JP2011118070A - 共焦点走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】共焦点絞りを励起光及び蛍光に作用させながら、自家蛍光による蛍光画像の画質の劣化を抑制することができる共焦点走査型顕微鏡を提供する。
【解決手段】共焦点走査型顕微鏡１は、光源部２から射出された励起光を光分離手段３により対物光学系６へ導き、対物光学系６の試料１２側の焦点位置に配置された試料１２に照射する。共焦点走査型顕微鏡１は、試料１２から生じた蛍光を、対物光学系６を介して光分離手段３へ入射させ励起光から分離し、撮像光学系１３を介して撮像素子１９で検出する。共焦点走査型顕微鏡１は、光源部２と対物光学系６の間で、且つ、対物光学系６の試料１２側の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されたラインスリット部材５ａにより共焦点効果を生じさせ、撮像光学系１３内でラインスリット部材５ａと光学的に共役な位置に配置されたラインスリット部材１５ａにより自家蛍光を遮断する。
【選択図】図１

Description

本発明は、共焦点走査型顕微鏡に関し、特に、共焦点絞りを用いた共焦点走査型顕微鏡に関する。

蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡の一つとして、共焦点効果により高コントラストで鮮明な画像が得られる共焦点走査型顕微鏡が知られている。

これまでにさまざまな種類の共焦点走査型顕微鏡が提案されているが、その一つとして、共焦点効果を得るために用いられる共焦点絞りを蛍光だけでなく励起光に対しても作用する位置に配置した顕微鏡が特許文献１で開示されている。

特許文献１に開示される顕微鏡では、微小光変調要素アレイが、ダイクロイックミラーと試料の間の光路上であり、且つ、対物レンズの試料側の焦点位置と光学的に共役な位置に、配置されている。このため、微小光変調要素アレイは、蛍光または反射光に対しては共焦点ピンホール（共焦点絞り）として機能するとともに、レーザ光（励起光）に対してはレーザ光が試料に入射する位置、範囲や形状などを調整する照明調整手段として機能している。

このように、落射照明を用いた共焦点走査型顕微鏡では、照明光路と検出光路が重なった光路上であり、且つ、対物レンズの試料側の焦点位置と光学的に共役な位置に、共焦点絞りを配置した場合、共焦点絞りを、共焦点効果を生じさせるためだけではなく、照明状態を調整するためにも、利用することができる。

特開２００８−２０３８１３号公報

ところで、落射照明を用いた共焦点走査型顕微鏡の場合、共焦点絞りは、試料上の焦点位置周辺から生じる蛍光を遮断して共焦点効果を生じさせるだけではなく、照明光路上の光学素子から生じる自家蛍光を遮断する役割も担っている。

しかしながら、特許文献１に開示された顕微鏡のように、共焦点絞りが照明光路と検出光路が重なった光路上に配置される構成では、ダイクロイックミラーなどの分離素子と共焦点絞りとの間に配置された光学系から生じる自家蛍光は、共焦点絞りを通過することがない。また、自家蛍光は、分離素子を透過してしまうため、標本から生じた蛍光と一緒に撮像素子に入射し、蛍光画像の画質の劣化を引き起こしてしまう。

以上のような実情を踏まえ、本発明では、共焦点絞りを励起光及び蛍光に作用させながら、自家蛍光による蛍光画像の画質の劣化を抑制することができる共焦点走査型顕微鏡を提供することを課題とする。

