JP2011510671A - ヤロウイア株における特定遺伝子の多コピーの標的組み込み方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヤロウイア株のゲノムにおいて特定遺伝子の少なくとも三つのコピーを標的組み込みする方法に関するものであり、該方法は、（ａ）少なくとも三つの遺伝子のうちの一つに欠失を含むヤロウイア株を培養する過程であり、これらの欠失のそれぞれに関連する表現型が前記株に対する栄養要求性または優性形質に対応する培養過程と、（ｂ）前記ヤロウイア株が栄養要求性の補完、場合によっては、前記欠失のそれぞれから生じる優性形質の補完を可能にする選択マーカーを含む少なくとも三つの組み換えベクターによって得られた前記ヤロウイア株を形質転換する過程と、（ｃ）前記少なくとも三つの組み換えベクターを組み込んだ酵母を最小培地で選択する過程を含んでいる。本発明はまた、特定ポリペプチドの産生方法も含んでおり、該方法は、上記のような標的組み込み方法、ならびに、表現型が前記株に対する栄養要求性または優性形質に対応するこれらの欠失のそれぞれに関連する、少なくとも三つの遺伝子のうちの一つに欠失を含む修飾されたヤロウイア株の取得方法を利用するものである。

Description

本発明は、ヤロウイア株のゲノムにおいて特定遺伝子の少なくとも三つのコピーの標的組み込み方法に関するものであり、該方法は、（ａ）少なくとも三つの遺伝子のうちの一つに欠失を含み、これらの欠失のそれぞれに関連する表現型が前記株に対する栄養要求性または優性形質に対応する、ヤロウイアの株を培養する過程と、（ｂ）このようにして得られた前記ヤロウイア株を、前記ヤロウイア株が栄養要求性を補完することを可能にする、場合によっては、前記欠失のそれぞれから生じる優性形質を補完することを可能にする選択マーカーを含んだ少なくとも三つの組み換えベクターによって形質転換する過程と、（ｃ）前記少なくとも三つの組み換えベクターを組み込んだ酵母を最小培地で選択する過程とを含んでいる。また、本発明は、このような方法を利用する特定ポリペプチドの産生方法、ならびに少なくとも三つの遺伝子のうち一つに欠失を含み、これらの欠失のそれぞれに関連する表現型が前記株に対する栄養要求性または優性形質に対応する、修飾されたヤロウイア株の取得方法にも関するものである。

今日では、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は特定遺伝子の発現宿主として利用されるようになってきている。実際、この酵母は、培養培地において高い効率で、アルカリプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、またはＲＮアーゼのような高分子量のタンパク質を産生・分泌する特異性を有しており、前記タンパク質は培養培地から簡単に回収することができるものである。これらの特定遺伝子の発現を可能にするために、欧州特許第０１３８５０８号明細書または欧州特許第０２２０８６４号明細書に記載されているような、さまざまな技術が早期に開発されている。これらのさまざまな技術は、共通して「組み込み」と呼ばれるベクターを用いており、該ベクターによって、特定遺伝子を有するＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡに挿入することが可能となり、該特定遺伝子がその後発現する。しかし、それでもこれらの技術はいずれも産業上の生産にかかる要請、すなわち収率と長期にわたる安定性という要請を完全に満足させるものではない。

これらの産業上の要請をより良く満足させるために、新しい技術が開発されている。

ＰＣＴ出願である国際公開第００／０１２７２９号には、アルカン資化酵母のレトロトランスポゾンＹｌｔ１のＬＴＲに対応するゼータ配列が隣接する特定配列を含む組み込みベクターを用いる技術が記載されている。これらの組み込みベクターは、ゼータ配列のないアルカン資化酵母の株で用いられたとき、前記株のゲノムにおける多コピーのランダムな組み込みを可能にするものである。とりわけ、この特徴的な技術は、抗酸性細胞外リパーゼＬＩＰ２（ＰＣＴ出願である国際公開第０１／８３７７３号参照）を産生するために用いられた。

しかし、ＬＩＰ２によって形質転換されたアルカン資化酵母の株の大部分が凡庸な遺伝的安定性、一般的には５０％より低い安定性を有することが明らかになった。さらに、これらの形質転換された株はランダムな組み込み現象の後に得られるため、挿入部位の配列決定による株の遺伝的安定性の調査は非常に骨の折れるものである。

得られた株の安定性の問題および外来配列の詳細な組み込み部位を特定することの難しさというこれらの問題に、複数の選択マーカーが欠けたアルカン資化酵母の株が存在しないことに関連するさらなる問題が加わっており、この不存在は、これらの株が不安定性であることによる。

発現カセットの組み込み方法のうち、相同的な形質転換方法を利用する方法を挙げることができるが、これらの方法は、マーカー（ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＬＹＳ５）と、複数標識され、変換率の大幅な減少を可能とする欠失を伴う株とをほとんど使用しない。株は、変異に対応するゲノムマーカーを含むことが多く、欠失に対応するマーカーはほとんどない。欠失を伴う既知のゲノムマーカーは、ｕｒａ３−３０２（６９５ｂｐの欠失）、ｕｒａ３−４１（４１ｂｐの欠失）、ｌｅｕ２−２７０（６８１ｂｐのＳｔｕＩの欠失）だけである。ＭＡＤＺＡＫ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．１０９，ｐ：６３−８１，２００４）はｕｒａ３−３０２とｌｅｕ２−２７０を記載している。

ベクターのうち、標的組み込みを可能とするものを挙げることができるが、該ベクターは、プラスミド部分（例えばｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｄｅｓ ｐｌａｓｍｉｄｅｓ ａ ｕｎｅ ｐｌａｔｅｆｏｒｍｅ ｐＢＲ３２２，Ｍａｄｚａｋ ｅｔ ａｌ，Ｆｅｍｓ ｙｅａｓｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５，ｐ：６３５−６４６，２００５）またはゼータ部分（Ｂｏｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．７０，ｐ．４９３−５０２，２００７）を組み込むものである。組み込みおよび増幅を目的とした自己クローニング用のベクターがある。しかし、該ベクターは分散的であり、ランダムである。

治療用タンパク質を産生するためには、プラスミドＤＮＡがあってはならず、インサートを同定し、その配列を検証するための標的組み込みをすることが必要である。また、発現を増やすためには遺伝子のコピーの数を増やすことができなければならない。

発明者らは、「組み込みベクター」によって標的組み込みを可能にする方法を考案し、該組み込みベクターは、組み込みカセットを遊離し（稀な部位１）、そしてベクター部分を除去するために構築されており、該ベクター部分は、選択マーカーを迅速に導入するための部位（稀な部位２）と発現カセットをクローニングするための部位（稀な部位３）を有している。組み込みベクターと遺伝子座／マーカーの様々な組み合わせとの組み合わせ。

また、発明者らは、
−形質転換率、とりわけＡＤＥ２およびＧＵＴ２マーカーの形質転換率を高めるために形質転換条件を最適化し、
−組み込みカセットを所望の遺伝子座に組み込んだ、特定のクローンを迅速に同定するための、組み込みと表現型の関連付けを行った。

こうして、発明者らは、ここでは、新しい選択マーカー（たとえば新規のゲノムマーカー、新規の栄養要求性）を同時に導入することを可能にする遺伝子座に発現カセットを組み込む方法を実現することにより、対応する選択マーカーを有する新規の組み込みカセットを用いた新たな組み込みを可能にした。

良好な形質転換効率、低い変換率、インサートの同定（ＬＩＰ２のリパーゼ、ＡＤＥ２のマロン、ＵＲＡ３のＳＵＣ−）のスクリーニングが可能であることによって、共組み込み（二つの発現カセットを用いた形質転換）を行うことも可能である。このことによって、産生株を得るために必要な時間を削減することが可能となる。また、所定の部位への挿入によって、産生株を迅速に特徴付けることが可能となる。最終的な株が原栄養体である。

最終的な株は、主要な分泌タンパク質（ＡＥＰプロテアーゼ、リパーゼＬｉｐ２ｐ）を発現しなくなり、安定した欠失、弱い細胞溶解および清浄な上澄みを有する（分泌タンパク質がほとんどない）。

また、発明者らは、切り出し可能なこれらのマーカーによって、マーカーを再生成することおよび新しいコピーを再び組み込むことのできる、マーカーの全体的な切り出しが可能であることも明らかにした。

複数標識された株を得るために、さまざまな方法によってゲノムマーカーを導入することができる。

たとえば、ｌｅｕ２−２７０、ｕｒａ３−３０２およびｘｐｒ２−３２２マーカーを構築するためにアルカン資化酵母で用いられているＰＯＰ ＩＮ／ＰＯＰ ＯＵＴと呼ばれる方法が、Ｇ．Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．の雑誌論文、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．ｉｎ：Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｗｏｌｆ，Ｋ．，Ｅｄ），Ｖｏｌ．１，１９９６，ｐｐ．３１３−３８８，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇに記載されている。該方法は、遺伝子の欠失を有するベクターを遺伝子座に組み込み、次に、このベクターの切り出しを選択し、そして、組み換えによって野生型の遺伝子を除去し、変異遺伝子を保存しているクローンを同定することからなる。これは、時間がかかり、あまり効果的ではなく、対抗選択を可能とするマーカーの使用も必要とする方法である。たとえば、５ＦＯＡを用いたクローンＵｒａ＋の対抗選択である。この対抗選択は二次的な変異を導入する恐れがある。

また、ＳＥＰ法（Ｍａｆｔａｈｉ Ｍ．，Ｎｉｃａｕｄ Ｊ−Ｍ．，Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ Ｃ．，１９９６．Ｓｔｉｃｋｙ−ｅｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ．１２，ｐ：８５９−８６８）も使うことができ、該方法は、アルカン資化酵母においてＰＯＸ遺伝子を連続的に破壊するために適合化されている（Ｗａｎｇ Ｈ．Ｊ．，Ｌｅ Ｄａｌｌ Ｍ−Ｔ，Ｗａｃｈｅ Ｙ，Ｂｅｌｉｎ Ｊ−Ｍ，Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ Ｃ，Ｎｉｃａｕｄ Ｊ−Ｍ，１９９９．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｙｌ ＣｏＡ ｏｘｉｄａｓｅ（Ａｏｘ）ｉｓｏｚｙｍｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎ−ａｌｋａｎｅｓ−ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇ ｙｅａｓｔ Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１８１，ｐ．５１４０−５１４８）。この方法はより迅速であるが、対抗選択を可能にするマーカーの使用はやはり必要である。

また、Ｆｉｃｋｅｒｓと共同研究者によって開発された方法ＳＥＰ／ｃｒｅを使うこともできる（Ｆｉｃｋｅｒｓ Ｐ．，Ｌｅ Ｄａｌｌ Ｍ．Ｔ．，Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ Ｃ．Ｔｈｏｎａｒｔ Ｐ．Ｎｉｃａｕｄ Ｊ−Ｍ．，Ｎｅｗ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｒｋｅｒ ｒｅｓｃｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌ．５５，ｐ：７２７−７３７，２００３）。これは迅速な方法であり、対抗選択を可能にするマーカーの使用を必要としない方法である。この方法は、１）欠失させようとする特定遺伝子を選択することと、２）ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）またはクローニングによって破壊カセットを構築することと、３）マーカーを除去するために（有利にはリコンビナーゼｃｒｅの作用の下で組み換えを可能にするｌｏｘＰタイプの配列）配列中での組み換えを可能とする組み換え配列（有利にはｌｏｘＰまたはｌｏｘＲまたはその派生配列）を両側に備えた選択マーカーを導入することと、４）特定遺伝子が欠失した株を選択し（形質転換、および形質転換体の選択）、破壊を検証することと、５）リコンビナーゼの発現を可能にするベクターによって形質転換することと（有利には、ｌｏｘＰ／ｌｏｘＲ配列の組み換えとマーカーの除去とを可能にするリコンビナーゼｃｒｅ）、６）特定遺伝子が欠失し、リコンビナーゼの発現プラスミドが失われたクローンを単離することからなる。しかし、形質転換の間の遺伝子の変換を最小化するためには欠失とマーカーを最適化しなければならない。

上記より、アルカン資化酵母のゲノムにおいて、特定遺伝子の多量の発現を得るために該特定遺伝子の配列を特異的かつ安定的に組み込むことを可能にする形質転換技術は存在しないことになる。

現在、発明者らは、形質転換によって得られるヤロウイア株の安定性が組み込まれたコピーの数に強く依存することを明らかにしている。ＬＩＰ２遺伝子の８つのコピーを組み込んだ株は７０％の安定性を有し、該安定性は７つのコピーでは９８％、６つのコピーでは１００％に上昇する。

また、発明者らは、栄養要求性と、場合によっては、少なくとも三つの異なる選択マーカー、とりわけ、Ｕｒａ３、Ｌｅｕ２、Ｇｕｔ２およびＡｄｅ２という選択マーカーから選ばれる選択マーカーに関連する優性形質を有するアルカン資化酵母の、生存能力のある新しい株を開発することに成功した。さらに、開発された生存能力のある株は、とりわけ新規の欠失部分Ｇｕｔ−７４４およびＡｄｅ２−８４４を含む多量の欠失部分（Ｕｒａ３−３０２、Ｌｅｕ２−２７０、Ｇｕｔ２−７４４およびＡｄｅ２−８８４）を有し、該欠失部分によって遺伝子の変換の頻度を大幅に制限することが可能となる（実施例参照）。

特に標的組み込み法でこのような株を使うことによって、特定遺伝子の複数が組み込まれた、形質転換された株を迅速かつ簡単に得ることが可能となる。

最後に、発明者らは、アルカン資化酵母の株の新規な形質転換方法を開発することに成功し、該方法によって、安定に形質転換された、特定ポリペプチドの優良な産生レベルを有する株を得ることが可能となっている。

本発明の目的は、先行技術の不都合を改善し、異種タンパク質の産生を目的とした一つまたは複数の特定遺伝子を過剰産生する株を迅速に取得し、発現カセットを迅速に検証し、産生株を特徴付けられるようにすることである。

弱い変換レベルと形質転換の高い効率を可能にする選択マーカーを有する株が微生物として用いられる。

発現カセットを含んだベクターの構築と組み込みカセットを含んだベクターの構築とを可能とするベクターのセットが用いられる。

また、所定の遺伝子座へ組み込みカセットを組み込むことを含んだ、形質転換体を同定するための迅速な方法も用いられる。

最後に、本発明による方法によって、異種タンパク質の産生が可能となる。

より詳細には、本発明は、異種タンパク質の産生を目的とした一つまたは複数の特定遺伝子を過剰産生する株を迅速に取得するための、株と、ベクターと、選択マーカーと、表現型のテストと、挿入カセットの挿入の特徴付けとのセットを提案し、発現カセットを迅速に検証し、産生株を特徴付けることを提案するものであり、該セットは、
（ａ）栄養要求性、すなわちある種の培地における増殖性の欠如を付与する遺伝子が欠失した受容株と、
（ｂ）発現カセットを含む「発現ベクター」の構築を可能にするクローニングベクターのセットと、組み込みベクターの構築を可能にする「組み込みベクター」のセットと、
（ｃ）所定の遺伝子座へ組み込みカセットを組み込むことを含む、形質転換体を得るための方法、および形質転換体の同定方法と、
（ｄ）異種タンパク質の産生方法と、
を含んでいる。

