JP2011084571A - 虚血性心疾患危険群診断薬 - Google Patents

Abstract

【課題】虚血性心疾患の診断、治療、予測法、及び心筋梗塞後の心筋のリモデリングを抑制する方法の提供。
【解決手段】抗脳由来神経栄養因子抗体を有効成分とする虚血性心疾患危険群の診断薬、血液中の脳由来神経栄養因子の濃度を測定することによる虚血性心疾患危険群の検定方法、および脳由来神経栄養因子を含有する虚血性心疾患、特に心筋梗塞後の心筋リモデリングの抑制予防薬に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、虚血性心疾患危険群診断薬、診断法、予後予測法、および治療薬に関する。

冠動脈硬化を原因とする虚血性心疾患は、日本における全疾患死亡率の約７〜８％を占め、現在なお全国で１００万人以上が罹患している疾患である。食事の西欧化に伴い患者数は年々増加傾向にあり、医療経済の面からも、日本において虚血性心疾患の予防、管理が重要であることは明らかである。冠動脈硬化の危険因子としては糖尿病、喫煙、高血圧、高脂血症、家族歴、加齢、肥満などが知られている他、最近はインスリン抵抗性、肥満、高血圧、耐糖能異常などを主訴とする代謝性症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などが知られている。これらを原因として、心臓を栄養する冠動脈は内腔に粥状硬化を起こし、血流障害を起こすようになる。初期には自覚症状が無く、次第に狭心症発作を起こすようになるが、虚血性心疾患患者の３〜４割はかなり病状が進展してからも症状のない無症候性虚血性心疾患であることが知られている。様々なストレスにより、この冠動脈内粥腫が破綻すると冠動脈内腔に血栓を形成、閉塞を起こし急性心筋梗塞となる。再灌流療法などの治療法の進歩により急性心筋梗塞における死亡率は減少したが、現在でも急性期の死亡率は３０％近くに達し、その主な原因は心筋壊死に伴う不整脈、ポンプ失調、心破裂などである。また、急性期を過ぎた後も壊死心筋を原因として心筋の再構築（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ：リモデリング）が起こり、心機能の低下が起こる。慢性期にはこれらを原因とした心不全、不整脈などが死因となるため、厳密な薬物治療、生活指導が重要となる。その予後予測を行うことは、その薬物治療、生活指導の方針を決定する上で非常に重要である。また、心筋梗塞の約３０％に再発を認めるため、前述のような危険因子の管理が重要となる。

このような病態から、虚血性心疾患危険因子群のスクリーニング、同危険因子の管理、早期診断、心筋保護を含めた治療、罹患後の予後予測法、再発予防の重要性が認識されている。虚血性心疾患危険因子群のスクリーニング項目としては、血中コレステロール値、血糖値、血圧の測定、喫煙歴の聴取のほか、虚血性心疾患に関連して低ＨＤＬコレステロール血症（非特許文献１参照）、インスリン抵抗性（非特許文献２参照）、高ホモシステイン血症（非特許文献３参照）、酸化ＬＤＬ（非特許文献４参照）などが知られていることより、これらの血中濃度の測定が行われている。予後予測法としては核種トレーサーを用いた核医学的手法が現在主に用いられている。また、薬物治療としては抗血小板薬、冠動脈拡張薬の他、アンギオテンシン転換酵素阻害薬（非特許文献５参照）などが用いられている。しかし現在なお、虚血性心疾患危険因子群のスクリーニング、治療は十分ではない。また、予後予測のための核医学的手法は経済的負担が大きく、施行可能な設備が限られている。

脳由来神経栄養因子（以下、ＢＤＮＦと略称する）は、脳内で発見された神経栄養因子の一つであり、脳内神経回路網の形成や発達、さらにはその生存維持に重要な役割を果たしていることが判明している。また、１９９０年代後半には、ＢＤＮＦはシナプスの可塑性にも関与し、記憶や学習にも重要な役割を果たしていることが知られており、また神経細胞死に対して神経保護作用も有する事が報告されている。最近、さらにこのＢＤＮＦは神経系のみならずに心血管系において重要な役割を果たしていることが報告されている。最近の遺伝子改変動物を用いた研究により、ＢＤＮＦは冠動脈内皮細胞の安定に重要であり、血管新生に関係していることが示唆されている（非特許文献６参照）。また、血管内皮自身がＢＤＮＦを合成、分泌しており、血管障害、心筋虚血によりＢＤＮＦの合成、発現は促進されることも報告されている（非特許文献７および８参照）。その他、ＢＤＮＦは高脂血症による血管内皮障害に保護的に働く可能性があることや（非特許文献９参照）、ＢＤＮＦの低下は、耐糖能異常、脂質代謝異常などを示し動脈硬化に促進的に働く代謝性症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の病状を進展させる可能性などが示唆されている（非特許文献１０参照）。しかしながら虚血性心疾患におけるＢＤＮＦの役割、特に急性心筋梗塞後の心筋のリモデリングとの関係等については報告がない。

Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌｏ．（１９９５）１５：４３１−４４０ Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９８８）３７：１５９５−１６０７ ＪＡＭＡ（１９９２）２６８：８７７−８８１ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９１）８８：１７８５−１７９２ Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ．Ｊ．（１９９８）１９：Ａ１２−Ａ１９ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０００）１２７：４５３１−４５４０ ＦＡＳＥＢ（２０００）４７０：１１３−１１７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２００１）１９４：２４７−２５３ Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００１）１０９：３５７−３６０ Ｊ．Ｕｒｏｌ．（２００３）１６９：１５７７−１５７８

