増殖させた細胞を、順に、バッチ・リフィード（以下にさらに記載される、また、Ｄｒａｐｅａｕら， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５（１−３）：１０３−９（１９９４）も参照されたい）、流加（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ）（例えば、米国特許第５，６７２，５０２号；第６，９２４，１２４号；または第７，３３２，３０３号を参照されたい）、または灌流（新鮮な培地が添加された際に、バイオリアクターから廃棄物が除去されうるように、細胞保持デバイスを使用する、例えば、米国特許第４，８１４，２７８号または第６，６０７，９１０号を参照されたい）培養法を含む、当該技術分野に知られる多様な方法によって培養してもよい。いくつかの特定の態様において、細胞をバッチ・リフィード・プロセスによって培養する。より詳細な態様において、細胞を本質的に一定の温度で培養する。いくつかの態様において、適切な培養温度は、約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、または４２℃より選択されうる。いくつかの態様において、本質的に一定の温度は、３５〜３９℃または３６〜３８℃の狭い温度範囲内であってもよい。より詳細な態様において、約３７℃の一定の温度で、細胞を培養する。

[0049]バイオリアクターは、例えば酸素添加（溶解Ｏ_２）、ｐＨ、モル浸透圧濃度、温度、光、および特定の栄養素（例えばグルコースまたはアミノ酸）の濃度を含む、培地の多様な生理学的パラメーターを維持することも可能である。特定の態様において、バイオリアクターは、温度、ｐＨ、および溶解Ｏ_２含量を監視し、そして維持する。いくつかの態様において、グルコースはバッチ（複数）で与える。例えば、バッチ・リフィードによって、バイオリアクター中で細胞を増殖させる。特定の態様において、総培養（すなわち細胞および培地）部分を定期的に除去し（例えば採取し）、そして新鮮な培地と交換する。いくつかの態様において、総培養の少なくとも約１０、２５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、９９％、またはそれより多くを定期的に除去し、そして新鮮な培地と交換する。より詳細な態様において、総培養の少なくとも約７５％を除去し、そして交換する。特定の態様において、細胞培地部分を約６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、または４８時間ごとに、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い日数ごとに除去する。より詳細な態様において、３日ごとに、培地部分を除去しそして交換する。他の態様において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い細胞分裂周期で、総培養部分を除去し、そして交換する。「細胞分裂周期」によって、対数増殖の間、すなわちリッチな培地中、接触阻害の非存在下での、培養される細胞の平均倍加時間を意味する。

[0050]特定の態様において、細胞による乳酸産生を限定するかまたは調節することによって、細胞力価および／またはタンパク質収量を増進させることも可能である。例えば、２００５年３月３１日公開の米国特許公報第２００５／００７００１３号（また、米国特許第７，４２９，４９１号も参照されたい）に開示されるような制限方式で、培養細胞へのグルコース供給を限定することによって、乳酸産生を調節することも可能である。

[0051]すべての特許、出願、ＧｅｎｅＩＤ、参照配列、または本明細書に引用する他の参考文献に関しては、すべての目的のため、ならびに列挙する提案のため、その全体が本明細書に援用されると理解すべきである。本明細書に援用される文書および本出願の間にいかなる不一致が存在する場合も、本出願が優位に立つであろう。

実施例１： ｒｈＢＭＰ−２産生中のスケールアップの問題
[0052]ＢＭＰ−２産生プロセスの開発中、１，９００リットルのバイオリアクターにおいて、ｒｈＢＭＰ−２およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を同時発現するＣＨＯ細胞（本明細書において、ＥＭＣ−Ｇ５細胞として知られる）の高細胞密度培養で、スケールアップの問題が観察された。高細胞密度培養は、３日間バッチには０．６０ｘ１０^６細胞／ｍＬで、または４日間バッチには０．３０ｘ１０^６細胞／ｍＬで接種された。バッチ−リフィード・プロセスの最初の継代中、最終細胞密度は通常、３．０ｘ１０^６細胞／ｍＬに到達するが、以下の継代の最終細胞密度は次第に低下した。例えば、３回の継代は、それぞれ、３．０ｘ１０^６、１．６ｘ１０^６、および１．０ｘ１０^６細胞／ｍＬの採取細胞密度を生じるであろう。こうした増殖速度低下は、培地中、より低量のＢＭＰ−２タンパク質を生じ、そして全体の生産性は望ましいよりも低くなった。増殖速度低下は、３リットル規模では再現不能であった。この問題を研究するためのモデルとして、１６０リットルのバイオリアクターを用いた。採取細胞密度低下は、図１に示すように、１６０Ｌバイオリアクター中で見られた。

