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JP2010539901A - 長鎖散在反復配列ポリペプチド組成物およびその使用方法 - Google Patents

長鎖散在反復配列ポリペプチド組成物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＬＩＮＥポリペプチド、および対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む免疫原性組成物を含めた組成物を提供する。本発明は、対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸を提供する。対象組成物は、ＬＩＮＥペプチドに対するＴ細胞免疫応答を刺激するために有用である。本発明は、さらに、個体において、レトロウイルスまたはレンチウイルスに感染した細胞に対する免疫応答を刺激する方法を提供する。本発明は、さらに、ＬＩＮＥポリペプチドが異常に発現されている組織に関連する癌を治療する方法を提供する。また、ＬＩＮＥポリペプチドに対する免疫応答を減少させることを含む、障害を治療する方法も提供する。

Description

相互参照
本出願は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年９月２０日出願の米国仮特許出願第６０／９７３，９９３号の優先権を主張するものである。
連邦支援の研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により授与された連邦補助金第ＡＩ６８４９８号および第ＡＩ４１５３１号の政府支援の下で行われた。政府は本発明の特定の権利を有する。
レトロエレメントは、少なくとも３つのクラス：外因性レトロウイルス、末端反復配列（ＬＴＲ）を含有するレトロトランスポゾンおよびＬＴＲを欠くレトロトランスポゾンに分類することができる。非ＬＴＲレトロトランスポゾンは、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）および短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）にさらに分類することができる。ＬＩＮＥ−１（「Ｌ１」）とは、すべての哺乳動物ゲノム中に見つかる非ＬＴＲレトロトランスポゾンであり、最も一般的なヒトＬＩＮＥである。約５００，０００個のＬＩＮＥ−１要素がヒトゲノム中に存在し、これは、その全配列の約１７％を占める。全ＬＩＮＥ−１ゲノム集団のうち、約１００個の完全長の要素が存在し、残りは様々な度合いで切断されている。ＬＩＮＥ−１は転写されて、２つのタンパク質、すなわちＯＲＦ１ｐ（またはｐ４０）およびＯＲＦ２ｐ（またはｐ１５０）をコードする約６ｋｂのｍＲＮＡを生じる。ＯＲＦ１ｐは、核酸シャペロン活性を有するＲＮＡ結合タンパク質をコードし、ＯＲＦ２ｐは、レトロ転位に必要な酵素であるエンドヌクレアーゼおよび逆転写酵素をコードする。ＬＩＮＥ−１のレトロ転位は、逆転写が組み込みと協調して起こる標的に刺激される逆転写（ＴＰＲＴ）機構によって引き起こされる。
米国特許第５，２８０，１０８号明細書
Ｂｏｇｅｒｄ等（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３（２３）：８７８０〜５ Ｈｏｈｊｏｈ等（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．、１６（１９）：６０３４〜６０４３ Ｂｏｉｓｓｉｎｏｔ等（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．、１８（１２）：２１８６〜２１９４ Ｅｒｇｕｎ等（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（２６）：２７７５３〜２７７６３
本発明は、ＬＩＮＥポリペプチド、および対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む免疫原性組成物を含めた組成物を提供する。本発明は、対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸を提供する。対象組成物は、ウイルスに感染した細胞上に存在するＬＩＮＥペプチドがＬＩＮＥ特異的Ｔ細胞によって認識されるように、ＬＩＮＥペプチドに対するＴ細胞免疫応答を刺激するために有用である。本発明は、さらに、個体において、レトロウイルスまたはレンチウイルスに感染した細胞に対する免疫応答を刺激する方法を提供する。本発明は、さらに、ＬＩＮＥポリペプチドが異常に発現している組織に関連する癌を治療する方法を提供する。また、ＬＩＮＥポリペプチドに対する免疫応答を減少させることを含む、障害を治療する方法も提供する。
本発明は、ＬＩＮＥポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物は、対象ＬＩＮＥポリペプチドと製薬上許容される担体とを含む。対象ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１〜２２のうちの任意の１つと少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。さらなる実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１〜１０１のうちの任意の１つに記載のアミノ酸配列を含む。対象免疫原性組成物は、非経口投与用または粘膜組織への投与用を含めた、様々な方法で製剤することができる。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９、またはモノホスホリル脂質Ａである。
本発明は、ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む免疫原性組成物を提供する。コードされるＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１〜２２のうちの任意の１つと少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物は、非経口投与用または粘膜組織への投与用に製剤する。一部の実施形態では、ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、組換えベクター、たとえばウイルスベクターである。
個体において、病原性ウイルスに感染したまたは感染する危険性のある宿主細胞に対するＴリンパ球応答を誘導する方法であって、それを必要としている個体に、対象ＬＩＮＥポリペプチドと製薬上許容される担体とを含む免疫原性組成物または対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を投与することを含む方法も提供する。一部の実施形態では、Ｔリンパ球応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む。さらなる実施形態では、Ｔリンパ球応答は、粘膜Ｔリンパ球応答を含む。対象方法を用いた治療に適した個体には、たとえば、ヒトレトロウイルスなどの病原性ウイルス、たとえばヒト免疫不全ウイルスに感染している、または感染する危険性のある個体が含まれる。
個体において、病原性ウイルスに感染したまたは感染する危険性のある宿主細胞に対するＴリンパ球応答を誘導する対象方法は、病原性ウイルスに感染していない個体で実施することができる。これらの実施形態では、対象方法は、ＬＩＮＥポリペプチドと製薬上許容される担体とを含む免疫原性組成物またはＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、病原性ウイルスに感染していない個体に投与することを含むことができる。他の実施形態では、対象方法は、病原性ウイルスに感染した個体においてＴリンパ球応答を誘導する。
また、一般に、個体に、対象ＬＩＮＥポリペプチドと製薬上許容される担体とを含む対象免疫原性組成物を投与すること、または、個体に、対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む対象免疫原性組成物を投与することを含む、個体において、ＬＩＮＥ発現を示し、その表面上にＬＩＮＥエピトープを提示する癌細胞に対するＴリンパ球応答を誘導する方法も提供する。
また、一般に、未刺激のＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、抗原提示プラットフォームと会合している対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドと接触させることを含み、接触により、ＬＩＮＥペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団の産生がもたらされる、ＬＩＮＥポリペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を作製する方法も提供する。
ＨＩＶ−１に感染した初代ＣＤ４＋Ｔ細胞中におけるＬ１−Ｐ１５０の発現を示す図である。 ＨＩＶ−１に感染した個体の末梢血中においてＬ１に対する免疫応答が存在するが、感染していない個体では存在しないことを示す図である。 Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＨＩＶ−１に感染した細胞の特異的認識を示す図である。 Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＨＩＶ−１に感染した細胞の特異的認識を示す図である。 Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＨＩＶ−１に感染した細胞の特異的認識を示す図である。 Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＨＩＶ−１に感染した細胞の特異的認識を示す図である。 ＨＩＶ−１に感染した細胞の排除およびＬ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのウイルス産生の抑制を示す図である。 多様なＨＩＶ−１パネルおよびＨＩＶ−２を用いたＬ１特異的Ｔ細胞クローン認識アッセイを示す図である（実験「ＴＯ１」）。 多様なＨＩＶ−１パネルおよびＨＩＶ−２を用いたＬ１特異的Ｔ細胞クローン認識アッセイを示す図である（実験「ＴＯ１」）。 多様なＨＩＶ−１パネルおよびＨＩＶ−２を用いたＬ１特異的Ｔ細胞クローン認識アッセイを示す図である（実験「ＴＯ１」）。 多様なＨＩＶ−１パネルおよびＨＩＶ−２を用いたＬ１特異的Ｔ細胞クローン認識アッセイを示す図である（実験「ＴＯ１」）。 多様なＨＩＶ−１パネルおよびＨＩＶ−２を用いたＬ１特異的Ｔ細胞クローン認識アッセイを示す図である（実験「ＴＯ１」）。 Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンの多様なＨＩＶ−１パネル認識アッセイを示す図である「ＳＦ１」。 Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンの多様なＨＩＶ−１パネル認識アッセイを示す図である「ＳＦ１」。 Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンの多様なＨＩＶ−１パネル認識アッセイを示す図である「ＳＦ１」。 Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンの多様なＨＩＶ−１パネル認識アッセイを示す図である「ＳＦ１」。 Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンの多様なＨＩＶ−１パネル認識アッセイを示す図である「ＳＦ１」。 Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンの多様なＨＩＶ−１パネル認識アッセイを示す図である「ＴＯ２」。 Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンの多様なＨＩＶ−１パネル認識アッセイを示す図である「ＴＯ２」。 多様なＨＩＶ−１単離体に感染した自己細胞に対するクローンＬ１−３Ｏの応答性の度合いと感染のレベルとの相関を示す図である。 抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗体とのプレインキュベーションによる感染細胞の認識の遮断を示す図である。 ＨＩＶ−１タンパク質に対するＬＩＮＥアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索を用いて同定した候補ＬＩＮＥポリペプチドを提供する表である。 ＨＩＶ−１タンパク質に対するＬＩＮＥアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索から生じる、対象ＬＩＮＥポリペプチドとＨＩＶタンパク質配列との間の例示的な配列アラインメントを提供する表である。 ＨＩＶ−１タンパク質に対するＬＩＮＥアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索から生じる、対象ＬＩＮＥポリペプチドとＨＩＶタンパク質配列との間の例示的な配列アラインメントを提供する表である。 ＨＩＶ−１タンパク質に対するＬＩＮＥアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索から生じる、対象ＬＩＮＥポリペプチドとＨＩＶタンパク質配列との間の例示的な配列アラインメントを提供する表である。 ＨＩＶ−１タンパク質に対するＬＩＮＥアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索から生じる、対象ＬＩＮＥポリペプチドとＨＩＶタンパク質配列との間の例示的な配列アラインメントを提供する表である。 ｉｎ ｓｉｌｉｃｏエピトープ予測を用いて同定したＬＩＮＥ−１ペプチドを示す表である。 単離ＬＩＮＥポリペプチドＬｉＤ９Ｒ、ＬｉＥ１３Ｅ、ＬｉＫ１０Ｉ、Ｌｉｌ９Ｃ、Ｌｉｍ１２Ｔ、ＬｉＮ１３ＶおよびＬｉＱ９ＥのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を提供する表である。 単離ＬＩＮＥポリペプチドＬｉＤ９Ｒ、ＬｉＥ１３Ｅ、ＬｉＫ１０Ｉ、Ｌｉｌ９Ｃ、Ｌｉｍ１２Ｔ、ＬｉＮ１３ＶおよびＬｉＱ９ＥのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を提供する表である。 単離ＬＩＮＥポリペプチドＬｉＤ９Ｒ、ＬｉＥ１３Ｅ、ＬｉＫ１０Ｉ、Ｌｉｌ９Ｃ、Ｌｉｍ１２Ｔ、ＬｉＮ１３ＶおよびＬｉＱ９ＥのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を提供する表である。 単離ＬＩＮＥポリペプチドＬｉＩＶ９、ＬｉＫＩ９、ＬｉＲＶ９、ＬｉＴＶ９のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を提供する表である。 単離ＬＩＮＥポリペプチドＬｉＩＶ９、ＬｉＫＩ９、ＬｉＲＶ９、ＬｉＴＶ９のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を提供する表である。 図２で言及するペプチドのペプチド配列および特徴を示す表である。 ＨＩＶ−１に感染した対象に関する情報を提供する表である。 ＨＩＶ−１に感染した対象に関する情報を提供する表である。 ＨＩＶ−１に感染した対象に関する情報を提供する表である。 ＨＩＶ−１に感染した対象に関する情報を提供する表である。 ＨＩＶ−１に感染した対象に関する情報を提供する表である。 ＨＩＶ−１に感染した対象に関する情報を提供する表である。 ウイルス単離体に関する情報を提供する表である。 ウイルス単離体に関する情報を提供する表である。 ウイルス単離体に関する情報を提供する表である。 ウイルス単離体に関する情報を提供する表である。 多様なＨＩＶ−１パネルを用いたＬＩＮＥ−１（Ｌ１）特異的Ｔ細胞クローン死滅アッセイの結果を示す図である。 １５量体ＬＩＮＥポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。 １５量体ＬＩＮＥポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。 １５量体ＬＩＮＥポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。 １５量体ＬＩＮＥポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
定義
本明細書中で使用する「生体試料」には、個体から得た様々な試料種が包含され、診断または監視アッセイで使用することができる。用語「生体試料」には、血液および生物由来の他の液体試料、生検標本またはそれに由来する組織培養物もしくは細胞およびその子孫などの固体組織試料が包含される。また、用語「生体試料」には、試薬を用いた処理；洗浄；またはＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、グリア細胞、マクロファージ、腫瘍細胞、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などの特定の細胞集団の濃縮などによって、その獲得後に任意の方法で操作された試料も含まれる。用語「生体試料」には臨床試料が包含され、また、培養中の細胞、細胞上清、組織試料、臓器、骨髄、血液、血漿、血清、脳脊髄液なども含まれる。
用語「レトロウイルス」は当分野で十分に理解されており、たとえば、ガンマレトロウイルス属（たとえばネズミ乳癌ウイルス）；イプシロンレトロウイルス属；アルファレトロウイルス属（たとえばトリ白血症ウイルス）；ベータレトロウイルス属；デルタレトロウイルス属（たとえば、ウシ白血病ウイルス；ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ））；レンチウイルス属；およびスプマウイルス属を含めた、一本鎖プラスセンスのエンベロープＲＮＡウイルスが含まれる。本明細書中で使用する用語「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科のウイルスの属をいい、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）；ヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が含まれる。
本明細書中で使用する「遺伝子送達ビヒクル」とは、１つまたは複数の目的の遺伝子またはヌクレオチド配列を宿主細胞内へと送達することができ、一部の実施形態では、発現させることができる構築体をいう。そのようなビヒクルの代表的な例には、ウイルスベクター、核酸発現ベクター、裸ＤＮＡ、および特定の真核細胞（たとえば産生細胞）が含まれる。
本明細書中で使用する「作動可能に連結した」とは、記載した構成要素がその通常の機能が行われるように構成されている要素の配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結した制御要素は、コード配列の発現に影響を与えることができる。制御要素は、その発現を指示するように機能する限りは、必ずしもコード配列と連続的である必要はない。したがって、たとえば、介在する未翻訳であるが転写された配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、それでも、プロモーター配列はコード配列に「作動可能に連結している」とみなすことができる。
本明細書中で互換性があるように使用される用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」とは、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態をいい、コードおよび非コードアミノ酸、化学もしくは生物化学修飾または誘導体化したアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含むことができる。この用語には、それだけには限定されないが、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたは有さない、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、異種および相同リーダー配列との融合体；免疫学的にタグ付けしたタンパク質などを含めた、融合タンパク質が含まれる。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシル基をいう。標準のポリペプチド命名法に沿うために、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３（１９６９）、３５５２〜５９を使用する。
本明細書中で使用する用語「単離した」とは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞が天然に存在する環境とは異なる環境中にある、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞を説明することを意味する。単離した遺伝子改変した宿主細胞は、遺伝子改変した宿主細胞の混合集団中に存在し得る。一部の実施形態では、単離したポリペプチドは合成である。「合成ポリペプチド」はアミノ酸からアセンブルし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、たとえば当業者に知られている手順を用いた無細胞化学合成を用いて化学合成する。一部の実施形態では、単離したポリペプチドは精製する。
「精製した」とは、目的化合物（たとえばポリペプチド）が、天然ではそれに付随する構成要素から分離されていることを意味する。また、「精製した」とは、製造中（たとえば化学合成中）にそれに付随する場合がある構成要素から分離された、目的化合物（たとえばポリペプチド）をいうためにも使用することができる。一部の実施形態では、化合物（たとえばポリペプチド）は、天然で会合しているまたは製造中に会合している有機分子が、少なくとも５０重量％〜６０重量％除かれた場合に、実質的に純粋である。一部の実施形態では、調製物は、目的化合物の少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、または少なくとも９９重量％である。したがって、たとえば、「精製した」対象ポリペプチドは、ポリペプチドが組成物の少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、または少なくとも９９重量％の量で組成物中に存在する。実質的に純粋な化合物は、たとえば、天然源（たとえば細菌）から抽出することによって、化合物を化学合成することによって、または精製および化学修飾の組合せによって、得ることができる。また、実質的に純粋な化合物は、たとえば、目的抗体と結合する化合物を有する試料を濃縮することによっても得ることができる。純度は、任意の適切な方法、たとえば、クロマトグラフィー、質量分析、高速液体クロマトグラフィー分析などによって測定することができる。
ＬＩＮＥポリペプチド融合タンパク質がＬＩＮＥポリペプチドおよび「異種」ポリペプチドを含むＬＩＮＥポリペプチドのコンテキストにおいて、本明細書中で使用する用語「異種」とは、ＬＩＮＥポリペプチド以外のポリペプチド、たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドと通常は天然で会合していないポリペプチドをいう。たとえば、異種ポリペプチドは、ＬＩＮＥポリペプチドと有意なアミノ酸配列同一性を保有せず、たとえば、異種ポリペプチドは、ＬＩＮＥポリペプチドと、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、または約２０％未満のアミノ酸配列同一性を有する。
「抗原」とは、抗体分子またはＴ細胞受容体によって特異的結合され得る任意の物質が含まれるように、本明細書中で定義される。「免疫原」とは、リンパ球活性化を開始させて、抗原特異的免疫応答をもたらすことができる抗原である。
「エピトープ」とは、特定的なＢ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を意味する。また、この用語は、「抗原決定基」または「抗原決定基部位」と互換性があるように使用される。タンパク質、多糖類、または他のバイオポリマー上のＢ細胞エピトープ部位は、折り畳みによってまとめられた巨大分子の様々な部位からの部分で構成され得る。この種のエピトープは、この部位が、直鎖配列中では不連続であるが折り畳まれたコンホメーションでは連続的であるポリマーセグメントから構成されているため、コンホメーションまたは不連続エピトープと呼ばれる。バイオポリマーまたは他の分子の単一セグメントから構成されるエピトープは、連続または直鎖エピトープと呼ばれる。Ｔ細胞エピトープは、一般に直鎖ペプチドである。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が別の抗体の標的抗原との結合を遮断する能力を示す、単純な免疫アッセイで同定することができる。
本明細書中で互換性があるように使用される用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのどちらかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいう。したがって、この用語には、それだけには限定されないが、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然、化学修飾、生物化学修飾、非天然、もしくは誘導体化したヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
核酸の説明において本明細書中で使用する「組換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、天然系中で見つかる内在核酸とは識別可能な構造的コードまたは非コード配列を有する構築体をもたらす、クローニング、制限、および／またはライゲーションステップの様々な組合せの産物であることを意味する。一般に、構造的コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連の合成オリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ、これにより、細胞または無細胞転写および翻訳系中に含有される組換え転写単位から発現できる合成核酸が提供される。したがって、たとえば、用語「組換え」ポリヌクレオチドまたは核酸とは、天然に存在せず、たとえば、人の介入によって、他の場合では分離されている２つの配列セグメントの人工的な組合せによって作製されるものをいう。
「作動可能に連結した」とは、そのように記載した構成要素が、その意図される様式で機能することが可能な関係性にある、近位をいう。たとえば、プロモーターがその転写または発現に影響を与える場合に、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している。
用語「癌」、「新生物」、および「腫瘍」とは、本明細書中で互換性があるように使用され、細胞増殖の制御の有意な損失によって特徴づけられる異常な成長表現型を示すように、比較的自律的な成長を示す細胞をいう。本出願における治療の目的細胞には、前癌性、悪性、転移前、転移性、および非転移性の細胞、ならびにｉｎ ｓｉｔｕ癌腫が含まれる。
「癌表現型」とは、一般に、癌細胞の特徴である様々な生物学的現象のうちの任意のものをいい、現象は、癌の種類に応じて変動する場合がある。癌表現型は、一般に、たとえば、細胞の成長または増殖（たとえば、非制御の成長または増殖）、細胞周期の調節、細胞可動性、細胞間相互作用、または転移などの異常によって同定する。
用語「対象」、「個体」、「宿主」、および「患者」とは、本明細書中で互換性があるように使用され、それだけには限定されないが、ネズミ（ラット、マウス）、ネコ科動物、非ヒト霊長類（たとえばサル）、ヒト、イヌ科動物、有蹄動物などを含めた哺乳動物をいう。
本明細書中で使用する用語「治療」、「治療すること」、「治療する」などとは、一般に、所望の薬理学的および／または生理的な効果を得ることをいう。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防することに関して予防的であり得るか、かつ／または、疾患および／もしくは疾患に起因し得る有害作用の部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒に関して治療的であり得る。本明細書中で使用する「治療」とは、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を含み、（ａ）疾患もしくは症状に罹りやすい可能性があるが、未だ罹患していると診断されていない対象において、疾患もしくは症状の発生を予防すること；（ｂ）疾患の症状を阻害すること、すなわち、その発達を停止させること；または（ｃ）疾患の症状を緩和させること、すなわち、疾患もしくは症状の回帰をもたらすことが含まれる。
本発明をさらに説明する前に、記載した特定の実施形態はもちろん変動し得るため、本発明はそれに限定されないことを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図しないことも理解されたい。
値の範囲を提供する場合、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの間の値（コンテキストにより明らかにそうでないと指示される場合以外は下限の単位の十分の一まで）、およびその記述した範囲内の任意の他の記述した値または間の値が、本発明内に包含されることを理解されたい。これらのより狭い範囲の上限および下限は、より狭い範囲内に独立して含められてもよく、やはり本発明内に包含され、記述した範囲中の任意の具体的に排除した限界に従う。記述した範囲に一方または両方の限界が含まれる場合は、これらの含まれる限界の一方または両方を排除する範囲も、本発明に含まれる。
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書中に記載するものと類似または均等の任意の方法および材料も本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書中で引用するすべての出版物は、出版物の引用に関連する方法および／または材料を開示および記載するために、本明細書中に参考として組み込まれている。
コンテキストにより明らかにそうでないと指示される場合以外は、本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数の指示対象が含まれることに注意されたい。したがって、たとえば、「（ａ）長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）ポリペプチド」への言及には複数のそのようなポリペプチドが含まれ、「（ｔｈｅ）免疫原性組成物」への言及には、１つまたは複数の免疫原性組成物および当業者に知られているその均等への言及が含まれる。特許請求の範囲は、任意の選択的要素を排除するように作成されている場合があることにさらに注意されたい。したがって、本記述は、特許請求の範囲の要素の記述と関連した「だけ」、「のみ」などの排他的用語の使用、または「負」の限定の使用の先行詞として役割を果たすことを意図する。
本明細書中に記述する出版物は、本出願の出願日より前のその開示についてのみ提示する。本明細書中のいかなる記載も、本発明が、先行発明の利点により、そのような出版物に先行する権利を有さないという承認として解釈されるべきでない。さらに、提供する出版日は、実際の出版日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があり得る。
詳細な説明
本発明は、ＬＩＮＥポリペプチド（たとえば、単離ＬＩＮＥポリペプチド；合成ＬＩＮＥポリペプチド）、および対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む免疫原性組成物を含めた組成物を提供する。本発明は、対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。免疫原性組成物は、ＬＩＮＥポリペプチド、たとえばウイルスに感染した細胞上のものに対するＴ細胞免疫応答を刺激するために有用である。たとえば、対象免疫原性組成物は、ＨＴＬＶまたはＨＩＶに感染した細胞上のＬＩＮＥポリペプチド（またはその断片）を認識することができるＴ細胞免疫応答を刺激するために有用である。以下により詳細に記述するように、ＨＴＬＶまたはＨＩＶに感染した細胞上のＬＩＮＥポリペプチドまたはその断片に対するＴ細胞免疫応答を刺激することにより、ウイルス感染症（たとえば、ＨＴＬＶ感染症、ＨＩＶ感染症）の治療を提供することができる。本発明は、さらに、個体において、レトロウイルスまたはレンチウイルスに感染した細胞に対する免疫応答を刺激する方法を提供する。本発明は、さらに、癌細胞によってＬＩＮＥポリペプチドが異常に発現されている癌を治療する方法を提供する。たとえば、対象免疫原性組成物は、癌性または前癌細胞上のＬＩＮＥポリペプチド（またはその断片）を認識できるＴ細胞免疫応答を刺激するために有用である。また、ＬＩＮＥポリペプチドに対する免疫応答を減少させることを含む、障害を治療する方法も提供する。
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物は、レトロウイルスに感染した細胞、たとえばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した細胞に特異的なＴ細胞免疫応答を誘導する。対象ＬＩＮＥポリペプチドによって提示されたエピトープは、エピトープに対するＴ細胞免疫応答を刺激または増強する。ＬＩＮＥエピトープもレトロウイルスに感染した細胞の表面上に存在する場合は、レトロウイルスに感染した細胞に対するＴ細胞応答も起こる。「Ｔ細胞免疫応答」には、以下のうちの１つまたは複数が含まれる：１）ＬＩＮＥエピトープに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の数および／または活性の増加；２）ＬＩＮＥエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数および／または活性（たとえば細胞毒性）の増加；ならびに３）Ｔｈ１型免疫応答を誘導するまたはその指標であるサイトカインの分泌。Ｔｈ１免疫応答を誘導するまたはその指標であるサイトカインには、それだけには限定されないが、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）およびＩＬ−２が含まれる。対象免疫原性組成物で刺激されるＴ細胞免疫応答には、粘膜Ｔ細胞免疫応答および全身性Ｔ細胞免疫応答が含まれる。
対象免疫原性組成物は、静脈内投与、皮下投与、または他の非経口投与経路に適した製剤物；粘膜組織への投与に適した製剤物などを含めた、様々な方法のうちの任意のもので製剤することができる。本発明は、対象免疫原性組成物を含む医薬製剤を提供する。
本発明は、さらに、レトロウイルス感染症（たとえばＨＴＬＶ感染症）の治療に対する患者の応答の監視に使用するために適したＬＩＮＥポリペプチド組成物を提供する。したがって、本発明は、さらに、レトロウイルス感染症（たとえばＨＴＬＶ感染症）の治療に対する患者の応答の監視する方法を提供する。
本発明は、さらに、レンチウイルス感染症（たとえばＨＩＶ感染症）の治療に対する患者の応答の監視に使用するために適したＬＩＮＥポリペプチド組成物を提供する。したがって、本発明は、さらに、レンチウイルス感染症（たとえばＨＩＶ感染症）の治療に対する患者の応答の監視する方法を提供する。
単離ＬＩＮＥポリペプチド
本発明は、ＬＩＮＥポリペプチド、および対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む組成物を提供する。対象ＬＩＮＥポリペプチドは、たとえば、免疫原性組成物を作製すること（たとえば、個体においてＬＩＮＥポリペプチドに対する免疫応答を増強するため、または個体においてＨＩＶエピトープもしくはポリペプチドに対する免疫応答を増強するため）；免疫調節組成物を作製すること（たとえば、個体においてＬＩＮＥポリペプチドに対する免疫応答を減少させるため；治療、たとえばレトロウイルス感染症の治療に対する患者の応答を監視すること；疾患の段階を決定すること；疾患を検出すること；および養子移植方法のためにＣＤ８＋Ｔ細胞を作製するにおいて、使用が見つかる。一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチドは単離されている。一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは合成である（たとえば化学合成）。したがって、本発明は、合成ＬＩＮＥポリペプチドを提供する。以下の記述では、用語「対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド」、または単に「対象ＬＩＮＥポリペプチド」を使用する。しかし、以下の記述は「対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド」にも均等に適用されることを理解されたい。
ＬＩＮＥポリペプチド
ＬＩＮＥポリペプチドには、任意のＬＩＮＥのクレード、ファミリー、サブファミリー、クラスまたはグループによってコードされるポリペプチド、たとえば、ＣＲＥ、Ｒ２、Ｒ４、Ｌ１、Ｌ２、ＲＴＥ、Ｔａｄ１、Ｒ１、ＬＯＡ、Ｊｏｃｋｅｙ、ＣＲ１、およびＩ、ならびにその任意のサブグループが含まれる。ＬＩＮＥのクレード、ファミリー、サブファミリー、クラス、グループ、およびサブグループは、当分野で知られている。たとえば、Ｍａｌｉｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、１６（６）：７９３．（１９９９）；Ｌｏｖｓｉｎ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、１８：２２１３〜２２２４を参照されたい。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド（または対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド）は、ＬＩＮＥでコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３〜１５、１５〜１７、１７〜２０、２０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、もしくは３５０〜４００個、またはそれより多くの連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。ＬＩＮＥでコードされるポリペプチドには、ＬＩＮＥのＯＲＦ１ｐ（ｐ４０）およびＯＲＦ２ｐ（ｐ１５０）によってコードされるポリペプチドが含まれる。
