JP2011000040A - せん断力影響評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】従来よりも簡単にせん断力が細胞へ与える影響を評価することができるせん断力影響評価方法を提供することを目的とする。
【解決手段】せん断力影響評価方法が、細胞が配置されたマイクロ流路に所定の流速の液体を流入させることによって、細胞へのせん断力を発生させるせん断力発生工程と、せん断力発生工程においてマイクロ流路に液体が流入された後の細胞が、液体の流入によるせん断力に応じて破砕されたか否か評価する細胞破砕評価工程と、を具備する。
【選択図】図２

Description

本発明は、せん断力が細胞へ与える影響を評価するせん断力影響評価方法に関する。

混合槽での混合操作は、化学工業等において重要な操作の一つである。すなわち、食品、化粧品、医薬、製薬、塗料等の現場では、反応・抽出・吸収・混合などの種々の処理において、混合操作が活用されている。例えば、混合操作の１つとして、バイオリアクタ等の動物細胞培養槽では、槽内に供給した酸素供給源の気泡及び栄養源等を均一に混合する為に、槽内を撹拌することが行われている。

このような動物細胞培養槽では、特に培養槽が大きくなり、鉛直方向の高さが高くなると、槽内をより均一に混合するために、撹拌によって培養槽内に大きな軸流を生じさせることで高い混合度を得る必要がある。また、一般に密度差のある材料を均一に混合したい場合に、これら材料は、その密度差によって上下に分離し易いため、やはり撹拌によって混合槽内に大きな軸流を生じさせる必要がある。特に、固液混合の場合では、密度差が大きくなって固形分が沈降し易いため、撹拌により軸流を生じさせ、この軸流によって槽内を鉛直方向に撹拌することが一層必要になる。

そして、混合槽では、高い混合度を得る為に、撹拌装置として高性能のものを用いる必要がある。しかしながら、動物細胞培養槽では、撹拌装置の攪拌翼によって生じるせん断力によって動物細胞が破壊／死滅してしまう為に、攪拌効率とせん断力とのバランスを量る必要がある。そして、攪拌装置では、攪拌翼の回転数の上限を決定する為に、任意の回転数で攪拌翼を回転した場合の細胞の増殖率を測定したり、また顕微鏡観察により全体の細胞に対する破砕された細胞や径の小さな細胞の割合を測定することで、攪拌翼の回転数毎の細胞へのせん断力の影響が判断されている。

このように、流体によって生じるせん断力を測定するものとして、下記特許文献１には、液体中に、表面に伝熱面を形成した平板を鉛直に吊し、伝熱面を一様熱流束加熱することで生じる流体の平板周りの自然対流によって平板に作用するせん断力を電子天秤で計測し、該計測値、平板の寸法、発熱量、および流体の熱物性値から演算により液体の粘度を測定する粘度測定装置が開示されている。

特開２００３−１４９１１４号公報

ところで、上記従来技術では、攪拌翼の回転数の上限を決定する為に、任意の回転数で攪拌翼を回転した場合の細胞の増殖率を測定したり、また顕微鏡観察により全体の細胞に対する破砕された細胞や径の小さな細胞の割合を測定することで、攪拌翼の回転数毎のせん断力が判断されている。しかしながら、この方法では、攪拌装置の回転数を変えながら、回転数毎に、細胞の増殖率を測定したり、また破砕された細胞や径の小さな細胞の割合を測定しなければならない為に、攪拌翼の回転数毎の細胞へのせん断力の影響が判断されるまでに非常に大きな労力を要すると共にせん断力の判断結果が得られるまでに長い時間がかかってしまう。
また、上記特許文献１では、物理的な方法によってせん断力を測定しているが、せん断力が細胞に与える影響を測定することは、困難である。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、従来よりも簡単にせん断力が細胞へ与える影響を評価することができるせん断力影響評価方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明では、せん断力影響評価方法に係る第１の解決手段として、細胞が配置されたマイクロ流路に所定の流速の液体を流入させることによって、前記細胞へのせん断力を発生させるせん断力発生工程と、前記せん断力発生工程において前記マイクロ流路に前記液体が流入された後の前記細胞が、前記液体の流入によるせん断力に応じて破砕されたか否か評価する細胞破砕評価工程と、を具備するという手段を採用する。

本発明では、せん断力影響評価方法に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記せん断力発生工程では、細胞が付着した細胞培養担体を前記マイクロ流路に配置するという手段を採用する。