[0053]さらなる実験は同じ困難を示した。１つの試験において、最初の高密度継代は、２．９９ｘ１０^６の最終細胞密度に到達する一方、第二の継代は２．２８ｘ１０^６細胞／ｍＬにしか到達しなかった。対照条件下で、継代前のものをリアクターに再び接種すると、第一および第二高密度継代は、それぞれ、２．６５ｘ１０^６および１．４９ｘ１０^６細胞／ｍＬの最終細胞密度に達した。どちらの対照実験でも、第一の高植え付け継代が高い最終密度に達するが、続く継代の増殖速度が次第に有意に低下する、スケールアップの問題が示された。ＢＭＰ−２力価および特異的生産性データは、類似の傾向を示した。

[0054]微量要素Ｄ（「微量Ｄ」）の増殖培地への添加は、培地におけるスケールアップ問題を排除した。微量Ｄは、３μＭ鉄、３μＭ亜鉛、および０．０３μＭ銅からなる。微量Ｄを用いると、高植え付けバッチ（３日間および４日間）は、一貫して、３．０ｘ１０^６細胞／ｍＬ以上の採取密度に到達した。増殖速度および特異的生産性もまた高く維持された。これによって、微量Ｄが、細胞増殖特性に正に影響を及ぼすことが示される。補充の鉄および銅を含むおよび含まない培地中で細胞を増殖させた実験結果を図２に示す。

[0055]微量Ｄのどの構成要素が最も重要であるかを発見する試みの中で、銅のみを補充した培地を試験した（未提示）。第一の高植え付けバッチが、３．０ｘ１０^６細胞／ｍＬより高い値に到達した後、続く２つのバッチは、増殖速度低下を示し、これは、対照バッチ（微量Ｄを含まない）の振る舞いと同様であった。３回の高植え付け継代の増殖速度の低下によって、銅単独では、スケールアップ問題を改善するのに有効ではないことが示される。

実施例２：デキストラン硫酸は、クロマトグラムの異常を排除する
[0056]これらの微量金属評価中、先の高密度培養において生じたｒｈＢＭＰ−２由来のサイズ排除クロマトグラム（ＣＥＸ）の第二のピーク上に異常な肩が観察された。培地中で低レベルのデキストラン硫酸（２００ｍｇ／Ｌの代わりに１０ｍｇ／Ｌ）を用いると、リン酸とのインキュベーション後、より高い割合の肩ピークが生じることが見出された（それぞれ、およそ４％に対しておよそ１２％）。デキストラン硫酸用量反応実験によって、細胞培地中のデキストラン硫酸レベルがより高いと、用量依存方式で、観察された肩ピーク量が減少することが示された。デキストラン硫酸は、以前、ＢＭＰ−２産生中、タンパク質収量を増加させることが示されてきている。例えば、米国特許第５，３１８，８９８号および第５，５１６，６５４号を参照されたい。

実施例３．１：金属補充培地中の細胞力価低下
[0057]鉄および銅濃度が、培地中で濃縮されている場合、実験室規模バイオリアクター中であっても、細胞増殖が安定でないことが時折観察された。図３を参照されたい。さらなる金属が、他の培地構成要素（単数または複数）と反応し、そして不安定な培養増殖を生じうると仮定された。

[0058]組織培養フラスコ中の予備実験において（図４）、０．０８ｘ１０^６細胞／ｍＬの密度で細胞を植え付け、そして４日間増殖させた。銅または亜鉛のみを補充された培地Ａ１（１４０）は、補充されていない培地と匹敵する増殖速度を補助する一方、微量Ｄ補充（さらなる鉄、銅、および亜鉛）は、より低い増殖速度を生じた。細胞はまた、培地Ａ１に鉄のみを補充した場合、増殖速度の用量依存性減少も示した。培地Ｂ１（２４８）における増殖細胞は、鉄を補充された培地Ａ１中の増殖細胞と類似の増殖速度減少を示した。