他の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、ＬＩＮＥでコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３〜１５、１５〜１７、１７〜２０、２０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、もしくは３５０〜４００個、またはそれより多くの連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含むが、ただし、ＬＩＮＥでコードされるポリペプチドは、ＬＩＮＥ−１のＯＲＦ１ｐ（ｐ４０）またはＯＲＦ２ｐ（ｐ１５０）のどちらかによってコードされるポリペプチドよりも短いアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、ＨＩＶにコードされるタンパク質、ポリペプチド、またはエピトープ中の同じ長さのアミノ酸ストレッチと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３〜１５、１５〜１７、１７〜２０、もしくは２０〜２５個、またはそれより多くの連続的なアミノ酸のストレッチを含む。
他の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、ＨＩＶにコードされるタンパク質、ポリペプチド、またはエピトープ中の同じ長さのアミノ酸ストレッチと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３〜１５、１５〜１７、１７〜２０、もしくは２０〜２５個、またはそれより多くの連続的なアミノ酸のストレッチからなる、またはそのストレッチから本質的になる。
さらなる実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、同定および単離したＬＩＮＥポリペプチドであり、ＬＩＮＥポリペプチドは、レトロウイルスタンパク質データベース、たとえばＨＩＶタンパク質データベースを、短いほぼ完全一致について、ＬＩＮＥポリペプチド配列を用いて検索することによって同定する。そのような検索は、たとえば、ＨＩＶタンパク質に対するＬＩＮＥアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９７）を利用して、アルゴリズムの短いほぼ完全一致（ｅ値＝２０００００、ＰＡＭ３０マトリックス、ＳＥＧフィルターＯＦＦ、ワードサイズ＝２）パラメータを使用することによって実施し得る。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの短いほぼ完全一致のパラメータは、通常はタンパク質の多様性によって圧倒されているペプチド配列間の短い一致の検出を容易にする。これらの類似または同一の領域は系統学的分析において有意性を有さない場合があるが、これらは、Ｔ細胞認識の潜在的な交差反応性のタンパク質および／または領域の高度に保存された機能的ドメインを表すことができる。
また、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、エピトープ予測ソフトウェアを用いて、ＬＩＮＥ−１のＯＲＦ１およびＯＲＦ２から予測したタンパク質配列を分析することによって同定することができる。たとえば、ＬＩＮＥ−１のエピトープペプチドは、ＬＩＮＥ−１のＯＲＦ１およびＯＲＦ２からＮＥＴＣＴＬ（商標）エピトープ予測プログラムを用いて予測したタンパク質配列を分析することによって、同定することができる。ＮＥＴＣＴＬ（商標）は、タンパク質全体を分析して、プロテオソーム切断部位、生じる分解産物の抗原プロセシング（ＴＡＰ）機構と関連するトランスポーターと結合する最良の潜在性を有するサブセット、およびこれら分解産物のうち、様々なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子に対して最良の結合親和性を有するペプチドを同定する（Ｌａｒｓｅｎ他、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．３５（８）：２２９５〜３０３．２００５）。
対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸６個の長さから天然に存在するＬＩＮＥポリペプチドの長さであることができ、たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドは、６個のアミノ酸（ａａ）、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２〜１５ａａ、１５〜２０ａａ、２０〜２５ａａ、２５〜３０ａａ、３０〜４０ａａ、４０〜５０ａａ、５０〜１００ａａ、または１００個より長いアミノ酸、たとえば、１００ａａ〜１５０ａａ、１５０ａａ〜２００ａａであることができる。一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、約６ａａ〜約１５０ａａ、約６ａａ〜約１０ａａ、約１０ａａ〜約１５ａａ、約１５ａａ〜約２０ａａ、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、約３０ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約７５ａａ、約７５ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、または約１２５ａａ〜約１５０ａａの長さを有する。
ＬＩＮＥでコードされるポリペプチドの例示的な非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ５１２６１（配列番号２３）、ＡＡＣ５１２６２（配列番号２４）、ＡＡＣ５１２６３（配列番号２５）、ＡＡＣ５１２６４（配列番号２６）、ＡＡＣ５１２６５（配列番号２７）、ＡＡＣ５１２６６（配列番号２８）、ＡＡＣ５１２６７（配列番号２９）、ＡＡＣ５１２６８（配列番号３０）、ＡＡＣ５１２６９（配列番号３１）、ＡＡＣ５１２７０（配列番号３２）、ＡＡＣ５１２７１（配列番号３３）、ＡＡＣ５１２７２（配列番号３４）、ＡＡＣ５１２７３（配列番号３５）、ＡＡＣ５１２７４（配列番号３６）、ＡＡＣ５１２７５（配列番号３７）、ＡＡＣ５１２７６（配列番号３８）、ＡＡＣ５１２７７（配列番号３９）、ＡＡＣ５１２７８（配列番号４０）、ＡＡＣ５１２７９（配列番号４１）号などに見つかる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１：
ＭＮＥＭＫＲＥＧＫＦＲＥ（配列番号１）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、９、１０、１１、または１２個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号２：
ＳＱＬＫＥＬＥＫＱＥ（配列番号２）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、９または１０個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号３：
ＭＬＲＡＡＲＥＫＧＷＶＴ（配列番号３）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、９、１０、１１または１２個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＭＬＲＡＡＲＥＫＧＲＶＴ；またはアミノ酸配列ＭＬＲＡＡＲＥＥＧＲＶＴを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号４：
ＫＩＤＲＬＬＡＲＬＩ（配列番号４）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、９または１０個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＩＤＲＰＬＡＲＬＩ；またはアミノ酸配列ＫＩＤＲＰＬＳＲＬＩを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号５：
ＬＲＡＡＲＥＫＧＣ（配列番号５）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号６：
ＮＧＫＱＫＫＡＧＦＡＩＬＶ（配列番号６）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＮＧＫＱＫＫＡＧＶＡＩＬＶを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号７：
ＤＥＬＲＥＥＧＶＲ（配列番号７）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号８：
ＴＭＲＹＨＬＴＰＶ（配列番号８）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号９：
ＲＰＮＬＲＬＩＧＶ（配列番号９）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＲＰＮＬＨＬＩＧＶを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１０：
ＫＶＩＹＲＦＮＡＩ（配列番号１０）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＶＩＹＲＦＳＡＩ；またはＫＶＴＹＲＦＮＴＩを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１１：
ＩＶＹＬＥＮＰＩＶ（配列番号１１）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＩＶＹＬＥＮＰＭＶ；またはアミノ酸配列ＩＶＣＬＫＮＰＩＶを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１２：
ＳＬＱＥＩＷＤＹＶ（配列番号１２）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１３：
ＮＬＥＥＣＩＴＲＩ（配列番号１３）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１４：
ＴＰＲＨＩＩＶＲＦ（配列番号１４）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＴＰＲＨＶＩＶＲＦ；またはアミノ酸配列ＴＰＲＨＩＬＶＲＦ；またはアミノ酸配列ＴＰＲＨＩＬＶＫＦを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１５：
ＬＬＦＮＩＶＬＥＶ（配列番号１５）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１６：
ＹＴＭＥＹＹＡＡＩ（配列番号１６）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１７：
ＲＡＲＩＡＫＳＩＬ（配列番号１７）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＲＡＲＭＡＫＳＩＬ；またはアミノ酸配列ＲＡＣＩＡＫＳＩＬ；またはアミノ酸配列ＲＡＨＩＡＫＳＴＬを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１８：
ＡＰＲＦＩＫＱＶＬ（配列番号１８）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１９：
ＩＳＹＰＡＫＬＳＦ（配列番号１９）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＩＳＦＰＡＫＬＳＦ；またはアミノ酸配列ＩＳＹＰＡＴＬＧＦを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号２０：
ＳＳＰＡＴＥＱＳＷ（配列番号２０）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＳＳＰＡＴＤＱＳＷ；またはアミノ酸配列ＳＳＬＡＴＥＱＳＷを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号２１：
ＫＡＴＶＴＫＴＡＷ（配列番号２１）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＴＶＴＫＴＶＷ；またはアミノ酸配列ＫＡＴＶＴＫＴＡＣを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号２２：
ＲＶＮＲＱＰＴＴＷ（配列番号２２）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の、約６、７、８、または９個の連続的なアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸配列ＲＡＮＲＱＰＴＴＷ；またはアミノ酸配列ＲＶＮＲＱＰＴＥＷ；またはアミノ酸配列ＲＶＮＲＱＡＴＥＷを含むことができる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含む：
ＭＮＥＭＫＲＥＧＫＦＲＥ（配列番号１）；
ＳＱＬＫＥＬＥＫＱＥ（配列番号２）；
ＭＬＲＡＡＲＥＫＧＷＶＴ（配列番号３）；
ＫＩＤＲＬＬＡＲＬＩ（配列番号４）；
ＬＲＡＡＲＥＫＧＣ（配列番号５）；
ＮＧＫＱＫＫＡＧＦＡＩＬＶ（配列番号６）；
ＤＥＬＲＥＥＧＶＲ（配列番号７）；
ＴＭＲＹＨＬＴＰＶ（配列番号８）；
ＲＰＮＬＲＬＩＧＶ（配列番号９）；
ＫＶＩＹＲＦＮＡＩ（配列番号１０）；
ＩＶＹＬＥＮＰＩＶ（配列番号１１）；
ＳＬＱＥＩＷＤＹＶ（配列番号１２）；
ＮＬＥＥＣＩＴＲＩ（配列番号１３）；
ＴＰＲＨＩＩＶＲＦ（配列番号１４）；
ＬＬＦＮＩＶＬＥＶ（配列番号１５）；
ＹＴＭＥＹＹＡＡＩ（配列番号１６）；
ＲＡＲＩＡＫＳＩＬ（配列番号１７）；
ＡＰＲＦＩＫＱＶＬ（配列番号１８）；
ＩＳＹＰＡＫＬＳＦ（配列番号１９）；
ＳＳＰＡＴＥＱＳＷ（配列番号２０）；
ＫＡＴＶＴＫＴＡＷ（配列番号２１）；
ＲＶＮＲＱＰＴＴＷ（配列番号２２）；
ＭＬＲＡＡＲＥＫＧＲＶＴ（配列番号７７）；
ＭＬＲＡＡＲＥＥＧＲＶＴ（配列番号７８）；
ＫＩＤＲＰＬＡＲＬＩ（配列番号７９）；
ＫＩＤＲＰＬＳＲＬＩ（配列番号８０）；
ＮＧＫＱＫＫＡＧＶＡＩＬＶ（配列番号８１）；
ＲＰＮＬＨＬＩＧＶ（配列番号８２）；
ＫＶＩＹＲＦＳＡＩ（配列番号８３）；
ＫＶＴＹＲＦＮＴＩ（配列番号８４）；
ＩＶＹＬＥＮＰＭＶ（配列番号８５）；
ＩＶＣＬＫＮＰＩＶ（配列番号８６）；
ＴＰＲＨＶＩＶＲＦ（配列番号８７）；
ＴＰＲＨＩＬＶＲＦ（配列番号８８）；
ＴＰＲＨＩＬＶＫＦ（配列番号８９）；
ＲＡＲＭＡＫＳＩＬ（配列番号９０）；
ＲＡＣＩＡＫＳＩＬ（配列番号９１）；
ＲＡＨＩＡＫＳＴＬ（配列番号９２）；
ＩＳＦＰＡＫＬＳＦ（配列番号９３）；
ＩＳＹＰＡＴＬＧＦ（配列番号９４）；
ＳＳＰＡＴＤＱＳＷ（配列番号９５）；
ＳＳＬＡＴＥＱＳＷ（配列番号９６）；
ＫＡＴＶＴＫＴＶＷ（配列番号９７）；
ＫＡＴＶＴＫＴＡＣ（配列番号９８）；
ＲＡＮＲＱＰＴＴＷ（配列番号９９）；
ＲＶＮＲＱＰＴＥＷ（配列番号１００）；および
ＲＶＮＲＱＡＴＥＷ（配列番号１０１）
上述の実施形態のうちの任意のものにおいて、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸６個の長さから天然に存在するＬＩＮＥポリペプチドの長さであることができ、たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドは、６個のアミノ酸（ａａ）、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２〜１５ａａ、１５〜２０ａａ、２０〜２５ａａ、２５〜３０ａａ、３０〜４０ａａ、４０〜５０ａａ、５０〜１００ａａ、または１００個より長いアミノ酸、たとえば、１００ａａ〜１５０ａａ、１５０ａａ〜２００ａａであることができる。上述の実施形態のうちの任意のものにおいて、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、約６ａａ〜約１５０ａａ、たとえば、約６ａａ〜約１０ａａ、約１０ａａ〜約１５ａａ、約１５ａａ〜約２０ａａ、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、約３０ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約７５ａａ、約７５ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、または約１２５ａａ〜約１５０ａａの長さを有する。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、図２０、および図２１Ａ〜Ｃに示す１５量体のアミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、ＬＩＮＥポリペプチドは融合タンパク質であり、たとえば、ＬＩＮＥ融合タンパク質は、異種タンパク質と共有結合したＬＩＮＥポリペプチドを含み、異種タンパク質は「融合パートナー」とも呼ばれる。一部の実施形態では、融合パートナーはＬＩＮＥタンパク質のＮ末端に付着しており、たとえば、ＮＨ２−融合パートナー−ＬＩＮＥ−ＣＯＯＨである。他の実施形態では、融合パートナーはＬＩＮＥタンパク質のＣ末端に付着しており、たとえば、ＮＨ２−ＬＩＮＥ−融合パートナー−ＣＯＯＨである。他の実施形態では、融合パートナーはＬＩＮＥタンパク質の内部にあり、たとえば、ＮＨ２−（ＬＩＮＥ１−ＦＰ−（ＬＩＮＥ２−ＣＯＯＨ）２であり、ＦＰは融合パートナーであり、ＬＩＮＥ１およびＬＩＮＥ２はそれぞれＬＩＮＥのＮ末端およびＣ末端領域である。
適切な融合パートナーには、それだけには限定されないが、赤血球凝集素、ＦＬＡＧ、ｍｙｃなどを含めた、エピトープタグなどの免疫学的タグ；それだけには限定されないが、蛍光タンパク質、酵素（たとえば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）等を含めた、検出可能なシグナルをもたらすタンパク質；融合タンパク質の精製または単離を容易にするポリペプチド、たとえば、６Ｈｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの金属イオン結合ポリペプチド；細胞内局在化をもたらすポリペプチド；および細胞からの分泌をもたらすポリペプチドが含まれる。検出可能なシグナルをもたらす融合パートナーは、「レポーター」とも呼ばれる。一部の実施形態では、融合パートナーは、ＬＩＮＥポリペプチド以外の免疫調節性ポリペプチド、たとえば、抗原、サイトカインなどである。
多量体ＬＩＮＥポリペプチド
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは多量体化しており、たとえば、２つ以上のＬＩＮＥポリペプチドがタンデムで連結されている。多量体には、二量体、三量体、四量体、五量体などが含まれる。単量体ＬＩＮＥポリペプチド、直接またはリンカーを介して互いに連結している。したがって、一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、式（Ｘ１−（Ｙ）０〜４０−Ｘ２−（Ｙ）０〜４０）ｎを有し、Ｘ１およびＸ２はＬＩＮＥポリペプチドであり、Ｙはリンカーであり、ｎは１〜約１０の整数である（たとえば、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）。リンカーを使用する場合、Ｙは、１つもしくは複数のアミノ酸、または他の連結基である。Ｘ１およびＸ２は同一または異なることができ、たとえば、同じアミノ酸配列を有するか、またはアミノ酸配列が互いに異なることができる。したがって、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、たとえばＬＩＮＥポリペプチドが二量体である場合に式Ｘ１−（Ｙ）０〜４０−Ｘ２を有することができる。１つの非限定的な例として、対象ＬＩＮＥポリペプチドが式（Ｘ１−（Ｙ）０〜４０−Ｘ２−（Ｙ）０〜４０）ｎを有する場合、Ｘ１はＭＮＥＭＫＲＥＧＫＦＲＥ（配列番号１）であることができ、Ｘ２はＳＱＬＫＥＬＥＫＱＥ（配列番号２）であることができる。別の非限定的な例として、対象ＬＩＮＥポリペプチドが式（Ｘ１−（Ｙ）０〜４０−Ｘ２−（Ｙ）０〜４０）ｎを有する場合、Ｘ１およびＸ２はどちらもＭＮＥＭＫＲＥＧＫＦＲＥ（配列番号１）であることができる。
別の例として、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、たとえばＬＩＮＥポリペプチドが三量体である場合に式Ｘ１−（Ｙ）０〜４０−Ｘ２−（Ｙ）０〜４０−Ｘ３を有することができる。１つの非限定的な例として、対象ＬＩＮＥポリペプチドが式Ｘ１−（Ｙ）０〜４０−Ｘ２−（Ｙ）０〜４０−Ｘ３を有する場合、Ｘ１はＭＮＥＭＫＲＥＧＫＦＲＥ（配列番号１）であることができ、Ｘ２はＳＱＬＫＥＬＥＫＱＥ（配列番号２）であることができ、Ｘ３はＭＬＲＡＡＲＥＫＧＷＶＴ（配列番号３）であることができる。１つの非限定的な例として、対象ＬＩＮＥポリペプチドが式Ｘ１−（Ｙ）０〜４０−Ｘ２−（Ｙ）０〜４０−Ｘ３を有する場合、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３はすべてＭＮＥＭＫＲＥＧＫＦＲＥ（配列番号１）であることができる。
Ｙがスペーサーペプチドである場合、これは一般に柔軟な性質のものであるが、他の化学結合が排除されるわけではない。現在、最も有用なリンカー配列は、一般に、アミノ酸約２〜約４０個の長さ、たとえば、アミノ酸約２個〜約１０個、アミノ酸約１０個〜約２０個、またはアミノ酸約６個〜約２５個の長さのペプチドであることが企図される。これらのリンカーは、一般に、合成の、オリゴヌクレオチドをコードするリンカーを用いて生成して、タンパク質をカップリングする。一般に、一定の度合いの柔軟性を有するペプチドリンカーを使用する。連結ペプチドは事実上任意のアミノ酸配列を有していてよく、ただし、好ましいリンカーは一般に柔軟なペプチドをもたらす配列を念頭に置かれたい。グリシンおよびアラニンなどの小さいアミノ酸の使用が、柔軟なペプチドの作製に有用である。例示的なペプチドリンカーには、（Ｇｌｙ）２〜４０（配列番号７４）、（Ｓｅｒ）２〜４０（配列番号７５）、および（Ａｌａ）２〜４０（配列番号７６）が含まれる。そのような配列の作製は、当業者によって日常的であろう。多くの異なるリンカーが市販されており、開示した実施形態に従った使用に適しているとみなされる。しかし、任意の柔軟なリンカーは、一般に、アミノ酸約２個〜約４０個であり、たとえば、アミノ酸約６個〜約１０個の長さを使用し得る。リンカーは、一般に柔軟なペプチドをもたらす事実上任意の配列を有し得る。
ホモもしくはヘテロポリマーのための連結または担体とのカップリングのための連結は、様々な方法で提供することができる。たとえば、システイン残基をアミノおよびカルボキシル末端の両方に付加することができ、ここではペプチドはシステイン残基の制御された酸化を介して共有結合されている。また、一方の官能基末端にジスルフィド結合を生じ、他方にペプチド結合を生じる、Ｎ−スクシジミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（ＳＰＤＰ）を含めた、数々のヘテロ二官能性剤も有用である。この試薬は、自身と一方のタンパク質中のシステイン残基との間のジスルフィド結合、および他方中のリシンまたは他の遊離アミノ基上のアミノを介したアミド結合を生じる。様々なそのようなジスルフィド／アミド形成剤が知られている。たとえば、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．、６２：１８５（１９８２）を参照されたい。他の二官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合の代わりにチオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くは市販されており、６−マレイミドカプロン酸、２ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルが含まれる。カルボキシル基は、それらをスクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸、ナトリウム塩と組み合わせることによって活性化することができる。例示的なカップリング剤は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）である。もちろん、連結は、どちらの連結された基も、その意図された使用のため、たとえば免疫原としての機能を実質的に妨害すべきでないことが、理解されよう。
担体
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは担体と連結している。本明細書中で用語「カップリングした」と互換性があるように使用する用語「連結した」とは、近位で会合していることをいい、たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドおよび担体は近い空間的近位にある。一部の実施形態では、連結は共有結合。他の実施形態では、連結は非共有結合。一部の実施形態では、ＬＩＮＥポリペプチドは担体と直接連結している。他の実施形態では、ＬＩＮＥポリペプチドは、間接的に、たとえばリンカー分子を介して連結している。
適切な担体の例には、大きな、ゆっくりと代謝される巨大分子、たとえば、タンパク質；セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどの多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリシンなどの高分子アミノ酸；アミノ酸コポリマー；不活性化ウイルス粒子；ジフテリア、破傷風、コレラ、ロイコトキシン分子からのトキソイドなどの不活性化細菌毒素；リポソーム；不活性化細菌；樹状細胞等が含まれる。担体を以下にさらに詳述する。
適切な担体は当分野で周知であり、たとえば、サイログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ポリ（Ｄ−リシン：Ｄ−グルタミン酸）などのポリアミノ酸；ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド；インフルエンザウイルス赤血球凝集素、インフルエンザウイルス核タンパク質；Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原；結核菌からのツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）；不活性化緑膿菌外毒素Ａ（毒素Ａ）；キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）；百日咳菌の繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）；破傷風トキソイド（ＴＴ）のＴヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープおよびバチルスカルメット−ゲラン（ＢＣＧ）細胞壁；ライ菌もしくは結核菌からの組換え１０ｋＤａ、１９ｋＤａおよび３０〜３２ｋＤａタンパク質、またはこれらのタンパク質の任意の組合せ等が含まれる。担体、およびペプチドを担体とコンジュゲートさせる方法の記述には、たとえば、米国特許第６，４４７，７７８号を参照されたい。
緑膿菌外毒素Ａ（毒素Ａ）は、ワクチンのコンジュゲートにおいて担体として有効に使用されている。緑膿菌外毒素Ａは、発酵器で成長させた緑膿菌ＰＡ１０３の培養物の上清から精製し得る。毒素Ａは、動物における結果に基づいてスーパー抗原として分類されている。毒素Ａは、４個の炭素のスペーサー分子であるアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）との共有カップリングによって、完全かつ不可逆的に解毒することができる。このステップにより、毒素分子のＡＤＰＲ−トランスフェラーゼ活性が破壊され、したがって無毒性となる。未反応のヒドラジド基は、ポリペプチドを毒素Ａと共有カップリングするために使用することができる。また、毒素Ａは、カルボジイミド試薬を用いてポリペプチドとカップリングさせ得る。
ＰＰＤ−ペプチドコンジュゲートは、グルタルアルデヒドをカップリング剤として用いて好都合に調製される。たとえば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ他（１９９５）ＡＩＤＳ、９：２４３〜５１を参照されたい。
対象ポリペプチドを担体とコンジュゲートさせる方法には、Ｃ末端ペプチドシステイン結合を介したジスルフィド結合、グルタルアルデヒド溶液と２時間カップリングさせること、チロシンとのカップリング、または水溶性カルボジイミドとのカップリングが含まれる。
一部の実施形態では、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは脂質化されている。脂質化により、脂質と連結しているペプチドに対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の応答が増加する。パルミチン酸などの脂質残基はペプチドのアミノ末端に付着している。脂質は、ペプチドに直接、または、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ結合などの連結を介して間接的に、付着していることができる。別の例として、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌リポタンパク質を用いて、ペプチドと共有結合している場合は特異的ＣＴＬを刺激することができる。Ｄｅｒｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：５６１〜５６４（１９８９）を参照されたい。ＬＩＮＥポリペプチドは、酢酸からステアリン酸にわたる様々な鎖長および不飽和化度合いの無電荷の脂肪酸残基と、および適切なカルボン酸無水物を介して負荷電スクシニル残基とコンジュゲートさせることができる。たとえば、米国特許第６，４１９，９３１号を参照されたい。
対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドは、直接または間接的に、たとえばリンカー分子を介して、担体とコンジュゲートさせ得る。様々なリンカー分子が当分野で知られており、コンジュゲート中で使用することができる。ペプチドと担体との連結は、ペプチド反応性側鎖、またはペプチドのＮもしくはＣ末端を介したものであり得る。リンカーは有機、無機、または半有機分子であってよく、また、有機分子、無機分子のポリマー、または無機および有機分子の両方を含むコポリマーであってもよい。
存在する場合は、リンカー分子は、一般に、ＬＩＮＥポリペプチドおよび連結された担体が、ＬＩＮＥポリペプチドと担体との間にある程度の柔軟な動きを可能にするのに十分な長さである。リンカー分子は、一般に原子約６〜５０個の長さである。また、リンカー分子は、たとえば、アリールアセチレン、２〜１０個の単量体単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二価酸、アミノ酸、またはその組合せであってもよい。本開示に鑑みて、ポリペプチドと結合することができる他のリンカー分子を使用し得る。
組成物
本発明は、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドを含む組成物を提供する。対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドを含む組成物には、以下のうちの１つまたは複数が含まれることができる：塩、たとえば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、たとえば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；洗剤、たとえば、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗剤；プロテアーゼ阻害剤等。一部の実施形態では、以下にさらに詳述するように、対象ＬＩＮＥ組成物は免疫原性組成物である。他の実施形態では、以下にさらに詳述するように、対象ＬＩＮＥ組成物は、医薬組成物、たとえば、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチドと製薬上許容される賦形剤とを含む組成物である。
一部の実施形態では、対象組成物は、単一の種類（または「種」）の対象ＬＩＮＥポリペプチドを含み、たとえば、一部の実施形態では、対象組成物中のＬＩＮＥポリペプチドは、すべて実質的に同じアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、対象免疫原性組成物は２つ以上の異なるＬＩＮＥポリペプチドを含み、たとえば、組成物は対象ＬＩＮＥポリペプチドの集団を含み、その集団のメンバーはアミノ酸配列が異なることができる。対象組成物は２〜約２０種の異なるＬＩＮＥポリペプチドを含むことができ、たとえば、対象組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜１５、または１５〜２０種の異なるＬＩＮＥポリペプチドを含むことができ、そのそれぞれは、他のＬＩＮＥポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸を有する。たとえば、一部の実施形態では、対象組成物は、第１のアミノ酸配列を有する第１のＬＩＮＥポリペプチド；および第２のアミノ酸配列を有する少なくとも第２のＬＩＮＥポリペプチド（第２のアミノ酸配列は第１のアミノ酸配列とは異なる）を含む。別の例として、一部の実施形態では、対象組成物は、第１のアミノ酸配列を有する第１のＬＩＮＥポリペプチド；第２のアミノ酸配列を有する第２のＬＩＮＥポリペプチド（第２のアミノ酸配列は第１のアミノ酸配列とは異なる）；ならびに第３のアミノ酸配列を有する少なくとも第３のＬＩＮＥポリペプチド（第３のアミノ酸配列は第１および第２のアミノ酸配列のどちらとも異なる）を含む。他の実施形態では、対象組成物は上述の多量体ＬＩＮＥポリペプチドを含む。
ＬＩＮＥポリペプチドの産生
対象ＬＩＮＥポリペプチドは、たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドが「合成」ポリペプチドである化学合成によること；天然に存在する供給源からの単離および精製によること；およびＬＩＮＥポリペプチドが「組換え」ポリペプチドである組換え手段によることを含めた、いくつかの方法で産生することができる。対象ＬＩＮＥポリペプチドを産生するための組換え手段は当分野で周知であり、対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを用いて宿主細胞の遺伝子改変を行うこと、ＬＩＮＥポリペプチドが遺伝子改変した細胞によって産生されるような条件下で適切な時間の間、宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養すること、および遺伝子改変した細胞によって産生されたＬＩＮＥポリペプチドを単離することを含む。
医薬組成物
本発明は、対象ＬＩＮＥポリペプチドと製薬上許容される賦形剤とを含む、対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
様々な製薬上許容される賦形剤が当分野で知られており、本明細書中で詳述する必要はない。製薬上許容される賦形剤は、たとえば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）「レミントン：製薬の科学および実施（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；製薬財形および薬物送達系（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ他編、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；および製薬賦形剤の手引き（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ他編、第３版、Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．を含めた様々な出版物中に十分に記載されている。
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの製薬上許容される賦形剤は、容易に公的に入手可能である。さらに、ｐＨ調節剤および緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤、湿潤剤などの製薬上許容される補助物質は、容易に公的に入手可能である。
適切な賦形剤ビヒクルは、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組合せである。さらに、所望する場合は、ビヒクルは、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有し得る。
対象ＬＩＮＥポリペプチド医薬組成物は、対象ＬＩＮＥポリペプチドを、水性または非水性溶媒、たとえば、植物または他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸もしくはプロピレングリコールのエステル中に；所望する場合は、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および保存料などの慣用の添加剤と共に、溶解、懸濁または乳化させることによって、調製することができる。
対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む免疫原性組成物
本発明は、対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。対象免疫原性組成物中に含めるために適したＬＩＮＥポリペプチドおよび単離ＬＩＮＥポリペプチドは、上述のものである。
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物は、レトロウイルスに感染した細胞の表面上に提示された場合に、レトロウイルスに感染した細胞、たとえば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した細胞またはＨＴＬＶに感染した細胞に特異的なＴ細胞免疫応答を誘導する、１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含むＬＩＮＥポリペプチドを含む。「Ｔ細胞免疫応答」には、以下のうちの１つまたは複数が含まれる：１）ＬＩＮＥエピトープに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の数および／または活性の増加；２）ＬＩＮＥエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数および／または活性の増加；ならびに３）Ｔｈ１型免疫応答を誘導するまたはその指標であるサイトカインの分泌。Ｔｈ１免疫応答を誘導するまたはその指標であるサイトカインには、それだけには限定されないが、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）およびＩＬ−２が含まれる。
