JP2011045375A

JP2011045375A - 新規多機能性サイトカイン

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Publication number: JP2011045375A
Application number: JP2010222286A
Authority: JP
Inventors: Stephane Paul; ステファーヌ、ポール
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 2003-07-21
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2011-03-10
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Abstract

【課題】癌および感染症を含む種々の疾患の治療または予防に有用な新規融合蛋白質、これをコードする核酸、融合蛋白質の製造方法、融合蛋白質を含む医薬組成物を提供する。
【解決手段】式Ｘ−ＹまたはＹ−Ｘ（式中、Ｘは第１の免疫調節ポリペプチドを表し、かつ、ＹはＸとは異なる第２の免疫調節ポリペプチドを表す）を有する新規融合タンパク質。このような融合タンパク質をコードする核酸分子およびこのような核酸分子を含んでなるベクター。このような核酸分子またはこのようなベクターを含んでなる感染性ウイルス粒子および宿主細胞、ならびにこのような感染性ウイルス粒子を作製するための手順。このような融合タンパク質を組換えにより作製するための方法。このような融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子および宿主細胞を含んでなる医薬組成物、ならびにその治療上の使用方法。
【選択図】なし

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は、式Ｘ−ＹまたはＹ−Ｘ（式中、Ｘは第１の免疫調節ポリペプチドを表し、かつ、ＹはＸとは異なる第２の免疫調節ポリペプチドを表す）を有する新規融合タンパク質に関する。本発明はまた、このような融合タンパク質をコードする核酸分子およびこのような核酸分子を含んでなるベクターにも関する。本発明はまた、このような核酸分子またはこのようなベクターを含んでなる感染性ウイルス粒子および宿主細胞、ならびにこのような感染性ウイルス粒子を生産するため生産するための方法にも関する。最後に、本発明はまた、このような融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子および宿主細胞を含んでなる医薬組成物、ならびにその治療上の使用も提供する。

本発明は、遺伝子療法および免疫療法の分野において、特に、癌および感染症（細菌およびウイルス感染）を含む種々の疾患の治療または予防に特に有用である。

背景技術
大まかに言えば、宿主の免疫応答は２つのカテゴリー：非特異的（すなわち、先天性）免疫応答および特異的（すなわち、適応的または後天性）免疫応答に分類される。これらの違いは、特異的免疫応答が特定の抗原に対して高度に特異的である一方で、非特異的応答が特定の病原体／抗原に対する反復曝露に依存しないことにある。免疫系を制御するネットワークは、免疫細胞の機能をオンおよびオフにするとともに、それらの増殖を調節し、かつ、免疫応答の大きさを制御する分泌タンパク質（例えば、サイトカイン）に依存する。具体的に言えば、２種類のリンパ球−−Ｂ細胞およびＴ細胞−−が特異的免疫の中核を成している。抗原によって誘導され、Ｂ細胞は分裂し、娘細胞が抗体分子を合成し、それを分泌する（体液性免疫）。Ｔ細胞の活性化は、とりわけ、非自己抗原を有する標的細胞（例えば、感染細胞または腫瘍性細胞）を特異的に排除する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により媒介される細胞性免疫の発生を伴う。特異的（すなわち、適応的）免疫応答の活性化は、数多くのサイトカインによって調節されている。とりわけ注目すべきは、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびインターフェロンγ（ＩＦＮｇ）である。他方、非特異的（先天性）応答には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージをはじめとする様々な種類の免疫細胞が関係しており、とりわけ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１のようなサイトカインの分泌によって媒介される。しかしながら、実際には、in vivoでの病原体および腫瘍の排除が両方のタイプの免疫応答の協調に伴って生じる可能性が高いため、特異的免疫応答と非特異的免疫応答の厳密な区別はある部分任意なものである。また、特異的エフェクターは、サイトカインシグナル伝達経路を通じて、非特異的エフェクターの誘導および活性化において重要な役割を果たし得るし、またその逆もそうである。例えば、ＮＫＴ細胞の１つの顕著な特性が、Ｔ細胞受容体連結を受けて大量のサイトカインを迅速に産生するそれらの能力であり、これにより、活性化ＮＫＴ細胞が特異的免疫応答も調整し得ることが示唆される。免疫応答、免疫エフェクター細胞および免疫メディエーターの一般的な考察については、例えば、最新版“Encyclopedia of Immunology”(Ivan Roitt and Peter Delves編; Academic Press Limited)および“Fundamental Immunology(例えば、第２版, W. Paul編; Raven Press)を参照。

癌が細胞増殖の制御の喪失によって生じる多段階プロセスであることは、一般的に認められている。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の悪性表現型の発現への関与を裏付ける多数の詳細な研究が存在している。これらの抗原としては、癌遺伝子産物（例えば、ｐ５３、ｒａｓ、ｎｅｕ、ｅｒｂ）、再活性化胚遺伝子産物（例えば、Ｐ８１５肥満細胞種に見られるＰ９１Ａ）、修飾自己抗原（例えば、高度にグリコシル化されたＭＵＣ−１）、発癌性ウイルス遺伝子（例えば、乳頭腫ウイルスの早期抗原）および他の種々のものが挙げられる。腫瘍細胞の認識および排除において作用する機構に関しては、Ｔリンパ球が腫瘍拒絶への特異性の付与において重要な役割を果たすことが分かっている。特に、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、特異的腫瘍抗原を認識するための重要なエフェクター細胞であることが確認されている。ＣＴＬは、腫瘍抗原に前感作された後初めて、かつ、ＭＨＣクラスＩ遺伝子産物によってそれが細胞表面に提示される場合にだけ、腫瘍を死滅させ得る。多くの場合、抗腫瘍反応の誘導は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在にも依存している。このような特異的免疫エフェクター細胞である他、ＮＫ細胞、および抗原に依存せず、かつ、ＭＨＣに限定されない方法で腫瘍細胞を溶解し得る、ＮＫＴおよびマクロファージのような他の非特異的エフェクター細胞の腫瘍拒絶においてもその役割が確認された。

腫瘍関連抗原の大部分が患者の免疫系と豊富な殺腫瘍免疫機構により異物として認識され得るという事実に関わらず、ほとんどの癌は悪性細胞の増殖を制御するのに十分な免疫応答を引き起こさない。腫瘍細胞は、腫瘍細胞による抗原提示の減退によるか、または患者の免疫性の全身的な低下によりそれらが宿主免疫から免れるいくつかの機構を発達させている。ＣＴＬによる異種抗原の認識には細胞表面でのＭＨＣクラスＩ決定基の発現が必須であるため、ＭＨＣクラスＩ抗原の発現抑制または不全が、腫瘍細胞が免疫系を回避するために利用する、報告されている機構の１つである(Tanaka et al., 1988, Ann. Rev. Immunol. 6, 359-380)。免疫アネルギーのもう１つの機構は、腫瘍抗原の脱落を伴い、その結果として、免疫細胞の腫瘍標的細胞自体との相互作用を妨げる。さらに、腫瘍は免疫抑制分子を活性化して、腫瘍抗原に対する免疫応答の強度を弱め得るか、または免疫エフェクター細胞のアポトーシスを促進し得る。例えば、ある状況では、ＩＬ−２が末梢寛容の維持において重要な役割を有している可能性がある。活性化誘発性細胞死（ＡＩＣＤ）におけるその極めて重要な役割により、ＩＬ−２を含有する腫瘍ワクチンを受けて生じたＴ細胞は、腫瘍細胞を自己として解釈し、腫瘍反応性Ｔ細胞はＡＩＣＤ誘導性アポトーシスによって死滅に至ることがある(Lenardo, 1996, J. Exp. Med. 183, 721-724)。さらに、ＩＬ−２は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋陰性制御性Ｔ細胞を維持し、ＣＤ８^＋記憶Ｔ細胞の存続を終わらせることが報告されている(Shevach, 2000, Ann. Rev. Immunol. 18, 423-449)。

数多くの研究により、免疫療法エフェクター機構の増強における腫瘍特異的ＣＤ４（＋）細胞の重要な役割が報告されている。しかしながら、このようなＣＤ４（＋）Ｔ細胞の慢性刺激は、多くの場合、ＦａｓおよびＦａｓリガンド両方のアップレギュレーションを引き起こし、これらの分子の同時発現によって活性化誘発性細胞死（ＡＩＣＤ）が起こり、その後に抗腫瘍反応の消失をもたらす可能性がある。これに対し、ＡＩＣＤ耐性は、Ｔ細胞エフェクター活性を大幅に高める(Saff et al. 2004, J. Immunol. 172, 6598-6606)。

数多くのこれまでのアプローチでは、サイトカインを使用して、宿主の免疫性を高め、その結果として、腫瘍による免疫アネルギー状態を克服した。例えば、ヒトＩＬ−２（プロリュウキン）は、進行期転移性癌の認可済み治療薬である。しかしながら、サイトカインの全身投与は、患者には耐えにくいことが多く、しばしば、悪心、骨痛および発熱をはじめとする数多くの副作用を伴う(Mire-Sluis, 1993, TIBTech vol. 11; Moore, 1991, Ann Rev Immunol. 9, 159-191)。これらの問題は、有効な血漿濃度の維持に必要な用量レベルによって悪化する。ウイルスベクターおよび細胞ビヒクルを用いたサイトカインの送達により、全身毒性が低減することが提示されている。

種々のサイトカインを放出する、遺伝子操作腫瘍細胞が、腫瘍免疫原性を高め、既存腫瘍の退縮を引き起こすことが証明されている。ＩＬ−２(Karp et al., 1993, J. Immunol. 150, 896-908)、αインターフェロン（ＩＦＮａ）(Porgador et al., 1993, J. Immunol. 150, 1458-1470)またはＧＭ−ＣＳＦ(Dranoff et al., 1993, PNAS 90, 3539-3543)を分泌するよう改変された腫瘍細胞による免疫が、腫瘍免疫原性を高め、既存腫瘍の退縮を引き起こすことが証明されている。場合によっては、免疫学的記憶が形成されており、操作していない親腫瘍細胞によるその後の攻撃に耐える。さらに、サイトカイン遺伝子導入腫瘍は、in vivoで、一般に、動物モデルにおいて腫瘍の崩壊をもたらす炎症性滲出液を取り込み得る。サイトカインを分泌する腫瘍細胞で処置した、確立された新生物を有する実験動物および少数の患者は、ほとんどの場合、最終的には腫瘍増殖が再び起こるが、長期間生き延びた。

Ｔ細胞エピトープの提示を増強する目的で、または腫瘍特異的Ｔリンパ球の活性化を強化する目的で、種々のサイトカインおよびケモカインをコードする遺伝子を有するベクターの固形腫瘍への直接注射も試みられた。γインターフェロン（ＩＦＮ−ｇ）、ＩＬ−２(Slos et al., 2001, Cancer Gene Ther. 8, 321-332)、ＩＬ−７(Miller et al., 2000, Human Gene Therapy 11(1), 53-65; Sharma et al., 1996, Cancer Gene Therapy 3, 302-313)、ＩＬ−１２(Melero et al., 2001, Trends Immunol. 22, 113-115)、ＩＬ−１５(Suzuki et al., 2001, J. Leukoc. Biol. 69, 531-537; Kimura et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29, 1532-1542)、ＩＬ−１８(Cao et al., 1999, FASEB J. 13, 2195-2202)およびＩＬ−２１(Ugai et al., 2003, Cancer Gene Therapy 10, 187-192)をはじめとする多くのサイトカインは、マウスにおいて著しい抗腫瘍活性を示した。例えば、ＩＬ−７を発現するアデノウイルスにより形質導入された樹状細胞の腫瘍内注射により、ネズミ肺癌モデルにおいて著しい全身免疫応答が誘導され、強力な抗腫瘍効果がもたらされた(Miller et al., 2000, Hum Gene Ther. 11, 53-65)。

最近になって、マウス腫瘍モデルおよびヒト腫瘍モデルに関する多くの研究で、最適免疫応答の発生におけるサイトカインの組合せの重要性が示された(例えば、Putzer et al., 1997, Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 10889-10894; Melero et al., 2001, Trends Immunol. 22, 113-115; Zhu et al., 2001, Cancer Res. 61, 3725-3734参照)。例えば、ＩＬ−１２とＴｈ１誘導型ＩＬ−１８との組合せが細胞性免疫応答の刺激に有用であることが分かった(Hashimoto et al., 1999, J. Immunol. 163, 583-589; Barbulescu et al., 1998, J. Immunol. 160, 3642-3647)。ＩＬ−２とＩＦＮｇは、腫瘍細胞増殖を阻害すべく協力することが証明されている（米国特許第５，０８２，６５８号）。最近になって、ＩＬ−２１がヒトＮＫ細胞およびＴ細胞におけるＩＦＮｇの増産においてＩＬ−１５またはＩＬ−１８の効果に相乗作用を与えることが記載された(Strengell et al., 2003, J. Immunol., 170, 5464-5469)。ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦの組合せは、ＤＣの刺激において特に有用である(Palucka et al., 1998, J. Immunol. 160, 4587-4595)。他の研究では、ＩＬ−３とＩＬ−１１の組合せがＩＬ−１２と合わさり、初期造血前駆細胞の増殖への相乗作用を示すことが見出された(Trinchieri et al., 1994, Blood 84, 4008-4027)。Grahamらは、２つのアデノウイルスの組合せ、ＩＬ−２をコードするものと他のＩＬ−１２をコードするもう１つのものを開発した(Addison et al., 1998, Gene Ther. 5, 1400-1409)。彼らによって、確立された乳癌の６０％を超えるもので全な退縮と強力な抗腫瘍ＣＴＬ活性の誘導が観察された。最近のデータにより、ヒト肺癌細胞の二重トランスフェクション後、ＩＬ−１５がＩＬ−１２に相乗作用を与え得ることも示されている(Di Carlo et al., 2000, J. Immunol. 165, 3111-3118)。また、ＩＬ−１８はＩＦＮｇの強力なインデューサーであることも確認され、重要なことには、ＩＬ−１８はＩＬ−１２受容体の発現をアップレギュレートする(Nakanishi et al., 2001, Ann. Rev. Immunol. 19, 423-474)。報告されている免疫抗原性が低い腫瘍（ＭＣＡ２０５）では、主としてＮＫ細胞によって媒介される抗腫瘍効果に関し、はっきりとした相乗効果がこれら２つのサイトカイン間に認められた。

しかしながら、これらの研究の多くでは、各サイトカインの相対レベルが極めて重要であることが判明した。例えば、マウスにおける抗腫瘍反応の発生に関するＩＬ−１２と他のサイトカイン間の相乗効果研究では、結論が一致しなかった。最適量より低いＩＬ−２の存在下でＩＬ−１２を添加した場合には、誘導、増殖、細胞溶解活性およびＩＦＮｇ誘導において相乗効果がもたらされたが、一方のサイトカインを高用量で用いたＩＬ−２とＩＬ−１２の組合せでは、拮抗性を示すことが判明した(Perussia et al., 1992, J Immunol. 149, 3495-3502; Mehrotra et al., 1993, J Immunol. 151, 2444-2452)。一部のモデルでは、一方のサイトカインに対してもう一方のものが非最適用量である場合には、毒性が高まることとなり、他のモデルでは、ＩＬ−１２とＩＬ−２の組合せによって、ほとんどまたは全く相乗効果を示さなかった(例えば、Nastala et al., 1994, J. Immunol. 153, 1697-1706)。ＩＬ−１２とＩＬ−７の組合せでも同様の状況が起こる。これらの結果は、特に、異なる薬理学的特性、例えば、異なる循環半減期および生体内分布を有する２つの成分の活性比を一定に維持することが必要である場合には、相乗作用する可能性のある２つのサイトカインをin vivoで組み合わせることが難しいということを示している。

サイトカイン組合せに内在する困難を減らすための１つの戦略が、サイトカインの融合である。２つのサイトカインの融合については、すでに文献で提示されている。例えば、ＷＯ０１／１０９１２は、ＩＬ−１２自身の薬物動態挙動と同様の長い薬物動態挙動を提供することを目的とした、ＩＬ−１２と半減期の短い第２のサイトカインとの融合を記載している。特に、ＩＬ−１２とＩＬ−２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはＩＬ−４のいずれかとの融合が開示されている。米国特許第５，８８３，３２０号およびＷＯ９２／０４４５５は、造血細胞のレベル低下を伴う疾患の治療において使用し得る、ＩＬ−３と第２のサイトカインとの融合を開示している。ＩＬ−３とＩＬ−１１との融合は、巨核球および血小板の産生を促すのに有用であることが分かった。Drexler et al. (1998, Leuk Lymphoma 29, 119-128)は、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３の融合を記載している。最後に、米国特許第６，２６１，５５０号は、血液生成を増進する、例えば、癌患者における化学療法または放射線療法が原因で起こる造血欠損を補償することを目的とした、Ｇ−ＣＳＦのサイトカインとの融合を構想している。

ヒト腫瘍に対して有効な分子の開発は、念願の目標であり、まだ実現されていない。以上のことを踏まえて、免疫応答を引き起こし、腫瘍免疫抑制を回避し得るサイトカイン融合物の必要性が残る。

このような技術上の問題は、特許請求の範囲において定義される態様を提供することによって解決される。

本発明は、宿主生物体において免疫応答、特に、特異的免疫応答と非特異的免疫応答を増強するのに有用である新規融合タンパク質を提供する。結果として生じる応答は、病原体または癌細胞によって誘導される免疫抑制またはアネルギー機構を無効にするのに有用である。これらの融合タンパク質またはそれらを発現するベクターは、急性もしくは慢性感染または癌のような種々の臨床症状から動物またはヒトを防御するのに使用され得る。本発明は、それらをコードするアデノウイルスベクターの種々の動物モデルへの腫瘍内送達後に高い腫瘍拒絶率を提供する融合タンパク質を示し、重要な免疫刺激についての証拠を提供する。本発明によれば、これらの融合タンパク質またはそれらのコード配列は、ヒトおよび他の哺乳動物における癌または感染症の予防および治療において、免疫アジュバントとして（例えば、１以上の免疫原と組み合わせて）ワクチン技術にも使用し得るし、または自殺遺伝子アプローチと組み合わせても使用し得る。

よって、第１の態様において、本発明は、下記式を有する新規融合タンパク質を提供する：
（ａ）Ｘ−Ｙ、または
（ｂ）Ｙ−Ｘ
［式中、
Ｘは第１の免疫調節ポリペプチドを表し、
Ｙは第２の免疫調節ポリペプチドを表し、かつ、
ＸはＹと異なる］。

融合タンパク質をコードするアデノウイルスベクターを作製するための構築工程の概略図を例示する。Ｔ細胞共刺激の測定によるＩＬ−２含有融合タンパク質の機能性のin vitroでの評価を例示する。「Ｓｐｌｅｎｏ」は脾細胞を表し、「ＣｏｎＡ」はコンカナバリンＡにより活性化した脾細胞を表し、「抗ＣＤ３」はネズミＣＤ３特異的抗体により活性化した脾細胞を表し、そして、「１／２」および「１／１０」はこのアッセイに使用したウイルス上清の希釈度を表す。「エンプティーＡｄ」は融合物をコードする配列を含有していない陰性対照を表す。プロＢ−２Ｅ８リンパ芽球細胞増殖の測定によるＩＬ−７含有融合タンパク質の機能性のin vitroでの評価を例示する。「ｒＭｕＩＬ−７」は組換えネズミＩＬ−７（１〜５００ｎｇ／ｍｌ）を表し、「ｐ」は純粋なウイルス上清を表し、そして、「１／２」および「１／１０」はこのアッセイに使用したウイルス上清の希釈度を表す。ＣｏｎＡで予め活性化したネズミ脾細胞（コンカナバリンＡ１０μｇ／ｍｌ；２４時間）によるＩＦＮ−ｇ分泌誘導の測定によるＩＬ−１８含有融合タンパク質の機能性のin vitroでの評価を例示する。ＩＦＮ−ｇの産生はＥＬＩＳＡ法により評価される。「１／２０」および「１／５０」はこのアッセイに使用したウイルス上清の希釈度を表す。ここでのＩＬ−１８はプロＩＬ−１８を表す。脾細胞のin vitroでの活性化を例示する。ＣｏｎＡ活性化（１０μｇ／ｍｌ）または非活性化脾細胞における、２０ｎｇ／ｍｌのｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）、ｍＩＬ−２＋ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の組合せ、ｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８（Ａｄ−ｍＩＬ−２／ＩＬ−１８）、ｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）（Ａｄ−ｍＩＬ−２／ＩＬ−１８^＊）、ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８およびｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を含有するＡ５４９上清によるＩＦＮｇ分泌誘導の解析。陰性対照として、対照ウイルスに感染したＡ５４９細胞の上清を使用した。これらの結果は、同様の結果を示した異なる３試験のものである。ＩＬ−１８^＊はＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を表す。融合サイトカインの全身毒性および細胞傷害性のin vivoでの解析を例示する。マウスの、２．１０^９ｉｕのエンプティーＡｄ（ａ）、Ａｄ−ｍＩＬ−２（ｂ）、Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）（ｃ）、Ａｄ−ｍＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の組合せ（ｂ＋ｃ）、Ａｄ−ｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）（ｄ）およびＡｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）（ｅ）でのｉ．ｖ．処置により誘発されたＶＬＳ症候群の評価。ＭＶＡ−Ｅ７との併用でのＡｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の免疫アジュバント効果を例示する。前述のとおり、^＊は突然変異（Ｋ８９Ａ）を表す。ＭＶＡ−ＦＣＵ１との併用でのＡｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の免疫アジュバント効果を例示する。前述のとおり、^＊は突然変異（Ｋ８９Ａ）を表す。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスにおけるＩＬ−１５含有融合物を発現するＡｄの３回の腫瘍内注射後の抗腫瘍活性を例示する。Ｇ１は導入遺伝子を発現しないＡｄベクターでの処置であり（Ａｄエンプティー）、Ｇ２はそのＮ末端にＩＬ−２シグナルペプチドを備えた成熟ネズミＩＬ−１５サイトカインを発現するＡｄベクターでの処置であり（Ａｄ−ｍＩＬ−１５）、Ｇ６はそのＮ末端にＩＬ−２シグナルペプチドを備えた成熟ネズミＩＬ−１５サイトカインとネズミＩＬ−７の融合物を発現するＡｄベクターでの処置である（Ａｄ−ｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−７）。Ｇ７はネズミＩＬ−２１サイトカインと成熟ネズミＩＬ−１５の融合物を発現するＡｄベクターでの処置である（Ａｄ−ｍＩＬ−２１／ｍＩＬ−１５）。Ｇ１０はそのＮ末端にＩＬ−２シグナルペプチドを備えた成熟ネズミＩＬ−１５サイトカインとネズミプロＩＬ−１８変異体Ｋ８９Ａの融合物を発現するＡｄベクターでの処置である（Ａｄ−ｍＩＬ−１５／プロＩＬ−１８^＊）。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスにおける新規改良型ＩＬ−１５をコードするアデノウイルスの腫瘍内注射を示す。Ｇ１は導入遺伝子を発現しないＡｄベクターでの処置であり（Ａｄ参照）、Ｇ２はそのＮ末端にＩＬ−２シグナルペプチドを備えた成熟ネズミＩＬ−１５サイトカインを発現するＡｄベクターでの処置である（Ａｄ−ｍＩＬ−１５またはＡｄ−ｓｐｉｌ２−ＩＬ−１５）。Ｇ３はそのＮ末端にＩｇＧκ軽鎖シグナルペプチドを備えた成熟ネズミＩＬ−１５サイトカインを発現するＡｄベクターでの処置である（Ａｄ−ｓｐｖＫＬ−ＩＬ−１５）。Ｇ４は内因性長鎖型シグナルペプチドを備えた成熟ネズミＩＬ−１５サイトカインを発現するＡｄベクターでの処置である（Ａｄ−ｓｐＬＳＰ−ＩＬ−１５）。Ｇ５は内因性短鎖型シグナルペプチドとスプライスを備えた成熟ネズミＩＬ−１５サイトカインを発現するＡｄベクターでの処置である（Ａｄ−ｓｐＬＳＰ−ＩＬ−１５スプライス）。

発明の具体的説明

出願全体を通じて本明細書において使用する「１つの」とは、特に断りのない限り、それが「少なくとも１つの」、「少なくとも最初の」、「１以上の」または「複数の」記載の化合物または工程を意味するという意味で用いる。例えば、「１つの細胞」とは、その混合物を含む複数の細胞を含む。

「および／または」とは、本明細書のどこで使用されようとも、「および」、「または」および「前記用語で結ばれた要素の総てまたは他のあらゆる組合せ」という意味を含む。

本明細書において「約」または「およそ」とは、指定した値または範囲の２０％以内、好ましくは、１０％以内、より好ましくは、５％以内を意味する。

本明細書において、産物、組成物および方法の定義に使用する際の、「含んでなる」とは、その産物、組成物および方法が記載の成分または工程を含み、他のものを除外することではないことを意味するものとする。「から本質的になる」とは、本質的に重要なもの以外の成分または工程を除外することを意味するものである。よって、列挙した成分から本質的になる組成物は、微量混入物質や医薬上許容される担体を除外するものではない。「からなる」とは、他の成分または工程の微量ではない要素を除外することを意味するものである。

「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、本明細書において互換的に、あらゆる長さのアミノ酸、好ましくは、少なくとも５０アミノ酸残基の重合体を指すために用いる。重合体は、直鎖または分枝重合体であってよく、改変アミノ酸を含んでなってよく、非アミノ酸が介在していてもよい。この用語は、部分的置換もしくは付加によるか、または当技術分野では周知の化学修飾技術により１以上のアミノ酸残基において改変されているアミノ酸重合体も包含する。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、水酸化、ヨウ素化、メチル化、アセチル化、アシル化、γカルボキシル化、リン酸化、タンパク質分解プロセシングまたは検出可能な部分（すなわち、シンチグラフィー用標識、放射性標識、蛍光標識または色素標識など）とのコンジュゲーションもしくは結合のような他のいずれの操作も本発明の範囲内に含まれる。好適な放射性標識としては、限定されるものではないが、^９９ｍＴｃ、^１２３Ｉおよび^１１１Ｉｎが挙げられる。本発明において、「アミノ酸」および「残基」とは、同義語である。それらは、ＤまたはＬ光学異性体、改変アミノ酸およびアミノ酸類似体を含む天然、非天然および／または合成アミノ酸を包含する。

本明細書において「融合」または「融合タンパク質」または「融合サイトカイン」とは、１ポリペプチド鎖における、好ましくは、対応するヌクレオチドコード配列のインフレーム融合による第１のポリペプチドのアミノ酸配列と第２のポリペプチドのアミノ酸配列の組合せを指す。本発明の融合タンパク質において結び付けられるＸ構成要素とＹ構成要素は、通常、自然界において、別々のタンパク質に存在するものである。本発明の融合タンパク質において、第１のポリペプチドのコード配列（Ｘ）は、第２のポリペプチドのコード配列（Ｙ）とインフレームで、直接またはリンカーを介して融合される。「インフレームで融合される」とは、融合されたコード配列の発現によって、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドの両方を含んでなる融合タンパク質が生じることを意味する。これは、例えば、ＸポリペプチドとＹポリペプチドのリーディングフレーム間に翻訳終止配列が存在しないことを意味する。たとえＸ構成要素とＹ構成要素との融合が内部のどの部位でも起こり得るとしても、Ｙ構成要素は、好ましくは、Ｘ構成要素のＣＯＯＨまたはＮＨ２末端のいずれかと融合される（その結果、それぞれ、式Ｘ−ＹおよびＹ−Ｘの融合物が生じる）。本明細書において、「直接に」とは、ペプチドリンカーを介してないポリペプチドＸとＹの融合物を指す（すなわち、Ｘ構成要素をコードするコドンがＹ構成要素をコードするコドンに隣接している）。さらに、融合タンパク質は、Ｘ、Ｙおよびリンカーとは別の、イニシエーターメチオニン、シグナルペプチドおよび／またはプロペプチドのようなさらなる要素も含み得る。ＸおよびＹ、所望により、リンカーから本質的になるまたはからなる融合タンパク質は、本発明において好ましい態様である。

本明細書において「免疫調節ポリペプチド」とは、動物またはヒト生物体において免疫応答を調節し得るポリペプチドを指す。「免疫応答の調節」とは、免疫応答に関与する免疫エフェクター細胞またはメディエーター分子の活性を調整することを指す。「調節する」とは、免疫応答の増強または減弱を指し得るが、特に増強を指す。本明細書において「増強」とは、１以上の免疫エフェクター細胞の活性化、分化、成熟および／もしくは増殖を誘導し、かつ／または好適な免疫メディエーターの産生を誘導し、かつ／または抗原提示の増加をもたらし、かつ／または臨床的利益の発現（例えば、腫瘍増殖の阻害、腫瘍退縮）をもたらす免疫応答の発生を誘導し、かつ／またはその大きさおよびその期間を調整することを指す。免疫応答の調節は、当技術分野で公知の方法、ならびに本明細書において開示されている方法を用いて判定することができる。