虚血性心疾患は前述したとおり、日本における主な死因のひとつであり、現在もなお、患者数が増加している疾患であるが、無症状に進行することも多く、そのスクリーニングも十分でなく、治療法も十分ではない。また罹患後の治療方針決定のための予後予測法も十分ではない。従って医療現場から虚血性心疾患の危険因子を早期診断できる診断薬、診断方法、治療薬、簡便な予後予測法の開発が望まれている。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、虚血性心疾患の患者の血清中ＢＤＮＦのレベルが、健常者のそれと比較して有意に低下していることを見出し、その違いを利用することにより、抗脳由来神経栄養因子抗体（以下、「抗ＢＤＮＦ抗体」という）を用いてＢＤＮＦを測定することにより虚血性心疾患危険群の診断が可能となることを見出した。また、ＢＤＮＦあるいはＢＤＮＦを増加させる薬物を投与することにより虚血性心疾患の治療、特に心筋梗塞後の心筋のリモデリングを抑制できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明は下記の態様の発明を提供するものである。
１．抗ＢＤＮＦ抗体を含有する虚血性心疾患危険群診断薬。
２．血液中のＢＤＮＦの濃度を測定するためのものである上記１に記載の虚血性心疾患危険群診断薬。
３．抗ＢＤＮＦ抗体および標識化抗ＢＤＮＦ抗体を含む上記１または２に記載の虚血性心疾患危険群診断薬。
４．抗ＢＤＮＦ抗体および標識化剤を含有する虚血性心疾患危険群の診断キット。
５．血液中のＢＤＮＦの濃度を測定するためのものである上記４に記載の虚血性心疾患危険群の診断キット。
６．抗ＢＤＮＦ抗体および標識化抗ＢＤＮＦ抗体を含む上記４または５に記載の虚血性心疾患危険群の診断キット。
７．血液中のＢＤＮＦの濃度を測定することを特徴とする虚血性心疾患危険群の検定方法。
８．抗ＢＤＮＦ抗体を用いてＢＤＮＦの濃度を測定するものである上記７に記載の虚血性心疾患危険群の検定方法。
９．抗ＢＤＮＦ抗体および標識化抗ＢＤＮＦ抗体を用いてＢＤＮＦの濃度を測定するものである上記７に記載の虚血性心疾患危険群の検定方法。
１０．血液中のＢＤＮＦの濃度を測定することを特徴とする虚血性心疾患の治療薬の検定方法。
１１．ＢＤＮＦを増加させる化合物を含有する虚血性心疾患の治療薬。
１２．ＢＤＮＦを含有する虚血性心疾患の治療薬。
１３．ＢＤＮＦを増加させる化合物の、虚血性心疾患の治療薬製造のための使用。
１４．ＢＤＮＦの、虚血性心疾患の治療薬製造のための使用。
１５．ＢＤＮＦを増加させる化合物を投与することを特徴とする虚血性心疾患の治療方法。
１６．ＢＤＮＦを投与することを特徴とする虚血性心疾患の治療方法。
１７．ＢＤＮＦを含有する心筋梗塞後の心筋リモデリングの抑制・予防薬。
１８．ＢＤＮＦの、心筋梗塞後の心筋リモデリングの抑制予防薬製造のための使用。
１９．ＢＤＮＦを投与することを特徴とする心筋梗塞後の心筋リモデリングの抑制・予防方法。

本発明の虚血性心疾患危険群の診断薬を用いれば、血液中のＢＤＮＦを測定することによって、冠動脈硬化症、狭心症、急性および陳旧性心筋梗塞等の虚血性心疾患危険群が正確に診断できる。特に、抗ＢＤＮＦ抗体と標識化抗ＢＤＮＦ抗体とを用いて患者血液中のＢＤＮＦの濃度を測定することによって該診断が容易に行われる。また、本発明によれば、ＢＤＮＦあるいはＢＤＮＦを増加させる化合物を含有する虚血性心疾患の治療薬、さらに心筋梗塞後の心筋リモデリングの抑制・予防薬が提供される。

正常対照（ＮＣ）、虚血性心疾患（ＩＨＤ）の患者における血清ＢＤＮＦ濃度の散布図である。 虚血性心疾患患者における糖尿病合併例（ＤＭ（＋））と糖尿病非合併例（ＤＭ（−））における血清ＢＤＮＦ濃度の散布図である。 虚血性心疾患患者における血清ＢＤＮＦ濃度と血糖値（ＢＳ）の間の相関関係を示す。 虚血性心疾患患者における血清ＢＤＮＦ濃度とグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）値の間の相関関係を示す。 虚血性心疾患患者における高脂血症合併例（ＨＬ（＋））と高脂血症非合併例（ＨＬ（−））における血清ＢＤＮＦ濃度の散布図である。 虚血性心疾患患者における血清ＢＤＮＦ濃度と血清総コレステロール（Ｔ−ｃｈｏ）値の間の相関関係を示す。 虚血性心疾患患者における血清ＢＤＮＦ濃度と血清ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ）値の間の相関関係を示す。 虚血性心疾患患者における高血圧合併例（ＨＴ（＋））と高血圧非合併例（ＨＴ（−））における血清ＢＤＮＦ濃度の散布図である。 虚血性心疾患患者における血清ＢＤＮＦ濃度と収縮期血圧の間の相関関係を示す。 虚血性心疾患患者における血清ＢＤＮＦ濃度と拡張期血圧の間の相関関係を示す。 虚血性心疾患患者における喫煙例（喫煙（＋））と非喫煙例（喫煙（−））における血清ＢＤＮＦ濃度の散布図である。 虚血性心疾患患者におけるＣＣＳスコアによる血清ＢＤＮＦ濃度の違いを示す。 心筋梗塞モデル作成のプロトコールを示す。 心臓標本の肉眼的所見を示す。 心臓切片のマッソントリクローム染色結果を示す。 心筋梗塞のサイズ（マッソントリクローム染色）を示す。