特定の実施形態では、対象免疫原性組成物の投与は、レトロウイルスに感染した細胞の表面上のＬＩＮＥポリペプチドまたはその断片の特異的Ｔ細胞認識による、レトロウイルスに感染した細胞たとえばＨＩＶ感染細胞の、Ｔ細胞に媒介される死滅をもたらす。他の実施形態では、対象免疫原性組成物の投与は、ＬＩＮＥポリペプチドまたはその断片に特異的なＴ細胞とレンチウイルスに感染した細胞の表面上に提示されるレトロウイルスエピトープとの交差反応性による、レトロウイルスに感染した細胞たとえばＨＩＶ感染細胞の、Ｔ細胞に媒介される死滅をもたらす。
対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む対象免疫原性組成物は、以下にさらに詳述するように、いくつかの方法で製剤することができる。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物は単一種のＬＩＮＥポリペプチドを含み、たとえば、免疫原性組成物は、実質的にすべて同じアミノ酸配列を有するＬＩＮＥポリペプチドの集団を含む。他の実施形態では、対象免疫原性組成物は２つ以上の異なるＬＩＮＥポリペプチドを含み、たとえば、免疫原性組成物は、ＬＩＮＥポリペプチドの集団を含み、その集団のメンバーはアミノ酸配列が異なることができる。対象免疫原性組成物は２〜約２０種の異なるＬＩＮＥポリペプチドを含むことができ、たとえば、対象免疫原性組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜１５、または１５〜２０種の異なるＬＩＮＥポリペプチドを含むことができ、そのそれぞれは、他のＬＩＮＥポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸を有する。たとえば、一部の実施形態では、対象免疫原性組成物は、第１のアミノ酸配列を有する第１のＬＩＮＥポリペプチド；および第２のアミノ酸配列を有する少なくとも第２のＬＩＮＥポリペプチド（第２のアミノ酸配列は第１のアミノ酸配列とは異なる）を含む。別の例として、一部の実施形態では、対象免疫原性組成物は、第１のアミノ酸配列を有する第１のＬＩＮＥポリペプチド；第２のアミノ酸配列を有する第２のＬＩＮＥポリペプチド（第２のアミノ酸配列は第１のアミノ酸配列とは異なる）；ならびに第３のアミノ酸配列を有する少なくとも第３のＬＩＮＥポリペプチド（第３のアミノ酸配列は第１および第２のアミノ酸配列のどちらとも異なる）を含む。他の実施形態では、対象免疫原性組成物は上述の多量体ＬＩＮＥポリペプチドを含む。
対象免疫原性組成物は、水溶液、たとえば生理食塩水などの製薬上許容される希釈剤、半固体形態（たとえばゲル）、または散剤形態で提供することができる。そのような希釈剤は不活性であることができる。
アジュバント
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリペプチド（単離または合成）とアジュバントとを含む。適切なアジュバントには、ヒトでの使用に適したものが含まれる。ヒトで使用することができる既知の適切なアジュバントの例には、必ずしもそれだけには限定されないが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖのスクワレン、０．５％ｗ／ｖのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖのトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５））、ＣｐＧ含有核酸（シトシンはメチル化されていない）、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａ、ＩＳＣＯＭからの抽出物（たとえば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ他（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．、６４：７１３参照）、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、Ｑｕｉｌ Ａ、インターロイキンなどが含まれる。それだけには限定されないが動物実験を含めた獣医学的用途では、フロイント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ぶ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ぶ）、ならびに２％のスクワレン／Ｔｗｅｅｎ８０の乳濁液中の、細菌から抽出した３つの構成要素、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有するＲＩＢＩを使用することができる。
組成物の有効性を増強するためのさらなる例示的なアジュバントには、それだけには限定されないが：（１）水中油乳濁液製剤物（ムラミルペプチド（以下参照）または細菌細胞壁構成要素などの他の特異的免疫刺激剤を含むまたは含まない）、たとえば、（ａ）微小流動化装を用いてサブミクロンの粒子へと製剤した５％のスクワレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、および０．５％のＳｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと共有結合したムラミルトリペプチド（ＭＴＰ−ＰＥ）を任意選択で含有）を含有する、ＭＦ５９（商標）（ＷＯ９０／１４８３７号；第１０章、ワクチン設計：サブユニットおよびアジュバント手法（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）、（ｂ）サブミクロンの乳濁液へと微小流動化した、または渦攪拌してより大きな粒子径の乳濁液を作製した、１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（ｃ）２％のスクワレン、０．２％のＴｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリ脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）などの１つまたは複数の細菌細胞壁構成要素、たとえば、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、（２）ＱＳ２１またはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、マサチューセッツ州Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）などのサポニンアジュバント、または追加の洗剤を欠くＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などのそれから作製した粒子を使用し得る、たとえばＷＯ００／０７６２１号；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン、たとえば、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６号）など）、インターフェロン（たとえばγインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、他のＴＮＦスーパーファミリー分子（たとえば、ＣＨ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌなど）等；（５）モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、たとえば、ＧＢ−２２２０２２１号、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４号、肺炎球菌の糖類と共に使用した場合は、任意選択でミョウバンが実質的に存在しない、たとえばＷＯ００／５６３５８号；（６）３ｄＭＰＬと、たとえばＱＳ２１および／または水中油乳濁液との組合せ、たとえば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８号、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８号、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１号；（７）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド［Ｋｒｉｅｇ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０００、１９、６１８〜６２２；Ｋｒｉｅｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２００１、３：１５〜２４；Ｒｏｍａｎ他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３、８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、８７０〜８７６；Ｃｈｕ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１９９７、１８６、１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、２７、２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６、１２１６〜１２２４、Ｋｒｉｅｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５６、４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎ他、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１６７、７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８８、７９、８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１、１４７、１７５９〜１７６４；Ｙｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、４９１８〜４９２５；Ｙｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、５３９４〜５４０２；Ｙｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、４７５５〜４７６１；およびＹｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、５８９８〜５９０６；国際特許出願ＷＯ９６／０２５５５号、ＷＯ９８／１６２４７号、ＷＯ９８／１８８１０号、ＷＯ９８／４０１００号、ＷＯ９８／５５４９５号、ＷＯ９８／３７９１９号およびＷＯ９８／５２５８１号］、すなわち、シトシンがメチル化されていない少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含有する；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、たとえばＷＯ９９／５２５４９号；（９）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７号）またはオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２号）；（１０）サポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド（たとえばＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ００／６２８００号）；（１１）免疫賦活剤および金属塩粒子、たとえばＷＯ００／２３１０５号；（１２）サポニンおよび水中油乳濁液、たとえばＷＯ９９／１１２４１号；（１３）サポニン（たとえばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（任意選択で＋ステロール）、たとえばＷＯ９８／５７６５９号；（１４）免疫刺激剤として作用して組成物の有効性を増強する他の物質が含まれる。ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などが含まれる。
対象免疫原性組成物には、慣用の製薬上許容される賦形剤、たとえば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、カルボネートなどが含まれることができる。対象免疫原性組成物には、ｐＨ調節剤および緩衝剤、毒性調節剤などの、生理的条件に近似させるために必要な１つまたは複数の製薬上許容される補助物質、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどが含まれることができる。これらの製剤物中の抗原（たとえば対象ＬＩＮＥポリペプチド）の濃度は広く変動する場合があり、流体体積、粘度、体重などの様々な要素に基づいて、選択した特定の投与様式および患者の要求に従って選択することができる。生じる組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エアロゾルなどの形態であり得る。
医薬製剤中の対象免疫原性組成物のタンパク質濃度は広く変動する場合があり、たとえば、約０．１重量％未満、約０．１重量％〜約２重量％、約２重量％〜２０重量％、もしくは約２０重量％〜約５０重量％、またはそれより多く、流体体積、粘度などの様々な要素に基づいて、選択した特定の投与様式に従って選択される。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、１つまたは複数の脂質を用いて製剤する。たとえば、様々な大きさのリポソームを作製することができる。形成された小リポソームまたは小胞は単層であり、約２０〜４００ナノメートルの範囲の大きさであり、多層小胞を超音波に供することによって、定義された大きさの孔を有する膜を通して圧力下で押し出すことによって、または高圧ホモジネーションによって生成することができる。直径が約０．１〜１μｍの範囲の大きさのより大きな単層リポソームは、脂質を有機溶媒または洗剤に溶かし、溶かした薬剤をそれぞれ蒸発または透析によって除去した場合に得ることができる。特定の脂質または厳密な脱水−水和条件を必要とする方法による、より小さな単層リポソームの融合により、細胞と同等またはそれよりも大きい単層胞を得ることができる。
リポソームは、１つまたは複数のカチオン性脂質、たとえば、ＤＤＡＢ、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド；Ｎ−［１−（２，３−ジオロイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート；１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（それだけには限定されないが、ジオレオイル（ＤＯＴＡＰ）、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジセアロイルを含む）；１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（それだけには限定されないが、ジオレオイル、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジセアロイルを含む）ＤＯＴＭＡ、Ｎ−［１−［２，３−ビス（オレオイルオキシ）］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド；ＤＯＧＳ、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン；ＤＣ−コレステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール；ＤＯＳＰＡ、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−（２（スペルミンカルボキサミド）−エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（それだけには限定されないが、ジオレオイル（ＤＯＥＰＣ）、ジラウロイル、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、パルミトイル−オレオイルを含む）；β−アラニルコレステロール；ＣＴＡＢ、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド；ジＣ１４−アミジン、Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシルアミノプロピオンアミジン；１４Ｄｅａ２、Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノールイル−Ｎ−（トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロライド；ＤＯＳＰＥＲ、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシルエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムヨウ化物；１−［２−アシルオキシ）エチル］２−アルキル（アルケニル）−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド誘導体、たとえば、１−［２−（９（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）エチル］−２−（８（Ｚ）−ヘプタデセニル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（ＤＯＴＩＭ）、１−［２−（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］−２−ペンタデシル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（ＤＰＴＩＭ）；１−［２−テトラデカノイルオキシ）エチル］−２−トリデシル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリウムクロライド（ＤＭＴＩＭ）−Ｓｏｌｏｄｉｎ他（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４３：１３５３７〜１３５４４に記載；第四級アミン上のヒドロキシアルキル部分を含有する２，３−ジアルキルオキシプロピル第四級アンモニウム化合物誘導体、たとえば、１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシプロピルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ−ＨＰ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシブチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ−ＨＢ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシペンチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ−ＨＰｅ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシルエチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジパルミチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＰＲＩＥ）；１，２−ジステリルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＳＲＩＥ）−たとえば、Ｆｅｌｇｎｅｒ他（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２５５０〜２５６１に記載を含むことができる。上述の脂質の多くは、たとえば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｎｏｒｔｈｅｒｍ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；およびＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている。
リポソームは、カチオン性脂質を、単独で、または他の脂質、特に、コレステロール；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（それだけには限定されないが、ジオレオイル（ＤＯＰＥ）、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；天然卵黄ホスファチジルコリン（ＰＣ）など；合成モノおよびジアシルホスホコリン（たとえばモノアシルホスファチジルコリン（ＭＯＰＣ）を含む）ならびにホスホエタノールアミンなどの中性脂肪との混合物で含み得る。上記ジアシル誘導体の合成および天然の不斉脂肪酸ならびに混合製剤物も含まれ得る。
他の適切なリポソーム組成物には、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびコレステロールが含まれる。そのようなリポソームは、たとえば米国特許第５，９１６，５８８号に記載されている。さらなる適切なリポソーム組成物、およびその調製方法は当分野で知られており、たとえば、米国特許第４，２４１，０４６号および第６，３５５，２６７号を含めた様々な出版物に記載されている。
ＬＩＮＥポリヌクレオチド
本発明は、対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え（たとえば合成）核酸を提供する。対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え（たとえば合成）核酸は、本明細書中で「対象ＬＩＮＥ核酸」または「対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド」と呼ぶ。本発明は、さらに、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む、医薬組成物および免疫原性組成物を含めた組成物を提供する。
特定の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドは、対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１〜２２のうちの任意の１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥ核酸は、単一の種類（または「種」）のＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、たとえば、一部の実施形態では、ＬＩＮＥ核酸は、すべて実質的に同じアミノ酸配列のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、対象ＬＩＮＥ核酸組成物は２つ以上の異なるＬＩＮＥ核酸を含み、たとえば、組成物はＬＩＮＥポリペプチドの集団をコードするＬＩＮＥ核酸の集団を含み、その集団のメンバーはアミノ酸配列が異なることができる。コードされるＬＩＮＥポリペプチドの集団は、２〜約２０種の異なるＬＩＮＥポリペプチドを含むことができ、たとえば、対象組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜１５、または１５〜２０種の異なるＬＩＮＥポリペプチドを含むことができ、そのそれぞれは、他のＬＩＮＥポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸を有する。たとえば、一部の実施形態では、コードされるＬＩＮＥポリペプチドの集団は、第１のアミノ酸配列を有する第１のＬＩＮＥポリペプチド；および第２のアミノ酸配列を有する少なくとも第２のＬＩＮＥポリペプチド（第２のアミノ酸配列は第１のアミノ酸配列とは異なる）を含む。別の例として、一部の実施形態では、コードされるＬＩＮＥポリペプチドの集団は、第１のアミノ酸配列を有する第１のＬＩＮＥポリペプチド；第２のアミノ酸配列を有する第２のＬＩＮＥポリペプチド（第２のアミノ酸配列は第１のアミノ酸配列とは異なる）；ならびに第３のアミノ酸配列を有する少なくとも第３のＬＩＮＥポリペプチド（第３のアミノ酸配列は第１および第２のアミノ酸配列のどちらとも異なる）を含む。他の実施形態では、コードされるＬＩＮＥポリペプチドは上述の多量体ＬＩＮＥポリペプチドである。
発現ベクターおよび送達ビヒクル
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドは発現ベクターである。発現ベクターは、誘導可能または構成的であり得る転写および翻訳開始領域を提供し、コード領域は、転写開始領域ならびに転写および翻訳終結領域の転写制御下で作動可能に連結している。したがって、たとえば、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドは、転写制御要素（たとえばプロモーター）に作動可能に連結した、対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、転写制御要素は、誘導可能または構成的であることができる。
発現ベクターは、一般に、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入を提供するために）、プロモーター配列の近くに位置する好都合な制限部位を有する。発現宿主中で作動可能な選択マーカーが存在し得る。適切な発現ベクターには、それだけには限定されないが、ウイルスベクター（たとえば、以下に基づくウイルスベクター：ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（たとえば、Ｌｉ他、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、３５：２５４３ ２５４９、１９９４；Ｂｏｒｒａｓ他、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、６：５１５ ５２４、１９９９；ＬｉおよびＤａｖｉｄｓｏｎ、ＰＮＡＳ、９２：７７００ ７７０４、１９９５；Ｓａｋａｍｏｔｏ他、Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、５：１０８８ １０９７、１９９９；ＷＯ９４／１２６４９号、ＷＯ９３／０３７６９号；ＷＯ９３／１９１９１号；ＷＯ９４／２８９３８号；ＷＯ９５／１１９８４号およびＷＯ９５／００６５５号参照）、アデノ関連ウイルス（たとえば、Ａｌｉ他、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、９：８１ ８６、１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ他、ＰＮＡＳ、９４：６９１６ ６９２１、１９９７；Ｂｅｎｎｅｔｔ他、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、３８：２８５７ ２８６３、１９９７；Ｊｏｍａｒｙ他、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、４：６８３ ６９０、１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ他、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１０：６４１ ６４８、１９９９；Ａｌｉ他、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、５：５９１ ５９４、１９９６；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、ＷＯ９３／０９２３９号、Ｓａｍｕｌｓｋｉ他、Ｊ．Ｖｉｒ．、（１９８９）６３：３８２２〜３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ他、Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４〜１６５；およびＦｌｏｔｔｅ他、ＰＮＡＳ、（１９９３）９０：１０６１３〜１０６１７参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（たとえば、Ｍｉｙｏｓｈｉ他、ＰＮＡＳ、９４：１０３１９ ２３、１９９７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７３：７８１２ ７８１６、１９９９参照）；レトロウイルスベクター（たとえば、ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびに、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血症ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）；等が含まれる。
数々の適切な発現ベクターが当業者に知られており、多くが市販されている。以下のベクターを例として提供する；真核宿主細胞では、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、宿主細胞と適合性がある限りは、任意の他のベクターを使用し得る。
利用する宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写終結因子などを含めたいくつかの適切な転写および翻訳制御要素のうちの任意のものを、発現ベクター中で使用し得る（たとえば、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５１６〜５４４）。
適切な真核プロモーター（真核細胞内で機能的なプロモーター）の非限定的な例には、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当分野の通常の技術レベル範囲内に十分ある。また、発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結因子も含有し得る。また、発現ベクターには、発現を増幅するための適切な配列も含まれ得る。
一部の実施形態では、対象組換えベクターには１つまたは複数の選択マーカーが含まれる。さらに、多くの実施形態では、発現ベクターは、真核細胞培養物ではジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性などの、形質転換させた宿主細胞を選択するための表現型の形質を提供するために、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含有する。
死滅させたアデノウイルス単独と連結したまたは連結していないポリカチオン凝縮ＤＮＡ、たとえばＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１４７〜１５４；リガンドと連結したＤＮＡ、たとえばＷｕ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６９８５〜１６９８７参照；真核細胞送達ビヒクル細胞；光重合ヒドロゲル材料の沈着；米国特許第５，１４９，６５５号に記載の手持ち遺伝子移入粒子銃；米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３号に記載の電離放射線；核電荷中和または細胞膜との融合を含めた、他の遺伝子送達ビヒクルおよび方法を用い得る。さらなる手法は、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４；２４１１〜２４１８、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：１５８１〜１５８５に記載されている。
裸ＤＮＡも用い得る。例示的な裸ＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。取り込み効率は、生分解性ラテックスビーズを用いて改善し得る。ＤＮＡでコーティングしたラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始後に細胞内に効率的に輸送される。この方法は、疎水性を増加させ、それによりエンドソームの破壊およびＤＮＡの細胞質内への放出を促進するためにビーズを処理することによって、さらに改善し得る。遺伝子送達ビヒクルとして作用することができるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ ＷＯ９５／１３７９６号、ＷＯ９４／２３６９７号、およびＷＯ９１／１４４４５号、ならびにＥＰ５２４ ９６８号に記載されている。
リポソームまたは脂質の核酸送達ビヒクルも使用することができる。遺伝子送達用のリポソーム複合体は、たとえば米国特許第７，００１，６１４号に記載されている。たとえば、２．０ｍＭ １０ｍＭのモル比範囲で存在するＤＯＴＡＰと少なくとも１つのコレステロールおよび／またはコレステロール誘導体とを含むリポソームが有効な送達系をもたらし、たとえば、ＤＯＴＡＰ対コレステロールのモル比は１：１ ３：１である。カチオン性脂質Ｎ−［（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｌ−リシンアミド（ＬＡＤＯＰ）を、ＬＩＮＥポリヌクレオチドを送達するための組成物中で使用することができ、ＬＡＤＯＰ含有リポソームは、たとえば米国特許第７，０６７，６９７号に記載されている。形質移入を促進することができる極性の頭部基および脂肪族構成要素を有する両親媒性脂質を含むリポソーム製剤物が使用に適しており、たとえば米国特許第６，４３３，０１７号に記載されている。
使用に適したさらなる非ウイルス送達には、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎ他、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１１５８１〜１１５８５に記載の手法などの機械的送達系が含まれる。さらに、コード配列およびその発現産物は、光重合ヒドロゲル材料の沈着によって送達することができる。コード配列の送達に使用することができる遺伝子送達の他の慣用方法には、たとえば、米国特許第５，１４９，６５５号に記載の手持ち遺伝子移入粒子銃の使用；米国特許第５，２０６，１５２号およびＰＣＴ ＷＯ９２／１１０３３号に記載の、移入した遺伝子を活性化するための電離放射線の使用が含まれる。
組成物
本発明は、対象ＬＩＮＥ核酸を含む組成物を提供する。対象ＬＩＮＥ核酸を含む組成物には、以下のうちの１つまたは複数が含まれることができる：塩、たとえば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、たとえば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；洗剤、たとえば、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗剤；ヌクレアーゼ阻害剤等。一部の実施形態では、以下にさらに詳述するように、対象ＬＩＮＥ核酸組成物は免疫原性組成物である。
医薬組成物
本発明は、対象ＬＩＮＥ核酸と製薬上許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。様々な製薬上許容される賦形剤が当分野で知られており、本明細書中で詳述する必要はない。製薬上許容される賦形剤は、たとえば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）「レミントン：製薬の科学および実施（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；製薬財形および薬物送達系（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ他編、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；および製薬賦形剤の手引き（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ他編、第３版、Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．を含めた様々な出版物中に十分に記載されている。
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの製薬上許容される賦形剤は、容易に公的に入手可能である。さらに、ｐＨ調節剤および緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤、湿潤剤などの製薬上許容される補助物質は、容易に公的に入手可能である。
適切な賦形剤ビヒクルは、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組合せである。さらに、所望する場合は、ビヒクルは、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有し得る。
免疫原性組成物
本発明は、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供する。それを必要としている個体に投与した場合、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドは、細胞、たとえば抗原提示細胞によって取り込まれ、コードされるＬＩＮＥポリペプチドが細胞内で産生され、ＬＩＮＥポリペプチドはポリペプチド断片（「エピトープ断片」）へとプロセッシングされ、その後、これらはＭＨＣ分子と会合している細胞の表面上に提示される。コードされるＬＩＮＥポリペプチドは、細胞表面上に提示されているエピトープ（複数可）に対するＴ細胞応答を刺激または増強する。ＬＩＮＥエピトープがレトロウイルスに感染した細胞上にも存在する場合は、レトロウイルスに感染した細胞に対するＴ細胞応答も起こる。
対象ＬＩＮＥ核酸を含む対象免疫原性組成物には、対象ＬＩＮＥ核酸に加えて、対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む免疫原性組成物について上述した１つまたは複数の追加の構成要素が含まれる。
アジュバント