本発明の融合タンパク質は、その融合タンパク質の添加によって認められる免疫応答（特異的免疫応答、非特異的免疫応答を問わず）が、その添加を行わないで測定した同じ免疫応答と比べて大きいか、または多少なりとも強化されているときに免疫応答を「増強する」。好ましくは、本発明の融合タンパク質によって提供される免疫応答の増強により病状の改善がもたらされる。本発明の融合ポリペプチドの免疫応答増強能力は、当技術分野で標準的な種々のアッセイを使用してin vitroまたはin vivo のいずれかで評価することができる。免疫応答（特異的免疫応答、非特異的免疫応答を問わず）の発生および活性化を評価するのに利用可能な技術の概要については、例えば、Coligan et al.(引用することにより本明細書の一部とされる、1992および1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health)参照。本発明の融合タンパク質の試験および検証については、添付の実施例節でも示している。好適なアッセイとしては、限定されるものではないが、特定のタイプの免疫エフェクター細胞の活性化状態の判定、このような細胞の増殖速度、細胞表面マーカーの定量、好適な腫瘍または標的細胞への免疫エフェクター細胞の溶解活性、活性化されたエフェクター細胞により分泌されたサイトカイン発現プロフィールの測定が挙げられる。免疫応答の評価を行うのに好適な方法は一般的であり、これらの方法としては、とりわけ、ＥＬＩＳＡ法、免疫蛍光測定法、ウエスタンブロッティング法、免疫組織化学、組織学、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法が挙げられる。例えば、Ｔ細胞増殖は、例えば、古典的な［^３Ｈ］チミジン取り込みアッセイによって測定することができる。もう１つの例として、融合タンパク質を使用した場合と使用しない場合の細胞傷害性Ｔ細胞の溶解活性を、例えば、^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して測定してもよい。ナイーブ免疫エフェクター細胞と活性化された免疫エフェクター細胞とは、特異的細胞表面マーカーの同定によっても識別することができる。例えば、未熟またはナイーブＴ細胞は、それらのＴ細胞の、ＣＤ４５ＲＡとして知られる高分子量イソ型ＣＤ４５分子の発現によって同定され得る。成熟Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯとして知られる低分子量イソ型ＣＤ４５を発現する。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＭＨＣII−Ｉａｂのアップレギュレーションは、樹状細胞の成熟を反映している。ＣＤ８の存在が、活性化されたＣＴＬのマーカーとなる。他の有益なマーカー種またはこれらの免疫細胞の成熟／活性化状態は、当技術分野で公知である。適切には、好適な動物モデルで候補融合タンパク質を試験し、免疫応答の増強を反映するその抗腫瘍活性を評価してもよい。例えば、融合タンパク質を腫瘍動物モデルに投与し、その腫瘍増殖および／または生存率を定期的に対照との比較により評価する。腫瘍阻害を判定するためのin vivo方法の他、種々のin vitro方法を利用してin vivoでの腫瘍阻害を予測してもよい。代表的な例としては、例えば、^５１Ｃｒ放出アッセイにより測定されるリンパ球媒介性抗腫瘍細胞溶解活性、腫瘍依存性リンパ球増殖(Ioannides et al., 1991, J. Immunol. 146, 1700-1707)、in vitroでの腫瘍特異的抗体の作製(Herlyn et al., 1984, J. Immunol. Meth. 73, 157-167)、in vitroでの細胞増殖の細胞（例えば、ＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞）または体液（例えば、抗体）媒介性阻害(Gazit et al., 1992, Cancer Immunol. Immunother. 35; 135-144)および細胞前駆体頻度の測定(Vose, 1982, Int. J. Cancer 30, 135-142)が挙げられる。

好ましい態様では、本発明の融合タンパク質が、前記融合タンパク質を添加しない場合のその対応する免疫応答と比べて、少なくとも２倍、より好ましくは、少なくとも３倍の免疫応答の増強を提供する。

本発明に包含される融合タンパク質は、ＸおよびＹの特性によっても融合タンパク質に使用されるＸ構成要素数および／またはＹ構成要素数によっても制限されない。ＸポリペプチドとＹポリペプチドは異なっている、すなわち、互いに異種である。その違いは、構造面（例えば、それぞれのアミノ酸配列間の同一性は４０％未満）および／またはそれぞれの生物活性面（例えば、ＸおよびＹは免疫系の異なる経路に関与する）にあり得る。本発明の融合タンパク質に関与するＸ構成要素とＹ構成要素は、個々に、ヒトまたは動物起源（例えば、イヌ、鳥類、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、ネコ、サルなど）に由来し（から得られ、から単離され）得る。融合タンパク質は、異なる起源のＸ構成要素とＹ構成要素（例えば、ヒト起源のＸと動物起源のＹ）を含んでなってもよい。

好ましい態様では、Ｘは、特異的免疫応答を増強し得る免疫調節ポリペプチドを表し、一方、Ｙは、非特異的免疫応答を増強し得る免疫調節ポリペプチドを表す。

好ましい態様によれば、上記式のＸ免疫調節ポリペプチドおよびＹ免疫調節ポリペプチドは、各々、サイトカインを表す。本明細書において、「サイトカイン」とは、一般に、特異的および／または非特異的である免疫のメディエーターとしての役割を果たすポリペプチドを指す。当然のことではあるが、本発明は、宿主細胞または生物体において免疫応答を誘導し得るか、または増強し得、その結果として、腫瘍または感染細胞によって発達した免疫アネルギーの少なくとも１つの機構を低下させるか、または抑制して、宿主免疫から免れさせる「多機能性」融合サイトカインを提供することを目的とする。

本発明の一般目標に従って、Ｘは、好ましくは、非特異的（先天性）免疫応答、特に、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞からなる群から選択される１以上のエフェクター細胞によって媒介される免疫応答を増強し得るサイトカインを表す。Ｙは、好ましくは、特異的（適応的）免疫、特に、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球のようなエフェクター細胞（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）によって媒介される免疫応答を増強し得るサイトカインを表す。

Ｘおよび／またはＹの定義によって含まれるサイトカインの非排他的リストとしては、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、ケモカイン、腫瘍壊死因子受容体リガンド（例えば、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ）、ＫＩＲ（死滅抑制性受容体）リガンド、ＫＡＲ（死滅活性化受容体）リガンド（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３４６５９５にて開示されているＲＡＥ−１およびＨ６０；例えば、Diefenbach et al., 2001, Nature 413、165-171; Diefenbach et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33、381-391参照）、ＩＲＦ（ＩＦＮ制御因子）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００１５７１にて開示されているＩＲＦ−３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５３８３０にて開示されているＩＲＦ−７またはそのキメラ；例えば、Au et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11657-11661; Zhang and Pagano, 1997, Mol. Cell Biol. 17, 5748-5757; Nguyen, et al., 1997, Cytokine Growth Factor Rev. 8, 293-312; Duguay et al., 2002、Cancer Res. 62, 5148-5152; Sharma et al., 2003, Science 300, 1148-1151; Bramson et al., 2003, Vaccine 21, 1363-1370参照）およびＢ細胞刺激因子が挙げられる。ＸおよびＹとしては、独立に、限定されるものではないが、サイトカインの前駆体、成熟形態、変異体が挙げられ得る。好適なサイトカインとしては、限定されるものではないが、ＩＬ−１〜ＩＬ−３１、ならびにＩＦＮα〜γが挙げられる。当然のことではあるが、これらのサイトカインおよび特定の培地におけるそれらのレベルを定量するのに利用可能方法は、Oppenheim et al.(2001, Cytokine Reference; A compendium of cytokines and other mediators of host defense; Eds Durum et al. Academic Press)のような基本テキストに記載されている。好ましい融合タンパク質は、ＸおよびＹが、独立に、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１またはＩＦＮｇである融合タンパク質である。好ましくは、ＸがＩＬ−２である場合にはＹがＧＭ−ＣＳＦではなく、かつ、ＸがＩＬ−１２である場合にはＹがＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４ではない。

ＩＬ−２は、特異的免疫においても非特異的免疫においても作用する多面的サイトカインである。２０年以上にわたる研究によって、ＩＬ−２がＴ細胞の強力な増殖および分化因子であることが確立された。ＩＬ−２は、ＮＫ細胞(Caligiuri et al., 1990, J. Exp. Med. 171, 1509-1526)およびいわゆるリンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）細胞(Pawelec et al., 1999, Crit Rev Oncog. 10, 83-127)の細胞溶解活性も促す。ＩＬ−２は、ＩＦＮ−ｇをはじめとする他のサイトカインの分泌を促進する(Trinchieri et al., 1984, J. Exp. Med. 160, 1147-1169)。ＩＬ−２は、強力なＢ細胞増殖因子活性も示し、単球系細胞も刺激し得る。ＩＬ−２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含む抗原により活性化されたＴリンパ球によってのみ産生されると思われる。ＩＬ−２は、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）と結合することによりその生物活性を媒介する。そのＩＬ−２受容体は、抗原により活性化されたＴ細胞で一時的に発現され、続けてＮＫ細胞によって発現される。成熟ヒトＩＬ−２タンパク質は、１３３個のアミノ酸で構成されている(Taniguchi et al., 1983, Nature 302、305-310)。この成熟タンパク質は、２０残基の疎水性リーダー配列（シグナルペプチド）を有する１５３個のアミノ酸を含有する前駆体として合成され、その２０残基の疎水性リーダー配列が分泌前または分泌中に切断されて成熟タンパク質が産生する。ＩＬ−２のアミノ酸およびヌクレオチド配列については、現在、３１種由来のものがすでに分かっている。例えば、ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋにおいて受託番号Ｐ０１５８５を受けたヒトＩＬ−２タンパク質の配列。Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００８３６６およびＮＭ０００５８６は、それぞれ、マウスおよびヒトＩＬ−２遺伝子配列を記載している（総ての受託番号が引用することにより本明細書の一部とされる）。

ＩＬ−７は、Ｔ細胞およびＢ細胞の発生において欠くことのできない役割を果たす。ＩＬ−７は、これらの細胞の分化においてもある役割を果たす。ＩＬ−７は、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞の増殖を促し、成熟Ｔ細胞の生存および増殖に影響を及ぼし、細胞溶解性Ｔ細胞およびそれらの前駆体の増殖およびエフェクター機能を促進する。さらに、ＩＬ−７は、末梢血のＬＡＫ細胞活性を増強し、単球およびマクロファージの抗腫瘍活性を促し得る。ＩＬ−７は、マクロファージおよび腫瘍のＴＧＦβ産生もダウンレギュレートし、その結果として、腫瘍による免疫アネルギーを制限する働きもし得る(Dubinett et al., 1993, J. Immunol. 151, 6670-6680; Miller et al., 1993, Blood 82, 3686-3694)。ＩＬ−７は、一本鎖グリコシル化タンパク質であり、その大部分が上皮細胞、特に、ケラチノサイトおよび胸腺上皮細胞によって産生される。ヒトＩＬ−７ｃＤＮＡは、分泌プロセス中に成熟タンパク質から切断される２５個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む１７７個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する。ＩＬ−７のＤＮＡおよびアミノ酸配列については、現在、数多くの種由来のものがすでに分かっている（例えば、Namen et al., 1988, J. Exp. Med. 167, 988-1002; Namen et al., 1988, Nature, 333, 571-573; Conlon et al., 1989, Blood 74, 1368-1373参照）。例えば、ヒト、ウシおよびネズミＩＬ−７タンパク質の配列は、それぞれ、ＧｅｎＥＭＢＬにおいて受託番号ＮＰ０００８７１、ＣＡＡ４５８３８およびＣＡＡ３０７７９として開示されている。マウスＩＬ−７遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて受託番号ＮＭ００８３７１として入手可能である。ヒトＩＬ−７遺伝子のヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ０００８８０として入手可能である。ウシＩＬ−７遺伝子は、受託番号Ｘ６４５４０として開示されている（総ての受託番号が引用することにより本明細書の一部とされる）。ヒト（１５２個のアミノ酸）およびネズミ（１２７個のアミノ酸）ＩＬ−７は、タンパク質レベルにおいて６０％配列相同性を示すと考えられる。

ＩＬ−２と同様に、ＩＬ−１５は、特異的免疫においても非特異的免疫においても作用する多面的サイトカインである。ヒトＩＬ−１５ｃＤＮＡは、４８個のアミノ酸のリーダーペプチドと１１４個のアミノ酸の成熟タンパク質からなる１６２個のアミノ酸の前駆体をコードする(Grabstein et al., 1994, Science 264, 965-968)。ＩＬ−１５は、ＩＬ−２Ｒβおよびγ鎖と結合することを通じてその生物活性を発揮し、特異的なＩＬ−１５Ｒα鎖によって補強される(Giri et al., 1995, EMBO J. 14, 3654-3663)。受容体サブユニットのこのような共用が、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞で認められるＩＬ−２とＩＬ−１５の類似した機能活性の説明となるだろう。ＩＬ−１５は、ＩＬ−２と同様に、Ｔ細胞増殖因子として定義されている(Grabstein et al., 1994, Science 264, 965-968; Nishimura et al., 1996, J. Immunol. 156, 663-669)。ＩＬ−１５の最も重要な機能の１つは、ＮＫ細胞の発生、生存および活性化におけるその極めて重要な役割である。ＩＬ−１５によるＮＫ細胞の処置によって増殖および細胞傷害性の増強が起こり、ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦａおよびＧＭ−ＣＳＦの産生が生じる(Carson et al., 1994, J. Exp. Med. 180, 1395-1403)。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞における活性だけではなく、ＩＬ−２と同様に、活性化Ｂ細胞の増殖を共刺激する(Armitage et al., 1995, J. Immunol. 154, 483-490)。ＩＬ−１５は、ＣＤ４＋記憶細胞の発生と存続を促す（ＷＯ９８／３６７６８）。しかしながら、ＩＬ−１５とＩＬ−２の最も著しい違いは、それらの発現パターンにある。ＩＬ−２に対し、ＩＬ−１５ｍＲＮＡは、繊維芽細胞および上皮細胞のような種々の非リンパ系組織に広く分布する。他方では、ＩＬ−１５ｍＲＮＡは、主要なＩＬ−２供給源である静止または活性化Ｔ細胞には存在しない。Grabstein et al.(1994, Science 264, 965-968)は、ヒトＩＬ−１５についての配列の獲得に関する開示内容を提供して
いる。Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００８３５７およびＮＭ０００５８５は、それぞれマウスＩＬ−１５ヌクレオチド配列およびヒトＩＬ−１５ヌクレオチド配列を提供する。ＩＬ−１５アミノ酸配列に関するＧｅｎＥＭＢＬにおける受託番号は：ヒトタンパク質（Ｐ４０９３３）、ネズミタンパク質（Ｐ４８３４６）、ラットタンパク質（Ｐ９７６０４）およびウシタンパク質（Ｑ２８０２８）である（総ての受託番号が引用することにより本明細書の一部とされる）。

ＩＬ−１８は、最近発見された、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方において重大な免疫調節機能を有しているといわれているＴｈ１サイトカインである(Okamura et al., 1995, Nature 378, 88-91)。特に、ＩＬ−１８は、Ｔ細胞の増殖を増大させ、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強し、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方からのＧＭ−ＣＳＦの分泌を促し、ＩＦＮ−ｇ産生に関してＩＬ−１２に相乗作用を与える(Okamura et al., 1998, Curr Opin Immunol. 10, 259-264)。ＩＬ−１８は、生物学的に不活性な前駆体分子（プロＩＬ−１８）として合成される。活性型ＩＬ−１８を生じるには、プロ配列が細胞内システインプロテアーゼ、ＩＬ−１β変換酵素ＩＣＥによってＡｓｐ−Ｘプロセシング部位にて切断されなければならない。ＩＬ−１８は、一部のネズミ腫瘍系において腫瘍増殖を抑制し得るが、ＩＬ−１８遺伝子療法単独での定着腫瘍の退縮は立証されていない(Micallef et al., 1997, Cancer Immunol Immunother. 43, 361-367; Osaki et al., 1998, J Immunol. 160, 1742-1749; Osaki et al., 1999, Gene Ther. 6, 808-815; Hashimoto et al., 1999, J Immunol. 163, 583-589)。ＩＬ−１８分子のＤＮＡおよびタンパク質配列は公開されている（例えば、Okamura et al., 1995, Nature 378, 88-91; Ushio et al., 1996, J. Immunol., 156, 4274-4279参照；マウスＩＬ−１８ヌクレオチド配列およびヒトＩＬ−１８ヌクレオチド配列それぞれを記載しているＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００８３６０およびＮＭ００１５６２、ならびにヒトＩＬ−１８タンパク質に関するＮＰ＿００１５５３；総ての受託番号が引用することにより本明細書の一部とされる）。

ＩＬ−２１は、最近同定された、４本ヘリックスバンドル構造を有するサイトカインである(Parrish-Novak et al., 2000, Nature 408, 57-63)。このサイトカインおよびその受容体の発現および機能により、ＩＬ−２１がリンパ球分化において新たな役割を果たすことが示唆される。ＩＬ−２１が、あらゆる種類のリンパ球：Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞に強い影響を及ぼすことが分かった。ＩＬ−２１の最も興味深い生物活性の１つが、増殖とは関係なく、成熟ＮＫ細胞の細胞傷害性を実質的に増強することである。ＩＬ−２１分子のＤＮＡおよびタンパク質配列は、文献にて開示されている（例えば、Parrish-Novak et al., 2000, Nature 408, 57-63参照；マウスＩＬ−２１ヌクレオチド配列およびヒトＩＬ−２１ヌクレオチド配列それぞれを記載しているＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ０２１７８２およびＮＭ０２１８０３、ならびにヒトＩＬ−２１タンパク質に関するＮＰ＿０６５３８６；総ての受託番号が引用することにより本明細書の一部とされる）。

腫瘍免疫応答の調整において中心的な役割を果たすことが十分に認識されている１つのサイトカインがＩＦＮｇである。ＩＦＮｇは、主として活性化リンパ球により産生され、特異的免疫応答においてその活性を発揮する。これに関し、ＩＦＮ−ｇは、プロフェッショナル抗原提示細胞だけでなくノンプロフェッショナル抗原提示細胞においてもＭＨＣクラスＩ分子の発現を増大させる。ＩＦＮ−ｇは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の増殖および分化に関与する。Ｔヘルパー細胞によるＩＦＮｇの産生は、Ｔｈ１型表現型の特徴である。よって、ＩＦＮ−ｇの高レベル産生は、一般に、細胞内病原体からの宿主の効果的な防御と関係している。ＩＦＮｇは、その抗脈管形成作用と腫瘍から分泌された免疫抑制分子の発現をダウンレギュレートするその能力に基づき、抗腫瘍療法において重要である。ＩＦＮｇは、腫瘍免疫原性を高めることにより、最終的に、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球による腫瘍認識を高め、腫瘍拒絶に有利に働く(Beatty et al., 2001, Immunol Res. 24, 201-10)。ＩＦＮｇ分子のＤＮＡおよびタンパク質配列は、文献にて開示されている（例えば、Gray et al., 1982, Nature 295, 503-508; Gray et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5842-5846参照；マウスＩＦＮｇ遺伝子配列を記載しているＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｋ０００８３およびヒトＩＦＮｇ遺伝子配列を記載しているＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ０００６１９、ならびにヒトＩＦＮｇタンパク質に関するII０１５７９；総ての受託番号が引用することにより本明細書の一部とされる）。

本発明の好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、
（ａ）ＸがＩＬ−２であり、かつ、ＹがＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１およびＩＦＮ−ｇからなる群から選択される融合タンパク質；
（ｂ）ＸがＩＬ−１２であり、かつ、ＹがＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１からなる群から選択される融合タンパク質；
（ｃ）ＸがＩＬ−１５であり、かつ、ＹがＩＬ−７、ＩＬ−１８もしくはＩＬ−２１からなる群から選択される融合タンパク質；ならびに
（ｄ）ＸがＩＬ−１８であり、かつ、ＹがＩＬ−２１である融合タンパク質
である。

本発明において、本発明の融合タンパク質に使用されるＸ構成要素およびＹ構成要素は、あらゆる種から得られ（から単離され、またはに由来し）得る。天然型ヒトサイトカインまたは生物活性のある改変型ヒトサイトカインのいずれかを使用して得られる融合物が特に好ましい。ＩＬ−１２に関する場合、ＩＬ−１２は、３５ｋＤａサブユニットと４０ｋＤａサブユニットで構成されるヘテロ二量体タンパク質形態で存在する（この場合、Ｙ構成要素が３５ｋＤａサブユニットまたは４０ｋＤａサブユニットのいずれかと融合される）か、または３５ｋＤａサブユニットと４０ｋＤａサブユニットがともに一本鎖タンパク質として融合した単量体タンパク質形態（この場合、Ｙ構成要素が３５ｋＤａ−４０ｋＤａ融合物と融合される）で存在するとされているが、本発明においてはこの後者のものが好ましい。好ましくは、ＩＬ−１２構成要素（ｐ３５もしくはｐ４０またはｐ３５−ｐ４０一本鎖）は、本発明の融合タンパク質のＮ末端に配置される（例えば、ＩＬ−１２／ＩＬ−１５、ＩＬ−１２／ＩＬ−１８、ＩＬ−１２／ＩＬ−２１）。

本発明の融合タンパク質の最適活性を得るためには融合物の構造が重要であり得る。よって、本発明は、
（ａ）式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−７である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−７がＩＬ−２のＮＨ２末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−７／ＩＬ−２で示される）；
（ｂ）式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−１５である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−１５がＩＬ−２のＣＯＯＨ末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−２／ＩＬ−１５で示される）もしくは式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−１５である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−１５がＩＬ−２のＮＨ２末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−１５／ＩＬ−２で示される）；
（ｃ）式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−１８である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−１８がＩＬ−２のＣＯＯＨ末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−２／ＩＬ−１８で示される）；
（ｄ）式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−２１である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−２１がＩＬ−２のＮＨ２末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−２１／ＩＬ−２で示される）；
（ｅ）式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＦＮ−ｇである）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＦＮｇがＩＬ−２のＮＨ２末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＦＮｇ／ＩＬ−２で示される）；
（ｆ）式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−１５であり、かつ、ＹはＩＬ−７である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−１５がＩＬ−７のＮＨ２末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−１５／ＩＬ−７で示される）；
（ｇ）式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−１５であり、かつ、ＹはＩＬ−１８である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−１８がＩＬ−１５のＣＯＯＨ末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−１５／ＩＬ−１８で示される）もしくは式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−１５であり、かつ、ＹはＩＬ−１８である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−１８がＩＬ−１５のＮＨ２末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−１８／ＩＬ−１５で示される）；
（ｈ）式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−１５であり、かつ、ＹはＩＬ−２１である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−２１がＩＬ−１５のＣＯＯＨ末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−１５／ＩＬ−２１で示される）もしくは式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−１５であり、かつ、ＹはＩＬ−２１である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−２１がＩＬ−１５のＮＨ２末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−２１／ＩＬ−１５で示される）；または
（ｉ）式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−１８であり、かつ、ＹはＩＬ−２１である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−２１がＩＬ−１８のＣＯＯＨ末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−１８／ＩＬ−２１と示される）もしくは式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−１８であり、かつ、ＹはＩＬ−２１である）を有する融合タンパク質（すなわち、ここで、ＩＬ−２１がＩＬ−１８のＮＨ２末端と融合しており、この融合タンパク質はＩＬ−２１／ＩＬ−１８で示される）
を含んでなる、あるいはから本質的になる、あるいはからなる融合タンパク質を提供する。

以上に記載するように、本発明は、全長プレプロセシング形態だけでなく成熟プロセシング形態、その断片、ならびに、対立遺伝子変異体および非天然変異体を含む、Ｘ構成要素およびＹ構成要素のそれぞれ、またはそれらの両方の変異体を使用して得られる融合タンパク質を包含する。集団内に存在する可能性があるＸ構成要素および／またはＹ構成要素の天然対立遺伝子変異体の他、当業者ならばさらに、ランダム突然変異誘発または標的突然変異誘発を引き起こす古典的な技術または組換え技術を利用した突然変異により変化（すなわち、１以上の欠失、付加および／または１個以上のアミノ酸置換）を導入し得ることが分かるであろう。本発明での使用に好適な変異体は、その対応する天然型サイトカインのアミノ酸配列と高い相同性を有するアミノ酸配列を有していることが好ましい。１つの態様において、本発明の融合タンパク質に使用される変異型サイトカインのアミノ酸配列は、その対応する天然型配列と少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、好ましくは、少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９７％、さらに好ましくは、少なくとも約９９％同一である。

アミノ酸配列または核酸配列間の同一性％は、当業者に公知の標準的な方法を用いて決定することができる。例えば、２つのアミノ酸配列間の相同性％を決定するために、最適な比較が行えるようにそれらの配列をアラインする。次いで、対応するアミノ酸の位置に存在するアミノ酸残基を比較する。最適なアラインメントを行うために、一方または両方のアミノ酸配列にギャップを導入してもよく、比較では、非相同配列を無視してもよい。第１の配列のある位置に、第２の配列のその対応する位置と同じアミノ酸残基が存在している場合には、それらの配列はその位置において同一である。２つの配列間の同一性％は、最適なアラインメントを行うために導入する必要があるギャップ数と各ギャップの長さを考慮した、それらの配列に共通する同一の位置の数の関数である。配列の比較ならびに２つの配列間の同一性％および類似性％の決定は、数学アルゴリズムを用いて行うことができる（例えば、Computional Molecular Biology, 1988, Ed Lesk AM, Oxford University Press, New York; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, 1993, Ed Smith D. W., Academic Press, New York; Computer Analysis of Sequence Data, 1994, Eds Griffin A. M. and Griffin H. G., Human Press, New Jersey; Sequence Analysis Primer, 1991, Eds Griskov M. and Devereux J., Stockton Press, New York）。さらに、アミノ酸配列間および核酸配列間の同一性％を決定するためには、ＧＣＧ．ＴＭ．プログラム（Genetics Computer Group, Madison, Wis.から入手可能）、ＤＮＡｓｉｓ．ＴＭ．プログラム（Hitachi Software, San Bruno, Calif.から入手可能）またはＭａｃＶｅｃｔｏｒ．ＴＭ．プログラム（Eastman Kodak Company, New Haven, Conn.から入手可能）のような種々のコンピュータープログラムが利用可能である。

本発明での使用に好適なＸ構成要素および／またはＹ構成要素の変異体は、生物活性があり、かつ、その対応する天然型サイトカインに関して本明細書において記載する活性の少なくとも１つを有しているものである。その天然型サイトカインの特定の機能は、ある程度良い影響または悪い影響を受け得るが、治療効果（例えば、抗腫瘍活性、腫瘍による免疫アネルギーの回避）が維持されることが好ましく、例えば、細胞傷害性の減弱または生物活性の増強を示す変異体である。特定の機能に必須のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発法のような当技術分野で公知の方法により同定することができる。パートナー／基質（例えば、受容体）結合に重要なアミノ酸もまた、結晶化、核磁気共鳴および／または光学的親和性標識のような構造解析により決定することができる。得られた変異体は、以上で記載したもののようなアッセイにより生物活性について試験することができる。

例えば、ある種の機能的変異体では、１以上のアミノ酸残基が保存的に置換されている。「保存的アミノ酸置換」とは、その天然型ポリペプチドのアミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。類似側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当技術分野において定義されている（例えば、the Atlas of Protein Sequence and Structure, 1978, Vol. 5, ed. M. O. Dayhoff, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C.の図８４および８５のマトリックス参照）。一般に、置換が脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ間；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間；または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間で互いに行われるときに、その置換が保存的であると見なされる。また、もう１つの態様では、例えば、飽和突然変異誘発により、サイトカインコード配列の総てまたは一部に沿ってランダムに突然変異を導入し得る。その結果として生じた変異株を本明細書において記載するその生物活性についてスクリーニングして、少なくとも治療活性を有する変異株を同定してもよい。

本発明によれば、その対応する天然型ＩＬ−２と比べて細胞傷害性の減弱を示す変異型ＩＬ−２が特に重要である。好適な変異型ＩＬ−２としては、限定されるものではないが、欧州特許ＥＰ６７３２５７および米国特許第５，２２９，１０９号（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている、ヒトＩＬ−２の残基３３〜４６により形成されるＢαヘリックス内にアミノ酸置換を有するものが挙げられる。低毒性変異型ＩＬ−２の具体的な例としては、その天然型ＩＬ−２の４２位のフェニルアラニン残基がリジン残基で置換されている変異体Ｆ４２Ｋまたはその天然型ＩＬ−２の３８位のアルギニン残基がアラニン残基で置換されている変異体Ｒ３８Ａが挙げられる。本発明での使用に好適なさらなる変異型ＩＬ−２としては、ＷＯ９９／６０１２８に記載されているものやShanafelt et al.(2000, Nat Biotech 18, 1197-1202)により記載されているもの（引用することにより本明細書の一部とされる）も挙げられる。具体的な例としては、その天然型ＩＬ−２の２０位のアスパラギン酸残基がイソロイシン残基で置換されている変異体Ｄ２０Ｉ、その天然型ＩＬ−２の８８位のアスパラギン残基がグリシン残基で置換されている変異体Ｎ８８Ｇ、その天然型ＩＬ−２の８８位のアスパラギン残基がアルギニン残基で置換されている変異体Ｎ８８Ｒおよびその天然型ＩＬ−２の１２６位のグルタミン残基がメチオニン残基で置換されている変異体Ｑ１２６Ｍまたはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。本明細書において「〜位に」とは、各々の変異型サイトカインが、個々に引用されたその天然型サイトカインのその位置にあるものに対応する部位において突然変異しているという意味を包含する用語である。

本発明での使用に好適な変異型ＩＬ−１５としては、限定されるものではないが、ヒトＩＬ−１５遺伝子の遺伝的変異体、ならびにＩＬ−１５受容体のα鎖との結合を妨害する、１以上のアミノ酸残基において突然変異しているあらゆる変異型ＩＬ−１５に関するＷＯ０２／６３０４４に記載されているもの（例えば、Bernard et al.(2004, J. Biol. Chem. 279, 24313-22)によって記載されたもの、突然変異の位置がBernard et al.を基準として示され、＋１が成熟ＩＬ−１５の１番目の残基に相当する、変異体Ｌ４５Ｅ、Ｓ５１Ｄ、Ｌ５２Ｄ、Ｅ６４Ｋ、Ｎ６５ＫおよびＩ６８Ｄが特に好ましい）が挙げられる。

本発明において、その対応する天然型ＩＬ−１８と比べて生物活性の増強を示す変異型ＩＬ−１８が特に重要である。好適な変異型ＩＬ−１８としては、限定されるものではないが、Kim et al.(2002, J. Biol. Chem. 277, 10998-11003)およびKim et al.(2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3304-3309)により記載されているもの（引用することにより本明細書の一部とされる）、より詳細には、その天然型ＩＬ−１８の４２位のグルタミン酸残基がアラニン残基で置換されている変異体Ｅ４２Ａまたはその天然型ＩＬ−１８の８９位のリジン残基がアラニン残基で置換されている変異体Ｋ８９Ａ、あるいは両置換を組み合わせた変異体が挙げられる。好ましくは、本発明の融合タンパク質を含んでなるＩＬ−１８が、その天然型ＩＬ−１８の８９位のリジン残基がアラニン残基で置換されている突然変異型ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を含む。

さらに、以上に記載するように、本明細書においてＩＬ−１８とは、プロＩＬ−１８と成熟ＩＬ−１８の両方を包含する用語である。１つの態様および好ましい態様によれば、本発明に使用されるＩＬ−１８ポリペプチドは、特に、それが他のサイトカインパートナーのＮＨ２末端と融合している場合にはプロＩＬ−１８（すなわち、その内在性プロ配列を含んでなる）である。しかし、異種（ＩＬ−１８に対して）プロ配列を含んでなるＩＬ−１８構成要素（例えば、成熟ＩＬ−１８）の使用も想定され得る。もう１つの態様によれば、本発明に使用されるＩＬ−１８ポリペプチドは、特に、それが他のサイトカインパートナーのＣＯＯＨ末端と融合している場合にはそのプロ配列を有していない。