本発明では、せん断力影響評価方法に係る第３の解決手段として、第２の解決手段において、前記せん断力発生工程では、流入された前記液体の流れに対して並列になるように複数の前記細胞培養担体が前記マイクロ流路に配置されているという手段を採用する。

本発明では、せん断力影響評価方法に係る第４の解決手段として、第１の解決手段において、せん断力発生工程では、流入された前記液体の流れに対して並列になるように複数の細胞単体が前記マイクロ流路に配置されているという手段を採用する。

本発明では、せん断力影響評価方法に係る第５の解決手段として、上記第１〜第４いずれかの解決手段において、前記せん断力発生工程では、前記液体に膜電位変化検出色素を溶解し、細胞破砕評価工程では、前記膜電位変化検出色素によって細胞膜の電位の変化を検出することで、細胞の破砕を評価するという手段を採用する。

本発明では、せん断力影響評価方法に係る第６の解決手段として、上記第１〜第５いずれかの解決手段において、前記せん断力発生工程では、シリンジポンプによって前記液体を前記マイクロ流路に流入させるという手段を採用する。

本発明によれば、せん断力影響評価方法が、細胞が配置されたマイクロ流路に所定の流速の液体を流入させることによって、細胞へのせん断力を発生させるせん断力発生工程と、せん断力発生工程においてマイクロ流路に液体が流入された後の細胞が、液体の流入によるせん断力に応じて破砕されたか否か評価する細胞破砕評価工程と、を具備する。

このように、せん断力影響評価方法では、動物細胞培養槽の攪拌装置の回転数を変えながら、回転数毎に、細胞の増殖率を測定したり、また破砕された細胞や径の小さな細胞の割合を測定する必要がない為、従来よりも簡単にせん断力が細胞へ与える影響を評価することができる。

本発明の一実施形態に係るせん断力影響評価方法のせん断力発生工程のマイクロキャリア１及びマイクロ流路２の配置を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係るせん断力影響評価方法のせん断力発生工程のマイクロキャリア１、マイクロ流路２及びシリンジポンプ３の位置を示す平面図である。

以下、図面を参照して、本発明の一実施形態について説明する。本実施形態は、せん断力が細胞へ与える影響を評価するせん断力影響評価方法に関する。

本実施形態に係るせん断力影響評価方法における工程について、説明する。
本実施形態に係るせん断力影響評価方法は、動物細胞培養槽の攪拌翼の回転等によって生じるせん断力が細胞へ与える影響を評価する方法であり、せん断力発生工程と、細胞破砕評価工程とを備える。

せん断力影響評価方法における、各工程について、手順に沿って説明する。
まず、せん断力影響評価方法では、せん断力発生工程において、複数（約１０個程度）の細胞Ｃを付着させたマイクロキャリア（細胞培養担体）１を上面側の空いたマイクロ流路２に配置し、図１に示すように、その上を透明平板２ａによって覆うことでマイクロ流路２の上面側を閉塞する。図１は、本実施形態に係るせん断力影響評価方法のせん断力発生工程のマイクロキャリア１及びマイクロ流路２の配置を示す斜視図である。

マイクロキャリア１は、細胞を培養する為の担体として細胞培養において用いられるものであり、５０μｍ〜２００μｍ程度のマイクロメートルレベルの微細なビーズ形状をしている。せん断力発生工程では、付着させる細胞の数に応じて各大きさのマイクロキャリア１を適宜使い分ける。なお、１つの細胞あたりの大きさは、１０μｍ〜２０μｍ程度である。

そして、マイクロキャリア１は、ガラスビーズ、プラスチックビーズ又はこれらに陰イオン交換基を結合させたものが基材ビーズとして用いられている。さらに、マイクロキャリア１として、上記基材ビーズの表面をセルロース、コラーゲン、ヒドロキシアパタイトで被覆したものも存在する。

マイクロ流路２は、動物細胞培養に用いる培養液Ｌに不活性部材製の基板によって構成されている。この不活性材料とは、培養液Ｌの溶媒、溶質及び化学反応によって生成する化合物に反応性を持たない材料であり、例えば、ガラス、石英、シリカ、マグネシア、ジルコニア、アルミナ、アパタイト、窒化ケイ素、ケイ素、チタン、アルミニウム、イットリウム及びタングステンのような金属の酸化物、炭化物、窒化物、ホウ化物及びケイ化物等のセラミック部材である。また、このほか、不活性材料である限り、金属、プラスチック等をマイクロ流路２の基板として用いることができる。