したがって、本発明の第一の目的は、ヤロウイア株のゲノムにおいて、特定遺伝子の少なくとも三つのコピーを標的組み込みする方法に関するものであり、該方法は、
少なくとも三つの遺伝子における欠失過程であり、これら少なくとも三つの遺伝子が互いに独立して、これら欠失のそれぞれに関連する表現型が前記株の栄養要求性または優性形質に対応することを特徴とする欠失過程と、
ｂ）栄養要求性および／または優性形質を有する前記ヤロウイア株を、選択マーカーを含んだ少なくとも三つの組み換えベクターによって形質転換する過程であり、該選択マーカーによって、前記ヤロウイア株に対して、前記欠失のそれぞれから生じる栄養要求性および／または優性の表現型を補完することが可能となり、該組み換えベクターがそれぞれ、
ｉ）前記特定遺伝子の配列と、
ｉｉ）選択マーカーと、
ｉｉｉ）前記特定遺伝子の配列と前記選択マーカーを囲む二つのＤＮＡ配列であり、該二つのＤＮＡ配列が前記ヤロウイア株のゲノムにおける標的組み込みのための部位の端部に対応する配列に対して相同的であることによって、相同組み換えによって前記組み換えベクターの標的組み込みが可能となるようになっているＤＮＡ配列、
を含んでいる形質転換過程と、
ｃ）最小培地において、前記少なくとも三つの組み換えベクターを組み込んだ酵母を選択する過程と、
を含んでいる。

好ましい実施態様では、本発明による標的組み込み法は、欠失を有し、栄養要求性の表現型または優性形質の表現型に関連する遺伝子が、
−栄養要求性のマーカーについては、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２、ＡＤＥ２、ＨＩＳおよびＬＹＳ５から選択され、
−優性形質については、ハイグロマイシン耐性遺伝子ＨＹＧ４と、遺伝子ＭＤＲ３、ＫａｎＭＸ、ＨＰＨおよびＴｎ５ｂｌｅから選択される、
ことを特徴としている。

好ましくは、欠失を有する遺伝子は栄養要求性の表現型に関連し、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２およびＡＤＥ２が最も好ましい遺伝子である。

有利には、ＵＲＡ３の欠失はＵｒａ３−３０２の欠失に対応するが、該欠失は当業者には既知のものであり、とりわけＭＡＤＺＡＫ ｅｔ ａｌ．（２００４）に記載されている。

有利には、ＬＥＵ２の欠失はＬｅｕ２−２７０の欠失に対応するが、該欠失もまた、当業者には既知のものであり、とりわけＭＡＤＺＡＫ ｅｔ ａｌ．（２００４）に記載されている。

有利には、ＧＵＴ２の欠失は実施例に記載されているＧｕｔ２−７４４の欠失に対応する。Ｇｕｔ２−７４４は遺伝子ＧＵＴ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のＯＲＦの全体の欠失に対応し、該欠失は変異株ＦＦ−Ｌｕｇ（ＣＮＣＭ−３９１１）およびＦＦ−ｌｕｇａ（ＣＮＣＭ−３９１３）にある。切り出し後、ヤロウイアのゲノム上で、ＧＵＴ２のプロモーター配列と末端配列との間にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の配列が残る。

有利には、ＡＤＥ２の欠失は実施例に記載しているＡｄｅ２−８４４の欠失に対応する。Ａｄｅ２−８４４はＡＤＥ２遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のＯＲＦの完全な欠失に対応し、前記欠失は株ＦＦ−Ｌｕａ（ＣＮＣＭ−３９１２）およびＦＦ−ｌｕｇａ（ＣＮＣＭ−３９１３）にある。切り出し後、ヤロウイアのゲノムの上で、ＡＤＥ２のプロモーター配列と末端配列の間に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の配列が残る。

最小培地とは、ここではヤロウイア株が栄養要求性になる要素、あるいは場合によって株の選択を可能にする要素を含んでいない培地を意味する。

ヤロウイアの株は当業者にはよく知られているものである。このような株の好ましい例として、アルカン資化酵母の株を挙げることができる。

遺伝子の標的組み込みによる酵母の形質転換技術は、頻繁に用いられる分子生物学の技術である。この技術では、ＤＮＡ断片はベクター中でクローニングされ、該ベクターが形質転換すべき細胞中に導入され、前記ＤＮＡ断片が相同組み換えによって受容ゲノムの標的領域に組み込まれる（ＯＲＲ−ＷＥＡＶＥＲ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７８，ｐ：６３５４−６３５８，１９８１）。このような形質転換方法は当業者にはよく知られており、とりわけ、ＩＴＯ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５３，ｐ：１６３−１６８，１９８３）、ＫＬＥＢＥ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２５，ｐ：３３３−３４１，１９８３）およびＧＹＳＬＥＲ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ，Ｔｅｃｈｎ．，ｖｏｌ．４，ｐ：２８５−２９０，１９９０）に記載されている。この組み換え現象がまれである限り、形質転換後に、対応するマーカーを明らかにすることによって、断片の組み込みが生じた細胞の単離を可能にすることを目的として組み換えを保証する配列の間に選択マーカーが挿入される。

栄養要求性の補完を可能にする選択マーカーは、一般に栄養要求性マーカーとも呼ばれるものだが、当業者にはよく知られたものである。

ＵＲＡ３選択マーカーは当業者によく知られている。より特定的には、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードしているＵＲＡ３遺伝子（アルカン資化酵母についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１であり、該配列はアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｌａｂｒｉ．ｆｒ／Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ＃」において付託番号Ｙａｌｉ０Ｅ２６７１９ｇでアクセスすることもできる）が不活性（たとえば欠失によって）であるヤロウイア株は、ウラシルを補給していない培地では成長することができない。そこで、このヤロウイア株にＵＲＡ３選択マーカーを組み込むことによって、ウラシルのない培地においてこの株の増殖性を修復することが可能となる。

ＬＥＵ２選択マーカーはとりわけ米国特許第４９３７１８９号明細書に記載されており、やはり当業者によく知られたものである。より特定的には、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子ＬＥＵ２（Ｙａｌｉ０Ｅ２６７１９ｇ；アルカン資化酵母についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）が不活性（たとえば欠失によって）であるヤロウイア株は、ロイシンを補給していない培地では成長することができない。そこで、先述のように、このヤロウイア株にＬＥＵ２選択マーカーを組み込むことによって、ロイシンを補給していない培地においてこの株の増殖性を修復することが可能となる。

ＡＤＥ２選択マーカーも酵母の形質転換の分野では当業者にはよく知られている。ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコードするＡＤＥ２遺伝子（アルカン資化酵母についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３、ＹＡＬＩ０Ｂ２３１８８ｇ）が（たとえば欠失によって）不活性であるヤロウイア株は、アデニンを補給していない培地では成長することができない。ここでもまた、このヤロウイア株にＡＤＥ２選択マーカーを組み込むことによって、アデニンを補給していない培地においてこの株の増殖性を修復することが可能となる。

ＧＵＴ２遺伝子はグリセロール−３−ホスファート デヒドロゲナーゼ（アルカン資化酵母についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４、ＹＡＬＩ０Ｂ１３９７０ｇ）をコードし、（たとえば欠失による）その不活性化によって、生じる変異体は、炭素源がグリセロールに対応する非発酵性の培地では成長することができなくなる。

優性形質を有する表現型をヤロウイア株に与えるために選択マーカーとして使うことのできる耐性遺伝子の中では、
−Ｐ糖タンパク質をコードするマウス由来のＭＤＲ３遺伝子であり、該遺伝子がヤロウイア株で発現したとき、ＦＫ５２０（抗真菌薬かつ免疫抑制剤：ＲＡＹＭＯＮＤ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１４，ｐ：２７７−２８６，１９９４）に対する耐性を付与する遺伝子、
−糸状子嚢菌であるＡｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉのＴＥＦ遺伝子の転写配列と融合した、あるいは、あらゆる機能的な転写プロモーターまたは転写ターミネーターと融合した大腸菌のＴｎ９０３トランスポゾンに由来するｋａｎ^ｒ配列を含み、ヤロウイア株にジェネティシンに対する耐性を付与するＫａｎＭＸモジュール（Ｇ４１８；ＷＡＣＨ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ．１０，ｐ：１７９３−１８０８，１９９４）と、
−大腸菌のプラスミドに由来し、ハイグロマイシンＢに対する耐性を可能にするＨＰＨ（ＨＹＧ）遺伝子（ＧＲＩＴＺ ＆ ＤＡＶＩＥＳ，Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ．８，ｐ：６６７−６６８，１９９２；ＣＯＲＤＥＲＯ ＯＴＥＲＯ ＆ ＧＡＩＬＬＡＩＲＤＩＮ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，ｖｏｌ．４６，ｐ：１４３−１４８，２００４）と、
−大腸菌に由来し、形質転換した酵母がフレオマイシンに対する耐性を得ることができるようにするＴｎ５ｂｌｅ遺伝子（ＷＥＮＺＥＬ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ．８，ｐ：６６７−６６８，１９９２）、
を挙げることができる。

本発明による方法で使うことのできるその他の選択マーカーもまた、ＢＡＲＴＨ ＆ ＧＡＩＬＬＡＲＤＩＮ（Ｔｈｅ ｄｉｍｏｏｒｐｈｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．Ｉｎ：Ｎｏｎ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｙｅａｓｔｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗｏｌｆ Ｋ．Ｅｄ．）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐ：３１３−３８８，１９９６）に記載されている。

同様に好ましい実施態様では、本発明による標的組み込み法は、過程ｂ）において、前記ヤロウイア株のゲノムにある標的組み込みの部位が、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２、ＬＩＰ２、ＬＩＰ７、ＬＩＰ８、ＡＸＰ、ＧＵＴ２およびＸＰＲ２から選択されることを特徴としている。

好ましくは、標的組み込み法は、過程ｂ）において、前記ヤロウイア株のゲノムにある組み込みの部位が、破壊によって容易に検出可能な表現型（視覚化可能、測定可能）が与えられる遺伝子、とりわけ遺伝子ＵＲＡ３、ＡＤＥ２、ＬＩＰ２、ＬＩＰ８、ＡＸＰから選択されることを特徴としている。

遺伝子ＬＩＰ２（アルカン資化酵母についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５）は挿入遺伝子座として使うことができる。ＬＩＰ２遺伝子は細胞外リパーゼ（ＰＩＧＮＥＤＥ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１８２（１０），ｐ：２８０２−１０，２０００）をコードしており、該細胞外リパーゼはオレイン酸残基の長鎖トリグリセリドを好適に加水分解する。ＬＩＰ２遺伝子が（たとえば欠失によって）不活性のヤロウイア株は、縮小したリパーゼ活性を有することになる（弱い細胞外リパーゼ活性、トリブチリン培地の加水分解の弱いハロー）。

遺伝子ＬＩＰ８（アルカン資化酵母についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６）は挿入遺伝子座として使うことができる。遺伝子ＬＩＰ８はトリアシルグリセロール加水分解酵素をコードしている。遺伝子ＬＩＰ８が不活性（ＬＩＰ２を不活性化した後）であるヤロウイア株は、ＹＮＢＴ培地上でのトリブチリンの加水分解のハローを有することがなく、またリパーゼ活性もない（ＦＩＣＫＥＲＳ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４２，ｐ：２６４−２７４，２００５）。

遺伝子ＡＸＰ（アルカン資化酵母についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７）は挿入遺伝子座として使うことができる。ＡＸＰ遺伝子は、普通は培地のｐＨが４より低いときに発現する細胞外酸性プロテアーゼをコードしている。ＡＸＰ遺伝子が不活性（たとえば欠失によって）であるヤロウイア株は、酸性ｐＨにあるＹＮＢカゼイン培地で、カゼイン加水分解の縮小したハローと縮小したプロテアーゼ活性を有することになる（ＧＬＯＶＥＲ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４３，ｐ．：３０４５−５４，１９９７）。

ＸＰＲ２遺伝子は、培地のｐＨが６より高いときに発現する細胞外アルカリプロテアーゼをコードしている。遺伝子ＸＰＲ２（アルカン資化酵母についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８）が不活性（たとえば欠失によって）であるヤロウイア株は、ｐＨ６にあるＹＮＢカゼイン培地上でカゼイン加水分解の縮小したハローと縮小したプロテアーゼ活性を有することになる（ＤＡＶＩＤＯＷ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６９，ｐ．４６２１−９、１９８７）。

好ましくは、栄養要求性の前記ヤロウイア株は、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＡＤＥ２またはＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＧＵＴ２の遺伝子のうち少なくとも一つに欠失を含むものである。

たとえば、ブダペスト条約にしたがって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５，ＦｒａｎｃｅにＣＮＣＭ−３９１２という番号で２００８年２月４日に付託されたアルカン資化酵母の株を挙げることができる。

たとえば、ブダペスト条約にしたがって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５，ＦｒａｎｃｅにＣＮＣＭ−３９１１という番号で２００８年２月４日に付託されたアルカン資化酵母の株を挙げることができる。

有利には、本発明による方法の過程ａ）で用いられる栄養要求性のヤロウイア株は、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２およびＧＵＴ２を含む群の四つの遺伝子に対する栄養要求性の表現型をもたらす、四つの遺伝子のうちの一つの欠失を含んでいる。

ブダペスト条約にしたがって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ、２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５，ＦｒａｎｃｅにＣＮＣＭ−３９１３という番号で２００８年２月４日に付託されたアルカン資化酵母の株を挙げることができる。

本発明による方法の好ましい実施態様によると、該方法によって、特定遺伝子の３個から１０個のコピー、好ましくは４個から８個のコピー、より好ましくは前記特定遺伝子の５個から７個のコピーの標的組み込みが可能となる。

有利には、本発明による方法は栄養要求性の前記ヤロウイア株を、３個から１０個の組み換えベクター、好ましくは４個から８個の組み換えベクター、より好ましくは５個から７個の組み換えベクターによって形質転換することを含んでいる。

過程ｂ）で用いられる組み換えベクターはさらに、該組み換えベクターとは異なる一つまたは複数の選択マーカーを含むことができ、該選択マーカーによって、前記ヤロウイア株は、栄養要求性の補完と、場合によっては少なくとも三つの遺伝子の欠失から生じる優性形質の補完を行うことが可能となる。

