JP2011504730A - 標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子およびその合成方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子およびその合成方法に関する。前記複合体分子は少なくとも８０％が相補的である二本鎖のｓｉＲＮＡ鎖Ｘ₁とＸ₂を含む。鎖Ｘ₁の５’末端と鎖Ｘ₂の３’末端とは、非核酸分子Ｌ₁を介して連結され、鎖Ｘ₂の５’末端と鎖Ｘ₁の３’末端とが非核酸分子Ｌ₂を介して連結される。本発明によれば供する複合体分子の二本鎖のｓｉＲＮＡ鎖Ｘ₁とＸ₂の５’末端と３’末端はいずれも非核酸分子を介して連結されるため、ｓｉＲＮＡ鎖の巻き戻しおよび分解ができなくなり、ｓｉＲＮＡの化学的安定性と血中での滞留時間を大幅に改善できる。前記複合体分子が細胞内に導入されると、細胞内に存在しているダイサー（Ｄｉｃｅｒ）酵素により複合体分子中のロックされたｓｉＲＮＡを放出し、巻き戻された後、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が二重鎖のｓｉＲＮＡから放出され、標的遺伝子発現の干渉を実現する。

Description

本発明は、標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子およびその合成方法に関する。

スモールインターフェアリングＲＮＡ（ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ）は、最近発見された遺伝子発現を抑制する小型ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの主な作用原理は、アンチセンスＲＮＡと標的遺伝子のｍＲＮＡとの実質的配列同一性の相補を介して遺伝子の発現を抑制することである。ｓｉＲＮＡは標的遺伝子の発現を特異的に抑制できるため、医薬分野への応用が大きく期待されている。しかし、外因性のｓｉＲＮＡは、化学的安定性が乏しく、血中での滞留時間が短く、さらに細胞および組織侵入性が弱いという問題を抱えている。これらの問題は外因性のｓｉＲＮＡの標的遺伝子発現抑制への適用を強く妨げている。

ｓｉＲＮＡの化学的不安定性の原因は、二本鎖の形式で分解されることではなく、二本鎖−一本鎖のハイブリダイセーション−巻き戻しの平衡（二本鎖核酸の“ゆらぎ”としても知られる）において、その一本鎖がＲＮａｓｅにより分解されることにより、その平衡がすぐに崩れ、その結果、さらに二本鎖のｓｉＲＮＡが速く巻き戻され、分解されることにある。上記原理に従い、多くの研究者は、ｓｉＲＮＡを修飾することによってその二本鎖の巻き戻しが容易にできなくなり、それによって安定性と血中での滞留時間を増大させることを試みた。しかし、それらの修飾はｓｉＲＮＡの安定性改善にとって十分とはいえない。例えば特許文献ＷＯ２００４／０１５０７５には、「干渉のヘアピン型ＲＮＡはＸ₁−Ｌ−Ｘ₂の構造を有する。ここで、Ｘ₁とＸ₂は二本鎖ステムハイブリッドを形成できる十分な相補性をもつ塩基配列であり、Ｌは非核酸リンカー分子からなるループ領域であり、前記二本鎖ステムに位置する塩基配列の少なくとも一部は標的ＲＮＡの配列と相補している」ことが開示されている。即ち、両方のｓｉＲＮＡ鎖の一つの末端は非核酸分子（非ヌクレオチド）を介して連結し、ヘアピン ｓｉＲＮＡを形成し、ここで、前記非核酸分子は、ポリエーテル、ポリアミン、ポリエステル、ポリリン酸ジエステル、アルキレン、付加物、生体複合体（バイオコンジュゲート）、発色団、レポーター基、色素標識ＲＮＡおよび非天然起源核酸類似物など、およびこれらの組み合わせ物からなる群より選択される。しかし、前記ヘアピン型構造の安定性と血中での滞留時間は依然として満足ではない。さらにそのような櫛型構造に機能性分子の導入は容易ではない。前記機能性分子の例としては、細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子、および蛍光標識分子などが挙げられる。

本発明は、化学的安定性が乏しく、血中滞留時間が短いというような従来のｓｉＲＮＡが有する欠点を解消し、標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子、即ちジップ核酸（ｚｉｐｐｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｚｉＲＮＡ）およびその合成方法を提供することを主な目的とする。

本発明によれば、標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子が提供される。前記複合体分子は、少なくとも８０％が相補的である二本鎖のｓｉＲＮＡ鎖Ｘ₁とＸ₂を含み、非核酸分子Ｌ₁を介して鎖Ｘ₁の５’末端と鎖Ｘ₂の３’末端とを連結し、非核酸分子Ｌ₂を介して鎖Ｘ₂の５’末端と鎖Ｘ₁の３’末端とを連結する。

さらに、本発明によれば、標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子の合成方法が提供される。前記方法は、少なくとも８０％が相補的である修飾された二本鎖のｓｉＲＮＡと、結合可能な基を有する修飾された二本鎖のｓｉＲＮＡの５’末端と３’末端とを調製し、修飾された１つのｓｉＲＮＡ鎖の５’末端と３’末端の連結可能な基を、もう１つのｓｉＲＮＡ鎖の３’末端と鎖５’末端の連結可能な基に連結することを含む。

本発明の提供する複合体分子の二本鎖のｓｉＲＮＡ鎖Ｘ₁とＸ₂の５’末端と３’末端とはいずれも非核酸分子を介して連結するため、ｓｉＲＮＡ鎖の巻き戻しと分解ができなくなり、ｓｉＲＮＡの化学的安定性と血中での滞留時間を大幅に改善できる。前記複合体分子が細胞内に導入されると、細胞内に存在しているダイサー（Ｄｉｃｅｒ）酵素により複合体分子からロックされたｓｉＲＮＡを放出し、巻き戻された後、アンチセンス鎖のｓｉＲＮＡが二本鎖ｓｉＲＮＡから放出され、標的遺伝子発現の干渉を実現できる。

本発明の複合体分子を表す図である。 実施例１におけるｚｉＲＮＡの薬物代謝動態学の結果を表す図である。 実施例１におけるｚｉＲＮＡの安定性に関する電気泳動試験結果を表す図である。 従来のｓｉＲＮＡの安定性に関する電気泳動試験結果を表す図である。

本発明の提供する標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子は、少なくとも８０％が相補的である二本鎖のｓｉＲＮＡ鎖Ｘ₁とＸ₂を含み、非核酸分子Ｌ₁を介して鎖Ｘ₁の５’末端と鎖Ｘ₂の３’末端とを連結し、非核酸分子Ｌ₂を介して鎖Ｘ₂の５’末端と鎖Ｘ₁の３’末端とを連結する。ここで説明したいこととして、前記５’末端と３’末端は非核酸鎖の方向を示すのみに用いて、５’位と３’位に限定されることではない。例えば、３’末端の連結は３’位のヒドロキシル基で行ってもいいし、２’位または１’位のヒドロキシル基で行ってもよい。

ｓｉＲＮＡ鎖のＸ₁とＸ₂は標的遺伝子の発現を干渉する機能を有する種々のｓｉＲＮＡ鎖を使用できる。ｓｉＲＮＡ鎖Ｘ₁とＸ₂は少なくとも８０％が相補的であればよい。好ましくは、ｓｉＲＮＡ鎖Ｘ₁またはＸ₂の少なくとも９０％の塩基が前記標的遺伝子と相補的である。より好ましくはｓｉＲＮＡ鎖Ｘ₁またはＸ₂の全塩基が前記標的遺伝子と相補的である。ｓｉＲＮＡ鎖Ｘ₁またはＸ₂は１９から５０個の塩基を有し、好ましくは１９から４０個の塩基を有し、より好ましくは１９から３０個の塩基を有する。