本発明の第１の態様は、励起光を射出する光源部と、励起光を試料に集光させる対物光学系と、光源部と対物光学系の間であり、且つ、対物光学系の試料側の焦点位置と光学的に共役な位置に、配置された第１の絞り手段と、試料と第１の絞り手段の間であり、且つ、対物光学系の瞳位置近傍に配置され、試料を走査する第１の走査手段と、光源部と第１の絞り手段の間に配置され、励起光を第１の絞り手段に集光させる第１の集光光学系と、光源部と第１の集光光学系の間に配置され、試料から発せられた蛍光を励起光から分離する光分離手段と、蛍光を検出し、試料を撮像する撮像手段と、光分離手段で分離された蛍光を撮像手段に導く撮像光学系と、を含み、撮像光学系は、第１の絞り手段と光学的に共役な位置に配置された第２の絞り手段を含む共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡において、対物光学系は、励起光を試料に集光させる対物レンズと、対物レンズの瞳を第１の走査手段近傍にリレーする第１のリレー光学系と、を含む共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第３の態様は、第１の態様または第２の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡において、撮像光学系は、光分離手段で分離された蛍光を、第２の絞り手段に集光させる第２の集光光学系と、第２の絞り手段を通過した蛍光を撮像手段に集光させる第３の集光光学系と、を含む共焦点走査型顕微鏡を提供する。
本発明の第４の態様は、第３の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡において、撮像手段は、ラインセンサである共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第５の態様は、第３の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡において、さらに、第２の絞り手段と撮像素子の間であり、且つ、対物光学系の瞳と光学的に共役な位置近傍に配置され、第１の走査手段の動作と同期して動作する第２の走査手段を含み、第３の集光光学系は、第２の絞り手段と第２の走査手段の間に配置され、対物光学系の瞳を第２の走査手段近傍にリレーする、第２のリレー光学系と、第２の走査手段と撮像手段の間に配置され、蛍光を撮像手段に集光させる、結像レンズと、を含む共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第６の態様は、第１の態様乃至第５の態様のいずれか１つに記載の共焦点走査型顕微鏡において、第１の絞り手段は、ライン状のスリットからなる開口部を有する共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第７の態様は、第１の態様乃至第５の態様のいずれか１つに記載の共焦点走査型顕微鏡において、第１の絞り手段は、ライン状のミラーからなる開口部を有する共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第８の態様は、第６の態様または第７の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡において、第１の走査手段は、試料を一方向に走査する走査手段であり、開口部の長手方向は、一方向と直交する方向である共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第９の態様は、第１の態様乃至第５の態様のいずれか１つに記載の共焦点走査型顕微鏡において、第１の絞り手段は、デジタルマイクロミラーデバイスである共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第１０の態様は、第１の態様乃至第９の態様のいずれか１つに記載の共焦点走査型顕微鏡において、第１の絞り手段は、第１の開口径を有する開口部を含み、λを蛍光の波長とし、ＮＡを対物光学系の第１の絞り手段側の開口数とするとき、第１の開口径は、２×０．６１×λ／ＮＡで定義される回折径程度である共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第１１の態様は、第１０の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡において、第２の絞り手段は、第２の開口径を有する開口部を含み、第２の開口径は、第１の開口径よりも大きい共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第１２の態様は、第１１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡において、第２の開口径は、第１の開口径の１．５倍から３倍である共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第１３の態様は、第１の態様乃至第１２の態様のいずれか１つに記載の共焦点走査型顕微鏡において、光分離手段と第１の絞り手段の間に配置された光学部材は、自家蛍光の発生が少ない低自家蛍光硝材で構成される共焦点走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、共焦点絞りを励起光及び蛍光に作用させながら、自家蛍光による蛍光画像の画質の劣化を抑制することができる共焦点走査型顕微鏡を提供することができる。

実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡の構成を例示した図である。 実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡に含まれる絞り手段の構成を例示した図である。 実施例２に係る共焦点走査型顕微鏡の構成を例示した図である。 実施例３に係る共焦点走査型顕微鏡の構成を例示した図である。 実施例３に係る共焦点走査型顕微鏡に含まれるデジタルマイクロミラーデバイスの構成を例示した図である。 実施例４に係る共焦点走査型顕微鏡の構成を例示した図である。

以下、図面を参照しながら、各実施例について説明する。

図１は、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡の構成を例示した図である。

図１に例示される共焦点走査型顕微鏡１は、励起光を射出する光源部２と、試料１２から発せられた蛍光を励起光から分離する光分離手段３と、集光光学系４と、ラインスリット部材５ａと、励起光を試料１２に集光させる対物光学系６と、試料１２を励起光で走査する第１の走査手段１１と、撮像光学系１３と、第１の走査手段１１の動作と同期して動作する第２の走査手段１８と、蛍光を検出し試料１２を撮像する撮像素子１９と、を含んで構成されている。なお、以降では、光軸方向（つまり、光線の進行方向）を常にＺ方向として定義する。また、後述するラインスリット部材５ａ及びラインスリット部材１５ａの開口部の長手方向をＹ方向として、第１の走査手段１１及び第２の走査手段１８の走査方向をＸ方向として、定義する。

光源部２としては、例えば、レーザ光源などを用いることができる。また、光源部２は、その内部にＹ方向に対して負の屈折力を備えるシリンドリカルレンズ等を備え、Ｙ方向の光束径を広げてもよい。また、光分離手段３は、光源部２と集光光学系４の間に配置され、例えば、ダイクロイックミラーなどが用いられる。集光光学系４は、光源部２から射出された励起光をラインスリット部材５ａ上に集光させる、共焦点走査型顕微鏡１の第１の集光光学系であり、光源部２とラインスリット部材５ａの間に配置される。

ラインスリット部材５ａは、光源部２と対物光学系６の間であり、且つ、対物光学系６の試料１２側の焦点位置と光学的に共役な位置に配置された共焦点絞りであり、共焦点走査型顕微鏡１の第１の絞り手段として機能する。

対物光学系６は、レンズ７と、レンズ８と、レンズ９と、励起光を試料１２に集光させる対物レンズ１０と、を含んで構成されている。レンズ７は、励起光に対しては励起光を平行光に変換するコリメータレンズであり、蛍光に対しては蛍光をラインスリット部材５ａに集光させる集光レンズである。レンズ８及びレンズ９は、対物レンズ１０の瞳を第１の走査手段１１近傍にリレーする、共焦点走査型顕微鏡１の第１のリレー光学系である。

第１の走査手段１１は、試料１２とラインスリット部材５ａとの間であり、且つ、対物光学系６の瞳位置近傍に配置されている。なお、図１では、対物光学系６内に第１の走査手段１１が配置されている例が示されている。