実施例３．２：ピリドキサール−鉄相互作用は、増殖速度減少を生じる
[0059]さらなる研究において、増殖速度欠陥を誘発する培地Ａ１を、増殖速度欠陥を誘発しない培地Ａ２に比較した。培地Ａ１は、主にピリドキサールを含有する一方、培地Ａ２はピリドキシンのみを含有することが注目された。ＢＭＰ−２ ＥＭＣ Ｇ５細胞を、異なる鉄濃度であり、そしてピリドキサールを含む、および含まない、培地Ａ１および培地Ａ２中で増殖させた。培地Ａ１およびＡ２の鉄およびビタミンＢ６含量を表２に要約する。

表２

[0060]３７℃に維持され、７％ＣＯ_２を含むインキュベーター中、組織培養ディッシュ中で、細胞を３日間培養した。０．１５ｘ１０^６細胞／ｍＬで細胞を植え付け、３日間の最後に採取した。第３日、細胞をＣＡＳＹカウンター上で計数して、最終細胞密度を得た（１０^６細胞／ｍＬの単位）。次いで、以下の等式によって増殖速度を計算した：増殖速度（ｕ）＝Ｉｎ（最終細胞密度／最初の細胞密度）／培養時間（時間）。結果を図５に示す。

[0061]ピリドキシンではなく、ピリドキサールが鉄と相互作用する構成要素であり、そして一貫性のない培養成績を引き起こすことが発見された。ピリドキシンはピリドキサールの前駆体である。これらは、培地中のビタミンＢ６として交換可能であり、そしてアミノ基転位、脱カルボキシル化、および脱アミノの補因子として作用する。大部分の細胞培養プロセスに関して、培地がピリドキシン、ピリドキサール、または両方を含有していても相違はない。しかし、特定の濃度のピリドキサールは、増加した量の鉄と相互作用し、そしてｒｈＢＭＰ−２産生プロセスに負に影響を及ぼす。図５に示すように、培地Ａ１は、培地Ａ２に比較して増殖速度欠陥を誘発し、これはさらなる鉄によって悪化しうる。ピリドキサールを補充すると、培地Ａ２は、鉄用量依存方式で増殖速度欠陥を誘発する。したがって、培地中の鉄濃度がより高く、そしてピリドキサールの濃度または比率がより高いと、不安定でそして最適以下の培養増殖が生じる。

実施例４：細胞密度およびタンパク質力価の頑強な（ｒｏｂｕｓｔ）増加
[0062]培地からピリドキサールを除いたさらなる培地修飾後（培地Ｂ２を生じる）、細胞増殖およびＢＭＰ−２生産性は一貫しており、そして以前のプロセスに比較して、小規模バイオリアクター中、ならびに商業規模バイオリアクター中で、生産性に２倍の増加を示した。図６および図７を参照されたい。したがって、本出願に記載する培地に対する修飾は、商業規模への組換えタンパク質産生のスケールアップ中に生じる増殖欠陥を排除した結果、高品質組換えタンパク質の収量が実質的に増加する。

[0063]製造中に組換えヒト骨形成タンパク質−２（ｒｈＢＭＰ−２）を産生するのに用いる細胞株は、ＢＭＰ−２およびＤＨＦＲを同時発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であり、本明細書において、ＥＭＣ−Ｇ５と称される。０．６ｘ１０^６細胞／ｍＬの標的細胞密度で接種して、２，５００リットルの作業体積バイオリアクター中で細胞を培養した。培地Ｂ２中で細胞を培養した（表４を参照されたい）。培養温度を３７℃に維持した。７．１０のセットポイントまで、継代の最初の数時間にわたって培養のｐＨが下がることを許し、そして滴定剤の添加によって、その値で維持した。培地Ｂ２の最初のｐＨは〜７．３０であった。２回の３日間継代および２回の４日間継代に関して、各接種物細胞密度で、培養を連続継代した。血中ガス分析計（ＢＧＡ）からの測定値にしたがって、ｐＨプローブをオンラインで較正した。顕微鏡を用い、トリパンブルー排除を用いて生存率を決定する、手動計数によって、細胞密度および生存率を決定した。遠心分離によって、各継代後のすべての培養から馴化培地を採取し、そして次いでろ過した。