前記非核酸連結分子Ｌ₁は共有結合で、鎖Ｘ₁の５’末端のリン酸基またはヒドロキシル基と鎖Ｘ₂の３’末端のリン酸基またはヒドロキシル基とを連結し、前記非核酸連結分子Ｌ₂は共有結合で鎖Ｘ₂の５’末端のリン酸基またはヒドロキシル基と鎖Ｘ₁の３’末端のリン酸基またはヒドロキシル基とを連結する。前記非核酸連結分子Ｌ₁および非核酸連結分子Ｌ₂は種々の連結基を用いることができる。好ましくは、前記非核酸連結分子Ｌ₁および前記非核酸連結分子Ｌ₂はそれぞれ独立して、カルボキシル基、アミノ基、およびメルカプト基からなる群より選択される基を有するオリゴペプチド、ポリエステル、ポリエーテル、アルカン、アルケン、アルキン、および人工合成核酸類似物からなる群より選択される。前記非核酸連結分子Ｌ₁および前記非核酸連結分子Ｌ₂の原子総数は１０から１００個であってもよい。

より好ましくは、前記非核酸連結分子Ｌ₁および前記非核酸連結分子Ｌ₂はそれぞれ独立して、下記に示されている式Ｉ、式IIおよび式IIIからなる群より選択される。

前記Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₁₀およびＲ₁₂は独立して、カルボキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり；

Ｒ₅は、
であり；

Ｒ₇およびＲ₈は独立して、−（ＣＨ₂）_n−であり；

Ｒ₆、Ｒ₉およびＲ₁₁は独立して、以下に示されている基からなる群より選択され；
且つ、上記各基のｎはそれぞれ独立して、０から１０の整数であり、ｍは１から５の整数である。

前記非核酸連結分子Ｌ₁および／またはＬ₂に細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子および蛍光標識分子からなる群より選択される少なくとも１種を連結することができる。前記非核酸連結分子Ｌ₁および前記非核酸連結分子Ｌ₂の少なくとも一つは式Ｉに示されているものであり、かつＲ₅は、
である。ここで、ｍは２から５の整数である。前記細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子および蛍光標識分子からなる群より選択される少なくとも１種はＲ₅のアジド基（Ｎ₃−）と連結する。

好ましくは、前記細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子および蛍光標識分子の構造式は、
であり、ここで、Ｒは細胞指向識別基、細胞侵入性を増大する脂質類基および蛍光標識基からなる群より選択される少なくとも１種であり、前記アルキニル基はＬ₁及び／またはＬ₂と連結する。

前記アルキニル基はＬ₁及び／またはＬ₂のＲ₅のアジド基（Ｎ₃−）と連結して、
を形成する。

前記細胞指向識別基、細胞侵入性を増大する脂質類基および蛍光標識基はそれらの機能を有する基の種々を用いることができる。

本発明の提供する複合体分子の例としては、下記に示されている式（Ｉ）、式（II）、式（III）および式（IV）が挙げられるが、これらの実例に限定されない。

ここで、式（Ｉ）、式（II）、式（III）および式（IV）において、ｎが０〜１０の整数であってもよい。ここで説明したいこととして、式（Ｉ）、式（II）、式（III）および式（IV）において、Ｎから構成されている鎖は標的遺伝子により設定されているｓｉＲＮＡまたは前記ｓｉＲＮＡの相補的な鎖のイメージ表示であり、Ｎの数がそのｓｉＲＮＡの長さを表すことではない。

本発明の提供する標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子の合成方法において、少なくとも８０％が相補的である修飾された二本鎖のｓｉＲＮＡを含み、修飾された二本鎖のｓｉＲＮＡの５‘末端と３’末端はいずれも連結可能な基を有し、そして修飾された二本鎖のｓｉＲＮＡの一本の５‘末端と３’末端の連結可能な基は修飾された二本鎖のｓｉＲＮＡのもう一本の３‘末端と鎖５’末端の連結可能な基とを連結することを含む。

本発明の好ましい第一の実施態様によれば、前記複合体分子の合成方法において、ａ３とａ３’をそれぞれ固定させ、ａ３において３’から５’の方向へＸ₁を合成し、ａ３’において３’から５’の方向へＸ₂を合成し、ａ３−Ｘ₁とａ３’−Ｘ₂を得るステップ；ａ１とａ１’をａ３−Ｘ₁とａ３’−Ｘ₂の５’末端にそれぞれ導入し、ａ１−Ｘ₁−ａ３とａ１’−Ｘ₂−ａ３’を形成するステップ；ａ２とａ２’をａ１−Ｘ₁−ａ３とａ１’−Ｘ₂−ａ３’にそれぞれ導入し、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’を形成するステップ；およびａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’に対してアニーリングを行い、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３のａ２とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’のａ３’とを、および、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３のａ３とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’のａ２’とを、それぞれ連結反応させ、前記複合体分子を生成するステップを含む。

ここで、ａ１とａ１’はそれぞれ独立して、
であり；

ａ２とａ２’はそれぞれ独立して、
であり；

ａ２−ａ１とａ２’−ａ１’はそれぞれ独立して、
であり；

ａ３とａ３’はそれぞれ独立して、下記に示されている基からなる群より選択される；
なお、前記各基中のｎは独立して、０から１０の整数であり、ｍは１〜５の整数である。

記述の便宜のため、前記ａ１、ａ１’、ａ２、ａ２’、ａ３およびａ３’に対して、分子および基の状態を具体的に区別していない。例えば、ａ３とａ３’の基は、
であってもよいが、それに対応する反応前の分子状態は一般の前記基を含有する反応分子であってもよい。例えば、前記基にハロゲンを連結した分子であり、例としては、
が挙げられる。ここで、同様の例はさらに列挙しない。

核酸の汎用的合成方法を用いて、まずａ３とａ３’を固定させ、次いでａ３において３’から５’の方向へＸ₁を合成し、ａ３’において３’から５’の方向へＸ₂を合成し、ａ３−Ｘ₁とａ３’―Ｘ₂を得ることができる。例えば、「生化学」（Ｉ）（王鏡岩ら編著、第３版、高等教育出版社、中国）５２０〜５２１ページに紹介されている固相合成法を参照することができる。合成過程において、所定の長さに伸長した後、塩基上の保護基を除去することができる。保護基を除去する（脱保護）方法は以下に示されるステップを含むことができる：

（１） ０．５Ｍ ＬｉＣｌの濃アンモニア水溶液（アンモニア水の濃度：２５％）を用いて、分子を５５℃で３時間インキュベーションした後、残存のアンモニアをエバポレーターで除去する；

（２） アンモニアが除去されたＲＮＡ試料に、１Ｍのフッ化テトラｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を含むＴＨＦ溶液１ｍＬを加えて密閉した後、６０℃で２４時間振とうする。トリメチルプロピルオキシシラン１ｍｍｏｌを加えて反応をクエンチし、残余液に同体積量のジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を加え、混合体積量の１０分の１のｄｄＨ₂Ｏ、３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ＝７．０）で処理し、５倍の体積量の無水エタノールを加えて沈殿させる。