撮像光学系１３は、光分離手段３で分離された蛍光を撮像素子１９に導く光学系であり、レンズ１４と、ラインスリット部材１５ａと、レンズ１６と、レンズ１７と、を含んで構成されている。レンズ１４は、光分離手段３で分離された蛍光をラインスリット部材１５ａに集光させる、共焦点走査型顕微鏡１の第２の集光光学系である。レンズ１６は、ラインスリット部材１５ａと第２の走査手段１８の間に配置されていて、対物光学系６の瞳を第２の走査手段１８近傍にリレーする、共焦点走査型顕微鏡１の第２のリレー光学系である。レンズ１７は、第２の走査手段１８と撮像素子１９の間に配置されていて、蛍光を撮像素子１９に集光させる結像レンズである。また、レンズ１６及びレンズ１７は、ラインスリット部材１５ａを通過した蛍光を撮像素子１９に集光させる、共焦点走査型顕微鏡１の第３の集光光学系である。

ラインスリット部材１５ａは、ラインスリット部材５ａと光学的に共役な位置に配置された絞り手段であり、共焦点走査型顕微鏡１の第２の絞り手段として機能する。

第２の走査手段１８は、ラインスリット部材１５ａと撮像素子１９の間であり、且つ、対物光学系６の瞳と光学的に共役な位置近傍に配置されている。なお、図１では、撮像光学系１３内に第２の走査手段１８が配置されている例が示されている。

第１の走査手段１１及び第２の走査手段１８としては、例えば、ガルバノミラーなどを用いることができる。また、撮像素子１９としては、例えば、２次元ＣＣＤセンサなどを用いることができる。
次に、以上のように構成された共焦点走査型顕微鏡１の作用について説明する。

以降では、光源部２が、レーザ光源であり、第１の走査手段１１及び第２の走査手段１８が、それぞれ対物レンズ１０、レンズ１７の光軸に直交する一方向（Ｘ方向）に試料１２、撮像素子１９を走査する１次元走査手段であり、撮像素子１９が、ＣＣＤをレンズ１７の光軸に直交する面内に並べた２次元センサである場合を例に説明する。なお、撮像素子１９では、ＣＣＤは、第１の走査手段１１及び第２の走査手段１８の走査方向であるＸ方向、及び、Ｘ方向と直交するＹ方向に並べられている。

まず、励起光として作用する光源部２から射出されたレーザ光は、光分離手段３を反射し、集光光学系４に入射する。集光光学系４は、入射したレーザ光をラインスリット部材５ａ上に集光させる。

図２（ａ）は、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡１に含まれるラインスリット部材５ａの構成を例示した図である。図２（ａ）に例示されるように、ラインスリット部材５ａは、光を遮断する絞り部２０ａと、光を通過させる開口部２０ｂとから構成されている。このため、ラインスリット部材５ａに入射した光のうち開口部２０ｂに集光した光のみが、ラインスリット部材５ａを通過する。開口部２０ｂは、ライン状のスリットからなり、Ｙ方向を長手方向とする矩形形状を呈しているため、ラインスリット部材５ａから射出されたレーザ光は、開口部２０ｂによりＹ方向を長手方向とするライン状のレーザ光に変換され、対物光学系６に入射する。

このように、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡１では、ラインスリット部材５ａは、レーザ光の形状などを調整する照明調整手段として機能する。また、ラインスリット部材５ａが対物レンズ１０の集光位置と光学的に共役な位置に配置されていることから、対物レンズ１０の集光位置に入射するレーザ光のみがラインスリット部材５ａを通過することが可能となる。従って、ラインスリット部材５ａは、レーザ光に対しても共焦点効果を生じさせて、不要なレーザ光の照射による試料１２の損傷を抑制することができる。

なお、ラインスリット部材５ａをこのような照明調整手段として機能させるため、集光光学系４は、少なくとも開口部２０ｂ全体にレーザ光が照射されるように、レーザ光を集光させる。また、光源部２から射出されたレーザ光を効率良く試料１２に照射するためには、集光光学系４は、レーザ光の光束のアスペクト比を開口部２０ｂのアスペクト比に近づけるアスペクト比変換光学系を含むことが望ましい。このようなアスペクト比変換光学系は、例えば、シリンドリカルレンズなどを用いて構成してもよい。

対物光学系６に入射したＹ方向を長手方向とするライン状のレーザ光は、レンズ７で平行光に変換されて、第１の走査手段１１に入射する。第１の走査手段１１は、レーザ光を反射し、レンズ８及びレンズ９からなるリレー光学系を介して対物レンズ１０に入射させる。そして、対物レンズ１０は、入射したレーザ光を対物レンズ１０の焦点位置に配置された試料１２に集光させる。このとき、レーザ光は、試料１２上にＹ方向を長手方向とするライン状に集光する。このため、共焦点走査型顕微鏡１は、第１の走査手段１１によりレーザ光をＸ方向に移動させることで、試料１２を走査することができる。

レーザ光が照射された試料１２では、蛍光物質が励起され蛍光が生じる。蛍光は、対物レンズ１０で集光され、レーザ光と同じ光路を反対方向に進行して、第１の走査手段１１に入射する。