本発明の虚血性心疾患危険群診断薬、診断キット、虚血性心疾患危険群の検定方法、虚血性心疾患治療薬およびその検定方法について以下に詳細に説明する。

本明細書における用語の意味あるいは定義は以下のとおりである。
「抗脳由来神経栄養因子抗体（抗ＢＤＮＦ抗体）」とは、ＢＤＮＦを抗原として得られる抗体をいう。該抗体は、ＢＤＮＦに結合する能力があればよく、ポリクロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗体、さらに遺伝子組み換え技術によって得られる抗体を含む。また必要により当該抗体は、精製や化学修飾を施したものであっても、Ｆ（ａｂ‘）₂など断片化したものであっても良い。好ましいものとしては、特異的にＢＤＮＦに結合するポリクロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗体等が挙げられる。当該抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体としては市販されているものを使用することができる。

「標識化抗脳由来神経栄養因子抗体（標識化抗ＢＤＮＦ抗体）」とは、抗ＢＤＮＦ抗体にペルオキシダ−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ、アルカリフォスファタ−ゼ、グルコ−ス−６−リン酸脱水素酵素等の酵素、蛍光性物質、放射性同位元素または同位元素、金コロイド粒子、カラーラテックス等を結合させて標識し、試料中のＢＤＮＦを検出できるように工夫された抗体をいう。さらに「標識化抗ＢＤＮＦ抗体」には、ビオチン、２，４−ジニトロフェノ−ル等で修飾した抗ＢＤＮＦ抗体も含まれる。これらビオチン、２，４−ジニトロフェノ−ル等で修飾した抗ＢＤＮＦ抗体を使用する際には、該標識化抗ＢＤＮＦ抗体に加え、さらに、標識化したアビジン、標識化した抗２，４−ジニトロフェノ−ル抗体を用いることで、高感度に試料中のＢＤＮＦを検出することができる。

「虚血性心疾患」とは、冠動脈硬化症、狭心症、急性および陳旧性心筋梗塞を含み、壮年期以降の男女に多く、生命維持に必要な心臓の重篤な障害をいう。冠動脈硬化症の特徴は、心臓を栄養する冠動脈内の動脈硬化であり、狭心症の特徴は、冠動脈血流障害による胸痛発作であり、心筋梗塞の特徴は冠動脈血流障害による心筋壊死と、それに付随する不整脈、心不全、心破裂、ポンプ失調などの致命的な合併症である。重要臓器である心臓への血流障害はこれら虚血性心疾患の本質的な特徴である。
「心筋梗塞後の心筋リモデリング」とは、心筋梗塞後に生じる梗塞部位の非薄化による心機能低下の代償として起こる非梗塞部位の心筋細胞の肥大、間質（細胞外マトリクス）の増加、心内腔の拡大などの一連の変化をいう。心筋梗塞後の長期予後は、左心室機能不全の程度と相関するため、心筋リモデリングを抑制することは左心室の機能を維持・保存するために重要である。

本発明による虚血性心疾患危険因子群の診断は、例えばヒトの血液中のＢＤＮＦ量を測定することによって行なうことが出来る。具体的には、ヒトの血液から血清を調製し、血清中のＢＤＮＦの量を種々の方法により測定する。血液中のＢＤＮＦ量の測定は、抗ＢＤＮＦ抗体を用いた免疫学的方法が好ましく、抗ＢＤＮＦ抗体と標識化抗ＢＤＮＦ抗体とを用いた免疫学的方法がより好ましく、望ましくはＢＤＮＦに対して特異性の高い抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによってＢＤＮＦを検出・定量することである。

より具体的には、固相化抗ＢＤＮＦ抗体に検体である血清を接触させ、固相を洗浄後標識化抗ＢＤＮＦ抗体を接触させ、該標識を用いてＢＤＮＦ量を測定する方法が好ましい。ここで標識化抗ＢＤＮＦ抗体としては、前記の如く直接測定可能な標識体で標識したもの、ビオチンとアビジンの組み合せや２，４−ジニトロフェノールとその抗体との組み合せも挙げられる。

具体的な血液中のＢＤＮＦを測定する方法としては、例えば
１．ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバ−、セファロ−ス等の固相に抗ＢＤＮＦ抗体を固定する工程；
２．診断する患者の血清を固相に加える、または接触させる工程；
３．固相を洗浄する工程；
４．標識化された抗ＢＤＮＦ抗体を加える、または接触させる工程；
５．該標識を用いてＢＤＮＦの量を測定する工程；
からなる方法等が挙げられる。