[0064]表３および４は、これらの研究で用いる培地の配合を示す。
表３

表４

[0065]本明細書を考慮し、そして本明細書に開示する本発明を実施すると、当業者には、本発明の他の態様が明らかであろう。明細書および実施例は例示のみと見なされ、本発明の真の範囲および精神は、以下の請求項によって示されることが意図される。

Claims (52)

1. ＢＭＰ−２産生法であって：
   ｉ）少なくとも約２．２５μＭの濃度の鉄、ポリアニオン性化合物を含み、そしてピリドキサールが存在している場合、ピリドキサールが培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５％未満を構成する培地中で、ＢＭＰ−２をコードするＤＮＡ分子を含む適切な宿主細胞を培養し；そして
   ｉｉ）関心対象のタンパク質を回収する
   工程を含み、
   宿主細胞を約３Ｌより大きい容量を有するバイオリアクター中で培養する、前記方法。
2. 鉄が少なくとも約５μＭの濃度である、請求項１の方法。
3. 培地が少なくとも約２ｘ１０^６細胞／ｍＬの採取密度を補助しうる、請求項１の方法。
4. 培地がさらに、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキシン５’−リン酸、ピリドキサミン５’−リン酸からなる群より選択される、少なくとも１つのビタミンＢ６を含む、請求項１の方法。
5. 培地が少なくとも約１５μＭの総ビタミンＢ６濃度を有する、請求項４の方法。
6. 培地が約１．２未満のピリドキサール対ピリドキシン比を有する、請求項４の方法。
7. ピリドキサール対ピリドキシン比が０．４未満である、請求項６の方法。
8. 培地が少なくとも約１０ｎＭの濃度の銅をさらに含む、請求項１の方法。
9. 培地が少なくとも約０．２μＭの濃度の亜鉛をさらに含む、請求項１の方法。
10. ポリアニオン性化合物がデキストラン硫酸である、請求項１の方法。
11. デキストラン硫酸が少なくとも約１０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項１０の方法。
12. デキストラン硫酸が少なくとも約１００ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項１０の方法。
13. デキストラン硫酸が、約５，０００〜５００，０００ｇ／モルの間の分子量を有する、請求項１１の方法。
14. デキストラン硫酸が約７，０００ｇ／モルの分子量を有する、請求項１３の方法。
15. 培地が少なくとも約２０ｍＭの総濃度のアミノ酸をさらに含む、請求項１の方法。
16. 培地が少なくとも約０．５ｍＭの濃度のＬ−システインを含む、請求項１５の方法。
17. 培地が最大で約０．３ｍＭの濃度のＬ−グルタミン酸を含む、請求項１６の方法。
18. 培地が約２６０〜３６０ｍＯｓｍの間の初期モル浸透圧濃度を有する、請求項１の方法。
19. ＢＭＰ−２が哺乳動物ＢＭＰ−２である、請求項１の方法。
20. 哺乳動物ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２（ｈＢＭＰ−２）である、請求項１９の方法。
21. ヒトＢＭＰ−２が組換え（ｒｈＢＭＰ−２）である、請求項２０の方法。
22. 適切な宿主細胞が、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞、または２９３細胞からなる群より選択される、請求項１の方法。
23. 適切な宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２２の方法。
24. ＣＨＯ細胞がＤＨＦＲ遺伝子の減少した発現を有する、請求項２３の方法。
25. 適切な宿主細胞を少なくとも約１６０Ｌの容量を有するバイオリアクター中で培養する、請求項１の方法。
26. バイオリアクターが少なくとも約５００Ｌの容量を有する、請求項２５の方法。
27. バイオリアクターが少なくとも約２，５００Ｌの容量を有する、請求項２６の方法。
28. バイオリアクターが少なくとも約１２，０００Ｌの容量を有する、請求項２７の方法。
29. 宿主細胞をバッチ・リフィード（ｂａｔｃｈ ｒｅｆｅｅｄ）、流加（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ）、または灌流によって培養する、請求項２７の方法。