ａ１とａ１’をリン酸エステル結合によりａ３−Ｘ₁とａ３’−Ｘ₂の５’末端に導入し、ａ１−Ｘ₁−ａ３とａ１’−Ｘ₂−ａ３’を形成する。

下記に示されている反応式（１）に記載されている方法に基づいて、ａ２とａ２’をａ１−Ｘ₁−ａ３とａ１’−Ｘ₂−ａ３’にそれぞれ導入し、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’を形成することができる：

一般化されたアニーリング方法と条件を用いて、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’のアニーリングを行うことができる。

前記連結反応はアジド基とアルキニル基との付加環化反応を指し、アジド基とアルキニル基との付加環化反応の実例としては、反応式（２）に示されているものが挙げられる：
反応式（２）は、Ｘ₁の一末端とＸ₂の一末端との連結を表示しているが、もう一末端の連結はこれと類似する方法により行われる。

好ましくは、ａ２および／またはａ２’は、
であり、好ましくはｍは２から５の整数である。

この好ましい実施態様によれば、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３のａ２とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’のａ３’と、および、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３のａ３とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’のａ２’と、を連結反応させた後、ａ２および／またはａ２’には残されたアジド基があり、その残されたアジド基は機能性分子と連結できる。前記機能性分子にはアジド基（Ｎ₃−）と反応できる基があり、その反応によって機能性分子と非核酸分子とが連結される。好ましくは、前記細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子および蛍光標識分子の構造式は、
であり、ここで、Ｒは細胞指向識別基、細胞侵入性を増大する脂質類基および蛍光標識基からなる群より選択される少なくとも１種である。前記細胞指向識別基、細胞侵入性を増大する脂質類基および蛍光標識基は慣用の機能を有する基である。前記機能性分子のアルキニル基はａ２および／またはａ２’の残されたアジド基（Ｎ₃−）と付加環化反応ができて、細胞指向識別基、細胞侵入性を増大する脂質類基および蛍光標識基からなる群より選択される少なくとも１種を複合体分子に導入できる。

本発明の好ましい第二の実施態様によれば、前記複合体分子の合成方法は、ａ４とａ４’をそれぞれ固定させ、ａ４において３’から５’の方向へＸ₁を合成し、ａ４’において３’から５’の方向へＸ₂を合成し、ａ４−Ｘ₁とａ４’−Ｘ₂を得る；ａ５とａ５’をａ４−Ｘ₁とａ４’−Ｘ₂の５’末端にそれぞれ導入し、ａ５−Ｘ₁−ａ４とａ５’−Ｘ₂−ａ４’を形成する；ａ６をａ５−Ｘ₁−ａ４とａ５’−Ｘ₂−ａ４’のどちらか一つの鎖と先に連結反応させる；二本鎖がアニーリングされてから、ａ６をもう一つの鎖と連結反応させ、前記複合体分子を生成することを含む。

ここで、ａ４、ａ４’、ａ５およびａ５’はそれぞれ独立して、下記に示されている基からなる群より選択される：
ここで、前記各基においてｎは独立して、０から１０の整数である。

ａ６は、
であり、ここでｐは２から１２の整数である。

好ましい第二の実施態様において、ａ４およびａ４’を固定させ、ａ４において３’から５’の方向へＸ₁を合成し、ａ４’において３’から５’の方向へＸ₂を合成し、ａ４−Ｘ₁とａ４’−Ｘ₂を得る過程では、好ましい第一の実施態様と同じ方法を使用できる。

ａ６の二つのアジド基はそれぞれ結合性の反応基と（反応式（２）に示されているように）連結反応を行うことができる。この連結反応はクリック反応（Ｃｌｉｃｋ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）とも呼ばれ、前記クリック反応の反応条件は当分野において確立された条件を利用できる。

ａ６は、ジハロゲン炭化水素（炭素数が２個以上であり、かつその二つのハロゲン元素は炭化水素鎖の二つの末端炭素に位置する）とアジ化ナトリウムと反応して得ることができる。次に１，２−ジアジドエタン、１，３−ジアジドプロパンおよび１，４−ジアジドブタンの合成を例として挙げて、ジアジド化合物の合成をより詳しく説明する。

（１）１，２−ジアジドエタン（１，２−ｄｉａｚｉｄｏｅｔｈａｎｅ）の合成

５０ｍｌの反応器に、化合物８（１．８７ｇ、１ｍｍｏｌ）およびアジ化ナトリウム（２．６ｇ、４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）（２０ｍｌ）に溶解した。混合物を６０℃で２４時間加熱攪拌し、反応の終了をＴＬＣによって確認した後、水（１５ｍｌ）を加えて反応を停止し、ジクロロメタン（２０ｍｌ×３）で３回抽出した。有機層を合併して、飽和食塩水で洗浄した。エバポレーターで溶剤を除去して得られた残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して、黄色油状の化合物９（１．０２ｇ、収率９２％）を得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ， ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ ３．４１（４Ｈ，ｓ， ＣＨ₂×２）。

（２）１，３−ジアジドプロパン（１，３−ｄｉａｚｉｄｏｐｒｏｐａｎｅ）の合成

５０ｍｌの反応器に、化合物１０（２．００ｇ、１ｍｍｏｌ）およびアジ化ナトリウム（２．６ｇ、４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）に溶解し、６０℃で２４時間加熱攪拌し、反応の終了をＴＬＣによって確認した後、水（１５ｍｌ）を加えて反応を停止し、ジクロロメタン（２０ｍｌ×３）で３回抽出した。有機層を合併して、飽和食塩水で洗浄した。エバポレーターで溶剤を除去して得られた残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して、黄色油状の化合物１１（１．０８ｇ、収率８６％）を得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ， ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ ３．４４−３．４０（４Ｈ，ｔ， ＣＨ₂−Ｎ₃×２）， １．８７−１．８０（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ， ＣＨ₂）。

（３）１，４−ジアジドブタン（１，４−ｄｉａｚｉｄｏｂｕｔａｎｅ）の合成

５０ｍｌの反応器に、化合物１２（２．１３ｇ、１ｍｍｏｌ）およびアジ化ナトリウム（２．６ｇ、４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）に溶解し、６０℃で２４時間加熱攪拌し、反応の終了をＴＬＣによって確認した後、水（１５ｍｌ）を加えて反応を停止し、ジクロロメタン（２０ｍｌ×３）で３回抽出した。有機層を合併して、飽和食塩水で洗浄した。エバポレーターで溶剤を除去して得られた残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して、黄色油状の化合物１３（１．１３ｇ、収率８１％）を得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ， ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ ３．３４（４Ｈ，ｓ， ＣＨ₂−Ｎ₃×２）， １．６９（４Ｈ，ｓ， ＣＨ₂×２）。

以下、実験例、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例に用いる原材料の一部およびその入手先を以下に示す。
２−デオキシ−Ｄ−リボース：上海海曲化工公司
プロパルギルアルコール：Ｆｌｕｋａ社
ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴｒ−Ｃｌ）および天然の保護されたヌクレオシド・ホスホロアミダイトの単量体：上海吉瑪製薬技術有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
ユニバーサルＣＰＧ：北京賽百盛遺伝子技術有限公司（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＳＢＳ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）
ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）は自家製で、青島海洋化工工場製のシリカゲル（品番：ＧＦ２５４、化学グレード）を用いる
カラムクロマトグラフィー用シリカゲル：ＺＣＸ−Ｈ、マクロ多孔性、２００〜３００メッシュ、青島海洋化工工場製）
合成に用いる溶媒、例えば、ピリジン、石油エーテル、酢酸エチル：天津試薬第六工場