さらに、具体的な血清中のＢＤＮＦを測定する方法としては、例えば、
１．ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、セファロ−ス等の固相に抗ＢＤＮＦ抗体を固定する工程；
２．診断する患者の血清を固相に加える、または接触させる工程；
３．固相を洗浄する工程；
４．ビオチンまたは２，４−ジニトロフェノ−ルで修飾した抗ＢＤＮＦ抗体を加える、または接触させる工程；
５．標識化アビジンまたは標識化２，４−ジニトロフェノ−ル抗体を加える、または接触させる工程；
６．該標識を用いてＢＤＮＦの量を測定する工程；
からなる方法等が挙げられる。

さらに、具体的な血清中のＢＤＮＦを測定する方法としては、例えば、
１．ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバ−、セファロ−ス等の固相に抗ＢＤＮＦ抗体を固定する工程；
２．診断する患者の血液を固相に加える、または接触させる工程；
３．固相を洗浄する工程；
４．ビオチンで修飾した抗ＢＤＮＦ抗体を加える、または接触させる工程；
５．標識化アビジンを加える、または接触させる工程；
６．該標識を用いてＢＤＮＦの量を測定する工程；
からなる方法等が挙げられる。

固相の形状として小球、ウェル、試験管、ニトロセルロースなどのメンブラン等が挙げられる。

抗原またはＥＬＩＳＡのスタンダ−ドとして用いるＢＤＮＦは、市販されているものを使用することができる他、生物材料からの精製あるいは遺伝子工学的手法により調製することができる。遺伝子工学的手法を用いる場合、ＢＤＮＦをコ−ドする遺伝子を適切なベクタ−に組み込み、これを適切な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換の培養上清から目的とする組換えＢＤＮＦを得ることができ、均質で多量のＢＤＮＦの生産に好適である。上記宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、植物または動物細胞を用いることができる。

抗ＢＤＮＦ抗体は、ＢＤＮＦを抗原として、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヤギなどに免疫することにより調製される。標識化抗ＢＤＮＦ抗体は、汎用される方法のほか、市販されているビオチン化試薬や架橋剤付きペルオキシダ−ゼ等を用いて調製することができる。

虚血性心疾患危険群の診断は、血液中ＢＤＮＦの濃度について一定の基準を設定し、測定した血液検体のＢＤＮＦ濃度を該基準と比較、評価することで実施できる。基準の設定の仕方としては、臨床検査の分野でよく使用される９５パーセンタイル値やＲＯＣ曲線を用いて所望の検査精度から設定する方法などが挙げられる。虚血性心疾患者の血液中ＢＤＮＦ濃度は健常者のそれより有意に低いので、上記の手段により血液中のＢＤＮＦ量を測定し、健常者のそれと比較すれば、虚血性心疾患の危険度が高いことが診断できる。
このような評価は、ＢＤＮＦの測定単独で行う方法のほかにＢＤＮＦとそれ以外の指標、例えば公知のマーカー等の測定値と関連付けて行う方法が挙げられる。ここで関連付けるとは、計算式を使用してＢＤＮＦ測定単独では得ることができなかった情報を得ることをいう。関連付ける方法として、ＢＤＮＦの測定値を公知のマーカーの測定値で除し、求めた比（二つの測定値の比）を新たな指標とすることなどが例示できる。これにより検査・診断の精度を所望のものに調整することができる。

本発明の虚血性心疾患危険群診断薬または診断薬キットは、抗ＢＤＮＦ抗体、抗ＢＤＮＦ抗体および標識化剤、あるいは抗ＢＤＮＦ抗体および標識化抗ＢＤＮＦ抗体を含むものであればよい。

本発明方法は、また虚血性心疾患の治療薬の検定にも有用である。すなわち、虚血性心疾患治療薬の治療効果を検定することもできる。また、ＢＤＮＦを増加させる作用を有する化合物は、虚血性心疾患の治療薬として有用である。また、ＢＤＮＦの量が低いモデル動物（マウスやラットなど）は、虚血性心疾患の動物モデルとしても有用である。従って、この検定方法を利用することにより、新しい虚血性心疾患の治療薬のスクリ−ニングも行なうことが可能である。

このような方法で見出される治療薬には、非経口的または経口的に投与できる薬物が含まれ得る。虚血性心疾患の治療薬としては、ＢＤＮＦ自身の他、下記式（１）：

（式中、Ｒ¹はハロゲン原子、置換されていてもよい複素環基、置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいチオール基または置換されていてもよいアミノ基を、Ａは置換されていてもよいアシル基、置換されていてもよい複素環基、置換されていてもよいヒドロキシ基またはエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基を、Ｂは置換されていてもよい芳香族基を、Ｘは酸素原子、硫黄原子または置換されていてもよい窒素原子を、Ｙは２価の炭化水素基または複素環基を示す。）で表されるアゾール誘導体（特開平２００１−１３１１６１）が例示される。

また、下記式（２）：

（式中、Ｒ³およびＲ⁴はそれぞれハロゲン原子であり、Ｒ⁵およびＲ⁶はそれぞれ水素原子、炭素原子数１〜５のアルキル基、炭素原子数１〜３のアルキルスルフォニル基またはアセチルアミノアルキル基である。）で表される５−フェニルピリミジン化合物およびその塩（特開平８−３１４２）が例示される。