第１の走査手段１１でのデスキャンにより、レーザ光の照射位置によらず、蛍光は第１の走査手段１１で一定の方向に反射される。第１の走査手段１１を反射した蛍光は、レンズ７により対物レンズ１０の試料１２側の焦点位置と共役な位置に配置されたラインスリット部材５ａ上に集光する。これにより、ラインスリット部材５ａから射出された蛍光は、図２（ａ）に例示される開口部２０ｂによりＹ方向を長手方向とするライン状の蛍光に変換され、集光光学系４に入射する。

なお、開口部２０ｂの開口径は、画像の明るさやコントラストなどに影響を与えるため、適切に設定される。例えば、図２（ａ）に例示される開口部２０ｂのＸ方向の開口径（第１の開口径）Ｄ１は、回折による蛍光の広がりを考慮して、回折径程度としてもよい。回折径は、蛍光波長λと、対物光学系６のラインスリット部材５ａ側の開口数ＮＡと、を用いて、一般に、２×０．６１×λ／ＮＡで定義される。これにより、光が照射された試料１２上のライン状の集光位置から生じた蛍光のみが、ラインスリット部材５ａの開口部２０ｂを通過し、集光位置の周辺から生じた蛍光は、ラインスリット部材５ａの絞り部２０ａに遮断される。

ライン状の蛍光は、集光光学系４で平行光に変換されて、光分離手段３へ入射するが、光分離手段３に入射する光は、試料１２から生じた蛍光のみで構成されているわけではない。試料１２を反射したレーザ光や、ラインスリット部材５ａでは遮断できない光分離手段３とラインスリット部材５ａの間の光学系で生じる自家蛍光などが含まれる。

光分離手段３は、レーザ光を反射し蛍光を透過する波長透過率特性を有しているため、試料１２を反射したレーザ光は、光分離手段３を透過することができず、撮像光学系１３へ入射しない。しかし、光分離手段３とラインスリット部材５ａの間の光学系、ここでは、集光光学系４で生じる自家蛍光は、試料１２から生じた蛍光とともに光分離手段３を透過して、撮像光学系１３へ入射する。

上述したように、自家蛍光は、蛍光画像の画質を劣化させる要因となり得るため、検出光路から排除されることが望ましい。このため、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡１では、自家蛍光を遮断するための手段として、ラインスリット部材１５ａをラインスリット部材５ａと光学的に共役な位置に配置している。
撮像光学系１３へ入射した自家蛍光を含む蛍光は、レンズ１４によりラインスリット部材１５ａ上に集光する。

図２（ｂ）は、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡１に含まれるラインスリット部材１５ａの構成を例示した図である。図２（ｂ）に例示されるように、ラインスリット部材１５ａは、ラインスリット部材５ａと同様に、光を遮断する絞り部２１ａと、光を通過させる開口部２１ｂとから構成されている。このため、ラインスリット部材１５ａに入射した蛍光のうち開口部２１ｂに集光した蛍光のみが、ラインスリット部材１５ａを通過することができる。

開口部２１ｂは、開口部２０ｂと光学的に共役な位置に設けられている。また、開口部２１ｂは、開口部２０ｂと同様に、ライン状のスリットからなり、Ｙ方向を長手方向とする矩形形状を呈している。このため、絞り部２０ａを透過した試料１２から生じた蛍光は、開口部２１ｂを通過する。一方、集光光学系４などで生じた自家蛍光は、ラインスリット部材１５ａのさまざまな位置に入射するため、その多くは、絞り部２１ａで遮断され、ラインスリット部材１５ａを通過することはできない。従って、ラインスリット部材１５ａから射出される蛍光は、自家蛍光が十分に排除されたライン状の蛍光となる。

なお、図２（ａ）及び図２（ｂ）に例示されるように、開口部２１ｂのＸ方向の開口径（第２の開口径）Ｄ２は、開口部２０ｂのＸ方向の開口径（第１の開口径）よりも大きくてもよい。これは、ラインスリット部材１５ａは、迷光、特に、自家蛍光などを遮断するための絞りであり、ラインスリット部材５ａのような共焦点効果を生じさせるための絞りではないからである。

試料１２の集光位置周辺から生じる蛍光を遮断するラインスリット部材５ａは、開口部２０ｂの開口径のわずかな違いが画質に大きな影響を及ぼすことになる。一方、ラインスリット部材１５ａは、ラインスリット部材１５ａのさまざまな位置に入射する自家蛍光を遮断することを目的とするため、開口部２１ｂの開口径のわずかな違いが画質に及ぼす影響は小さい。

このため、開口部２１ｂのＸ方向の開口径（第２の開口径）を、開口部２０ｂのＸ方向の開口径（第１の開口径）の１．５倍から３倍に設定してもよい。これにより、例えば、対物レンズの変更などにより最適な開口径が変化した場合であっても設定作業を省略することができるため、開口部２１ｂの開口径の設定に伴う負担を最小限に抑えることができる。また、最適な開口径に合わせて開口部２１ｂの開口径を変更する場合であっても、高精度な設定は不要であるので、作業負担を軽減することができる。

ラインスリット部材１５ａから射出されたライン状の蛍光は、レンズ１６により平行光に変換されて、第２の走査手段１８に入射する。第２の走査手段１８に入射した蛍光は、第２の走査手段１８を反射し、レンズ１７により撮像素子１９上にＹ方向を長手方向とするライン状に集光する。