Ｘ構成要素とＹ構成要素は、本発明の融合タンパク質において直接融合され得るが、ＸとＹを結び付けるためにリンカーペプチドを使用することが好ましい。リンカーの目的は、Ｘ構成要素およびＹ構成要素各々を正確に構成し、折りたたみ、かつ／または機能させることである。リンカーは、目的を達成するのに十分にフレキシブルで、かつ、十分に長いものである必要がある。好ましくは、リンカーのコード配列は、それが翻訳停止を促し、その結果として、Ｘ構成要素とＹ構成要素の独立した折りたたみを促すように選択することができる。当業者であれば、本発明に従って好適なリンカーを設計することができる。しかしながら、本発明は、使用されるリンカー配列の形態、大きさまたは数によって限定されない。選択したリンカー配列の多数のコピーをＸおよびＹの間に挿入してもよい。リンカー配列に関する唯一の必要条件は、それが融合タンパク質の各構成要素の折りたたみおよび／または機能を機能的に不利に妨害しないことである。例えば、好適なリンカーは、５〜５０個アミノ酸長であり、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アラニンおよびプロリンのようなアミノ酸を含んでなってよい（例えば、Wiederrecht et al., 1988, Cell 54, 841; Dekker et al., 1993, Nature 362, 852; Sturm et al., 1988, Genes and Dev. 2, 1582; Aumailly et al., 1990 FEBS Lett. 262, 82参照）。セリンおよびグリシン残基を含んでなる繰り返し配列が、本発明において好ましい。好適なリンカーの具体な例は、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）の２または３以上（例えば、最大８）コピーで構成されているものである。本発明が、この特定のリンカーの使用に限定されないことは明らかである。

本発明はさらに、配列番号１〜１９で示したいずれかのアミノ酸配列の総てまたは一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％相同であるか、場合によっては、さらに高く、１００％相同である（同一である）アミノ酸配列を含んでなる、あるいはから本質的になる、あるいはからなる融合タンパク質を含む。

配列番号１で示した配列は、ヒトＩＬ７とヒトＩＬ−２の融合物に相当し、ヒトＩＬ−７がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１７７までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１７８からアミノ酸残基１９２までに及び、そして、ヒトＩＬ−２がアミノ酸残基１９３からアミノ酸残基３４５までに及んでいる。配列番号２で示した配列は、ネズミＩＬ７とネズミＩＬ−２の融合物に相当し、ネズミＩＬ−７がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１５４までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１５５からアミノ酸残基１６４までに及び、そして、ネズミＩＬ−２がアミノ酸残基１６５からアミノ酸残基３３３までに及んでいる。

配列番号３で示した配列は、ヒトＩＬ−２とヒトＩＬ−１５の融合物に相当し、ヒトＩＬ−２がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１５３までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１５４からアミノ酸残基１６８までに及び、そして、ヒトＩＬ−１５がアミノ酸残基１６９からアミノ酸残基３３０までに及んでいる。配列番号４で示した配列は、ヒトＩＬ−１５とヒトＩＬ−２の融合物に相当し、ヒトＩＬ−１５がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１６２までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１６３からアミノ酸残基１７７までに及び、そして、ヒトＩＬ−２がアミノ酸残基１７８からアミノ酸残基３３０までに及んでいる。配列番号５で示した配列は、ヒトＩＬ−２のシグナルペプチド、ヒトＩＬ−１５およびヒトＩＬ−２の融合物に相当し、ヒトＩＬ−２のシグナルペプチドがアミノ酸残基１からアミノ酸残基２０までに及び、ヒトＩＬ−１５がアミノ酸残基２１からアミノ酸残基１８２までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１８３からアミノ酸残基１９７までに及び、そして、ヒトＩＬ−２がアミノ酸残基１９８からアミノ酸残基３５０までに及んでいる。配列番号６で示した配列は、ネズミＩＬ−２とネズミＩＬ−１５の融合物に相当し、ネズミＩＬ−２がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１６９までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１７０からアミノ酸残基１７９までに及び、そして、ネズミＩＬ−１５がアミノ酸残基１８０からアミノ酸残基３２４までに及んでいる。配列番号７で示した配列は、ネズミＩＬ−１５とネズミＩＬ−２の融合物に相当し、ネズミＩＬ−１５がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１４５までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１４６からアミノ酸残基１５５までに及び、そして、ネズミＩＬ−２がアミノ酸残基１５６からアミノ酸残基３２４までに及んでいる。

配列番号８で示した配列は、ヒトＩＬ−２とヒトＩＬ−１８（プロＩＬ−１８）の融合物に相当し、ヒトＩＬ−２がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１５３までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１５４からアミノ酸残基１６８までに及び、そして、ヒトプロＩＬ−１８がアミノ酸残基１６９からアミノ酸残基３６１までに及んでいる。配列番号９で示した配列は、ヒトＩＬ−２とヒトプロＩＬ−１８の変異体Ｋ８９Ａの融合物に相当し、ヒトＩＬ−２がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１５３までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１５４からアミノ酸残基１６８までに及び、そして、ヒトプロＩＬ−１８の変異体がアミノ酸残基１６９からアミノ酸残基３６１までに及んでいる、そのアミノ酸残基２５７がその天然型ＩＬ−１８でのリジンに代わってアラニンである。配列番号１０で示した配列は、ヒトＩＬ−２とヒト成熟ＩＬ−１８の融合物に相当し、ヒトＩＬ−２がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１５３までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１５４からアミノ酸残基１６８までに及び、そして、ヒト成熟ＩＬ−１８がアミノ酸残基１６９からアミノ酸残基３２５までに及んでいる。配列番号１１で示した配列は、ヒトＩＬ−２とヒト成熟ＩＬ−１８の変異体Ｋ８９Ａの融合物に相当し、ヒトＩＬ−２がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１５３までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１５４からアミノ酸残基１６８までに及び、そして、ヒト成熟ＩＬ−１８の変異体がアミノ酸残基１６９からアミノ酸残基３２５までに及んでおり、そのアミノ酸残基２２１がその天然型ＩＬ−１８でのリジンに代わってアラニンである。配列番号１２で示した配列は、ネズミＩＬ−２とネズミプロＩＬ−１８の融合物に相当し、ネズミＩＬ−２がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１６９までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１７０からアミノ酸残基１７９までに及び、そして、ネズミプロＩＬ−１８がアミノ酸残基１８０からアミノ酸残基３７１までに及んでいる。配列番号１３で示した配列は、ネズミＩＬ−２とネズミＩＬ−１８の変異体Ｋ８９Ａの融合物に相当し、ネズミＩＬ−２がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１６９までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１７０からアミノ酸残基１７９までに及び、そして、ネズミＩＬ−１８の変異体がアミノ酸残基１８０からアミノ酸残基３７１までに及んでおり、そのアミノ酸残基２６６がその天然型ＩＬ−１８でのリジンに代わってアラニンである。配列番号１４で示した配列は、ネズミＩＬ−２とネズミ成熟ＩＬ−１８の融合物に相当し、ネズミＩＬ−２がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１６９までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１７０からアミノ酸残基１７９までに及び、そして、ネズミ成熟ＩＬ−１８がアミノ酸残基１８０からアミノ酸残基３３６までに及んでいる。配列番号１５で示した配列は、ネズミＩＬ−２とネズミ成熟ＩＬ−１８の変異体Ｋ８９Ａの融合物に相当し、ネズミＩＬ−２がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１６９までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１７０からアミノ酸残基１７９までに及び、そして、ネズミ成熟ＩＬ−１８の変異体がアミノ酸残基１８０からアミノ酸残基３３６までに及んでおり、そのアミノ酸残基２３１がその天然型ＩＬ−１８でのリジンに代わってアラニンである。

配列番号１６で示した配列は、ヒトＩＬ−２１とヒトＩＬ−２の融合物に相当し、ヒトＩＬ−２１がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１７９までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１８０からアミノ酸残基１９４までに及び、そして、ヒトＩＬ−２がアミノ酸残基１９５からアミノ酸残基３４７までに及んでいる。配列番号１７で示した配列は、ネズミＩＬ−２１とネズミＩＬ−２の融合物に相当し、ネズミＩＬ−２１がアミノ酸残基１からアミノ酸残基１４６までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１４７からアミノ酸残基１５６までに及び、そして、ネズミＩＬ−２がアミノ酸残基１５７からアミノ酸残基３２５までに及んでいる。

配列番号１８で示した配列は、ヒトＩＦＮｇとヒトＩＬ−２の融合物に相当し、ヒトＩＦＮｇがアミノ酸残基１からアミノ酸残基１６６までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１６７からアミノ酸残基１８１までに及び、そして、ヒトＩＬ−２がアミノ酸残基１８２からアミノ酸残基３３４までに及んでいる。配列番号１９で示した配列は、ネズミＩＦＮｇとネズミＩＬ−２の融合物に相当し、ネズミＩＦＮｇがアミノ酸残基１からアミノ酸残基１５５までに及び、リンカーペプチドがアミノ酸残基１５６からアミノ酸残基１６５までに及び、そして、ネズミＩＬ−２がアミノ酸残基１６６からアミノ酸残基３３４までに及んでいる。

本発明において、タンパク質が列挙したアミノ酸配列以外のアミノ酸を含まない場合、そのタンパク質は、そのアミノ酸配列「からなる」という。このようなアミノ酸配列が数少ないさらなるアミノ酸残基、一般に、約１〜約５０個ほどのさらなる残基とともに存在する場合、タンパク質は、そのアミノ酸配列「から本質的になる」という。アミノ酸配列がタンパク質の最終的な（すなわち、成熟）アミノ酸配列の少なくとも一部である場合、そのタンパク質は、そのアミノ酸配列を「含んでなる」という。このようなタンパク質は、数個〜数百個までのさらなるアミノ酸残基を有し得る。このようなさらなるアミノ酸残基は、融合物に含まれる各構成要素もしくは両方の構成要素または異種アミノ酸／ペプチド配列（それぞれの構成要素に対して異種である）と自然に結び付き得る。このようなさらなるアミノ酸残基は、融合タンパク質の前駆体から成熟型へのプロセシングに関与し、タンパク質トラフィッキングを促進し、タンパク質半減期を延長もしくは短縮し、または、とりわけ、アッセイまたは製造での融合タンパク質の操作を容易にすることができる。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞または生物体における分泌を促すためにＮＨ２末端にシグナルペプチドを含んでなる。例えば、内因性シグナルペプチド（すなわち、前記融合物のＮＨ２末端に存在するサイトカインに自然に存在する）を使用してもよいし、あるいは、好適な異種（問題のサイトカインに対して）シグナルペプチド配列を融合物のＮＨ２末端に存在するサイトカイン構成要素に付加してもよいし、または内因性のものの代わりに挿入してもよい。適切には、ＩＬ−１５が本発明の融合タンパク質のＮＨ２末端に存在する場合には、特定の宿主における分泌を促し、または増大させるために、異種ペプチドシグナル（ＩＬ−１５に対して異種である）をＩＬ−１５の天然型シグナルに付加してもよいし、またはＩＬ−１５の天然型シグナルと置き換えてもよい。好適な異種シグナルペプチドとしては、限定されるものではないが、ＩＬ−２のシグナルペプチドおよびマウスＩｇＧのκ軽鎖のシグナルペプチドのような免疫グロブリン（Ｉｇ）のシグナルペプチドが挙げられる(Meazza et al., 2000, Int. J. Cancer 87, 574; Susukiet al., 2001, J. Leukoc. Biol. 69, 531)。この態様の説明に役立つ実例は、配列番号５で示した融合タンパク質により提供される。あるいは、短鎖型または長鎖型いずれかの内因性ＩＬ−１５ペプチドシグナルを使用することも可能である(Kuryus et al., 2000, J. Biol. Chem. 275, 30653)。さらに、融合タンパク質をタグ付ペプチド、例えば、同定および／または精製を容易にするペプチドと融合してもよい。

本発明において、本発明の融合タンパク質は、あらゆる起源、すなわち、あらゆるヒトまたは動物起源（イヌ、鳥類、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ネコ、ブタなどを含む）のサイトカイン構成要素を含んでなり得る。「キメラ」融合タンパク質も本発明に包含される（例えば、一方のサイトカイン構成要素がヒト起源のものでもう一方が動物起源のもの）が、各構成要素が同じ起源のものである（例えば、両方ともヒト由来である）ことが好ましい。

本発明の融合タンパク質は、標準的な技術により作製することができる。本発明の融合タンパク質に関与するサイトカインそれぞれのポリペプチドおよびＤＮＡ配列は、組換えまたは化学合成技術を通じてその発現を獲得するための方法がそうであるように、当技術分野では公開されている。もう１つの態様では、融合物をコードするＤＮＡ配列を、自動ＤＮＡ合成装置をはじめとする従来の技術によって合成することができる。よって、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列はベクターにおいて構築することができ、宿主細胞または生物体における融合タンパク質の発現を制御し得る調節領域に作動可能なように連結することができる。例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドでＤＮＡ配列をクローニングするための技術は、当業者には公知である(Sambrook et al, 2001, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY)。本発明の融合タンパク質は、以下に記載するように、それを発現するように形質転換された細胞から精製することができる。

本発明の融合タンパク質は、融合物を形成するＸ構成要素およびＹ構成要素の少なくとも一方の通常の活性を有することを特徴としたものであってもよいし、または本発明の融合タンパク質が、さらに、ＸとＹの単純な相加機能を上回る生物活性を有することを特徴としたものであってもよい。活性をこのように高めることによって、治療効果が高まり、その結果として、投与計画を低減し、コンプライアンスおよび維持療法を改善することが可能になり、緊急状態を緩和することが可能になり、さらに生活の質を向上させることが可能になる。ある場合において、本発明の融合分子は、意外にも、ＸまたはＹの存在から予測されるものとは異なる活性も提供し得る。例えば、本発明に関連して強調される、１つの特定の予期できない活性が、ＩＬ−２／ＩＬ−１８（ＩＬ−２／プロＩＬ−１８またはＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８）融合物およびＩＬ−７／ＩＬ−２融合物の、例えば、腫瘍またはウイルス抗原に対する非特異的免疫応答を増強する目的で樹状細胞の成熟を促進する能力である。ＩＬ−２／ＩＬ−１８（ＩＬ−２／プロＩＬ−１８またはＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８）融合物で発見されたもう１つの活性が、例えば、腫瘍またはウイルス抗原に対する非特異的免疫応答を増強する目的でＮＫＴ細胞を活性化することである。本発明に関連して発見されたもう１つの予期できない効果が、特定の生物体においてサイトカインを個々に投与したときと比べて、ＩＬ−２／ＩＬ−１８（ＩＬ−２／プロＩＬ−１８またはＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８）融合物およびＩＬ−７／ＩＬ−２融合物によって細胞傷害性（ＡＩＣＤ活性）が制限されることであり、例えば、この効果を細胞傷害性副作用を低減するために使用することができる

さらに、本発明の範囲に、本発明の融合タンパク質、特に、配列番号１〜１９のいずれかで示したものの新規ペプチド断片が含まれる。本明細書において、断片とは、本明細書において開示される融合タンパク質の少なくとも８個、１５個、２０個、５０個以上の連続したアミノ酸残基を含んでなるものである。このような断片は、融合タンパク質の１以上の治療活性および／または生物活性を保持するそれらの能力に基づいて選択することができるし、または例えば、基質と結合するか、または免疫原としての役割を果たすように機能するそれらの能力について選択してもよい。好適なペプチド断片は、一般に、新規免疫原性構造を含有する融合タンパク質のドメインまたはモチーフを含んでなるものである。推定免疫原性部位は、当業者には周知で、容易に利用可能なコンピュータープログラムにより容易に同定可能である。特に重要なものは、Ｘ構成要素とＹ構成要素との融合部位をオーバーラッピングするペプチド断片である。本発明の融合タンパク質のペプチド断片は、公知のタンパク質合成方法を用いても合成することができる。

本発明はまた、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。
本発明において、「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、互換的に使用される用語であり、あらゆる長さを有するヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチド類似体を用いて作製したＤＮＡまたはＲＮＡ類似体（ヌクレオチド類似体の例として米国特許第５，５２５，７１１号、同第４，７１１，９５５号またはＥＰＡ３０２１７５参照）のいずれの重合体も定義する。ヌクレオチド構造に対して修飾を行うとすれば、重合体の構成前または後に行うことができる。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチドエレメントが介在してもよい。重合後、標識成分とのコンジュゲーションによるなど、核酸分子をさらに修飾してもよい。核酸、特に、ＤＮＡは、二本鎖であってもよいし、または一本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。一本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）であってもよいし、または非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。

本発明の核酸分子としては、限定されるものではないが、融合タンパク質をコードする配列だけであるが、さらなる非コード配列、例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合およびｍＲＮＡ安定性に関与するイントロンならびに非コード５’および３’配列を含んでいてよい。例えば、本発明の核酸分子は、自然にフランキングする（すなわち、５’および３’末端に存在する配列）か、あるいはＸ構成要素および／またはＹ構成要素をコードするゲノムＤＮＡ内に存在する約５ｋｂ未満、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂのヌクレオチド配列を含み得る。

好ましい態様によれば、本発明は、配列番号１〜１９に示したいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、好ましくは、少なくとも約９７％、より好ましくは、少なくとも約９９％相同であり、さらに好ましくは、１００％相同である融合タンパク質をコードするアミノ酸配列の総てまたは一部をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、あるいはから本質的になる、あるいはからなる核酸分子を提供する。

もう１つの態様では、本発明の核酸分子は、配列番号１〜１９のいずれかに示した融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の総てまたは一部の相補体である核酸分子を含んでなる。本発明のヌクレオチド配列と相補的である核酸分子は、それがストリンジェントな条件下で融合物をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、その結果として安定した二本鎖を形成するように、十分な相補性を有するものである。このようなストリンジェントな条件は、当業者には公知である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい限定されない例が、約４５℃にて６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、続いて、５０〜６５℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄である。１つの態様において、本発明は、本発明の核酸分子のアンチセンス核酸に関する。アンチセンス核酸は、コード鎖全体と相補的であり得るし、またはその一部とのみ相補的であり得る。

さらにもう１つの態様では、本発明は、例えば、以上で記載している融合タンパク質の変異体をコードする上記の本発明の核酸分子の変異体を包含する。本発明に包含される変化は、部位特異的突然変異誘発やＰＣＲ媒介突然変異誘発のような標準的な技術によってヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチド置換、付加および／または欠失を導入することにより作製することができる。突然変異誘発の後、本明細書において記載するように、変異型核酸分子を組換え発現させ、得られたタンパク質の活性を、例えば、本明細書において記載するアッセイを利用して決定することができる。あるいは、本発明の核酸分子を改変して、特定の宿主細胞（例えば、大腸菌(E. coli); Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20, 2111-2118）に優先的なコドン使用を提供してもよい。本発明はさらに、遺伝子コードの縮重によって異なるが、例えば、配列番号１〜１９に示したもののいずれかと同じ融合タンパク質をコードする核酸分子を包含する。

本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸分子の断片、例えば、制限エンドヌクレアーゼおよびＰＣＲによって生じた断片に関する。このような断片は、融合タンパク質の免疫原性部分をコードするプローブ、プライマーまたは断片として使用することができる。

本発明の核酸分子は、本明細書において提供する配列情報を用いて作製することができる。Ｘ構成要素およびＹ構成要素それぞれをコードする核酸を、当技術分野で入手可能な配列データ（例えば、本発明の融合タンパク質に関して以上で提供されるもの、または実施例部分で提供されるもの）に基づく標準的な分子生物学技術（例えば、Sambrook, et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001に記載されるように）または標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、ｃＤＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡを、鋳型および好適なプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーとして用いてクローニングしてもよいし、または増幅してもよい。Ｘ配列とＹ配列の融合は、以下の実施例に記載のとおり行ってよいし、または従来の技術により行ってもよい。例えば、Ｘをコードする配列とＹをコードする配列は、インフレームで、直接またはペプチドリンカーをコードする配列を介して連結し得る。また、Ｘをコードする配列を、Ｙをコードする配列を含有するベクターに直接挿入してもよいし、逆の場合も同様である。あるいは、Ｘをコードする配列とＹをコードする配列のＰＣＲ増幅を、相補的オーバーハングを生み出すプライマーを用いて実施し、その後、その相補的オーバーハングをアニーリングし、再び増幅して、融合遺伝子配列を作製してもよい。

また、本発明により、本発明の核酸分子を含有するベクターも提供される。
本明細書において「ベクター」とは、発現ベクターと非発現ベクターの両方を指す。これらのベクターとしては、自律的自己複製環状プラスミドを含むウイルスベクター、ならびに非ウイルスベクターが挙げられる。組換え微生物または細胞培養物が「発現ベクター」の宿主とされる場合、このベクターに、染色体外環状ＤＮＡと宿主染色体に組み込まれたＤＮＡの両方が含まれる。好ましい本発明のベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードするベクター内の核酸分子が転写され、必要に応じて、宿主細胞内で翻訳され得るように、位置的にかつ連続的に配向された、すなわち、他の必須エレメントと作動可能なように連結された多数の遺伝因子を含有している。

本発明においては、プラスミド由来のものであれ、ウイルス由来のものであれ、組み込みベクターであれ、非組み込みベクターであれ、あらゆるタイプのベクターを使用することができる。このようなベクターは、市販されているか、または文献にて記載されている。本発明において特に重要なものは、遺伝子療法に用いるベクター（すなわち、核酸分子を標的細胞へと送達し得るもの）、ならびに組換え技術に用いる発現ベクター（すなわち、例えば、宿主培養細胞において本発明の核酸分子を発現し得るもの）である。

本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞において、あるいは両方の細胞において機能し得る（シャトルベクター）。好適なベクターとしては、限定されるものではないが、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣまたはＭＡＣのような人工染色体由来のベクター、ならびに、バキュロウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、泡沫状ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクターが挙げられる。また、これらの起源を組み合わせて、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子から得られるものなどのベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）を得てもよい。ウイルスベクターは、複製能力を有している場合、条件付きで複製する場合、または複製欠損型である場合がある。ウイルス複製が欠損している場合では、欠損を補う機能を提供する宿主細胞において複製が起こる。

好適なプラスミドの例としては、限定されるものではないが、ｐＢＲ３２２(Gibco BRL)、ｐＵＣ(Gibco BRL)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Stratagene)、ｐＰｏｌｙ(Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201)、ｐＴｒｃ(Amann et al., 1988, Gene 69, 301-315)およびｐＥＴ１１ｄ(Studier et al., 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, 60-89)から得られたものが挙げられる。プラスミドの形態が発現効率に影響を及ぼし得ることは周知であり、大部分のベクターがスーパーコイル型であることが好ましい。酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)）での発現用のベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１(Baldari et al., 1987, EMBO J. 6, 229-234)、ｐＭＦａ(Kujan et al., 1982, Cell 30, 933-943)、ｐＪＲＹ８８(Schultz et al., 1987, Gene 54, 113-123)およびｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)が挙げられる。また、昆虫培養細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）で発現させるために、本発明のベクターをバキュロウイルスから得てもよい。

本発明の好ましい態様によれば、本明細書において記載する核酸分子を、哺乳類発現ベクターを用いて発現させる。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitrogene)、ｐＣＩ(Promega)、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987, Nature 329, 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6, 187-195)が挙げられる。本明細書において記載する発現ベクターは、当業者が利用可能ないくつかの周知ベクターのほんの一例として示している。当業者ならば、本明細書において記載する核酸分子の維持、拡大または発現に好適な他のベクターを認識しているであろう。

さらに、本発明のベクターは、トランスフェクト細胞を選択するか、または同定するためのマーカー遺伝子（例えば、細胞の栄養要求性の相補性によるか、または抗生物質耐性による）、安定化エレメント（例えば、ｃｅｒ配列；Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103）、組み込みエレメント（例えば、ＬＴＲウイルス配列およびトランスポゾン）、ならびに自己複製機能を提供し、細胞内でのベクターのコピー数に関係なく、ベクターを細胞内で安定に維持させ得るエレメントも含んでなってもよい。マーカーとしては、原核宿主細胞にはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子、真核宿主細胞には、ジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性が挙げられる。しかしながら、表現型形質についての選抜を行うあらゆるマーカーが有効である。ウイルス複製起点を使用し、その特定のウイルス起点が媒介する複製に必要である１以上のウイルス複製因子を提供することによって、自己複製機能を与え得る（ＷＯ９５／３２２９９）。複製起点およびあらゆる複製因子は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトおよびウシ乳頭腫ウイルスならびにパポバウイルスＢＫをはじめとする種々のウイルスから得られる。

特に好ましい本発明のベクターは、ウイルスベクター、特に、遺伝子療法用のベクターとして十分に立証された利点が数多くあるアデノウイルスベクターである。アデノウイルスゲノムは、ウイルスサイクルを完了するのに必要な約３０個を越える遺伝子を有するおよそ３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ分子からなる。初期遺伝子は、４領域（Ｅ１〜Ｅ４）に分かれており、Ｅ３領域を除いてウイルス複製に必要な領域である(Pettersson and Roberts, 1986, In Cancer Cells (Vol 4): DNA Tumor Viruses, Botchan and Glodzicker Sharp Eds pp 37-47, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.; Halbert et al., 1985, J. Virol. 56, 250-257)。Ｅ３領域は、Ｅ３領域内に欠失がある天然変異株またはハイブリッドウイルスが、培養細胞において依然として野生型ウイルス様に複製するという観察結果(Kelly and Lewis, 1973, J. Virol. 12, 643-652)に基づき、ウイルス複製には不必要であると思われる。Ｅ１遺伝子産物は、ウイルスゲノムの転写調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２遺伝子産物は、ウイルスＤＮＡ合成の開始および鎖伸長に必要なものである。Ｅ３がコードするタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞融解を抑制する(Wold and Gooding、1991, Virology 184, 1-8)。Ｅ４領域がコードするタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現およびスプライシングおよび宿主細胞シャットオフに関与する(Halbert et al., 1985, J. Virol. 56, 250-257)。後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）は、それらの大多数がウイルスキャプシドを構成する構造タンパク質をコードする。それらは、少なくとも部分的に初期転写ユニットでオーバーラップしており、特異的なプロモーター（主要後期プロモーター、ＭＬＰ）から転写される。さらに、アデノウイルスゲノムは、両端にシス作用５’および３’ＩＴＲ（逆方向末端繰り返し配列）とキャプシド形成領域を有しており、
いずれもＤＮＡ複製に必須のものである。ＩＴＲが、ＤＮＡ複製起点を有する一方で、キャプシド形成領域が、アデノウイルスＤＮＡの感染粒子へのパッケージングに必要とされる。

本明細書において、「アデノウイルスベクター」とは、ベクターＤＮＡならびに従来の技術よって作製されるそのウイルス粒子を包含する。

本発明に従って使用されるアデノウイルスベクターは、ヒト細胞に感染することが好ましい。あらゆるヒトまたは動物起源、特にイヌ（例えば、ＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２；それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＣＡＶ１ＧＥＮＯＭおよびＣＡＶ７７０８２）、鳥類（Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＡＡＶＥＤＳＤＮＡ）、ウシ（ＢＡＶ３など；Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Virol. 72, 1394-1402）、ネズミ（Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＡＤＲＭＵＳＭＡＶ１）、ヒツジ、ネコ、ブタまたはサルアデノウイルスから、あるいはそれらのハイブリッドからそれを得ることができる。アデノウイルス血清型１〜５１のいずれの血清型を使用してもよい。例えば、アデノウイルスは、亜群Ａ（例えば、血清型１２、１８および３１）、亜群Ｂ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４および３５）、亜群Ｃ（例えば、血清型１、２、５および６）、亜群Ｄ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９および４２〜４７）、亜群Ｅ（血清型４）、亜群Ｆ（血清型４０および４１）のものまたは他のあらゆるアデノウイルス血清型のものであってよい。しかしながら、ＢまたはＣ亜群のヒトアデノウイルス、特に、アデノウイルス２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５）および３５（Ａｄ３５）が好ましい。一般的に言えば、前述のアデノウイルスの起源として使用し得るアデノウイルスストックは、現在、American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.)からまたは他のあらゆる供給元から入手可能である。さらに、このようなアデノウイルスは、それらの配列、構成および生物学について記載されており、技術者によるそれらの使用を可能にする数多くの刊行物の主題となっている。アデノウイルスベクター、アデノウイルスベクターの作製方法およびアデノウイルスベクターの使用法は、Ｃ群アデノウイルスベクターについては、例えば、米国特許第６，１３３，０２８号および同第６，０４０，１７４号、同第６，１１０，７３５号、同第６，３９９，５８７号、ＷＯ００／５０５７３およびＥＰ１０１６７１１に開示されており、非Ｃ群アデノウイルスベクターについては、例えば、米国特許第６，４９２，１６９号およびＷＯ０２／４０６６５に開示されている。

１つの態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、複製能力を有している。本明細書において「複製能力を有する」とは、相補作用の不在下で宿主細胞において複製し得るアデノウイルスベクターを指す。本発明において、この用語は、癌または過剰増殖性宿主細胞においてより良くまたは選択的に複製するように操作された、複製選択的アデノウイルスベクターまたは条件付きで複製するアデノウイルスベクターも包含する。このような複製能力を有するアデノウイルスベクターの例は、当技術分野では周知であり、当業者ならば容易に利用可能である（例えば、Hernandez-Alcoceba et al., 2000, Human Gene Ther. 11, 2009-2024; Nemunaitis et al., 2001, Gene Ther. 8, 746-759; Alemany et al., 2000, Nature Biotechnology 18, 723-727参照）。