実施例１
本実施例は本発明の標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子を合成する。

下記に示されているステップによって、標的遺伝子の表現を干渉する複合体分子を合成する。

１．標的遺伝子を選択し、Ｘ₁とＸ₂の配列を確定する
ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＣ ００００１２）を標的遺伝子に選択し、ｓｉＲＮＡを設計した。ＮＣ ００００１２に対応する位置は２７００−２７１８ｂｐである。

ここで、Ｘ₁がセンス鎖であり、その配列は、
５’ ＧＵＡ ＵＧＡ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＣＵ ＣＡＡ ＧＴＴ ３’
であり；Ｘ₂がアンチセンス鎖であり、その配列は、
５’ ＣＵＵ ＧＡＧ ＧＣＵ ＧＵＵ ＧＵＣ ＡＵＡ ＣＴＴ ３’
である。

２． アルキニル基を含有するヌクレオシドを合成する（塩基Ｕを例にする）：
（１）反応式（３）に示された方法に基づいて行う。２０ｍｌのマイクロ波反応瓶に、保護されたヌクレオシドＵ ａ（９９１ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（１５ｍｌ）に溶解し、無色澄明の溶液を得た。さらにアルキニル基を含む原料ｂ（７１４ｍｇ、３ｍｍｏｌ）と１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセン−７（４５６ｍｇ，３ｍｍｏｌ）を加え、マイクロ波で６０℃に加熱して１時間反応した。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層は合併して、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。エバポレーターで溶剤を除去して得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：石油エーテル／酢酸エチル＝２：１）で精製し、白色固体の粉末ｃ（収率２８％）と粘度の高い淡黄色固体ｄ（収率２０％）を得た。

（２）反応式（４）に示された方法に基づいて行う。２５ｍｌの丸底フラスコに、アルキニル基を含む原料ｄ（１８５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１０ｍｌ）に溶解し、無色澄明の溶液を得た。さらにフッ化テトラブチルアンモニウムの無水テトラヒドロフラン溶液（２０４μｌ、０．２０ｍｍｏｌ、１Ｍ 溶液）を１６℃で加え、混合物を室温で２時間撹拌してから、水１０ｍｌを加え、反応をクエンチした。エバポレーターでＴＨＦを除去し、反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層は合併して、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。エバポレーターで溶剤を除去して得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン／酢酸エチル／メタノール＝１：１：０．０４）で精製し、粘度の高い淡黄色固体ｆ（収率９５％）を得た。

（３）反応式（５）に示された方法に基づいて行う。５０ｍｌの二つ口ナスフラスコに窒素雰囲気下でアルキニル基を含む原料ｆ（１２８ｍｇ、１ｅｑ、１ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解し、２３℃で攪拌しながらジイソプロピルアミン（１０１ｍｇ、１ｅｑ、１ｍｍｏｌ）およびテトラゾール（７０ｍｇ、１ｅｑ、１ｍｍｏｌ）を含む無水ジクロロメタン溶液（５ｍｌ）を滴下した。反応物をしばらく攪拌してから、ホスホロアミダイト試薬ｇ（３６２ｍｇ、１．２ｅｑ、１．２ｍｍｏｌ）を含む無水ジクロロメタン溶液（５ｍｌ）を滴下した。反応混合物を２時間、室温で撹拌しながら、ＴＬＣを用いて反応の進行具合を追跡した。飽和炭酸水素ナトリウムを加え、反応をクエンチし、有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄し、エバポレーターで溶剤を除去した（この操作はできるだけ速く完了する。まず氷浴中で溶剤除去し、ほぼ除去できたらフラスコを氷浴から外して大気中で減圧濃縮する。濃縮が完了したらフラスコを水に入れる。）。カラムクロマトグラフィー（１００〜２００メッシュのシリカゲル）で精製し、黄色の油状物ｉ（収率９０％）を得る。

３．反応式（６）に示された方法に基づいて下記の反応を行う：
（i）ジクロロメタン２０ｍｌに化合物ａ（０．４６ｇ、３．６ｍｍｏｌ）とＮ−ヒド
ロキシ琥珀酸イミドｃ（０．４９ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌し均一に混合した。さらにジシクロへキシルカルボジイミドｂ（０．８９ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌し、反応の終了をＴＬＣによって確認した後、飽和食塩水（２０ｍｌ）を加え、反応をクチエンし、有機層を分離し、水で洗浄し無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝９９：１）で精製し、無色の油状物ｄ（０．５１ｇ、収率６３％）を得た。

分析結果：ＩＲ （薄膜） υ： ２０９１， １７８０， １７３１ ｃｍ^-1。 δＨ （３００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） ３．３７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ， Ｎ₃ＣＨ₂）， ２．７７（４Ｈ，ｍ， ＣＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ）， ２．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ ７．０Ｈｚ， ＣＯＣＨ₂−）， １．９４（２Ｈ，ｍ， ＣＨ₂）； δＣ （７５ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） １６８．９（ＣＯ）， １６７．９（ＣＯ）， ５０．０（Ｎ₃ＣＨ₂）， ２８．１（ＣＯＣＨ₂−）， ２５．６（ＣＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ）， ２４．１（ＣＨ₂）． ｍ／ｚ ＬＲＭＳ ［ＥＳ^-， ＭｅＣＮ］ ２４９ （Ｍ＋Ｎａ⁺， １００％）． ＨＲＭＳ （Ｍ＋Ｎａ^-） （Ｃ₈Ｈ₁₀Ｎ₄ＮａＯ₄）： ｃａｌｃｄ， ２４９．０５９４； ｆｏｕｎｄ， ２４９．０５９０。

（ii）反応に使用する、５’末端アミノ基鎖が修飾されたＲＮＡ ｅは合成装置に
よって合成し、アミノ基を含む化合物および天然の保護されたヌクレオシド・ホスホルアミダイトの単量体は上海吉瑪製薬技術有限公司より購入した。

アミノ基を含む化合物の構造式は以下に示す：
アミノ基にあるＴＦＡ保護基はアンモニアによる脱塩基保護の過程中同時に除去できる。

具体的な操作方法：修飾されたＲＮＡ ｅ（１０〜５０ｎｍｏｌ）を炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．７５、０．５Ｍ、４０μｌ）に溶解し、さらに化合物ｄ（１０μｍｏｌ）を溶解したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（１２μｌ）を加え、室温で４時間インキュベーションする。粗核酸生成物をＮＡＰ−１０ゲルカラムで脱塩して、逆相ＨＰＬＣで精製し、次いで、ＮＡＰ−１０ゲルカラムで脱塩し、最終生成物ｆを得る。

４．下記に示されている反応式（７）に基づき連結反応を行う：
塩化ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、９５０μｌ）にＴＢＴＡ（１．３８μｍｏｌ）、ビタミンＣナトリウム塩（２．０μｍｏｌ）および硫酸銅五水塩（０．２０μｍｏｌ）を順次加え、均一に混合してから、修飾された一本鎖の核酸ａ（２．０ｎｍｏｌ）と修飾された一本鎖の核酸ｂ（２．０ｎｍｏｌ）とを加える。反応混合物を室温で２時間インキュベーションする。反応が完結した後、粗核酸生成物をまず最初にＮＡＰ−１０ゲルカラムで脱塩して、陰イオン交換ＨＰＬＣで精製した。生成物ｃをＮＡＰ−１０ゲルカラムで脱塩した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ−Ｔｉｍｅ Ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間）質量分析計で測定した。