選択マーカーをコードしている配列および特定遺伝子の配列はさらに、ヤロウイア株での発現に必要な要素を含んでいる。

このような要素はとりわけ、ヤロウイア株で活性のプロモーター配列および末端配列に対応する。好ましくは、用いられるプロモーター配列および末端配列は異なる遺伝子に帰属していることで、ヤロウイア株のゲノムにおいて望まれない組み換えの危険性を最小化するようになっている。

このようなプロモーター配列は当業者にはよく知られており、とりわけ誘導プロモーターまたは構成的プロモーターに対応してよい。本発明による方法で使うことのできるプロモーターの例として、とりわけ、アルカン資化酵母の遺伝子のプロモーターを挙げることができ、該プロモーターは、アルカン資化酵母のアシルＣｏＡオキシダーゼ２の遺伝子のＰＯＸ２プロモーターおよびＰＣＴ出願である国際公開第０１／８３７７３号に記載されているＬＩＰ２遺伝子のプロモーターのように、グルコースによって強く抑制され、脂肪酸またはトリグリセリドによって誘導可能である。また、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼの遺伝子のＦＢＡ１遺伝子のプロモーター（米国特許出願公開第２００５／０１３０２８０号明細書）、アンモニウムの輸送体遺伝子のＹＡＴ１遺伝子のプロモーター（米国特許出願公開第２００６／００９４１０２号明細書）、グリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランフェラーゼの遺伝子のＧＰＡＴ遺伝子のプロモーター（米国特許出願公開第２００６／００５７６９０号明細書）、ＴＥＦ遺伝子のプロモーター（米国特許出願公開第２００１／６２６５１８５号明細書）およびｈｐ４ｄのハイブリッドプロモーター（国際公開第９６／４１８８９号）を使うこともできる。

このような末端配列も当業者にはよく知られており、本発明による方法で使うことのできる末端配列の例として、ＰＫＧ１遺伝子の末端配列と、ＰＣＴ出願である国際公開第０１／８３７７３号に記載されているＬＩＰ２遺伝子の末端配列を挙げることができる。

特定遺伝子の産物を宿主細胞によって分泌させることを目的とするとき、前記挿入物はさらに、前記産物の分泌の制御シグナルを含む。この目的のために、ＰＣＴ出願である国際公開第０１／８３７７３号に記載されている、例えばＬＩＰ２遺伝子のプレプロ配列の全部または一部のような、ヤロウイア株において機能するシグナル配列を使うことができる。

特定遺伝子は、形質転換したヤロウイア株で大量に産生させようとするポリペプチドをコードしている。前記ポリペプチドは、好ましくは、例えばＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アスパラギナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９）または大腸菌のＬ−アスパラギナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０）のような異種ポリペプチドに対応するが、同様に、前述したアルカン資化酵母のＬＩＰ２リパーゼのような自己ポリペプチドに対応してもよい。

本発明による方法の特徴的な実施態様によると、ヤロウイア株の形質転換過程ｂ）と最小培地での選択過程ｃ）は、前記少なくとも三つの組み換えベクターそれぞれについて別々に行われる。

より好ましい実施態様によると、本発明による標的組み込み法は、過程ｂ）において、少なくとも三つの組み換えベクターを用いた形質転換が、組み換えベクターのそれぞれとは独立して、そして連続して行われ、あるいは、前記組み換えベクターの全体によって同時に行われ、また、これらの形質転換の全体の後に、最小培地における、前記組み換えベクターの全体を組み込んだ酵母の選択過程ｃ）が続くことを特徴としている。

また、好ましい実施態様によると、本発明による方法は、選択マーカーが前記組み換えベクターの標的組み込みの後に自身の切り出しを可能にする配列によって囲まれていることを特徴としている。

本発明による方法の第四の好ましい実施態様によると、選択マーカーは前記組み換えベクターの標的組み込みの後に自身の切り出しを可能とする配列によって囲まれている。

本発明の方法によって、新たな形質転換過程の際に、他の標的組み込みのために、同一の選択マーカー、とりわけ栄養要求性マーカーを再利用することが可能となる。

ヤロウイア株において、囲まれた配列の切り出しと除去とを可能にするこのような配列は当業者によく知られたものである。

たとえば、欧州特許第０９９４１９２号明細書または欧州特許公開第０６３５５７４号明細書に記載されているような組み換え事象を得るために、直接反復配列（ＤＲＳ）と呼ばれる二つの同一または類似した配列を使うことを挙げることができる。

たとえば、欧州特許第０２２０００９号明細書に記載されているような「Ｃｒｅ−ｌｏｘ」システムも挙げることができ、該システムにおいて、直接反復配列と同等の配列は、この場合、「ｌｏｘ」と呼ばれる特異的配列であり、二つの「ｌｏｘ」配列の間に含まれるＤＮＡ配列の切り出しは、発現ベクターによって発現した「Ｃｒｅ」リコンビナーゼの存在下で行われる。その他の特異的なリコンビナーゼを用いる同等のその他のシステムも当業者に知られており、とりわけ方法は欧州特許第０８１４１６５号明細書に記載されている。

もう一つの側面として、本発明は特定遺伝子によってコードされたポリペプチドの産生方法も対象としており、該方法は、
Ａ）本発明による標的組み込み法と、
Ｂ）形質転換された前記ヤロウイア株の増殖を可能にすることを目的とした、炭素、窒素および無機塩の同化源を含んだ液体培養培地におけるヤロウイア株の培養過程ｄ）と、
Ｃ）ヤロウイア細胞または過程Ｂ）で得られた培養培地から発現した前記特定ポリペプチドの回収、
を含むことを特徴としている。

有利には、本発明による方法は過程Ｃ）の後に、特定遺伝子によってコードされている前記ポリペプチドの精製過程ｅ）を含んでいる。

この精製過程ｅ）は細胞溶解の後、あるいは、有利には、細胞から分泌される培養培地から、それ自体は知られている従来の技術、たとえば分別沈殿に続く一回または複数回のクロマトグラフィー過程によって行うことができる。

本発明にしたがった方法によって得ることのできる形質転換したヤロウイアの細胞もまた、本発明の一部を構成している。

もう一つの側面によると、本発明はヤロウイアの修飾された株を得る方法に関するものであり、該方法は、少なくとも三つの遺伝子において欠失を含みそしてこれら少なくとも三つの遺伝子のそれぞれが独立していることを特徴とするヤロウイアの株をもたらすことを可能にする、少なくとも三つのベクターによって、前記ヤロウイア株を形質転換する過程を含んでおり、これらの欠失のそれぞれに関連する表現型が前記株に対する栄養要求性または優性形質に対応することを特徴としている。

好ましくは、ここでは、栄養要求性または優性形質の表現型に関係する少なくとも三つの遺伝子の欠失は、
−栄養要求性のマーカーについては、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２、ＡＤＥ２、ＨＩＳおよびＬＹＳ５、好ましくは遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２およびＡＤＥ２から選択され、
−優性形質については、ハイグロマイシン抵抗遺伝子ＨＰＨ（ＨＹＧ）と、遺伝子ＭＤＲ３、ＫａｎＭＸおよびＴｎ５ｂｌｅから選択され、ＨＹＧ遺伝子が耐性遺伝子の中で最も好ましい遺伝子である。

好ましい実施態様では、本発明によるヤロウイアの修飾株を得る方法は、欠失を有する遺伝子が栄養要求性の表現型に関連し、好ましくは遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２およびＡＤＥ２から選択されることを特徴とする。

最後の側面として、本発明は、本発明によるヤロウイアの修飾株を得る方法によって得ることのできる、栄養要求性のヤロウイア株と、場合によっては、後天的な優性形質を有するヤロウイア株も対象としており、該株は、ゲノムの少なくとも三つの遺伝子において欠失を含み、そしてこれら少なくとも三つの遺伝子のそれぞれが独立して、これらの欠失のそれぞれに関連する表現型が前記株に対する栄養要求性または優性形質に対応することを特徴としている。欠失した遺伝子の数に対して決まっているそれぞれの選択は、遺伝子が本発明による組み込み方法の過程ａ）について定義されているように欠失について選ばれているため、この方法でも好まれる。

有利には、この方法で得られる前記ヤロウイア株はアルカン資化酵母の株である。

好ましくは、栄養要求性の前記ヤロウイア株は、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＡＤＥ２、または、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＧＵＴ２のうち少なくとも一つの変異を含む。

たとえば、ブダペスト条約にしたがって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５，ＦｒａｎｃｅにＣＮＣＭ Ｉ−３９１１およびＣＮＣＭ Ｉ−３９１２という番号で２００８年２月４日に付託されたアルカン資化酵母の株を挙げることができる。

第二の好ましい実施態様によると、本発明による方法で使うことのできる栄養要求性のヤロウイア株は、前記株の増殖に必要な四つの遺伝子のうち一つの変異を含み、該三つの遺伝子はＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２、ＬＩＰ２、ＬＩＰ７、ＬＩＰ８、ＡＸＰ、ＧＵＴ２およびＸＰＲ２を含む群から選択される。

好ましくは、前記栄養要求性のヤロウイア株は、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２およびＧＵＴ２のうち少なくとも一つの変異を含む。

たとえば、ブダペスト条約にしたがって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５，ＦｒａｎｃｅにＣＮＣＭ Ｉ−３９１３という番号で２００８年２月４日に付託されたアルカン資化酵母の株を挙げることができる。

本発明は、本発明にしたがったアルカン資化酵母の形質転換された株の取得に関する非限定的な実施例を示す、図面およびその解説と以下に続く説明による補足によってより良く理解されるものである。

「発現カセット」の標的「組み込みカセット」の構築を示す概略図である。 クローニングベクターの概略図である。 組み込みベクターおよび標的組み込みのカセットの取得の概略図を示す図である。 ランダムな組み込みのための組み込みベクターの概略図である。 さまざまな数の遺伝子のコピーを含んだ株におけるアスパラギナーゼの発現を示す図である。 遺伝子座ＵＲＡ３での挿入を検証するためのＳｕｃ＋／Ｓｕｃ−表現型の分析を示す図である。 遺伝子座ＬＩＰ２での挿入を検証するためのＬｉｐ＋／Ｌｉｐ−表現型の分析を示す図である。 形質転換体におけるＲＴ−ｑＰＣＲによるＬＩＰ２遺伝子およびＡｓｐ遺伝子のコピーの数の判定を示す図である。

図１は「発現カセット」の標的「組み込みカセット」の構築を示す概略図である。１）特定遺伝子は発現ベクター中でクローニングされ、２）発現カセットは、Ｉ−ＳｃｅＩの消化によって遊離し、３）次に、さまざまな組み込みベクターの中でクローニングされ、４）組み込みカセットはＮｏｔＩの消化によって遊離し、精製され、組み込み株を形質転換するために利用される。

図２はクローニングベクターの概略図である。１）クローニングベクターは強いプロモーターを含み、該プロモーターの後ろには特定遺伝子をクローニングするための唯一の制限部位と転写ターミネーターが続き、両側には発現カセットの切り出しを可能にするための稀な部位を含んでいる。２）ベースベクターｐＶＣは部位ＣｌａＩ、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＡｖｒｌｌから構成される複数の部位を含み、ＬＩＰ２遺伝子の末端配列（ＬＩＰ２ｔｅｒｍ）は両側に稀な部位Ｉ−Ｃｅｕｌを伴い、３）発現ベクターは部位ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩでクローニングされるプロモーターｐＰＯＸ２を含んでおり、４）発現カセットは、特定遺伝子の複数部位でのクローニングによって、たとえばＢａｍＨＩ−ＡｖｒＩＩで得られ、発現ベクターの消化はＩ−ＣｅｕＩによって行われる。

図３は組み込みベクターおよび標的組み込みのカセットの取得の概略図を示す図である。１）組み込みベクターは、組み込みカセットの切り出しを目的として、両側に稀な部位１を伴う挿入遺伝子座の上流領域（プロモーターという意味で領域Ｐ）と挿入遺伝子座の下流領域（末端という意味で領域Ｔ）とを含んでいる。領域ＰとＴの間に二つの稀な部位があり、稀な部位２は選択マーカーを挿入するためであり、稀な部位３は発現カセットを挿入するためである。

図４はランダムな組み込みのための組み込みベクターの概略図である。Ｉ）プラスミド部分から発現カセットを遊離させるために使用可能な稀な部位１と、アルカン資化酵母用の選択マーカーをクローニングするための稀な部位２とを含んだベクターの概略図である。該ベクターは、部位ＣｌａＩとＢａｍＨＩの間にプロモーター（ここではｐＰＯＸ２プロモーター）を含み、ＬＩＰ２遺伝子のターミネーターおよびランダムな組み込みのためのゼータ領域を含んでいる（増幅に関する特許参照）。ＪＭＰ６１の種類はＬｉｐ２リパーゼのアドレッシング配列を有している。ＩＩ）稀な部位１としての部位ＮｏｔＩおよび、マーカーＵＲＡ３、ＬＥＵ２、Ｈｙｇ、ＧＵＴ２およびＡＤＥ２を挿入するために用いられる稀な部位２としての部位Ｉ−ＳｃｅＩによって構築された、ランダムな組み込みのための組み込みベクターの概略図である。

図５はさまざまな数の遺伝子のコピーを含んだ株におけるアスパラギナーゼの発現を示す図である。Ａ）電気泳動ゲル１０％ＮｕＰＡＧＥでの分析とコロイダルブルーによる染色（３０μｌの上澄みと同等）、Ｂ）電気泳動ゲル１０％ＮｕＰＡＧＥでの分析、ならびに抗アスパラギナーゼ抗体を用いたウェスタンブロット法による移動および検出（１０μｌの上澄みと同等）。バンドａはグリコシル化していないタンパク質に対応し、バンドｂはモノグリコシル化したタンパク質に対応する。Ｌ１はＦＦ−ｌｕｇａ受容株、Ｌ２は５ＬＡｓｐ１株：ａｄｅ２：：ＧＵＴ２−Ａｓｐ、１コピー、Ｌ３は６ＬＡｓｐ１株：ａｄｅ２：：ＧＵＴ２−Ａｓｐ、１コピー、Ｌ４は１５ＬＡｓｐ２株：ａｄｅ２：：ＧＵＴ２−Ａｓｐ ｌｉｐ２：：ＵＲＡ３−Ａｓｐ、２コピー、Ｌ５は２１ＬＡｓｐ２株：ａｄｅ２：：ＧＵＴ２−Ａｓｐ ｌｉｐ２：：ＵＲＡ３−Ａｓｐ、：２コピー、Ｌ６は１ＬＡｓｐ３株：ａｄｅ２：：ＧＵＴ２−Ａｓｐ ｌｉｐ２：：ＵＲＡ３−Ａｓｐ ｌｅｕ２：：ＡＤＥ２−Ａｓｐ：３コピー、Ｌ７は２ＬＡｓｐ４株：ａｄｅ２：：ＧＵＴ２−Ａｓｐ ｌｉｐ２：：ＵＲＡ３−Ａｓｐ ｌｅｕ２：：ＡＤＥ２−Ａｓｐ ｕｒａ３：：ＬＥＵ２−Ａｓｐ：４コピーである。