本発明の複製能力を有するアデノウイルスベクターは、野生型アデノウイルスゲノムであってよいし、または、例えば、条件付きで複製するアデノウイルスベクターを作製するために、そのウイルスゲノムに修飾を導入することによってそれらから得たものであってもよい。このような修飾としては、コード配列および／または調節配列における１以上のヌクレオチドの欠失、挿入および／または突然変異が挙げられる。好ましい修飾は、前記複製能力を有するアデノウイルスベクターを、腫瘍または癌性細胞に特異的に存在する細胞活性に依存的にするものである。これに関して、腫瘍細胞において不必要となるウイルス遺伝子、例えば、ｐ５３またはＲｂ結合を通じた細胞周期の活性化に関与する遺伝子を、完全にまたは部分的に欠失させてもよいしまたは突然変異させてもよい。例として、このような条件付きで複製するアデノウイルスベクターは、５５ｋＤａタンパク質をコードするアデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子の完全欠失またはｐ５３結合を無効にするためのＥ１Ｂ領域の完全欠失によって操作することができる（例えば、米国特許第５，８０１，０２９号および同第５，８４６，９４５号参照）。これにより、正常細胞でのウイルスによる腫瘍抑制の不活性化が回避される。このことはウイルスが複製し得ないことを意味している。しかしながら、ウイルスは複製し、発癌性形質転換を通じてｐ５３またはＲｂ発現をシャットオフした細胞を溶解する。もう１つの例として、Ｅ１Ａ領域の完全欠失により、固有活性またはＩＬ−６誘導Ｅ１Ａ様活性に依存的なアデノウイルスベクターを作製する。状況に応じて、Ｅ１Ａ領域に不活性化突然変異を導入して、Ｒｂとの結合を無効にしてもよい。好ましくは、Ｅ１ＡＣＲ１および／またはＣＲ２ドメイン内にＲｂ欠損突然変異／欠失を導入する（例えば、ＷＯ００／２４４０８参照）。第２の戦略では、状況に応じて、または第１のアプローチと組み合わせて、ウイルス遺伝子の転写を制御する天然型ウイルスプロモーターを組織または腫瘍特異的プロモーターで置き換えてもよい。例として、Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ遺伝子の調節を、ＰＳＡ、カリクレイン、プロバシン、ＡＦＰ、ａ−フェトプロテインもしくはテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）プロモーターのような腫瘍特異的プロモーター（例えば、米国特許第５，９９８，２０５号、ＷＯ９９／２５８６０、米国特許第５，６９８，４４３号およびＷＯ００／４６３５５参照）またはＥ２Ｆ−１プロモーターのような細胞周期特異的プロモーター（ＷＯ００／１５８２０およびＷＯ０１／３６６５０）の制御下に置いてもよい。これに関連して、特に好ましくは、Ｅ１ＡＣＲ２ドメイン内でのＲｂ欠損８アミノ酸残基欠失とＥ１ＡおよびＥ４ウイルス遺伝子両方の発現を制御するＥ２Ｆ−１プロモーターの使用を組み合わせた、ＯＮＹＸ−４１１と呼ばれる典型的なベクターである。

もう１つの態様および好ましい態様によれば、本発明のアデノウイルスベクターは複製欠損型ベクターである。複製欠損アデノウイルスベクターは、当技術分野で公知であり、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムの１以上の領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２もしくはＥ４またはそれらの組合せ）内に欠失があるため、相補作用（例えば、相補的に作用する細胞またはヘルパーウイルスのいずれかによって提供される）の不在下では増殖し得ないものと定義され得る。複製欠損表現型は、ウイルスゲノムに修飾を導入して、ウイルス複製に必要な１以上のウイルス遺伝子の機能を無効にすることによって得られる。好ましい複製欠損ベクターは、Ｅ１が欠失しているため、Ｅ１機能が欠損している。このようなＥ１欠失アデノウイルスベクターとしては、米国特許第６，０６３，６２２号；同第６，０９３，５６７号；ＷＯ９４／２８１５２；ＷＯ９８／５５６３９およびＥＰ９７４６６８（これら公報の総ての開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているものが挙げられる。好ましいＥ１欠失は、ヒトアデノウイルス５型の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋにおいて受託番号Ｍ７３２６０として開示されており、Chroboczek et al., 1992, Virol. 186, 280-285にて開示されている）を参照することにより、およそヌクレオチド（ｎｔ）４５９〜３３２８または４５９〜３５１０に及ぶ。

さらに、ベクターのアデノウイルス骨格の追加ウイルス領域に修飾（例えば、欠失、挿入または突然変異）を含めて、ウイルス抗原の残留合成物を完全に破壊し、および／または形質導入細胞における核酸分子の長期発現を向上させてもよい（例えば、ＷＯ９４／２８１５２; Lusky et al., 1998, J. Virol 72, 2022-2032; Yeh et al., 1997, FASEB J. 11, 615-623参照）。これに関連して、本発明は、Ｅ１機能欠損アデノウイルスベクター、またはＥ１およびＥ２機能欠損アデノウイルスベクター、またはＥ１およびＥ３機能欠損アデノウイルスベクター、またはＥ１およびＥ４機能欠損アデノウイルスベクター、またはＥ１およびＥ２およびＥ３機能欠損アデノウイルスベクター、またはＥ１およびＥ２およびＥ４機能欠損アデノウイルスベクター、またはＥ１およびＥ３およびＥ４機能欠損アデノウイルスベクター、またはＥ１およびＥ２およびＥ３およびＥ４機能欠損アデノウイルスベクターの使用を意図している。Ｅ２機能欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ２領域（好ましくは、Ｅ２Ａ領域内あるいはＥ２Ｂ領域内またはＥ２Ａ領域内とＥ２Ｂ領域内の両方）の総てまたは一部に欠失があるか、またはＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）をコードする遺伝子の温度感受性突然変異のような１以上の突然変異を含んでなる(Ensinger et al., J. Virol. 10 (1972), 328-339)。このアデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の総てまたは一部も欠失していることもある（例えば、ＥＰ９７４６６８およびＷＯ００／１２７４１参照）。典型的なＥ４欠失は、ヒトアデノウイルス５型の配列を参照することにより、およそヌクレオチド３２９９４位〜３４９９８位に及ぶ。さらに、非必須Ｅ３領域内（例えば、Ａｄ５の２８５９７位〜３０４６９位）の欠失によりクローニング能力が増強され得るが、宿主免疫系(Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53-71)および炎症反応（ＥＰ００４４０２６７．３）を回避するためには、ｇｐ１９ｋ、１４．７Ｋおよび／またはＲＩＤをコードするＥ３配列を保有していることが有利である。シス作用配列を除き、初期（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４）および後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）を含む総ての機能的遺伝子を欠失している最少（または弱い）アデノウイルスベクターを使用することも考えられる（例えば、Kovesdi et al., 1997, Current Opinion in Biotechnology 8, 583-589; Yeh and Perricaudet, 1997, FASEB 11, 615-623; ＷＯ９４／１２６４９；およびＷＯ９４／２８１５２を参照）。当業者ならば、最低限必要な配列を考慮して、複製欠損アデノウイルスベクターを容易に操作することができるため、複製欠損アデノウイルスベクターはこれらの典型的な態様に限定されない。

本発明の核酸分子は、シス作用配列を除き、アデノウイルスゲノムのあらゆる位置に挿入することができる。欠失領域（Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４）の代わりに挿入されることが好ましく、欠失したＥ１領域の代わりに挿入されることが特に好ましい。さらに、発現カセットが、問題の領域の自然転写方向に対してセンスまたはアンチセンス方向に配置され得る。

レトロウイルスベクターも本発明において好適である。レトロウイルスは、ウイルスがコードする逆転写酵素を使用して複製する組み込みウイルスの種類であり、ウイルスＲＮＡゲノムを、感染細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる二本鎖ＤＮＡに複製する。文献にて記載されている数多くのベクターを、本発明の範囲内で使用し得るが、特に、これらはネズミ白血病ウイルス、とりわけ、モロニー(Gilboa et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241, 29)またはFriendのＦＢ２９株（ＷＯ９５／０１４４７）由来のものであった。一般に、レトロウイルスベクターは、ウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの総てまたは一部が欠失し、５’および３’ＬＴＲとキャプシド形成配列を保有している。これらのエレメントは、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性を高めるように改変してもよい。このような改変としては、レトロウイルスキャプシド形成配列の、ＶＬ３０のようなレトロトランスポゾンの１つとの置換が挙げられる（米国特許第５，７４７，３２３号）。本発明の核酸分子をキャプシド形成配列の下流に、好ましくは、レトロウイルスゲノムに対して反対方向に挿入してもよい。

ポックスウイルスベクターも本発明において好適である。ポックスウイルスは、それらの大ＤＮＡゲノムとそれらの細胞質複製部位によって上記のウイルスと区別される複雑なエンベロープを有するウイルス群である。ポックスウイルス科に属する一部のメンバーのゲノムはマッピングされ、配列決定されている。そのゲノムは、約２００個のタンパク質（そのうちのおよそ１００個がウイルスに関与する）をコードするおよそ２００ｋｂの二本鎖ＤＮＡである。本発明において、ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科(poxviridae)のあらゆるメンバー、特に、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスおよびワクシニアウイルスから得られるが、後者のものが好ましい。好適なワクシニアウイルスとしては、限定されるものではないが、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株(Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 and 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401)、Ｗｙｅｔｈ株および改変Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株(Antoine et al., 1998, Virol. 244, 365-396)が挙げられる。核酸分子を含むポックスウイルスを構築するための一般条件は、当技術分野では周知である（例えば、ＣｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスについてはＥＰ８３２８６；ＥＰ２０６９２０およびＭＶＡウイルスについてはMayr et al., 1975、Infection 3, 6-14; Sutter and Moss、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851, 米国特許第６，４４０，４２２号参照）。本発明の核酸分子を、好ましくは、非コード遺伝子間領域または遺伝子の不活性化もしくは欠失によってウイルス増殖および複製に大幅な低下はないいずれかの遺伝子のような非必須遺伝子座のポックスウイルスゲノム内に挿入してもよい。チミジンキナーゼ遺伝子は、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスにおける挿入に特に好適である(Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 53
0-537)。ＭＶＡに関する限り、核酸分子の挿入は、切除Ｉ〜ＶIIのいずれか、好ましくは、切除IIもしくはIII(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040)またはＤ４Ｒ遺伝子座において行うことができる。鶏痘ウイルスの場合、チミジンキナーゼ遺伝子内への挿入も考えられるが、核酸分子を、非コード遺伝子間領域内に導入することが好ましい（例えば、ＥＰ３１４５６９および米国特許第５，１８０，６７５号参照）。欠損機能が途中で、ヘルパーウイルスを介してか、または生成細胞系統における発現により補われる場合には、必須ウイルス遺伝子座への挿入も想定し得る。好適なポックスウイルスベクターは、ＡＴＣＣ（鶏痘ＡＴＣＣＶＲ−２５１、サル痘ＡＴＣＣＶＲ−２６７、豚痘ＡＴＣＣＶＲ−３６３、カナリア痘ＡＴＣＣＶＲ−１１１、牛痘ＡＴＣＣＶＲ−３０２）またはＩＣＴＶ(Canberra, Australia)（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎウイルスコード５８．１．１．０．００１；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７）のような認可された保存機関で入手可能な野生型ポックスウイルスから容易に作製することができる。

好ましい態様によれば、本発明のベクターは、本発明の核酸分子を、宿主細胞または生物体におけるその発現に好適な形態で含んでなる。このことは、その核酸分子が１以上の調節配列の制御下に置かれ、発現させるべき核酸分子に作動可能なように連結されたベクターのタイプおよび／または宿主細胞に基づいて選択されることを意味している。本明細書において、「調節配列」とは、核酸またはその誘導体の１つ（すなわち、ｍＲＮＡ）の複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または宿主細胞もしくは生物体への輸送を含む核酸分子の機能的調節を可能にするか、提供するか、または調整するあらゆる配列を指す。本発明において、この用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡ安定性に影響を及ぼすエレメント）を包含する。「作動可能なように連結された」とは、目的の核酸分子が、その核酸分子の発現が（例えば、宿主細胞または生物体において）可能となるように、調節配列に連結されていることを意味するものとする。当業者ならば、発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に応じて行われることが分かるであろう。

調節配列としては、多くの種類の宿主細胞において核酸分子の構成的発現を命令するプロモーターおよび特定の宿主細胞でのみまたは特異的事象もしくは外生要因（例えば、温度、栄養素添加物、ホルモンまたは他のリガンドによる）を受けてヌクレオチド配列の発現を命令するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。

本発明において有用な好適な調節配列としては、限定されるものではないが、バクテリオファージλのレフトプロモーター、大腸菌のｌａｃ、ＴＲＰおよびＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターまたはエンハンサー(Boshart et al., 1985, Cell 41, 521-530)、アデノウイルス初期および後期プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター(Hitzeman et al., 1983, Science 219, 620-625; Adra et al., 1987, Gene 60, 65-74)、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびレトロウイルス長い末端繰り返し配列（例えば、ＭｏＭｕＬＶおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ）が挙げられる。ポックスウイルスベクターにおいて本発明の核酸分子の発現を推進するのに有用な好適なプロモーターとしては、ワクシニアウイルスの７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１またはＫ１Ｌプロモーターが挙げられる。あるいは、Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097)、Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138)およびKumar and Boyle (1990, Virology 179, 151-158)に記載されているもののような合成プロモーター、ならびに初期ポックスウイルスプロモーターと後期ポックスウイルスプロモーターのキメラプロモーターを使用してもよい。

誘導プロモーターは、外から供給された化合物により調節されるプロモーターであり、これらのプロモーターとしては、限定されるものではないが、亜鉛誘導性メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター(Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848)、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）、エクジソン昆虫プロモーター(No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351)、テトラサイクリン抑制性プロモーター(Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551)、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Kim et al., 1995, J. Virol. 69, 2565-2573)、ＲＵ４８６誘導性プロモーター(Wang et al., 1997, Nat. Biotech. 15, 239-243およびWang et al., 1997, Gene Ther. 4, 432-441)およびラパマイシン誘導性プロモーター(Magari et al., 1997, J. Clin. Invest. 100, 2865-2872)が挙げられる。

本発明において使用する調節配列は、治療的効用が望まれる組織においてその核酸分子の発現を推進するために組織特異的でもあり得る。典型的な肝臓特異的調節配列としては、限定されるものではないが、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ(Luskey, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 1881-1893)；ステロール調節エレメント１(SRE-1; Smith et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 2306-2310)；アルブミン(Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1, 268-277)；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）(Eisenberger et al., 1992, Mol. Cell Biol. 12, 1396-1403)；ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）(Li et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 4136-4142)；ヒトグルコキナーゼ(Tanizawa et al., 1992, Mol. Endocrinology 6, 1070-1081)；コレステロール７−αヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ−７）(Lee et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 14681-14689)；α−１抗トリプシン(Ciliberto et al., 1985, Cell 41, 531-540)；インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１）(Babajko et al., 1993, Biochem Biophys. Res. Comm. 196, 480-486)；ヒトトランスフェリン(Mendelzon et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18, 5717-5721)；Ｉ型コラーゲン(Houglum et al., 1994, J. Clin. Invest. 94, 808-814)およびＦＩＸ（米国特許第５，８１４，７１６号）遺伝子のものが挙げられる。典型的な前立腺特異的調節配列としては、限定されるものではないが、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）(Banas et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta. 1217, 188-194)；前立腺分泌タンパク質９４（ＰＳＰ９４）（Nolet et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1089, 247-249）；前立腺特異的抗原複合体(Kasper et al., 1993, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 47, 127-135)；ヒト腺性カリクレイン（ｈｇｔ−１）(Lilja et al.,1993, World J. Urology 11, 188-191)遺伝子のものが挙げられる。典型的な膵臓特異的調節配列としては、限定されるものではないが、膵炎関連タンパク質（ＰＡＰ）プロモーター(Dusetti et al., 1993, J. Biol. Chem. 268, 14470-14475)；エラスターゼ１転写エンハンサー(Kruse et al., 1993, Genes and Development 7, 774-786)；膵臓特異的アミラーゼおよびエラスターゼエンハンサー／プロモーター(Wu et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11, 4423-4430; Keller et al., 1990, Genes & Dev. 4, 1316-1321)；膵臓コレステロールエステラーゼ遺伝子プロモーター(Fontaine et al., 1991, Biochemistry 30, 7008-7014)ならびにインスリン遺伝子プロモーター(Edlund et al., 1985, Science 230, 912-916)のものが挙げられる。典型的なニューロン特異的調節配列としては、限定されるものではないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）(Forss-Petter et al., 1990, Neuron 5, 187-197)および神経フィラメント(Byrne and Ruddle, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5473-5477)遺伝子プロモーターが挙げられる。脳での発現用の典型的な調節配列としては、限定されるものではないが、神経フィラメント重鎖（ＮＦ−Ｈ）プロモーター(Schwartz et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 13444-13450)が挙げられる。典型的なリンパ系特異的調節配列としては、限定されるものではないが、ヒトＣＧＬ１／グランザイムＢプロモーター(Hanson et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 24433-24438)；ターミナルデオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、リンパ球特異的チロシンタンパク質キナーゼ（ｐ５６ｌｃｋ）プロモーター(Lo et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11, 5229-5243)；ヒトＣＤ２プロモーター／エンハンサー(Lake et al., 1990, EMBO J. 9, 3129-3136)、ヒトＮＫ細胞およびＴ細胞特異的活性化（ＮＫＧ５）(Houchins et al., 1993, Immunogenetics 37, 102-107)、Ｔ細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989, EMBO J. 8, 729-733)および免疫グロブリン(Banerji et al., 1983, Cell 33, 729-740; Queen and Baltimore, 1983, Cell 33, 741-748)プロモーターが挙げられる。典型的な結腸特異的調節配列としては、限定されるものではないが、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ(Talamonti et al., 1993, J. Clin. Invest 91, 53-60)；器官特異的新抗原（ＯＳＮ）、ｍｗ４０ｋＤａ（ｐ４０）(Ilantzis et al., 1993, Microbiol. Immunol. 37, 119-128)；および結腸特異的抗原−Ｐプロモーター(Sharkey et al., 1994, Cancer 73, 864-877)プロモーターが挙げられる。乳腺および乳房細胞での発現用の典型的な調節配列としては、限定されるものではないが、ヒトα−ラクトアルブミン(Thean et al., 1990, British J. Cancer. 61, 773-775)および乳漿（米国特許第４，８７３，３１６号）プロモーターが挙げられる。典型的な筋肉特異的調節配列としては、限定されるものではないが、ＳＭ２２（ＷＯ９８／１５５７５；ＷＯ９７／３５９７４）、デスミン（ＷＯ９６／２６２８４）、ミトコンドリアクレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターおよびＥＰ１３１０５６１に開示されているキメラプロモーターが挙げられる。典型的な肺特異的調節配列としては、限定されるものではないが、ＣＦＴＲおよび界面活性剤プロモーターが挙げられる。

本発明での使用に好適なさらなるプロモーターは、増殖性腫瘍細胞で選択的に発現される遺伝子からのものであってもよい。このような遺伝子は、例えば、ディスプレイゲノムハイブリダイゼーションおよび比較ゲノムハイブリダイゼーションによって同定することができる（例えば、米国特許第５，７５９，７７６号および同第５，７７６，６８３号参照）。典型的な腫瘍特異的プロモーターとしては、限定されるものではないが、乳癌および前立腺癌で過剰発現されるＭＵＣ−１遺伝子のプロモーター(Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782)、結腸癌で過剰発現される癌胎児性抗原（ＣＥＡ）をコードする遺伝子のプロモーター(Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748)、乳癌および膵臓癌で過剰発現されるＥＲＢ−２をコードする遺伝子のプロモーター(Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175)、肝臓癌で過剰発現されるα-フェトプロテイン遺伝子のプロモーター(Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465)、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のプロモーター(ＷＯ９９／２７１１３、ＷＯ０２／０５３７６０およびHorikawa et al., 1999, Cancer Res. 59, 826)、低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）、自己分泌型運動因子受容体、ＬプラスミンおよびヘキソキナーゼIIが挙げられる。

当業者ならば、本発明の核酸分子の発現を制御する調節エレメントが、宿主細胞または生物体における転写および翻訳の適切な開始、調節ならびに／または終結のためのさらなるエレメントをさらに含んでなってもよいことが分かるであろう。このようなさらなるエレメントとしては、限定されるものではないが、非コードエクソン／イントロン配列、輸送配列、分泌シグナル配列、核局在シグナル配列、ＩＲＥＳ、ポリＡ転写終結配列、３部分からなるリーダー配列、複製または組み込みに関与する配列が挙げられる。本発明において好適なイントロンの、説明に役立つ実例としては、αまたはβグロビン（すなわち、ウサギβグロビン遺伝子の第２イントロン; Green et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16, 369; Karasuyama et al., 1988, Eur. J. Immunol. 18, 97-104）、オボアルブミン、アポリポタンパク質、免疫グロブリン、第ＩＸ因子および第ＶIII因子をコードする遺伝子から単離されたもの、ＳＶ４０１６Ｓ／１９Ｓイントロン(Okayma and Berg, 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 280-289)ならびにマウス免疫グロビン受容体と融合するヒトβグロビン供与体で作製されたｐＣＩベクター（Promega Corp, ｐＣＩ哺乳類発現ベクターＥ１７３１）に存在するイントロンのような合成イントロンが挙げられる。融合タンパク質の分泌が望ましい場合には、好適な分泌シグナルがベクターに組み込まれる。シグナル配列は、融合タンパク質に内在しているもの（例えば、Ｘ構成要素またはＹ構成要素に内在しているもの）であってよいし、または融合タンパク質に関与するＸ構成要素およびＹ構成要素以外からのものであってよい。当業者ならば、発現ベクターに有用な数多くの調節配列を認識している。

本発明の好ましい態様は、Ｅ１領域の代わりに挿入され、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれた本発明の核酸分子を含んでなるＥ１−およびＥ３−欠失複製欠損アデノウイルスベクターに向けられる。

さらに、本発明のベクターは、１以上の導入遺伝子（すなわち、宿主細胞または生物体において本発明の核酸分子とともに発現させようとする目的の遺伝子）をさらに含んでなり得る。その導入遺伝子の発現が、本発明のベクターを与える目的である疾患または病状に対して治療または防御活性を有することが望ましい。好適な導入遺伝子としては、限定されるものではないが、（ｉ）腫瘍増殖阻害剤および／または（ii）それに対する免疫応答が望まれる少なくとも１つの特異的抗原、をコードする遺伝子が挙げられる。本発明の好ましい形態では、導入遺伝子産物と融合タンパク質が免疫応答の誘導または治療的（例えば、抗腫瘍）効用の提供において相乗的に作用する。よって、このような組合せは、疾患の免疫学的予防に好適なだけでなく、驚くべきことに、ウイルス、細菌または寄生虫感染のような疾患、さらには、癌のような慢性疾患の免疫療法にも好適である。

腫瘍増殖阻害剤は、直接、細胞増殖を抑制するか、または腫瘍細胞を死滅させることにより作用する。腫瘍増殖阻害剤の代表的な例としては、毒素および自殺遺伝子が挙げられる。毒素の代表的な例としては、限定されるものではないが、リシン(Lamb et al., 1985, Eur. J. Biochem. 148, 265-270)、ジフテリア毒素(Tweten et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 10392-10394)、コレラ毒素(Mekalanos et al., 1983, Nature 306, 551-557; Sanchez and Holmgren, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 481-485)、ゲロニン(Stirpe et al., 1980, J. Biol. Chem. 255, 6947-6953)、抗ウイルスタンパク質(Barbieri et al., 1982, Biochem. J. 203, 55-59; Irvin et al., 1980, Arch. Biochem. Biophys. 200, 418-425)、トリチン、赤痢菌(Shigella)毒素(Calderwood et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4364-4368; Jackson et al., 1987, Microb. Path. 2, 147-153)および緑膿菌(Pseudomonas)外毒素Ａ(Carroll and Collier, 1987, J. Biol. Chem. 262, 8707-8711)が挙げられる。

<<自殺遺伝子>>は、本発明において、不活性物質（プロドラッグ）を細胞傷害性物質へと形質転換し、その結果として、細胞死を引き起こすことのできる発現産物をコードする遺伝子と定義することができる。ＴＫＨＳＶ−１をコードする遺伝子は、自殺遺伝子ファミリーの典型的メンバーを構成している(Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552)。ＴＫポリペプチドは、それ自体は無毒であり、アシクロビルまたはガンシクロビルのようなヌクレオシド類似体（プロドラッグ）の形質転換を触媒する。形質転換されたヌクレオシドが、伸長プロセスにあるＤＮＡ鎖に組み込まれ、前記伸長の障害が起き、そのために細胞分裂の阻害が起こる。多数の自殺遺伝子／プロドラッグ組合せが、現在、利用可能である。より詳しく記載されているものが、ラットシトクロムｐ４５０およびシクロホスファミド(Wei et al., 1994, Human Gene Ther. 5, 969-978)、大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよび６−メチルプリンデオキシリボヌクレオシド(Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 223-238)、大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよび６−チオキサンチン(Mzoz et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 589-595)である。しかしながら、好ましい態様では、本発明のベクターは、プロドラッグ５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）とともに使用できる、シトシンデアミナーゼ（ＣＤアーゼ）活性もしくはウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴアーゼ）活性を有するポリペプチドまたはＣＤアーゼ活性とＵＰＲＴアーゼ活性の両方を有するポリペプチドをコードする自殺遺伝子を含んでなる。好適なＣＤアーゼコード遺伝子としては、限定されるものではないが、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ＦＣＹ１遺伝子（Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6; ＷＯ９３／０１２８１）および大腸菌ｃｏｄＡ遺伝子（ＥＰ４
０２１０８）が挙げられる。好適なＵＰＲＴアーゼコード遺伝子としては、限定されるものではないが、大腸菌（ｕｐｐ遺伝子; Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 51-56）およびサッカロミセス・セレビシエ（ＦＵＲ−１遺伝子; Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157）由来のものが挙げられる。好ましくは、ＣＤアーゼコード遺伝子がＦＣＹ１遺伝子由来のものであり、ＵＰＲＴアーゼコード遺伝子がＦＵＲ−１遺伝子由来のものである。特に重要なことは、ＷＯ９９／５４４８１（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている、ＣＤアーゼ活性とＵＰＲＴアーゼ活性（ＦＣＵ−１）の両方を有する２ドメイン酵素をコードする融合タンパク質の使用である。

特異的抗原は、好ましくは、特定の病原体（ウイルス、細菌、真菌または寄生虫）に対するまたは非自己抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対する、特異的および／または非特異的な、抗体および／または細胞媒介性免疫応答を与えやすいものである。好ましくは、選択された抗原がエピトープを含んでなり、そのエピトープがＭＨＣクラスＩタンパク質によって細胞表面と結合し、そこに存在する。特異的抗原の代表的な例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：

・Ｂ型肝炎表面抗原の抗原は当技術分野では周知であり、それらとしては、とりわけ、欧州特許出願ＥＰ４１４３７４；ＥＰ３０４５７８およびＥＰ１９８４７４に記載されているＰｒｅＳ１、Ｐａｒｓ２Ｓ抗原が挙げられる。

・コア（Ｃ）、エンベロープ糖タンパク質Ｅ１、Ｅ２、非構造ポリペプチドＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４（ＮＳ４ａおよび／もしくはＮＳ４ｂ）、ＮＳ５（ＮＳ５ａおよび／もしくはＮＳ５ｂ）またはそれらのあらゆる組合せ（例えば、ＮＳ３とＮＳ４、ＮＳ３とＮＳ４とＮＳ５ｂ）からなる群から選択される免疫原性抗原またはその断片を含むＣ型肝炎ウイルスの抗原

・ＨＩＶ−１ウイルスの抗原、特に、ｇｐ１２０およびｇｐ１６０（ＷＯ８７／０６２６０に記載されている）。

・陰部疣贅（ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１など）および子宮頸癌（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ−３３など）と関連があると考えられているヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）由来の抗原。特に重要なＨＰＶ抗原は、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１およびＬ２からなる群から個別にまたは組み合わせて選択される（例えば、ＷＯ９４／００１５２、ＷＯ９４／２０１３７、ＷＯ９３／０２１８４、ＷＯ９０／１０４５９およびＷＯ９２／１６６３６参照）。本発明において特に重要なものは、ＨＰＶ関連癌に対する抗腫瘍効果を実現するのに特に好適な、早期ＨＰＶ−１６Ｅ６および／またはＥ７抗原の膜結合型非発癌性変異体（ＷＯ９９／０３８８５に記載）である。

・マラリアの原因である寄生虫由来の抗原。例えば、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodia falciparum)由来の好ましい抗原としては、ＲＴＳ（ＷＯ９３／１０１５２）およびＴＲＡＰ（ＷＯ９０／０１４９６）が挙げられる。候補と考えられる他のマラリア原虫抗原は、熱帯熱マラリア原虫ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、セキストリン、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７１２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０および他のマラリア原虫(Plasmodium)種のそれらの類似体である。

・他の好適な抗原としては、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、肉腫癌または黒色腫癌に関連したもののような腫瘍関連抗原が挙げられる。典型的な抗原としては、ＭＡＧＥ１、３およびＭＡＧＥ４または他のＭＡＧＥ抗原（ＷＯ９９／４０１８８）、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹＥｏｓ１の別名でも知られる）ＳＡＧＥならびにＨＡＧＥ（ＷＯ９９／５３０６１）またはＧＡＧＥ(Robbins and Kawakami, 1996. Current Opinions in Immunol. 8, pps 628-636)が挙げられる。他の好適な腫瘍関連抗原としては、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡをはじめとするプロスターゼとして知られるものが挙げられる。プロスターゼヌクレオチド配列および推定ポリペプチド配列ならびにホモログは、Ferguson, et al. (1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 3114-3119)ならびにＷＯ９８／１２３０２、ＷＯ９８／２０１１７およびＷＯ００／０４１４９に開示されている。他の好適な腫瘍関連抗原としては、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２およびＭＵＣ−１のような乳癌に関連したもの（例えば、ＷＯ９２／０７０００参照）が挙げられる。

本発明において使用される導入遺伝子は、選択された宿主細胞または生物体においてその構成的または誘導的な発現を可能にするために好適な調節エレメントの制御下に置かれる。このような調節エレメントの選択は、当業者が理解できる範囲にある。本発明の融合タンパク質の発現に関して以上で記載したように、構成的プロモーター、誘導プロモーター、腫瘍特異的プロモーターおよび組織特異的プロモーターからなる群から調節エレメントを選択することが好ましい。１つの例では、高度発現を確実にするために導入遺伝子がＣＭＶプロモーターの制御下に置かれる。

本発明において使用される導入遺伝子は、ベクターのあらゆる位置に挿入することができる。１つの選択肢によれば、導入遺伝子を、好ましくは、本発明の核酸分子に接近して置かない。もう１つの選択肢によれば、導入遺伝子を、核酸分子に対してアンチセンス方向に置いて、２つの発現カセット間の転写干渉を避けてもよい。例えば、アデノウイルスゲノムにおいては、導入遺伝子を、本発明の核酸分子の異なる欠失領域（Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４）に挿入するか、または前記核酸分子と同じ欠失領域に、互いにアンチセンス方向に挿入することができる。