上記各ステップで合成して得た化合物の一部分の構造式と¹Ｈ ＮＭＲデータを表１に示し、上記各ステップで合成して得た化合物の一部分の構造式と³¹Ｐ ＮＭＲデータを表２に示す。

実施例２
本実施例は蛍光標記分子の連結を説明する。

反応式（８）に示された方法に基づいて行う。反応式（８）の化合物ｂは蛍光色素のダンシルクロリドが修飾された生成物であり、発光波長は約５３０ｎｍである。
塩化ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、９５０μｌ）にＴＢＴＡ（１．３８μｍｏｌ）、ビタミンＣナトリウム塩（２．０μｍｏｌ）および硫酸銅五水塩（０．２０μｍｏｌ）を順次加え、均一に混合してから、修飾された二本鎖の核酸ａ（２．０ｎｍｏｌ）と蛍光色素分子ｂ（２．０μｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２時間インキュベーションした。反応が終了した後、粗生成物をＮＡＰ−１０ゲルカラムで脱塩し、陰イオン交換ＨＰＬＣで精製し、生成物ｃを得る。生成物ｃはＮＡＰ−１０ゲルカラムで脱塩した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計または蛍光検出器で測定した。

反応式（８）にあるＴＢＴＡの構造式は以下に示す：

反応式（８）の中、ＮＮＮＮ……ＮＮＮＮはｓｉＲＮＡ二本鎖を示し、センス鎖の配列は５’ ＧＵＡ ＵＧＡ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＣＵ ＣＡＡ ＧＴＴ ３’であり、アンチセンス鎖の配列は５’ ＣＵＵ ＧＡＧ ＧＣＵ ＧＵＵ ＧＵＣ ＡＵＡ ＣＴＴ ３’である。

実施例３
本実施例は、実施例１と実施例２で合成されたｚｉＲＮＡの標的遺伝子発現を抑制する効果を測定する。

（１）ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞系）の培養
１０％のウシ胎児血清および２ｍＭＬのグルタミンを含むＭＥＭ完全培地を用いて、６穴細胞培養用プレートに５×１０⁶個細胞／穴の濃度で、ＨＥＫ２９３細胞（入手先：北京大学分子医学研究所）を接種し、５％ＣＯ₂を含むインキュベーター中、３７℃で培養する。４８時間毎に継代し、新鮮な培地に交換した。

（２）ｚｉＲＮＡのトランスフェクション
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）２０００脂質（インビトロンジェン社製）を用いて、実施例１で合成したｚｉＲＮＡと実施例２で合成したｚｉＲＮＡに対して、それぞれトランスフェクションを実施する。ｚｉＲＮＡの不添加を陰性対照にし、ｓｉＲＮＡの添加を陽性対照にする。具体的な操作方法を以下に示す：
ｚｉＲＮＡをＲＮＡ酵素を含まない滅菌水に溶解し、２０μｍｏｌ／Ｌ濃度のｚｉＲＮＡ溶液を調製した。ＨＥＫ２９３細胞を２４穴細胞培養用プレートに接種し、血清使用量低減培地ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（インビトロンジェン社製、番号：３１９８５−０６２）を用いて８×１０⁵個細胞／ｍｌに希釈し、一つの穴あたり５００μｌずつとした。２０μｍｏｌ／Ｌ濃度のｚｉＲＮＡ溶液（３μｌ）を血清使用量低減培地ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（インビトロンジェン社製、番号：３１９８５−０６２（５０μｌ）で希釈し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）２０００脂質（１μｌ）を血清使用量低減培地ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（インビトロンジェン社製、番号：３１９８５−０６２（５０μｌ）で希釈し、上記の２種の希釈溶液を室温で５分間インキュベーションしてから混合する。この混合溶液を室温に２０分間静置してから、その中の１００μｌ溶液を上記細胞を接種した２４穴のプレート中に添加する。ｚｉＲＮＡの最終濃度は１００ｎＭである。３７℃で４時間インキュベーションした後、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭＬのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＭＥＭ完全培地（１ｍｌ）を添加して、その後、３７℃でさらに２４時間インキュベーションする。

（３）リアルタイム（ｒｅａｌｔｉｍｅ）法による標的遺伝子発現を抑制する効果の評価
リアルタイムＰＣＲを用いて、トランスフェクションされた実施例１のｚｉＲＮＡおよび実施例２のｚｉＲＮＡのＨＥＫ２９３細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を、ｚｉＲＮＡがトランスフェクションされていないＨＥＫ２９３細胞を陰性対照に用い、また、ｓｉＲＮＡ（センス鎖の配列：５’ ＧＵＡ ＵＧＡ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＣＵ ＣＡＡ ＧＴＴ ３’、 アンチセンス鎖の配列：５’ ＣＵＵ ＧＡＧ ＧＣＵ ＧＵＵ ＧＵＣ ＡＵＡ ＣＴＴ ３’）がトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞を陽性対照に用いて、定量した。

具体的な操作方法：トランスフェクションされたｚｉＲＮＡのＨＥＫ２９３細胞および対照試料をトリゾール（ｔｒｉｚｏｌ、ＧＩＢＣＯＬ社製）１ｍｌで溶解し、トータルＲＮＡを以下の方法により抽出する。
トータルＲＮＡの抽出方法：トランスフェクションされた細胞を３７℃、５％ＣＯ₂を含むインキューベーター中で２４時間インキュベートし、遠心分離によって細胞を回収し、予め冷却したＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）２ｍｌで１回洗浄する。前記ＰＢＳの組成物は、１３７ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、４．３ｍｍｏｌ／ＬのＮａ₂ＨＰＯ₄および１．４ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄から構成される。１つの穴あたりトリゾール１ｍｌずつを注入し、室温で５分間放置し、細胞を溶解する。溶解物を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移す。２００μｌのクロロホルムを加え１５秒間激しく手で振とうする。３分間室温に置いた後、１４０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心する。液層の上清の約５００μｌを取って新しいエッペンドルフチューブに移し、５００μｌのイソプロパノールを加え、室温で１０分間放置する。次いで、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取り除いた後、７５％エタノール１ｍｌで沈殿物を１回リンスする。４℃、７６００ｒｐｍで５分間遠心する。上清を取り除き、室温でＲＮＡ沈殿を１０分間乾燥し、２０μｌのｄｄＨ₂Ｏを加えＲＮＡを溶解させる。

２ＵのＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅフリー）（タカラバイオ株式会社製）を上記のＲＮＡを溶解したＤＥＰＣ水（ジエチルピロカーボネート処理水）に加え、３７℃で３０分間静置し、トータルＲＮＡ中の残存したＤＮＡを除去する。ＤＮａｓｅ Ｉで処理後、インビトロジェン社のＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍｉｃｒｏ―ｔｏ―Ｍｉｄｉ（商品名）トータルＲＮＡ精製キットを用いてトータルＲＮＡを精製する。
精製の具体的な方法：トータルＲＮＡに７０％エタノール２０μｌを加え、振とうで均一に混合し、混合物を精製カラムに移し、室温１２０００ｒｐｍで１５秒間遠心し、ろ過液を捨て、洗浄緩衝液Ｉ（タカラバイオ株式会社製）７００μｌを加え、室温１２０００ｒｐｍで１５秒間遠心し、ろ過液を捨て、洗浄緩衝液II（タカラバイオ株式会社製）５００μｌを加え、室温１２０００ｒｐｍで１５秒間遠心し、ろ過液を捨て、室温１２０００ｒｐｍで１分間遠心し、精製カラムをＲＮＡ回収管に移し、ＤＥＰＣ水３０μｌを加え、室温で１分間放置し、室温１３０００ｒｐｍで２分間遠心し、ＲＮＡ試料を−８０℃で保存する。