さらに、カテコール誘導体（Ｆｕｒｕｋａｗａ．Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１巻，６０３９頁（１９８６年）、特開昭６３−８３０２０、特開昭６３−１５６７５１、特開平２−５３７６７、特開平２−１０４５６８、特開平２−１４９５６１、特開平３−９９０４６、特開平３−８３９２１、特開平３−８６８５３、特開平５−３２６４６）、キノン誘導体（特開平３−８１２１８、特開平４−３３００１０、特開平７−２８５９１２）、グルタミン酸誘導体（特開平７−２２８５６１）、不飽和脂肪酸誘導体（特開平８−１４３４５４）、オイデスマン誘導体（特開平８−７３３９５）、縮環系オキサゾール誘導体（特開平８−１７５９９２）、カルバゾール誘導体（特開平８−１６９８７９）、インドール誘導体（特開平７−１１８１５２、特開平８−２３９３６２）、天然物由来のテルペン誘導体（特開平７−１４９６３３、特開平８−３１９２８９）、プリン誘導体であるレテプリニム（ＮｅｕｒｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、米国）などが挙げられる。

これらの化合物のうち、２−アミノ−５−（２，４−ジクロロフェニル）ピリミジン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６６（２００３）１０１９−１０２３）および４−（４−クロロフェニル）−２−（２−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−５−［３−（２−メトキシフェノキシ）プロピル］−１，３−オキサゾール（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５１（５）５６５−５７３（２００３）が好ましい。

これら虚血性心疾患治療薬の正確な投与量および投与計画は、個々の治療対象毎の所要量、治療方法、疾病または必要性の程度、および薬物の種類によって異なり、また当然医師の判断によることが必要である。例えば、ＢＤＮＦの場合について言えば、非経口的投与する場合の投与量、投与回数は症状、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、例えば注射剤として皮下または静脈に投与する場合、成人の患者の体重１ｋｇ、一日当たり約０．１ｍｇ〜約２５００ｍｇの範囲、好ましくは約１ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲から投与量が選択され、例えば噴霧剤として気管に投与する場合、成人の患者の体重１ｋｇ、一日当たり約０．１ｍｇ〜約２５００ｍｇの範囲、好ましくは約１ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲から投与量が選択される。投与計画としては、連日投与または間欠投与またはその組み合わせがある。経口的投与する場合の投与量、投与回数は症状、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、例えば、成人の患者の体重１ｋｇ、一日当たり約０．５ｍｇ〜約２５００ｍｇの範囲、好ましくは約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲から投与量が選択される。

本発明の虚血性心疾患の治療薬を薬学的に許容しうる非毒性の担体と混和することにより医薬組成物を製造することができる。このような組成物を、非経口投与用（皮下注射、筋肉注射、または静脈注射）に調製する場合は、特に溶液剤形または懸濁剤形がよく、膣または直腸投与用の場合は、特にクリ−ムまたは坐薬のような半固形型剤形がよく、経鼻腔投与用の場合、特に粉末、鼻用滴剤、またはエアロゾル剤形がよい。

組成物は一回量投与剤形で投与することができ、また例えばレミントンの製薬科学（マック・パブリッシング・カンパニ−、イ−ストン、ＰＡ、１９７０年）に記載されているような製薬技術上良く知られているいずれかの方法によって調製できる。注射用製剤は医薬担体として、例えば、アルブミン等の血漿由来蛋白、グリシン等のアミノ酸、マンニト−ル等の糖を加えることができる。注射剤形で用いる場合にはさらに緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。また、水溶製剤、凍結乾燥製剤として使用する場合、凝集を防ぐためにＴｗｅｅｎ８０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）などの界面活性剤を添加するのが好ましい。また注射剤以外の非経口投与剤形は、蒸留水または生理食塩液、ポリエチレングリコ−ルのようなポリアルキレングリコ−ル、植物起源の油、水素化したナフタレン等を含有してもよい。例えば坐薬のような膣または直腸投与用の製剤は、一般的な賦形剤として例えばポリアキレングリコ−ル、ワセリン、カカオ油脂等を含有する。膣用製剤では、胆汁塩、エチレンジアミン塩、クエン酸塩等の吸収促進剤を含有しても良い。吸入用製剤は固体でも良く、賦形剤として例えばラクト−スを含有してもよく、また経鼻腔滴剤は水または油溶液であってもよい。