本発明の核酸分子のベクター骨格への導入は、あらゆる種類のベクターに関する技術分野において好適な遺伝子工学的戦略により、例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されている方法により進めることができる。一般に、核酸分子のアデノウイルスベクターへの導入では、融合物をコードする核酸分子を含んでなる細菌プラスミドを操作して、複製または構成に必要なアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１）を置換核酸分子と置き換える。次いで、そのプラスミドをシャトルベクターとして使用し、アデノウイルスゲノムの相補的部分を含有する第２のプラスミドと合わせて、２つのプラスミドにおけるアデノウイルス配列のオーバーラッピングによって起こる相同組換えを可能にする。組換えは、好適な哺乳類宿主（Graham and Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7 “Gene Transfer and Expression Protocols”; Ed E. J. Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJに記載されている２９３など）あるいは酵母ＹＡＣクローンまたは大腸菌（ＷＯ９６／１７０７０に記載されている）において直接行われ得る。完成したアデノウイルスゲノムを、続いて、複製およびウイルスキャプシド形成のために哺乳類宿主細胞にトランスフェクトする。

本発明はまた、特定の標的細胞の選択的ターゲッティングを可能にするよう改変した本発明のベクターまたはその粒子も包含する。本発明の標的化ベクター／粒子（ウイルス起源および非ウイルス起源のいずれものもの、例えば、ポリマーベクター複合体および脂質ベクター複合体）の独特の特徴は、細胞成分および表面露出成分を認識し、その成分と結合し得る標的化部分がそれらの表面に存在することである。このような標的化部分としては、限定されるものではないが、化学的コンジュゲート、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリジン、ＰＥＩなど）、ペプチド、ポリペプチド（例えば、ＷＯ９４／４０９５８に記載されているＪＴＳ１）、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチン、抗体およびそのフラグメントが挙げられる。それらは、好ましくは、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原エピトープまたは腫瘍関連マーカーを認識し、それと結合し得る。これに関連して、アデノウイルスの細胞ターゲッティングは、ウイルスの表面に存在するキャプシドポリペプチド（例えば、ファイバー、ペントンおよび／またはｐＩＸ）をコードするウイルス遺伝子の遺伝子改変によって行うことができる。このような改変の例は、文献に記載されている（例えば、Wickam et al., 1997, J. Virol. 71, 8221-8229; Arnberg et al., 1997, Virol. 227, 239-244; Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668; ＷＯ９４／１０３２３、ＥＰ０２３６０２０４およびＷＯ０２／９６９３９に記載されている）。例としては、ＥＧＦをコードする配列を、アデノウイルスファイバーをコードする配列内に挿入して、ＥＧＦ受容体を発現する細胞に標的化させる。ポックスウイルス親和性の改変もＥＰ１１４６１２５に記載されているように行うことができる。細胞特異的ターゲッティングについての他の方法は、ウイルス粒子の表面にある標的化部分の化学的コンジュゲーションにより行うことができる。

もう１つの態様では、本発明は、以上で記載した本発明の核酸分子またはベクターを含んでなる感染性ウイルス粒子に関する。

本発明はまた、感染性ウイルス粒子を作製するための手順であって、
（ａ）本発明のウイルスベクターを好適な細胞系統に導入する工程、
（ｂ）前記感染性ウイルス粒子を作製させるために、前記細胞系統を好適な条件下で培養する工程、および
（ｃ）前記細胞系統の培養物から作製された感染性ウイルス粒子を回収する工程、さらに
（ｄ）所望により、前記回収された感染性ウイルス粒子を精製する工程
を含んでなる手順にも関する。

本発明の核酸分子を含有するベクターは、当業者には容易に利用可能な周知の技術を用いて増殖または発現に好適な細胞系統に導入することができる。これらの技術としては、限定されるものではないが、微量ＤＮＡの細胞の核へのマイクロインジェクション(Capechi et al., 1980, Cell 22, 479-488)、ＣａＰＯ_４によるトランスフェクション(Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 2745-2752)、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション(Chu et al., 1987, Nucleic Acid Res. 15, 1311-1326)、リポフェクション／リポソーム融合(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417)、粒子衝撃(Yang et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572)、遺伝子銃、形質導入、感染（例えば、感染性ウイルス粒子による）およびSambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、N. Y., 2001)に見られるような他の技術が挙げられる。

本発明のベクターが欠損している場合には、感染粒子を、通常、相補的に作用する細胞系統において作製するかまたはヘルパーウイルスの使用を介して作製し、途中で非機能的ウイルス遺伝子を補う。例えば、アデノウイルスベクターを補うのに好適な細胞系統としては、２９３細胞(Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36, 59-72)ならびにＥ１機能を補うのに一般的に使用されるＰＥＲ−Ｃ６細胞(Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917)が挙げられる。二重欠損アデノウイルスベクターを補うように操作された他の細胞系統もある（Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565; Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Ther. 6, 1575-1586; Wang et al., 1995, Gene Ther. 2, 775-783; Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2033; ＷＯ９４／２８１５２およびＷＯ９７／０４１１９）。感染性ウイルス粒子は、培養上清から回収することができ、溶解後、細胞からも回収でき、所望により、標準的な技術（例えばＷＯ９６／２７６７７、ＷＯ９８／００５２４、ＷＯ９８／２２５８８、ＷＯ９８／２６０４８、ＷＯ００／４０７０２、ＥＰ１０１６７００およびＷＯ００／５０５７３に記載されているクロマトグラフィー、塩化セシウム勾配超遠心分離法）によってさらに精製される。

本発明はまた、本明細書において記載する本発明の核酸分子、ベクターまたは感染性ウイルス粒子を含んでなる宿主細胞にも関する。本発明の目的では、「宿主細胞」とは、組織、器官または単離細胞の特定の組織体に関する、限定されることなく広く理解すべき用語である。このような細胞は、特異な種類の細胞に属するものであってよいし、または様々な種類の細胞群であってもよく、培養細胞系、一次細胞および増殖性細胞を包含する。

よって、宿主細胞としては、原核細胞、酵母のような下等真核細胞ならびに昆虫細胞、植物および高等真核細胞（例えば、脊椎動物細胞）のような他の真核細胞が挙げられるが、哺乳類（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞が特に好ましい。好適な哺乳類細胞としては、限定されるものではないが、造血細胞（全能性幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、ＡＰＣ、樹状細胞、非ヒト細胞など）、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞（例えば、骨格筋、心筋または平滑筋）または繊維芽細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、大腸菌、バチルス属(Bacillus)、リステリア属(Listeria)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＭＤＣＫ細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞系統）、ＣＲＦＫ細胞（Ｃｒａｎｄｅｌｌネコ腎臓細胞系統）、ＣＶ−１細胞（アフリカザル腎臓細胞系統）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＶｅｒｏ細胞が挙げられる。宿主細胞は、上記のもののような本発明の複製欠損ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）の少なくとも１つの欠損機能を補い得る相補的に作用する細胞も包含する。

本発明の宿主細胞は、２以上の本発明の核酸分子、ベクターまたは感染性ウイルス粒子を含んでもよい。さらに、本発明の宿主細胞は、導入遺伝子、例えば、上記のような導入遺伝子をコードするベクターをさらに含んでなってもよい。２以上の核酸分子、ベクターまたは感染性ウイルス粒子を細胞に導入する場合、核酸分子、ベクターまたは感染性ウイルス粒子を個別に導入してもよいし、または同時に導入してもよい。

さらに、特定の態様によれば、本発明の宿主細胞をさらにカプセル封入することができる。細胞カプセル封入技術は、これまでに記載されているものである(Tresco et al., 1992, ASAIO J. 38, 17-23; Aebischer et al., 1996, Human Gene Ther. 7, 851-860)。前記特定の態様によれば、トランスフェクト真核宿主細胞または感染真核宿主細胞を、微多孔膜を形成する化合物を用いてカプセル封入し、前記カプセル封入された細胞をさらにin vivo移植することができる。目的の細胞を含有するカプセルを、一方で、移植された細胞の宿主細胞との接触を妨げながら、タンパク質と栄養素とがカプセル内外を自由に通過するのに適した分子量カットオフを有する中空微多孔膜を使用して調製してもよい（例えば、Akzo Nobel Faser AG, Wuppertal, Germany; Deglon et al. 1996, Human Gene Ther. 7, 2135-2146）。

本発明のさらなる態様は、本発明のベクター、感染性ウイルス粒子および／または宿主細胞を使用して融合タンパク質を組換えにより作製するための方法である。融合タンパク質を作製するための方法は、本発明のベクターまたは感染性ウイルス粒子を好適な宿主細胞に導入すること、トランスフェクト宿主細胞または感染宿主細胞を産生すること、前記トランスフェクト宿主細胞または感染宿主細胞を宿主細胞の増殖に好適な条件下でin-vitro培養すること、および、その後、前記培養物から前記融合タンパク質を回収すること、さらに、所望により、前記回収された融合タンパク質を精製することを含む。当業者ならば、好適な宿主細胞における本発明の融合タンパク質の発現に利用可能な数多くの発現系を熟知しているであろう。

本発明の宿主細胞は、好ましくは、宿主細胞を、１以上の本発明の核酸分子を含んでなる１以上の組換え分子（例えば、本発明のベクター）でトランスフェクトする／に感染させることにより作製される。組換えＤＮＡ技術を利用して、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、核酸分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率、翻訳後修飾の効率および好適な選択の使用を操作することにより、宿主細胞における核酸分子の発現を高めてもよい。本発明の核酸分子の発現を増強するのに有用な組換え技術としては、限定されるものではないが、高コピー数ベクターの使用、ベクター安定配列の付加、１以上の転写調節配列（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳調節配列（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガルノ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用頻度に対応するための本発明の核酸分子の修飾および転写物を不安定にする配列の欠失が挙げられる。

本発明の宿主細胞は、従来の発酵バイオリアクター、フラスコおよびペトリ板で培養させることができる。培養は、特定の宿主細胞に好適な温度、ｐＨおよび酸素含有量で実施することができる。原核細胞および真核細胞におけるタンパク質の発現について知られる種々の方法をここで詳細に記載しようとしているのではない。１つの態様において、ベクターは、好適な調節エレメントと関連して作用する、融合物をコードする核酸分子を含有するプラスミドである。本発明の方法において使用される好ましい宿主細胞は、哺乳類細胞系統、酵母細胞および細菌細胞である。

融合タンパク質が生成細胞外に分泌されない場合、または融合タンパク質が完全には分泌されない場合には、凍結融解、超音波処理、機械的破砕、溶解剤の使用などをはじめとする標準的な破砕手法により細胞から回収することができる。分泌される場合には、培養培地から直接回収することができる。こうして、融合タンパク質を回収し、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、ゲル電気泳動、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーをはじめとする周知の精製方法により精製することができる。本発明の特定の融合タンパク質を精製するのに使用される条件および技術は、合成方法および正味電荷、分子量、疎水性、親水性のような因子によって異なるが、当業者には明らかであろう。さらに当然のことながら、本明細書において記載する融合タンパク質の組換え生産に使用される宿主細胞に応じて、融合タンパク質が多様なグリコシル化パターンを有し得るか、またはグリコシル化されていないことがある（例えば、細菌で生産させる場合）。さらに、宿主媒介手順を受けて、融合タンパク質が開始メチオニンを含んでいる場合がある。

本発明の融合タンパク質は、細胞物質を実質的に含まない程度まで精製することができる。精製レベルは、使用目的に応じたものとする。調製物は、他の成分がかなりの量で存在していても融合タンパク質の所望の機能を可能にするものという重大な特徴がある。一部の用途では、「細胞物質を実質的に含まない」とは、約３０％未満（乾燥重量で）の他のタンパク質（すなわち、夾雑タンパク質）を含有する融合タンパク質、好ましくは、約２０％未満の他のタンパク質、より好ましくは、約１０％未満の他のタンパク質、あるいはさらに好ましくは、約５％未満の他のタンパク質を含有する融合タンパク質の調製物を含む。融合タンパク質を組換えにより生産すると、その融合タンパク質は培養培地も実質的に含みまない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物量の約２０％未満である。

もう１つの態様では、本発明は、有効量の、本発明の融合タンパク質、発現ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞またはそれらのあらゆる組合せ（本明細書では「活性剤」とも呼ぶ）、および、所望により、医薬上許容されるビヒクルを含んでなる医薬組成物を提供する。特別な場合では、組成物が、（ｉ）コードされる融合タンパク質の性質が異なりかつ／または（ii）融合タンパク質の発現に使用される調節配列の性質が異なりかつ／または（iii）導入遺伝子が追加的に存在することが異なり、かつ／または（iv）ベクター骨格が異なる２以上の活性剤を含んでなってよい。

本発明の組成物は、前記組成物を全身投与、局所投与および局在化投与をはじめとする種々の投与様式により投与することによって、疾患にかかりやすいか、または疾患を患っている哺乳動物を防御または治療するために使用し得る。全身投与では、注射、例えば、皮下注射、皮内注射、筋肉注射、静脈注射、腹腔内注射、髄腔内注射、心腔内注射（例えば、経心内膜および心膜）、腫瘍内注射、腟内注射、肺内注射、鼻腔内注射、気管内注射、血管内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、脳室内注射、経皮的（局所的）注射またはリンパ節内への直接注射が好ましい。筋肉内投与、皮内投与、静脈内投与または腫瘍内投与が全身投与に好ましい経路となる。また、本発明の組成物を、経口／食事性経路、経鼻経路、気管内経路、腟内経路または直腸内経路のような粘膜経路を介して投与してもよい。好ましい粘膜投与経路は、経鼻経路または気管内経路を介するものである。

本明細書において、「医薬上許容されるビヒクル」とは、医薬投与に適合するあらゆる担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬ならびに吸収遅延剤などを含むものとする。

適切には、本発明の医薬組成物は、ヒトまたは動物生物体への注射によるその送達に好適な担体および／または希釈剤を含んでなる。このような担体および／または希釈剤は、使用する用量および濃度において無毒である。このような担体および／または希釈剤は、組成物を非経口投与用に単回投与型または複数回投与型のいずれかに、または持続注入もしくは定期的注入による直接注入用に製剤するのに通常使用されるものから選択される。このような担体および／または希釈剤は、好ましくは、等張性、低張性または弱高張性であり、糖、ポリアルコールおよび等張性食塩水によって提供されるような比較的低いイオン強度を有している。代表的な例としては、滅菌水、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム）、静菌水、リンガー溶液、グルコースまたはサッカロース溶液、ハンクス溶液および他の水性生理的平衡塩類溶液（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkinsの最新版参照）が挙げられる。本発明の組成物のｐＨは、ヒトまたは動物での使用に好適であるように適切に、好ましくは、生理的または弱塩基性ｐＨ（約ｐＨ８〜約ｐＨ９の間、特に好ましくはｐＨ８．５）に調整され、中和される。好適なバッファーとしては、リン酸バッファー（例えば、ＰＢＳ）、重炭酸バッファーおよび／またはＴｒｉｓバッファーが挙げられる。特に好ましい組成物は、１Ｍサッカロース、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、５４ｍｇ／ｌＴｗｅｅｎ８０、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．５で製剤される。もう１つの好ましい組成物は、１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌＨＳＡ、２０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．２，および１５０ｍＭＮａＣlで製剤される。これらの組成物は、−７０℃にて少なくとも６ヶ月間安定している。

本発明の組成物は、種々の形態、例えば、固体（例えば、粉末、凍結乾燥形態）または液体（例えば、水性）であり得る。固体組成物の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、この方法により、予め滅菌濾過した活性剤と所望のあらゆる追加成分との溶液から、その粉末が得られる。このような溶液は、必要に応じて、注射用滅菌水の添加による再構成が可能な滅菌アンプルで保存することができる。

ネブライザーまたはエアゾール製剤もまた、本発明の一部である。鼻腔内投与の方法は当技術分野では周知であり、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素のようなガスの入った加圧容器またはディスペンサー、あるいはネブライザーから、液滴、スプレーまたは乾燥粉末形態の組成物を治療すべき個体の鼻咽頭に投与することなどがある（例えば、ＷＯ９５／１１６６４参照）。経口投与用の胃耐性カプセル剤および顆粒剤のような腸溶性製剤、直腸投与または膣投与用の坐剤もまた、本発明の一部である。非経口投与では、組成物が粘膜の孔の大きさを増大させる吸収促進剤も含み得る。このような吸収促進剤としては、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、ジメチル−β−シクロデキストリン、ラウロイル−１−リソホスファチジルコリンおよび粘膜のリン脂質ドメインと構造類似性を有する他の物質が挙げられる。

組成物は、例えば、製剤のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄度、色、無菌性、安定性、溶解速度を改変または維持する、ヒトまたは動物生物体への放出または吸収を改変または維持するといった所望の薬剤学的特性または薬物動態学的特性を提供するために、他の医薬上許容される賦形剤も含み得る。例えば、ポリエチレングリコールのようなポリマーを使用して、溶解度、安定性、半減期の所望の特性および他の医薬上有利な特性を得てもよい(Davis et al., 1978, Enzyme Eng. 4, 169-173; Burnham et al., 1994, Am. J. Hosp. Pharm. 51, 210-218)。安定化成分の代表的な例としては、ポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロースおよびそれらの組合せが挙げられる。プラスミドに基づく組成物に特に好適な他の安定化成分としては、ヒアルロニダーゼ（ＷＯ９８／５３８５３に記載されているように、宿主細胞の細胞外基質を不安定にすると考えられている）、クロロキン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチルＬ−２−ピロリドンまたはその誘導体のようなプロトン性化合物、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチル−ホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリル（ＥＰ８９０３６２参照）のような非プロトン性化合物、アクチンＧ（ＷＯ９９／５６７８４）のようなヌクレアーゼ阻害剤ならびにマグネシウム（Ｍｇ^２＋）（ＥＰ９９８９４５）およびリチウム（Ｌｉ^＋）（ＷＯ０１／４７５６３）のようなカチオン塩とそのあらゆる誘導体が挙げられる。本発明の組成物におけるカチオン塩の量は、好ましくは、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの間であり、なおさらに好ましくは、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの間である。増粘剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランが挙げられる。組成物は、血液関門または特定の器官の膜を通じた浸透または輸送を促進する当技術分野で公知の物質も含み得る（例えば、トランスフェリン受容体に対する抗体; Friden et al., 1993, Science 259, 373-377）。ポリリジンとラクトースのゲル複合体(Midoux et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 871-878)またはポロキサマー４０７(Pastore, 1994, Circulation 90, I-517)を使用して、動脈細胞内での投与を容易にすることができる。

本発明の組成物は、ヒトにおける全身適用または粘膜適用に好適な１以上のアジュバントを含んでなってもよい。有用なアジュバントの代表的な例としては、限定されるものではないが、ミョウバン、フロイントの完全アジュバントおよび不完全アジュバントのような鉱油エマルション、リポ多糖類またはその誘導体(Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)、ＱＳ２１（Sumino et al., 1998, J. Virol. 72, 4931-4939; ＷＯ９８／５６４１５）、エスシン、ジギトニン、ジプソフィラ属(Gypsophila)またはキノア(Chenopodium quinoa)サポニンのようなサポニンが挙げられる。また、本発明の組成物を、キトサンまたは他のポリカチオン性ポリマー、ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン系ポリマーマトリックス、ポリ糖類または化学改変型ポリ糖類からなる粒子、ならびに脂質系粒子他からなる従来のワクチンビヒクルとともに製剤してもよい。また、組成物を、リポソームのような粒子構造を形成させるために、コレステロールの存在下で製剤してもよい。

組成物は、特に、動物またはヒト生物体における免疫応答を増強するのに有効な量で患者に投与され得る。本明細書において、<<有効な量>>とは、所望の生物学的作用を実現するのに十分な量を指す。例えば、免疫応答を増強するのに有効な量は、免疫系の活性化をもたらし、例えば、その結果として、癌患者における抗腫瘍反応（例えば、組成物が注入された腫瘍および／または遠位の腫瘍のサイズ縮小または退縮）を起こすのに必要な量でもあり得る。適切な用量は、特定の活性剤の薬力学的特性、宿主生物体の年齢、健康状態および重量；治療すべき状態、症状の性質および程度、併用治療の種類、治療頻度、予防もしくは治療の必要性ならびに／または所望の効果のような既知因子に応じて変動し得る。用量は、選択された特定の投与経路に応じても算出される。通常、医師により、関連した状況に照らして、治療に適切な用量を決定するのに必要な計算にさらなる改善が行われる。一般的指針では、ウイルス（例えば、アデノウイルス）粒子に基づく組成物は、１０^４〜１０^１４ｉｕの間（感染単位）、有利には１０^５〜１０^１３ｉｕの間、好ましくは、１０^６〜１０^１２ｉｕの間の用量で製剤することができる。力価は、従来の技術によって決定され得る。ベクタープラスミドに基づく組成物は、１μｇ〜１００ｍｇの間、有利には１０μｇ〜１０ｍｇの間、好ましくは、１００μｇ〜１ｍｇの間の用量で製剤することができる。タンパク質に基づく組成物は、１０ｎｇ〜１００ｍｇの間の用量で製剤することができる。好ましい用量は、体重ｋｇ当たり治療用タンパク質約１μｇ〜約１０ｍｇである。投与は、単回用量か、または一定の時間間隔をおいて１回または数回繰り返す用量で行ってよい。１つの好ましい態様では、本発明の組成物が、従来のシリンジおよび注射針、または固体組成物の衝撃送達用に設計された装置（ＷＯ９９／２７９６１）、あるいは注射針不要の加圧液体ジェット装置（米国特許第４，５９６，５５６号；同第５，９９３，４１２号）を用いて注射により投与される。

本発明の組成物は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量型バイアルに封入することができる。いずれの場合でも、組成物は、滅菌済のものでなければならず、容易に注射可能な程度に流体であるべきである。組成物は、製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用から保護しなければならない。滅菌注射剤は、必要量の活性剤（例えば、融合タンパク質または感染粒子）を以上に列挙した１成分または成分の組合せとともに導入し、続いて、滅菌濾過することにより調製することができる。

本発明の医薬組成物は、遺伝的疾患、先天性疾患、ならびに感染症（例えば、ウイルス感染および／または細菌感染）、癌、免疫不全症および自己免疫疾患のような後天性疾患をはじめとする種々の疾患および病態を治療または予防するための方法に使用し得る。よって、本発明はまた、このような疾患、特に癌または感染症を治療または予防することを目的とする薬剤の調製のための、本発明の融合タンパク質、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞または組成物の使用も包含する。

本発明の組成物は、特に、癌に関連する障害、症状または疾患の予防的または治癒的治療を目的としている。「癌」とは、広汎性または限局性腫瘍、転移、癌性ポリープおよび前新生物（例えば、形成異常）ならびに望まれていない細胞増殖が原因で起こる疾患を含むあらゆる担癌状態を包含する。本明細書において記載する方法に従う治療には種々の腫瘍が選択され得る。一般に、固形腫瘍が好ましい。本発明において意図される癌としては、限定されるものではないが、膠芽腫、肉腫、黒色腫、肥満細胞腫、癌腫ならびに乳癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌（特に、乳頭腫ウイルスに起因するもの）、肺癌（例えば、大細胞癌、小細胞癌、扁平上皮癌および腺癌を含む肺癌）、腎臓癌、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、肛門癌、膵臓癌、胃癌、消化管癌、口腔癌、喉頭癌、脳癌およびＣＮＳ癌、皮膚癌（例えば、黒色腫および非黒色腫）、血液癌（リンパ腫、白血病、特にそれらが固体塊として発現した場合）、骨癌、網膜芽細胞腫ならびに甲状腺癌が挙げられる。本発明の使用の１つの好ましい態様では、組成物が固形腫瘍内にまたは固形腫瘍に接近して投与される。

他の病的疾患および症状、特に、真菌、細菌、原虫およびウイルスのような病原体による感染と関わりのある感染症も、本発明において意図されている。ウイルス病原体の代表的な例としては、限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２）、サイトメガロウイルス、ロタウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルス）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、パラミクソウイルス、コロナウイルス；呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、フラビウイルス属(Flavivirus)（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）、インフルエンザウイルス、好ましくは、ヒト乳頭腫ウイルス（例えば、ＨＰＶ−６、１１、１６、１８、３１、３３）が挙げられる。病原菌の代表的な例としては、ナイセリア属(Neisseria)（例えば、淋菌(N. gonorrhea)および髄膜炎菌(N. meningitides)）；ボルデテラ属(Bordetella)（例えば、百日咳菌(B. pertussis)、パラ百日咳菌(B. parapertussis)および気管支敗血症菌(B. bronchiseptica)）、マイコバクテリア属(Mycobacteria)（例えば、結核菌(M. tuberculosis)、ウシ結核菌(M. bovis)、らい菌(M. leprae)、鳥結核菌(M. avium)、パラ結核菌(M. paratuberculosis)、スメグマ菌(M. smegmatis)）；レジオネラ属(Legionella)（例えば、レジュネラ・ニューモフィラ菌(L. pneumophila)）；エシェリキア属(Escherichia)（例えば、毒素原性大腸菌(enterotoxic E. coli)、腸管出血性大腸菌(Enterohemorragic E. coli)、腸管病原性大腸菌(enteropathogenic E. coli)）；ビブリオ属(Vibrio)（例えば、コレラ菌(V. cholera)）；赤痢菌属(Shigella)（例えば
、ソンネ赤痢菌(S. sonnei)、志賀赤痢菌(S. dysenteriae)、フレクスナー赤痢菌(S. flexnerii)）；サルモネラ属(Salmonella)（例えば、チフス菌(S. typhi)、パラチフス菌(S. paratyphi)、豚コレラ菌(S. choleraesuis)、腸炎菌(S. enteritidis)）；リステリア属(Listeria)（例えば、リステリア菌(L. monocytogenes)）；ヘリコバクター属(Helicobacter)（例えば、ピロリ菌(H. pylori)）；シュードモナス属(Pseudomonas)（例えば、緑膿菌(P. aeruginosa)）；ブドウ球菌属(Staphylococcus)（例えば、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)）；腸球菌属(Enterococcus)（例えば、大便連鎖球菌(E. faecalis)、Ｅ．フェシウム(E. faecium)）、クロストリジウム属(Clostridium)（例えば、破傷風菌(C. tetani)、ボツリヌス菌(C. botulinum)、Ｃ．ディフィシレ(C. difficile)）；バチルス属(Bacillus)（例えば、炭疽菌(B. anthracis)）；コリネバクテリウム属(Corynebacterium)（例えば、ジフテリア菌(C. diphtheriae)）およびクラミジア属(Chlamydia)（例えば、トラコーマクラミジア(C. trachomatis)、Ｃ．ニューモニエ(C. pneumoniae)、オウム病クラミジア(C. psittaci)）が挙げられる。寄生虫病原体の代表的な例としては、マラリア原虫属(Plasmodium)（例えば、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)）、トキソプラズマ属(Toxoplasma)（例えば、トキソプラスマ原虫(T. gondii)）リーシュマニア属(Leishmania)（例えば、大形リーシュマニア(L. major)）、ニューモシスチス属(Pneumocystis)（例えば、Ｐ．カリニ(P. carinii)）、トリコモナス属(Trichomonas)（例えば、腟トリコモナス(T. vaginalis)）、住血吸虫属(Schisostoma)（例えば、マンソン住血吸虫(S. mansoni)）が挙げられる。真菌の代表的な例としては、カンジダ属(Candida)（例えば、Ｃ．アルビカンス(C. albicans)）およびアスペルギルス属(Aspergillus)が挙げられる。

自己免疫疾患の例としては、限定されるものではないが、多発性硬化症（ＭＳ）、硬皮症、慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎、真性糖尿病、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、グレーブズ病、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、多発性筋炎／皮膚筋炎、橋本病、自己免疫性血球減少症、シェーグレン症候、血管炎症候群および薬剤誘発性自己免疫疾患（例えば、薬剤誘発性エリテマトーデス）が挙げられる。

さらに、上記のように、本発明の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、感染粒子、宿主細胞および／または組成物をアジュバントとして使用して、特定の抗原に対する動物またはヒト生物体の免疫応答を増強することができる。本発明のこの特定の使用を、例えば、免疫療法を目的として、以上で定義した１以上の導入遺伝子または導入遺伝子産物と組み合わせて行ってもよい。好ましくは、活性剤（例えば、本発明の融合タンパク質、感染粒子または医薬組成物）を、１以上の導入遺伝子または導入遺伝子産物と組み合わせて投与する。従って、導入遺伝子産物（例えば、ウイルス抗原または自殺遺伝子産物）と融合タンパク質を組み合わせて含んでなる組成物、ならびに導入遺伝子産物をコードするベクターまたはウイルス粒子と融合タンパク質を含んでなる組成物もまた提供されることが好ましい。導入遺伝子と融合物をコードする核酸配列は、同じベクターから発現され得るし、または同じ起源を有していても（例えば、アデノウイルスベクター）、異なる起源を有していてもよい別のベクター（例えば、特定の抗原をコードするＭＶＡベクターと融合タンパク質をコードするアデノウイルスベクター）からも発現され得る。融合タンパク質と導入遺伝子産物（またはそれら各々のコーディングベクター）は、宿主細胞または生物体に粘膜経路および／または全身経路を介して、同時にまたは逐次に導入することができる。

本発明において好ましい組合せは、（ｉ）配列番号１〜１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質、および（ii）ＨＰＶ抗原（これに関連して特に好ましくは、ＨＰＶ−１６の非発癌性膜結合型早期抗原である）を含んでなるか、またはそれらをコードする組成物の使用である。例えば、宿主生物体を、本発明の融合タンパク質を発現するベクターで処置し、さらに、非発癌性膜結合型ＨＰＶ−１６Ｅ７変異体またはそれを発現するベクターのいずれかで処置することができる。あるいは、宿主生物体を、本発明の融合タンパク質で処置し、さらに、非発癌性膜結合型ＨＰＶ−１６

Ｅ７変異体またはそれを発現するベクターのいずれかで処置してもよい。好ましくは、本発明の融合タンパク質がアデノウイルスベクターによってコードされ、ＨＰＶ抗原がＭＶＡベクターによってコードされる。これに関して、宿主生物体には、本発明の融合タンパク質をコードするアデノウイルスベクターを最初に投与し、１日〜２ヶ月の期間経過後に、続いて、同じ宿主生物体に免疫原性ＨＰＶ抗原をコードするＭＶＡベクターを投与する。融合タンパク質をコードするアデノウイルスベクターを粘膜経路により投与し、一方、ＭＶＡベクターを皮下経路により注入することが好ましい。これに関連して、融合タンパク質をコードする配列と非発癌性膜結合型ＨＰＶ−１６Ｅ７変異体をコードする配列の両方を含有する独特のベクターを含んでなる組成物も想定し得る。特定の抗原またはそれを発現するベクターの追加接種を、最初の投与から約２週間〜数年後に実施することもできる。