図６：遺伝子座ＵＲＡ３での挿入を検証するためのＳｕｃ＋／Ｓｕｃ−表現型分析。遺伝子座ＵＲＡ３での標的組み込みカセットで得られる形質転換体をグルコース（ＹＰＤ）とショ糖（ＹＰＳ）の豊富な培養皿上で画線ごとにテストした。受容株Ｓｕｃ＋ＦＦ−ｌｕｇ、ＦＦ−ｌｕａおよびＦＦ−ｌｕｇａを対照として用いた。

図７：遺伝子座ＬＩＰ２での挿入を検証するためのＬｉｐ＋／Ｌｉｐ−表現型分析。遺伝子座ＬＩＰ２での標的組み込みカセットで得られた形質転換体をオレイン酸の豊富な培地（ＹＰＤ２Ｏ２）で培養した。アスパラギナーゼのさまざまなコピーを含んだ株の上澄みにおけるリパーゼ活性。受容株Ｌｉｐ＋ＦＦ−ｌｕｇａを対照として用いた。遺伝子座ＡＤＥ２に１つのコピーを伴う株（ａｄｅ２：：ＧＵＴ２−Ａｓｐ）：５ＬＡｓｐ１および６ＬＡｓｐ１、遺伝子座ＡＤＥ２に１つのコピーと遺伝子座ＬＩＰ２に１のコピーを伴う株（ａｄｅ２：：ＧＵＴ２−Ａｓｐ，ｌｉｐ２：：ＵＲＡ３−Ａｓｐ）：１４ＬＡｓｐ２、１５ＬＡｓｐ２、１６ＬＡｓｐ２、１７ＬＡｓｐ２および２１ＬＡｓｐ２。

図８：形質転換体におけるＲＴ−ｑＰＣＲによるＬＩＰ２遺伝子およびＡｓｐ遺伝子のコピーの数の判定。

実施例１：実施例で用いられる株
本発明の方法で用いられる株はアルカン資化酵母の野生株、とりわけＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｗ２９（ＡＴＣＣ ２０４６０、ＣＩＲＭ（Ｃｅｎｔｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｅｎｎｅｓ））のコレクションにおいてＣＬＩＢ８９に分類されている）の野生株から派生したものである。

したがって、Ｐｏ１ｄ株［ロイシン（Ｌｅｕ−）およびウラシル（Ｕｒａ−）に対して栄養要求性の株］を介してＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＴＣＣ ２０４６０から派生した新規の変異株を用いることができ、該Ｐｏ１ｄ株は、Ｇ．Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．の雑誌論文：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．ｉｎ：Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｗｏｌｆ，Ｋ．，Ｅｄ．）Ｖｏｌ．１，１９９９，ｐｐ．３１３−３８８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇに記載されている。該株はＣＩＲＭではＣＬＩＢ１３９に分類されている。

これらの新規の受容株（ＦＦ−ｌｕ、ＦＦ−ｌｕｇ（ＣＮＣＭ Ｉ−３９１１）、ＦＦ−ｌｕａ（ＣＮＣＭ Ｉ−３９１２）、ＦＦ−ｌｕｇａ（ＣＮＣＭ Ｉ−３９１３））の取得については後で説明することにする。

株の取得
本発明の方法で使用可能な受容変異株は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｗ２９の野生株から派生した株Ｐｏ１ｄから得ることができる。Ｐｏ１ｄ株はロイシン（ｌｅｕ−）およびウラシル（ｕｒａ−）に対して栄養要求性の株である。該株は、Ｇ．Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．の雑誌論文：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．ｉｎ：Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｗｏｌｆ，Ｋ．，Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１，１９９６，ｐｐ．３１３−３８８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。該株はＣＩＲＭのコレクションではＣＬＩＢ１３９に分類されている。本発明の方法で使うことのできる変異株は、栄養要求性を与える、すなわち、ある特定の培地での増殖性を欠如させる遺伝子の欠失を挿入することで得ることができ、該培地の遺伝子は欠失、可能であれば、不可逆的であり、有利には遺伝子の完全な欠失に対応する欠失であり、該遺伝子に対応する遺伝子は組み込みカセットを組み込んだ形質転換体の選択を目的とし選択マーカーとして使うことができるものである。欠失は、転換率を減少させるために、選択マーカーの構築に使われる対応するカセットと比べて大きな欠失を有することになる。

１．ＧＵＴ２遺伝子の欠失（Δｇｕｔ２−７４４）、ＧＵＴ２マーカーの構築および変異株ＦＦ−ｌｕｇ（ＣＮＣＭ Ｉ−３９１１）の取得。
１．１ ＧＵＴ２遺伝子の欠失（Δｇｕｔ２−７４４）。
この株を得るためには以下のように進めることができる。
１）欠失させようとする特定遺伝子を選択する。
２）クローニングまたはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって遺伝子の上流領域（「プロモーター」領域、Ｐという記号で表す）および遺伝子の下流の領域（「末端」領域、Ｔという記号で表す）を増幅することで破壊カセットを構築する。
３）両側に組み換え配列を含んだ選択マーカー（有利にはｌｏｘＰまたはｌｏｘＲ配列またはその派生配列）を導入し、該配列によってマーカーを除去するために該配列中での組み換えが可能となる（有利には、リコンビナーゼｃｒｅの作用下での組み換えを可能にするｌｏｘＰタイプの配列）。
４）破壊カセットによって形質転換し、欠失した特定遺伝子によって株を選択し（形質転換と形質転換体の選択）、遺伝子の破壊を検証する。
５）リコンビナーゼ（有利には、配列ｌｏｘＰ／ｌｏｘＲの組み換えおよびマーカーの除去を可能にするリコンビナーゼｃｒｅ）の発現を可能にするベクターによって形質転換する。
６）特定遺伝子の欠失を有し、リコンビナーゼの発現プラスミドを失っているクローンを単離する。

栄養要求性（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）の変異体ＦＦ−ｌｕから、ロイシンおよびウラシルに対して栄養要求性であり（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）、炭素源としてグリセロールを使うことのできない（ｇｌｙ−）アルカン資化酵母の変異株ＦＦ−ｌｕｇを構築した。第一の過程は、ＰＣＲ断片ＧＵＴ２−ＰＵｅｘＴ（ＪＭＥ７４４）を形質転換し、ＹＮＢｃａｓａ上でＵｒａ＋を選択して、破壊カセットｇｕｔ２：：ＵＲＡ３ｅｘによる遺伝子ＧＵＴ２の欠失によってウラシルに対して原栄養体の（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ＋）ＦＦ−ｌｕｇ：：ＵＲＡ３株を構築することである。リコンビナーゼＣｒｅおよびマーカーＬＥＵ２（Ｃｒｅ−ＬＥＵ２）を含んだ複製ベクターｐＲＲＱ２によって形質転換し、ウラシルに対して栄養要求性Ｌｅｕ＋である形質転換体を選択して、マーカーＵＲＡ３ｅｘを切り出すことで、ウラシルに対する栄養要求性（Ｌｅｕ＋、Ｕｒａ−）を選択した。プラスミドｐＲＲＱ２は、ＹＰＤの豊富な培地での培養およびクローンの単離（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、Ｇｌｙ−）によって行なわれた。

これら変異体の構築の概略は以下の表１にまとめている。

遺伝子ＧＵＴ２のための破壊カセットは、上流領域（領域Ｐ、Ｙａｌｉ０Ｂ：１８７３５１８．．１８７２４００補充、１１１９ｂｐ）と下流領域（領域Ｔ、Ｙａｌｉ０Ｂ：１８７０４６８．．１８６９６５２補充、８１７ｂｐ）の増幅によって構築され、これによって、遺伝子の変換を最小化するために、ＧＵＴ２遺伝子のＯＲＦ（ＹａｌｉＯＢ１８７０４６９．．１８７２４０１）の欠失が可能となり、選択マーカーＧＵＴ２ｅｘ−０．５との相同性（領域Ｐとは４８５ｂｐ、領域Ｔでは５６ｂｐ）が残される。選択マーカーｅｘは表１１に示している。

領域Ｐおよび領域Ｔは、プライマーＧ３ＰＤ−Ｐ１、Ｇ３ＰＤ−Ｐ２、Ｇ３ＰＤ−Ｔ１およびＧ３ＰＤ−Ｔ２（表９）によって増幅した。

プライマーＧ３ＰＤ−Ｐ２およびＧ３ＰＤ−Ｔ１は、切り出し可能な選択マーカーＵＲＡ３ｅｘを挿入するための稀な部位Ｉ−ＳｃｅＩを含んでいる。プラスミドｐＧＥＭ−ＧＵＴ２−ＰＴ（ＪＭＥ７４３）を与えるために断片ＰＴをｐＧＥＭ−Ｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングした。プラスミドＪＭＥ５０７に由来するＩ−ＳｃｅＩ部位へマーカーＵＲＡ３ｅｘを挿入することで、破壊プラスミドｐＧＥＭ−ＧＵＴ２−ＰＵｅｘＴ（ＪＭＥ７４４）を得た。

破壊カセット（３２４５ｂｐ）はプライマーＧ３ＰＤ−Ｐ１およびＧ３ＰＤ−Ｔ２を用いたＰＣＲによって得た。ＰＣＲ産物は抽出ゲルのキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、アガロースゲル上で精製した。株は酢酸リチウム法によって形質転換した。形質転換体Ｕｒａ＋は培地ＹＮＢｃａｓａ上で選択した。

形質転換体Ｕｒａ＋は典型的な形質転換率で得られた（Ｆｉｃｋｅｒｓ，２００３）。遺伝子ＧＵＴ２の破壊は、領域Ｐの５’にあるプライマー（Ｇ３ＰＤｖｅｒ１）と領域Ｔの３’にあるプライマー（Ｇ３ＰＤｖｅｒ２）を用いて、ＰＣＲによって検証した。次に、変異体ＪＭＹ１２０２ ｇｕｔ２：：ＵＲＡ３ｅｘを複製プラスミドｐＲＲＱ２（ｐＫＳ Ｃｒｅ ＡＲＳ６８ ＬＥＵ２；ＪＭＥ４６１）によって形質転換した。得られた形質転換体はマーカーＵＲＡ３の切り出しのためにスクリーニングし、リコンビナーゼｃｒｅの複製発現プラスミドは、ＹＰＤの豊富な培地での培養とクローン（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、Ｇｌｙ−）の単離によって消失した。変異体ＪＭＹ１３４６（ＦＦ−ｌｕｇ）を選択した。

変異体ＪＭＹ１３４６の遺伝子座ｇｕｔ２−８４４での配列を、プライマーＧ３ＰＤｖｅｒ１およびＧ３ＰＤｖｅｒ２を用いて増幅した。サイズが２４１５ｂｐのＰＣＲ産物を配列決定した。得られた配列は、マーカーＵｒａ３の配列を有さないことを示した。切り出し後、ゲノム上の遺伝子座ＧＵＴ２のＰとＴの間には、以下の配列が残った：ＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣＧＡＧＡＡＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＣＧＣＴＴＣＧＧＡＴＡＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＡＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、すなわちＩ−ＳｃｅＩ部位−ＬｏｘＲ配列−Ｉ−ＳｃｅＩ部位）。

１．２ マーカーＧＵＴ２ｅｘの構築
マーカーＧＵＴ２ｅｘを構築するために、遺伝子座ＧＵＴ２のゲノム配列をプライマーＧ３ＰＴＳおよびＧ３ＰＴＲ（表８）を用いて増幅し、ＥｃｏＲＩ部位のベクターｐＫＳ−ＬＰＲ（Ｆｉｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．５５，ｐ：７２７−７３７）でクローニングした。該マーカーは、４９２ｂｐのプロモーターと、遺伝子ＧＵＴ２のＯＲＦ（ＯＲＦ Ｙａｌｉ０Ｂ：１８７０５４６．．１８７２３８４）および末端を１３２ｂｐ含み、該末端は、配列Ｙａｌｉ０Ｂ：１８７２８７６．．１８７０４１７に対応する。このＯＲＦはＢａｍＨＩという２つの部位とＥｃｏＲＩという１つの部位を含み、該部位はサイレント変異を導入することで、定方向突然変異によって除去した。
以下のプライマーを用いた：第一のＢａｍＨＩ部位（ｇｇＡｔｃｃからｇｇＣｔｃｃ）についてはＧ３ＰＢ１ＳおよびＧ３ＰＢ１Ｒ、第二のＢａｍＨＩ部位（ｇｇａｔｃＣからｇｇａｔｃＴ）についてはＧ３ＰＢ２ＳおよびＧ３ＰＢ２Ｒ、そしてＥｃｏＲＩ部位（ｇａＡｔｔｃからｇａＧｔｔｃ）についてはＧ３ＰＥ１ＳおよびＧ３ＰＥ１Ｒである（表９）。

マーカーは二つの方向に挿入することができる。このマーカーＧＵＴ２ｅｘ０．５に関しては、ｐＫＳ−ＬＰＲにおいてはセンス１のみが得られた。配列決定による検証の後、修飾されたマーカーＧＵＴ２ｅｘ０．５を含むプラスミドはＪＭＥ７９２である。

マーカーＧＵＴ２ｅｘ０．５（段落１．３）から形質転換体を得る困難性のため、それぞれ１ｋｂと１．５ｋｂのプロモーターを含むその他二つのマーカーＧＵＴ２ｅｘ１．０およびＧＵＴ２ｅｘ１．５を構築した。これらのプロモーターはそれぞれ、プライマーＰ１ＫＢおよびＰＮＨＥ１とＰ１５ＫＢおよびＰＮＨＥ１を用いてｇＤＮＡ（アルカン資化酵母の株Ｅ１５０）から増幅した。クローニングは、ｐＫＳ−ＬＰＲ（脱リン酸化したＥｃｏＲＩ）、ＰＣＲ産物（ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩ）ならびにＪＭＥ７９２に由来する修飾されたマーカーＧＵＴ２ｅｘの残り（ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ）の間の３つの経路をライゲーションすることで行った。センス１におけるマーカーＧＵＴ２ｅｘ１．０はＪＭＥ９１９に対応し、センス２ではＪＭＥ９２０に対応している。センス１におけるマーカーＧＵＴ２ｅｘ１．５はＪＭＥ９２１に対応し、センス２ではＪＭＥ９２２に対応している。