第２の走査手段１８の動作は、第１の走査手段１１の動作と同期している。より具体的には、第２の走査手段１８は、試料１２上に形成されるライン状の集光位置のＸ座標に合わせて、ライン状の蛍光が集光する撮像素子１９のＣＣＤ列を変化させる。これにより、蛍光は、試料１２上の集光位置に対応した撮像素子１９上のＣＣＤで検出されるため、共焦点走査型顕微鏡１は、撮像素子１９で得られる試料１２の位置毎の蛍光の強度から蛍光画像を生成することができる。

以上、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡１によれば、励起光と蛍光の両方に作用する共焦点絞りとは別に、共焦点絞りと光学的に共役な位置に蛍光にのみ作用する絞り手段（第２の絞り手段）を設けることで、共焦点絞りを照明調整手段として機能させながら、自家蛍光による蛍光画像の画質の劣化を抑制することができる。

また、共焦点走査型顕微鏡１に設けられる絞り手段（第２の絞り手段）は、迷光、特に、自家蛍光を遮断するための手段であるので、共焦点絞りに比べて高精度の設定を必要とせず、設定作業が比較的容易である。このため、共焦点走査型顕微鏡１では、利用者に過度の負担を掛けることなく、自家蛍光による蛍光画像の画質の劣化を抑制することができる。

なお、以上では、共焦点絞りとは別の絞り手段（第２の絞り手段）を設けて、自家蛍光を遮断する構成について説明したが、これに加えて、自家蛍光の発生自体を抑制してもよい。例えば、光分離手段３とラインスリット部材５ａの間に配置された光学部材、ここでは、集光光学系４を、自家蛍光の発生が少ない低自家蛍光部材、主に低自家蛍光硝材で構成してもよい。なお、低自家蛍光硝材とは、例えば、Ｓ−ＦＰＬ５１及びＳ−ＦＰＬ５３（いずれも株式会社オハラの商品名）、石英、蛍石などがあるが、特にこれに限られない。

なお、自家蛍光の発生自体を抑制する観点からすると、共焦点走査型顕微鏡１は、光分離手段３とラインスリット部材５ａの間に光学系を含まない構成が望ましい。しかしながら、このような構成とした場合、光源部２から射出され光分離手段３に入射する励起光、及び、ラインスリット部材５ａを通過して光分離手段３に入射する蛍光は、いずれも平行光とならない。このため、平行でない光束中に配置された平行平板である光分離手段３により、収差が発生してしまい、好ましくない。

また、図１では、ライン状の開口を有するラインスリット部材５ａ及びラインスリット部材１５ａと、一方向に走査するための第１の走査手段１１及び第２の走査手段１８と、を用いた構成を例示したが、特にこれに限られない。例えば、ラインスリット部材５ａ及びラインスリット部材１５ａの代わりに、スポット状の開口を有する絞り手段を用いても良い。この場合、第１の走査手段１１及び第２の走査手段１８を２次元に試料１２や撮像素子１９を走査する２次元走査手段として構成すればよい。これにより、さらに良好な共焦点効果が得られるため、より高い画質の蛍光画像を得ることができる。

また、図１では、撮像光学系１３にも走査手段（第２の走査手段１８）を設けた構成を例示したが、特にこれに限られない。例えば、第２の走査手段１８を省略し、撮像素子１９として、Ｘ方向及びＹ方向にＣＣＤなどの受光素子が並べられた２次元センサの代わりに、Ｙ方向にＣＣＤなどの受光素子が並べられたラインセンサを用いる。その上で、撮像素子１９の各受光素子から得られる電気信号と、第１の走査手段１１の動作情報から得られる集光位置情報と、を用いて蛍光画像を生成してもよい。これにより、撮像光学系１３の構成を簡略化することができるため、共焦点走査型顕微鏡１全体をコンパクトに構成することができる。

さらに、ラインスリット部材５ａ及びラインスリット部材１５ａの代わりに、スポット状の開口を有する絞り手段を用いる場合には、第２の走査手段１８を省略し、撮像素子１９として位置情報を取得しないポイントセンサを用いても良い。その上で、撮像素子１９から得られる電気信号と、第１の走査手段１１の２次元動作情報から得られる集光位置情報と、を用いて蛍光画像を生成してもよい。これにより、コンパクトな構成でより高い画質の蛍光画像を得ることができる。

図３は、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡の構成を例示した図である。

図３に例示される共焦点走査型顕微鏡２２は、第１の絞り手段（共焦点絞り）として、ラインスリット部材５ａの代わりに、ライン状ミラー５ｂを含む点が実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と異なっている。その他の構成は、実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と同様であるので、同一の符号を付与し、説明を省略する。なお、以降では、光軸方向を常にＺ方向として定義する。また、ライン状ミラー５ｂ及びラインスリット部材１５ａの開口部の長手方向をＹ方向として、第１の走査手段１１及び第２の走査手段１８の走査方向をＸ方向として、定義する。