本発明においてもう１つの好ましい組合せは、（ｉ）配列番号１〜１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質またはそれをコードするベクター、および（ii）ＦＣＵ−１遺伝子産物をコードするベクター（ＷＯ９９／５４４８１に記載されているＣｄアーゼ−ＵＰＲＴアーゼ融合物）の使用である。好ましくは、本発明の融合タンパク質がアデノウイルスベクターによってコードされ、ＦＣＵ−１遺伝子産物がＭＶＡベクターによってコードされる。これに関して、宿主生物体には、両方のベクターを、例えば、腫瘍内注射により同時投与することができるし、または短時間のうちに逐次投与することもできる。その後、両ベクターの投与の翌日または翌週、宿主生物体にプロドラッグ５−ＦＣを施与する。

本発明はまた、ヒトまたは動物生物体の治療のための方法であって、前記生物体に治療上有効な量の本発明の融合タンパク質、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞または組成物を投与することを含む方法も提供する。本明細書において「治療上有効な量」とは、治療することが望まれる疾患または症状に伴って通常起こる１以上の症状の緩和に十分な用量である。予防的使用に関しては、この用語は疾患または症状の確立を妨げるか、あるいは遅延するのに十分な用量を意味する。

本発明の方法は、以上に挙げた疾患または症状に関する予防目的で使用することができ、治療用途でも使用することができる。当然のことながら、本方法は、種々のアプローチのいずれによっても行える。このため、本発明の融合タンパク質、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞または組成物を、以上に列挙したもののような任意の従来の生理学上許容される投与経路により、この投与経路に適した特異的送達手段を用いてin vivoで直接投与することができる。血管の透過性を高めた後に活性剤の投与を行うことが有利である。この透過性の上昇は、静水圧（すなわち、流出および／または流入を妨げることにより）、浸透圧（すなわち、高張液を用いて）を上昇させることによりおよび／または好適な薬剤（例えば、ヒスタミン；ＷＯ９８／５８５４２）を使用することにより得られ得る。

また、ex vivoで本発明の活性剤を含有するように操作した真核宿主細胞を使用してもよい。トランスフェクト／感染細胞をin vitroで増殖させた後、それを患者に再導入する。本発明においては、カプセル封入した宿主細胞の移植も可能である(Lynch et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1138-1142)。ex-vivo感染細胞は、自己細胞または異種細胞、例えば、１被験体または治療しようとする被験体と同様の状態にある複数の被験体から得られた異種細胞、のいずれかであり得る。それらの細胞は、単一細胞型のものまたは混合細胞型のものであり得る、例えば、それらが臨床腫瘍サンプルから確立された１細胞系統の細胞を含んでいる場合、または複数の細胞系統の細胞を含んでいる場合がある。投与用の細胞を、好ましくは、投与の前に、例えば、照射により不活性化することができる。それらの細胞のうち、このように有効に処置し得るものは、例えば、ヒトまたは非ヒト生物体の悪性細胞である（R Jurecic et al, ch 2, pp 7-30 in `Somatic Gene Therapy` CRC Press 1995, ed. P. L. Chang参照）。

動物またはヒト生物体において免疫応答を増強する本発明の活性剤または組成物の有効性は、限定されるものではないが、処置した生物体内の細胞性免疫の検出、リンパ球または樹状細胞活性の測定、免疫グロブリンレベルの検出、抗原提示細胞の活性の測定、処置した生物体が耐病性を有するかどうかの判定に好適な感染性因子または腫瘍誘発因子による処置した生物体の樹状細胞の発生または攻撃誘発の測定をはじめとする種々の方法により試験することができる。１つの態様において、治療用組成物はマウスのような動物モデルで試験することができる。このような技術は当業者には公知である。

上記のように、本発明の方法は、特に、癌の治療のために腫瘍増殖の阻害または腫瘍退縮を提供することを目的とする。例えば、腫瘍阻害は、実際の腫瘍サイズをある期間にわたって測定することにより判定してもよい。さらに詳しく言えば、種々の放射線画像検査法（例えば、単光子およびポジトロン放出断層撮影法；一般に、"Nuclear Medicine in Clinical Oncology," Winkler, C. (ed.) Springer-Verlag, New York, 1986参照）を利用して、腫瘍サイズを測定してもよい。このような方法では、例えば、従来の造影剤（例えば、クエン酸ガリウム−６７）だけでなく、代謝産物または受容体画像もしくは免疫学的画像に特化した試薬（例えば、特異的腫瘍マーカーに向けられた放射性標識モノクローナル抗体）も含む種々の造影剤も利用してよい。さらに、超音波（"Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors", Kossoff and Fukuda, (eds.), Igaku-Shoin, New York, 1984参照）のような非放射性方法を使用して、腫瘍のサイズを測定してもよい。また、腫瘍増殖の阻害は、腫瘍マーカーの存在下での変化に基づいて判定することができる。例としては、前立腺癌検出用のＰＳＡおよび結腸直腸および特定の乳癌検出用のＣＥＡが挙げられる。白血病のようなさらに他の種類の癌では、腫瘍増殖の阻害を典型的な血球数における白血病細胞数の減少に基づいて判定してもよい。

癌治療における本発明の活性剤の治療効力についてのさらなる検証は、好適な動物モデルにおいて、例えば、典型的なヒト癌細胞系統を注射したマウスを用いて行うことができる。固形腫瘍が相当の大きさの径まで増殖した後、マウスに活性剤を静脈内または腫瘍内注射し、その後、腫瘍増殖速度の低減および生存の増加についてモニターリングする（実施例４参照）。

疾患または症状の予防または治療は、本方法だけを使用して行うことができるし、または、必要に応じて、現在または従来の治療モダリティ（例えば、照射、化学療法および／または手術）と併用して行うこともできる。複数の治療的アプローチを使用することにより、患者に幅広い介入を提供する。１つの態様において、本発明の活性剤による治療を外科的介入によって進めることができる。もう１つの態様では、本発明の活性剤と組み合わせて放射線療法（例えば、γ線照射）が提供される。当業者ならば、本発明の方法に使用できる好適な放射線療法プロトコールおよびパラメーターを容易に作成することができる（例えば、Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB Lippincott Coを参照し、当業者には容易に理解できるような好適な改変および修飾による）。好ましくは、個体を治療上有効な量の抗癌照射に曝露する前に、本発明の活性剤を投与する。さらにもう１つの態様では、本発明の方法が化学療法と併用される。化学療法としては、単回用量で、あるいは、数時間、数日および／または数週間かけて投与される複数回用量で提供し得る細胞傷害性薬および／または細胞増殖抑制剤の投与が挙げられる。化学療法薬は、標準的な薬剤、用量および計画を用いる標準的なプロトコールに従って送達される、それらの投与は、本発明の活性剤の投与と同時に行ってもよいし、または本発明の活性剤の投与に続いて行ってもよい。好適な化学療法薬としては、限定されるものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、タモキシフェン、タキソール、５−ＦＵおよびメトトレキサートが挙げられる。いくつかの態様においては、本発明の活性剤の投与前または後に、化学療法と放射線治療の両方を使用する。

本発明の方法で、自殺遺伝子産物をコードする導入遺伝子を発現するように操作したベクター、感染粒子、宿主細胞または組成物を使用する場合には、医薬上許容される量の、自殺遺伝子発現産物に特異的なプロドラッグをさらに投与することが有利であり得る。２種類の投与は同時に行っても、または連続して行ってもよいが、本発明の活性剤の後にプロドラッグを投与することが好ましい。例として、プロドラッグの用量は５０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日を使用することができるが、用量２００ｍｇ／ｋｇ／日が好ましい。プロドラッグは、標準的な実施に従って投与される。経口経路が好ましい。単回用量のプロドラッグまたは宿主生物体または細胞内で毒性代謝産物を産生させるのに十分に長い期間繰り返す用量での投与が可能である。上記のように、プロドラッグガンシクロビルまたはアシクロビルは、ＴＫＨＳＶ−１遺伝子産物と組み合わせて、５−ＦＣはシトシンデアミナーゼおよび／またはウラシルホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物と組み合わせて使用することができる。

本発明はまた、動物またはヒト生物体において免疫応答を増強するための方法であって、前記免疫応答を増強するように、前記生物体に本発明の融合タンパク質、ベクター、感染粒子、宿主細胞または組成物を導入することを含む方法にも関する。その免疫応答は、特異的および／または非特異的な、体液性および／または細胞性応答であり得る。詳しくは、、その免疫応答がＴ細胞応答であり、さらに詳しは、細胞傷害性Ｔ細胞応答である。好ましくは、本発明の方法によって、選択された抗原に特異的なＣＴＬの数を増加させ、および／または細胞溶解活性を増強させる。導入は、好ましくは、皮下に、皮内に、筋肉内に、鼻腔内に、腫瘍内にまたは腫瘍に接近して行われる。１つの好ましい態様では、本発明の方法は、それに対する特異的免疫応答が望ましい１以上の特異的抗原（例えば、ＨＰＶ−１６Ｅ６またはＥ７変異体）からなる導入遺伝子産物を含んでなる活性剤または導入遺伝子産物を発現する活性剤を使用することによる、宿主細胞または生物体における抗原特異的免疫応答の増強に向けられる。もう１つの態様では、本発明の方法は、腫瘍に存在する１以上の腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原からなる導入遺伝子を含んでなる活性剤または導入遺伝子を発現する活性剤を使用することによる、前記抗原を有するあらゆる腫瘍の増殖を抑制するまたは再生を妨げるための、宿主細胞または生物体における抗原特異的免疫応答の増強に向けられる。

本発明はまた、動物またはヒト生物体において樹状細胞の成熟を促進することによって、腫瘍またはウイルス抗原に対する非特異的免疫応答を増強するという目的のために意図された薬剤の調製のための、本発明の融合タンパク質、ベクター、感染粒子、宿主細胞または組成物の使用も提供する。好ましい態様では、この使用は、樹状細胞の成熟を促進することにより好転し得る疾患の予防または治療を意図している。樹状細胞の成熟の増進は、実施例２で示すように評価することができる。１つの好ましい態様では、この使用に用いる融合タンパク質がＩＬ−２／ＩＬ−１８（特に好ましくは、示されているＩＬ−２／プロＩＬ−１８融合物とＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合物である）またはＩＬ−７／ＩＬ−２である。

本発明はまた、動物またはヒト生物体においてＮＫＴ細胞を活性化することによって、腫瘍またはウイルス抗原に対する非特異的免疫応答を増強するという目的のために意図された薬剤の調製のための、本発明の融合タンパク質、ベクター、感染粒子、宿主細胞または組成物の使用も提供する。好ましい態様では、この使用は、癌および感染症のような、ＮＫＴ細胞を活性化することにより好転し得る疾患の予防または治療を意図している。ＮＫＴ細胞の活性化の増強は、実施例２にて示すように評価することができる。１つの好ましい態様では、この使用に用いる融合タンパク質がＩＬ−２／ＩＬ−１８（特に好ましくは、示されているＩＬ−２／プロＩＬ−１８融合物とＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合物である）である。

本発明はまた、動物またはヒト生物体において投与した際に、個々のＸ構成要素および／またはＹ構成要素を投与した際に見られる細胞傷害性と比べて細胞傷害性の減弱をもたらす薬剤を調製するための、本発明の融合タンパク質、ベクター、感染粒子、宿主細胞または組成物の使用も提供する。上記のもののような癌および感染症を治療するためには、細胞傷害性の制限が特に有利である。それは実施例３にて示すように、ＡＩＣＤ活性またはＶＬＳ（血液漏出症候群）を測定することにより評価することができる。１つの好ましい態様では、この使用に用いる融合タンパク質がＩＬ−２／ＩＬ−１８（特に好ましくは、示されているＩＬ−２／プロＩＬ−１８融合物とＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合物である）またはＩＬ−７／ＩＬ−２である。

本発明はまた、本発明の融合タンパク質またはそのペプチド断片と選択的に結合する抗体も提供する。本明細書において、抗体が標的ペプチドと結合するが、無関係のタンパク質とは有意に結合するとはいえない場合に、その抗体は標的ペプチドと選択的に結合するという。場合によっては、ペプチドと結合する抗体が、ある程度交差反応性を示したとしてもなお選択的であるということが理解できよう。

本明細書において、抗体は、当技術分野で認識されているものと一致した条件により定義される。本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに、限定されるものではないが、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメントを含むこのような抗体のフラグメントが挙げられる。

特定の標的ポリペプチド／ペプチドに対する抗体を作製し、および／または同定するための数多くの方法が知られている。いくつかのこのような方法は、Harlow (1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press)により記載されている。本発明の抗体を作製するための好ましい方法は、（ａ）動物に有効量の本発明の融合タンパク質および／またはそのペプチド断片を投与して、抗体を産生させること、および（ｂ）それらの抗体を回収することを含む。もう１つの方法では、当技術分野における従来の技術を用いて本発明の抗体を組換えにより作製する。全長融合タンパク質または抗原ペプチド断片を使用することができる。抗体は、好ましくは、分泌タンパク質の領域または不連続断片から調製される。特に重要な領域および断片は、Ｘ構成要素とＹ構成要素との融合部位をオーバーラッピングするもののような本発明の融合タンパク質の独特の配列を含んでなるものである。抗原断片は、一般に、少なくとも８個の連続したアミノ酸残基を含んでなるが、しかしながら、抗原断片は、少なくとも１０個、１２個、１４個、１６個以上のアミノ酸残基を含んでなり得る。

本発明の抗体は、本発明の範囲内である種々の利用可能性がある。例えば、このような抗体を（ａ）本発明の融合タンパク質を検出するためのアッセイにおける試薬として、（ｂ）本発明の融合タンパク質を通じて細胞活性を調整するためのアッセイにおける試薬として、および／または（ｃ）タンパク質と他の混入物質の混合物から本発明の融合タンパク質を回収するためのツールとして使用することができる。本発明の抗体を検出可能な物質とカップリングさせること（すなわち、物理的連結）により、本発明の抗体の試薬としての使用が容易になり得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサアビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる。好適な放射性物質の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈが挙げられる。

アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により本発明の融合タンパク質の１つを単離するために、本発明の抗体を使用することができる。この抗体は、組換えにより作製された融合タンパク質の培養細胞からの精製を容易にし得る。また、発現の存在量およびパターンを評価するために、in situで、in vitroでまたは細胞溶解物もしくは上清中のタンパク質の検出にこのような抗体を使用することもできる。さらに、このような抗体は、治療の間に個体の細胞、生体サンプルまたは組織中の本発明の融合タンパク質の１つの存在を検出するか、またはその発現を評価するために有用である。さらに、このような抗体を、改良治療モダリティを必要とする個体を特定するためにも使用することができる。これらの使用は、治療が本発明の融合タンパク質の機能障害を伴うというような治療状況においても適用され得る。

本発明を例示的に記載してきたが、当然のことながら、使用してきた技術用語は、限定するためのものではなく、説明するための用語であることを意図している。以上の教示に照らして、本発明の数多くの修飾および変形が可能であることは明らかである。よって、当然のことながら、添付の請求項の範囲内であるならば、本明細書において詳しく記載されていることとは異なる方法で本発明を実施してもよい。

特許、刊行物およびデータベースエントリーの上記の開示内容の総ては、そのそれぞれの特許、刊行物またはエントリーが明示的にかつ個々に引用することにより本明細書の一部とされることが示された場合と同一程度に、明示的にそれらの総てが引用することにより本明細書の一部とされる。

以下、実施例により本発明を説明する。

以下に記載する構築物を、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY)で詳述しているような遺伝子工学および分子クローニングの一般的な技術に従って、または市販のキットを使用する場合には製造業者の推奨事項に従って調製する。細菌プラスミドを使用するクローニング工程は、好ましくは、大腸菌株５Ｋ(Hubacek and Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50, 111-127)または大腸菌株ＢＪ５１８３(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580)で実施される。後者の株は、好ましくは、相同組換え工程に使用される。ＮＭ５２２株(Stratagene)は、Ｍ１３ファージベクターの増殖に好適である。ＰＣＲ増幅技術は、当業者には公知である（例えば、PCR Protocols - A guide to methods and applications, 1990; Ed Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press Inc参照）。制限部位の修復に関して、使用される技術は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）の大断片を使用してオーバーハング５’末端を埋める技術である。Ａｄ５ヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベースにおいて参照Ｍ７３２６０またはＡＹ３３９８６５として開示されているものである。

材料および方法
多機能性サイトカインｃＤＮＡのクローニングと構築
Ｃ５７Ｂｌ６マウスの脾細胞を採取し、コンカナバリンＡ（１０μｇ／ｍｌ、SIGMA）とネズミＩＬ−２（１０ＩＵ／ｍｌ、R&D Systems）の混合物またはＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ、SIGMA）とネズミＧＭ−ＣＳＦ（５０ＩＵ／ｍｌ、R&D Systems）の混合物で３日間刺激した。次いで、活性化した脾細胞のｍＲＮＡをＲＮＡＮｏｗ(Ozyme)を用いて抽出した。ネズミＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１ｃＤＮＡを、専門のデータバンクで入手可能な配列データに基づいた特異的オリゴヌクレオチドを使用し、ＲＴ−ＰＣＲ（プラチナ定量ＲＴ−ＰＣＲ、サーモスクリプト（商標）ワンステップシステム、Invitrogen）により増幅した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA, USA)を使用して、突然変異型ネズミＩＬ−２（Ｄ２０Ｉ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８ＧおよびＱ１２６Ｍ）および突然変異型ネズミＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を作製した。融合分子には、前駆体プロＩＬ−１８をコードするものと成熟ネズミＩＬ−１８（プロ配列を含有していない）をコードするものとの２種類のネズミＩＬ−１８ｃＤＮＡを使用した。ネズミ分泌性ＩＬ−１５は、Fehniger et al. (2001, J. Exp. Med. 193, 219-231)およびSuzuki et al. (2001, J. Leuk. Biol. 69, 531-537)に記載されている。以下のオリゴヌクレオチドを使用して、サイトカイン配列をクローニングし、突然変異させた：

図１に記載のとおり、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した後、２つのサイトカイン部分（ＸおよびＹ）をコードする配列を、それらの間にフレキシブルリンカー（Ｇ_４Ｓ）^２または（Ｇ_４Ｓ）^３を置くＰＣＲ技術(Gillies et al., 2002, Cancer Immunol. Immunother. 51, 449-460)により、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、インフレームでクローニングした:

いずれの場合にも、両方の種類の融合タンパク質（Ｘ−ＹおよびＹ−Ｘ）を構築し、それらを生物活性および治療活性についてアッセイした。また、各サイトカインも個別に同じアデノウイルス骨格にクローニングし、それらを対照とした。

アデノウイルスの作製および力価測定
各融合タンパク質をコードする配列を、アデノウイルス配列（それぞれ、アデノウイルスヌクレオチド１〜４５８とヌクレオチド３３２８〜５７８８）に囲まれたＣＭＶ系発現カセットを含有するアデノウイルスシャトルプラスミドに挿入して、相同組換えによりベクターゲノムを作製した(Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810)。得られたアデノウイルスベクターは、Ｅ３（ヌクレオチド２８５９２〜３０４７０）とＥ１（ヌクレオチド４５９〜３３２７）が欠失しており、Ｅ１領域が、５’から３’に向かって、ＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーター、キメラヒトβ−グロビン／ＩｇＧイントロン、融合タンパク質をコードする配列およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを含有する発現カセットに置き換わっている。ＰａｃＩ線状化ウイルスゲノムをＰＥＲＣ６相補作用性細胞系統にトランスフェクトすることにより組換えアデノウイルスを作製した(Fallaux et al., 1998, Human Gene Therapy 9, 1909-1917)。ウイルスの増殖、精製および力価測定はこれまでに記載されているように行った(Erbs et al., 2000, Cancer Res 60, 3813-3822)。

細胞培養
次の実施例では、ヒト肺癌細胞系統Ａ５４９（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ−１８５）、２Ｅ８ネズミリンパ芽球（ＡＴＣＣ；ＴＩＢ−２３９）およびネズミ２Ｂ４．１１Ｔ細胞ハイブリドーマを使用する(Delgado et al., 2001, J. Immunol. 166, 1028-1040)。培養条件は、当技術分野では一般的な条件にする。例示を目的として、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を補給したＤＭＥＭ(Gibco)において３７℃にて細胞を増殖させる。当業者に公知である標準的な技術に従って細胞をトランスフェクトする。

Ｐ８１５ネズミ肥満細胞種（ＤＢＡ／２；ＦｃＲ＋、Ｈ２Ｄ^ｄ、ＭＨＣＩ＋、ＩＣＡＭ１＋、ＣＤ４８＋）およびＢ１６Ｆ１０（Ｃ５７Ｂｌ／６；Ｈ２Ｄ^ｂ、ＭＨＣＩ−、ＭＨＣII−、ＩＣＡＭ１−、ＣＤ４８−）は、American Type Culture Collectionから入手したネズミ黒色腫癌細胞系統（それぞれ、ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−６４およびＡＴＣＣ、ＣＲＬ−６４７５）である。ＲｅｎＣａネズミ腎臓癌（ＢＡＬＢ−Ｃ；Ｈ２Ｄ^ｄ、ＭＨＣＩ＋、ＭＨＣII＋、Ｆａｓ＋）およびＴＣ１ネズミ腫瘍細胞系統は、それぞれ、Dybal et al. (1992, J. Urol. 148, 1331-1337)およびLin et al. (1996, Cancer Res. 56, 21-26)に記載されている。総ての細胞系統は、ヘキスト色素、細胞培養およびＰＣＲを利用したマイコプラズマの検査で陰性との結果が出た。

抗体およびサイトカイン
ビオチン標識抗ネズミＩＬ−２および抗ネズミＩＦＮ−ｇは、R&D Systems(UK)から購入した。ビオチン標識抗ネズミＩＬ−１８および抗ネズミＩＬ−７は、Peprotech Inc.(USA)から購入した。精製ウサギポリクローナル抗マウスＩＬ−１５は、Bioscience(USA)から購入した。精製ヤギ抗ネズミＩＬ−２１は、R&D Systems(UK)から購入した。ビオチン標識抗ヤギＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧは、Amersham Life Sciences(USA)から購入した。

ＰｅｒＣＰ−ＣＹ５．５、ＦＩＴＣもしくはフィコエリトリン標識ラット抗マウスＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ６９、ＭＡＣ１、ＣＤ１１ｃ、Ｈ−２Ｋ^ｂ／Ｄ^ｂ、Ｉａ^ｂ、ＮＫ−１．１、ＮＫ−Ｔ／ＮＫ細胞抗原または非結合ラット抗マウスＣＤ４およびＣＤ８は、製造業者(Pharmingen; San Diego, CA, USA)により規定されているように使用した。非結合ウサギ抗ヒトＣＤ３（マウスＣＤ３と交差反応する）またはウサギ抗ラットＩｇＧおよびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギをDAKO(Germany)により推奨された濃度で使用した。

Ｔ細胞アポトーシス（ＡＩＣＤ）の測定は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット(Pharmingen, San Diego, CA, USA)を使用して行った。
組換えネズミＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１をR&D Systems(UK)から購入した。組換えネズミＩＬ−１５およびＩＬ−１８をPeprotech Inc.(USA)から購入した。コンカナバリンＡは、１μｇ／ｍｌにて使用し、SIGMAから購入した。

多機能性サイトカイン発現の解析
ＲｅｎＣａまたはＡ５４９細胞を、懸濁状態で、ＭＯＩ（多重感染度）５０のこれまでに記載したアデノウイルスベクターで感染させた（細胞を２％ＦＣＳ、１％カチオンを補給した１００μｌのＰＢＳ中、ウイルス希釈液とともに３０分間インキュベーション）(Erbs et al., 2000, Cancer Res. 60, 3813-3822)。次いで、細胞を５％ＦＣＳ含有完全培地において４８時間培養した。感染したＡ５４９細胞のＲＮＡを、^３２Ｐ標識マウスサイトカインＤＮＡ特異的プローブを用いて、ノーザンブロットにより解析した。

それぞれの融合タンパク質を構成している個々のサイトカインの発現を、ウエスタンブロットにより、Amersham Life Sciences(UK)によって提供されているＥＣＬ（商標）ウエスタンブロッティングプロトコールに従って解析した。Ａ５４９細胞をＭＯＩ５０で感染させた。感染の７２時間後、上清を回収し、それらの細胞をＰＢＳで１回洗浄し、サンプルバッファー(Novex, Invitrogen, France)中で超音波処理により破壊した。上清および細胞抽出物を回収し、その後、特異的抗マウスサイトカインおよびＥＣＬ検出システム(Amersham Life Sciences)を用いて、４〜１２％Ｎｕｐａｇｅゲル(Novex, Invitrogen, France)でのウエスタンブロットにより解析した。

多機能性サイトカインのin vitro生物活性
Ｔ細胞またはＢ細胞増殖アッセイマウス脾細胞または２Ｅ８リンパ芽球細胞増殖を、これまでに記載されているように(Gillis et al., 1978, J. Immunol. 120, 2027-2032; Ishihara et al., 1991, 1, 149-161)、［^３Ｈ］チミジンの取り込みにより評価した。Ｔ細胞増殖に関しては、脾細胞を、これまでに記載されているように(Ting et al., 1988, J. Immunol. 141, 741-748)、低用量（２０ｎｇ／ｍｌ）のネズミＣＤ３特異的抗体（１４５−２Ｃ１１、Pharmingen, San Diego, USA）により予め活性化した。ＣＤ３により活性化した脾細胞を、感染Ａ５４９上清に含まれる、試験しようとする融合サイトカインと混合した。陽性対照として、脾臓または２Ｅ８細胞（５×１０^４細胞／ウェル）を、完全培地中、ＣｏｎＡ（１０μｇ／ｍｌ）、１００ｎｇ／ｍｌ組換えネズミＩＬ−２または種々の濃度のネズミＩＬ−７(R&D Systems, UK)のいずれかで刺激した。９６時間後、これらの細胞に１μＣｉ／ウェル［^３Ｈ］チミジンを適用した。増殖中のＴ細胞のＤＮＡへの［^３Ｈ］チミジンの組み込みを、４時間後ガラスフィルターペーパー(PHD harvester, Cambridge Technology, USA)上の細胞ＤＮＡを採取することにより、さらに、液体シンチレーションカウンター(Beckman, Germany)で放射能を計数することにより測定した。総ての測定を３回ずつ行った。

ＩＦＮ−ｇ分泌アッセイネズミＩＬ−１８の相対的生物活性を、ＩＦＮ−ｇ産生を増大させるＡｄ−融合物上清（感染細胞から得られた）のin vitroでの能力により判定した(Okamura et al., 1995, Nature, 378, 88-91; Oshikawa et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13351-13356)。要するに、マウス脾細胞をＣｏｎＡ（１，２５μｇ／ｍｌ）と、２４穴プレートで４８時間共培養した。９６穴プレートにおいてＣｏｎＡ活性化脾細胞の細胞懸濁液にＡｄ−融合物上清を２４時間添加した。上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりアッセイして、ＩＦＮ−ｇ産生を検出した(Quantikine-R&D Systems, Minneapolis, Minn.)。

ＣＴＬおよびＮＫ／ＮＫＴ細胞の細胞傷害性アッセイ融合サイトカインの活性も、これまでに記載されているように(Paul et al., 2000, Cancer Gene Ther. 7, 615-623)、ＣＴＬおよびＮＫ細胞傷害性についてアッセイした。マウス脾細胞をＡ５４９感染細胞から得られたＡｄ−融合物上清と７日間共培養した。活性化脾細胞の細胞傷害性を、これまでに記載されているように(Shortman et al., 1986, J. Immunol., 137, 798-804)、ＥｕＤＴＰＡ細胞傷害性アッセイ(Wallac Lab., Turku, Finland)(Blomberg et al., 1993, J. Immunol. Methods, 160, 27-34)を使用して、Ｐ８１５−ＣＴＬ標的またはＹＡＣ−ＮＫ標的において測定した。

in vitroでの免疫刺激多機能性融合サイトカインのin vitroでの効果を解析するため、骨髄由来樹状細胞または脾細胞をＡｄ−融合物上清と３〜７日間インキュベートした。樹状細胞の成熟および／または活性化の表現型マーカー、その他ＡＰＣＳ、Ｂ細胞、Ｔ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８）、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を、フローサイトメトリー解析(FACScan, Becton Dickinson, USA)により、マウス特異的抗体を用いて解析した。

ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡ法により融合サイトカイン濃度を測定した。要するに、マキシソープ９６穴プレート(NUNC)を、融合物を含む上清の希釈液で４℃にて一晩コーティングした。次いで、精製ポリクローナルウサギ抗マウスＩＬ−２またはＩＬ−１８(Biovision CA)を用いて融合サイトカインを明らかにした。さらに、ＨＲＰＯ結合特異的モノクローナル抗ウサギＩｇＧ(Jackson Laboratories)を用いてウサギＩｇＧを明らかにした。組換えネズミＩＬ−２またはネズミＩＬ−１８の組織培養培地での連続希釈物でコーティングした穴を陽性対照として使用して(R&D Systems, Minneapolis, Minn.)、フソカイン(fusokine)濃度測定用の標準曲線を作成した。

ＡＩＣＤ（活性化誘発性細胞死）アッセイ
通常はリンパ球刺激に関連するシグナルが、その代わりに、細胞の死を引き起こすというＡＩＣＤは、抗原特異的リンパ球除去の機構として提示されている。Ｔ細胞は、ＡＩＣＤに対して感受性を示したり、または耐性を示したりし、ＩＬ−２がＴ細胞のＡＩＣＤに対する感受性を調節している(Brunner et al., 1996, Int. Immunol., 8, 1017-1026; Nguyen et al., 2001, Immunology, 103, 426-434)。ネズミＴ細胞ハイブリドーマは、十分記載があるＡＩＣＤの研究用のモデル系である。大部分のＴ細胞ハイブリドーマは、抗ＴＣＲまたは抗ＣＤ３抗体の提示により活性化し、続いて、ＩＬ−２処置を行った後数時間以内に死に至る。ＡＩＣＤは、Ｆａｓ（ＣＤ９５）およびそのリガンド（ＦａｓＬ）のデノボ合成により特徴付けられると考えられる(Brunner et al., 1996, Int. Immunol., 8, 1017-1026)。ネズミＴ細胞ハイブリドーマのＡＩＣＤに対する感受性を比較するため、２Ｂ４．１１Ｔハイブリドーマ細胞(Delgado et al., 2001, J. Immunol. 166, 1028-1040)を、抗ＣＤ３コーティング９６穴プレート（１４５−２Ｃ１１抗体；４μｇ／ｍｌ）で完全培地において１８時間培養した。次いで、多機能性サイトカインをコードするＡｄに感染させたＡ５４９細胞の上清または対照上清（ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−７、ｍＩＬ−１８、ｍＩＬ−２１それぞれをコードするＡｄまたはエンプティーアデノウイルス）のいずれかをさらに１８時間添加した。組換えネズミＩＬ−２(R&D Systems, UK)も陽性対照（１０〜２０ｎｇ／ｍｌ）として使用した。ＡＩＣＤをフローサイトメトリー解析により、フィコエリトリン標識マウス抗マウスＦａｓＬ特異的抗体(Ｋａｙ−１０、Pharmingen, San Diego, USA)およびＦＩＴＣ標識アネキシンＶアポトーシス検出キット(Pharmingen, San Diego, USA)を用いて測定した。