１．３ マーカーＧＵＴ２ｅｘ０．５、ＧＵＴ２ｅｘ１．０およびＧＵＴ２ｅｘ１．５による形質転換。
マーカーＧＵＴ２ｅｘの使用を有効にするために、マーカーＧＵＴ２ｅｘ０．５はＩ−ＳｃｅＩの消化によってプラスミドＪＭＥ７９２（ｐＫＳ−ＬＰＲ−ＧＵＴ２ｅｘ０．５）から単離し、プラスミドＪＭＰ６２ Ｉ−ＳｃｅＩ（ＪＭＥ８０１）のＩ−ＳｃｅＩ部位に挿入することで、プラスミドＪＭＰ６２Ｇｕｔ２−ｅｘ０．５（ＪＭＥ８０５）を得た。

プラスミドＪＭＥ８０５はＮｏｔＩによって消化され、酢酸リチウム法で株ＦＦ−ｌｕｇを形質転換するために用いた。形質転換体は、ウラシル（１００ｍｇ／Ｌ）を補給したグリセロール１％のＹＮＢｃａｓａ培地で選択した。複数回の試行の後にも、このマーカーでは形質転換体が得られなかった。

まず、本発明者らはプロモーター部分（４９２ｂｐ）の欠失が強過ぎるという仮説を立てた。したがって、より長いプロモーター部分を含むその他の２つのマーカー（段落１、２参照）、すなわちマーカーＧＵＴ２ｅｘ１．０およびＧＵＴ２ｅｘ１．５を構築した。同一の結果が得られた。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、Δｇｕｔ２株に対するグリセロールの存在下でのグルコース使用の抑制が記載されている。実際、株ＦＦ−ｌｕｇは前述した２つの炭素源の存在下では成長することができない。本発明者らの形質転換方法を修正し、形質転換体を得た。この新しい形質転換方法は酢酸リチウムおよびポリエチレングルコールを用いた方法と同一のままであり（Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．１９８５）、該方法に、選択培地で形質転換を展開する前の発現過程を加えている。この発現段階は、１０分間にわたる４２℃での熱衝撃の後、行った。３分間、２０００ｒｐｍで形質転換体を遠心分離し、ＴＥ ｐＨ８の緩衝液を２ｍＬ用いて細胞を洗浄した。この洗浄は２回繰り返した。次に、細胞は、酵母抽出物１％、ペプトン１％およびＤ形グルコース０．２％の培養培地にとった。

攪拌せずに、２８℃で１６時間にわたってインキュベーションを行った。改めて、３分間、２０００ｒｐｍで遠心分離を行い、ＴＥ ｐＨ８の緩衝液を２ｍＬ用いて細胞を洗浄した。この洗浄は２回繰り返した。次に、細胞を、２ｍＬのＴＥにとり、単一の炭素源としてグリセロール１％を含有する選択培地に広げた。

株ＦＦ−ｌｕｇにおけるマーカーＧＵＴ２ｅｘ１．０の形質転換の結果は、以下の表２に示している。

２．遺伝子ＡＤＥ２の欠失（Δａｄｅ２−８４４）、マーカーＡＤＥ２の構築および変異株ＦＦ−ｌｕａ（ＣＮＣＭ Ｉ−３９１２）およびＦＦ−ｌｕｇａ（ＣＮＣＭ Ｉ−３９１３）の取得。
２．１ 遺伝子ＡＤＥ２の欠失（Δａｄｅ２−８４４）
これらの株を得るためには以下のように進めることができる。変異体ＦＦ−ｌｕから、株ＦＦ−ｌｕａ、Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、Ａｄｅ−を構築し、変異体ＦＦ−ｌｕｇから、株ＦＦ−ｌｕｇａ Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、Ａｄｅ−、Ｇｌｙ−を構築する。

２．１ａ 栄養要求性の変異体ＦＦ−ｌｕ（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）から、ロイシン、ウラシルおよびアデニンに対して栄養要求性の（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、Ａｄｅ−）アルカン資化酵母の変異株ＦＦ−ｌｕａを構築した。第一の過程は、カセットＮｏｔＩ ＰＴＡｄｅ２−Ｕｒａ３Ｅｘ（ＪＭＥ８４４）を形質転換し、アデニン（８００ｍｇ／Ｌ）を補給したＹＮＢｃａｓａ上でＵｒａ＋を選択して、破壊カセットＡｄｅ２：：Ｕｒａ３ｅｘによるＡＤＥ２遺伝子の欠失によってウラシルに対して原栄養体（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ＋、Ａｄｅ−）の株ＦＦ−ｌｕａ：：ＵＲＡ３を構築することである。リコンビナーゼＣｒｅおよびマーカーＬＥＵ２（Ｃｒｅ−ＬＥＵ２）を含有する複製ベクターｐＲＲＱ２によって形質転換し、ウラシルに対して栄養要求性Ｌｅｕ＋の形質転換体を選択することで、マーカーＵＲＡ３ｅｘの切り出しによってウラシルに対する栄養要求性（Ｌｅｕ＋、Ｕｒａ−、ａｄｅ−）を選択した。リコンビナーゼｃｒｅの発現の複製プラスミドｐＲＲＱ２の消失は、ＹＰＤの豊富な培地およびクローンの単離（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、Ａｄｅ−）によって行なわれた。変異体ＪＭＹ１４０９（ＦＦ−ｌｕａ）を選択した。

２．１．ｂ．栄養要求性であり（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）、炭素源としてグリセロールを使うことができない（Ｇｌｙ−）変異体ＦＦ−ｌｕｇから、ロイシン、ウラシルおよびアデニンに対して栄養要求性であり（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、Ａｄｅ−）、炭素源としてグリセロールを使うことができない（Ｇｌｙ−）アルカン資化酵母の変異株ＦＦ−ｌｕｇａを構築した。第一の過程は、カセットＮｏｔＩ ＰＴＡｄｅ２−ＰＵｒａ３ＥｘＴ（ＪＭＥ８４４）を形質転換し、アデニン（８００ｍｇ／Ｌ）を補給したＹＮＢｃａｓａ上でＵｒａ＋を選択し、破壊カセットａｄｅ２：：ＵＲＡ３ｅｘによる遺伝子ＡＤＥ２の欠失によって、ロイシンおよびアデニンに対して栄養要求性（Ｌｅｕ−、Ａｄｅ−、Ｕｒａ＋）の株ＦＦ−ｌｕｇａ：：ＵＲＡ３を構築することである。リコンビナーゼＣｒｅおよびマーカーＬＥＵ２（Ｃｒｅ−ＬＥＵ２）を含有する複製ベクターｐＲＲＱ２によって形質転換し、ウラシルに対して栄養要求性の形質転換体Ｌｅｕ＋を選択することで、マーカーＵＲＡ３ｅｘの切り出しによって、ウラシルに対する栄養要求性（Ｌｅｕ＋、Ｕｒａ−）を選択した。プラスミド：ｐＲＲＱ２の消失は、ＹＰＤの豊富な培地での培養とクローン（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、Ａｄｅ−、Ｇｌｙ−）の単離によって行われた。変異体ＪＭＹ１４０４（ＦＦ−ｌｕｇａ）を選択した。

これらの変異体の構築の概略は以下の表３にまとめている。

遺伝子ＡＤＥ２用の破壊カセット（Ｙａｌｉ０Ｂ２３１８８ｇ、ｔｒ｜Ｑ９Ｐ４Ｖ１ Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉに極めて似ている）は、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼをコードし、５６５ａａ（Ｙａｌｉ０Ｂ：３０３０４６０．．３０３２１５７、センス）から取られたタンパク質だが、該カセットは、上流領域（領域Ｐ；Ｙａｌｉ０Ｂ：３０２９０１１．．３０２９９３１、９２０ｂｐ）と下流領域（領域Ｔ；７９２ｂｐ、Ｙａｌｉ０Ｂ：３０３１８７１．．３０３２６６２）の増幅によって構築され、これによって、ＡＤＥ２遺伝子のＯＲＦ（Ｙａｌｉ０Ｂ：３０３０４６０．．３０３２１５７）の欠失が可能となる。除去された領域は１９３９ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｂ：３０２９９３２．．３０３１８７０）であり、該領域は、遺伝子の変換を最小化するために、選択マーカーＡＤＥ２ｅｘとは非常に低い相同性（領域Ｐとは０ｂｐ、領域Ｔでは４１５ｂｐ）しか残さなかった。マーカーＡＤＥ２ｅｘは２３１９ｂｐのＹａｌｉ０Ｂ：３０２９９６１．．３０３２２８０断片の領域に対応している。選択マーカーｅｘは表１１に示している。

領域ＰおよびＴは、以下のプライマー、Ｐ１ＡＤＥ２、Ｐ２ＡＤＥ２、Ｔ１ＡＤＥ２、Ｔ２ＡＤＥ２（表９）によって増幅した。

プライマーＰ２およびＴ１は、切り出し可能な選択マーカーＵＲＡ３ｅｘを挿入するための希少な部位Ｉ−ＳＣｅＩを含んでいる。プライマーＴ１はまた、発現カセットを挿入するための希少な部位Ｉ−ＣｅｕＩも含んでいる。プライマーＰ１およびＴ２は、ｐＨＳＳ６−ＮｏｔＩ（ＪＭＥ８００）でのクローニングを行うための希少な部位ＮｏｔＩを含んでいる。ＰＴ断片は、ＮｏｔＩで消化したＪＭＥ８００でクローニングし、脱リン酸化することで、向き１（センス１、ＪＭＥ８１３）または向き２（センス２、ＪＭＥ８１４）のプラスミドｐＡＤＥ２−ＰＴを産生させた。方向は、部位Ｉ−ＳｃｅＩの方向にしたがって決定される。すなわち、センス方向のＩ−ＳｃｅＩ部位に対するセンス１あるいは補完方向のＩ−ＳｃｅＩ部位に対するセンス２である。破壊プラスミドｐＰＴＡｄｅ２−Ｕｒａ３Ｅｘ（ＪＭＥ８４４）は、プラスミドＪＭＥ８１３のＩ−ＳｃｅＩ部位にマーカーＵＲＡ３ｅｘを挿入することで得た。

ＮｏｔＩの消化と３０８９ｂｐのバンドを精製することで破壊カセットを得た。株Ｐｏ１ｄは酢酸リチウム法によって形質転換した。形質転換体Ｕｒａ＋は、アデニン（１００ｍｇ／Ｌ）を補給したＹＮＢｃａｓａ培地で選択した。栄養要求性の補完に必要な、用いられる典型的な濃度は、一般的に、１００から２００ｍｇ／Ｌの間に含まれる。

形質転換体Ｕｒａ＋は低い形質転換率、ＤＮＡのマイクログラムあたりおよそ５０個の形質転換体という率で得られ、形質転換体の分析によって、該形質転換体がｕｒａ３−３０２マーカーの変換を含み、遺伝子ＡＤＥ２の欠失は含まないことが明らかになった。

アデニンの濃度を徐々に高めて複数回の破壊試験を行った。ＤＮＡのμｇあたり１０３個の形質転換体より高い形質転換率を得るためには、培地中に４００ｍｇ／Ｌより高いアデニンの濃度が必要である。補完のために用いた濃度は８００ｍｇ／Ｌであった。

ＡＤＥ２遺伝子の破壊を有する形質転換体が得られたのはこれらの条件によってのみであった。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとは逆に、Ａｄｅ−株はバラ色ではなかった。逆に、アルカン資化酵母のＡｄｅ−クローンは数日後にペトリ皿の上で栗色になっており、液体培地では上澄みは栗色であった。形質転換体または発現カセットの組み込みを同定するために利用可能な表現型は遺伝子座ＡＤＥ２にうまく組み込まれた。

遺伝子座ａｄｅ２−８４４の配列の検証。遺伝子座ａｄｅ２−８４４の配列は、プライマーｖｅｒ１ａｄｅ２およびｖｅｒ２ａｄｅ２（表９）を用いて増幅した。サイズが２２０４ｂｐのＰＣＲ産物を配列決定した。得られた配列は、マーカーＵＲＡ３の配列がないことを示した。さらに、この検証によって、破壊カセットＰＵｅｘＴの５’と３’にあるＮｏｔＩ部位の組み込みがないことが示された。切り出し後、ゲノム上の遺伝子座ａｄｅ２のＰとＴの間には、以下の配列が残った：ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＡＴＣＧＣＴＴＣＧＧＡＴＡＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、すなわちＩ−ＳｃｅＩ−ＬｏｘＲ−Ｉ−ＳｃｅＩ−Ｉ−ＣｅｕＩという部位である。

２．２ マーカーＡＤＥ２ｅｘの構築
マーカーＡＤＥ２ｅｘを構築するために、プライマーＡＤＥ２ＳおよびＡＤＥ２Ｒを用いて遺伝子座ＡＤＥ２のゲノム配列を増幅し、ＥｃｏＲＩ部位のベクターｐＫＳ−ＬＰＲ（Ｆｉｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．５５，ｐ：７２７−７３７）でクローニングした。該マーカーは、５００ｂｐのプロモーターと、ＡＤＥ２遺伝子のＯＲＦ（Ｙａｌｉ０Ｂ２３１８８ｇ）および１２５ｂｐの末端を含み、該末端は、配列Ｙａｌｉ０Ｂ：３０２９９６１．．３０３２２８０、すなわち２３１９ｂｐに対応する。ＡＤＥ２遺伝子のＯＲＦにあるＥｃｏＲＩ部位は、プライマーＡＤＥ２ＥＳおよびＡＤＥ２ＥＲ（表９）による定方向突然変異によってｇａａＴｃをｇａａｔＣｃに修飾することで除去した。この修飾された塩基がＡＴＴからＡＴＣへのサイレント変異を創出した。

マーカーは二つの方向に挿入することができる。センス１におけるマーカーＡＤＥ２ｅｘはＪＭＥ７９８に対応し、センス２ではＪＭＥ７９９に対応する。

２．３ マーカーＡＤＥ２ｅｘによる形質転換
マーカーＡＤＥ２ｅｘの使用を試験するために、Ｉ−ＳｃｅＩの消化によってマーカーＡＤＥ２ｅｘをプラスミドＪＭＥ７９８（ｐＫＳ−ＬＰＲ−ＡＤＥ２）から単離し、プラスミドＪＭＰ６２ Ｉ−ＳｃｅＩ（ＪＭＥ７９３）のＩ−ＳｃｅＩ部位に挿入することで、プラスミドＪＭＰ６２ＡＤＥ２ｅｘ（ＪＭＥ８６２）を得た。

プラスミドＪＭＥ８６２はＮｏｔＩによって消化され、酢酸リチウム法で株ＦＦ−ｌｕａを形質転換するために用いた。形質転換体は、ウラシル（１００ｍｇ／Ｌ）およびアデニンを補給したＹＮＢｃａｓａ培地で選択した。参考文献では、Ａｄｅ−変異体におけるさまざまな種の酵母が一般に記載されており、選択培地は、１００から２００ｍｇ／Ｌの濃度のアデニンを補給されている。本発明の場合、先述したＡｄｅ−変異体については、形質転換体の正しい増加のために必要な濃度は８００ｍｇ／Ｌであった。これらの条件において、マーカーＵＲＡ３で得られる形質転換率と似た形質転換率が得られた。