そして、マイクロ流路２では、その両側壁は不透明部材を用いてもよいが、下面は、上面と同様に透明平板２ａを用いる。これは、後述する細胞破砕評価工程において、蛍光顕微鏡によってマイクロキャリア１に付着した細胞を観察する為である。マイクロ流路２では、上面及び下面の透明平板２ａによって圧迫することでマイクロキャリア１を固定している。

そして、マイクロキャリア１の両脇に培養液Ｌを流す為、培養液Ｌを流す空間を形成することが可能な幅を有するマイクロ流路２を用いる。また、マイクロ流路２の上面及び下面の透明平板２ａの圧迫によってマイクロキャリア１をマイクロ流路２に固定する為、マイクロキャリア１の高さに応じた適切な高さ有するマイクロ流路２を用いる。

そして、せん断力発生工程では、マイクロ流路２の上面を透明平板２ａによって覆った後に、図２に示すように、シリンジポンプ３の送液口をマイクロ流路２の流入口に差込むと共にマイクロ流路２の排出口に廃液貯めを配設し、所望の流速でシリンジポンプ３によって、ローダミン１２３（膜電位変化検出色素）を溶解させた培養液Ｌをマイクロ流路２に流入させる。すると、せん断力発生工程では、流入された培養液Ｌがマイクロキャリア１の両脇を流れ、培養液Ｌの流速に応じたせん断力が発生する。

図２は、本実施形態に係るせん断力影響評価方法のせん断力発生工程のマイクロキャリア１、マイクロ流路２及びシリンジポンプ３の位置を示す平面図である。なお、図２における矢印が、シリンジポンプ３による培養液Ｌのマイクロ流路２への流入方向Ｆを示している。

シリンジポンプ３とは、脈流が無くかつ高精度に極微量を送液する為のものである。シリンジポンプ３では、予め設定された単位時間辺りの送液量に基づいて、ＣＰＵ（Central Processing Unit）が注射器（シリンジ）のプランジャを一定速度でモータに押圧させることで、高精度に極微量を送液する。

ローダミン１２３は、細胞透過性を有する陽イオン蛍光色素であり、負の膜電位である細胞Ｃの細胞膜に取り込まれる、すなわち破砕またはストレスによって膜電位が変化していない正常な箇所の細胞膜に取り込まれる。そして、ローダミン１２３は、細胞毒性を引き起こすことなく、さらに比較的速やかに細胞Ｃの細胞膜に取り込まれる。

そして、上記せん断力発生工程が終了すると、次に、せん断力影響評価方法の細胞破砕評価工程（図示せず）において、せん断力発生工程においてマイクロ流路２に培養液Ｌが流入された後のマイクロ流路２を蛍光顕微鏡に取り付け、波長４９５ｎｍの青色の励起光をマイクロ流路２上のマイクロキャリア１に付着する細胞Ｃへ蛍光顕微鏡に照射させることによって、ローダミン１２３によって染色された細胞Ｃを波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発光させる。

上記せん断力発生工程によって作製した標本を蛍光顕微鏡によって観察すると、マイクロ流路２に流入された培養液Ｌによって生じるせん断力によって、細胞Ｃの細胞膜の所定の個所に破損やストレスによる膜電位の変化が生じる場合には、細胞膜の当該所定の個所がローダミン１２３によって染色されていないことを確認することができる。

細胞破砕評価工程では、細胞Ｃの細胞膜のローダミン１２３の染色の有無によって、せん断力に応じて細胞Ｃの細胞膜が破砕されたか否か評価する。なお、せん断力は、せん断力発生工程におけるマイクロ流路２に流入された培養液Ｌの流速、培養液Ｌの流量、マイクロ流路２の形状、マイクロ流路２の大きさ、マイクロキャリア１の形状、マイクロキャリア１の大きさ、細胞Ｃの形状及び細胞Ｃの大きさ等に基づいて、算出される。
そして、せん断力発生工程において様々なせん断力を発生させることで、細胞破砕評価工程において、細胞Ｃが、様々なせん断力に応じて破砕されたか否か評価する。

以上のように、本実施形態に係るせん断力影響評価方法では、せん断力発生工程において、細胞Ｃを付着させたマイクロキャリア１をマイクロ流路２に配置し、当該マイクロ流路２へシリンジポンプ３にローダミン１２３を溶解した培養液Ｌを流入させることによってせん断力を発生させ、細胞破砕評価工程において、細胞Ｃの細胞膜のローダミン１２３の染色の有無によって、せん断力に応じて細胞Ｃの細胞膜が破砕されたか否か評価することで、せん断力による細胞Ｃへの影響を評価する。