ＡＩＣＤを多機能性融合サイトカインをコードするアデノウイルスの皮下注射後にin vivoでも測定した。要するに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２．１０^８ｉｕのＡｄ−融合物（または対照として、ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−７、ｍＩＬ−１８、ｍＩＬ−２１それぞれをコードするＡｄまたはエンプティーアデノウイルス）を１回皮下注射した。次いで、注射後の異なる時点に（５、８および１８時間）流入領域リンパ節を採取した。以下に記載するように、リンパ節に含まれるリンパ球においてＡＩＣＤを測定した。

ＶＬＳの定量（血液漏出症候群アッセイ）
記載されているように(Rafi-Janajreh et al., 1999, J. Immunol. 163, 1619-1627)、ｉ．ｖ．投与すると、血漿タンパク質、特に、アルブミンと結合し、漏出後、種々の器官で検出され得るエバンスブルーの漏出を測定することにより血液漏出を研究した。２．１０^９ｉｕのネズミＩＬ−２をコードするアデノウイルスベクターを３日間、１日１回、ｉ．ｖ．注射することにより、血液漏出を起こした。５匹からなるＣ５７Ｂｌ／６マウス群に、ＰＢＳ、エンプティーアデノウイルス、Ａｄ−ｍＩＬ−２、Ａｄ−ｍＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８またはＡｄ−融合物をｉ．ｖ．注射した。４日目に、マウスにＰＢＳ中１％エバンスブルー０，１ｍｌをｉ．ｖ．注射した。２時間後、マウスを麻酔下、出血多量で死亡させ、心臓にＰＢＳ中ヘパリンを潅流させた。最大漏出が起こることが分かっている肺および肝臓を採取し、３７℃にて一晩ホルムアミド中に入れた。上清の６５０ｎｍでの吸光度を測定することにより、器官中のエバンスブルーを定量した。Ａｄ−サイトカインで処置したマウスで見られたＶＬＳを、ＰＢＳで処置した対照でのＶＬＳに対する漏出の増加率として表した。組織病理学的研究では、５匹からなる別個のマウス群に、先に記載したエンプティーＡｄまたはＰＢＳ、Ａｄ−ｍＩＬ−２、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍＩＬ−７、Ａｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）およびＡｄ−ｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を注射し、４日目に、肺および肝臓を１０％ホルマリン溶液で固定した。それらの器官をパラフィン包埋し、薄片を作製し、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。血管に浸潤しているリンパ球数を計数し、各群の最小および最大範囲の平均をとることにより、血管周囲の浸潤を測定した。注射したマウスの血清もＡＳＡＴおよびＡＬＡＴ測定用に採取した。

in vivo試験
ネズミＰ８１５、Ｂ１６Ｆ１０、ＲｅｎＣａおよびＴＣ１腫瘍細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＰＢＳへ３×１０^６細胞／ｍｌに再懸濁した。次いで、６〜７週齢の免疫能の正常なＢ６Ｄ２マウスの右側腹部に、１００マイクロリットルの細胞懸濁液を皮下注射した。腫瘍が触知可能となった注射後７日目、８日目および９日目に、マウスに、５×１０^８ｉｕの、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ_２で希釈したＡｄ−融合物またはＡｄ対照の３回の腫瘍内注射を施した。腫瘍サイズおよび生存率を１２０日間にわたって評価した。

ＭＶＡ−Ｅ７ベクターとの併用でのＡｄ−融合物の免疫アジュバント効果の評価では、１００マイクロリットルのＴＣ１細胞懸濁液（３×１０^６細胞／ｍｌ）を、６〜７週齢の免疫能の正常なＢ６Ｄ２マウスの尾静脈に静脈注射した。注射後、マウスに、３９日目、４６日目および５３日目に、５×１０^８ｉｕの、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ_２で希釈したＡｄ融合物（Ａｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ））の３回の鼻腔内注射を施し、４２日目、４９日目および５６日目に、５×１０^６ｐｆｕのＭＶＡ−Ｅ７の３回の皮下注射を施した。腫瘍サイズおよび生存率を１２０日間にわたって評価した。

ＭＶＡ−ＦＣＵ−１との併用でのＡｄ−融合物の免疫アジュバント効果の評価では、１００マイクロリットルのＢ１６Ｆ１０細胞懸濁液（３×１０^６細胞／ｍｌ）を、６〜７週齢の免疫能の正常なＢ６Ｄ２マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍が触知可能となった注射後７日目、８日目および９日目に、マウスに、５×１０^８ｉｕの、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ_２で希釈したＡｄ−融合物（Ａｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ））と１０^７ｐｆｕのＭＶＡ−ＦＣＵ１の３回の腫瘍内注射を施した。プロドラッグ５−ＦＣを、供給する水に終濃度０．５％に加えて与えた。腫瘍サイズおよび生存率を８０日間にわたって評価した。
カプラン・マイヤー生存曲線のフィッシャー正確検定アプリケーション（スタティスティカ５．１ソフトウェア、Statsoft Inc.）を使用して、in vivo生存試験における異なる群間の統計的な差を評価した。Ｐ≦０．０５を統計的に有意と見なした。

in vivo応答の組織学、免疫組織化学またはフローサイトメトリー解析
腫瘍を作製し、その腫瘍に上記のようなin vivo試験用の種々のウイルスを注射した。１３日目に、腫瘍を測定し、切除した。腫瘍流入領域リンパ節も同時に採取した。フローサイトメトリー解析では、腫瘍をコラゲナーゼ(SIGMA)消化により破壊し、細胞を指定の抗体で染色し、集団を細胞蛍光測定法により解析した(Paul et al., 2002, Cancer Immunol. Immunother. 51, 645-654)。

腫瘍Ｐ８１５組織を摘出し、ドライアイス冷却したイソペンタン上でＯＣＴ化合物により直接包埋した。ヘマトキシリン−エオジン染色（光学顕微鏡による構造観察）または免疫組織化学では、５μｍ切片を使用した。メタノール−アセトン（５０：５０）で固定した凍結切片で、以下の抗体を用いて浸潤細胞および血管検出を行った：１／５００希釈のラット抗マウスＣＤ４（ｎ°５５３７２７−Pharmingen）、１／５００希釈のラット抗マウスＣＤ８（ｎ°５５３０２７−Pharmingen）、非希釈のウサギ抗ヒトＣＤ３（Ｎ１５８０−１／５０希釈−Dako）、１／１００希釈のハムスター抗マウスＣＤ１１ｃ（ｎ°５５３７９９−Pharmingen）、１／５００希釈のラット抗マウスＩａ−Ｉｅ（ｎ°５５６９９９−Pharmingen）、１／５０希釈のラット抗マウスＣＤ２５−ＦＩＴＣ(Pharmingen)、１／５０希釈のヤギ抗マウスＩＬ１８−Ｒ（ＡＦ８５６−R&D Systems）、１／５０希釈の抗マウスＣＤ３１（ｎ°０１９５１Ｄ−Pharmingen）および１／１００希釈のウサギ抗ヒトフォン・ウィルブランド因子（Ａ００８２−Dako）。まず、抗体を室温にて１時間半インキュベートし、ＴＢＳ−０，１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗い流した。特異的二次抗体１／５００希釈のウサギ抗ラットＩｇ（Ｚ０４９４−Dako）、１／５００希釈のウサギ抗ハムスターＩｇ（ｎ°６０７４１０２−Rockland）、１／１００希釈の、ウマ抗ヤギビオチン化０，５％（ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅＰＫ６２００−Vector）またはウサギ抗ＦＩＴＣＨＲＰ（Ｐ０４０４−Dako）結合抗体により一次抗体を明らかにし、３０分間インキュベートした後、バッファーで洗い流した。二次ウサギ抗体（ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍｎ°Ｋ４００３−Dako）またはストレプトアビジン−ＨＲＰ(Vector)と結合したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ポリマーを３０分間使用した後、洗い流し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質として使用した。総てのスライドをヘマトキシリンで対比染色した。

実施例１：多機能性融合サイトカインを発現するアデノウイルスの構築
図１ならびに材料および方法に概要が記載されているように、多機能性融合サイトカインをコードする配列を構築した。作製した融合物を以下に記載する：
ｍＩＬ−２／ｍＩＦＮ−ｇ、ｍＩＦＮ−ｇ／ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−２／ｍＩＬ−７、ｍＩＬ−７／ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−２／ｍＩＬ−２１、ｍＩＬ−２１／ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−２／ｍＩＬ−１５、ｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−７／ｍＩＬ−１５、ｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−７、ｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−２１、ｍＩＬ−２１／ｍＩＬ−１５、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８、ｍプロＩＬ−１８／ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−２／ｍ成熟ＩＬ−１８、ｍ成熟ＩＬ−１８／ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）、ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）／ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）、成熟ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）／ｍＩＬ−２。ネズミＩＬ−２変異体（Ｄ２０Ｉ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８ＧおよびＱ１２６Ｍ）を含有する融合サイトカインも作製した。

これらの多機能性サイトカインそれぞれをコードする配列をアデノウイルスシャトルプラスミドでクローニングし、それらを使用してＥ１およびＥ３欠失アデノウイルスベクターを作製した。単一種の対照サイトカインもアデノウイルスシャトルプラスミドでクローニングした（Ａｄ−ｍＩＬ−２、Ａｄ−ｍＩＬ−２（Ｄ２０Ｉ）、Ａｄ−ｍＩＬ−２（Ｎ８８Ｇ）、Ａｄ−ｍＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）、Ａｄ−ｍＩＬ−２（Ｑ１２６Ｍ）、Ａｄ−ｍＩＦＮ−ｇ、Ａｄ−ｍＩＬ−７、Ａｄ−ｍＩＬ−１５、Ａｄ−ｍＩＬ−１８、Ａｄ−ｍＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）およびＡｄ−ｍＩＬ−２１）。

異なるアデノウイルスベクターに感染したＡ５４９細胞での多機能性融合サイトカインの発現をノーザンブロットおよびウエスタンブロットにより解析した。ノーザンブロット解析により、各融合サイトカインと各対照サイトカインの特異的なｍＲＮＡの正確なサイズを明らかにした。サイトカイン特異的抗体を使用したウエスタンブロット解析により、それぞれの融合物の推定分子量を有する主要なバンドを明らかにした。場合によっては、選択的スプライシング事象または異なるグリコシル化パターンを示すさらなるバンドを観察した。一部のＩＬ−１５含有融合物およびＡｄ−ｍＩＬ−１５を除く、大半の融合物で高発現および分泌レベルを検出した（Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８およびＡｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）に感染した細胞の上清でより高いレベルが検出される）（実施例６参照）。

分泌された組換え融合サイトカインの量を、ＩＬ−２／ＩＬ−１８融合サイトカインをコードするアデノウイルスベクターに感染後のＡ５４９細胞培養上清の特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定し、それらを個々のサイトカインをコードするＡｄに感染した細胞により分泌された量と比較した。

表１：

ウエスタンブロット解析により観察されたように、Ａｄ−感染細胞において、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８およびｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）は、ｍＩＬ−２単独とおよそ同じ程度であるが、Ａｄ−プロＩＬ−１８単独よりも１００倍高い最高レベルで発現された。ｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８およびｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の発現は、Ａｄ−ｍＩＬ−２で得られるもののおよそ１０分の１であり、プロ配列の欠失が、少なくともアデノウイルス系での発現に悪影響を及ぼすことが分かる。

組換え融合サイトカインの安定性もウエスタンブロット解析によりin vitroで評価した。Ａ５４９細胞を、Ａｄ−ｍＩＬ−２もしくはＡｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）単独、またはＡｄ−ｍＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の組合せ、あるいはＩＬ−２／ＩＬ−１８融合物（Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ））を発現するアデノウイルスに感染させた。感染の２４時間、４８時間および７２時間後に上清を解析した。ブロットを、（ａ）ウサギ抗マウスＩＬ−２抗体または（ｂ）ウサギ抗マウスＩＬ−１８抗体を用いて調べた。意外にも、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合タンパク質では、サイトカイン単独の場合または２つのサイトカインを組み合わせた場合に比べて、ＩＬ−２発現のより高い安定性が観察された。さらに、プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）構成要素が、個別に発現される（Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）構築物）場合よりもｍＩＬ−２との融合物として発現される（Ａｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）構築物）場合に、より高いＩＬ−１８発現が観察された。この結果に基づいて、ＩＬ−２はＩＬ−１８と融合することにより、Ａｄ−ｍＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の組合せとは対照的に、一定比率のｍＩＬ−２とｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を維持することが可能となると思われる。

融合サイトカインｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の発現もＲＴ−ＰＣＲにより評価した。触知可能なＰ８１５腫瘍を有する免疫能の正常なＢ６Ｄ２マウスに、５×１０^８ｉｕのエンプティーＡｄ、Ａｄ−ｍＩＬ−２、Ａｄ−ｍＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）またはＡｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を注射した。注射の７２時間後に腫瘍を切除し、ｍＲＮＡを抽出した。ｍＩＬ−２、ｍプロＩＬ−１８またはｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合物特有の配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。前述のように、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の注射では、Ａｄ−ｍＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の組合せとは対照的に、一定比率のｍＩＬ−２とｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）が維持された。

実施例２：融合サイトカインのin vitroでの機能性
ＩＬ−２含有融合物のin vitroでの機能性
材料および方法に記載されているように、抗ＣＤ３に加え、Ａｄ−融合サイトカイン上清とインキュベートしたときのネズミ脾細胞の増殖を評価することにより、融合タンパク質のＴ細胞刺激に対する効果を解析した。ＩＬ−２は、ＣＤ３により予め活性化された脾細胞の増殖の強力なインデューサーであることが分かっている。要するに、Ａｄ−融合物上清とインキュベートしたネズミ脾細胞の増殖を、Ｔ細胞増殖アッセイにより測定した。上清濃度は、総てのサイトカインまたは融合サイトカイン含量が等しくなるように調整した（２０μｇ／ｍｌ）。図２に示すように、Ａｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２およびＡｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８上清では高い刺激指数が得られ（それぞれ、２および１．８）、Ａｄ−ｍＩＬ−２で得られた指数よりも高かった。変異型ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を発現するＡｄ−融合物のＴ細胞増殖活性も、個々のサイトカインを発現するＡｄ（Ａｄ−ｍＩＬ−２、Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ））およびそれら２つの組合せ（Ａｄ−ｍ−ＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ））との比較により解析した。これらの結果から、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）では、Ａｄ−ｍＩＬ−２、Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）またはそれら２つの組合せで得られた刺激指数よりも高い指数が得られることが確認される。他方、融合物ＩＬ−２１／ＩＬ−２、ＩＬ−１５／ＩＬ−７、ＩＬ−２／ＩＬ−１５およびＩＬ−１５／ＩＬ−２１を含む上清は、ＩＬ−２上清で得られた刺激指数と同等の指数を示し、エンプティーウイルス上清では増殖は認められなかった。

ＩＬ−７含有融合物のin vitroでの機能性
培地中、ＩＬ−７の存在下でしか増殖できないＩＬ−７依存性細胞系統−ネズミプロＢ２Ｅ８細胞系統を使用して、ＩＬ−７含有融合物のin vitroでの機能性を評価した。Ａｄ−ｍＩＬ−２／ＩＬ−７およびＡｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２に感染したＡ５４９細胞の上清の２Ｅ８増殖を促進する能力を試験し、Ａｄ−ｍＩＬ−７上清、ならびに陽性対照としての組換えＩＬ−７および陰性対照としてのエンプティーＡｄと比較した。

予想されたように、組換えネズミＩＬ−７は、Ａｄ−ｍＩＬ−７上清のように２Ｅ８の増殖を誘導した。図３に示すように、Ａｄ−ＩＬ−２／ＩＬ−７上清で処置した２Ｅ８の増殖速度は、同じ希釈度のＡｄ−ｍＩＬ−７上清で得られた速度よりも速い。結果として、１／１０希釈したＡｄ−ＩＬ−２／ＩＬ−７、Ａｄ−ＩＬ−７／ＩＬ−２およびＡｄ−ＩＬ−７上清で得られた増殖速度は、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１５ｎｇ／ｍｌの組換えネズミＩＬ−７それぞれで得られた速度と同程度であり、エンプティーウイルス上清では増殖は認められなかった。

ＩＬ−１８含有融合物のin vitroでの機能性
ＩＬ−１８は、in vitroおよびin vivo両方でのＩＦＮ−ｇ分泌の強力なインデューサーであるとされている。ＩＬ−１８含有融合物の生物活性を評価するため、材料および方法に記載されているように、ｃｏｎＡ活性化ネズミ脾細胞によるネズミＩＦＮ−ｇの分泌を定量した。結果として、図４に示すように、１／２０希釈したＡｄ−ｍプロＩＬ−１８／ＩＬ−２を含む上清により、in vitroで、Ａｄ−ｍＩＬ−２（４μｇ／ｍｌ／２４時間／１０^６細胞）、Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（２μｇ／ｍｌ／２４時間／１０^６細胞）およびＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（５，５μｇ／ｍｌ／２４時間／１０^６細胞）により誘導されたものより高い濃度のネズミＩＦＮ−ｇが誘導された（７〜８μｇ／ｍｌ／２４時間／１０^６細胞）。これらの差は統計的に有意である。ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）含有融合サイトカインの生物活性も、ｃｏｎＡ活性化脾細胞によるネズミＩＦＮγの分泌を測定することにより評価した。図５に示すように、ＩＬ−２／ＩＬ−１８融合物（ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８、ｍＩＬ２／成熟ＩＬ−１８、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）およびｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）それぞれ）を含む上清は、ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）単独またはＡｄｍＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の組合せを含む上清（それぞれ、およそ８０および６０ｎｇ／ｍｌ／１０^６細胞）より少し高いレベルのＩＦＮｇ（およそ１００ｎｇ／ｍｌ／１０^６細胞）を誘導する。

次の一連の試験では、非活性化ネズミ脾細胞を使用したときのＩＦＮｇの分泌も定量した。意外にも、図５に示すように、非活性化脾細胞は、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）、ｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８およびｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合サイトカインを含むＡｄ上清での活性化後にだけ刺激を受けて高レベルのＩＦＮγを分泌した。このことは、個々のサイトカインまたはそれら２つのものの混合物では見られず、ＩＬ−２／ＩＬ−１８融合サイトカインに関する新規な活性であることを示唆している。

ＩＦＮ−ｇ含有融合物のin vitroでの機能性
本発明の融合物に含まれるＩＦＮ−ｇ遺伝子産物の機能性を、ＡＰＣおよび腫瘍細胞において活性化マーカーをアップレギュレートするこのサイトカインの能力を利用して測定した。簡易試験では、Ａｄ−融合物上清をin vitroでネズミ脾細胞に７２時間添加した後、フローサイトメトリー解析により、ネズミ脾細胞、ＡＰＣおよびＣＤ８＋リンパ球に特異的な活性化マーカーのアップレギュレーションを、材料および方法に記載されているように、特異的抗体を使用して、Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）および樹状細胞（ＣＤ１１ｂ）、ならびにＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスIIマーカーの変化について評価した。

表２：ネズミ脾細胞における活性化マーカーのアップレギュレーション

- = 陽性細胞なし
+ = 陽性細胞が１〜５％の間
++ = 陽性細胞が１０〜２０％の間
+++ = 陽性細胞が２０〜４０％の間
++++ = 陽性細胞が４０％を上回る

表２に示すように、ＡｄＩＬ−２／ＩＦＮ−ｇ融合物に感染した細胞の上清が最も強く、in vitroでＭＨＣクラスＩおよびクラスII分子のアップレギュレーションを誘導するだけでなく、意外にも、ＡＰＣ（ＣＤ１１ｂ^＋）およびＣＤ８^＋Ｔリンパ球の数も飛躍的に増加する。これらのマーカーに関しては、Ａｄ−ＩＦＮ−ｇ／ＩＬ−２上清はＡｄ−ＩＦＮ−ｇと同レベルの応答を誘導しているが、ＩＬ−２によって誘導されるこれらの細胞集団の活性化レベルは低い。

エフェクター細胞の細胞傷害性を高める融合タンパク質のin vitroでの能力
多機能性サイトカインの活性を、材料および方法に記載されているように、ＣＴＬおよびＮＫ細胞傷害性についてアッセイした。Ａｄ−融合物に感染したＡ５４９細胞の上清をネズミ脾細胞と７日間インキュベートした。それらの結果を表３に要約している。

表３：エフェクター細胞の細胞傷害性の増強

- = 明瞭な溶解はない
+ = Ｅ／Ｔ比＝５０／１において溶解が２０〜４０％の間
++ = Ｅ／Ｔ比＝５０／１において溶解が４０〜６０％の間
+++ = Ｅ／Ｔ比＝５０／１において溶解が６０〜８０％の間
++++ = Ｅ／Ｔ比＝５０／１において溶解が８０〜１００％の間

表３で示されるように、Ａｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２およびＡｄ−ｍプロＩＬ−１８／ＩＬ−２に感染したＡ５４９細胞の上清は、in vitroでＣＴＬ活性に対してもＮＫ活性に対しても高い細胞傷害性を誘導した。これらの活性は、Ａｄ−ｍＩＬ−２、Ａｄ−ｍＩＬ−７およびＡｄ−ｍプロＩＬ−１８上清で得られたものよりも大いに優れている。さらに、Ａｄ−ｍＩＦＮ−ｇ／ＩＬ−２上清は、ＣＴＬ応答ではなく、ＮＫ細胞傷害性において高い応答を誘導した。

さらに、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合物の効果をＣＴＬおよびＮＫ細胞傷害性について評価し、それを各サイトカイン単独（それぞれ、ｍＩＬ−２またはｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ））またはｍＩＬ−２＋ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の組合せのものと比較した。ネズミ脾細胞を、対応するＡｄ（Ａｄ−ｍＩＬ−２、Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）、Ａｄ−ｍＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）およびＡｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ））に感染したＡ５４９細胞の上清と７日間培養した。上清濃度は、総てのサイトカインまたはフソカイン含量が等しくなるように調整した（２０μｇ／ｍｌ）。その結果からは、Ａｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合物に感染したＡ５４９細胞の上清が、Ｐ８１５およびＹＡＣ標的細胞の両方において細胞傷害性を誘導したことが分かる。意外にも、ｍＩＬ２／プロＩＬ１８（Ｋ８９Ａ）融合物と培養した脾細胞による溶解作用は、個々のサイトカインまたは混合物ｍＩＬ−２＋ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を含む上清と培養した脾細胞により観察されたものより大きかった。

ＣＤ８、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の誘導
先天性免疫エフェクター細胞および適応的免疫エフェクター細胞両方の増殖を誘導する融合サイトカインの能力を評価した。このために、ＣＤ８Ｔリンパ球、ＮＫおよびＮＫ／ＮＫＴエフェクター細胞の割合を、Ａｄ−融合物上清と１週間培養したネズミ脾細胞を使用して、フローサイトメトリーにより定量した。このアッセイの結果を表４に示す。

表４：ＣＤ８、ＮＫおよびＮＫＴ増殖の誘導

mIL-21 rec = 組換えネズミＩＬ−２１（２０ｎｇ／ｍｌ）

表４に示すように、試験した総てのＡｄ−融合物上清は、Ａｄ−ｍＩＬ−２上清と同じ割合（およそ５０％）のＣＤ８^＋Ｔリンパ球（特異的エフェクター細胞）を誘導する。さらに、Ａｄ−ｍＩＬ−２またはＡｄ−ｍＩＬ−２１とは対照的に、Ａｄ−融合物（Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ＩＬ−２１およびＡｄ−ｍＩＬ−２１／ＩＬ−２）上清は、非常に大きな大きな割合（＞５０％）のＮＫ／ＮＫＴ^＋細胞を誘導する。ＮＫ１．１^＋細胞もまた、これらの融合タンパク質をコードするＡｄ上清の存在下でかなり誘導された。

さらに、ネズミ脾細胞のｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）とのインキュベーションにより、エンプティーＡｄ、Ａｄ−ｍＩＬ−２およびＡｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）と培養した脾細胞の上清と比べて、ＣＤ８^＋（５０％）、ＮＫ^＋（１８％）およびＮＫ／ＮＫＴ^＋（５１％）細胞総ての割合の飛躍的な上昇が起こることが報告されている。

ネズミ樹状細胞の成熟に対する融合サイトカインの効果
これまでに記載されているように(Fields et al., 1998, J. Immunother. 21, 323-339)、骨髄由来樹状細胞をＣ５７Ｂｌ６マウスから得た。未熟樹状細胞をＡｄ−融合物上清と４８時間インキュベートした後、フローサイトメトリー解析による表現型解析を行った。特異的モノクローナル抗体(Pharmingen)を使用してＣＤ８０、ＣＤ８６およびＭＨＣII−Ｉａｂマーカーの割合を測定することにより、ネズミ樹状細胞の成熟因子のアップレギュレーションを判定した。Ａｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２およびＡｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）に感染した細胞から得られた上清は、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＭＨＣIIマーカーをアップレギュレートすることが分かり、それによって、ネズミＤＣの成熟が示されたが、陽性対照（ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌ、DIFCO）またはＡｄ−ｍＩＬ−７の上清より少し低いレベルであった。

要するに、多機能性サイトカインを発現するアデノウイルスベクターは、十分に機能するものであり、場合によっては、融合物を構成する各サイトカインの単純な相加活性より高い生物活性を示す。これらの融合物の一部では、ＩＬ２／ＩＬ−１８融合物（特に、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ））のネズミＮＫＴ細胞を活性化する能力およびＩＬ−７／ＩＬ−２およびＩＬ２／ＩＬ−１８（特に、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ１８およびｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ））融合物のネズミＤＣ成熟を誘導する能力のような予期しなかった活性も検出された。

実施例３：融合サイトカインの毒性
ＩＬ−２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の初期活性化におけるその役割に加え、末梢寛容の維持において重要な役割を有している(Lenardo, 1996, J. Exp. Med. 183, 721-724)。この点に関して、ＩＬ−２は、自己反応性Ｔ細胞の排除を促すプロセスであるＦａｓ媒介活性化誘発性細胞死（ＡＩＣＤ）において極めて重要である(Lenardo, 1996, J. Exp. Med. 183, 721-724; Van Parijs et al., 1999, Immunity 11, 281-288)。ＡＩＣＤにおけるこの極めて重要な役割から、ＩＬ−２を含有する腫瘍ワクチンを受けて生じたＴ細胞は、腫瘍細胞を自己と解釈し、腫瘍反応性Ｔ細胞をＡＩＣＤ誘導性アポトーシスにより死滅させ得る。

ＡＩＣＤは、ＣＤ４腫瘍特異的Ｔ細胞のエフェクター機能を抑制し、Ｔ細胞エフェクター活性を低減することが最近報告されている(Saff et al., 2004, J. Immunol. 172, 6598-6606)。ＩＬ−２は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞サプレッサー機能の活性化に極めて必要であることも分かっている(Thorton et al., 2004, J. Immunol. 172, 6519-6523; Shimizu et al., 1999, J. Immunol. 163, 5211-5218)。ＩＬ−２療法は、特定の種類の癌の治療において有望な結果が得られたが、体重増加、呼吸困難、腹水および肺水腫を特徴とする用量依存的な毒性からその使用は制限される。これらの毒性の徴候は、血液漏出症候群（ＶＬＳ）の別名でも知られる毛細血管漏出の増加によって起こる(Rosenstein et al., 1986, J. Immunol. 137, 1735-1742; Baluna and Vitetta, 1997, Immunopharmacology 37, 117-132; Baluna et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3957-3962)。このため、本発明の融合サイトカインの毒性を、ＡＩＣＤアッセイおよびＶＬＳアッセイにより、ＩＬ−２によってもたらされるものと比較した。

ＡＩＣＤアッセイ
材料および方法に記載されているように、ＡＩＣＤアッセイにより、in vitroおよびin vivoの両方で２つのアポトーシスマーカー（アネキシンとＦａｓリガンド（ＦａｓＬ））の割合を評価した。それらの結果を表５に示す。

表５：融合サイトカインのin vitroでの毒性．ＡＩＣＤの測定（結果は、ゲート細胞全体に対する割合として表している）

in vitroでは、Ａｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２およびＡｄ−ｍＩＬ−２／ＩＬ−１８上清は、２つのアポトーシスマーカーであるアネキシンＶとＦａｓＬが低レベルである（それぞれ、３６％と４８％のアネキシンＶ＋細胞および９％と１８％のＦａｓＬ＋細胞）ことによって示されるように、ＡＩＣＤから２Ｂ４．１１細胞を防御する。これとは好対照に、組換えネズミＩＬ−２およびＡｄ−ｍＩＬ−２での処置により高アポトーシスが誘導された（それぞれ、６５％と６７％のアネキシンＶ＋細胞および２４％と２５％のＦａｓＬ＋細胞）。

Ａｄ−融合物またはＡｄ−ＩＬ−２の皮下注射の８時間後に、流入領域リンパ節においてＡＩＣＤをin vivo評価した。得られた結果を表６に要約している。それらの結果は、各試験に３匹のマウスを用いた２試験のものである。

表６：融合サイトカインのin vivoでの毒性．ＡＩＣＤの測定（結果は、ゲート細胞全体に対する割合として表している）

表６に示すように、リンパ節に含まれる細胞のフローサイトメトリー解析により、Ａｄ−ｍＩＬ−２の注射によってin vivoで強いＡＩＣＤ（４８％アネキシンＶ^＋および２９％ＦａｓＬ^＋細胞）が誘導されることが分かった。これとは好対照に、ＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（１９％アネキシンＶ^＋および１８％ＦａｓＬ^＋細胞）、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）（９％アネキシンＶ^＋および１５％ＦａｓＬ＋細胞）は、ＩＬ−２誘発性ＡＩＣＤからＴ細胞を防御し、ＩＬ−７／ＩＬ−２（６％アネキシンＶ^＋および１２％ＦａｓＬ^＋細胞）はさらに優れている。
要するに、in vitroでもin vivoでも、ＡＩＣＤアッセイによって、本発明の融合タンパク質により与えられる低アポトーシス状態が示される。