３．遺伝子ＬＥＵ２の欠失（マーカーΔｌｅｕ２−９５８）、変異株ＦＦ２−ｌｕ、ＦＦ−２ｌｕｇ、ＦＦ２−ｌｕａおよびＦＦ２−ｌｕａｇの取得およびマーカーＬＥＵ２ΔＢａｍＨＩの構築。
３．１ 遺伝子ＬＥＵ２の欠失（Δｌｅｕ２−９５８）
これらの株を得るためには以下のように進めることができる。変異体ＦＦ−ｌｕから、株ＦＦ２−ｌｕ、Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−を構築する。同様に、欠失Δｌｅｕ２−９５８を有するＦＦ−ｌｕａ、ＦＦ−ｌｕｇ、ＦＦ−ｌｕａｇの派生株も構築することができる。変異体ＦＦ−ｌｕａから、株ＦＦ２−ｌｕｇ、Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、ｇｌｙ−を構築することができ、変態ＦＦ−ｌｕａから、株ＦＦ２−ｌｕａ、Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、ａｄｅ−を構築することができ、そしてＦＦ−ｌｕａｇから、株ＦＦ２−ｌｕａｇ、Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−、ａｄｅ−、ｇｌｙ−を構築することができる。

たとえば、変異体ＦＦ−ｌｕから、遺伝子マーカーｌｅｕ２−２７０に対するよりも強い遺伝子ＬＥＵ２の欠失を有する、対応するアルカン資化酵母の変異株を構築した。第一の過程は、このマーカーを含有するプラスミドｐＰＴＬｅｕ２−Ｕｒａ３Ｅｘ（ＪＭＥ９５８）に由来するＮｏｔＩカセットを形質転換し、ＹＮＢｃａｓａ上でＵｒａ＋を選択し、破壊カセットｌｅｕ２：：ＵＲＡ３ｅｘによる遺伝子ｌｅｕ２−２７０を欠失させることで、ウラシルに対して栄養要求性（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ＋）の株ＦＦ２−ｌｕ：：ＵＲＡ３を構築することである。リコンビナーゼＣｒｅおよびマーカーＬＥＵ２（Ｃｒｅ−ＬＥＵ２）を含んだ複製ベクターｐＲＲＱ２によって形質転換し、ウラシルに対する栄養要求性形質転換体Ｌｅｕ＋を選択し、マーカーＵＲＡ３ｅｘの切り出しを行うことで、ウラシルに対する栄養要求性（Ｌｅｕ＋、Ｕｒａ−）を選択した。プラスミドｐＲＲＱ２の消失は、ＹＰＤの豊富な培地での培養とクローン（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）の単離によって行なわれた。変異体ＦＦ２−ｌｕａ、ＦＦ２−ｌｕｇおよびＦＦ２−ｌｕｇａを得るために同じ方法を使うことができる。

変異体ＦＦ２−ｌｕの構築の概略図は以下の表４にまとめている。

遺伝子ＬＥＵ２のための破壊カセットは、上流領域（領域Ｐ：Ｙａｌｉ０Ｃ４４９８９．．Ｙａｌｉ０Ｃ４６０８１，１０９２ｂｐ）と下流領域（領域Ｔ；Ｙａｌｉ０Ｃ４７０３６．．Ｙａｌｉ０Ｃ４７９３２，８９７ｂｐ）を増幅することで構築し、これによって、遺伝子ＬＥＵ２のＯＲＦ（Ｙａｌｉ０Ｃ４６０８２．．Ｙａｌｉ０Ｃ４７０３５，９５４ｂｐ）を欠失させることが可能となり、遺伝子の変換を最小化するために、選択マーカーＬＥＵ２ｅｘとの非常に低い相同性（領域Ｐとは０ｂｐ、領域Ｔでは２０７ｂｐ）しか残さなくなった。選択マーカーＬｅｕ２Ｅｘは、遺伝子マーカーｌｅｕ２−２７０とは強い相同性（領域Ｐとは４０１ｂｐ、領域Ｔでは７１０ｂｐ）を示したが、これは、該遺伝子マーカーが遺伝子ＬＥＵ２の６８１ｂｐのＳｔｕＩの単純な欠失に対応するからである。選択マーカーｅｘは表１１に示している。

領域ＰおよびＴは、プライマーＰ１Ｌｅｕ２、Ｐ２Ｌｅｕ２、Ｔ１Ｌｅｕ２およびＴ２Ｌｅｕ２（表９）によって増幅した。

切り出し可能な選択マーカーＵｒａ３ｅｘを挿入するために、プライマーＰ２およびＴ１は、稀な部位Ｉ−ＳｃｅＩを含んでいる。第一のプライマーＴ１は、発現カセットを挿入するための稀な部位Ｉ−ＣｅｕＩも含んでいる。プライマーＰ１およびＴ２は、ｐＨＳＳ６−ＮｏｔＩ（ＪＭＥ８００）でのクローニングのために稀な部位ＮｏｔＩを含んでいる。ＰＴ断片は、ＮｏｔＩによって消化されたＪＭＥ８００においてクローニングし、向き１（センス１、ＪＭＥ８１１）または向き２（センス２、ＪＭＥ８１２）にあるプラスミドｐＬｅｕ２−ＰＴを得るために脱リン酸化した。方向は、Ｉ−ＳｃｅＩ部位の方向にしたがって決定される。すなわち、センス方向にあるＩ−ＳｃｅＩ部位に対するセンス１あるいは補完方向にあるＩ−ＳｃｅＩ部位に対するセンス２である。破壊プラスミドｐＰＴＬｅｕ２−Ｕｒａ３Ｅｘ（ＪＭＥ９５８）は、プラスミドＪＭＥ８１１のＩ−ＳｃｅＩ部位へのマーカーＵｒａ３ｅｘの挿入によって得た。

破壊カセットはＮｏｔＩの消化および３３５１ｂｐのバンドの精製によって得られた。株は酢酸リチウム法によって形質転換した。形質転換体Ｕｒａ＋はＹＮＢｃａｓａ培地で選択した。

３．２ マーカーＬＥＵ２ｎ（ＬＥＵ２ｅｘΔＢａｍＨＩ）の構築
発現カセットと組み込みカセットを構築するためには、選択マーカーは特定遺伝子をクローニングするために使われる単一の部位（ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩおよびＡｖｒＩＩ）を含んでいてはならない。マーカーＬＥＵ２ｎ（ＬＥＵ２ｅｘΔＢａｍＨＩ）を構築するために、ｇｇａａｔＴからｇｇａａｔＣへの修飾をもたらし、ＡｐａＩ部位（表９）を有するリンカーを生成するためにプライマーＬｅｕ２−Ｌ１およびＬｅｕ２−Ｌ２を用いた。プラスミドｐＫＳ−ＬＰＲ−Ｌｅｕ２（ＪＭＥ５０９）は、一方ではＡｐａＩとＳｃａＩによって消化され、他方ではＢａｍＨＩおよびＳｃａＩによって消化された。１４７１ｂｐのバンドＡｐａＩ−Ｓｃａｌおよび３３００ｂｐのバンドＢａｍＨＩ−ＳｃａＩをアガロースゲル上で精製した。これら２つのバンドにリンカーＬｅｕ２Ｌ１／Ｌｅｕ２Ｌ２を加えて、３つの経路のライゲーションを行った。修飾されたＬＥＵ２ｎである、新しいマーカーＬＥＵ２ｅｘΔＢａｍＨＩ（ＪＭＥ７９０）を含んだプラスミドを得た。

４．切り出し可能なさまざまなマーカーを用いたランダムな単コピーの組み込みシステムの開発
切り出し可能なさまざまな既存のマーカーおよび本発明で得られるマーカー（表１１）から構築を行った。

まず、本発明者らはＩ−ＳｃｅＩと名付けた２つのベースベクター、すなわちＪＭＰ６１ Ｉ−ＳｃｅＩおよびＪＭＰ６２ Ｉ−ＳｃｅＩを構築した。切り出し可能なマーカーＬＥＵ２を含有するベクターＪＭＰ６１ ｌｅｕ２ＥｘおよびＪＭＰ６２ ｌｅｕ２Ｅｘから、プライマー対、６２ｃｌａＳおよび６２ｃｌａＲ（表９）を用いてプラスミド全体のＰＣＲを行った。

定方向突然変異を行うことを可能にするＳｔｒａｔａｇｅｎｅのキット「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を用いた。原理は、ＰＣＲによる増幅に基づいており、ＰＣＲ産物の変異を強制的に引き起こすために特異的に構築されたプライマーが用いられる。短い挿入／欠失または点突然変異のために慣習的に用いられているため、我々はＩ−ＳｃｅＩ部位でプラスミドの再環化によってマーカーＬｅｕ２Ｅｘを除去するために、この原理を用いた。これら２つのプライマーを、Ｉ−ＳｃｅＩ部位の上流にあるプラスミドＪＭＰ６１ Ｌｅｕ２Ｅｘに含まれる部位ＢａｍＨＩおよびＡｖｒＩＩを除去し、この唯一の部位によるプロモーターの交換を可能にするようにＣｌａＩ部位を修復するためにもまた構築した。次に、得られたＰＣＲ産物は親菌糸の除去を可能にする制限酵素ＤｐｎＩによって消化した。該親菌糸は大腸菌の株ｄａｍ＋に由来するもので、メチル化されており、新しく形成された菌糸とは異なり、酵素ＤｐｎＩによって特異的に認識され、消化されるものである。形質転換およびスクリーニングの後、ベクターＪＭＰ６１ Ｉ−ＳｃｅＩおよびＪＭＰ６２ Ｉ−ＳｃｅＩ（表１２）を得た。

その他の構築（表１２）もこれら２つのプラスミドから行った。ライゲーションは、Ｉ−ＳｃｅＩによって消化され、脱リン酸化されたプラスミドと、対応するプラスミドｐＫＳ−ＬＰＲ（表１１）から切り出し可能なさまざまなマーカーの精製されたバンドＩ−ＳｃｅＩを用いて行った。切り出し可能なマーカーＬｅｕ２については、マーカーＬＥＵ２ｎ（Ｌｅｕ２ΔＢａｍＨＩ）を含んだプラスミドＪＭＥ７９０を用いた。

５．ベースベクター、クローニングベクターおよび発現ベクターの構築。
５．１ ベースベクターおよびクローニングベクター。
ベースクターの構築は、プラスミドｐＨＳＳ６に由来する大腸菌の連絡部分を保存しながらベクターＪＭＰ６２から行なわれた。ベクターＪＭＰ６２をＮｏｔＩによって消化した後、大腸菌の複製起点とカナマイシンに対する耐性を含んだ２２１０ｂｐのバンドを単離し、精製し、そして、ｐＨＳＳ６−ＮｏｔＩ（ＪＭＥ８００）と名付けたベースベクターを形成するために再びライゲーションした。

ベースベクターから、２つのリンカーと、ＪＭＰ６２ベクターに含まれるアルカン資化酵母のＬＩＰ２リパーゼの末端配列を含んだＰＣＲ断片とをライゲーションすることでクローニングベクター（図２）を構築した。リンカーは５’にあるリン酸化プライマー対、すなわち、プライマーリンク１および１１を伴うリンカー１と、プライマーリンク２および２２を伴うリンカー２（表１０）を合成することで構築した。これらのリンカーは、プロモーターの挿入のためにそれぞれＣｌａＩとＢａｍＨＩという部位を含み、特定遺伝子を挿入するためにＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩＩ／ＫｐｎＩ／ＡｖｒＩＩという部位を含んだクローニングのための複数の部位を生成する。また、ＡＴＧの−４と−１に「コンセンサス」配列Ｃ^−４ Ａ Ｃ Ａ^−１を導入した。この配列は強く発現するタンパク質をコードするアルカン資化酵母の遺伝子のためにある。したがって、この配列を用いた発現のために、特定遺伝子のクローニングは、ＨｉｎｄＩＩＩによって、５’にあるＢａｍＨＩによるこの配列なしで行った。ＬＩＰ２の末端配列を含んだＰＣＲ断片（８４０ｂｐ）は、プライマーＰＯＸ２ＸｈｏおよびＬｉｐ２Ｔｈｃを用いて得られた。この断片は、ＬＩＰ２の末端配列しか含まない１７９ｂｐの断片を得るために、ＡｖｒＩＩおよびＮｏｔＩによって消化した。ＡｖｒＩＩとＨｉｎｃＩＩによるこれら末端配列の交換が可能となるように特異的部位ＨｉｎｃＩＩを付加した。複数の部位と末端配列の両側に制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩの２つの稀な部位を導入した。この二重の部位Ｉ−ＣｅｕＩによって、組み込みベクターにおいてクローニングを行うために発現カセットを単離し、精製することが可能となる。

ｐＶＣと名付けたクローニングベクター（ＪＭＥ８２９）を得るために、２つのリンカー、１７９ｂｐのバンドＡｖｒＩＩ／ＮｏｔＩ、そして脱リン酸化したベースベクターｐＨＳＳ６ ＮｏｔＩによって３つの経路のライゲーションを行った。

５．２ 発現ベクター。
発現ベクターは、ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩによって消化されたクローニングベクターｐＶＣから構築した。縮小したプロモーターｐＰＯＸ２（１０１７ｂｐ）を単離し、ベクターＪＭＰ６２（表１２）のＣｌａＩおよびＢａｍＨＩによって消化した後、精製した。ｐＶＣとプロモーターｐＰＯＸ２のライゲーションは、ｐＶＣ−ｐＰＯＸ２（ＪＭＥ８３０）と名付けた発現ベクター（表６）を得るために行った。

６．挿入遺伝子座の選択と組み込みベクターの構築の原理。
我々は以下のさまざまな遺伝子座を選択した。

６．１ 遺伝子座Ｌｅｕ２−２７０
この遺伝子座は単純な「交差」による相同組み込みの標的として使われることが多いが（Ｂｏｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ，２００７）、このゲノムマーカーを用いると高い変換率（該変換は４０１ｂｐの５’領域（Ｙａｌｉ０Ｃ：４６４１１．．４６５３７）と７１０ｂｐの３’領域（Ｙａｌｉ０Ｃ：４６５２８．．４６９４８）を残す、６８１ｂｐのＳｔｕＩの小さな欠失に対応する）が得られ、該変換率によって、本発明者らのベクターで用いられる選択マーカーＬＥＵ２との二重の組み換えが可能となる。したがって、このマーカーを含んだ発現カセットの形質転換の際に、一般的に高い変換率が観察される。本発明者らは、変換率を最小化するために、５’と３’にあるこれらの相同領域を除去するように、最初の過程で発現カセットを遺伝子座ｌｅｕ２−２７０に挿入することにした。こうして、他方の遺伝子座にマーカーＬＥＵ２を含んだ新しい発現カセットを挿入した際、変換率は大きく減少した。そうでなければ、第３章で説明したように、マーカーｌｅｕ２−９５８を用いて株を構築することもできる。