精製して得たトータルＲＮＡに対して逆転写反応を行う。逆転写反応において、逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製）を使用する。
逆転写反応の具体的な方法：精製したトータルＲＮＡ １μｇとＯｌｉｇｏ−ｄＴ ０．５μｇとを試験管中で混合し、ＤＥＰＣ水で総容積を１６．２５μｌに調製し、試験管を７０℃で５分間加熱する。次いで、試験管を０℃に速く冷却し、緩衝液（５×ＭＬＶ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰ １．２５μｌ、ＲＮａｓｉｎ ０．５μｌ、Ｍ−ＭＬＶ １μｌ）を加え、４２℃で１時間インキュベーションして、ｃＤＮＡを得る。

得られたｃＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型にし、リアルタイムＰＣＲ反応を行う。リアルタイムＰＣＲ反応系は、ｄｄＨ₂Ｏ １７．５μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰ ０．５μｌ、１０×Ｔａｑ緩衝液２．５μｌ、Ｔａｑ ０．５μｌ、Ｆプライマー ０．５μｌ、Ｒプライマー ０．５μｌ、サイバーグリーンＩ（Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）１μｌとｃＤＮＡ ２μｌから構成される。９４℃２分間、９４℃１５秒、６０℃３０秒の計４０サイクルのＰＣＲ反応条件を用いる。同時にβ−アクチン（ａｃｔｉｎ）を内部標準遺伝子として使用し、下記の式に従って、ｚｉＲＮＡの抑制率を算出する。

ｚｉＲＮＡの抑制率＝［１−（ｚｉＲＮＡがトランスフェクションされた後のＧＡＰＤＨ遺伝子のコピー数／ｚｉＲＮＡがトランスフェクションされた後のβ−アクチンのコピー数）／（対照穴のＧＡＰＤＨ遺伝子のコピー数／対照穴のβ−アクチンのコピー数）］×１００％

上記式に従って以下の結果を得る：ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの抑制率が９１％であり、実施例１で得たｚｉＲＮＡと実施例２で得たｚｉＲＮＡがそれぞれトランスフェクションされた後、ＧＡＰＤＨに対する抑制率はそれぞれ９２％と８９％である。

上記の結果により、本発明のｚｉＲＮＡはＧＡＰＤＨ遺伝子発現を高い効率で抑制することが確認される。

実施例４
本実施例は実施例１で得られたｚｉＲＮＡの薬物代謝動態学を測定する。

実施例１で合成されたｚｉＲＮＡと従来のｓｉＲＮＡ（センス配列：５’ ＧＵＡ ＵＧＡ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＣＵ ＣＡＡ ＧＴＴ ３’、アンチセンス配列：５’ ＣＵＵ ＧＡＧ ＧＣＵ ＧＵＵ ＧＵＣ ＡＵＡ ＣＴＴ ３’）とは³²Ｐ末端標識方法によりそれぞれ標識され、標識の比活性は２μＣｉ／μｇである。実験動物は昆明マウス（体重２０〜２５ｇ、メスまたはオス）６０匹を用いる。１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で上記に放射線標記されたｚｉＲＮＡまたは従来のｓｉＲＮＡを投与する。注射の前、注射した後の１ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、３ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈと４８ｈの各時間にマウスを３匹ずつ取り、眼窩の静脈より採血し、血漿を分離し、血漿中の放射比活性を測定する。結果を図２に示す。図２から明らかなように、従来のｓｉＲＮＡに比べて、ｚｉＲＮＡは血清中での滞留時間が長い。

実施例５
本実施例は実施例１で合成されたｚｉＲＮＡの安定性を測定する。

実施例１で合成されたｚｉＲＮＡと１０％血清とを１ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１．５ｈ、３ｈ、６ｈ、１２ｈと２４ｈの各時間、それぞれインキュベーションした後、２０％ＰＡＧＥ（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｏ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）電気泳動試験を行い、ｚｉＲＮＡの血清中での安定性を観察した。結果を図３に示す。図３中の各数字の意味は以下のとおり：１ ｚｉＲＮＡ；２ 一本鎖ＲＮＡ；３ １ｍｉｎ；４ ３０ｍｉｎ；５ １．５ｈ；６ ３ｈ；７ ６ｈ；８ １２ｈ；９ ２４ｈ；１０ ＲＮＡ。

従来のｓｉＲＮＡ（センス配列：５’ ＧＵＡ ＵＧＡ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＣＵ ＣＡＡ ＧＴＴ ３’、 アンチセンス配列：５’ ＣＵＵ ＧＡＧ ＧＣＵ ＧＵＵ ＧＵＣ ＡＵＡ ＣＴＴ ３’）と１０％血清とを１ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１．５ｈ、３ｈ、６ｈ、１２ｈと２４ｈの各時間、それぞれインキュベーションした後、２０％ＰＡＧＥ電気泳動試験を行い、ｓｉＲＮＡの血清中での安定性を観察した。結果を図４に示す。図４中の各数字の意味は以下のとおり：１ 従来のｓｉＲＮＡ；２ 一本鎖ＲＮＡ；３ １ｍｉｎ；４ ３０ｍｉｎ；５ １．５ｈ；６ ３ｈ；７ ６ｈ；８ １２ｈ；９ ２４ｈ；１０ ＲＮＡ。

図３と図４を比較すると、その結果は、ｚｉＲＮＡの血清中での安定性が従来のｓｉＲＮＡより安定であることが確認される。従来のｓｉＲＮＡは、血清中で３０分のインキュベートの後に著しく分解され、６時間後２本鎖ＲＮＡの存在がほぼ確認できないことに対して、ｚｉＲＮＡは、血清中で２４時間以上安定的に存在する。

実施例６
本実施例は本発明の標的遺伝子発現を干渉する複合体分子を合成する。
実施例１において、アルキニル基を含有するヌクレオシドを合成するステップ２の代わりに下記に示されるプロセスを用いる以外は、実施例１と同じ方法で行う。

（１） ２’−デオキシ−１’α／β−プロピニルオキシ−Ｄ−リボフラノースの合成

２５０ｍｌのフラスコに、化合物１（５．２ｇ、４ｍｍｏｌ）とプロパルギルアルコール（３．９ｇ、７．３ｍｍｏｌ）を加え、氷浴中で攪拌しながら濃塩酸（１．２７ｇ）を滴下し、次いで、室温（２０℃）で３時間攪拌した。反応の終了をＴＬＣによって確認した後、蒸留・乾燥で処理されたピリジン（２０ｍｌ）を加え、エバポレーターによって溶剤を除去し、得られる残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：石油エーテル／酢酸エチル／メタノール＝１：１：０．２５）で精製し、白色固体物（化合物２、６．６ｇ、収率７５％）を得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ ５．２２（１Ｈ，ｍ，Ｈ１’）， ４．２２−４．０７（２Ｈ，ｍ， ＯＣＨ₂）， ３．９１−３．８６（２Ｈ，ｍ，Ｈ４’，Ｈ５’ａ）， ３．６５−３．４３（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’ｂ，Ｈ３’）， ２．４５（１Ｈ，ｔ，ＣＨ）， １．９６−１．９８（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’） ．ＥＳＩ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］^-， １９５．０６２８。