ＶＬＳアッセイ
候補融合サイトカインの毒性を評価するため、健常Ｃ５７Ｂｌ／６マウス群に、高用量のエンプティーＡｄまたはｍＩＬ−２、ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）、ｍＩＬ−２＋ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の組合せ、ならびに融合サイトカインｍＩＬ−２／ｍＩＬ７、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）およびｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）をコードするアデノウイルスベクターを静脈内投与した。図６に示すように、２つの融合型ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）およびｍＩＬ−２／成熟ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）では、ｍＩＬ−２およびｍＩＬ−２＋ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の組合せによって起こる血液漏出よりも誘導される血液漏出ははるかに少ない。Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍＩＬ−７を注射したマウスでも、血液漏出の減少が認められた。これらのデータから、ＩＬ−２とプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）、ならびにＩＬ−２とＩＬ−７を遺伝子融合することにより、血管透過性に関連するサイトカインの毒性が劇的に低下することが示される。

さらに、融合サイトカインによってもたらされる毒性の減弱を、注射を受けたマウスの血清中の肝酵素ＡＳＡＴおよびＡＬＡＴを定量することにより確認した。これらの結果から、Ａｄ−ｍＩＬ−２またはＡｄ−融合サイトカインでの処置後には肝毒性が存在しないことが示される。

実施例４：融合サイトカインのin vivoでの機能性
本発明の融合サイトカインの抗腫瘍活性を４種類の腫瘍モデル（Ｐ８１５、ＲｅｎＣａ、Ｂ１６Ｆ１０およびＴＣ１）において調べた。Ｂ６Ｄ２マウスにおいて腫瘍を作製し、Ａｄ−融合物（５×１０^８ｉｕ）の３回の腫瘍内注射を１２０日間にわたって行った後、腫瘍増殖およびマウスの生存を評価した。４腫瘍モデルで得られた結果を表７に要約している。

表７：ネズミ腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性（結果は、１２０日間での腫瘍のないマウスの割合で示す）

Nt = 試験せず

表７に示すように、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８が、種々の起源の腫瘍（特に、ネズミ肥満細胞種（Ｐ８１５）、腎臓癌（ＲｅｎＣａ）およびＨＰＶ形質転換腫瘍（ＴＣ１））の治療に最も効果的な融合物である。さらに重要なことには、この融合サイトカインで認められる抗腫瘍防御は、個々のサイトカインをコードするベクター（Ａｄ−ｍＩＬ−２またはＡｄ−ｍプロＩＬ−１８を参照）の投与、ならびにこれらのサイトカインを別個にコードするベクターの同時投与（Ａｄ−ｍＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８）によりもたらされるものよりも、少なくともＲｅｎＣａ、Ｐ８１５およびＴＣ１腫瘍モデルにおいてははるかに高い。さらに、突然変異型ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の使用により、総ての腫瘍モデルで抗腫瘍効果が飛躍的に高まる（Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を参照、Ｐ８１５モデルでは腫瘍のないマウスが７０％、Ｂ１６Ｆ１０モデルでは５０％、ＲｅｎＣａモデルでは９０％およびＴＣ１モデルでは６０％を示す）。Ａｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２で処置したいくつかの動物モデルでも、著しい抗腫瘍活性が認められた。Ａｄ−ｍＩＬ−２１／ＩＬ−２およびＡｄ−ｍＩＦＮ−ｇ／ＩＬ−２も、Ａｄ−ｍＩＬ−２と同程度に抗腫瘍防御をもたらす。

Slos et al., 2001, Cancer Gene Ther. 8, 321-332)により記載されているように、in vivoでＣＤ８細胞、ＮＫ細胞およびＣＤ４細胞の枯渇を行った。生存データは、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の抗腫瘍活性がＣＤ８細胞およびＮＫ細胞活性に厳密に依存していたことを示している。興味深いことに、ＣＤ４枯渇により、融合サイトカインの腫瘍内投与のin vivoでの効果が高まった。

重要なことには、in vivoで、処置したマウスの血清において融合サイトカインに対する免疫応答が認められない（データは示していない）ということに注目すべきである。
融合サイトカインのin vivoでの抗腫瘍効果は、材料および方法に記載されているような、Ｐ８１５モデルにおける組織学、免疫組織化学またはフローサイトメトリーによる腫瘍内浸潤物の解析とも、先天性免疫エフェクター細胞および適応的免疫エフェクター細胞（流入領域リンパ節における）両方の近位部活性化の解析とも相関していた。それらの結果を表８に示す。

表８：Ａｄ−融合物の腫瘍内注射後の腫瘍浸潤物の解析

表８に示すように、Ａｄ−融合物注射後に、免疫組織化学解析を行えば、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８およびＡｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を注射した腫瘍が高度に壊死性であることが分かる。さらに、免疫組織学により、初発腫瘍組織学とは異なる浸潤物パターンの顕著な変化とＣＤ８^＋／ＣＤ２５^＋活性化Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＡＰＣの数の増加が示される。さらに、注射した腫瘍では、ＩＬ−１８受容体のアップレギュレーションが明白に示される。このような変化は、Ａｄ−ｍＩＬ−２およびＡｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２を注射したＰ８１５腫瘍でも認められるが、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８またはＡｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を注射した場合より少し低いレベルである。驚くべきことに、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）を注射した腫瘍は、フォン・ウィルブランド因子に関して高度に陽性を示し、このことから、新たな血管の形成が示唆される。

Ｐ８１５腫瘍流入領域リンパ節でも同様の結果が得られた。さらに、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８およびＡｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の腫瘍内注射では、腫瘍流入領域リンパ節でのＡＩＣＤは全く起こらない。このことは、Ａｄ−ｍＩＬ−２で処置したＰ８１５腫瘍とは対照的である。さらに、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）およびＡｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２で処置したマウスでは、リンパ節において免疫細胞の増加（×３０〜×４０）が認められたが、一方、Ａｄ−ｍＩＬ−２で処置したマウスのリンパ節では、検出された免疫細胞の数は減少した。この増加は、腫瘍細胞数の劇的な減少と関係している。このことから、腫瘍の全細胞数と流入領域リンパ節の全細胞数との間に逆相関が明らかに示される。Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）およびＡｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２の腫瘍内注射後にリンパ節に存在する免疫エフェクター細胞は、主に、活性化ＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＤ３^＋／ＣＤ６９^＋；ＣＤ８^＋／ＣＤ２５^＋）と成熟樹状細胞のような活性化ＡＰＣ（ＣＤ１１ｃ^＋／ＭＨＣＩＩ^＋）である。これらのエフェクター細胞の割合および数は、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）およびＡｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２の注射後に、Ａｄ−ｍＩＬ−２、Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）、Ａｄ−ｍＩＬ−７単独またはＡｄｍＩＬ−２＋Ａｄ−ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の組合せを注射した場合よりも増加する。

実施例５：特異的免疫療法でのＡｄ−融合物の免疫アジュバント効果の評価
Ａｄ−融合物の免疫アジュバント効果を、ＴＣ１転移モデルにおいて評価した。Ｃ５７Ｂ１６マウスの肺において転移を確立するために、ＴＣ１細胞を静脈内経路により注射した。１０日後、いくつかのＡｄ−融合物を鼻腔内経路または気管内経路により投与して、融合タンパク質を肺転移環境で発現させ、さらに、粘膜免疫を誘導した。Ａｄ−ｍＩＬ−２／ＩＬ−１８の鼻腔内経路または気管内経路による投与によって、アデノウイルス投与から１５日後に処置マウスの膣洗浄液中の総ＩｇＡ量が促された。鼻腔内投与または気管内投与による総ＩｇＡのレベルは、同様であった。さらに、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ＩＬ−１８投与後の抗アデノウイルス中和抗体の割合は、エンプティーアデノウイルスまたはＡｄ−ｍＩＬ−２の投与後よりもずっと低い。これらの結果は、これらのベクターに対する体液性免疫応答が低いことから融合物をコードするアデノウイルスベクターの再投与が容易になる可能性があるということを示しているという点において重要である。

さらに、ＲＴ−ＰＣＲ解析により、これらの２つの「粘膜」経路により、肺、より正確には、肺に存在するＴＣ１転移における融合サイトカインＩＬ−２／ＩＬ−１８の非常に優れた発現が可能になることが示された。ＴＣ１転移の増殖が処置したマウスで停止したことから、融合物の発現が強いin vivo効果と関係しているということが重要である。

同時に、これらの結果は、融合サイトカインの癌またはウイルスワクチンのアジュバントとしての潜在的有用性も示している。

融合サイトカインｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の癌特異的ワクチンの遺伝子アジュバントとしての使用も評価した。まず、７．５Ｋプロモーターにより推進されるＨＰＶ−１６株の膜結合型非発癌性Ｅ７抗原（ＷＯ９９／０３８８５参照）を発現するＭＶＡベクターとの併用でのＡｄ−融合物の免疫アジュバント効果の評価を、ＴＣ１転移モデルで実施した。マウスに、３９日目、４６日目および５３日目に、５×１０^８ｉｕのＡｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の３回の鼻腔内注射を施し、４２日目、４９日目および５６日目に、ＭＶＡ−Ｅ７の３回の皮下注射を施した。腫瘍サイズおよび生存率を１２０日間にわたって評価した。図７に示すように、腫瘍特異的抗原を発現するベクターＭＶＡ−Ｅ７とＩＬ−２／ＩＬ−１８融合物を発現するアデノウイルスとを組み合わせることにより、極めて転移の遅いＴＣ１モデルにおいて腫瘍特異的免疫応答が強く増強された。この組合せによって、処置した動物の生存率が高まり、残留転移数を減らすことができた。

キメラ１１ｋ／７．５Ｋプロモーターの制御下に置かれたＦＣＵ−１自殺遺伝子（ＷＯ９９／５４４８１）を発現するＭＶＡベクターとの併用でのＡｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の免疫アジュバント効果も、Ｂ１６Ｆ１０モデルで評価した。６〜７週齢の免疫能の正常なＢ６Ｄ２マウスの右側腹部に、１００マイクロリットルのＢ１６Ｆ１０細胞懸濁液（３×１０^６細胞／ｍｌ）を皮下注射した。腫瘍が触知可能となった注射後７日目、８日目および９日目に、マウスに、５×１０^８ｉｕの、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ_２で希釈したＡｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）と１０^７ｐｆｕのＭＶＡ−ＦＣＵ１の３回の腫瘍内注射を施した。プロドラッグ５−ＦＣを、供給する水に終濃度０．５％となるように加えて与えた。腫瘍サイズおよび生存率を８０日間にわたって評価した。図８に示すように、Ａｄ−ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）とＭＶＡ−ＦＣＵ１との組合せによって、自殺遺伝子療法アプローチの抗腫瘍効果が明らかに向上した。このことは、化学療法に基づく戦略での融合サイトカインｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の強力なアジュバント効果を示している。

これらの結果から、本発明のＡｄ−融合物ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の、免疫原（例えば、ＨＰＶ−１６Ｅ７のような腫瘍特異的抗原）との併用でのワクチン接種ならびに自殺遺伝子療法および好適な化学療法との併用での癌特異的ワクチン接種での遺伝子アジュバントとしての可能性が明らかに示される。

実施例６：ＩＬ−１５含有融合サイトカイン
ＩＬ−１５含有Ａｄ構築物は、実施例１に記載している（ｍＩＬ−２／ｍＩＬ−１５、ｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−７／ｍＩＬ−１５、ｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−７、ｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−２１、ｍＩＬ−２１／ｍＩＬ−１５）。さらに、ｍＩＬ−１５とｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）との融合も、材料および方法および実施例１に記載されている同じ構築スキームを使用して行った。注目すべきは、ＩＬ−１５が融合物のＮＨ２末端に存在する構築物（ｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−７、ｍＩＬ−１５／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）およびｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−２１）において、ＩＬ−１５構成要素が、成熟ネズミＩＬ−１５とインフレームで融合されるＩＬ−２ペプチドシグナルを含んでなるように設計される（配列番号５で示されるように）ことである。対照Ａｄ−ｍＩＬ−１５もＩＬ−２のペプチドシグナルの前に成熟ＩＬ−１５を含んでなる。ＩＬ−１５含有融合物の発現は、材料および方法に記載されているように、ウエスタンブロットにより、異なるＡｄ−ベクターに感染したＡ５４９細胞において測定した。感染Ａ５４９細胞の培養培地に高レベルで分泌されたｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−７、ｍＩＬ−２１／ｍＩＬ−１５およびｍＩＬ−１５／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合物を除く、大半のＩＬ−１５含有融合物ならびにＡｄ−ｍＩＬ−１５で、低発現および分泌レベルを検出した。

ＩＬ−１５に基づく融合サイトカインをコードするアデノウイルスの抗腫瘍活性を、３回の腫瘍内注射により処置したＢ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスで調べた。移植後４３日間、腫瘍増殖を評価した。図９に示すように、Ａｄ−ｍＩＬ−１５／ｍＩＬ−７、Ａｄ−ｍＩＬ−２１／ｍＩＬ−１５およびＡｄ−ｍＩＬ−１５／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の腫瘍内注射により、導入遺伝子を含有していないＡｄ（Ａｄ−エンプティー）またはｍＩＬ−１５単独を発現する対照Ａｄ−ｍＩＬ−１５の腫瘍内注射と比べて、処置した動物における腫瘍増殖の統計的な制御が可能となる。

融合物のＩＬ−１５の分泌を高めるために、さらなる構築物を設計して、他のシグナルペプチドを評価した。Ａｄ−ｍＩＬ−１５構築物のＩＬ−２シグナルペプチドを、長鎖型（ｓｐＬＳＰ）もしくは短鎖天然型（ｓｐＬＳＰスプライス）の内因性ＩＬ−１５ペプチドシグナル(Kurys et al., 2000, J. Biol. Chem. 275, 30653)またはマウス免疫グロビンＧのκ軽鎖（ｓｐＶＫＬ）から得られた異種シグナルペプチド(Meazza et al., 2000, Int. J. Cancer 87, 574)のいずれかで置き換えた。それぞれのシグナルペプチドで推進されるＩＬ−１５の発現および分泌をウエスタンブロットにより評価し、ＩＬ−２シグナルペプチドを含有する最初の構築物と比較した。これらの結果により、ＩＬ−１５内因性のペプチドシグナル（短鎖型）、特に、ＩｇＧシグナルペプチドを使用することにより、ＩＬ−１５の分泌レベルが大きく３〜１０倍向上し得ることが分かる。さらに、種々のシグナルペプチドによって制御されるＩＬ−１５サイトカインをコードするアデノウイルスの抗腫瘍活性を、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスで調べた。図１０に示すように、ＩｇＧシグナルペプチドｖＫＬを使用した高分泌性Ａｄ−ＩＬ−１５構築物の腫瘍内注射により、他のＩＬ−１５形態よりもずっと高い生存率が提供される。シグナルペプチドｖＫＬ−ＩＬ−１５型を組み込んだ融合サイトカインの構築は、ＩＬ−１５／ＩＬ−７、ＩＬ−２１／ＩＬ−１５およびＩＬ−１５／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合物の活性および免疫アジュバント効果を高めるために行われる。

総合考察
組換えサイトカインの有用性から、サイトカイン生物学ならびにそれらの臨床応用が研究されるようになった。明らかになっている１つの態様は、多量のサイトカインの全身注射が、通常、血液漏出症候群に起因するかまたはそれを伴うかなりの毒性を伴うことである。その全身毒性に加え、ＩＬ−２の半減期が短いことによりその治療価値も制限される。文献で報告されている毒性と半減期が短いという問題を克服するための１つのアプローチが、ＩＬ−２と抗体（ＩＬ−２免疫サイトカイン）または半減期の長いタンパク質とを融合し、その融合物により体内の独特の抗原／受容体を標的化することである。本発明は、異なるアプローチにおいて、先天性免疫系を刺激するサイトカインを、適応的免疫応答を促進するサイトカインと組み合わせることを目指して、一連のサイトカイン融合タンパク質を提供する。ＩＦＮｇ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１をはじめとする種々のサイトカインをＩＬ−２と遺伝子融合し、Ｅ１およびＥ３欠失アデノウイルス発現系を用いて作製して、それらのin vitroおよびin vivo生物学的特性および腫瘍内注射後の抗腫瘍活性を検討した。これらのうち、いくつかの融合サイトカインが、融合物に関与する２つのサイトカインの生物活性の維持、重要な毒性の低減を含む興味深い特性を示した（例えば、ｍＩＬ２／プロＩＬ１８およびｍＩＬ７／ＩＬ２）。さらに、本発明は、記載した多くのＡｄ−融合サイトカイン（例えば、Ａｄ−ｍＩＬ−７／ＩＬ−２、Ａｄ−ｍＩＬ−２１／ｍＩＬ−２、Ａｄ−ｍＩＦＮｇ／ｍＩＬ−２およびＡｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８）が種々の起源の腫瘍の治療に効果的であることを示している。

より詳細には、本実施例で示した結果から、それぞれのサイトカインの互いの位置が少なくともアデノウイルス系における発現および生物活性に影響を及ぼし得ることが分かる。これに関して、ＩＬ−２とＩＬ−１８との構成物の分泌および活性では、ＩＬ−２が融合物（ＩＬ−２／ＩＬ−１８融合物）のＮ末端に存在する場合の方が、ＩＬ−２がＩＬ−１８のＣ末端に存在する場合よりもはるかに効果的であることが分かった。これに対して、ＩＬ−２とＩＬ−７の融合サイトカインではＩＬ−２がＩＬ−７構成要素のＣ末端に存在する場合にＩＬ−２とＩＬ−７のより効果的な融合サイトカインが得られた（実施例１および２参照）。

さらに、ＩＬ−１８は、最初、前駆体形態（プロＩＬ−１８）で作製されることが知られている。ＩＬ−１８前駆体は、分泌される酵素カスパーゼ−３／ＩＣＥによって切断されなければならない(Dinarello et al., 1999, Interleukin-18 Methods 19, 121-132)。実施例１および２は、プロＩＬ−１８を組み込んだ融合サイトカインが成熟ＩＬ−１８を含有するものよりもより効果的に発現されることを示している。これに基づき、ＩＬ−２／プロＩＬ−１８融合サイトカインの発現の際には、おそらく、ＩＬ−２関連シグナル配列の結果として、プロＩＬ１８が正確に折りたたまれ、分泌されると考えられる。

ＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の突然変異が、ＩＬ−１８の生物活性を増大させることが最近報告された。ＩＬ１８（Ｋ８９Ａ）含有融合サイトカインも、試験した総ての生物学的アッセイにおいて機能性の向上を示す。さらに重要なことには、ＩＬ１８（Ｋ８９Ａ）含有融合サイトカインが、アネキシンＶ、Ｆａｓ誘導（ＡＩＣＤ）または血液漏出（ＶＬＳ）により評価されるサイトカイン関連毒性についての著しい減少をさらに示すことが実施例３により分かる。興味深いことに、ｍＩＬ２／ｍプロＩＬ１８（Ｋ８９Ａ）融合サイトカインの生物活性は、個々のサイトカインの生物活性に必要なタンパク質濃度よりもずっと低く、それゆえ、毒性が少ないかまたは全く毒性がないタンパク質濃度で維持されると思われる。ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合物で得られる弱毒パターンは、融合タンパク質に関与するサイトカインの構造修飾の影響と考えられる。ネズミ融合サイトカインは、エフェクター細胞を発現するＩＬ−２受容体の特定集団を活性化するため、組換えＩＬ−２の見かけの毒性を低減することも可能である(Bensinger et al., 2004, J. Immunol. 172, 5287-5296)。

ＩＦＮｇを産生させるＩＬ−２またはＩＬ−１８サイトカインそれぞれのＴ細胞刺激には、脾臓Ｔ細胞がＣｏｎ−Ａにより予め活性化されていることが必要であるということは周知である(Osaki et al., 1998, J. Immunol. 160, 1742-1749; Osaki et al., 1999, Gene Ther. 6, 808-815; Hwang et al., 2004, Cancer Gene Ther. 11, 397-407)。興味深いことに、実施例２で示されるように、ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８融合サイトカインは、この活性に対し、Ｔ細胞の予備刺激を必要としない。そのため、ＩＬ−２およびＩＬ−１８生物活性が維持され、サイトカイン関連毒性が低減するだけでなく、ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８融合タンパク質は個々のサイトカインがいずれも持ち得ない新規活性を有すると思われる。

実施例４に示すように、極めて侵襲性の強いＢ１６Ｆ１０モデルを含む試験した総ての腫瘍モデルにおいて、Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）の腫瘍内注射を行うことにより非常に効果的な抗腫瘍防御が得られた。Ａｄ−ｍＩＬ−２／ｍプロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）によりもたらされる抗腫瘍活性は、Ａｄ−ＩＬ−２もしくはＡｄ−プロＩＬ−１８単独または２つの構築物の組合せのいずれかの腫瘍内注射を行って得られるものよりもはるかに高かった。枯渇試験では、先天性（ＮＫ細胞）免疫系だけでなく適応的（ＣＤ８）免疫応答もこの治療効果に関与することが明らかに示される。注射した腫瘍の免疫組織学的解析により、Ａｄ−ｍＩＬ２／プロＩＬ１８（Ｋ８９Ａ）によりもたらされる抗腫瘍活性が活性化Ｔ細胞および抗原提示細胞の浸潤と関係していることが示される。驚くべきことに、Ａｄ（ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ））を注射した腫瘍は、フォン・ウィルブランド因子に関して高度に陽性を示し、このことから、血管形成の増加が示唆される。通常、腫瘍の血管形成は、予後不良と関係しているが、この場合は、免疫エフェクター細胞による浸潤の増加と関係していると思われる。さらに、ｍＩＬ−２／プロＩＬ−１８（Ｋ８９Ａ）融合サイトカインは、腫瘍特異的Ｔ細胞の誘導に重要であると思われるＡＩＣＤ活性の低下を示す(Saff et al., 2004, J. Immunol. 172, 6598-6606)。

最後に、上記の結果に基づいて、本発明の融合サイトカインは、サイトカインの治療活性の増強だけでなく、毒性副作用の低減にも大いに将来性がある。

Claims

下式を有する、融合タンパク質：
（ａ）Ｘ−Ｙ、または
（ｂ）Ｙ−Ｘ
［式中、
Ｘは第１の免疫調節ポリペプチドを表し、
Ｙは第２の免疫調節ポリペプチドを表し、かつ、
ＸはＹと異なる］。
ＸおよびＹが各々、サイトカインを表す、請求項１に記載の融合タンパク質。
Ｘが、非特異的免疫応答を増強し得るサイトカインを表す、請求項２に記載の融合タンパク質。
非特異的免疫応答が、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞からなる群から選択される１以上のエフェクター細胞によって媒介される、請求項３に記載の融合タンパク質。
Ｙが、特異的免疫を増強し得るサイトカインを表す、請求項２〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
特異的免疫が、エフェクター細胞、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球によって媒介される、請求項５に記載の融合タンパク質。
ＸおよびＹが独立に、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１またはＩＦＮｇである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（ａ）ＸがＩＬ−２であり、かつ、ＹがＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１およびＩＦＮｇからなる群から選択される；
（ｂ）ＸがＩＬ−１２であり、かつ、ＹがＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１からなる群から選択される；
（ｃ）ＸがＩＬ−１５であり、かつ、ＹがＩＬ−７、ＩＬ−１８もしくはＩＬ−２１である；または
（ｄ）ＸがＩＬ−１８であり、かつ、ＹがＩＬ−２１である
、請求項７に記載の融合タンパク質。
（ａ）式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−７である）を有する；
（ｂ）式Ｘ−ＹまたはＹ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−１５である）を有する；
（ｃ）式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−１８である）を有する；
（ｄ）式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−２１である）を有する；
（ｅ）式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＦＮ−ｇである）を有する；
（ｆ）式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−１５であり、かつ、ＹはＩＬ−７である）を有する；
（ｇ）式Ｘ−ＹまたはＹ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−１５であり、かつ、ＹはＩＬ−１８である）を有する；
（ｈ）式Ｘ−ＹまたはＹ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−１５であり、かつ、ＹはＩＬ−２１である）を有する；および
（ｉ）式Ｘ−ＹまたはＹ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−１８であり、かつ、ＹはＩＬ−２１である）を有する
、請求項８に記載の融合タンパク質。
前記ＩＬ−２が、その対応する天然型ＩＬ−２と比べて細胞傷害性の減弱を示す変異型ＩＬ−２である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
前記変異型ＩＬ−２が、
（ａ）その天然型ＩＬ−２の４２位のフェニルアラニン残基がリジン残基で置換されている変異体Ｆ４２Ｋ；
（ｂ）その天然型ＩＬ−２の３８位のアルギニン残基がアラニン残基で置換されている変異体Ｒ３８Ａ；
（ｃ）その天然型ＩＬ−２の２０位のアスパラギン酸残基がイソロイシン残基で置換されている変異体Ｄ２０Ｉ；
（ｄ）その天然型ＩＬ−２の８８位のアスパラギン残基がグリシン残基で置換されている変異体Ｎ８８Ｇ；
（ｅ）その天然型ＩＬ−２の８８位のアスパラギン残基がアルギニン残基で置換されている変異体Ｎ８８Ｒ；
（ｆ）その天然型ＩＬ−２の１２６位のグルタミン残基がメチオニン残基で置換されている変異体Ｑ１２６Ｍ；および
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択される、請求項１０に記載の融合タンパク質。
前記ＩＬ−１８が変異型ＩＬ−１８である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
前記変異型ＩＬ−１８が、その対応する天然型ＩＬ−１８の８９位のリジン残基がアラニン残基で置換されている変異型Ｋ８９Ａである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
前記ＩＬ−１８がプロＩＬ−１８である、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
配列番号１〜１９で示したいずれかのアミノ酸配列の総てまたは一部と少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
配列番号１〜１９で示したいずれかのアミノ酸配列の総てまたは一部と１００％相同であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１５に記載の融合タンパク質。
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
請求項１７に記載の核酸分子を含有する、ベクター。
１以上の細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工染色体由来であるか、またはバキュロウイルス、パポバウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、泡沫状ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択されるウイルス由来である、請求項１８に記載のベクター。
アデノウイルスベクターである、請求項１９に記載のベクター。
Ｅ１領域の代わりに挿入され、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれた請求項１７に記載の核酸分子を含んでなるＥ１−およびＥ３−欠失複製欠損アデノウイルスベクターである、請求項２０に記載のベクター。
（ｉ）腫瘍増殖阻害剤および／または（ii）それに対する免疫応答が望まれる少なくとも１つの抗原、をコードする１以上の導入遺伝子をさらに含んでなる、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のベクター。
前記腫瘍増殖阻害剤がＣＤアーゼ活性とＵＰＲＴアーゼ活性の両方を有する２ドメイン酵素をコードする融合タンパク質である、請求項２２に記載のベクター。
前記特異的抗原がＥ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１およびＬ２からなる群から個別にまたは組み合わせて選択されるＨＰＶ抗原である、請求項２２に記載のベクター。
前記ＨＰＶ抗原が初期ＨＰＶ−１６Ｅ６および／またはＥ７抗原の膜結合型非発癌性変異体である、請求項２４に記載のベクター。
請求項１７に記載の核酸分子または請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、感染性ウイルス粒子。
請求項２６に記載の感染性ウイルス粒子を生産するための方法であって、
（ａ）請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のウイルスベクターを好適な細胞系統に導入する工程、
（ｂ）前記細胞系統を、前記感染性ウイルス粒子を生産させるのに好適な条件下で培養する工程、および
（ｃ）前記細胞系統の培養物から生産された感染性ウイルス粒子を回収する工程、さらに
（ｄ）所望により、前記回収された感染性ウイルス粒子を精製する工程
を含んでなる、方法。
請求項１７に記載の核酸分子または請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項２６に記載の感染性ウイルス粒子を含んでなる、宿主細胞。
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を生産するための方法であって、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項２６に記載の感染性ウイルス粒子を好適な宿主細胞に導入すること、トランスフェクト宿主細胞または感染宿主細胞を産生すること、前記トランスフェクト宿主細胞または感染宿主細胞を宿主細胞の増殖に好適な条件下でin-vitro培養すること、および、その後、前記培養物から前記融合タンパク質を回収すること、さらに、所望により、前記回収された融合タンパク質を精製することを含む、方法。
有効量の、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２６に記載の感染性ウイルス粒子、請求項２８に記載の宿主細胞またはそれらのいずれかの組合せと、所望により、医薬上許容されるビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
癌または感染症を治療または予防することを目的とする薬剤の調製のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２６に記載の感染性ウイルス粒子、請求項２８に記載の宿主細胞または請求項３０に記載の組成物の使用。
前記組成物が固形腫瘍内にまたは固形腫瘍に近接して投与される、請求項３１に記載の使用。
前記融合タンパク質、前記ベクター、前記感染性ウイルス粒子、前記宿主細胞または前記組成物が１以上の導入遺伝子または導入遺伝子産物と組み合わせて投与される、請求項３１または請求項３２に記載の使用。
ヒトまたは動物生物体の治療のための方法であって、前記生物体に治療上有効な量の、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２６に記載の感染性ウイルス粒子、請求項２８に記載の宿主細胞または請求項３０に記載の組成物を投与することを含む、方法。
動物またはヒト生物体において免疫応答を増強するための方法であって、前記免疫応答を増強するように、前記生物体に、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２６に記載の感染性ウイルス粒子、請求項２８に記載の宿主細胞または請求項３０に記載の組成物を導入することを含む、方法。
動物またはヒト生物体において樹状細胞の成熟を促進するという目的のために意図された薬剤の調製のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２６に記載の感染性ウイルス粒子、請求項２８に記載の宿主細胞または請求項３０に記載の組成物の使用。
融合タンパク質が式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−１８である）を有しているか、または式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−７である）を有している、請求項３６に記載の使用。
動物またはヒト生物体においてＮＫＴ細胞を活性化するという目的のために意図された薬剤の調製のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２６に記載の感染性ウイルス粒子、請求項２８に記載の宿主細胞または請求項３０に記載の組成物の使用。
融合タンパク質が式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−１８である）を有している、請求項３８に記載の使用。
動物またはヒト生物体において投与した際に、個々のＸ構成要素および／またはＹ構成要素を投与した際に見られる細胞傷害性と比べて細胞傷害性の減弱をもたらす薬剤を調製のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター、請求項２６に記載の感染性ウイルス粒子、請求項２８に記載の宿主細胞または請求項３０に記載の組成物の使用。
融合タンパク質が式Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−１８である）を有しているか、または式Ｙ−Ｘ（式中、ＸはＩＬ−２であり、かつ、ＹはＩＬ−７である）を有している、請求項４０に記載の使用。