ライン状ミラー５ｂは、図２（ａ）に例示されるラインスリット部材５ａの開口部２０ｂと同様の形状を有している。つまり、ライン状ミラー５ｂは、Ｙ方向を長手方向とする矩形形状を呈している。

このため、ライン状ミラー５ｂ上に集光したレーザ光のみが、ライン状ミラー５ｂで反射されるため、ライン状ミラー５ｂから射出されたレーザ光は、Ｙ方向を長手方向とするライン状のレーザ光に変換され、対物光学系６に入射する。

また、試料１２から生じた蛍光も、対物レンズ１０の試料１２側の焦点位置と共役な位置に配置されたライン状ミラー５ｂに集光した蛍光のみが、ライン状ミラー５ｂで反射されるため、ライン状ミラー５ｂから射出された蛍光は、Ｙ方向を長手方向とするライン状の蛍光に変換され、集光光学系４に入射する。

このように、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２２では、ライン状ミラー５ｂ自体が開口部として作用している。なお、本明細書では、開口部は、光を後続の光学系に導く作用を有する部分を示す用語として使用されており、物理的な開口の有無は問わない。従って、本明細書では、光に直接的に作用せずに後続の光学系に光を導くスリットに加え、ライン状ミラー５ｂのように光を反射することで後続の光学系に光を導く反射部材も、開口部と表現される。

ライン状ミラー５ｂからなる開口部のＸ方向の開口径（第１の開口径）Ｄ１、つまり、ミラーのＸ方向の幅は、画像の明るさやコントラストなどに影響を及ぼすため、適切に設定されることが望ましい。例えば、開口径Ｄ１は、回折による蛍光の広がりを考慮して、回折径程度としてもよい。

以上、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２２によっても、実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と同様に、励起光と蛍光の両方に作用する共焦点絞りとは別に、共焦点絞りと光学的に共役な位置に蛍光にのみ作用する絞り手段（第２の絞り手段）を設けることで、共焦点絞りを照明調整手段として機能させながら、自家蛍光による蛍光画像の画質の劣化を抑制することができる。

また、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２２によれば、共焦点絞り（第１の絞り手段）を偏向手段として利用することができるので、共焦点走査型顕微鏡２２全体をコンパクトに構成することができる。

なお、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２２でも、実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と同様に、開口部の形状をスポット状にする変形や、走査手段を省略する変形など、さまざまな変形が可能である。また、光分離手段３とライン状ミラー５ｂの間に配置された光学部材、ここでは、集光光学系４を、自家蛍光の発生が少ない低自家蛍光部材、主に低自家蛍光硝材で構成し、自家蛍光の発生量自体を抑制してもよい。

図４は、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡の構成を例示した図である。

図４に例示される共焦点走査型顕微鏡２３は、第１の絞り手段（共焦点絞り）として、ラインスリット部材５ａの代わりに、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃを含む点が実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と異なっている。その他の構成は、実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と同様であるので、同一の符号を付与し、説明を省略する。なお、以降では、光軸方向を常にＺ方向として定義する。また、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃ及びラインスリット部材１５ａの開口部の長手方向をＹ方向として、第１の走査手段１１及び第２の走査手段１８の走査方向をＸ方向として、定義する。

図５は、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２３に含まれるデジタルマイクロミラーデバイスの構成を例示した図である。図５に例示されるデジタルマイクロミラーデバイス５ｃは、空間光変調器の一種であり、基板２４上に並べられた独立に制御される複数の光変調素子２６と、光変調素子２６を保護するためのカバーガラス２７と、を有している。光変調素子２６は、入射光Ｌ１を反射するマイクロミラー２５を備え、例えば、入射光Ｌ１を後続の光学系の方向に導くＯＮ状態と、後続の光学系から逸れた方向に導くＯＦＦ状態のいずれかに制御される。

図５では、複数の光変調素子２６のうち、光変調素子２６ｃのみがＯＮ状態に制御され、他の光変調素子２６（光変調素子２６ａ、光変調素子２６ｂ、光変調素子２６ｄ、光変調素子２６ｅ）はＯＦＦ状態に制御されている例が示されている。この場合、光変調素子２６ｃに入射した入射光Ｌ１のみが、射出光Ｌ２として後続の光学系の方向に反射される。

デジタルマイクロミラーデバイス５ｃでは、ＯＮ状態に制御された光変調素子２６に入射した入射光Ｌ１のみが、後続の光学系へ射出光Ｌ２として射出されるため、光変調素子２６を制御することで、射出光Ｌ２の形状を任意に制御することができる。

このため、Ｙ方向に一列に並んでいる光変調素子２６をＯＮ状態に制御し、他の光変調素子２６をＯＦＦ状態に制御することで、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃは、実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１のラインスリット部材５ａと同様に作用する。つまり、Ｙ方向に一列に並んでいるＯＮ状態の光変調素子２６が、Ｙ方向を長手方向とする矩形形状を呈した開口部として機能するため、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃは、入射光Ｌ１を、Ｙ方向を長手方向とするライン状の射出光Ｌ２に変換して射出することができる。