６．２ 遺伝子座Ｕｒａ３−３２０
二重交差によって行った欠失は、５’位に２１ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｅ：３１７１８７３．．３１７１８９３）、３’位に１０８ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｅ：３１７５１３４．．３１７５２４１）しか残さない。欠失された断片（６９５ｂｐ）は以下の発現カセットによって置換した：遺伝子ＸＰＲ２のプロモーターおよび逆方向のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼをコードしているＳＵＣ２遺伝子（３２４０ｂｐ、Ｙａｌｉ０Ｅ：３１７１８９４．．３１７５１３３）である。この遺伝子座Ｕｒａ３−３２０への組み込みによって、産生株においてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＳＵＣ２遺伝子を除去し、図６に記載したように、形質転換体Ｓｕｃ−（単一の炭素源としてショ糖しか含まない培地での増殖がない）の簡単かつ迅速なスクリーニングを行うことが可能となる。

６．３ 遺伝子座Ｌｉｐ２
遺伝子ＬＩＰ２はアルカン資化酵母のＬｉｐ２ｐリパーゼをコードしている。その発現は脂肪酸およびトリグリセリドの存在下で誘発される（Ｐｉｇｎｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）。本発明では、特定のタンパク質の発現が、強力で誘発可能なプロモーターｐＰＯＸ２の下に置かれる。このプロモーターもまた、オレイン酸のような脂肪酸によって誘導することができる。遺伝子座ＬＩＰ２に組み込むことによって、ＬＩＰ２遺伝子を無効化することができ、産生時に培養物の上澄みにおいてリパーゼＬｉｐ２ｐの発現をなくすことができる。さらに、このことによって、形質転換体Ｌｉｐ２−の簡単で迅速なスクリーニングを行うことも可能となる（寒天培地上で見えるトリブチリンの乳化液の劣化がないこと、または、図７に記載したように、培養物の上澄みにおいてリパーゼの活性がないこと）。

６．４ 遺伝子座Ａｄｅ２
本発明では、新規の株Ａｄｅ−ならびに選択マーカーＡｄｅ２ｅｘを構築した。ＡＤＥ２遺伝子を破壊するために配列ＰおよびＴを増幅した。したがって、これら同一の配列を組み込みベクターで用いた。このように、この遺伝子座についてはいかなる補助的な構築も必要ではなかった。

用いられる受容株がＦＦ−ｌｕｇであれば、遺伝子座ＡＤＥ２への挿入によって株はＡｄｅ−となり、このことは、新しい栄養要求性を創出し、該栄養要求性は特定遺伝子の補助的なコピーを導入するために使うことができる。この破壊はまた、迅速に識別できる表現型に関連している（ペトリ皿の栄養豊富な培地上で破壊されたコロニー栗色への染色、培養培地栗色への染色）。

このリストまたはこれらの遺伝子座／マーカーの組み合わせは網羅的ではない。その他のあらゆる組み合わせが可能であり、好ましくは、遺伝子座の破壊によって迅速に視覚可能な表現型を創出する遺伝子座を用いた組み合わせであり、該表現型によって、遺伝子座に発現カセットを正しく組み込んだ形質転換体の迅速なスクリーニングが可能となる。その他の遺伝子座およびその他のマーカーを選ぶことができ、またその他の組み合わせを行うこともできる。
６．５ 組み込みベクターの構築の原理
組み込みベクターの構築の原理は図３に記載している。所定の遺伝子座へ組み込むためのさまざまなカセットを同一の方法によって構築した。株Ｅ１５０のｇＤＮＡから、破壊すべき遺伝子のＰと名付けたプロモーター部分とＴと名付けた末端部分を増幅した。アルカン資化酵母において効果的な二重の相同組み換えを得るためには、断片ＰおよびＴは、好ましくは８００ｂｐと１０００ｂｐの間に含まれるサイズを有していなければならない。用いるプライマーは、遺伝子座の名称にならって、断片ＰについてはＰ１／Ｐ２と名付け、断片ＴについてはＴ１／Ｔ２と名付けた（表９）。プライマーＰ１およびＴ２は、ベースベクターｐＨＳＳ６−ＮｏｔＩにおけるクローニングを可能にし、また発現カセットの遊離を行うために、ここでは部位ＮｏｔＩである稀な部位１を含んでいる。プライマーＰ２およびＴ１は二つの異なる稀な部位、ここでは部位Ｉ−ＳｃｅＩとＩ−ＣｅｕＩである稀な部位２および３をそれぞれ含んでおり、該部位によって、２つの断片のＰＣＲによる融合と、ここではＩ−ＳｃｅＩ部位である稀な部位２にある選択マーカーと、ここではＩ−ＣｅｕＩである稀な部位３にある発現カセットの、後のクローニングが可能となる。ＰＣＲによる融合はしたがって、精製された２つの断片ＰおよびＴと、プライマー対Ｐ１／Ｔ２の混合物から行われる。得られた断片ＰＴはＮｏｔＩによって消化され、次に、ＮｏｔＩによって消化されたベクターｐＨＳＳ６におけるライゲーションによってクローニングされ、脱リン酸化される。組み込みベクターは遺伝子座の名前にならってｐＰＴと名付けている（表７）。

さまざまな遺伝子座の断片ＰおよびＴの説明。
遺伝子座Ｌｅｕ２−２７０：二重の相同組み換えのために増幅された領域は、領域Ｐについては１０９２ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｃ：４４９８９．．４６０８１）、領域Ｔについては８９７ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｃ：４７０３６．．４７９３２）である。除去されることになる領域は９５４ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｃ：４６０８２．．４７０３５）である。この領域は、マーカーＬｅｕ２の領域５’の全部（４０１ｂｐ）と領域３’の一部（５０３ｂｐ）を除去する。マーカーＬｅｕ２の領域３’の２０７ｂｐの相同性が残る。

遺伝子座Ｕｒａ３−３０２：二重の相同組み換えのために増幅された領域は、領域Ｐについては１１９７ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｅ：３１７０６９８．．３１７１８９４）、領域Ｔについては１０１３ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｅ：３１７５４１２．．３１７６４２４）である。除去されることになる領域は３５１６ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｅ：３１７１８９５．．３１７５４１１）である。この領域は、発現カセットｐＸＰＲ２＋ＳＵＣ２の全部と、マーカーＵｒａ３の領域３’（２８０ｂｐ）を除去する。マーカーＵｒａ３の領域５’の２００ｂｐの相同性が残る。

遺伝子座Ｌｉｐ２：二重相同組み換えのために増幅された領域は、領域Ｐについては１１２３ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ａ：２１８５８９７．．２１８７０１９）であり、領域Ｔについては９６１ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ａ：２１８７８８３．．２１８８８４３）である。除去されることになる領域は８６３ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｃ：２１８７０２０．．２１８７８８２）である。この領域は、遺伝子ＬＩＰ２の全体をほとんど除去する。ＬＩＰ２遺伝子の１４８ｂｐの領域３’の相同性が残る。

遺伝子座Ａｄｅ２：二重の相同組み換えのために増幅された領域は、領域Ｐについては９２０ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｂ：３０２９０１１．．３０２９９３１）であり、領域Ｔについては７９２ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｂ：３０３１８７１．．３０３２６６２）である。除去されることになる領域は１９３９ｂｐ（Ｙａｌｉ０Ｂ：３０２９９３２．．３０３１８７０）であり、該領域は遺伝子の変換を最小化するために、選択マーカーＡＤＥ２ｅｘとの非常に弱い相同性しか残さない（領域ＰとはＯｂｐ、領域Ｔにおいては４１５ｂｐ）。

各遺伝子座について、領域ＰおよびＴは、遺伝子座の名称にならってＰ１／Ｐ２およびＴ１／Ｔ２と名付けられたプライマー対を用いて増幅した（表９）。次に、ＰＴの融合はＰ１／Ｔ２の対を用いて行った。

これらのベクターｐＰＴから、さまざまな切り出し可能なマーカーをＩ−ＳｃｅＩ部位でのクローニングによって導入した。この部位によってマーカーの方向付けられたクローニングが可能となる。我々は、発現カセットの逆方向にマーカーを方向付けることにした。得られた組み込みベクターは遺伝子座の名称と挿入された切り出し可能なマーカーの名称にならってｐＰＴと名付けている（表７）。

遺伝子座／マーカーの組み合わせは例として示しているだけであり、さまざまな組み合わせが可能である。

７．特定タンパク質の発現のための組み込みベクターの構築の原理。
特定遺伝子のクローニングは、クローニングの２つの過程だけで行う。第一の過程は、プロモーターＰＯＸ２の制御下でベクターｐＶＣ−特定遺伝子を得るための、発現ベクターｐＶＣでのサブクローニングである（たとえばプロモーターｈｐ４ｄまたは誘導プロモーターのような、その他の強いプロモーターも構成的に使うことができる）。このベクターｐＶＣ−特定遺伝子は、発現カセットを単離し、精製するためにＩ−ＣｅｕＩによって消化される。第二の過程は、組み込みベクターにおけるこの発現カセットＩ−ＣｅｕＩのクローニングである。組み込みカセット／発現カセットは、アルカン資化酵母における形質転換の前、ＮｏｔＩによる消化の後に単離し、精製する（図３）。

アルカン資化酵母から産生されない治療用特定タンパク質をコードする遺伝子を標的挿入するための、組み込み／発現カセットの構築と利用。

Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＬ−アパラギナーゼタンパク質を例にとる。

このタンパク質をコードする遺伝子を、部位ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩにあるベクターｐＶＣ−ｐＰＯＸ２に導入する。このため、ＬＩＰ２プレプロ配列と、Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質の成熟形態をコードする遺伝子配列の部分の間でＰＣＲによる融合を行った。ＰＣＲは、ＬＩＰ２のプレプロ配列を増幅するためにはＬｉｐ２プレプロプライマーとＬｉｐ２ＫＲプライマーで行い、成熟タンパク質をコードする配列を増幅するためにはＬａｓｐｓｅｎｓプライマーおよびＬａｓｐｒｅｖプライマーを用いて行った。次に、得られた２つのＰＣＲ産物を混合し、Ｌｉｐ２プレプロプライマーとＬａｓｐｒｅｖプライマーの融合を行った。

ｐＣＶ−ｐＰＯＸ２において融合産物のクローニングを行うために、Ｌｉｐ２プレプロプライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含み、ＬａｓｐｒｅｖプライマーはＡｖｒＩＩ部位を含んでいる。こうして、Ｌ−アスパラギナーゼタンパク質の発現カセットを含んだベクターｐＶＣ−ｐＰＯＸ２−プレプロＬｉｐ２−ＬＡｓｐ（ＪＭＥ８９８）が得られる（表８）。

このベクターから、制限酵素Ｉ−Ｃｅｕｌによる消化によって発現カセットを抽出し、精製した。次にこのカセットをＩ−ＣｅｕＩ部位にあるさまざまな組み込みベクターでクローニングした。得られたさまざまな組み込みベクター／発現ベクターは表８に示している。

組み込み／発現カセットは、さまざまな組み込み／発現ベクターの制限酵素ＮｏｔＩの消化によって得られた。次に、大腸菌の外来性ＤＮＡの配列を除去するために、これらのカセットを抽出し、精製した。

アルカン資化酵母におけるＬ−アスパラギナーゼタンパク質の組み込み／発現カセットの形質転換。

たとえば、Ｌ−アスパラギナーゼの発現カセットの４つのコピーを連続して株ＦＦ−ｌｕｇａの前述した４つの遺伝子座に導入することができる。

１ 第一のコピーの遺伝子座ＡＤＥ２への挿入。
ベクターＪＭＥ９４１に由来する組み込み／発現カセットＰＴＡｄｅ２−Ｇｕｔ２−１．０Ｅｘ−ＬＡｓｐを用いて株ＦＦ−ｌｕｇａを形質転換することで、第一の発現カセットを遺伝子座ＡＤＥ２に導入した。形質転換体の選択は、ウラシルおよびアデニンを補給し、唯一の炭素源として１％のグリセロールを含有する選択培地ＹＮＢｃａｓａ上で行った。得られた形質転換体は同じ選択培地で単離し、遺伝子座への組み込みは、組み込み配列の上流および下流にあるプライマーＶｅｒ１ａｄｅ２およびＶｅｒ２ａｄｅ２を用いてＰＣＲによって検証した。

得られた形質転換率は形質転換されたＤＮＡのμｇあたり８．２×１０^３個の形質転換体であった。遺伝子座Ａｄｅ２への組み込みのＰＣＲによる検証によって、１００％の形質転換体がこの遺伝子座にＬＡｓｐ発現カセットを組み込んだことが示された。

５ＬＡｓｐ１および６ＬＡｓｐ１と名付けた２つの形質転換体を保存した（表５）。名称の最初にある数字は形質転換体の番号であり、名称の最後にある二番目の数字は発現カセットＬＡｓｐのコピーの数を示している。

２ 遺伝子座ＬＩＰ２への第二のコピーの挿入。
第二の発現カセットは、ベクターＪＭＥ９２７に由来する組み込み／発現カセットＰＴＬｉｐ２−Ｕｒａ３Ｅｘ−ＬＡｓｐを用いて形質転換体５ＬＡｓｐ１を形質転換することで遺伝子座ＬＩＰ２に導入した。形質転換体の選択は、アデニンを補給し、唯一の炭素源として１％のグルコースを含有する選択培地ＹＮＢｃａｓａにおいて行った。得られた形質転換体はこの同じ選択培地で単離し、遺伝子座への組み込みは、組み込み配列の上流および下流にあるプライマーＶｅｒ１ｌｉｐ２およびＶｅｒ２ｌｉｐ２を用いてＰＣＲによって検証した。

得られた形質転換率は、形質転換したＤＮＡのμｇあたり、１．１×１０^４個の形質転換体であった。ＰＣＲによる遺伝子座ＬＩＰ２への組み込みの検証によって、７５％の形質転換体がこの遺伝子座に発現カセットＬＡｓｐを組み込んだことが示された。そうでなければ、遺伝子座ＬＩＰ２への発現カセットの組み込みの検証は、図７に示したようなリパーゼ活性の測定によって行うことができる。