（２）２’−デオキシ−１’α／β−プロピニルオキシ−３’−ジ−Ｏ−アセチル−Ｄ−リボフラノースの合成

１００ｍｌのフラスコに、化合物２（１．７２ｇ、１ｍｍｏｌ）を乾燥処理されたピリジン（１０ｍｌ）に溶解し、無水酢酸（３．０６ｇ、３ｍｍｏｌ）を加え、１５０℃まで速やかに加熱し、５分間還流する。反応の終了をＴＬＣによって確認した後、反応液を水（１０ｍｌ）に加え、ジクロロメタン（１５ｍｌ×３）で抽出し、乾燥した。エバポレーターによって溶剤を除去し、得られる残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：石油エーテル／酢酸エチル＝５：１）で数回精製し、微黄色油状物（化合物３、０．８６ｇ）と白色結晶物（化合物４、１．６０ｇ）とを得た（総収率９１％）。¹Ｈ ＮＭＲ，α−アノーマー：¹Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ ５．０９（１Ｈ，ｔ，Ｈ１’）， ４．２４−４．２１（２Ｈ，ｍ，Ｈ４’，Ｈ３’）， ３．８８−３．７６（４Ｈ，ｍ，Ｈ５’， ＯＣＨ₂）， ２．４５（１Ｈ，ｓ， ＣＨ）， １．９７−１．９１（８Ｈ，ｍ， ＣＯＣＨ₃×２，Ｈ２’ａ，ｂ）；β−アノーマー：¹Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ ５．２３（１Ｈ，ｍ，Ｈ１’）， ４．３２−４．１６（３Ｈ，ｍ，Ｈ４’，Ｈ３’，Ｈ５’ａ）， ３．７６−３．６２（３Ｈ，ｍ，Ｈ５’ｂ， ＯＣＨ₂）， ２．４６（１Ｈ，ｍ， ＣＨ）， ２．２３−１．９５（８Ｈ，ｍ， ＣＯＣＨ₃×２，Ｈ２’ａ，Ｈ２’ｂ）． ＥＳＩ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］^-， ２７９．０８３９。

（３）２’−デオキシ−１’β−プロピニルオキシ−Ｄ−リボフラノースの合成

５０ｍｌのフラスコに、化合物３（５００ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍｌに攪拌しながら溶解し、１０％のＮａＯＨメタノール溶液（４ｍｌ）を加え、室温で５分間攪拌する。反応の終了をＴＬＣによって確認した後、水１０ｍｌを加え、エバポレーターによって一部分のメタノールを除去し、酢酸エチル（１５ｍｌ×３）で抽出し、乾燥し、エバポレーターによって溶剤を除去し、メタノールによって再結晶し、白色固体物（化合物５、３２０ｍｇ、収率９２％）を得た。¹Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ ５．２３（１Ｈ，ｍ，Ｈ１’）， ４．３０−４．２３（２Ｈ，ｍ， ＯＣＨ₂）， ４．１９（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’）， ３．８６（１Ｈ，ｍ，Ｈ５’ａ）， ３．６５−３．６１（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’ｂ，Ｈ３’）， ２．４７（１Ｈ，ｄｔ， ＣＨ）， ２．１７−１．９５（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’）． ＥＳＩ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］^-， １９５．０６２８。

（４）２’−デオキシ−１’β−プロピニルオキシ−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｄ−リボフラノースの合成

５０ｍｌのフラスコに、化合物５（３２０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）を加え、乾燥ピリジン（５ｍｌ）とエバポレーターによって水分除去を３回繰り返し、乾燥ピリジン（５ｍｌ）を加え溶解し、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（１．３５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を加え、室温で０．５時間攪拌して反応する。反応の終了をＴＬＣによって確認した後、無水メタノール３ｍｌを加え、さらに５分間攪拌し、反応液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍｌ）に加え、ジクロロメタン（１５ｍｌ×３）で抽出し、乾燥した。エバポレーターによって溶剤を除去し、得られる残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：石油エーテル／酢酸エチル＝３：１）で精製し、白色綿状固体（化合物６、６００ｍｇ、収率７１％）を得る。¹Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ ７．５６−７．２１（９Ｈ，ｍ， Ａｒ−Ｈ）， ６．８４（４Ｈ，ｍ， Ａｒ−Ｈ）， ５．２３（１Ｈ，ｍ，Ｈ１’）， ４．３４−４．１１（３Ｈ， ＯＣＨ₂ ，Ｈ４’）， ３．８１（６Ｈ，ｓ， ＯＣＨ₃×２）， ３．６３−３．５１（３Ｈ，ｍ，Ｈ３’Ｈ５’）， ２．４５（１Ｈ，ｍ， ＣＨ）， ２．３６−２．０６（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’）． ＥＳＩ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］^-， ４９７．１９３５。

（５）２’−デオキシ−１’β−プロピニルオキシ−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｄ−リボフラノースの合成

５０ｍｌの二口のフラスコに、窒素雰囲気下で、１−Ｈ−テトラゾール（１６０ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）とホスホロアミダイト試薬（７６０ｍｇ、５．５６ｍｍｏｌ）を再蒸留されたジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解し、５分間攪拌した後、化合物６（６００ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）が溶解されている再蒸留されたジクロロメタン（４ｍｌ）の溶液を滴下し、窒素雰囲気下室温で１０時間攪拌する。反応の終了をＴＬＣによって確認した後、エバポレーターによって溶剤を除去し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；石油エーテル／酢酸エチル＝５：１）で精製し、白色綿状固体（化合物７、６２０ｍｇ、収８２％）を得る。¹Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ₃） δ ｐｐｍ ７．５６−７．２１（９Ｈ，ｍ， Ａｒ−Ｈ）， ６．８４（４Ｈ，ｍ， Ａｒ−Ｈ）， ５．３６（１Ｈ，ｍ，Ｈ１’）， ４．３７−４．２３（４Ｈ，ｍ， ＯＣＨ₂Ｃ， Ｈ４’， ＰＯＣＨ₂ａ）， ３．８０（６Ｈ，ｓ， ＯＣＨ₃×２）， ３．６３−３．５１（３Ｈ，ｍ，Ｈ３’，Ｈ５’）， ３．３６−３．０７（２Ｈ，ｍ， ＣＨ×２）， ２．６５（１Ｈ，ｍ， ＰＯＣＨ₂ｂ）， ２．５６（１Ｈ，ｍ， ＣＣＨ）， ２．３７−２．０６（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’）， １．２３（１２Ｈ，ｍ， ４×ＣＨ₃）； ³¹Ｐ−ＮＭＲ（１６２Ｍ，ＣＤＣｌ₃）： δ ｐｐｍ １４８．３，１４７．４； ¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，１００ＭＨｚ） δ ｐｐｍ １５８．５２， １４５．８９， １３６．９２， １３０．５２， １２８．５６， １２７．６５， １２６．７３， １１７．７２， １１２．９９， ９６．７５２， ８６．３７， ７９．６９， ７７．４１， ７７．１０， ７６．７８， ７３．９０， ７１．１６， ６６．７３， ６３．８９， ５７．２０， ５５．２２， ５３．９０， ４３．３５， ３２．０９， ２４．７４， ２０．３８． ＥＳＩ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］^-， ６９７．３０１３。

Claims (13)