以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

実施例１
（１）被験者
後記表１に示す虚血性心疾患の患者３９名（男性２９名、女性１０名、平均年齢：６５．０歳（標準偏差９．４）、年齢範囲：３４歳〜８２歳）、ならびに同一年齢層の健康者３３名（男性１１名、女性２２名、平均年齢：６８．３歳（標準偏差１２．０）、年齢範囲：３５歳〜８２歳）を正常対照として被験者に選んだ。虚血性心疾患のすべての患者は心臓カテーテル法による冠動脈造影を施行し、冠動脈に動脈硬化による有意な冠動脈狭窄を確認することで診断した。冠動脈造影上定量的評価法により５０％以上の狭窄をもって有意狭窄とした。実験対象すべてに対して冠動脈の危険因子である高脂血症、糖尿病、高血圧の治療歴、および喫煙歴について調査した。高脂血症については、日本動脈硬化学会の診断基準、すなわち血清脂質のうち総コレステロール２２０ｍｇ／ｄｌ以上、ＬＤＬコレステロール１４０ｍｇ／ｄｌ以上、ＨＤＬコレステロール４０ｍｇ／ｄｌ未満、トリグリセリド１５０ｍｇ／ｄｌ以上、を満たすことにより診断した。糖尿病については、日本糖尿病学会の診断基準、すなわち空腹時静脈血漿グルコース濃度が１２６ｍｇ／ｄｌ以上、７５ｇブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の２時間値２００ｍｇ／ｄｌ以上、または随時血糖値２００ｍｇ／ｄｌ以上、を満たすことにより診断した。高血圧症については、国際高血圧学会の診断基準、すなわち収縮期血１４０ｍｍＨｇ以上または拡張期血圧９０ｍｍＨｇ以上、を満たすことによって診断した。すべての被験者に対して、自覚症状をＣＣＳ（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）分類にて付した。ＣＣＳ分類は狭心症の労作時症状を重症度に応じて４段階に分類したものである（例えばＣａｍｐｅａｕ，Ｌ．ら著、Ｇｒａｄｉｎｇ Ａｎｇｉｎａ ｐｅｃｔｏｒｉｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９７６）５４：５２２参照）。

（２）試験方法
被験者の血清検体を採取し、測定まで−８０℃で保存した。ＢＤＮＦの血清レベルはＢＤＮＦ測定キット（「ＢＤＮＦ Ｅｍａｘ^(R) ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、プロメガ社、米国）を用い、製造者の指示に従って測定した。すなわち、抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体を９６穴プレ−トにコ−ティングし、４℃で１８時間インキュベーションした。プレートをブロッキング緩衝液にて室温で１時間ブロッキング処理した。緩衝液で洗浄した後、希釈した血清１００μＬを添加した。定量用のスタンダ−ドとして、ヒトＢＤＮＦ（７８−５０００ｐｇ／ｍＬ）を添加したものを用いた。室温で２時間反応させた後、緩衝液で５回洗浄し、抗ヒトＢＤＮＦ抗体を添加し室温で２時間反応させた。緩衝液で５回洗浄した後、ワサビペルオキシダ−ゼ標識抗ＩｇＹ抗体（１００μＬ）を添加し、室温で１時間反応させた。次に、緩衝液で５回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（１００μＬ）を添加し、室温で１０分間反応させた後、停止液（１Ｍ塩酸：１００μＬ）を添加して反応を止め、３０分以内に４５０ｎｍ波長での吸光度を自動マイクロプレートリーダー（Ｅｍａｘ、モレキュラーデバイス、米国）で測定した。検体中のＢＤＮＦの含量をサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法にて測定し、検量線からそのＢＤＮＦの濃度を算出した。また、これと同時にすべての被験者において血圧、血糖値、グリコヘモグロビン（ＨｂＡ_1c）値、血清総コレステロール値、血清ＬＤＬコレステロール値を測定した。

（３）統計分析
データは平均値±標準偏差で示した。２群間の統計分析はスチュデントｔ−テストを用いて行った。変数間の関係はピアソンの積率相関係数で確認した。多群の差は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で解析した。自覚症状間の多重比較のため、ボンフェロニ・ダンテストを行った。０．０５以下のｐ値を統計的に有意とした。

（４）結果
表１に虚血性心疾患患者の特徴および上記実験結果を示す。

ｉ）全被験者における血清ＢＤＮＦの濃度
正常対照（ＮＣ）、虚血性心疾患（ＩＨＤ）の被験者における血清ＢＤＮＦ濃度の散布状態を図１に示す。
スチュデントｔ−テストの結果、虚血性心疾患でのＢＤＮＦ血清レベル（平均値：２１．６ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：９．６］）は正常対照での平均値：３３．２ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：１１．４］，ｐ＜０．０００１）よりも有意に低いことが判明した。ＮＣ群とＩＨＤ群（ｎ＝７２）を総合して、血清ＢＤＮＦ値と年齢間に有意な相関（ｒ＝−０．１２０，ｐ＝０．３１７）はなかった。また、ＮＣ群とＩＨＤ群を総合して男性（ｎ＝４０）のＢＤＮＦ血清レベル（平均値：２５．８ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：１１．２］）と女性の（ｎ＝３２）のＢＤＮＦ血清レベル（平均値：２８．４ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：１２．７］）は有意に違わなかった（スチュデントｔ−テスト、ｐ＝０．３４７）。

ｉｉ）血清ＢＤＮＦと糖尿病
虚血性心疾患患者のうち、糖尿病の既往歴のある者（ｎ＝１４）の血清ＢＤＮＦレベル（平均値：１９．８ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：７．７］）と糖尿病の既往歴の無い者（ｎ＝２５）の血清ＢＤＮＦレベル（平均値：２５．０ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：１１．７］）の比較を図２に示す。両群間のＢＤＮＦ血清レベルは有意に違わなかった（スチュデントｔ−テスト、ｐ＝０．１０２）。また、虚血性心疾患患者の血清ＢＤＮＦ値と血糖値の相関関係を図３に、全被験者の血清ＢＤＮＦ値とグリコヘモグロビンの相関関係を図４に示す。血清ＢＤＮＦ値と血糖値（ｒ＝−０．０１４，ｐ＝０．９３３）、グリコヘモグロビン（ｒ＝０．１１４，ｐ＝０．４８８）にはいずれも有意な相間はなかった。