30. 宿主細胞をバッチ・リフィードによって培養する、請求項２９の方法。
31. 宿主細胞を本質的に一定の温度で培養する、請求項３０の方法。
32. 温度が約３６〜３８℃である、請求項３１の方法。
33. ブチルセファロース樹脂上でＢＭＰ−２を精製する工程をさらに含む、請求項１の方法。
34. 精製が、ＢＭＰ−２を含有する馴化培地をヘパリン様樹脂に適用し、ＢＭＰ−２を含有する溶出物を得て、そして溶出物をブチルセファロース樹脂に適用する工程をさらに含む、請求項３３の方法。
35. ＢＭＰ−２産生法であって：
    ｉ）少なくとも約２．５μＭの濃度の鉄、ポリアニオン性化合物、および少なくとも約１５μＭのビタミンＢ６を含み、そしてピリドキサールが存在している場合、ピリドキサールが培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５％未満を構成する培地中で、ＢＭＰ−２タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む適切な宿主細胞を培養し；そして
    ｉｉ）ＢＭＰ−２タンパク質を回収する
    工程を含み、
    宿主細胞を約３Ｌより大きい容量を有するバイオリアクター中で培養する、前記方法。
36. 培地が少なくとも約１０ｎＭの濃度の銅をさらに含む、請求項３５の方法。
37. 培地が少なくとも約０．２μＭの濃度の亜鉛をさらに含む、請求項３５の方法。
38. 宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３５の方法。
39. ＢＭＰ−２がｒｈＢＭＰ−２である、請求項３５の方法。
40. ポリアニオン性化合物が、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌの濃度のデキストラン硫酸である、請求項３５の方法。
41. 培地が少なくとも約２０ｍＭの総濃度のアミノ酸を含む、請求項３５の方法。
42. 培地が少なくとも約０．５ｍＭの濃度のＬ−システインを含む、請求項４１の方法。
43. 培地が最大で約０．３ｍＭの濃度のＬ−グルタミン酸をさらに含む、請求項４２の方法。
44. 培地が約２６０〜３６０ｍＯｓｍの間の初期モル浸透圧濃度を有する、請求項３５の方法。
45. ＢＭＰ−２産生法であって：
    ｉ）少なくとも約２．５μＭの濃度の鉄、少なくとも約１０ｎＭの濃度の銅、少なくとも約２０ｍＭの総濃度のアミノ酸、少なくとも約０．５ｍＭの濃度のＬ−システイン、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌの濃度のデキストラン硫酸、および少なくとも約１５μＭの濃度のビタミンＢ６を含み、そしてピリドキサールが存在している場合、ピリドキサールが培地中のビタミンＢ６のモル濃度の約５５％未満を構成する培地中で、ＢＭＰ−２タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含むＣＨＯ細胞を、バッチ・リフィード・プロセスで培養し；そして
    ｉｉ）ＢＭＰ−２タンパク質を回収する
    工程を含み、
    宿主細胞を少なくとも約１６０Ｌの容量を有するバイオリアクター中で培養する、前記方法。
46. 培地が少なくとも約０．２μＭの濃度の亜鉛をさらに含む、請求項４５の方法。
47. ＢＭＰ−２産生法であって：
    ｉ）少なくとも約２．２５μＭの濃度の鉄、ポリアニオン化合物を含み、そしてピリドキサールが存在している場合、約１５μＭ未満の濃度で存在する培地中で、ＢＭＰ−２をコードするＤＮＡ分子を含む適切な宿主細胞を培養し；そして
    ｉｉ）関心対象のタンパク質を回収する
    工程を含み、
    宿主細胞を約３Ｌより大きい容量を有するバイオリアクター中で培養する、前記方法。
48. ＢＭＰ−２を精製する工程をさらに含む、請求項１〜３１または３５〜４７のいずれか一項の方法。
49. 精製ＢＭＰ−２を薬剤として配合する工程をさらに含む、請求項４８の方法。
50. 請求項１〜４９の方法のいずれかによって産生される産物。
51. 請求項５０の産物を含む薬学的配合物。
52. 骨組織の欠陥、傷害、疾患、または障害を持つ患者を治療するための薬剤の調製における、請求項５０の産物の使用。

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