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドとアジュバントとを含む。適切なアジュバントには、ヒトでの使用に適したものが含まれる。ヒトで使用することができる既知の適切なアジュバントの例には、必ずしもそれだけには限定されないが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖのスクワレン、０．５％ｗ／ｖのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖのトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５））、ＣｐＧ含有核酸（シトシンはメチル化されていない）、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａ、ＩＳＣＯＭからの抽出物（たとえば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ他（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．、６４：７１３参照）、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、Ｑｕｉｌ Ａ、インターロイキンなどが含まれる。それだけには限定されないが動物実験を含めた獣医学的用途では、フロイント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ぶ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ぶ）、ならびに２％のスクワレン／Ｔｗｅｅｎ８０の乳濁液中の、細菌から抽出した３つの構成要素、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有するＲＩＢＩを使用することができる。
組成物の有効性を増強するためのさらなる例示的なアジュバントには、それだけには限定されないが：（１）水中油乳濁液製剤物（ムラミルペプチド（以下参照）または細菌細胞壁構成要素などの他の特異的免疫刺激剤を含むまたは含まない）、たとえば、（ａ）微小流動化装を用いてサブミクロンの粒子へと製剤した５％のスクワレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、および０．５％のＳｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンと共有結合したムラミルトリペプチド（ＭＴＰ−ＰＥ）を任意選択で含有）を含有する、ＭＦ５９（商標）（ＷＯ９０／１４８３７号；第１０章、ワクチン設計：サブユニットおよびアジュバント手法（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）、（ｂ）サブミクロンの乳濁液へと微小流動化した、または渦攪拌してより大きな粒子径の乳濁液を作製した、１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（ｃ）２％のスクワレン、０．２％のＴｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリ脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）などの１つまたは複数の細菌細胞壁構成要素、たとえば、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）；（２）ＱＳ２１またはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、マサチューセッツ州Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）などのサポニンアジュバント、または追加の洗剤を欠くＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などのそれから作製した粒子を使用し得る、たとえばＷＯ００／０７６２１号；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン、たとえば、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６号）など）、インターフェロン（たとえばγインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、他のＴＮＦスーパーファミリー分子（たとえば、ＣＨ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌなど）等；（５）モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、たとえば、ＧＢ−２２２０２２１号、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４号、肺炎球菌の糖類と共に使用した場合は、任意選択でミョウバンが実質的に存在しない、たとえばＷＯ００／５６３５８号；（６）３ｄＭＰＬと、たとえばＱＳ２１および／または水中油乳濁液との組合せ、たとえば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８号、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８号、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１号；（７）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド［Ｋｒｉｅｇ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０００、１９、６１８〜６２２；Ｋｒｉｅｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２００１、３：１５〜２４；Ｒｏｍａｎ他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３、８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、８７０〜８７６；Ｃｈｕ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１９９７、１８６、１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、２７、２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６、１２１６〜１２２４、Ｋｒｉｅｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５６、４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎ他、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１６７、７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８８、７９、８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１、１４７、１７５９〜１７６４；Ｙｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、４９１８〜４９２５；Ｙｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、５３９４〜５４０２；Ｙｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、４７５５〜４７６１；およびＹｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、５８９８〜５９０６；国際特許出願ＷＯ９６／０２５５５号、ＷＯ９８／１６２４７号、ＷＯ９８／１８８１０号、ＷＯ９８／４０１００号、ＷＯ９８／５５４９５号、ＷＯ９８／３７９１９号およびＷＯ９８／５２５８１号］、すなわち、シトシンがメチル化されていない少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含有する；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、たとえばＷＯ９９／５２５４９号、（９）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７号）またはオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２号）；（１０）サポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド（たとえばＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ００／６２８００号）；（１１）免疫賦活剤および金属塩粒子、たとえばＷＯ００／２３１０５号；（１２）サポニンおよび水中油乳濁液、たとえばＷＯ９９／１１２４１号；（１３）サポニン（たとえばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（任意選択で＋ステロール）、たとえばＷＯ９８／５７６５９号；（１４）免疫刺激剤として作用して組成物の有効性を増強する他の物質が含まれる。ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などが含まれる。
対象免疫原性組成物には、慣用の製薬上許容される賦形剤、たとえば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、カルボネートなどが含まれることができる。対象免疫原性組成物には、ｐＨ調節剤および緩衝剤、毒性調節剤などの、生理的条件に近似させるために必要な１つまたは複数の製薬上許容される補助物質、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどが含まれることができる。これらの製剤物中の対象ＬＩＮＥ核酸の濃度は広く変動する場合があり、流体体積、粘度、体重などの様々な要素に基づいて、選択した特定の投与様式および患者の要求に従って選択することができる。生じる組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エアロゾルなどの形態であり得る。
医薬製剤中の対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドの濃度は広く変動する場合があり、たとえば、約０．１重量％未満、約０．１重量％〜約２重量％、約２重量％〜２０重量％、もしくは約２０重量％〜約５０重量％、またはそれより多く、流体体積、粘度などの様々な要素に基づいて、選択した特定の投与様式に従って選択される。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドは、１つまたは複数の脂質を用いて製剤する。たとえば、様々な大きさのリポソームを作製することができる。形成された小リポソームまたは小胞は単層であり、約２０〜４００ナノメートルの範囲の大きさであり、多層小胞を超音波に供することによって、定義された大きさの孔を有する膜を通して圧力下で押し出すことによって、または高圧ホモジネーションによって生成することができる。直径が約０．１〜１μｍの範囲の大きさのより大きな単層リポソームは、脂質を有機溶媒または洗剤に溶かし、溶かした薬剤をそれぞれ蒸発または透析によって除去した場合に得ることができる。特定の脂質または厳密な脱水−水和条件を必要とする方法による、より小さな単層リポソームの融合により、細胞と同等またはそれよりも大きい単層胞を得ることができる。
リポソームは、１つまたは複数のカチオン性脂質、たとえば、ＤＤＡＢ、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド；Ｎ−［１−（２，３−ジオロイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート；１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（それだけには限定されないが、ジオレオイル（ＤＯＴＡＰ）、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジセアロイルを含む）；１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（それだけには限定されないが、ジオレオイル、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジセアロイルを含む）ＤＯＴＭＡ、Ｎ−［１−［２，３−ビス（オレオイルオキシ）］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド；ＤＯＧＳ、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン；ＤＣ−コレステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール；ＤＯＳＰＡ、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−（２（スペルミンカルボキサミド）−エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（それだけには限定されないが、ジオレオイル（ＤＯＥＰＣ）、ジラウロイル、ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、パルミトイル−オレオイルを含む）、β−アラニルコレステロール；ＣＴＡＢ、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド；ジＣ１４−アミジン、Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシルアミノプロピオンアミジン；１４Ｄｅａ２、Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノールイル−Ｎ−（トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロライド；ＤＯＳＰＥＲ、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシルエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムヨウ化物；１−［２−アシルオキシ）エチル］２−アルキル（アルケニル）−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド誘導体、たとえば、１−［２−（９（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）エチル］−２−（８（Ｚ）−ヘプタデセニル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（ＤＯＴＩＭ）、１−［２−（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］−２−ペンタデシル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（ＤＰＴＩＭ）；１−［２−テトラデカノイルオキシ）エチル］−２−トリデシル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリウムクロライド（ＤＭＴＩＭ）−Ｓｏｌｏｄｉｎ他（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４３：１３５３７〜１３５４４に記載；第四級アミン上のヒドロキシアルキル部分を含有する２，３−ジアルキルオキシプロピル第四級アンモニウム化合物誘導体、たとえば、１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシプロピルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ−ＨＰ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシブチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ−ＨＢ）；１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシペンチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ−ＨＰｅ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシルエチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）；１，２−ジパルミチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＰＲＩＥ）、１，２−ジステリルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＳＲＩＥ）−たとえば、Ｆｅｌｇｎｅｒ他（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２５５０〜２５６１に記載を含むことができる。上述の脂質の多くは、たとえば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｎｏｒｔｈｅｒｍ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；およびＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている。
リポソームは、カチオン性脂質を、単独で、または他の脂質、特に、コレステロール；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（それだけには限定されないが、ジオレオイル（ＤＯＰＥ）、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；天然卵黄ホスファチジルコリン（ＰＣ）など；合成モノおよびジアシルホスホコリン（たとえばモノアシルホスファチジルコリン（ＭＯＰＣ）を含む）ならびにホスホエタノールアミンなどの中性脂肪との混合物で含み得る。上記ジアシル誘導体の合成および天然の不斉脂肪酸ならびに混合製剤物も含まれ得る。
他の適切なリポソーム組成物には、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびコレステロールが含まれる。そのようなリポソームは、たとえば米国特許第５，９１６，５８８号に記載されている。さらなる適切なリポソーム組成物、およびその調製方法は当分野で知られており、たとえば、米国特許第４，２４１，０４６号および第６，３５５，２６７号を含めた様々な出版物に記載されている。
治療方法
対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を利用する、様々な治療方法が本開示によって企図される。対象治療方法には、個体においてＬＩＮＥポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法、たとえば、レトロウイルス感染症（たとえばレンチウイルス感染症）を治療するため、癌を治療するためなどの、ＬＩＮＥポリペプチドに対する対象の免疫応答を増強する方法；ならびに、たとえば、自己免疫障害を治療するため、統合失調症を治療するためなどの、ＬＩＮＥポリペプチドに対する対象の免疫応答を減少させる方法が含まれる。
レトロウイルスに感染した細胞に対する免疫応答を誘導または増強する方法
本開示は、それを必要としている個体において、レトロウイルスに感染した細胞、たとえばＨＴＬＶに感染した細胞に対するＴ細胞免疫応答を誘導、誘発、または増強する方法を提供する。この方法は、一般に、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量（たとえば対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を個体に投与することを含む。
したがって、たとえば、本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥポリペプチド（たとえば、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド、対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド）、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥ医薬組成物、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を投与することを含む、個体においてレトロウイルス感染症を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物を投与することを含む、個体においてレトロウイルス感染症を治療する方法を提供する。本発明は、個体においてレトロウイルス感染症を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の使用を提供する。本発明は、個体においてレトロウイルス感染症を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）の使用を提供する。本発明は、個体においてレトロウイルス感染症を治療するための、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を提供する。本発明は、個体においてレトロウイルス感染症を治療するための、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）を提供する。
したがって、たとえば、本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥポリペプチド（たとえば、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド、対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド）、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥ医薬組成物、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を投与することを含む、個体においてＨＴＬＶ感染症を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物を投与することを含む、個体においてＨＴＬＶ感染症を治療する方法を提供する。本発明は、個体においてＨＴＬＶ感染症を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の使用を提供する。本発明は、個体においてＨＴＬＶ感染症を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）の使用を提供する。本発明は、個体においてＨＴＬＶ感染症を治療するための、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を提供する。本発明は、個体においてＨＴＬＶ感染症を治療するための、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）を提供する。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体におけるレトロウイルス量（たとえばＨＴＬＶ量）を、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を用いた治療前の個体におけるウイルス量と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％減少させる量である。
一部の実施形態では、レトロウイルスに感染した細胞に対するＴ細胞免疫応答を誘導、誘発、または増強する対象方法は、それを必要としている個体に、有効量の対象免疫原性組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体におけるレトロウイルス量を、免疫原性組成物を用いた治療前の個体におけるウイルス量と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％減少させる量である。一部の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、レトロウイルスに感染した細胞上に存在するレトロウイルスエピトープに特異的なＴ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を用いた治療前の個体におけるレトロウイルスエピトープに特異的なＴ細胞の数と比較して、レトロウイルスに感染した細胞上に存在するレトロウイルスエピトープに特異的なＴ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、レトロウイルスに感染した細胞上に存在するレトロウイルスエピトープに特異的なＴ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、免疫原性組成物を用いた治療前の個体におけるレトロウイルスエピトープに特異的なＴ細胞の数と比較して、レトロウイルスに感染した細胞上に存在するレトロウイルスエピトープに特異的なＴ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。一部の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、レトロウイルスに感染した細胞上に存在するレトロウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を用いた治療前の個体におけるレトロウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数と比較して、レトロウイルスに感染した細胞上に存在するレトロウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、レトロウイルスに感染した細胞上に存在するレトロウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、免疫原性組成物を用いた治療前の個体におけるレトロウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数と比較して、レトロウイルスに感染した細胞上に存在するレトロウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。一部の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物をナイーブ個体（すなわちＨＴＬＶなどのレトロウイルスに感染していない個体）に投与する場合、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体が後にＨＴＬＶなどのレトロウイルスに感染した場合に、レトロウイルス感染症の疾患の症状が発生する可能性を減少させる量である。一部の実施形態では、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物をナイーブ個体（すなわちレトロウイルスに感染していない個体）に投与する場合、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体が後にＨＩＶなどのレトロウイルスに感染した場合に、レトロウイルス感染症が制限および／または排除される可能性を増加する量である。
一部の実施形態では、たとえば、対象免疫原性組成物をナイーブ個体（すなわちＨＴＬＶなどのレトロウイルスに感染していない個体）に投与する場合、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体が後にＨＴＬＶなどのレトロウイルスに感染した場合に、レトロウイルス感染症の疾患の症状が発生する可能性を減少させる量である。一部の実施形態では、たとえば、免疫原性組成物をナイーブ個体（すなわちレトロウイルスに感染していない個体）に投与する場合、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体が後にＨＩＶなどのレトロウイルスに感染した場合に、レトロウイルス感染症が制限および／または排除される可能性を増加する量である。
レンチウイルスに感染した細胞に対する免疫応答を誘導または増強する方法
本発明は、それを必要としている個体において、レンチウイルスに感染した細胞、たとえばＨＩＶに感染した細胞に対するＴ細胞免疫応答を誘導、誘発、または増強する方法を提供する。この方法は、一般に、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量を個体に投与することを含む。
本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥポリペプチド（たとえば、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド、対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド）、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥ医薬組成物、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を投与することを含む、個体においてレンチウイルス感染症（たとえばＨＩＶ感染症）を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物を投与することを含む、個体においてレンチウイルス感染症を治療する方法を提供する。本発明は、個体においてレンチウイルス感染症を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の使用を提供する。本発明は、個体においてレンチウイルス感染症を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）の使用を提供する。本発明は、個体においてレンチウイルス感染症を治療するための、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を提供する。本発明は、個体においてレンチウイルス感染症を治療するための、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）を提供する。
本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥポリペプチド（たとえば、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド、対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド）、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥ医薬組成物、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を投与することを含む、個体においてＨＩＶ感染症を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物を投与することを含む、個体においてＨＩＶ感染症を治療する方法を提供する。本発明は、個体においてＨＩＶ感染症を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の使用を提供する。本発明は、個体においてＨＩＶ感染症を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）の使用を提供する。本発明は、個体においてＨＩＶ感染症を治療するための、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を提供する。本発明は、個体においてＨＩＶ感染症を治療するための、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）を提供する。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体におけるウイルス量（たとえばＨＩＶウイルス量）を、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を用いた治療前の個体におけるウイルス量と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％減少させる量である。
一部の実施形態では、個体においてレンチウイルスに感染した細胞に対するＴ細胞免疫応答を誘導、誘発、または増強する対象方法は、個体に有効量の対象免疫原性組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体におけるウイルス量を、免疫原性組成物を用いた治療前の個体におけるウイルス量と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％減少させる量である。一部の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体においてＣＤ４＋Ｔリンパ球のレベルおよび機能（複数可）の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を用いた治療前の個体におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球のレベルと比較して、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、正常範囲内にあるいくつかのＣＤ４＋Ｔリンパ球をもたらす量であり、ヒトの正常範囲は、約６００〜約１５００個のＣＤ４＋Ｔリンパ球／血液１ｍｍ３である。
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体においてＣＤ４＋Ｔリンパ球のレベルおよび機能（複数可）の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、免疫原性組成物を用いた治療前の個体におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球のレベルと比較して、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、正常範囲内にあるいくつかのＣＤ４＋Ｔリンパ球をもたらす量であり、ヒトの正常範囲は、約６００〜約１５００個のＣＤ４＋Ｔリンパ球／血液１ｍｍ３である。一部の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、レンチウイルスに感染した細胞（たとえばＨＩＶに感染した細胞）上に存在するレンチウイルスエピトープ（たとえばＨＩＶエピトープ）に特異的なＴ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を用いた治療前の個体におけるレンチウイルスエピトープに特異的なＴ細胞の数と比較して、レンチウイルスに感染した細胞（たとえばＨＩＶに感染した細胞）上に存在するレンチウイルスエピトープ（たとえばＨＩＶエピトープ）に特異的なＴ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、レンチウイルスに感染した細胞上に存在するレンチウイルスエピトープに特異的なＴ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、免疫原性組成物を用いた治療前の個体におけるレンチウイルスエピトープに特異的なＴ細胞の数と比較して、レンチウイルスに感染した細胞上に存在するレンチウイルスエピトープに特異的なＴ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。一部の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、レンチウイルスに感染した細胞上に存在するレンチウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を用いた治療前の個体におけるレンチウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数と比較して、レンチウイルスに感染した細胞上に存在するレンチウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、レンチウイルスに感染した細胞上に存在するレンチウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、免疫原性組成物を用いた治療前の個体におけるレンチウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数と比較して、レンチウイルスに感染した細胞上に存在するレンチウイルスエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。
一部の実施形態では、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物をナイーブ個体（すなわちＨＩＶなどのレンチウイルスに感染していない個体）に投与する場合、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体が後にＨＩＶなどのレンチウイルスに曝されるまたは感染した場合に、レンチウイルス感染症の疾患の症状が発生する可能性を減少させる量である。一部の実施形態では、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物をナイーブ個体（すなわちＨＩＶなどのレンチウイルスに感染していない個体）に投与する場合、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体が後にＨＩＶなどのレンチウイルスに感染した場合に、レンチウイルス感染症が制限および／または排除される可能性を増加させる量である。
一部の実施形態では、たとえば、免疫原性組成物をナイーブ個体（すなわちＨＩＶなどのレンチウイルスに感染していない個体）に投与する場合、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体が後にＨＩＶなどのレンチウイルスに曝されるまたは感染した場合に、レンチウイルス感染症の疾患の症状が発生する可能性を減少させる量である。一部の実施形態では、たとえば、免疫原性組成物をナイーブ個体（すなわちＨＩＶなどのレンチウイルスに感染していない個体）に投与する場合、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、個体が後にＨＩＶなどのレンチウイルスに感染した場合に、レンチウイルス感染症が制限および／または排除される可能性を増加させる量である。
組合せ療法
対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物は、レンチウイルス感染症を治療するため、またはレンチウイルス感染症に付随し得る障害（たとえば、細菌感染症、真菌感染症など）を治療するための１つまたは複数の治療剤と併せて投与することができる。治療剤のβ−ラクタム抗生物質、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、グラミシジン、バシトラシン、スルホンアミド、ニトロフラゾン、ナリジクス酸、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、ベータメタゾン、デキサメタゾン、フルオコルトロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、インドメタシン、スリンダク、アシクロビル、アマンタジン、リマンタジン、組換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）、抗受容体抗体（たとえばライノウイルス用）、ネビラピン、シドホビル（Ｖｉｓｔｉｄｅ（商標））、ホスホノギ酸三ナトリウム（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ（商標））、ファムシクロビル、ペンシクロビル、バラシクロビル、核酸／複製阻害剤、インターフェロン、ジドブジン（ＡＺＴ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ（商標））、ジダノシン（ジデオキシイノシン、ｄｄＩ、Ｖｉｄｅｘ（商標））、スタブジン（ｄ４Ｔ、Ｚｅｒｉｔ（商標））、ザルシタビン（ジデオキシシトシン、ｄｄＣ、Ｈｉｖｉｄ（商標））、ネビラピン（Ｖｉｒａｍｕｎｅ（商標））、ラミブジン（Ｅｐｉｖｉｒ（商標）、３ＴＣ）、プロテアーゼ阻害剤、サキナビル（Ｉｎｖｉｒａｓｅ（商標）、Ｆｏｒｔｏｖａｓｅ（商標））、リトナビル（Ｎｏｒｖｉｒ（商標））、ネルフィナビル（Ｖｉｒａｃｅｐｔ（商標））、エファビレンツ（Ｓｕｓｔｉｖａ（商標））、アバカビル（Ｚｉａｇｅｎ（商標））、アンプレナビル（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ（商標））インジナビル（Ｃｒｉｘｉｖａｎ（商標））、ガンシクロビル、ＡｚＤＵ、デラビルジン（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ（商標））、カレトラ、トリジビル、リファンピン、クラチロマイシン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、アドリアマイシン、フルオロウラシル、メトトレキサート、アスパラギナーゼならびにその組合せ。
対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物と組み合わせて投与することができるＨＩＶ感染症を治療するための薬剤には、たとえば、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（たとえば、エファビレンツ、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン）、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（たとえば、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン）、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤（テノホビル、アデフォビル）、ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤（サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ダルナビル）、ＨＩＶインテグラーゼの阻害剤（たとえば、ラルテグラビル、エルビテグラビル）、ＨＩＶの侵入または融合の阻害剤（たとえば、マラビロク、エンフビルチド）、および成熟阻害剤（たとえば、ビベリマット、ビベコン（ｖｉｖｅｃｏｎ））が含まれる。
癌を治療する方法
本発明は、さらに、個体において癌を治療する方法を提供し、癌状態は、ＬＩＮＥポリペプチドの異常な発現またはＬＩＮＥポリペプチドの発現の増加に関連し、たとえば、癌は、ＬＩＮＥポリペプチドの異常な発現を示す（たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドを、同じ細胞種の非癌性（正常）細胞によって発現されるＬＩＮＥポリペプチドのレベルよりも、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍、または１０倍より高いレベルで発現する）癌細胞または前癌細胞を含む。そのような癌には、それだけには限定されないが、黒色腫、卵巣癌、乳癌、および精巣癌（奇形腫、精上皮腫、および胚性癌腫またはこれらの種類のうちの１つもしくは複数からなる混合腫瘍を含む）が含まれる。この方法は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥポリペプチド（たとえば、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド、対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド）、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥ医薬組成物、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を投与することを含む。一部の実施形態では、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、１つもしくは複数の対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは１つもしくは複数の対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を投与することを含む。
本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥポリペプチド（たとえば、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド、対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド）、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥ医薬組成物、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を投与することを含む、個体において、癌（たとえば、黒色腫、卵巣癌、乳癌、および精巣癌（奇形腫、精上皮腫、および胚性癌腫またはこれらの種類のうちの１つもしくは複数からなる混合腫瘍を含む）を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物を投与することを含む、個体において癌を治療する方法を提供する。本発明は、個体において癌を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の使用を提供する。本発明は、個体において癌を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）の使用を提供する。本発明は、個体において癌を治療するための、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を提供する。本発明は、個体において癌を治療するための対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）を提供する。
たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量を、腫瘍の細胞がＬＩＮＥポリペプチド、たとえばＬＩＮＥ−１ポリペプチドを癌状態のマーカーとして発現する、腫瘍（たとえば固形腫瘍）を有する個体に投与する。
たとえば、１つまたは複数のＬＩＮＥポリペプチドを含む有効量の対象免疫原性組成物を、腫瘍の細胞がＬＩＮＥポリペプチド、たとえばＬＩＮＥ−１ポリペプチドを癌状態のマーカーとして発現する腫瘍（たとえば固形腫瘍）を有する個体に投与する。
別の例として、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量を、腫瘍が生じた組織が非癌状態でＬＩＮＥポリペプチド（たとえばＬＩＮＥ−１ポリペプチド）を発現し、そのような組織が、癌状態のマーカーとしてＬＩＮＥポリペプチドの発現の増加（たとえば、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍、または１０倍より高い増加）を示す、腫瘍を有する対象に投与する。
別の例として、有効量の対象免疫原性組成物を、腫瘍が生じた組織が非癌状態でＬＩＮＥポリペプチド（たとえばＬＩＮＥ−１ポリペプチド）を発現し、そのような組織が、ＬＩＮＥポリペプチドの発現の増加（たとえば、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍、または１０倍より高い増加）を癌状態のマーカーとして示す、腫瘍を有する対象に投与する。
対象免疫原性組成物を用いた治療を受け入れられる癌には、卵巣癌、乳癌、黒色腫、前立腺癌、および精巣癌（精上皮腫、奇形腫、および胚性癌腫を含む）が含まれる。
一部の実施形態では、癌治療のコンテキストでは、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、腫瘍の大きさ、癌細胞の数、および癌細胞の転移のうちの１つまたは複数を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、癌の完全根絶まで減少させる量である。
一部の実施形態では、癌治療のコンテキストでは、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、腫瘍の大きさ、癌細胞の数、および癌細胞の転移のうちの１つまたは複数を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、癌の完全根絶まで減少させる量である。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、癌細胞上に存在するエピトープに特異的なＴ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を用いた治療前の個体における癌細胞エピトープに特異的なＴ細胞の数と比較して、癌細胞上に存在するエピトープに特異的なＴ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、癌細胞上に存在するエピトープに特異的なＴ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、免疫原性組成物を用いた治療前の個体における癌細胞エピトープに特異的なＴ細胞の数と比較して、癌細胞上に存在するエピトープに特異的なＴ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、癌細胞上に存在するエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を用いた治療前の個体における癌細胞エピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数と比較して、癌細胞上に存在するエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。
一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、癌細胞上に存在するエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす量である。一部の実施形態では、対象免疫原性組成物の「有効量」とは、１回または複数回個体に投与した場合に、免疫原性組成物を用いた治療前の個体における癌細胞エピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数と比較して、癌細胞上に存在するエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％または２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１００倍、あるいはそれより多くの増加をもたらす量である。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）は、それを必要としている個体に、標準の癌治療に対するアジュバント治療として投与する。標準の癌治療には、手術（たとえば癌組織の外科的除去）、放射線療法、骨髄移植、化学療法処置、生物学的応答調節物質治療、および前述のものの特定の組合せが含まれる。
放射線療法には、それだけには限定されないが、ビームなどの外部源、または小さな放射源の埋め込みのどちらかによって送達する、Ｘ線またはγ線が含まれる。
化学療法剤とは、癌細胞の増殖を減少させる非ペプチド（すなわち非タンパク質）化合物であり、細胞毒性剤および細胞分裂抑制剤が包含される。化学療法剤の非限定的な例には、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイド、およびステロイドホルモンが含まれる。
細胞増殖を減少させる薬剤は当分野で知られており、幅広く使用されている。そのような薬剤には、アルキル化剤、たとえば、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキルが含まれ、それだけには限定されないが、メクロレタミン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、ダカルバジン、およびテモゾロマイドを含めたトリアゼンが含まれる。
代謝拮抗剤には、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤が含まれ、それだけには限定されないが、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロキシウリジン（ＦｕｄＲ）、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ペントスタチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート、１０−プロパルギル−５，８−ジデアザフォレート（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビンが含まれる。
適切な天然物およびその誘導体（たとえば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポドフィロトキシン）には、それだけには限定されないが、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナール；アルカロイド、たとえば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンなど；ポドフィロトキシン、たとえば、エトポシド、テニポシドなど；抗生物質、たとえば、アントラサイクリン、塩酸ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシンおよびモルホリノ誘導体など；フェノキシゾンビスシクロペプチド、たとえばダクチノマイシン；塩基性糖ペプチド、たとえばブレオマイシン；アンスラキノングリコシド、たとえばプリカマイシン（ミトラマイシン）；アントラセネジオン、たとえばミトキサントロン；アジリノピロロインドールジオン、たとえばマイトマイシン；大環状免疫抑制剤、たとえば、シクロスポリン、ＦＫ−５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシンなど等が含まれる。
他の抗増殖性細胞毒性剤は、ナベルベン、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イフォスアミド、およびドロロキサフィンである。
抗増殖活性を有する、微小管に影響を与える薬剤も使用に適しており、それだけには限定されないが、アロコルヒチン（ＮＳＣ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ７５７）、コルヒチン誘導体（たとえばＮＳＣ３３４１０）、ドルスタチン１０（ＮＳＣ３７６１２８）、メイタンシン（ＮＳＣ１５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ３３２５９８）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、Ｔａｘｏｌ（登録商標）誘導体、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、チオコルヒチン（ＮＳＣ３６１７９２）、トリチルシステリン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、それだけには限定されないが、エオプチロンＡ、エポチロンＢ、ディスコデルモリドを含めた天然および合成のエポチロン；エストラムスチン、ノコダゾールなどが含まれる。
使用に適したホルモンモジュレーターおよびステロイド（合成類似体を含む）には、それだけには限定されないが、副腎皮質ステロイド、たとえば、プレドニゾン、デキサメタゾンなど；エストロゲンおよびプレゲスチン、たとえば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェンなど；ならびに副腎皮質抑制剤、たとえばアミノグルテチミド；１７α−エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド（Ｄｒｏｇｅｎｉｌ）、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、およびＺｏｌａｄｅｘ（登録商標）が含まれる。エストロゲンは増殖および分化を刺激し、したがってエストロゲン受容体と結合する化合物を用いてこの活性を遮断する。コルチコステロイドはＴ細胞増殖を阻害し得る。
他の化学療法剤には、金属錯体、たとえば、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）、カルボプラチンなど；尿素、たとえばヒドロキシ尿素；およびヒドラジンたとえばＮ−メチルヒドラジン；エピドフィロトキシン；トポイソメラーゼ阻害剤；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガフールなどが含まれる。他の目的の抗増殖剤には、免疫抑制剤、たとえば、ミコフェノール酸、サリドマイド、デスオキシスペルグアリン、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン（ＳＫＦ１０５６８５）；Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ＺＤ１８３９、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−（３−（４−モルホリニル）プロポキシ）キナゾリン）などが含まれる。
「タキサン」には、パクリタキセルおよび任意の活性タキサン誘導体またはプロドラッグが含まれる。「パクリタキセル」（本明細書中では、たとえば、ドセタキセル、ＴＡＸＯＬ（商標）、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）（ドセタキセルの製剤物）、パクリタキセルの１０−デスアセチル類似体およびパクリタキセルの３’Ｎ−デスベンゾイル−３’Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル類似体などの、類似体、製剤物、および誘導体が含まれるとして理解されたい）は、当業者に知られている技術を利用して容易に調製し得るか（ＷＯ９４／０７８８２号、ＷＯ９４／０７８８１号、ＷＯ９４／０７８８０号、ＷＯ９４／０７８７６号、ＷＯ９３／２３５５５号、ＷＯ９３／１００７６号；米国特許第５，２９４，６３７号；第５，２８３，２５３号；第５，２７９，９４９号；第５，２７４，１３７号；第５，２０２，４４８号；第５，２００，５３４号；第５，２２９，５２９号；およびＥＰ５９０，２６７号も参照）、または、たとえばＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ（セイヨウイチイ由来のＴ７４０２もしくはタクスス・ヤナネンシス（Ｔａｘｕｓ ｙａｎｎａｎｅｎｓｉｓ）由来のＴ−１９１２）を含めた様々な市販源から得られ得る。
パクリタキセルは、パクリタキセルの一般的に化学的に利用可能な形態だけでなく、類似体および誘導体（たとえば、上述のＴａｘｏｔｅｒｅ（商標）ドセタキセル）ならびにパクリタキセルコンジュゲート（たとえば、パクリタキセル−ＰＥＧ、パクリタキセル−デキストラン、またはパクリタキセル−キシロース）をいうと理解されたい。
また、用語「タキサン」には、親水性誘導体および疎水性誘導体をどちらも含めた様々な既知の誘導体も含まれる。タキサン誘導体には、それだけには限定されないが、国際特許出願ＷＯ９９／１８１１３号に記載のガラクトースおよびマンノース誘導体；ＷＯ９９／１４２０９号に記載のピペラジノおよび他の誘導体；ＷＯ９９／０９０２１号、ＷＯ９８／２２４５１号、および米国特許第５，８６９，６８０号に記載のタキサン誘導体；ＷＯ９８／２８２８８号に記載の６−チオ誘導体；米国特許第５，８２１，２６３号に記載のスルフェンアミド誘導体；ならびに米国特許第５，４１５，８６９号に記載のＴａｘｏｌ誘導体が含まれる。さらに、これには、それだけには限定されないが、ＷＯ９８／５８９２７号；ＷＯ９８／１３０５９号；および米国特許第５，８２４，７０１号に記載のものを含めた、パクリタキセルのプロドラッグが含まれる。
本発明の方法に関連して使用に適した生物学的応答調節物質には、それだけには限定されないが、（１）チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性の阻害剤；（２）セリン／スレオニンキナーゼ活性の阻害剤；（３）腫瘍抗原と特異的に結合する抗体などの腫瘍関連抗原拮抗剤；（４）アポトーシス受容体作用剤；（５）インターロイキン−２；（６）ＩＦＮ−α；（７）ＩＦＮ−γ（８）コロニー刺激因子；および（９）血管形成の阻害剤が含まれる。
自己免疫疾患を治療する方法
本発明は、一般に、それを必要としている個体に、対象ＬＩＮＥポリペプチド（たとえば、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド、対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド）、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥ医薬組成物、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を、ＬＩＮＥポリペプチドに対する対象の免疫応答を減少させるために有効な量で投与し、それにより自己免疫疾患を治療することを含む、個体において自己免疫障害を治療する方法を提供する。対象方法を用いて治療することができる自己免疫障害には、それだけには限定されないが、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および１型糖尿病が含まれる。
本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥポリペプチド（たとえば、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド、対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド）、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥ医薬組成物、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を投与することを含む、個体において自己免疫障害を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物、たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物を投与することを含む、個体において自己免疫障害を治療する方法を提供する。本発明は、個体において自己免疫障害を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の使用を提供する。本発明は、個体において自己免疫障害を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）の使用を提供する。本発明は、個体において自己免疫障害を治療するための、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を提供する。本発明は、個体において自己免疫障害を治療するための、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象免疫原性組成物）を提供する。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量とは、ＬＩＮＥポリペプチドに対する対象の免疫応答を、対象ＬＩＮＥポリペプチドを用いた治療が存在しない場合のＬＩＮＥポリペプチドに対する対象の免疫応答のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、または５０％より多く減少させるために有効な量をいう。
一部の実施形態では、対象方法は、自己反応性を減少させるために有効であり、「自己反応性を減少させること」には、自己反応性細胞の数を減少させること；自己反応性細胞の活性を減少させること；および自己反応性抗体のレベルを減少させることのうちの１つまたは複数が含まれる。自己反応性は、それだけには限定されないが、Ｔリンパ球、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞を含めたいくつかの白血球の相互作用に依存する。Ｔリンパ球にはＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋リンパ球が含まれる。Ｂ細胞は、抗原提示細胞と組織を標的とすることができる自己抗体の産生者との両方として機能することができる。一部の実施形態では、対象方法は、様々な自己免疫反応に関与しているこれらの細胞の活性または数を変更することができる。一部の実施形態では、対象方法は、個体において、自己反応性細胞の数および／または活性を、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物で治療していない個体における自己反応性細胞の数および／またはレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、またはそれより多く減少させるために有効である。
一部の実施形態では、対象方法は、自己反応性Ｔリンパ球の数および／または活性を減少させるために有効である。したがって、一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量とは、個体において、自己反応性Ｔリンパ球の数および／または活性を、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物で治療していない個体における自己反応性Ｔリンパ球の数および／またはレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、またはそれより多く減少させるために有効な量である。
一部の実施形態では、対象方法は、自己反応性Ｂ細胞の数および／または活性を減少させるために有効である。したがって、一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量とは、個体において、自己反応性Ｂ細胞の数および／または活性を、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物で治療していない個体における自己反応性Ｂ細胞の数および／またはレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、またはそれより多く減少させるために有効な量である。
自己反応性Ｔリンパ球の活性には、それだけには限定されないが、「自己」細胞に向けられた細胞溶解活性；サイトカインの分泌；ケモカインの分泌；ケモカインに対する応答性；および輸送が含まれる。一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量とは、個体において自己反応性Ｔリンパ球のうちの１つまたは複数の活性を減少させるために有効な量である。
対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の投与が、個体において自己反応性Ｔリンパ球の数および／または活性ために有効であるかどうかは、既知のアッセイを用いて容易に決定される。たとえば、自己反応性Ｔリンパ球が自己抗原に対して特異的である場合、自己抗原特異的Ｔリンパ球の数および活性レベルは、たとえば、細胞質中に検出可能な標識を含み、自己抗原を提示している照射した細胞を、個体からのリンパ球と混合する、混合リンパ球反応を用いて決定する。自己抗原提示細胞の細胞質からの検出可能な標識の放出は、個体内に自己反応性リンパ球が存在することを示す。１型糖尿病に関連する自己反応性Ｔリンパ球の検出方法は当分野で知られており、任意のそのような方法を使用することができる。１型糖尿病に関連する自己反応性Ｔリンパ球の検出方法の記述には、たとえば、米国特許第６，０２２，６９７号を参照されたい。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量とは、自己免疫疾患の１つまたは複数の症状の重症度を減少させるために有効な量である。たとえば、一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量とは、自己免疫疾患の１つまたは複数の症状の重症度を、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物で治療していない個体における症状の重症度と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、またはそれより多く減少させるために有効な量である。
自己免疫障害に関連する症状は当分野で知られている。たとえば、「自己免疫疾患のテキストブック（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ ｔｈｅ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、Ｒ．Ｇ．Ｌａｈｉｔａ編（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、第１版を参照されたい。以下は非限定的な例である。
多発性硬化症は、中枢神経系（ＣＮＳ）機能不全の様々な症状および徴候によって特徴づけられており、寛解および再発性の増悪を伴う。最も一般的に提示される症状は、１つもしくは複数の四肢、体幹、または顔面の一面の錯感覚；脚または手の脱力または不器用；あるいは視力障害、たとえば、一方の眼球の部分的盲目および疼痛（球後視神経炎）、視界が薄暗くなること、または暗点である。他の一般的な初期症状は、二重視（複視）をもたらす眼麻痺、１つまたは複数の四肢の一過性の脱力、肢の軽微な硬直または異常な疲労、軽微な歩行障害、膀胱制御の困難、めまい、および緩和な情緒障害である。
真性糖尿病（ＤＭ）とは、インスリン分泌および／またはインスリン作用の絶対的または相対的機能障害によりもたらされる高血糖症によって特徴づけられる症候群である。任意の年齢で起こり得るが、Ｉ型ＤＭは、最も一般的には小児期または青年期に発生し、３０歳より前に診断されるＤＭの主要な型である。この型の糖尿病はＤＭの全症例の１０〜１５％を占め、高血糖症によって臨床的に特徴づけられる。
組合せ療法
一部の実施形態では、対象治療方法は、それを必要としている個体に、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の有効量と、自己免疫障害を治療するために有効な少なくとも１つの追加の薬剤とを投与することを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の薬剤は、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物以外である。
一部の実施形態では、対象治療方法は、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥポリペプチドと、自己免疫障害を治療するために有効な少なくとも１つの追加の薬剤とを投与することを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の薬剤は、対象ＬＩＮＥポリペプチド以外である。
当業者は、自己免疫障害の治療に適した薬剤（対象ＬＩＮＥポリペプチド以外）を知っているであろう。たとえば、１型糖尿病の治療に適した薬剤には、天然に存在するインスリン、インスリン類似体などを含めたインスリンが含まれる。
本発明における使用に適したインスリンには、それだけには限定されないが、レギュラーインスリン、セミレンテ、ＮＰＨ、レンテ、プロタミン亜鉛インスリン（ＰＺＩ）、ウルトラレンテ、インスリングラルギン、インスリンアスパルト、アシル化インスリン、単量体インスリン、超活性インスリン、肝選択的インスリン、および任意の他のインスリン類似体または誘導体、ならびに上述のものの任意の混合物が含まれる。本発明における使用に適したインスリンには、それだけには限定されないが、米国特許第４，９９２，４１７号；４，９９２，４１８号；第５，４７４，９７８号；第５，５１４，６４６号；第５，５０４，１８８号；第５，５４７，９２９号；第５，６５０，４８６号；第５，６９３，６０９号；第５，７００，６６２号；第５，７４７，６４２号；第５，９２２，６７５号；第５，９５２，２９７号；および第６，０３４，０５４号；ならびに公開ＰＣＴ出願ＷＯ００／１２１１９７号；ＷＯ０９／０１０６４５号；およびＷＯ９０／１２８１４号に開示されているインスリン形態が含まれる。インスリン類似体には、それだけには限定されないが、超活性インスリン類似体、単量体インスリン、および肝選択的インスリン類似体が含まれる。
統合失調症を治療する方法
本発明は、一般に、それを必要としている個体に、有効量の対象ＬＩＮＥポリペプチド（たとえば、対象の単離ＬＩＮＥポリペプチド、対象の合成ＬＩＮＥポリペプチド）、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥ医薬組成物、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）を投与することを含む、個体において統合失調症を治療する方法を提供する。本発明は、個体において統合失調症を治療するための医薬品の調製における、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の使用を提供する。本発明は、個体において統合失調症を治療するための、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を提供する。
これらの実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物の「有効量」とは、それを必要としている個体に、１回または複数回投与した場合に、統合失調症の少なくとも１つの症状を、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物を用いた治療が存在しない場合の個体における症状のレベルまたは重症度と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、またはそれより多く減少させる量である。統合失調症の症状は当分野で知られており、たとえば、「陽性」症状（たとえば、錯覚、幻覚、解体した会話、ひどく解体した行動または緊張病性行動）；および「陰性」症状（たとえば、アロギー、感情の平板化、意欲消失）が含まれる。
製剤物
上述の対象ＬＩＮＥポリペプチド、または対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドは、それを必要としている個体に投与するための様々な方法のうちの任意のもので製剤することができる。本発明は、ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む医薬製剤を提供する。ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物は上述されている。さらなる製剤物を以下に記載する。
ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを含む対象製剤物には、一般に、賦形剤（たとえば、スクロース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウム）、結合剤（たとえば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ポリビニルプロリドン、ゼラチン、アラビアガム、ポリエチレングリコール、スクロースまたはデンプン）、崩壊剤（たとえば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウムまたはクエン酸カルシウム）、潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルクまたはラウリル硫酸ナトリウム）、香味料（たとえば、クエン酸、メントール、グリシンまたはオレンジ粉末）、保存料（たとえば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）、安定化剤（たとえば、クエン酸、クエン酸ナトリウムまたは酢酸）、懸濁剤（たとえば、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはステアリン酸アルミニウム）、分散剤（たとえばヒドロキシプロピルメチルセルロース）、希釈剤（たとえば水）、および基剤ワックス（たとえば、カカオ脂、白色ワセリンまたはポリエチレングリコール）のうちの１つまたは複数が含まれる。
活性剤を含む錠剤は、たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、ジエチルフタレート、または三酢酸グリセロールなどの柔軟剤；スクロース、ソルビトール、キシリトール、グルコース、またはラクトースなどの充填剤；チタン水酸化物などの着色料等の適切な賦形剤を任意選択で加えてもよい、適切なフィルム形成剤、たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはエチルセルロースでコーティングしてもよい。
適切な賦形剤ビヒクルは、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組合せである。さらに、所望する場合は、ビヒクルは、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有し得る。そのような剤形を調製するための実際の方法は、当業者には知られているか、または明らかである。たとえば、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州Ｅａｓｔｏｎ、第１７版、１９８５を参照されたい。投与する組成物または製剤物は、いずれの場合でも、治療する対象において所望の状態を達成するために十分な薬剤の量を含有する。ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの製薬上許容される賦形剤は、容易に公的に入手可能である。さらに、ｐＨ調節剤および緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤、湿潤剤などの製薬上許容される補助物質は、容易に公的に入手可能である。
一部の実施形態、たとえば、レンチウイルスに対する免疫応答を誘導または増強するための使用では、ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドは、経膣送達用に製剤する。膣内投与用の対象製剤物は、膣内生体接着性錠剤、膣内生体接着性微粒子、膣内クリーム、膣内ローション、膣内泡沫、膣内軟膏、膣内ペースト、膣内溶液、または膣内ゲルとして製剤する。
用量
対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドの適切な用量は、単一または複数の用量で投与した場合に、所望の効果（たとえば、レンチウイルスに対するＴ細胞免疫応答の増加；癌細胞に対する免疫応答の増加；自己免疫応答の減少など）を有する用量であり、様々な要素に応じて変動するが、一般に、１回の投与または複数の投与に分割して投与する、約１μｇ〜約１００ｍｇ、たとえば、約１μｇ〜約５μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、または約５０ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲内である。
一部の実施形態では、投与あたりの対象ＬＩＮＥポリペプチドの量は、体重に基づいて決定される。たとえば、一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチドは、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ／用量、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、もしくは約９０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇより多い量で投与する。
一部の実施形態では、投与あたりの対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドの量は、体重に基づいて決定される。たとえば、一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドは、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ／用量、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、もしくは約９０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇより多い量で投与する。
当業者は、用量レベルが、具体的な化合物、症状の重症度および対象の副作用に対する感受性の関数として変動する場合があることを理解されよう。所与の化合物の好ましい用量は、当業者によって様々な手段によって容易に決定可能である。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドを複数回投与する。ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドの投与の頻度は、様々な要素、たとえば症状の重症度などのうちの任意のものに応じて変動する場合がある。たとえば、一部の実施形態では、ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥポリヌクレオチドは、１回／月、２回／月、３回／月、隔週（ｑｏｗ）、１回／週（ｑｗ）、２回／週（ｂｉｗ）、３回／週（ｔｉｗ）、４回／週、５回／週、６回／週、隔日（ｑｏｄ）、１日１回（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）、または１日３回（ｔｉｄ）投与する。
ＬＩＮＥポリペプチドの投与期間、たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドを投与する期間は、様々な要素、たとえば患者の応答などのうちの任意のものに応じて変動する場合がある。たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドは、約１日〜約１週間、約２週間〜約４週間、約１カ月〜約２カ月、約２カ月〜約４カ月、約４カ月〜約６カ月、約６カ月〜約８カ月、約８カ月〜約１年間、約１年間〜約２年間、もしくは約２年間〜約４年間の範囲、またはそれより長い期間にわたって投与することができる。
ＬＩＮＥポリヌクレオチドの投与期間、たとえば、ＬＩＮＥポリヌクレオチドを投与する期間は、様々な要素、たとえば患者の応答などのうちの任意のものに応じて変動する場合がある。たとえば、ＬＩＮＥポリヌクレオチドは、約１日〜約１週間、約２週間〜約４週間、約１カ月〜約２カ月、約２カ月〜約４カ月、約４カ月〜約６カ月、約６カ月〜約８カ月、約８カ月〜約１年間、約１年間〜約２年間、もしくは約２年間〜約４年間の範囲、またはそれより長い期間にわたって投与することができる。
投与経路
慣用かつ製薬上許容される投与経路には鼻腔内、筋肉内、気管内、腫瘍内、経皮、皮下、皮内、局所的塗布、静脈内、経膣、経鼻、および他の非経口投与経路が含まれる。また、適切な投与経路には、経口および直腸経路も含まれる。所望する場合は、投与経路を組み合わせてもよく、または、薬剤および／または所望の効果に応じて調節してもよい。組成物は、単一用量または複数用量で投与することができる。
対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物は、全身または局所経路を含めた、慣用薬物の送達に適した任意の利用可能な慣用方法および経路を用いて宿主に投与することができる。一般に、本発明によって企図される投与経路には、必ずしもそれだけには限定されないが、経腸、非経口、または吸入経路が含まれる。
吸入投与以外の非経口投与経路には、必ずしもそれだけには限定されないが、局所的、経膣、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、関節内、脊髄内、胸骨内、腫瘍内、腫瘍周囲、および静脈内経路、すなわち、消化管を通るもの以外の任意の投与経路が含まれる。非経口投与は、薬剤の全身または局所送達を達成するために実施することができる。全身送達が所望される場合は、投与は、典型的には、製薬調製物の侵襲性または全身吸収される局所または粘膜投与を含む。
また、対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物は、経腸投与によって対象に送達することもできる。経腸投与経路には、必ずしもそれだけには限定されないが、経口および直腸（たとえば坐薬を使用）送達が含まれる。
対象ＬＩＮＥポリペプチド、対象ＬＩＮＥポリヌクレオチド、または対象ＬＩＮＥ組成物（たとえば、対象ＬＩＮＥ医薬組成物、対象ＬＩＮＥ免疫原性組成物）は、粘膜組織、たとえば、経膣組織、直腸組織などに送達することができる。
ＬＩＮＥ特異的ＣＴＬを作製する方法
本発明は、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで作製する方法を提供する。この方法は、一般に、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはその前駆体を、抗原提示プラットフォームと会合しているＬＩＮＥポリペプチドと接触させることを含み、接触はｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。この方法は、ＬＩＮＥポリペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を作製するために有用であり、これらはレトロウイルス感染症、レンチウイルス感染症（たとえばＨＩＶ感染症）、および癌などの障害を治療する方法において有用である。
一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を個体から得て、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、抗原提示プラットフォームと会合しているＬＩＮＥポリペプチドと接触させる。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞の混合集団を個体から得て、ＣＤ８＋Ｔ細胞を混合集団から単離し、未刺激のＣＤ８＋Ｔ細胞集団を作製する。その後、未刺激のＣＤ８＋Ｔ細胞集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原提示プラットフォームと会合しているＬＩＮＥポリペプチドと接触させる。接触ステップは、ＬＩＮＥポリペプチドと結合してＬＩＮＥポリペプチドに特異的となることができるＴ細胞受容体を有する未刺激のＣＤ８＋Ｔ細胞集団の少なくとも一部分を活性化する。
ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む混合細胞集団の供給源は、たとえば全血であることができる。混合細胞集団は、１つまたは複数の方法またはステップで、たとえば、赤血球を除去するため；ＣＤ８＋Ｔ細胞について選択するため；および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞もしくは他の非ＣＤ８＋細胞集団に対して選択するために操作することができる。未刺激のＣＤ８＋細胞の数は、約１０２〜約１０９個の細胞、たとえば、約１０２個の細胞〜約１０３個の細胞、約１０３個の細胞〜約１０４個の細胞、約１０４個の細胞〜約１０５個の細胞、約１０５個の細胞〜約５×１０５個の細胞、約５×１０５個の細胞〜約１０６個の細胞、約１０６個の細胞〜約５×１０６個の細胞、約５×１０６個の細胞〜約１０７個の細胞、約１０７個の細胞〜約５×１０７個の細胞、約５×１０７個の細胞〜約１０８個の細胞、約１０８個の細胞〜約５×１０８個の細胞、または約５×１０８個の細胞〜約１０９個の細胞の範囲であることができる。
抗原提示プラットフォームは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドでパルスしたＡＰＣであることができ、ＡＰＣは、生存しているか、または不活化されていることができる。一部の実施形態では、抗原提示プラットフォームは、ＬＩＮＥポリペプチドが結合しているビーズ（たとえば、プラスチックビーズ、磁気ビーズなど）、または他の粒子である。天然に存在するＡＰＣ以外の抗原提示プラットフォームは当分野で知られており、それだけには限定されないが、ビーズ；不活性化させた表面を操作したウイルス（たとえば、Ｍｏｓｃａ他（２００７）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．、４：３２参照）；人工ＡＰＣ、たとえばリポソーム（たとえば、米国特許公開第２００６／００３４８６５号参照）などが含まれる。
抗原提示プラットフォームには、ＬＩＮＥポリペプチドに加えて、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団、たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子（たとえばＨＬＡクラスＩ分子）などの拡大を刺激するために十分な１つまたは複数の表面分子が含まれる。また、抗原提示プラットフォームには、１つまたは複数の共刺激分子が含まれることもでき、適切な共刺激分子には、それだけには限定されないが、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体などが含まれる）。
未刺激のＣＤ８＋Ｔ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、抗原提示プラットフォームと会合しているＬＩＮＥポリペプチドと接触させ、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が増加する。この方法は、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の１０倍〜１０６倍の増加をもたらす。対象方法によって得られるＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋細胞の数は、約１０３〜約１０９個の細胞、たとえば、約１０３個の細胞〜約１０４個の細胞、約１０４個の細胞〜約１０５個の細胞、約１０５個の細胞〜約５×１０５個の細胞、約５×１０５個の細胞〜約１０６個の細胞、約１０６個の細胞〜約５×１０６個の細胞、約５×１０６個の細胞〜約１０７個の細胞、約１０７個の細胞〜約５×１０７個の細胞、約５×１０７個の細胞〜約１０８個の細胞、約１０８個の細胞〜約５×１０８個の細胞、または約５×１０８個の細胞〜約１０９個の細胞の範囲であることができる。
本開示は、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いた治療方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ＨＩＶ感染症を治療する方法である。他の実施形態では、方法は、癌を治療する方法である。この方法は、一般に、それを必要としている個体に、有効量のＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することを含む。一部の実施形態では、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は自己であり、たとえば、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、混合細胞集団を得た個体と同一の個体に投与する（すなわち、ドナー個体およびレシピエント個体は同一である）。他の実施形態では、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は同種である、たとえば、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、混合細胞集団を得た個体（ドナー個体）と遺伝子的に同一ではない個体（レシピエント個体）に投与する。
一部の実施形態では、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、レシピエント個体に、約１０３〜約１０９個の細胞、たとえば、約１０３個の細胞〜約１０４個の細胞、約１０４個の細胞〜約１０５個の細胞、約１０５個の細胞〜約５×１０５個の細胞、約５×１０５個の細胞〜約１０６個の細胞、約１０６個の細胞〜約５×１０６個の細胞、約５×１０６個の細胞〜約１０７個の細胞、約１０７個の細胞〜約５×１０７個の細胞、約５×１０７個の細胞〜約１０８個の細胞、約１０８個の細胞〜約５×１０８個の細胞、または約５×１０８個の細胞〜約１０９個の細胞の量で、１回または複数回投与する。
診断方法
本発明は、対象ＬＩＮＥポリペプチドまたは対象ＬＩＮＥ組成物を利用する、様々な診断方法を提供する。対象診断方法には、治療に対する患者の応答を監視する方法；疾患の段階を決定する方法；および疾患を検出する方法が含まれる。
一部の実施形態では、対象診断方法は、個体においてＬＩＮＥポリペプチドを産生する癌細胞の存在を検出することを含む。ＬＩＮＥポリペプチドを産生する癌細胞を検出する方法には、免疫学的方法、たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドに特異的な抗体の使用が含まれ、免疫学的アッセイには、たとえば、免疫組織学的アッセイ、および蛍光活性化細胞分析アッセイ（たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドに対する蛍光標識した抗体を用いた蛍光活性化細胞分取アッセイ）が含まれる。
他の実施形態では、対象診断方法は、一般に、個体から得た生体試料中のＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を検出することを含む。ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、たとえば、５１Ｃｒ放出アッセイを用いて決定することができ、ＬＩＮＥペプチドでパルスし、５１Ｃｒで標識した標的細胞を、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有し得る試験試料と接触させる。ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、標的細胞からの５１Ｃｒの放出を測定することによって決定する。
他の実施形態では、対象診断方法は、個体の血清もしくは血漿（または他の生体液）中のＬＩＮＥポリペプチドを検出することを含む。個体から得た生体液中のＬＩＮＥポリペプチドの検出は、たとえば、ＬＩＮＥポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイを使用して実施することができる。適切な免疫学的アッセイには、それだけには限定されないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、タンパク質ブロット（「ウエスタンブロット」）アッセイ、免疫沈降アッセイなどが含まれる。
ＬＩＮＥ特異的抗体
上述のように、一部の実施形態では、対象診断的アッセイでは、ＬＩＮＥポリペプチドに特異的な抗体（「抗ＬＩＮＥ抗体」）を用いる。適切な抗ＬＩＮＥ抗体には、任意のアイソタイプの全抗体；抗ＬＩＮＥ抗体のエピトープ結合断片；ポリクローナル抗体；モノクローナル抗体；人工抗体；単鎖抗体などが含まれる。一部の実施形態では、本発明は、対象ＬＩＮＥポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。対象ＬＩＮＥポリペプチド特異的抗体は、対象診断的アッセイで使用することができる。一部の実施形態では、対象抗体は単離されている。一部の実施形態では、対象抗体は人工または合成である。
モノクローナル抗体は、慣用技術によって生成する。一般に、免疫化した宿主動物の脾臓および／またはリンパが形質細胞の供給源を提供する。形質細胞を骨髄腫細胞との融合によって不死化して、ハイブリドーマ細胞を生成する。個々のハイブリドーマからの培養上清を、標準技術を用いてスクリーニングして、所望の特異性を有する抗体を産生するものを同定する。モノクローナル抗体の産生に適した動物には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギなどが含まれる。抗体は、ハイブリドーマ細胞の上清または腹水から、慣用技術、たとえば、不溶性支持体に結合したタンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー、タンパク質Ａセファロースなどによって精製し得る。
抗体は、通常の多量体構造の代わりに単鎖として生成させ得る。単鎖抗体は、Ｊｏｓｔ他（１９９４）Ｊ．Ｂ．Ｃ．、２６９：２６２６７〜７３、および他のものに記載されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、グリシンおよび／またはセリンを含めた、小さな中性アミノ酸の、少なくとも約４個のアミノ酸をコードするスペーサーとライゲーションさせる。この融合物によってコードされるタンパク質により、元の抗体の特異性および親和性を保持する機能的可変領域のアセンブリが可能となる。
また、適切な抗ＬＩＮＥ抗体には、「人工」抗体、たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生および選択した抗体および抗体断片も含まれる。一部の実施形態では、そのような抗体は、バクテリオファージまたは他のウイルス粒子の表面上に提示される。多くの実施形態では、そのような人工抗体は、それだけには限定されないがＭ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質を含めた、ウイルスまたはバクテリオファージの構造タンパク質を有する融合タンパク質として存在する。そのような人工抗体を産生する方法は、当分野で周知である。たとえば、米国特許第５，５１６，６３７号；第５，２２３，４０９号；第５，６５８，７２７号；第５，６６７，９８８号；第５，４９８，５３８号；第５，４０３，４８４号；第５，５７１，６９８号；および第５，６２５，０３３号を参照されたい。
Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂなどの抗体断片は、無処置のタンパク質の切断によって、たとえば、プロテアーゼまたは化学的切断によって調製し得る。あるいは、切断された遺伝子を設計する。たとえば、Ｆ（ａｂ’）２断片の一部分をコードするキメラ遺伝子には、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域、続いて翻訳ストップコドンをコードするＤＮＡ配列が含まれて、切断された分子が得られる。
一部の実施形態では、抗ＬＩＮＥ抗体は、たとえば、放射性同位体、検出可能な産物を生じる酵素、蛍光タンパク質、色素原タンパク質などで検出可能に標識する。抗ＬＩＮＥ抗体は、特異的結合対のメンバー、たとえばビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）などの、他の部分とさらにコンジュゲートさせ得る。また、抗ＬＩＮＥ抗体は、それだけには限定されないが、ポリスチレンプレートまたはビーズ、磁気ビーズ、試験条片、膜などを含めた固体担体と結合していてもよい。
ＬＩＮＥポリペプチドに特異的な抗体は、直接または間接的に標識することができる。直接標識には、放射性同位体（たとえば、１２５Ｉ；３５Ｓなど）；その産物が検出可能である酵素（たとえば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）；蛍光標識（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリンなど）；ＥＤＴＡなどの金属キレート化基を介して抗体に付着した、蛍光発光金属、たとえば、１５２Ｅｕ、またはランタニド系の他のもの；化学発光化合物、たとえば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など；生物発光化合物、たとえば、ルシフェリン；蛍光タンパク質（たとえば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）等が含まれる。間接標識には、ＬＩＮＥ特異的抗体に特異的な第２の抗体が含まれ、第２の抗体は、上述のように標識し、特異的結合対、たとえばビオチン−アビジンなどのメンバーである。
一部の実施形態では、抗ＬＩＮＥ抗体は、抗体と共有結合した、検出可能なシグナルを提供するタンパク質を含む。適切なタンパク質には、それだけには限定されないが、蛍光タンパク質および酵素（たとえば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）が含まれる。適切な蛍光タンパク質には、それだけには限定されないが、それだけには限定されないがいくつかが市販されているアエクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来するＧＦＰまたはその誘導体；レニラ・レニホルミス、レニラ・ムレリ、またはプチロサルクス・グエルニ（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ ｇｕｅｒｎｙｉ）などの種由来のＧＦＰ（たとえば、ＷＯ９９／４９０１９号およびＰｅｅｌｌｅ他（２００１）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．、２０：５０７〜５１９号に記載）を含めた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；花虫綱の種由来の様々な蛍光および有色タンパク質のうちの任意のもの（たとえば、Ｍａｔｚ他（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：９６９〜９７３、米国特許公開第２００２／０１９７６７６号、または米国特許公開第２００５／００３２０８５号などに記載）が含まれる。
特定の実施形態では、対象診断的アッセイでは、ＬＩＮＥポリペプチドに特異的な抗体を用い、ＬＩＮＥポリペプチドに特異的な抗体は、ＬＩＮＥ−１ ｐ４０に対する結合親和性を有する抗体またはその結合断片、たとえばポリクローナル抗体ＡＨ４０．１を特異的に排除する。
レトロウイルス感染症の治療に対する患者の応答の監視
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド組成物は、レトロウイルス感染症、たとえば、ＨＩＶ感染症、ＨＴＬＶ感染症などの治療に対する患者の応答を監視するために有用である。
したがって、本開示は、レトロウイルス感染症、たとえばＨＩＶ感染症の治療に対する患者の応答を監視する方法をさらに提供する。この方法は、一般に、患者からの白血球（ＷＢＣ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対象ＬＩＮＥポリペプチドと接触させることと；ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答してＷＢＣによって分泌されたサイトカインを検出することとを含む。個体から治療前または治療中のより早い時点に得たＷＢＣによるサイトカイン産生のレベルと比較した、ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答したＷＢＣによるサイトカイン産生の減少は、治療がレトロウイルス感染症の治療に有効であることの指標である（たとえば、ウイルス量の減少の達成、ＣＤ４＋Ｔリンパ球レベルの増加の達成（ＨＩＶ感染症の場合）などにおいて）。適切なＷＢＣには、それだけには限定されないが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、単離したＴリンパ球、単離したＣＤ４＋Ｔリンパ球、単離したＣＤ８＋Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴリンパ球（ＮＫＴ、たとえばＮＫ１．１＋Ｔリンパ球）などが含まれる。
たとえば、一部の実施形態では、対象の監視方法は、ａ）ＷＢＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで対象の合成ＬＩＮＥポリペプチドと接触させることと（ＷＢＣは、患者から、レトロウイルス感染症の治療の開始後の第１の時点に得る）；ｂ）ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答してＷＢＣによって分泌されたサイトカインを検出し、ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答した対照ＷＢＣによるサイトカイン産生のレベルと比較した、ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答したＷＢＣによるサイトカイン産生の減少は、治療がレトロウイルス感染症の治療に有効であることを示すことと（対照ＷＢＣは、患者から、治療の開始前、または第１の時点よりも前の治療中の時点に得る）を含む。
別の例として、一部の実施形態では、対象の監視方法は、ａ）ＷＢＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで対象の合成ＬＩＮＥポリペプチドと接触させることと（ＷＢＣは、患者から、レトロウイルス感染症の治療の開始後の第２の時点に得る）；ｂ）ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答してＷＢＣによって分泌されたサイトカインを検出することを含み、ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答した対照ＷＢＣによるサイトカイン産生のレベルと比較した、ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答したＷＢＣによるサイトカイン産生の減少は、治療がレトロウイルス感染症の治療に有効であることを示し、対照ＷＢＣは、患者から、治療の開始後の、第２の時点よりも早い第１の時点に得る。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチド組成物は、ＨＴＬＶ感染症（たとえば、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩ感染症）の治療に対する患者の応答を監視するために有用である。この方法は、一般に、患者からの白血球（ＷＢＣ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対象ＬＩＮＥポリペプチドと接触させることと；ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答してＷＢＣによって分泌されたサイトカインを検出することとを含む。ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答したＷＢＣによるサイトカイン産生の減少は、治療がＨＴＬＶ−ＩまたはＩＩ感染症の治療に有効であることの指標である（たとえば、ウイルス量の減少の達成、ＣＤ４＋Ｔリンパ球レベルの増加の達成（ＨＩＶ感染症の場合）などにおいて）。適切なＷＢＣには、それだけには限定されないが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、単離したＴリンパ球、単離したＣＤ４＋Ｔリンパ球、単離したＣＤ８＋Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴリンパ球（ＮＫＴ、たとえばＮＫ１．１＋Ｔリンパ球）などが含まれる。
対象の監視方法での使用に適したＬＩＮＥポリペプチドは、アミノ酸６個、アミノ酸７個、アミノ酸８個、アミノ酸９個、アミノ酸１０個、アミノ酸１１個、アミノ酸１２個、アミノ酸１２〜１５個、アミノ酸１５〜１８個、アミノ酸１８〜２０個、もしくはアミノ酸２０〜２５個の長さ、またはそれより長いことができる。適切なＬＩＮＥポリペプチドには、上述のＬＩＮＥポリペプチドのうちの任意のものが含まれる。一部の実施形態では、ＬＩＮＥポリペプチドは、配列番号１〜２２のうちの任意の１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＰＢＭＣから分泌され、対象の患者監視方法で検出されるサイトカインには、それだけには限定されないが、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２が含まれる。
対象の患者監視方法での使用に適した、分泌されたサイトカインを検出する方法には、それだけには限定されないが、免疫学的アッセイ、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または酵素連結免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ；細胞アッセイなどが含まれる。
一部の実施形態では、患者から治療前または治療中のより早い時点に得たＷＢＣによるサイトカイン産生のレベルと比較した、ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答したＷＢＣによるサイトカイン産生の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％またはそれより多くの減少は、レトロウイルス感染症の治療が有効であることを示す。
ＷＢＣを含む患者試料を、治療の前および後、または治療過程中の様々な時点で得て、第１の時点で採取した試料と第２の（後の）時点で採取した試料との間のサイトカイン産生のレベルを比較することができる。
一部の実施形態では、患者から得たＰＢＭＣを、１つまたは複数のＬＩＮＥポリペプチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させ；ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてサイトカイン産生を検出する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは当分野で記載されている。たとえば、Ｌａｌｖａｎｉ他（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６：８５９；および米国特許第５，８５３，６９７号を参照されたい。これらの実施形態では、ＰＢＭＣによって産生されたサイトカインのレベルは、スポット形成単位（ＳＦＵ）の数／１０６個のＰＢＭＣとして表す。ＳＦＵの数の減少は、レトロウイルス感染症の治療が有効であることを示す。
癌治療に対する患者の応答の監視
特定の実施形態では、癌の治療レジメンに対する患者の応答を監視する方法を提供する。たとえば、癌に関連するＬＩＮＥポリペプチドのレベルを、治療レジメンの前、その間、および治療レジメンの後に監視する。
一部の実施形態では、ＬＩＮＥポリペプチドのレベルを、たとえば、血清中、特定の細胞集団の表面上などで監視する。
疾患の段階の決定
本開示は、個体における疾患の段階を決定する方法を提供し、ＬＩＮＥポリペプチドのレベルは、疾患の段階または重症度と関連している。この方法は、一般に、個体から得た生体試料中のＬＩＮＥポリペプチドのレベルを検出することを含む。生体試料中のＬＩＮＥポリペプチドのレベルは疾患または障害の重症度と相関しており、疾患の段階を決定するために使用する。
一部の実施形態では、疾患の段階を決定する対象方法は、個体から得た生体試料中の、対象ＬＩＮＥポリペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数を検出することを含む。一部の実施形態では、ＬＩＮＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、疾患の段階の指標である。
疾患の検出
本開示は、個体において癌などの疾患を検出する方法を提供し、個体から得た生体試料中のＬＩＮＥポリペプチドの存在またはレベルは、生体試料（したがって個体）中に癌細胞が存在することの指標である。この方法は、一般に、個体から得た生体試料中のＬＩＮＥポリペプチドのレベルを検出することを含む。ＬＩＮＥポリペプチドのレベルが正常細胞に関連するレベルよりも高い場合は、これが試料中に癌細胞が存在することの指標である。
一部の実施形態では、異常なＬＩＮＥ発現、たとえば、癌組織（たとえば腫瘍）またはＨＩＶ感染細胞中の異常に増加したＬＩＮＥ−１発現に関連する疾患の検出は、個体から得た生体試料中の、対象ＬＩＮＥポリペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数を検出することを含む。対象ＬＩＮＥポリペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答が生体試料中に存在する場合、これは、個体が異常なＬＩＮＥ発現に関連する疾患に罹患していることの指標である。
治療に適した対象
レトロウイルス感染症の治療
本開示は、レトロウイルス感染症、たとえばレンチウイルス感染症に罹患している個体；レトロウイルス感染症に罹る危険性のある、感染していない個体；レトロウイルス感染症の治療をしたが、治療への応答が失敗した個体；およびレトロウイルス感染症の治療をしたが、再発した個体の治療に適した方法を企図する。一部の実施形態では、「危険性のある」個体とは、レトロウイルス感染症（たとえば、ＨＩＶ感染症などのレンチウイルス感染症）に罹る危険性が一般集団よりも高い個体である。
一部の実施形態では、対象ＬＩＮＥポリペプチドを含む対象免疫原性組成物は、ナイーブ個体、たとえばＨＩＶに感染していない個体に投与する。ナイーブ個体への対象免疫原性組成物の投与は、個体がＨＩＶに感染した場合に、ＨＩＶ感染症による疾患の重症度を減少させることができる、および／またはＨＩＶ感染症を制限することができる、および／またはＨＩＶ感染症のクリアランスを行うことができる。
ナイーブ個体への対象免疫原性組成物の投与は、ＨＩＶ無症状感染、たとえば、ＨＩＶ感染症の症状の発生をもたらさないＨＩＶ感染症のクリアランスをもたらすことができる。たとえば、ナイーブ個体への対象免疫原性組成物の投与は、個体が臨床的ＨＩＶ感染症を発生しないように（たとえば、個体が、血清転換しない、検出可能なＨＩＶウイルス量を発生しない、検出可能なレベルの血清ＨＩＶ抗原を有さないなど）、ＨＩＶ無症状感染のクリアランスをもたらすことができる。
たとえば、本発明の方法は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症に罹患している個体；ＨＩＶ感染症に関してナイーブであるが、ＨＩＶ感染症に罹る危険性のある個体；およびＨＩＶ感染症の治療をしたが、治療への応答が失敗した個体、または最初は治療に応答したが、続いて再発した個体の治療に適している。そのような個体には、それだけには限定されないが、健康な無傷の免疫系を有するが、ＨＩＶに感染する危険性のある、感染していない個体（「危険」個体）が含まれる。危険個体には、それだけには限定されないが、ＨＩＶに感染する可能性が一般集団よりも高い個体が含まれる。ＨＩＶに感染する危険性のある個体には、それだけには限定されないが、ＨＩＶに感染した個体との性行為によりＨＩＶ感染の危険性のある個体；静脈内薬物使用者；ＨＩＶに感染した血液、血液製品、または他のＨＩＶ汚染体液に曝された可能性のある個体；およびＨＩＶに感染した母親によって授乳されている乳児が含まれる。治療に適した個体には、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはその任意の変異体に感染している、または感染する危険性のある個体が含まれる。
ＨＴＬＶ感染症の治療
上述の方法は、個体において、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）感染症、たとえば、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩ感染症を治療するために使用することができる。したがって、対象方法は、ＨＴＬＶに感染した個体；未だＨＴＬＶに感染していないが、ＨＴＬＶに感染する危険性のある個体；および未だＨＴＬＶに感染していないが、将来ＨＴＬＶに感染し得る個体の治療にも適している。
癌治療
特定の実施形態では、対象方法は、ＬＩＮＥの発現に関連する癌を診断された個体の治療に適しており、そのような癌には、それだけには限定されないが、乳癌、卵巣癌、黒色腫、奇形腫、精上皮腫、前立腺癌および精巣癌（奇形腫、精上皮腫、および胚性癌腫またはこれらの種類のうちの１つもしくは複数からなる混合腫瘍を含む）が含まれる。対象方法は、乳癌を診断された個体；卵巣癌を診断された個体；および精巣癌を診断された個体の治療に適している。また、癌を治療する対象方法は、乳癌、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、または精巣癌の治療をしたが、治療への応答が失敗した個体、または最初は応答したが、その後に再発した個体のいずれかの治療にも適している。
自己免疫障害の治療
特定の実施形態では、対象方法は、自己免疫障害を診断された個体の治療に適しており、そのような自己免疫障害には、それだけには限定されないが、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および１型糖尿病が含まれる。一部の実施形態では、この方法は、自己免疫障害の治療をしたが、治療への応答が失敗した個体、または最初は応答したが、その後に再発した個体のいずれかの治療に適している。
以下の実施例は、当業者に、本発明をどのように作製および使用するかの完全な開示および説明を提供するために示し、本発明者らがその発明としてみなす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が、行った実験のすべてこれらの実験しか行っていないことを表すことを意図しない。使用した数値（たとえば、量、温度など）に関して精度を確実にする努力はなされているが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮されたい。別段に指摘しない限りは、部は重量部である、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏、圧力は大気圧付近である。標準の略記、たとえば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロ塩基；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロ塩基；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内；ｉ．ｐ．、腹腔内；ｓ．ｃ．、皮下；ｍＡｂ、モノクローナル抗体などを使用し得る。
（実施例１）
ＬＩＮＥペプチドはヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてサイトカイン産生を刺激する。
方法
患者。ＨＩＶ−１陽性の志願者を本試験用に選択した。この研究は、現地の施設審査委員会によって承認され、対象に書面のインフォームドコンセントを与えた。試験は、様々な患者の時点の凍結保存した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）で行った。
ペプチド選択。候補ＬＩＮＥエピトープは２つの方法で選択した：（１）ＨＩＶ−１中に見つかるペプチド配列に対する類似度に基づく方法および（２）ＬＩＮＥオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ＯＲＦ１およびＬＩＮＥ ＯＲＦ２によってコードされるタンパク質の、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測した免疫原性に基づく方法。
ＨＩＶ−１ペプチドに類似のＬＩＮＥ−１ペプチドは、アルゴリズムの短いほぼ完全一致（ｅ値＝２０００００、ＰＡＭ３０マトリックス、ＳＥＧフィルターＯＦＦ、ワードサイズ＝２）パラメータを用いて、ＨＩＶタンパク質に対するＬＩＮＥアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索で同定した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９７、２５（１７）：３３８９〜４０２）。これらのパラメータは、高度に類似した配列の短い領域の検索に適している。これらのパラメータは、検索のワードサイズを３〜２減少させ、ＳＥＧフィルターを排除し、予測値を１０〜２０，０００以上増加させ、厳密性のより低い類似度マトリックスを使用するオプションを含む（ＢＬＯＳＵＭ６２に対してＰＡＭ３０）。ＬＩＮＥ配列データをＮＣＢＩデータベースおよびＬ１塩基データベース（Ｐｅｎｚｋｏｆｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００４、３３：Ｄ４９８〜Ｄ５００）から得て、検索用にＢＬＡＳＴデータベースにフォーマットしたファイルにコンパイルした。ＨＩＶ ＨＸＢ−２参照株の配列も、検索用に別のＢＬＡＳＴデータベースフォーマットファイルにコンパイルした。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの短いほぼ完全一致のパラメータは、通常はタンパク質の多様性によって圧倒されているペプチド配列間の短い一致の検出を容易にする。タンパク質間の全体的な配列保存は、内在性ウイルスおよびＨＩＶに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答間の任意の相互作用の原因としては比較的重要ではなく、むしろ、そのような相互作用は、エピトープの大きさの領域内のアミノ酸配列の高レベルの類似度または同一性に依存する。既知のＨＩＶエピトープに対して類似度を有する候補ＬＩＮＥペプチドをペプチド合成およびさらなる試験のために選択した。さらに、既知のエピトープ外のＨＩＶタンパク質に対して類似度を有するＬＩＮＥ領域も、さらなる研究のために選択した。
また、ＬＩＮＥ−１からの候補エピトープペプチドを、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測した、ＬＩＮＥ−１ ＯＲＦ１およびＬＩＮＥ−１ ＯＲＦ２によってコードされるタンパク質の免疫原性に基づいて同定した。ＬＩＮＥ−１ ＯＲＦ１およびＯＲＦ２配列は、プロテオソーム切断部位、生じる分解産物の、抗原プロセシング（ＴＡＰ）機構に関連するトランスポーターと結合する最良の潜在性を有するサブセット、およびこれらの分解産物のうちの、様々なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子に対して最良の結合親和性を有するペプチドを同定する、エピトープ予測ソフトウェア（ＮＥＴＣＴＬ（商標））を用いて分析した（Ｌａｒｓｅｎ他、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．３５（８）：２２９５〜３０３．２００５）。この方法に従って同定したＬＩＮＥ−１ペプチドを、図１２に示す表に提供する。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。Ｍｅｉｋｌｅｊｏｈｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、（２００４）２８８、１３５〜４７に記載のように、酵素連結免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ分析を行った。プレートを１６時間、３７℃でインキュベーションした。ＨＩＶおよびＬＩＮＥペプチドの応答比較のために、均等な抗原濃度を用いた。アッセイは、保存した試料からの細胞の回収が原因で単一ウェルの使用が強いられた場合以外は、それぞれの条件について２つ組ウェルで行った。プレートはＡＩＤ ＥＬＩＳＰＯＴ読取器（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で計数した。２つ組ウェルのスポットの合計の平均をとり、すべてのスポット数を、ＩＦＮ−γのスポット形成単位（ＳＦＵ）の数／１×１０６個のＰＢＭＣに対して正規化した。培地対照ウェルからのスポット値を減算して、それぞれのペプチドに対する応答を決定した。培地の減算後に生じるペプチド値が＜０のすべてのものを、さらなる分析のために０と設定した。
結果
図１０に示す表は、ＨＩＶ−１タンパク質に対するＬＩＮＥアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９７、２５（１７）：３３８９〜４０２）を用いて同定した候補ＬＩＮＥポリペプチドを提供する。
図１１に示す表は、ＨＩＶ−１タンパク質に対するＬＩＮＥアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索から生じる、対象ＬＩＮＥポリペプチドとＨＩＶタンパク質配列との間の例示的な配列アラインメントを提供する。垂直線はアミノ酸配列の一致を示し、「＊」は一致しないアミノ酸を示す。「対象」ＨＩＶ−１配列のＮＣＢＩデータベース受託番号を提供する。図１２に示す表は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏエピトープ予測を用いて同定したＬＩＮＥ−１ペプチドを表す。
ＨＩＶ感染細胞中のＬＩＮＥ−１転写物のレベルの増加
ＬＩＮＥ−１転写物のレベルにｉｎ ｖｉｔｒｏで影響を与えるＨＩＶ−１感染の能力を、ＨＩＶ−１感染およびモック感染の対照中の転写物の発現のレベルを比較することによって監視した。平行して、細胞ＤＮＡを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＬＩＮＥ−１のゲノムコピー数の増加について調査した。初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で活性化させ、ＨＩＶ−１−８１ＡのＲ５向性株に感染させた。感染の１４４時間後には、モック感染対照と比較して、ＬＩＮＥ−１転写物のレベルの有意な増加が観察された。１４４時間のＨＩＶ−１−８１Ａ感染培養物中で、ＬＩＮＥ−１の増加したβ−アクチン標準化ＤＮＡ定量が観察された。すべてのＲＮＡ試料をＴｒｉｚｏｌで単離し、逆転写前にＤＮＡｓｅで処理した。トリパンブルー色素排除は、ＨＩＶ−１−８１Ａとモック感染対照との間で同様であった。
ＨＩＶ−１に感染した対象から単離したＰＢＭＣにおけるＬＩＮＥ−１ポリペプチドに特異的な免疫応答の検出
図１３に示す表は、それぞれ配列番号１〜７に対応する単離ＬＩＮＥポリペプチドＬｉＤ９Ｒ、ＬｉＥ１３Ｅ、ＬｉＫ１０Ｉ、Ｌｉｌ９Ｃ、Ｌｉｍ１２Ｔ、ＬｉＮ１３ＶおよびＬｉＱ９ＥのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を提供する。試験ＩＤ２〜３４は感染していない対照を表し、試験ＩＤ４２９〜８４１はＨＩＶに感染した個体を表す。「ＬＩＮＥ」の列は、ＬｉＥ１３Ｅ、ＬｉＫ１０Ｉ、Ｌｉｌ９Ｃ、Ｌｉｍ１２Ｔ、ＬｉＮ１３ＶおよびＬｉＱ９ＥからなるＬＩＮＥポリペプチドのプールに対する応答を表す。ＧａｇおよびＮｅｆの列は、ＧａｇおよびＮｅｆ ＨＩＶタンパク質（それぞれのタンパク質に由来するペプチドのプール）に対する応答を表す。ＰＨＡおよびＳＥＢの列は、陽性対照に対する応答を表す。結果はスポット形成単位（ＳＦＵ）／１×１０６個のＰＢＭＣである。５０未満の値はバックグラウンドであるとみなされ、５０以上の値は肯定応答であるとみなされる。「ＮＴ」の記号は、特定の患者試料を、特定の試験日に示した条件下で試験しなかったことを意味する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果は、ＬＩＮＥポリペプチド抗原刺激に応答したサイトカイン産生を、ＨＩＶに感染した対象に由来するＰＢＭＣ中で検出できることを示す。
図１４に示す表は、それぞれ配列番号８〜１１に対応する単離ＬＩＮＥポリペプチドＬｉＩＶ９、ＬｉＫＩ９、ＬｉＲＶ９、ＬｉＴＶ９のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を提供する。試験ＩＤ３０〜４２は感染していない対照を表し、試験ＩＤ５６２〜６５３はＨＩＶに感染した個体を表す。ＧａｇおよびＮｅｆの列は、ＨＩＶタンパク質ＧａｇおよびＮｅｆ（それぞれのタンパク質に由来するペプチドのプール）に対する応答を表す。ＳＥＢの列は、陽性対照に対する応答を表す。結果はスポット形成単位（ＳＦＵ）／１×１０６個のＰＢＭＣである。５０未満の値はバックグラウンドであるとみなされ、５０以上の値は肯定応答であるとみなされる。「ＮＴ」の記号は、特定の患者試料を、特定の試験日に示した条件下で試験しなかったことを意味する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果は、ＬＩＮＥポリペプチド抗原刺激に応答したサイトカイン産生を、ＨＩＶに感染した対象に由来するＰＢＭＣ中で検出できることを示す。
データは、ＬＩＮＥ転写物の発現およびＨＩＶ−１感染に関連するＬＩＮＥペプチドに向けられたＴ細胞応答の上昇を実証する。ＨＩＶ−１に感染した個体におけるＬＩＮＥに対する自然に生じるＴ細胞応答は、新規ＨＩＶ−１ワクチンのパラダイムとして、応答を感染の初期または危険性のある感染していない個体においてに誘導することの実行可能性を示す。ＨＩＶ−１ワクチンの開発の最大の困難の１つは、ワクチンを用いて誘発させた特異的免疫応答を逃れることを可能にする、ウイルスの変異性を克服することである。ＬＩＮＥはゲノムにコードされる要素であり、ＬＩＮＥ挿入物の制御解除された転写から産生される翻訳産物は、可変性がＨＩＶ−１タンパク質よりもはるかに低いことが予測される。ＬＩＮＥ抗原の産生および提示が細胞のＨＩＶ−１感染の結果である場合、ＬＩＮＥ産物は、ＨＩＶ−１感染を免疫系に伝達する、安定した認識可能な代用マーカーとして役割を果たす。ワクチン接種によって、ＬＩＮＥ代用マーカーを認識するように免疫系を教育することで、ＨＩＶ−１に感染した細胞の死滅が誘導され、可変性の高いＨＩＶ−１抗原を認識する必要性が回避される場合がある。
(実施例２)
ＨＩＶに感染した細胞のＬ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞認識
方法
対象。対象は、カナダ免疫不全研究共同（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ）（ＣＩＲＣ）コホート、カナダ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、およびＳＣＯＰＥコホート、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）の参加者から選択した。慢性進行者は、＞１年間の間ＨＩＶ−１に感染しており、ＣＤ４＋Ｔ細胞計数の低下が＞５０個の細胞／ｍｍ３／年である個体として定義された。ウイルス対照者は、＞１年間の間ＨＩＶ−１に感染しており、ＣＤ４＋Ｔ細胞の計数の低下の証拠が見られず、ウイルス量が＜５，０００個のコピー／ｍｌのｂＤＮＡである個体として定義された。本研究はトロント大学施設審査委員会およびＵＣＳＦヒト研究委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって承認されており、対象は書面のインフォームドコンセントを与えた。試験は、凍結保存したＰＢＭＣで解凍直後に行った。
Ｌ１−ｐ１５０タンパク質発現の免疫沈降／ウエスタンブロット分析。ＨＩＶ−１に感染していないドナーからＰＢＭＣを得た。Ｅａｓｙｓｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、１０％のＦＢＳ、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、および５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＲＰＭＩ培地（Ｈｏｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）中の、ＣＤ３およびＣＤ２８に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、４８時間刺激した。これらの細胞を２つの等しいアリコートに分割し、そのうちの一方を０．０５ＭＯＩのＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染させ、他方をモック感染対照として維持した。感染後の示した時点（４８および１７０時間）に、１０６個の細胞を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加した放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液で溶解した。免疫沈降は、シーズタンパク質Ｇ（Ｓｅｉｚｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）免疫沈降キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、製造者の指示に従って行った。タンパク質を、５ｍｇの全細胞溶解液タンパク質から、４０μｇのヤギポリクローナル抗Ｌ１−ｐ１５０ Ｓ１９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて免疫沈降した。これらの溶出液を、ＹＭ−５０ ５０ｋＤａの分子量カットオフのマイクロコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてそれぞれ約５０μｌまで濃縮した、３つの等しい部分に分割し、ＮｕＰａｇｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコルに従って、３つの別々のゲル上の還元性ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。タンパク質を、ポリ（フッ化ビニリデン）（ＰＶＤＦ）膜に１時間、１００Ｖで移した。ウエスタンブロットは、１：２００希釈の抗Ｌ１−ｐ１５０ Ｓ１９およびＣ１６抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、次いで１：１０，０００希釈のロバ抗ヤギＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、および１：１０，０００希釈の抗ＨＩＶ−１−ｐ２４抗血清（ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラム（ＮＩＨ ＡＩＤＳ ｒｅａｇｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）カタログ番号４２５０）、次いで１：１０，０００希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でプロービングする、標準の手順によって行った。
エピトープ選択およびペプチド合成。Ｂｒｏｕｈａ他（（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：５２８０）によって提示されている「ホット」Ｌ１要素のコンセンサスヌクレオチド配列を翻訳して、Ｌ１のＯＲＦ１およびＯＲＦ２のアミノ酸配列を誘導した。これらの配列をＮｅｔＣＴＬアルゴリズム（インターネット上のｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＣＴＬ／）にアップロードして、Ａ２およびＢ７スーパーファミリーエピトープの両方を予測した。これらのスーパーファミリーのそれぞれの、最上位スコアの予測されたエピトープを、両方について高いスコアを有し、したがって幅広い反応性の潜在性を有するペプチドを選択しする目的で相互参照した。ペプチドは、標準の９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニル（ＦＭｏｃ）化学によって合成した。たとえば、「Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成：実用的な手法（Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｗ．Ｃ．ＣｈａｎおよびＰ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ編（２０００）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
ＥＬＩＳＰＯＴ。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、標準の手順を用いて行った（参考文献）。細胞を１０５個のＰＢＭＣ／ウェルで播種した。Ｌ１エピトープを表す個体ペプチドを１０μｇ／ｍｌで使用し、ＣＭＶ ｐｐ６５プールを５μｇ／ｍｌ／ペプチドで、ＨＩＶ−１ビッグプールを１μｇ／ｍｌ／ペプチドで使用した。インキュベーションは、１６時間、３７℃、５％のＣＯ２で行った。
ＣＤ８＋Ｔ細胞のクローニング。２つの異なるクローニング方法を本研究で用いた：抗原特異的細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大によって濃縮する標準プロトコル、抗原特異的細胞を磁気捕捉によって濃縮したおよび磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）方法。
手短に述べると、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ペプチドを用いて、全ｅｘ ｖｉｖｏ ＰＢＭＣのコンテキスト中で１６時間刺激した。この刺激に応答してサイトカイン（たとえばＩＦＮ−γ）を産生するＣＤ８＋Ｔ細胞をサイトカイン捕捉試薬で標識し、磁気ビーズを用いた特異的標識を可能にした（ＩＦＮ−γ−分泌アッセイ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）。その後、これらの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をバルク集団から磁気分離によって濃縮し、段階希釈で播種し、ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）およびＣＤ２８（クローンＣＤ２８．７）に対するｍＡｂ（どちらもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）を用いて、照射した同種ＰＢＭＣおよびＢ細胞リンパ腫系を使用して拡大した。
濃縮後、細胞を段階希釈で照射した支持細胞上に播種した。限界希釈の抗原特異的クローンを２回目の限界希釈に供した後、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｈｏｆｆｍａｎ Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＰＭＩ １０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で拡大および維持し、照射した支持細胞を隔週で加えた。クローン「Ｌ１−３Ｏ」がＭＡＣＳ方法によって得られた。
ＨＩＶ−１感染。ＮＬ４−３および８１ＡのＨＩＶ−１ストックは、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質移入し、４日後に上清を収集することによって調製した。多様なクレードのＨＩＶ−１を表す初代単離体は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラムから受け取ったままの状態で使用した。活性化した初代ＣＤ４＋Ｔ細胞標的は、標準の方法によって調製した。ｐ２４抑制アッセイおよび免疫沈降／ウエスタンブロット以外のすべての実験において、以前に記載されているように（Ｓａｃｈａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７；１７８：２７４６〜２７５４）、高レベルの感染を得るためにマグネトフェクションを用いた。ｐ２４抑制アッセイには、０．０２感染多重度（ＭＯＩ）のＨＩＶ−１を標的細胞に１時間加え、その後、洗い流し、感染を３７℃、５％のＣＯ２で進行させた。
認識アッセイ。ＨＩＶ−１に感染した細胞の認識についてＣＤ８＋Ｔ細胞クローンおよび系を試験することは、以前に記載されているように行った（Ｓａｃｈａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７；１７８：２７４６〜２７５４）。手短に述べると、再刺激の約２週間後、ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター系およびクローンをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１：１の比（少なくともそれぞれ２×１０４個）のＨＩＶ−１およびモック感染ＣＤ４＋Ｔ細胞標的と合わせた。動力学的アッセイには、感染細胞を感染後の指定した時間に加えた。エフェクターおよび標的を３７℃、５％のＣＯ２で１時間、一緒に培養した。ＣＤ１０７ａが読取りとして示された実験では（たとえばＴＯ２）、５μｇ／ｍｌのＰＥとコンジュゲートした抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ（ＢＤ）をこの段階で加えた（１時間の同時培養の前）。その後、ブレフェルジンＡを１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、インキュベーションをさらに５時間進行させた。その後、細胞を、ＣＤ４およびＣＤ８に対するｍＡｂを用いて表面染色し、ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；ＢＤ）を用いて透過処理し、その後、ｍＡｂ（ＢＤ）を用いてインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）または腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）のどちらかについて染色した。フローサイトメトリーは、ＬＳＲＩＩまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置のどちらか（どちらもＢＤ）で行った。
排除アッセイ。標的自己、またはＨＬＡミスマッチＣＤ４＋Ｔ細胞を、マグネトフェクション（上記参照）によってＨＩＶ−１に同時感染させた。感染の２時間後、標的細胞を、洗浄したＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター系およびクローン（最近の再刺激の少なくとも３週間後）と１：１で混合した。標的およびエフェクターを４８時間、３７℃、５％のＣＯ２で同時培養した。細胞を、ＣＤ４およびＣＤ８に対する蛍光色素とコンジュゲートしたｍＡｂ（ＢＤ）ならびにアミンレッド生存度色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で表面染色した。ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ）を用いた透過処理後、細胞を、ＨＩＶ−１−Ｇａｇに対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートしたモノクローナル抗体（クローンＫｃ５７、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で染色した。分析はＬＳＲＩＩフローサイトメトリー装置（ＢＤ）で行った。
ｐ２４産生の抑制。自己およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ミスマッチＣＤ４＋Ｔ細胞標的をＨＩＶ−１ ＮＬ４−３に感染させ（上記ＨＩＶ−１感染参照）、２×１０４個の細胞／ウェルで９６ウェルの丸底プレートに播種した。ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターを最新の再刺激の３週間後に採取し、ＰＢＳで２×洗浄し、所望の比でウェルに加えた。エフェクター／標的の混合物を、合計体積２００μｌの、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＲＰＭＩ−１０％のＦＢＳ中でインキュベーションした。感染の９日後、１００μｌの培地を取り出し、ｐ２４酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（ＮＣＩ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）によって、製造者の指示に従ってアッセイした。ｐ２４の濃度は、ＮＣＩ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋによって供給されるｐ２４標準を用いた検量線に基づいて計算した。
ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの遮断。抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体（クローンＧ４６−２．６）、およびマウスＩｇＧ１対照抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。標的およびエフェクター集団を上述のように調製した。標的およびエフェクターを同時培養する前に、感染した標的細胞を、１０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃまたはアイソタイプ対照と共に、３０分間、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベーションした。その後、エフェクターおよび標的細胞を上述のように同時培養し、認識について評価した。
結果
Ｌ１ ｐ１５０はＨＩＶ−１に感染した細胞中で検出可能であるが、非感染の初代ＣＤ４＋Ｔ細胞中では検出可能でない。
ＣＤ４＋Ｔ細胞をＨＩＶ−１に感染していない個体由来のＰＢＭＣから濃縮し、ＣＤ３およびＣＤ２８に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて４８時間刺激した。続いて、これらの細胞を、０．０５ＭＯＩで標準の感染プロトコルを用いて、ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染させるか、モック感染対照として維持した（方法参照）。細胞を、感染の４８および１７０時間後の時点に、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。全細胞溶解液からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＳ１９およびＣ１６抗Ｌ１−ＯＲＦ２ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を用いたウエスタンブロットによって分析した。これらの研究では、予測された分子量１５０ｋＤａでいかなるバンドを検出することも失敗した。本アッセイの感度を増加させるために、本発明者らは、ウエスタンブロット分析の前に免疫沈降ステップを含めた。上記試料の全細胞溶解液からの５ｍｇのタンパク質を、抗Ｌ１ ｐ１５０ Ｓ１９抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたシーズクラシック（Ｇ）免疫沈降キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して免疫沈降した。保持された画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、Ｓ１９抗体、または抗Ｌ１−ｐ１５０ Ｃ１６抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のどちらかを用いたウエスタンブロットでプロービングした。
ウエスタンブロットをＳ１９またはＣ１６のどちらかでプロービングした場合では、ＨＩＶ−１ ＮＬ４−３感染の１７０時間後の試料中で、予測されたＬ１−ｐ１５０の分子量１５０ｋＤａにバンドが観察された（図１Ａ、Ｂ）。このバンドは、モック感染試料、およびＨＩＶ−１感染の４８時間後の試料の両方では存在しなかった。Ｌ１−ｐ１５０−Ｓ１９免疫沈降画分を抗ＨＩＶ−１−Ｇａｇでプロービングした場合は、バンドは検出されなかった。これらのデータは、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＩＶ−１感染がＬ１−ｐ１５０の発現をもたらすことを実証している。免疫沈降およびウエスタンブロット後にかすかなバンドしか検出されなかったことは、Ｌ１−ｐ１５０が、ＨＩＶ−１感染細胞中で低レベルでしか発現されていないことを示している。このことは、高レベルのＬ１−ｐ１５０の発現は毒性があることを示す最近のデータと矛盾しない（Ｗａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｅ．、２００８；４１８（１〜２）：７５〜８１）。しかし、低レベルのＬ１ ｐ１５０の発現が、細胞免疫応答を刺激するために十分であり得る。
図１Ａおよび１Ｂ．Ｌ１−ｐ１５０は、ＨＩＶ−１に感染した初代ＣＤ４＋Ｔ細胞中で発現される。ＨＩＶ−１に感染していない個体からの初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を、４８時間の抗ＣＤ３／ＣＤ２８を用いた刺激によって活性化した。その後、細胞を２つのアリコートへと分割し、０．０５ＭＯＩのＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染させるか、またはモック感染対照として維持した。アリコートを感染（またはモック感染）の４８および１７０時間後に採取し、プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。溶解物をポリクローナル抗Ｌ１−ｐ１５０抗体Ｓ１９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で免疫沈降した。これらの免疫沈降からの溶出液を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗Ｌ１−ｐ１５０抗体Ｓ１９または抗Ｌ１−ｐ１５０抗体Ｃ１６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のどちらかを用いたウエスタンブロットでプロービングした。図１Ａ．Ｓ１９抗体で免疫沈降し、Ｃ１６抗体でプロービングした試料のウエスタンブロット。図１Ｂ．Ｓ１９抗体で免疫沈降およびプロービングをどちらも行った試料のウエスタンブロット。それぞれのブロットのレーン１にはＰａｇｅＲｕｌｅｒタンパク質ラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を載せ、レーン２には大腸菌中で発現されるＬ１−ｐ１５０のエンドヌクレアーゼドメインを載せた（ｐ１５０検出の陽性対照であるが、Ｌ１−ＯＲＦ２ｐの断片でしかないため、はるかに小さな分子量で流れる）。５５ｋＤａおよび２５ｋＤａの濃いバンドは、免疫沈降で用いた抗体の重鎖および軽鎖を表す。Ｓ１９およびＣ１６はどちらもヤギに由来するため、二次抗体は、プロービングおよび免疫沈降のどちらで使用した抗体とも反応する。陽性対照Ｌ１−エンドヌクレアーゼドメインは免疫沈降しなかったため、これらのバンドはこのレーンに存在しない。
Ｌ１に対する細胞免疫応答はＨＩＶ−１に感染した個体からのＰＢＭＣ中で検出可能である。
コンセンサス「ホット」Ｌ１ ｐ４０およびｐ１５０配列を、ＮｅｔＣＴＬアルゴリズムを用いて分析して、潜在的なＨＬＡ Ａ０２、Ｂ０７、およびＢ５８制限Ｔ細胞エピトープを予測した。７個のｐ４０および１０個のｐ１５０エピトープに対応するペプチドを作製し、多様な臨床特徴を有する６０人のＨＩＶ−１に感染した個体（ＳＣＯＰＥコホート、ペプチド配列には図１３に示す表、対象の特徴には図１６に示す表を参照）、および２７人の危険性の低いＨＩＶ−１に感染していない個体からのＰＢＭＣ中でＩＦＮ−γ産生を刺激するその能力について、ＥＬＩＳＰＯＴによって試験した。ＨＩＶ−１に感染した個体において、ｐ４０およびｐ１５０のどちらに由来するエピトープにも対する頻繁なＩＦＮ−γ応答、ならびにＨＩＶ−１に感染していない個体における応答の欠如が観察された（図２）。
図２．ＨＩＶ−１に感染した個体の末梢血中ではＬ１に対する免疫応答が存在するが、感染していない個体では存在しない。６０人のＨＩＶ−１に感染した個体および２７人のＨＩＶ−１に感染していない対象からの凍結保存したＰＢＭＣを、１０５個の細胞／ウェルで、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、合成Ｌ１ ｐ４０（ＯＲＦ１ｐ）およびｐ１５０（ＯＲＦ２ｐ）ペプチドに対する応答性について試験した。ＯＲＦ１ｐペプチドは接頭文字「Ｌ１Ｏ１」によって示し、ＯＲＦ２ｐは接頭文字「Ｌ１Ｏ２」によって示す。ペプチドの配列および特徴は、図１５に示す表に示す。ＨＩＶ−１に感染した対象の情報は、図１６および１７に表す表に示す。
Ｌ１ ｐ１５０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンはＨＬＡに制限された様式でＨＩＶ−１に感染した細胞を特異的に認識する。
Ｌ１−ｐ１５０エピトープ「ＫＶＩＹＲＦＮＡＩ」（ＫＩ９；配列番号１０）に特異的な６個のＣＤ８＋Ｔ細胞クローン、および２個のＣＭＶ−ｐｐ６５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、ＨＡＡＲＴなしに＞１０年間の間検出不可能なウイルス量を維持したＨＩＶ−１に感染した個体から得た。これらのクローンを、以前に記載されている細胞内サイトカイン染色に基づいた認識アッセイを用いて、自己のＨＩＶ−１感染細胞に対して特異的に応答するその能力について試験した（Ｓａｃｈａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７；１７８：２７４６〜２７５４）。手短に述べると、ＣＤ４＋Ｔ細胞を自己ＰＢＭＣから濃縮し、ＨＩＶ−１ ＮＬ４−３に感染させるか、またはモック感染対照として維持した。クローンを、モック感染、ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染した標的、および同族ペプチドでパルスしたモック感染標的と共に６時間同時培養し、ＣＤ１０７ａ染色およびクローンからのＩＦＮ−γ産生のレベルをフローサイトメトリーによって評価した。これらのデータを図３Ａに要約する。
試験したすべてのＬ１−ｐ１５０−ＫＩ９およびＣＭＶ−ｐｐ６５に特異的なクローンによる、ペプチドでパルスしたモック感染標的の認識が観察された。６個のＬ１−ｐ１５０−ＫＩ９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのそれぞれについて、ＨＩＶ−１に感染した標的細胞の強い認識が観察された。これは、ＣＭＶ−ｐｐ６５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンによるＨＩＶ−１に感染した標的細胞の認識の欠如と対照的である。図３Ｂ〜Ｅは、Ｌ１−ｐ１５０−ＫＩ９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン「Ｌ１−３Ｏ」の詳細なデータを示す。ＫＩ９エピトープは、ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３中のどの配列とも高い度合いの同一性を保有しない（最高で、ＮＬ４−３配列：ＮＣＢＩ受託番号Ｍ１９９２１とのｃｌｕｓｔａｌｗアラインメントによる１／９個のアミノ酸同一性）。
Ｌ１−ｐ１５０−ＫＩ９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンがＨＩＶ−１由来のペプチドを直接相互認識することは期待されていなかった。しかし、この可能性は、Ｌ１−３Ｏ−ＫＩ９クローンが、すべてのＨＩＶ−１コンセンサス配列遺伝子産物にわたる重複する１５量体のプール、「ＨＩＶ−１−ビッグプール」に対して、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって応答するかどうかを試験することによって、直接検査した。このクローンは、ＨＩＶ−１−ビッグプールを認識することに失敗した一方で、その同族Ｌ１−ｐ１５０ペプチドの強力な認識を示す。平行して、同じ個体から得られたＨＩＶ−１−Ｇａｇ特異的クローンを、ＨＩＶ−１−ＧａｇプールおよびＨＩＶ−１−ビッグプールの両方を認識する能力について試験し、どちらのプールに対しても同様の規模の応答が観察された（図３Ｂ）。次に、クローンＬ１−３Ｏを、自己およびＨＬＡミスマッチＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染したおよびモック感染標的細胞の認識について試験した。自己のＨＩＶ−１感染標的細胞の強力な認識が観察され、高レベルのＣＤ１０７ａ染色、およびＩＦＮ−γの産生が明示された（８９．２％のＣＤ１０７ａ＋ＩＦＮ−γ＋）（図３Ｃ）。これは、モック感染自己標的（２３．８％のＣＤ１０７ａ＋ＩＦＮ−γ＋）、またはモックもしくはＨＩＶ−１のどちらかに感染したＨＬＡミスマッチ標的（それぞれ１４．１％および１１．２％のＣＤ１０７ａ＋ＩＦＮ−γ＋）との同時培養後に、ＣＤ１０７ａ＋またはＩＦＮ−γ＋クローン細胞のどちらかが低頻度であることと対照的である。この実験をさらに４回繰り返し、同様の結果となった。一緒にすると、これらのデータは、Ｌ１−ｐ１５０特異的Ｔ細胞が、ＨＩＶ−１ペプチドを直接認識せずに、ＨＬＡに制限された様式でＨＩＶ−１に感染した細胞を認識することを支持している。
自己細胞の認識がＨＩＶ−１の用量に依存しているかどうかを決定するために、クローンＬ１−３Ｏエフェクター細胞を、１．６×１０−４〜２．０×１０−２の範囲のＭＯＩの４倍段階希釈のＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染した等数の自己ＣＤ４＋Ｔ細胞標的、およびモック感染対照と混合した。上記のように、ＣＤ１０７ａに対するｍＡｂを同時インキュベーションに含め、ＣＤ１０７ａ染色は、クローン応答性の読取りとしてフローサイトメトリーによって評価した。ＣＤ１０７ａ染色は、モック感染の０．５６％のＣＤ１０７ａ＋から２×１０−２のＭＯＩの１６．７％のＣＤ１０７ａ＋の範囲の、増加するＨＩＶ−１力価に伴って、用量依存的な様式で増加した（図３Ｄ）。Ｌ１特異的クローンがＨＩＶ−１感染細胞を認識する動力学的を検査した（図３Ｅ）。高力価のＨＩＶ−１および以前に記載したマグネトフェクションプロトコルを用いて、標的細胞のＨＩＶ−１感染を同期した（Ｓａｃｈａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７；１７８：２７４６〜２７５４）（方法参照）。感染後の様々な時点に、Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを感染した標的と１時間混合し、その後、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）で治療し、さらに５時間インキュベーションした。図３Ｅ中に示す時間は、標的およびクローンを最初に混合した感染後の時間を表す。ＢＦＡの添加は、新しく産生されたペプチド：ＭＨＣ複合体が細胞表面へと輸送されることを防止し、したがって、培養物上のＴ細胞に提示されたエピトープが、ＢＦＡの添加時存在するものに限定される。以前の実験と同様、ＣＤ１０７ａおよびサイトカイン染色をクローン刺激の読取りとして用いた。図３Ｅに示すデータは、クローン細胞上のＴＮＦ−α染色を表し、ＣＤ１０７ａまたはＩＦＮ−γを読取りとして使用することで、比較可能な動力学的がもたらされる。Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンによる標的の認識はＨＩＶ−１感染の２時間以内に一貫して観察され、応答のピークは１２時間で８２．４％のＴＮＦ−α＋であった。
図３Ａ〜Ｅ．Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は感染の２時間以内にＨＩＶ−１感染細胞を特異的に認識する。Ａ．６個のＬ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンおよび２個のＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、エリートコントローラーＨＩＶ−１感染個体から限界希釈方法によって得た。これらのクローンを、ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染した、モック感染対照として維持した、または同族ペプチドでパルスした自己ＣＤ４＋Ｔ細胞標的と同時培養した。標的細胞の認識は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０７ａ、およびＩＦＮ−γに対するｍＡｂを用いた細胞内サイトカイン染色フローサイトメトリーによって評価した。モック感染細胞に対するバックグラウンド応答を減算した後の％のＩＦＮ−γ産生クローン細胞（ＣＤ８＋ゲート）を示す。Ｂ．クローンは、同族ペプチドに対する応答性、およびＨＩＶ−１ビッグプール（すべてのＨＩＶ−１遺伝子産物にわたる１５量体ペプチドからなる）に対する交差反応性について、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって確認された。３つ組で試験したＬ１−ＯＲＦ−２−ＫＶＩＹＲＦＮＡＩ（配列番号１０）エピトープに特異的なクローン「Ｌ１−３Ｏ」からの結果を示す。また、平行して、ＨＩＶ−１−Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、Ｇａｇプールペプチド、およびＨＩＶ−１ビッグプールに対する応答性について試験したことも示す。どちらのクローンにも、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を陽性対照として用いた。Ｃ．Ｌ１ｐ１５０−ＫＶＩＹＲＦＮＡＩ（配列番号１０）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＬ１−ＫＩ９−３Ｏの代表的な認識アッセイデータを示す。Ｄ．Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＬ１−ＫＩ９−３Ｏを、０〜０．０２ＭＯＩのＨＩＶ−１−ＮＬ４−３の段階希釈に感染した自己ＣＤ４＋Ｔ細胞標的の認識について試験した。認識は、フローサイトメトリー、刺激期間の開始時にｍＡｂを加えた脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの染色によって評価した。Ｅ．クローンＬ１−ＫＩ９−３Ｏを、ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３の感染の０、２、６、１２、および２４時間後における自己ＣＤ４＋Ｔ細胞標的の認識について試験した。標的の同時ＨＩＶ−１感染はマグネトフェクションによって達成した（方法参照）。ペプチドのＭＨＣ−Ｉ提示は、ブレフェルジンＡを添加することによって示した時点で停止させ、刺激をさらに５時間進行させた。
Ｌ１ ｐ１５０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンはＨＩＶ−１に感染した細胞を特異的に排除し、ウイルス複製を抑制する。
Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンによるＨＩＶ−１感染細胞の認識が、ＨＩＶ−１に感染した細胞の排除をもたらすかどうかを決定した。標的自己、またはＨＬＡミスマッチＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＨＩＶ−１ ８１ＡのＮＬ４−３／Ｂａ−Ｌキメラクローン（Ｂａ−Ｌに由来し、ＣＣＲ５向性を与えるｅｎｖのＶ１〜Ｖ３領域を例外として、８１ＡはＮＬ４−３の類遺伝子である）に、マグネトフェクションによって同時感染させた。感染の２時間後、標的細胞を、ＰＢＭＣで十分に洗浄した後のＬ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＬ１−３Ｏと１：１で混合したか、または追加のエフェクターなしで平行に維持した。標的およびエフェクターを４８時間同時培養した。その後、細胞をＣＤ４およびＣＤ８について表面染色し、ＰＥとコンジュゲートしたｍＡｂ、クローンＫｃ５７（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＨＴＶ−１−Ｇａｇについて細胞内染色した。フローサイトメトリー分析により、Ｌ１−３Ｏ−ＫＩ９を存在させずに培養した場合に、自己およびＨＬＡミスマッチ標的細胞の強い感染が明らかとなった（それぞれ２４．５％および３１．５％）。Ｇａｇ＋標的細胞の頻度の劇的な減少が、Ｌ１−３Ｏ−ＫＩ９と同時培養した自己細胞で観察され、Ｇａｇ＋標的細胞の頻度の緩和な減少のみがＨＬＡミスマッチ対照で観察された（独立した自己排除アッセイで９３．１％および９２．７％の減少に対して、独立したＨＬＡミスマッチ排除アッセイで３０．５％および３１．１％の減少）（図４Ａ）。したがって、Ｌ１−ｐ１５０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＬ１−３Ｏ−ＫＩ９は、ＨＩＶ−１に感染した初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に排除する。
Ｌ１−３Ｏ−ＫＩ９が、ＨＩＶ−１に感染した細胞を感染後（２時間以内）に非常に迅速に認識し、ＨＩＶ−１に感染した細胞を排除する能力を考慮して、本発明者らは、このクローンが用量依存性様式でＨＩＶ−１−複製をｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制すると仮説をたてた。自己およびＨＬＡミスマッチＣＤ４＋Ｔ細胞標的を、標準の感染プロトコルを用いて０．０２ＭＯＩのＨＩＶ−１ ＮＬ４−３に感染させた（マグネトフェクションではない、プロトコル参照）。これらの標的細胞を２×１０４個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターを最新の再刺激の３週間後に採取し、ＰＢＳで洗浄し、１：１〜１：３１２５のエフェクター：標的の比の範囲の５倍段階希釈で加えた。それぞれのエフェクター：標的の比を３つ組で試験し、標的のみおよびエフェクターのみの対照も同様である。同じ個体からの、Ｌ１−３Ｏ−ＫＩ９ Ｌ１−ｐ１５０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンおよびＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、どちらも自己およびＨＬＡミスマッチ標的細胞に対して試験した。感染後９日目に、上清をＨＩＶ−１粒子産生の読取りとしてｐ２４ ＥＬＩＳＡによってアッセイした（ＮＣＩ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）。自己標的細胞からのｐ２４の産生はＬ１−３Ｏ−ＫＩ９クローンによって強力に抑制され、最大の抑制は１：４のエフェクター：標的の比で観察された（図４Ｂ）。したがって、Ｌ１−ｐ１５０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＬ１−３Ｏ−ＫＩ９は、ＨＩＶ−１−ウイルス粒子の産生を強力に阻害する。
図４Ａおよび４Ｂ．Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンによるＨＩＶ−１に感染した細胞の排除およびウイルス産生の抑制。Ａ．ＣＤ４＋Ｔ細胞標的をマグネトフェクションによってＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に同時感染させた。Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＬ１−３Ｏ−ＫＩ９を感染した自己およびＨＬＡミスマッチ標的に１：１の比で加えた。対照感染培養物を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の添加なしで平行に維持した。感染を１８時間進行させ、この時点で、細胞をＣＤ４に対するｍＡｂで表面染色し、ＨＩＶ−１−Ｇａｇに対するｍＡｂ（Ｋｉ６７、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で細胞内染色した。ＨＩＶ−１−Ｇａｇ（ｘ軸）対ＣＤ４（ｙ軸）のフローサイトメトリープロットを示す。クローン抑制は２つ組で示す。Ｂ．ＣＤ４＋Ｔ細胞標的を０．０２ＭＯＩのＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染させ、１５，０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞クローン（Ｌ１−３Ｏ）を所与の比で加え、感染を９日間進行させた。この時点で、上清中のＨＩＶ−１−ｐ２４レベルを、３つ組で既知のｐ２４濃度の標準と共に試験した。検量線に基づいて計算したｐ２４の濃度を示す。誤差バーは標準偏差を表す。
Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、多様なＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の単離体に感染した細胞を包括的に認識する。
Ｌ１特異的Ｔ細胞は、ＨＩＶ−１に感染した細胞の表面上に提示される、安定してゲノムにコードされるＬ１抗原を認識するため、これらの細胞の認識は、ＨＩＶ−１−配列の可変性とは独立しているはずである。５個の研究室に適応した単離体および３７個の初代単離体を含む４２個の多様なＨＩＶ−１ウイルスのパネルを、ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラムから獲得した。クレードによるこれらの初代単離ウイルスの分類は、クレードＢ−９個の単離体、クレードＣ−１０個の単離体、クレードＤ−４個の単離体、クレードＡ−８個の単離体、クレードＥ−１個の単離体、クレードＧ−１個の単離体、ＣＲＦＯ１＿ＡＥ−２個の単離体、ＣＲＦＯ２＿ＡＧ−２個の単離体であった。向性では、パネルは、４個のＣＸＣＲ４向性ウイルス、２７個のＣＣＲ５向性ウイルス、２個の二重向性ウイルス、および４個の未知の向性のウイルスを含む。ＮＣＢＩ受託番号を含めたこれらの単離体の詳細は図１８に示す表に示す。この多様なＨＩＶ−１のパネルに加えて、ＨＩＶ−２の単離体「６０１４５Ｋ」をＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラムから得た。
図１８に示す表中の実験コードは以下のとおりである：ＴＯ１：最初の多様な単離体認識アッセイ（カナダ、Ｔｏｒｏｎｔｏで行った）；ＳＦ１：多様な単離体認識アッセイ（カリフォルニア州Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏで行った）；ＴＯ２：多様な単離体認識アッセイ（カナダ、Ｔｏｒｏｎｔｏで行った）。
Ｌ１−ｐ１５０特異的クローンＬ１−３Ｏ−ＫＩ９を、上述のフローサイトメトリーアッセイを用いて、自己およびＨＬＡミスマッチ初代ＣＤ４＋Ｔ細胞の認識について試験した。パネルを３つの別々の実験：「ＴＯ１」、「ＳＦ１」、および「ＴＯ２」で試験した。これらの実験の日付およびそれぞれで試験したウイルスを図１８に示す表に示す。ＴＯ１のデータを図５に示し、図６をＳＦ１、図７をＴＯ２に示す。それぞれの実験で、モック感染対照を、非感染の自己ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するクローンＬ１−３Ｏのバックグラウンド応答性の測度として用いた。追加の対照の様々な組をそれぞれの実験に組み込み、応答性の様々な読取りを用いた。ＴＯ１（図５）ＣＤ１０７ａ染色（脱顆粒）およびＴＮＦ−α産生を認識の読取りとして用いた。
試験したＨＩＶ−１単離体のそれぞれに感染した自己標的の認識およびＨＩＶ−２に感染した自己標的の認識が観察された。ＨＬＡミスマッチＣＤ４＋Ｔ細胞をＨＩＶ−１−１１６５ＭＢおよびＨＩＶ−１−ＩＩＩＢに感染させ、Ｌ１−３Ｏクローンをこれらの標的の認識について試験し、これはＭＨＣ−Ｉ非依存性の認識を示す。これらの対照の認識は観察されなかった。平行して、クローンＬ１−３Ｏが、自己またはＨＬＡミスマッチＣＤ４＋細胞標的のどちらかによって提示されるその同族ペプチド「ＫＩ９」を認識する能力を試験した。ペプチドでパルスした自己標的のみの認識が観察された。この実験で用いた追加の対照は、Ｌ１−３Ｏと同じ個体に由来するＣＭＶ−ｐｐ６５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、ＨＩＶ−１に感染した自己標的細胞の認識について試験することであった。このＣＭＶ−ｐｐ６５特異的クローンを用いた認識の欠如が観察され、Ｌ１−ｐ１５０特異的クローンＬ１−３ＯによるＨＩＶ−１に感染した細胞の認識の特異的性質がさらに支持された（図５）。
図５Ａ〜Ｅ．多様なＨＩＶ−１パネルおよびＨＩＶ−２を用いたＬ１特異的Ｔ細胞クローン認識アッセイ。図３に詳述した認識アッセイを、多様なＨＩＶ−１単離体のパネル、およびＨＩＶ−２ ６０１４５Ｋに感染した初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて、クローンＬ１−３Ｏで繰り返した（ウイルスの詳細には図１８に示す表参照）。ＣＤ１０７ａをＴＮＦ−αによる脱顆粒のマーカーとしてプロットした、ＣＤ８＋細胞（クローン）でゲートしたフローサイトメトリーデータを示す。図５Ａおよび５Ｂは、所与のウイルスに感染した自己細胞に対するクローンの応答を示す（モック＝非感染、モック＋ＫＩ９ペプチド＝１０μｇ／ｍｌの合成ＫＩ９ペプチドでパルスした非感染の細胞）。ＨＬＡミスマッチＣＤ４＋Ｔ細胞標的をこれらのウイルスのサブセットに感染させ、対照として試験した。図５Ｃに示す結果は、クローンＬ１−３Ｏが自己を認識するがＨＬＡミスマッチ感染標的細胞を認識しないことを実証している。Ｌ１−ｐ１５０特異的クローンＬ１−３Ｏと同じ個体から得たＣＭＶ−ｐｐ６５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンも自己の感染標的の認識について試験し、認識の欠如が実証された（図５ＤおよびＥ）。
実験（図６Ａ〜Ｄ）では、ＳＦ１ ＣＤ１０７ａ染色（脱顆粒）およびＩＦＮ−γ産生を認識の読取りとして使用した。自己およびＨＬＡミスマッチＣＤ４＋細胞標的の両方を、試験した７個のウイルスのそれぞれに感染させた。比較可能な規模の感染が、試験したウイルスのそれぞれについて自己およびＨＬＡミスマッチ標的細胞で観察された（図６Ａ、Ｂ）。クローンＬ１−３Ｏを、これらの標的のそれぞれの認識について試験した。これらのウイルスのそれぞれに感染した自己ＣＤ４＋細胞標的の認識が観察され、これはＨＬＡミスマッチ標的感染細胞の認識の欠如と対照的であった。
図６．Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンの多様なＨＩＶ−１パネル認識アッセイ「ＳＦ１」。Ｌ１−ｐ１５０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、追加の多様なＨＩＶ−１の単離体の認識についてさらに試験した。実験の設定は図５に示すものと同様であり、ウイルスの詳細は図１８に示す表から入手可能である。Ａ、Ｂ．Ａ．自己およびＢ．ＨＬＡミスマッチＣＤ４＋Ｔ細胞標的におけるＨＩＶ−１感染のレベルの評価として、ＣＤ４染色によるＨＩＶ−１−Ｇａｇ染色を示す、フローサイトメリーデータを示す。Ｃ、Ｄ．Ｃ．自己およびＤ．ＨＬＡミスマッチ標的に対するクローン細胞の応答性の評価として、ＣＤ１０７ａ染色によるＩＦＮ−γ染色を示す、ＣＤ８＋Ｔ細胞（クローン）でゲートしたフローサイトメトリーデータを示す（「モック」＝非感染の細胞、ＢＣＬ＋ＫＩ９ペプチド＝１０μｇ／ｍｌのＫＩ９ペプチドでパルスした自己Ｂ細胞系）。
実験ＴＯ２では、ＣＤ１０７ａ染色（脱顆粒）およびＩＦＮ−γ産生を認識の読取りとして用い、さらに１７個のＨＩＶ−１−単離体に感染した自己ＣＤ４＋標的細胞の認識についてクローンＬ１−３Ｏを試験した（図７）。標的細胞をＳＦ１よりも低いレベルのＨＩＶ−１に感染させ、より低いレベルの認識がもたらされた。様々な単離体に感染した標的細胞の認識のレベルにある程度の可変性が観察された（１．４９％〜８．２１％のＣＤ１０７ａ＋）。クローンによって示された応答のレベルが、ＣＤ４＋Ｔ細胞標的集団内の感染のレベルに相関していたかどうかを試験した。感染した標的細胞の％を、抗ＨＩＶ−１−Ｇａｇ（Ｋｃ５７−ＲＤ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリー染色によって測定し、％ＣＤ１０７ａ＋クローン細胞に対してプロットした。
図７．Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンの多様なＨＩＶ−１パネル認識アッセイ「ＴＯ２」。Ｌ１−ｐ１５０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、追加の多様なＨＩＶ−１の単離体の認識についてさらに試験した試験した。実験の設定は図５、６に示すものと同様であり、ウイルスの詳細は図１８に示す表から入手可能である。
これら２つのパラメータ（Ｒ＝０．５７６６、ｐ＝０．００７８、図８）の間で強力な相関が観察され、これは、これらの様々なウイルスストックを用いた様々なレベルのＨＩＶ−１感染が、標的細胞に対するクローン応答性のレベルの可変性に主に貢献していることを示している。さらに、感染した標的細胞あたりの認識の度合いが、任意の特定のウイルスクレードについて、一貫してより高いまたは低いわけではないことが観察された（図８）。ウイルス配列の可変性はクレード内で多発しているため、ＨＩＶ−１単離体の配列可変性は、Ｌ１−ｐ１５０特異的クローンＬ１−３Ｏで観察された認識の度合いの要因ではないという証拠を提供する。実験ＴＯ２の追加の対照として、ＨＩＶ−１−８９ＳＭ＿１４５またはＨＩＶ−１−９４ＵＳ＿３３９３のどちらかに感染した標的細胞を、１０μｇ／ｍｌのＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに対する遮断抗体（クローンＧ４６−２．６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にプレインキュベーションすることが、クローンＬ１−３Ｏによる認識を防止するかどうかを試験した。これを、感染した標的細胞と等量のＩｇＧ１アイソタイプ対照とのプレインキュベーションに比較した。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃとのプレインキュベーションで認識の強力な阻害が観察された（図９）。一緒にすると、これらのデータは、Ｌ１−ｐ１５０−ＫＩ９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン「Ｌ１−３Ｏ」は、配列可変性とは独立して、ＭＨＣ−１に制限された様式で、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に感染した細胞を認識することを実証している。
図８．多様なＨＩＶ−１−単離体に感染した自己細胞に対するクローンＬ１−３Ｏの応答性の度合いは、感染のレベルに相関する。図７に示す認識アッセイで使用した標的集団中のＨＩＶ−１に感染した細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定し、ＨＩＶ−１−Ｇａｇに対する蛍光色素抗体（Ｋｃ５７−ＲＤ１）で染色した。脱顆粒（ＣＤ１０７ａ＋）によるクローンＬ１−３Ｏ応答のパーセンテージによる、感染した標的（ｘ軸）のパーセンテージを示す。
図９．抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗体とのプレインキュベーションによる感染細胞の認識の遮断。図７に示す認識アッセイでは、ウイルス８９ＳＭ＿１４５および９４＿ＵＳ＿３３９３の認識も、自己標的細胞を１０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗体（クローンＧ４６−２．６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ１アイソタイプ対照と共にプレインキュベーションした後に試験した。ＣＤ１０７ａ染色によるＣＤ８染色（脱顆粒のマーカーとして）を示すフローサイトメトリーデータを示す。
(実施例３）
Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンは多様なＨＩＶ−１の単離体に感染した細胞の死滅を媒介する
Ｌ１−ＯＲＦ−２−ＫＶＩＹＲＦＮＡＩ（配列番号１０）エピトープ特異的クローン「Ｌ１−３Ｏ」を、ＨＩＶに感染した細胞の死滅について試験した。
Ｌ１−３Ｏクローンが由来する個体およびＨＬＡミスマッチ個体の２人のドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞標的を、多様なＨＩＶ−１の単離体のパネルを用いてマグネトフェクションによって同時感染させ、感染を２４時間進行させた。Ｌ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＬ１−３Ｏ−ＫＩ９を、感染した自己およびＨＬＡミスマッチ標的に、１：１５のクローン：標的の比で加えた。対照感染培養物を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の添加なしで平行に維持した。感染をさらに１８時間進行させ、この時点で、細胞を、ＣＤ４に対するｍＡｂで表面染色し、ＨＩＶ−１−Ｇａｇに対するｍＡｂ（Ｋｉ６７、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で細胞内染色した。感染の度合いは、フローサイトメトリーアッセイにおいてＫｉ６７＋に染色される細胞の％として測定した。データを図１９に示す。
図１９に示すように、ＬＩＮＥ−１−ＯＲＦ２ｐ特異的クローンＬ１−３Ｏ−ＫＩ９は、試験したＨＩＶ−１のすべての単離体に感染した自己細胞を強力に排除した。クローンと同時培養したＨＬＡミスマッチ標的における感染レベルの減少は、自己標的で観察されたものよりも規模が小さかった。データは、ＬＩＮＥ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、多様なＨＩＶ１の単離体に感染した自己細胞を特異的に認識および排除することを実証している。
(実施例４）
Ｌ１特異的Ｔ細胞クローンはＨＩＶに感染した細胞の死滅を媒介する。
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、治療なしで感染の自然の制御を示しているＨＩＶに感染した個体（ＨＩＶウイルス量＜５０個のコピー／ｍｌのｂＤＮＡ）から単離した。これらの細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで７日間、ＬＩＮＥ−１−ＯＲＦ１−ＲＰＮＬＲＬＩＧＶ（配列番号９）、ＨＩＶ−Ｇａｇプールペプチド（ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラムからのコンセンサスペプチド）、ＣＭＶ ｐｐ６５プールペプチド（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかと共に、ペプチドでパルスした自己Ｂ細胞リンパ腫系を用いて拡大した。これらの拡大したＢ細胞系を、１：１の比で、ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染させたか、またはモック感染対照として維持した自己ＣＤ４＋Ｔ細胞と混合した。陽性対照として、拡大した系を、ペプチド（ＲＰＮＬＲＬＩＧＶ（配列番号９）、プールしたＧａｇペプチド、またはプールしたＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドのいずれか）でパルスした、ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染した自己ＣＤ４＋Ｔ細胞とも混合した。
エフェクターおよび標的を、３７℃、５％のＣＯ２で１時間、一緒に培養した。５μｇ／ｍｌのＰＥとコンジュゲートした抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ（ＢＤ）をこの段階で加えた（１時間の同時培養の前）。その後、ブレフェルジンＡを１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、インキュベーションをさらに５時間進行させた。その後、細胞を、ＣＤ４およびＣＤ８に対するｍＡｂを用いて表面染色し、ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；ＢＤ）を用いて透過処理し、その後、ｍＡｂ（ＢＤ）を用いて、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）または腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）のどちらかについて染色した。フローサイトメトリーをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（ＢＤ）で行った。
結果は、ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３に感染した自己細胞が、ＬＩＮＥ−１−ＲＰＮＬＲＬＩＧＶ（配列番号９）で拡大したＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＨＩＶ−１−Ｇａｇで拡大したＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することを示している。ＨＩＶ−１ ＮＬ４−３に感染した自己細胞は、ＣＭＶ−ｐｐ６５で拡大したＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激しなかった（陰性対照として用いる）。データは、ＬＩＮＥ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がＨＩＶ−１に感染した細胞を特異的に認識することを実証している。
本発明を、その具体的な実施形態を参照しながら説明したが、当業者には、本発明の真の精神および範囲から逸脱せずに、様々な変更を行い、均等物で置き換え得ることが理解されよう。さらに、本発明の特定の状況、材料、組成物、方法、方法ステップまたは複数のステップ、目的、精神および範囲に適応するために、多くの改変を行い得る。すべてのそのような改変が、本明細書に添付する特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (39)

  1. 単離した長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）ポリペプチドと製薬上許容される担体とを含む免疫原性組成物。
  2. 単離ＬＩＮＥポリペプチドが、配列番号１〜２２のうちの任意の１つと少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  3. 単離ＬＩＮＥポリペプチドが、配列番号１〜２２のうちの任意の１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  4. 非経口投与用に製剤する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  5. 粘膜組織への投与用に製剤する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  6. アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  7. アジュバントが、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９、またはモノホスホリル脂質Ａを含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。
  8. 長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む免疫原性組成物。
  9. ＬＩＮＥポリペプチドが、配列番号１〜２２のうちの任意の１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
  10. 非経口投与用に製剤する、請求項８に記載の免疫原性組成物。
  11. 粘膜組織への投与用に製剤する、請求項８に記載の免疫原性組成物。
  12. 核酸が組換えベクターである、請求項８に記載の免疫原性組成物。
  13. 組換えベクターが組換えウイルスベクターである、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
  14. 合成長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）ポリペプチド。
  15. 配列番号１〜２２のうちの１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の合成ＬＩＮＥポリペプチド。
  16. 多量体である、請求項１４に記載の合成ＬＩＮＥポリペプチド。
  17. 担体と連結している、請求項１４に記載の合成ＬＩＮＥポリペプチド。
  18. アミノ酸６個〜約２００個の長さを有する、請求項１４に記載の合成ＬＩＮＥポリペプチド。
  19. 請求項１４に記載の長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）ポリペプチドを含む組成物。
  20. 免疫原性組成物であり、アジュバントをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
  21. 製薬上許容される賦形剤をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
  22. 請求項１４に記載の合成ＬＩＮＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  23. 請求項２２に記載の核酸を含む組成物。
  24. 個体に、請求項１、８、１９、および２３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、個体において、病原性ウイルスに感染したまたは感染する危険性のある宿主細胞に対するＴリンパ球応答を誘導する方法。
  25. Ｔリンパ球応答がＣＤ８＋Ｔ細胞応答またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. Ｔリンパ球応答が粘膜Ｔリンパ球応答を含む、請求項２４に記載の方法。
  27. 病原性ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項２４に記載の方法。
  28. 個体が病原性ウイルスに感染していない、請求項２４に記載の方法。
  29. 個体が病原性ウイルスに感染している、請求項２４に記載の方法。
  30. 個体に、請求項１、８、１９、および２３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、個体において、ＬＩＮＥ発現を有し、癌細胞の表面上にＬＩＮＥエピトープを提示している癌細胞に対するＴリンパ球応答を誘導する方法。
  31. 未刺激のＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、抗原提示プラットフォームと会合している単離ＬＩＮＥポリペプチドと接触させることを含み、前記接触により、ＬＩＮＥペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団の産生がもたらされる、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）ポリペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を作製する方法。
  32. 個体に、有効量の、請求項１、８、１９、および２３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、個体においてレトロウイルス感染症を治療する方法。
  33. 前記投与が、個体におけるウイルス量を少なくとも約１０％減少させるのに有効である、請求項３２に記載の方法。
  34. レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項３２に記載の方法。
  35. 個体に、有効量の、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、およびＨＩＶ侵入／融合阻害剤のうちの１つまたは複数を投与することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 個体に、有効量の、請求項１、８、１９、および２３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、癌が異常なレベルの長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）ポリペプチドを発現している癌細胞を含む、個体において癌を治療する方法。
  37. 癌が黒色腫、卵巣癌、乳癌、または精巣癌である、請求項３６に記載の方法。
  38. 個体に、有効量の、請求項１９に記載の組成物を投与することを含む、個体において自己免疫障害を治療する方法。
  39. ａ）白血球（ＷＢＣ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）ポリペプチドと接触させることと（ＷＢＣは、患者から、治療の開始後の第１の時点に得る）；
    ｂ）ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答してＷＢＣによって分泌されたサイトカインを検出することを含み、
    ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答した対照ＷＢＣによるサイトカイン産生のレベルと比較した、ＬＩＮＥポリペプチドとの接触に応答したＷＢＣによるサイトカイン産生の減少は、治療がレトロウイルス感染症の治療に有効であることを示し、対照ＷＢＣは、患者から、治療開始前、または第１の時点よりも前の治療中の時点に得る、レトロウイルス感染症の治療に対する患者の応答を監視する方法。
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