ｉｉｉ）血清ＢＤＮＦと高脂血症
虚血性心疾患患者のうち、高脂血症の既往歴のある者（ｎ＝２７）の血清ＢＤＮＦレベル（平均値：２２．７ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：９．５］）と高脂血症の既往歴の無い者（ｎ＝１２）の血清ＢＤＮＦレベル（平均値：１９．３ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：９．７］）の比較を図５に示す。両群間のＢＤＮＦ血清レベルは有意に違わなかった（スチュデントｔ−テスト、ｐ＝０．３１９）。また、虚血性心疾患患者の血清ＢＤＮＦ値と血清総コレステロール値の相関関係を図６に、虚血性心疾患患者の血清ＢＤＮＦ値と血清ＬＤＬコレステロール値の相関関係を図７に示す。血清ＢＤＮＦ値と血清総コレステロール値（ｒ＝−０．２０５、ｐ＝０．２１０）、血清ＬＤＬコレステロール値（ｒ＝−０．１９０，ｐ＝０．２４６）にはいずれも有意な相関はなかった。

ｉｖ）血清ＢＤＮＦと高血圧症
虚血性心疾患患者のうち、高血圧症の既往歴のある者（ｎ＝２２）の血清ＢＤＮＦレベル（平均値：２３．０ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：１０．６］）と高血圧症の既往歴の無い者（ｎ＝１７）の血清ＢＤＮＦレベル（平均値：１９．９ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：８．０］）の比較を図８に示す。両群間のＢＤＮＦ血清レベルは有意に違わなかった（スチュデントｔ−テスト、ｐ＝０．３３３）。また、虚血性心疾患患者の血清ＢＤＮＦ値と収縮期血圧の相関関係を図９に、虚血性心疾患患者の血清ＢＤＮＦ値と拡張期血圧の相関関係を図１０に示す。血清ＢＤＮＦ値と収縮期血圧（ｒ＝−０．１１２，ｐ＝０．４５８）、拡張期血圧（ｒ＝−０．１１２，ｐ＝０．４７６）にはいずれも有意な相関はなかった。

ｖ）血清ＢＤＮＦと喫煙
虚血性心疾患患者のうち、喫煙の既往歴のある者（ｎ＝２２）の血清ＢＤＮＦレベル（平均値：２３．３ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：８．９］）と喫煙の既往歴の無い者（ｎ＝１７）の血清ＢＤＮＦレベル（平均値：１９．５ｎｇ／ｍＬ［標準偏差：１０．３］）の比較を図１１に示す。両群間のＢＤＮＦ血清レベルは有意に違わなかった（スチュデントｔ−テスト、ｐ＝０．２２３）。

ｖｉ）血清ＢＤＮＦと狭心症状
図１２に示すように、虚血性心疾患患者の血清ＢＤＮＦ濃度はＣＣＳ分類によって有意な違いは無かった（Ｆ＝１．８０７、ｐ＝０．１７９）。

上記試験結果に見られるように、虚血性心疾患患者の血清ＢＤＮＦ値は同一年齢層の正常対照の値と比べて有意に減少していることがわかった。また、虚血性心疾患患者の血清ＢＤＮＦ値は、糖尿病、高脂血症、高血圧、喫煙の既往により差は見られず、血糖値、グリコヘモグロビン値、血清総コレステロール値、血清ＬＤＬコレステロール値、血圧とも直接の関係は認めなかった。さらに、血清ＢＤＮＦ値はＣＣＳ分類に基づく狭心症状の自覚とも無関係であった。総合すれば、減少した血清ＢＤＮＦ値は虚血性心疾患の病態生理に寄与しているものと考えられる。

虚血性心疾患の主たる病態生理は動脈硬化による冠動脈の血流障害である。上記試験における虚血性心疾患患者は、全例で、冠動脈に動脈硬化による有意な狭窄または閉塞を示していた。血清ＢＤＮＦ値の低下は糖代謝、脂質代謝などに悪影響を与えるが、上記試験において血清ＢＤＮＦ値の低下は他の動脈硬化の危険因子となる疾患の既往、これまで知られた血糖値、グリコヘモグロビン、血清総コレステロール、血清ＬＤＬコレステロールなどの危険因子からでは予測できなかった。

従って、本試験により、ＢＤＮＦは虚血性心疾患の病態生理学において極めて重要な役割を果たし、特にこれまで知られた危険因子（診断マーカー）では見落とされていた患者を発見することができるため、血液中のＢＤＮＦ測定は、虚血性心疾患危険群の生物学的診断マーカーとして有用であることがわかる。