1. 標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子であって、少なくとも８０％が相補的である二本鎖のｓｉＲＮＡ鎖Ｘ₁とＸ₂を含み、非核酸分子Ｌ₁を介して鎖Ｘ₁の５’末端と鎖Ｘ₂の３’末端とを連結し、非核酸分子Ｌ₂を介して鎖Ｘ₂の５’末端と鎖Ｘ₁の３’末端とを連結することを特徴とする標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子。
2. 前記非核酸連結分子Ｌ₁は共有結合で鎖Ｘ₁の５’末端のリン酸基またはヒドロキシル基と鎖Ｘ₂の３’末端のリン酸基またはヒドロキシル基とをそれぞれ連結し、前記非核酸連結分子Ｌ₂は共有結合で鎖Ｘ₂の５’末端のリン酸基またはヒドロキシル基と鎖Ｘ₁の３’末端のリン酸基またはヒドロキシル基とをそれぞれ連結する、請求項１に記載の複合体分子。
3. 前記非核酸連結分子Ｌ₁および前記非核酸連結分子Ｌ₂はそれぞれ独立して、カルボキシル基、アミノ基、およびメルカプト基からなる群より選択される基を有するオリゴペプチド、ポリエステル、ポリエーテル、アルカン、アルケン、アルキン、および人工合成核酸類似物からなる群より選択される、請求項１に記載の複合体分子。
4. 前記非核酸連結分子Ｌ₁および前記非核酸連結分子Ｌ₂はそれぞれ独立して、以下に示されている式Ｉ、式II、および式IIIからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体分子。
   前記Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₁₀およびＲ₁₂は独立して、カルボキシル基、アミノ基、およびメルカプト基からなる群より選択され；
   Ｒ₅は、
   からなる群より選択され；
   Ｒ₇およびＲ₈は独立して、−（ＣＨ₂）_n−であり；
   Ｒ₆、Ｒ₉およびＲ₁₁は以下に示されている基からなる群より選択され；
   且つ、上記各基のｎはそれぞれ独立して、０から１０の整数であり、ｍは１から５の整数である。
5. 前記非核酸連結分子Ｌ₁および／またはＬ₂に細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子および蛍光標識分子からなる群より選択される少なくとも１種を連結する、請求項１に記載の複合体分子。
6. 前記非核酸連結分子Ｌ₁および前記非核酸連結分子Ｌ₂はそれぞれ独立して、以下に示されている式Ｉ、式II、および式IIIからなる群より選択され、且つ前記非核酸連結分子Ｌ₁および前記非核酸連結分子Ｌ₂の少なくとも一つは式Ｉであり、および前記細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子および蛍光標識分子からなる群より選択される少なくとも１種はＲ₅のアジド基（Ｎ₃−）と連結する、請求項５に記載の複合体分子。
   前記Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₁₀およびＲ₁₂は独立して、カルボキシル基、アミノ基、およびチオール基からなる群より選択され；
   Ｒ₅は、
   であり；
   Ｒ₇およびＲ₈は独立して、−（ＣＨ₂）_n−であり；
   Ｒ₆、Ｒ₉およびＲ₁₁は以下に示されている基からなる群より選択され；
   且つ、上記各基のｎはそれぞれ独立して、０から１０の整数であり、ｍは２から５の整数である。
7. 前記細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子および蛍光標識分子の構造式は、
   であり、ここで、Ｒは細胞指向識別基、細胞侵入性を増大する脂質類基および蛍光標識基からなる群より選択される少なくとも１種であり、前記アルキニル基はＬ₁及び／またはＬ₂と連結する、請求項５または６に記載の複合体分子。
8. 前記アルキニル基はＬ₁及び／またはＬ₂のＲ₅のアジド基（Ｎ₃−）と連結して、
   を形成する、請求項７に記載の複合体分子。
9. 少なくとも８０％が相補的である修飾された二本鎖のｓｉＲＮＡと、修飾された二本鎖のｓｉＲＮＡの連結可能な基を有するそれぞれの鎖の５’末端と３’末端とを調製し、修飾された一つのｓｉＲＮＡ鎖の５’末端と３’末端の連結可能な基を、修飾された他方のｓｉＲＮＡ鎖の３’末端と鎖５’末端の連結可能な基とをそれぞれ連結する、ことを含むことを特徴とする請求項１に記載の標的遺伝子の発現を干渉する複合体分子の合成方法。
10. ａ３とａ３’をそれぞれ固定し、ａ３において３’から５’の方向へＸ₁を合成し、ａ３’において３’から５’の方向へＸ₂を合成し、ａ３−Ｘ₁とａ３’−Ｘ₂を得るステップ；
    ａ１とａ１’をａ３−Ｘ₁とａ３’−Ｘ₂の５’末端にそれぞれ導入し、ａ１−Ｘ₁−ａ３とａ１’−Ｘ₂−ａ３’を形成するステップ；
    ａ２とａ２’をａ１−Ｘ₁−ａ３とａ１’−Ｘ₂−ａ３’にそれぞれ導入し、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’を形成するステップ；および、
    ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’とをアニーリングし、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３のａ２とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’のａ３’と、および、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３のａ３とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’のａ２’とを連結反応させ、前記複合体分子を生成するステップ、
    を含む、請求項９に記載の方法。
    ここで、ａ１とａ１’はそれぞれ独立して、
    であり；
    ａ２とａ２’はそれぞれ独立して、
    であり；
    ａ２−ａ１とａ２’−ａ１’はそれぞれ独立して、
    であり；
    ａ３とａ３’はそれぞれ独立して、下記に示されている基からなる群より選択される；
    ここで、前記各基中のｎは独立して、０から１０の整数であり、ｍは１〜５の整数である。
11. ａ２および／またはａ２’は、
    であり、ｍは２から５の整数であり、ｎは０から１０の整数であり、さらに、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３のａ２とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’のａ３’と、および、ａ２−ａ１−Ｘ₁−ａ３のａ３とａ２’−ａ１’−Ｘ₂−ａ３’のａ２’とを連結反応させてから、ａ２および／またはａ２’に細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子および蛍光標識分子からなる群より選択される少なくとも１種を連結させ、この細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子および蛍光標識分子からなる群より選択される少なくとも１種は、ａ２および／またはａ２’のアジド基（Ｎ₃−）と連結されることを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記細胞指向識別分子、細胞侵入性を増大する脂質類分子および蛍光標識分子の構造式は、
    であり、ここで、Ｒは細胞指向識別基、細胞侵入性を増大する脂質類基および蛍光標識基からなる群より選択される少なくとも１種であり、前記アルキニル基はａ２および／またはａ２’のアジド基（Ｎ₃−）と連結して、
    を形成する、請求項１１に記載の方法。
13. ａ４とａ４’をそれぞれ固定し、ａ４において３’から５’の方向へＸ₁を合成し、ａ４’において３’から５’の方向へＸ₂を合成し、ａ４−Ｘ₁とａ４’−Ｘ₂を得る；ａ５とａ５’をａ４−Ｘ₁とａ４’−Ｘ₂の５’末端にそれぞれ導入し、ａ５−Ｘ₁−ａ４とａ５’−Ｘ₂−ａ４’を形成する；ａ６をａ５−Ｘ₁−ａ４とａ５’−Ｘ₂−ａ４’のいずれか一つの鎖と先に連結反応させる；二本の鎖をアニーリングしてから、ａ６を他方の鎖と連結反応させ、前記複合体分子を生成することを含む、請求項９に記載の方法。
    ここで、ａ４、ａ４’、ａ５およびａ５’はそれぞれ独立して、下記に示されている基からなる群より選択される：
    ここで、前記各基においてｎは独立して、０から１０の整数であり、
    ａ６は、
    であり、ここでｐは２から１２の整数である。