１４ＬＡｓｐ２、１５ＬＡｓｐ２、１６ＬＡｓｐ２、１７ＬＡｓｐ２および２１ＬＡｓｐ２と名付けた５つの形質転換体を保存した（表５）。

３ 遺伝子座ＬＥＵ２への第三のコピーの挿入。
第三の発現カセットは、ベクターＪＭＥ９２６に由来する組み込み／発現カセットＰＴＬｅｕ２−Ａｄｅ２Ｅｘ−ＬＡｓｐを用いて形質転換体１５ＬＡｓｐ２を形質転換することによって遺伝子座ＬＥＵ２に導入した。形質転換体の選択は、唯一の炭素源として１％のグルコースを含有する選択培地ＹＮＢｃａｓａ上で行った。得られた形質転換体はこの選択培地で単離し、遺伝子座への組み込みは、組み込み配列の上流および下流にあるプライマーＶｅｒ１ｌｅｕ２およびＶｅｒ２ｌｅｕ２を用いてＰＣＲによって検証した。

得られた形質転換率は、形質転換されたＤＮＡのμｇあたり１．６×１０^４個の形質転換体であった。ＰＣＲによる遺伝子座ＬＥＵ２への組み込みの検証によって、２０％の形質転換体がこの遺伝子座に発現カセットＬＡｓｐを組み込んだことが示された。

１ＬＡｓｐ３と名付けた１つの形質転換体を保存した（表５）。

４ 遺伝子座ＵＲＡ３への第四のコピーの挿入。
第四の発現カセットは、ベクターＪＭＥ９２３に由来する組み込み／発現カセットＰＴＵｒａ３−Ｌｅｕ２ｎＥｘ−ＬＡｓｐを用いて形質転換体１ＬＡｓｐ３を形質転換することによって遺伝子座ＵＲＡ３に導入した。形質転換体の選択は、唯一の炭素源として１％のグルコースを含有する選択培地ＹＮＢにおいて行った。得られた形質転換体はこの同じ選択培地上で単離し、遺伝子座への組み込みは、組み込み配列の上流および下流にあるプライマーＶｅｒ１Ｕｒａ３およびＶｅｒ２Ｕｒａ３を用いてＰＣＲによって検証した。

得られた形質転換率は形質転換されたＤＮＡのμｇあたり５．２５×１０^３個の形質転換体であった。遺伝子座ＵＲＡ３への組み込みのＰＣＲによる検証によって、８７％の形質転換体がこの遺伝子座にＬＡｓｐ発現カセットを組み込んでおり、８７％の形質転換体がＵｒａ−であることが示された（図６）。

２ＬＡｓｐ４と名付けた１つの形質転換体を保存した（表５）。

この最後の株は確かに少なくとも一つの追加のコピーを含んでいる（図５（電気泳動ゲル）および図８（ＲＴ−ｑＰＲＣによる定量）参照）。

５ 挿入手順の変形例。
本発明は以下の過程にしたがって実施することができる。第一に、（たとえば）４つの形質転換体を順に構築する。第二に、さまざまなマーカーを用いて挿入物のスクリーニングを行う。そこから、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムを実施しなければ、組み込むべきコピーと同じだけの異なったスクリーニングシステムを保持する利点がある。

組み込まれたコピーの数にしたがったＬ−アスパラギナーゼの発現の分析。
１個から４個のコピーを含んだ、得られたさまざまな形質転換体による産生について、Ｌ−アスパラギナーゼの発現を分析した。産生は、酵母エキス１％、バクトトリプトン２％、グルコース１％、ｐＨ６．８、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液およびオレイン酸乳化液２％で構成された栄養豊富な２５ｍＬの培地（Ｙ１Ｔ２Ｄ１Ｏ２と名付けた）を含有する２５０ｍＬの小瓶で行った。オレイン酸がプロモーターｐＰＯＸ２の誘導剤の役割を果たした。発現は、培養の上澄みに基づき、変性条件および還元性条件の下で電気泳動ゲルによって分析した。電気泳動ゲルはコロイダルブルーによる染色と、Ｌ−アスパラギナーゼに対するウサギのポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法によって標識した。この分析の結果は図５に示している。

遺伝子座ＵＲＡ３への組み込み／発現カセットの挿入によって得られた形質転換体のペトリ上でのスクリーニング。
前述のように、遺伝子座ＵＲＡ３への挿入によってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼをコードしている相同遺伝子ＳＵＣ２を除去することが可能となる。発現カセットを組み込んだ形質転換体はこのときＳｕｃ２−となる。該形質転換体は、唯一の炭素源としてのショ糖上では発生できなくなる。形質転換体を、ＹＰＤ（グルコース１％）とＹＰＳ（ショ糖１％）という２つの栄養豊富な培地に画線状に広げた。この分析の結果は図６に示している。このスクリーニングによって、プライマーＶｅｒ１Ｕｒａ３およびＶｅｒ２Ｕｒａ３を用いたＰＣＲによる分析で得られた結果を確証することができた。

遺伝子座ＬＩＰ２への組み込み／発現カセットの挿入によって得られた形質転換体のスクリーニング。
前述のように、遺伝子座ＬＩＰ２への挿入によって、アルカン資化酵母の細胞外リパーゼｌｉｐ２ｐをコードしている遺伝子ＬＩＰ２を除去することが可能となる。発現カセットを組み込んだ形質転換体はこのときＬｉｐ２−となっている。オレイン酸のような誘導剤を含んだ培地での産生の際、形質転換体は培養の上澄みでリパーゼを分泌しなくなっている。スクリーニングは２８℃での４８時間にわたるＹ１Ｔ２Ｄ１Ｏ２産生培地での培養と１８０ｒｐｍでの攪拌によって行った。上澄みの中のリパーゼの存在は、２０μＬの上澄みに基づくマイクロプレート上での酵素試験によって検出された。この分析結果は図７に示している。このスクリーニングによって、プライマーＶｅｒ１Ｌｉｐ２およびＶｅｒ２Ｌｉｐ２によるＰＣＲによる分析で得られた結果を確証することができた。

ＲＴ−ｑＰＣＲで得られた形質転換体の分析。
組み込まれたコピーの数は、Ｌ−アスパラギナーゼをコードしている遺伝子の単位複製配列（１５０ｂｐ）をリアルタイム定量ＰＣＲによって特異的に定量することによって分析することができる。得られた形質転換体のｇＤＮＡから、Ｌ−アスパラギナーゼをコードする遺伝子に特異的なプライマーＬＡｓｐ１およびＬＡｓｐ２と、アルカン資化酵母のアクチンをコードしている遺伝子に特異的なプライマーＡｃｔ４およびＡｃｔ５を用いてＲＴ−ｑＰＣＲを行った。このＲＴ−ｑＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｆａｓｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳｙＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）というキットを用いて行った。アクチンの単位複数配列は、ハウスキーピング遺伝子と呼ばれる遺伝子であってもよく、該遺伝子の発現は、試験した条件間で修飾されないことで知られており、本発明の場合、ゲノム中で唯一のコピーとして存在した遺伝子であった。このように、この単位複製配列によって結果を標準化した。また、遺伝子座ＬＩＰ２に組み込まれた第二の発現カセットから遺伝子の不在を検証するために、アルカン資化酵母のリパーゼＬｉｐ２ｐをコードしている遺伝子に特異的なプライマーＬｉｐ２−１およびＬｉｐ２−２を用いてＲＴ−ｑＰＣＲも行った。この分析の結果は図８に示している。

欧州特許第０１３８５０８号明細書 国際公開第００／０１２７２９号

Claims (20)

1. ヤロウイア株のゲノムにおいて、特定遺伝子の少なくとも三つのコピーを標的組み込みするための方法であり、該方法は、
   ａ）少なくとも三つの遺伝子において欠失を含むヤロウイア株を培養する過程であり、これら少なくとも三つの遺伝子が互いに独立して、これらの欠失のそれぞれに関連する表現型が前記株に対する栄養要求性または優性形質に対応することを特徴とする過程と、
   ｂ）栄養要求性および／または優性形質を有する前記ヤロウイア株を、選択マーカーを含んだ少なくとも三つの組み換えベクターによって形質転換する過程であり、該選択マーカーによって、前記ヤロウイア株に対して、前記欠失のそれぞれから生じる栄養要求性および／または優性の表現型を補完することが可能となり、該組み換えベクターがそれぞれ、
   ｉ）前記特定遺伝子の配列と、
   ｉｉ）選択マーカーと、
   ｉｉｉ）前記特定遺伝子の配列と前記選択マーカーを囲む二つのＤＮＡ配列であり、該二つのＤＮＡ配列が、前記ヤロウイア株のゲノムにおける標的組み込みのための部位の端部に対応する配列に対して相同的であることによって、相同組み換えによって前記組み換えベクターの標的組み込みが可能となるようになっている二つのＤＮＡ配列、
   を含んでいる形質転換の過程と、
   ｃ）最小培地において、前記少なくとも三つの組み換えベクターを組み込んだ酵母を選択する過程、
   を含んでいる方法。
2. 欠失を有し、栄養要求性の表現型または優性形質の表現型に関連する欠失を有する遺伝子が、
   −栄養要求性のマーカーについては、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２、ＡＤＥ２、ＨＩＳおよびＬＹＳ５から選択され、
   −優性形質については、ハイグロマイシン耐性遺伝子ＨＰＨ（ＨＹＧ）と、遺伝子ＭＤＲ３、ＫａｎＭＸおよびＴｎ５ｂｌｅから選択され、ＨＹＧが最も好ましい遺伝子である、
   ことを特徴とする、請求項１に記載の標的組み込み方法。
3. 欠失を有する遺伝子が栄養要求性の表現型に関連し、好ましくは遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２およびＡＤＥ２から選択されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の標的組み込み方法。
4. 過程ｂ）において、前記ヤロウイア株のゲノムにある標的組み込み部位が、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２、ＬＩＰ２、ＬＩＰ７、ＬＩＰ８、ＡＸＰ、ＧＵＴ２およびＸＰＲ２から選択されることを特徴とする、請求項１から請求項３のいずれか一つに記載の標的組み込み方法。
5. 過程ｂ）において、前記ヤロウイア株のゲノムにある標的組み込み部位が、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２、ＬＩＰ２、ＬＩＰ８およびＡＸＰから選択されることを特徴とする、請求項４に記載の標的組み込み方法。
6. ヤロウイア株の形質転換過程ｂ）と最小培地での選択過程ｃ）が、前記少なくとも三つの組み換えベクターのそれぞれについて別々に行われることを特徴とする、請求項１から請求項５のいずれか一つに記載の方法。
7. 過程ｂ）において、少なくとも三つの組み換えベクターを用いた形質転換が、組み換えベクターのそれぞれとは独立して、そして連続的に行われ、あるいは、前記組み換えベクターの全体を用いて同時に行われ、また、これらの形質転換の全体の後に、最小培地における、前記組み換えベクターの全体を組み込んだ酵母の選択過程ｃ）が続くことを特徴とする、請求項１から請求項５のいずれか一つに記載の標的組み込み方法。
8. 前記株がアルカン資化酵母の株であることを特徴とする、請求項１から請求項７のいずれか一つに記載の方法。
9. 前記ヤロウイア株がそれぞれ独立して栄養要求性の表現型または優性形質の表現型に関連する欠失を有する三つの遺伝子を含み、好ましくは遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２およびＡＤＥ２から選択されることを特徴とする、請求項１から請求項８のいずれか一つに記載の方法。
10. 前記ヤロウイア株がそれぞれ独立して栄養要求性の表現型または優性形質の表現型に関連する欠失を有する四つの遺伝子を含み、好ましくは遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２およびＡＤＥ２から選択されることを特徴とする、請求項１から請求項８のいずれか一つに記載の方法。
11. 形質転換過程ｂ）が三個から十個の組み換えベクターを用いて行われることを特徴とする、請求項１から請求項８のいずれか一つに記載の方法。
12. 選択マーカーが、前記組み換えベクターの標的組み込みの後に、自身の切り出しを可能にする配列によって囲まれていることを特徴とする、請求項１から請求項１１のいずれか一つに記載の方法。
13. 特定遺伝子にコードされているポリペプチドの産生方法であり、
    Ａ）請求項１から請求項１２のいずれか一つに記載の方法と、
    Ｂ）形質転換された前記ヤロウイア株の増殖を可能にすることを目的とした、炭素、窒素および無機塩の同化源を含んだ液体培養培地におけるヤロウイア株を培養する過程ｄ）と、
    Ｃ）ヤロウイア細胞または過程Ｂ）で得られた培養培地から発現した前記特定ポリペプチドの回収、
    を含むことを特徴とする方法。
14. 少なくとも三つの遺伝子において欠失を含み、そしてこれら少なくとも三つの遺伝子のそれぞれが独立していることを特徴とする、ヤロウイア株をもたらすことを可能にする少なくとも三つのベクターによって、前記ヤロウイア株を形質転換する過程を含んでおり、これらの欠失のそれぞれに関連する表現型が前記株に対する栄養要求性または優性形質に対応することを特徴とする、修飾されたヤロウイア株の取得方法。
15. 栄養要求性の表現型または優性形質の表現型に関連する少なくとも三つの遺伝子の欠失が、
    −栄養要求性については、遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２、ＡＤＥ２、ＨＩＳおよびＬＹＳ５、好ましくは遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２およびＡＤＥ２から選択され、そして、
    −優性形質については、ハイグロマイシン抵抗遺伝子ＨＰＨ（ＨＹＧ）と、遺伝子ＭＤＲ３、ＫａｎＭＸ、Ｔｎ５ｂｌｅから選択され、ＨＹＧ遺伝子が最も好ましい遺伝子である、
    ことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. 欠失を有する遺伝子が栄養要求性の表現型に関連し、好ましくは遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２およびＡＤＥ２から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. ゲノムの少なくとも三つの遺伝子において欠失を含み、そして、これら少なくとも三つの遺伝子がそれぞれ独立していることを特徴とする請求項１４から請求項１６のいずれか一つに記載の方法によって得ることのできる栄養要求性のヤロウイア株であり、これらの欠失のそれぞれに関連する表現型が前記株に対する栄養要求性または優性形質に対応する、栄養要求性のヤロウイア株。
18. 遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２、ＡＤＥ２、ＨＩＳおよびＬＹＳ５から選択され、好ましくは遺伝子ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＧＵＴ２およびＡＤＥ２から選択されるそのゲノムの少なくとも三つの遺伝子において欠失を含むことを特徴とする、請求項１４から請求項１６のいずれか一つに記載の方法で得ることのできる、栄養要求性のヤロウイア株。
19. ブダペスト条約にしたがって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５，ＦｒａｎｃｅにＣＮＣＭ Ｉ−３９１１およびＣＮＣＭ Ｉ−３９１２という番号で２００８年２月４日に付託されたアルカン資化酵母の株で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１７または請求項１８に記載のヤロウイア株。
20. ブダペスト条約にしたがって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５，ＦｒａｎｃｅにＣＮＣＭ Ｉ−３９１３という番号で２００８年２月４日に付託されたアルカン資化酵母の株に対応することを特徴とする、請求項１７または請求項１８に記載のヤロウイア株。

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