開口部のＸ方向の開口径（第１の開口径）Ｄ１、つまり、ＯＮ状態の光変調素子２６のＸ方向の幅は、画像の明るさやコントラストなどに影響を及ぼすため、適切に設定されることが望ましい。例えば、開口径Ｄ１は、回折による蛍光の広がりを考慮して、回折径程度としてもよい。

以上、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２３によっても、実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と同様に、励起光と蛍光の両方に作用する共焦点絞りとは別に、共焦点絞りと光学的に共役な位置に蛍光にのみ作用する絞り手段（第２の絞り手段）を設けることで、共焦点絞りを照明調整手段として機能させながら、自家蛍光による蛍光画像の画質の劣化を抑制することができる。

また、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２３によれば、共焦点絞りがデジタルマイクロミラーデバイス５ｃで構成されているため、共焦点絞りの開口径Ｄ１を容易に調整することができる。具体的には、ＯＮ状態に制御されるＹ方向に並べられた光変調素子２６の列の数を変更することで、開口径Ｄ１を変更することができる。

また、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２３によれば、共焦点絞り（第１の絞り手段）、及び、蛍光にのみ作用する絞り手段（第２の絞り手段）を、偏向手段として利用することができるので、共焦点走査型顕微鏡２３全体をコンパクトに構成することができる。

なお、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２３でも、実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と同様に、開口部の形状をスポット状にする変形や、走査手段を省略する変形など、さまざまな変形が可能である。また、光分離手段３とマイクロミラーデバイス５ｃの間に配置された光学部材、ここでは、集光光学系４及びマイクロミラーデバイス５ｃのカバーガラス２７を、自家蛍光の発生が少ない低自家蛍光部材、主に低自家蛍光硝材で構成し、自家蛍光の発生量自体を抑制してもよい。
また、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃの代わりに、透過型や反射型の液晶などの他の空間光変調器を用いてもよい。

図６は、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡の構成を例示した図である。

図６に例示される共焦点走査型顕微鏡２８は、第１の絞り手段（共焦点絞り）として、ラインスリット部材５ａの代わりに、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃを含み、第２の絞り手段として、ラインスリット部材１５ａの代わりに、ライン状ミラー１５ｂを含む点が実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と異なっている。その他の構成は、実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と同様であるので、同一の符号を付与し、説明を省略する。また、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃは、実施例３に係る共焦点走査型顕微鏡２３に含まれるデジタルマイクロミラーデバイス５ｃと同様であるので、説明を省略する。なお、以降では、光軸方向を常にＺ方向として定義する。また、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃ及びライン状ミラー１５ｂの開口部の長手方向をＹ方向として、第１の走査手段１１及び第２の走査手段１８の走査方向をＸ方向として、定義する。

ライン状ミラー１５ｂは、図２（ｂ）に例示されるラインスリット部材１５ａの開口部２１ｂと同様の形状を有している。つまり、ライン状ミラー１５ｂは、Ｙ方向を長手方向とする矩形形状を呈している。

ライン状ミラー１５ｂ上に集光した蛍光のみが、ライン状ミラー１５ｂで反射されるため、ライン状ミラー１５ｂから射出された蛍光は、Ｙ方向を長手方向とするライン状の蛍光に変換され、レンズ１６に入射する。このように、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２８では、ライン状ミラー１５ｂ自体が開口部として作用している。

ライン状ミラー１５ｂからなる開口部のＸ方向の開口径（第２の開口径）Ｄ２、つまり、ミラーのＸ方向の幅は、マイクロミラーデバイス５ｃの開口部のＸ方向の開口径（第１の開口径）よりも大きくてもよい。これは、ライン状ミラー１５ｂは、迷光、特に、自家蛍光などを遮断するための絞りであり、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃのような共焦点効果を生じさせるための絞りではないからである。ライン状ミラー１５ｂのＸ方向の開口径（第２の開口径）を、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃのＸ方向の開口径（第１の開口径）の１．５倍から３倍に設定してもよい。これにより、例えば、対物レンズの変更などにより最適な開口径が変化した場合であってもライン状ミラー１５ｂの開口径の設定作業を省略することができるため、ライン状ミラー１５ｂの開口径の設定に伴う負担を最小限に抑えることができる。また、最適な開口径に合わせてライン状ミラー１５ｂの開口径を変更する場合であっても、高精度な設定は不要であるので、作業負担を軽減することができる。

以上、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２８によっても、実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と同様に、励起光と蛍光の両方に作用する共焦点絞りとは別に、共焦点絞りと光学的に共役な位置に蛍光にのみ作用する絞り手段（第２の絞り手段）を設けることで、共焦点絞りを照明調整手段として機能させながら、自家蛍光による蛍光画像の画質の劣化を抑制することができる。

また、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２８によれば、共焦点絞りがデジタルマイクロミラーデバイス５ｃで構成されているため、共焦点絞り（第１の絞り手段）の開口径を容易に調整することができる。具体的には、ＯＮ状態に制御されるＹ方向に並べられた光変調素子２６の列の数を変更することで、開口径を変更することができる。

また、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２８によれば、共焦点絞り（第１の絞り手段）、及び、蛍光にのみ作用する絞り手段（第２の絞り手段）を、偏向手段として利用することができるので、共焦点走査型顕微鏡２８全体をコンパクトに構成することができる。