実施例２
（方法）
実験には１０週齢のＣ５７／ＢＬ６バックグラウンドの野生型マウス（Ｗｉｌｄ）とＢＤＮＦノックアウトマウスへテロタイプ（ＢＤＮＦ（＋／−））（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６８：１４７−１５０、ＴＨＥ ＪＡＣＫＳＯＮ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹより入手した。）を用いた。前記２種類のマウスについて、麻酔・人工呼吸管理下で開胸し、冠動脈左前下行枝を結紮することによって急性心筋梗塞（ＭＩ）を作成し、それぞれを「Ｗｉｌｄ＋ＭＩ」群、「ＢＤＮＦ（＋／−）＋ＭＩ」群とした。同時に前記２種類のマウスそれぞれにｓｈａｍ手術（偽手術）を行いコントロールとしての「ｓｈａｍ」群とした。ＢＤＮＦ（住友製薬）（１ｍｇ／ｋｇ）の投与は心筋梗塞作成直後から開始し連続１０日間腹腔内投与した（図１３）。心筋梗塞作成２週間後に心エコー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｏｎｏｓ ４５００）を施行した（表３）。その後屠殺し、実体顕微鏡にて心臓の肉眼的な所見を撮影し（図１４）、左心室の重量測定を行った（表２）。心臓サンプルのホルマリン固定後パラフィン切片を作成し、マッソントリクローム染色（図１５）を用いて心筋梗塞サイズの定量化を行った（図１６）。多群の差は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で解析した。

（結果）
図１４において、「△」は結紮した冠動脈左前下行枝を示し、「↑」は心筋梗塞後の心筋リモデリングが認められた部位を示す。野生型マウスの心筋梗塞群（Ｗｉｌｄ＋ＭＩ）（下段中央）と比較して、ＢＤＮＦノックアウトマウス群（ＢＤＮＦ（＋／−）＋ＭＩ）（下段右側）では、心筋梗塞後の心筋リモデリングが増大していたのに対し、ＢＤＮＦ投与群（Ｗｉｌｄ＋ＭＩ＋ＢＤＮＦ ｉｐ）（下段左側）では小さい傾向にあった（図１４）。
表２は、各試験群における左心室重量の変化を示す。心筋梗塞後の体重で補正した左心室重量（ＨＷ／ＢＷ）は、コントロールであるｓｈａｍ群と比較して心筋梗塞群（ＭＩ）で有意に増加しており（ｐ＜０．０１）、その増加はＢＤＮＦ投与群（ＭＩ＋ＢＤＮＦ ｉｐ）では小さい傾向にあった（表２、Ｗｉｌｄの欄）。
ＢＤＮＦノックアウトマウスの心筋梗塞群（ＢＤＮＦ（＋／−）＋ＭＩ）では、野生型マウスの心筋梗塞群（Ｗｉｌｄ＋ＭＩ）と比較して心筋梗塞後の左心室重量増加が有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。
図１５は、各心筋梗塞群における心筋梗塞サイズを示す。野生型マウスの心筋梗塞群（Ｗｉｌｄ＋ＭＩ）と比較してＢＤＮＦノックアウトマウスの心筋梗塞群（ＢＤＮＦ（＋／−）＋ＭＩ）では梗塞サイズが大きい傾向にあった（図１５〜１６）。ＢＤＮＦ投与群（Ｗｉｌｄ＋ＭＩ＋ＢＤＮＦ ｉｐ）の梗塞サイズは野生型マウスの心筋梗塞群（Ｗｉｌｄ＋ＭＩ）と比較して小さい傾向にあった。
表３は、心エコーによる解析結果を示す。コントロールであるｓｈａｍ群と比較して心筋梗塞群（ＭＩ）では、左室拡張期径（ＬＶＤＤ）の有意な増加、左室内径短縮率（ＦＳ）の有意な減少がみられた。心筋梗塞後の左室拡張期径（ＬＶＤＤ）の増加や左室内径短縮率（ＦＳ）の減少は、ＢＤＮＦ投与群（Ｗｉｌｄ＋ＭＩ＋ＢＤＮＦ ｉｐ）において有意に抑制されていた。逆に、ＢＤＮＦノックアウトマウスの心筋梗塞群（ＢＤＮＦ（＋／−）＋ＭＩ）では野生型マウスの心筋梗塞群（Ｗｉｌｄ＋ＭＩ）と比較して心筋梗塞後の左室拡張期径（ＬＶＤＤ）がより増加傾向を示し、左室内径短縮率（ＦＳ）はより減少傾向を示した。

急性心筋梗塞後には、左室のリモデリングの進行とそれに伴う心機能の低下により心不全が発症することが知られている。ＢＤＮＦが低下しているマウス（ＢＤＮＦ（＋／−））では低下していないマウス（Ｗｉｌｄ）と比較して、心筋梗塞後の左心室重量増加、梗塞サイズの増大、左室拡張期径（ＬＶＤＤ）の増大、左室内径短縮率（ＦＳ）の低下がみられることから、内因性のＢＤＮＦは心筋梗塞後の左室リモデリングに抑制的に働いていると考えられる。野生型マウスの心筋梗塞後に、ＢＤＮＦを投与した群（Ｗｉｌｄ＋ＭＩ＋ＢＤＮＦ ｉｐ）ではこれら全ての変化が抑制されていることから、ＢＤＮＦの心筋梗塞後の心筋リモデリング抑制に対する有用性が認められた。虚血性心疾患患者ではＢＤＮＦの発現が低下していることを考えあわせると、ＢＤＮＦやその発現・活性を増加させる薬物の投与が心筋梗塞急性期の治療として非常に有効である。

Claims (2)

1. 脳由来神経栄養因子を含有する心筋梗塞後の心筋リモデリングの抑制・予防薬。
2. 脳由来神経栄養因子の、心筋梗塞後の心筋リモデリングの抑制・予防薬製造のための使用。