このように、せん断力影響評価方法では、動物細胞培養槽の攪拌装置の回転数を変えながら、回転数毎に、細胞の増殖率を測定したり、また破砕された細胞や径の小さな細胞の割合を測定する必要がない為、従来よりも簡単にせん断力が細胞へ与える影響を評価することができる。

以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態では、せん断力発生工程において、複数の細胞Ｃを付着したマイクロキャリア１をマイクロ流路２に配置したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、マイクロキャリア１の幅を広くして、マイクロ流路２に流入された培養液Ｌの流れに対して並列になるように複数のマイクロキャリア１を配置するようにしてもよい。これにより、より多くの細胞Ｃへのせん断力の影響を評価することができる。また、マイクロ流路２に流入された培養液Ｌの流れに対して縦列になるように複数のマイクロキャリア１を配置するようにしてもよい。

また、１つの細胞Ｃを配置できる大きさのマイクロ流路２に１つの細胞Ｃを配置し、透明平板２ａの圧迫によって細胞Ｃをマイクロ流路２に固定し、当該マイクロ流路２に培養液Ｌを流入させることによって、せん断力を発生させるようにしてもよい。また、マイクロ流路２に流入された培養液Ｌの流れに対して並列になるように複数の細胞Ｃを配置するようにしてもよい。また、マイクロ流路２に流入された培養液Ｌの流れに対して縦列になるように複数の細胞Ｃを配置するようにしてもよい。

（２）上記実施形態では、せん断力発生工程において、直線のマイクロ流路２に培養液Ｌを流すことによって層流を発生させ、当該層流によってせん断力を発生させたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、マイクロ流路２に乱流を発生させる乱流発生板を設けることで、マイクロ流路２に乱流を発生させ、当該層流によってせん断力を発生させるようにしてもよい。また、マイクロ流路２は、直線だけでなく、曲線によって構成されていてもよい。

（３）上記実施形態では、せん断力発生工程において、培養液Ｌをマイクロ流路２に流入したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、培養液Ｌの代わりに、水をマイクロ流路２に流すようにしてもよい。すなわち、細胞Ｃの形質に影響を与えない液体であればよい。しかしながら、動物細胞培養槽の攪拌装置の攪拌翼の回転によって生じるせん断力を評価するという観点からは、動物細胞培養槽に貯留されている培養液Ｌを用いることが好ましい。

（４）上記実施形態では、せん断力発生工程において、膜電位変化検出色素としてローダミン１２３を用いたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ローダミン１２３の代わりに、膜の完全性を評価する色素としてトリパンブルーを培養液Ｌに溶解するようにしてもよい。

１…マイクロキャリア、２…マイクロ流路、２ａ…透明平板、３…シリンジポンプ

Claims (6)

1. 細胞が配置されたマイクロ流路に所定の流速の液体を流入させることによって、前記細胞へのせん断力を発生させるせん断力発生工程と、
   前記せん断力発生工程において前記マイクロ流路に前記液体が流入された後の前記細胞が、前記液体の流入によるせん断力に応じて破砕されたか否か評価する細胞破砕評価工程と、
   を具備することを特徴とするせん断力影響評価方法。
2. 前記せん断力発生工程では、細胞が付着した細胞培養担体を前記マイクロ流路に配置することを特徴とする請求項１に記載のせん断力影響評価方法。
3. 前記せん断力発生工程では、流入された前記液体の流れに対して並列になるように複数の前記細胞培養担体が前記マイクロ流路に配置されていることを特徴とする請求項２に記載のせん断力影響評価方法。
4. せん断力発生工程では、流入された前記液体の流れに対して並列になるように複数の細胞単体が前記マイクロ流路に配置されていることを特徴とする請求項１に記載のせん断力影響評価方法。
5. 前記せん断力発生工程では、前記液体に膜電位変化検出色素を溶解し、
   細胞破砕評価工程では、前記膜電位変化検出色素によって細胞膜の電位の変化を検出することで、細胞の破砕を評価することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のせん断力影響評価方法。
6. 前記せん断力発生工程では、シリンジポンプによって前記液体を前記マイクロ流路に流入させることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のせん断力影響評価方法。
   

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