なお、本実施例に係る共焦点走査型顕微鏡２８でも、実施例１に係る共焦点走査型顕微鏡１と同様に、開口部の形状をスポット状にする変形や、走査手段を省略する変形など、さまざまな変形が可能である。また、光分離手段３とマイクロミラーデバイス５ｃの間に配置された光学部材、ここでは、集光光学系４及びマイクロミラーデバイス５ｃのカバーガラス２７を、自家蛍光の発生が少ない低自家蛍光部材、主に低自家蛍光硝材で構成し、自家蛍光の発生量自体を抑制してもよい。
また、デジタルマイクロミラーデバイス５ｃの代わりに、透過型や反射型の液晶を用いて構成してもよい。

１、２２、２３、２８・・・共焦点走査型顕微鏡、２・・・光源部、３・・・光分離手段、４・・・集光光学系、５ａ、１５ａ・・・ラインスリット部材、５ｂ、１５ｂ・・・ライン状ミラー、５ｃ・・・デジタルマイクロミラーデバイス、６・・・対物光学系、７、８、９、１４、１６、１７・・・レンズ、１０・・・対物レンズ、１１・・・第１の走査手段、１２・・・試料、１３・・・撮像光学系、１８・・・第２の走査手段、１９・・・撮像素子、２０ａ、２１ａ・・・絞り部、２０ｂ、２１ｂ・・・開口部、２４・・・基板、２５・・・マイクロミラー、２６、２６ａ、２６ｂ、２６ｃ、２６ｄ、２６ｅ・・・光変調素子、２７・・・カバーガラス

Claims (13)

1. 励起光を射出する光源部と、
   前記励起光を試料に集光させる対物光学系と、
   前記光源部と前記対物光学系の間であり、且つ、前記対物光学系の前記試料側の焦点位置と光学的に共役な位置に、配置された第１の絞り手段と、
   前記試料と前記第１の絞り手段の間であり、且つ、前記対物光学系の瞳位置近傍に配置され、前記試料を走査する第１の走査手段と、
   前記光源部と前記第１の絞り手段の間に配置され、前記励起光を前記第１の絞り手段に集光させる第１の集光光学系と、
   前記光源部と前記第１の集光光学系の間に配置され、前記試料から発せられた蛍光を前記励起光から分離する光分離手段と、
   前記蛍光を検出し、前記試料を撮像する撮像手段と、
   前記光分離手段で分離された前記蛍光を前記撮像手段に導く撮像光学系と、を含み、
   前記撮像光学系は、前記第１の絞り手段と光学的に共役な位置に配置された第２の絞り手段を含むことを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
2. 請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
   前記対物光学系は、
   前記励起光を前記試料に集光させる対物レンズと、
   前記対物レンズの瞳を前記第１の走査手段近傍にリレーする第１のリレー光学系と、を含むことを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
3. 請求項１または請求項２に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
   前記撮像光学系は、
   前記光分離手段で分離された前記蛍光を、前記第２の絞り手段に集光させる第２の集光光学系と、
   前記第２の絞り手段を通過した前記蛍光を前記撮像手段に集光させる第３の集光光学系と、を含むことを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
4. 請求項３に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
   前記撮像手段は、ラインセンサであることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
5. 請求項３に記載の共焦点走査型顕微鏡において、さらに、
   前記第２の絞り手段と前記撮像素子の間であり、且つ、前記対物光学系の瞳と光学的に共役な位置近傍に配置され、前記第１の走査手段の動作と同期して動作する第２の走査手段を含み、
   前記第３の集光光学系は、
   前記第２の絞り手段と前記第２の走査手段の間に配置され、前記対物光学系の瞳を前記第２の走査手段近傍にリレーする、第２のリレー光学系と、
   前記第２の走査手段と前記撮像手段の間に配置され、前記蛍光を前記撮像手段に集光させる、結像レンズと、を含むことを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
6. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
   前記第１の絞り手段は、ライン状のスリットからなる開口部を有することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
7. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
   前記第１の絞り手段は、ライン状のミラーからなる開口部を有することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
8. 請求項６または請求項７に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
   前記第１の走査手段は、前記試料を一方向に走査する走査手段であり、
   前記開口部の長手方向は、前記一方向と直交する方向であることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
9. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
   前記第１の絞り手段は、デジタルマイクロミラーデバイスであることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
10. 請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
    前記第１の絞り手段は、第１の開口径を有する開口部を含み、
    λを前記蛍光の波長とし、ＮＡを前記対物光学系の前記第１の絞り手段側の開口数とするとき、
    前記第１の開口径は、２×０．６１×λ／ＮＡで定義される回折径程度であることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
11. 請求項１０に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
    前記第２の絞り手段は、第２の開口径を有する開口部を含み、
    前記第２の開口径は、前記第１の開口径よりも大きいことを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
12. 請求項１１に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
    前記第２の開口径は、前記第１の開口径の１．５倍から３倍であることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。
13. 請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の共焦点走査型顕微鏡において、
    前記光分離手段と前記第１の絞り手段の間に配置された光学部材は、自家蛍光の発生が少ない低自家蛍光硝材で構成されることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡。