JP2010536870A - カリクレイン阻害剤を用いた治療 - Google Patents

Abstract

関節の病変を治療するための、非天然カリクレイン阻害剤および任意に関節内補充薬を含む方法、キットおよび組成物を開示する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２００７年８月２１日付けで出願された米国出願第６０／９５６，９５２号の優先権を主張する。先願の開示は、本願の開示の一部とみなされる（さらに、参照により本願の開示に含まれる）。

発明の分野
本発明は、任意にビスコサプリメンテーション（関節内補充療法）を併用した、血漿カリクレイン活性の阻害剤、具体的には非天然カリクレイン阻害剤の投与による関節の病変の治療に関する。

変形性関節症（ＯＡ）は、進行性変性疾患であり、関節中での軟骨の崩壊、関節の接合部に存在する滑液の変質、および、骨棘形成に伴う肋軟骨下の骨硬化症を特徴とする。ＯＡを有する患者の多くは、彼等の日常生活における多くの局面に影響を及ぼす重度の痛みを示す。ＯＡの罹患率は加齢に伴って増加し、相当な医療費の原因となっている。

滑液は、関節内の接合部表面を円滑にして、それらを保護するものであり、主として高分子多糖類ヒアルロナン（ＨＡ、ヒアルロン酸のナトリウム塩であり、またヒアルロン酸ナトリウムとしても知られている）で構成される。正常なヒトの滑膜性の連結の流体におけるＨＡの濃度は、約３ｍｇ／ｍｌである。ＨＡは、繰り返しのＮ−アセチルグルコサミンおよびグロクロン酸ナトリウム二糖類単位からなる非硫酸化型多糖類である。正常な滑液中のＨＡは、５ＭＤａの総分子量（ＭＷ）に対して１２，５００個の二糖類単位を含む（Ｂａｌａｚｓ等（１９９３）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，３９：３−９）。ＯＡ患者において、滑液中でのＨＡ濃度およびＭＷは減少するため、流体の軟骨を保護する能力の低下が起こる。

高分子ＨＡを含む粘弾性溶液の関節内注射は、罹患した関節の正常なホメオスタシスを回復させることが示されている。この手法はビスコサプリメンテーションとして知られており、痛みの軽減および関節機能の強化において有効であることが証明されている（例えば、Ｂａｌａｚｓ等（１９９３）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，３９：３−９；Ｗｏｂｉｇ（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．，２０（３）：４１０−４２３を参照）。

Ｂａｌａｚｓ等（１９９３）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，３９：３−９ Ｗｏｂｉｇ（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．，２０（３）：４１０−４２３

本発明は、関節の病変を治療し、このような病変に伴う痛みおよび不快感を低減させる方法および組成物を提供する。このような病変の例としては、変形性関節症、リウマチ様関節炎、関節の傷害、軟骨の病変、および、関節炎前の状態が挙げられる。本発明によれば、このような関節の病変は、非天然血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）阻害剤を、任意にヒアルロン酸（ＨＡ）ベースの関節内補充薬のような関節内補充薬と組み合わせて投与することによって治療される。

一実施態様において、上記治療は、関節の病変、例えば変形性関節症、リウマチ様関節炎、関節の傷害（例えば、反復動作による傷害）、軟骨の病変（軟骨軟化症）、または、関節炎前の状態に伴う痛みを低減させる。

一実施態様において、上記治療は、関節の機能（例えば、可動域、歩行速度、握力など）を改善するか、または、安定化させる。
一実施態様において、上記治療は、患者の機能（例えば、患者の日常生活の仕事を遂行する能力）を改善する。その他の実施態様において、上記治療は、患者の機能を安定化させる（例えば、患者の機能を減少させない）。患者の機能は、利用可能な関節炎関連の、または、全般的な性能の測定のいずれかによって測定することができ、例えば健康状態質問票（ＨＡＱ）、日常生活動作のカッツ（Ｋａｔｚ）インデックス（ＫＩＡＤＬ）、または、日常生活の手段的動作（ＩＡＤＬ）によって測定することができる。

一実施態様において、ｐＫａｌ阻害剤は、以下のアミノ酸配列：

または、それらのフラグメント、例えば配列番号２のアミノ酸３〜６０を含むか、または、それらからなる。
一実施態様において、非天然ｐＫａｌ阻害剤は、ビスコサプリメンテーション療法と組み合わせて投与される。このような併用療法は、ｐＫａｌ阻害剤および関節内補充薬の混合物の関節内投与、ｐＫａｌ阻害剤および関節内補充薬の別々の関節内投与、または、ｐＫａｌ阻害剤の全身（例えば、非経口、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下注射）投与、および、関節内補充薬の局所（関節内）投与を含んでいてもよい。この実施態様において、本ｐＫａｌ阻害剤は、以下のアミノ酸配列：

または、それらのフラグメント、例えば配列番号２のアミノ酸３〜６０を含んでもよいし、または、それらからなる。ｐＫａｌ阻害剤が配列番号２のアミノ酸３〜６０からなるか、または、それらを含むいくつかの実施態様において、関節内補充薬は、ヒランＧ−Ｆ２０（例えば、シンビスク（ＳＹＮＶＩＳＣ（Ｒ）））である。

一形態において、本発明は、関節の病変を治療するためのキットを提供する。本キットは、非天然ｐＫａｌ阻害剤、および、関節の病変を有する被検体に本阻害剤を投与するための説明書を含む。

一実施態様において、本キットはさらに、関節内補充薬を投与するための説明書を含み、さらに、任意にこのような関節内補充薬を含んでいてもよい。
その他の形態において、関節の病変を治療する医薬品を製造するための非天然ｐＫａｌ阻害剤の使用が本明細書で提供される。このような医薬品は、任意に関節内補充薬を含んでいてもよい。

一実施態様において、このような非天然ｐＫａｌ阻害剤を含む医薬品は、関節内補充薬を用いた併用療法における使用を目的とするか、または、そのような使用に適している。
開示された方法、キットまたは組成物のいずれかで用いられる非天然カリクレイン阻害剤は、以下で説明される１種またはそれより多くの特徴を有していてもよい。

本カリクレイン阻害剤は、血漿カリクレインに関して、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、例えば約４４ｐＭ未満のＫｉを有していてもよい。本ｐＫａｌ阻害剤は、ｐＫａｌを、その他のカリクレイン、例えばヒト尿カリクレイン、または、その他のプロテアーゼ、例えばプラスミンまたはトロンビンよりも、少なくとも１００、２００、５００、または、１０００倍多く選択的に阻害することができる。

一実施態様において、本カリクレイン阻害剤は、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを含むポリペプチドを含み、例えば以下のアミノ酸配列を含む：

クニッツドメインのフレームワークは、ヒトクニッツドメインのフレームワークであってもよいし、または、ヒトクニッツドメインのフレームワークと６、５、４、３、または、２個未満のアミノ酸が異なるものでもよい。例えば、クニッツドメインのフレームワークは、ヒトリポタンパク質関連凝固阻害剤（ＬＡＣＩ）タンパク質のクニッツドメインの１種、例えば第一、第二または第三のクニッツドメインのフレームワークであってもよい。またＬＡＣＩは、「組織因子経路阻害剤」または「ＴＦＰＩ」としても知られている。典型的に言えば、このようなポリペプチドは、ＢＰＴＩおよび／またはＬＡＣＩクニッツドメインの１種またはそれより多くと、結合ループにおいて少なくとも１、２、３または４個のアミノ酸が異なっており、例えば少なくとも１、２または３個のアミノ酸が異なっている、および／または、フレームワーク領域において少なくとも２、３、４または６個のアミノ酸が異なっている。例えば、このようなポリペプチドは、天然に存在するクニッツドメイン（例えばヒトクニッツドメイン）から誘導された非天然クニッツドメインを含んでいてもよい。一実施態様において、クニッツドメインを含む阻害剤は、ＢＰＴＩおよび／またはＬＡＣＩよりも少なくとも１０、１００または５００倍高い親和性で血漿カリクレインに結合する。

一実施態様において、本カリクレインを阻害するポリペプチドは、第二の使用において、免疫原性ではない。
一実施態様において、本カリクレインを阻害するポリペプチドは、１種またはそれより多くの以下の特徴を有していてもよい：Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７またはＸａａ５８は、それぞれにアミノ酸であるか、または、存在せず；Ｘａａ１０は、ＡｓｐおよびＧｌｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１１は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、および、Ｔｈｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１３は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、および、Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１５は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、および、Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１６は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、および、Ａｓｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１７は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、および、Ｔｈｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１８は、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、および、Ａｌａからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１９は、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、および、Ｉｌｅからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２１は、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、および、Ｉｌｅからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２２は、Ｔｙｒ、および、Ｐｈｅからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２３は、Ｔｙｒ、および、Ｐｈｅからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３１は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、および、Ｔｈｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３２は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、および、Ｖａｌからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３４は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、および、Ｌｅｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３５は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、および、Ｐｈｅからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３９は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、および、Ａｓｐからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４０は、Ｇｌｙ、および、Ａｌａからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４３は、Ａｓｎ、および、Ｇｌｙからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４５は、Ｐｈｅ、および、Ｔｙｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；および、ここでこれらのポリペプチドは、カリクレインを阻害する。

具体的な実施態様において、配列番号１のアミノ酸配列を含むカリクレイン阻害剤の個々のアミノ酸の位置は、以下に示す位置のうち１またはそれより多くである：Ｘａａ１０は、Ａｓｐであり、Ｘａａ１１は、Ａｓｐであり、Ｘａａ１３は、Ｐｒｏであり、Ｘａａ１５は、Ａｒｇであり、Ｘａａ１６は、Ａｌａであり、Ｘａａ１７は、Ａｌａであり、Ｘａａ１８は、Ｈｉｓであり、Ｘａａ１９は、Ｐｒｏであり、Ｘａａ２１は、Ｔｒｐであり、Ｘａａ３１は、Ｇｌｕであり、Ｘａａ３２は、Ｇｌｕであり、Ｘａａ３４は、Ｉｌｅであり、Ｘａａ３５は、Ｔｙｒであり、Ｘａａ３９は、Ｇｌｕである。

上記カリクレインを阻害するポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：

または、それらのフラグメント、例えばカリクレインに結合しそれらを阻害するフラグメントを含んでいてもよい（または、それらからなっていてもよい）。例えば、上記ポリペプチドは、８０、７０、６５、６０、５８、５５、または、５２個より少ないアミノ酸を有していてもよい。

上記カリクレインを阻害するポリペプチドは、米国特許第５，７８６，３２８号（その内容は、参照により開示に含まれる）で説明されているポリペプチドを含んでいてもよい（または、それらからなっていてもよい）。

本明細書において説明される方法、キットおよび組成物は、本明細書において説明されるアミノ酸配列のいずれか、および、アミノおよび／またはカルボキシ末端ドメインにおける１〜６個のアミノ酸の追加のフランキング配列を有する非天然クニッツドメインのポリペプチドを含む阻害剤を含んでいてもよい。このような追加のアミノ酸は、例えば酵母、細菌、哺乳動物細胞系、昆虫細胞などで用いられる様々な組換え発現ベクター系のいずれかにおいて、特定の非天然カリクレイン阻害剤ポリペプチド、または、クニッツドメインのポリペプチドを発現する人工産物であってもよい。好ましくは、このような本明細書において説明される非天然クニッツドメインのアミノおよび／またはカルボキシ末端における追加のアミノ酸は、カリクレインへの親和性、または、上記ドメイン、または、上記ドメインを含むポリペプチドのカリクレイン阻害活性を減少させない。

本阻害剤ポリペプチドは、酵母中で組換えタンパク質として上記ポリペプチドが生産された結果として配列番号１に記載のアミノ酸配列、および、アミノ末端のフランキング配列を有する非天然クニッツドメインのポリペプチドを含んでいてもよい。特に好ましい酵母の組換え発現系の例は、配列番号１に記載の非天然クニッツドメインに関するヌクレオチドのコード配列を、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｍａｔαプレプロペプチドのリーダー配列をコードするヌクレオチド配列に融合させること、および、この組換えコード配列を酵母のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で発現することを含む。このようにして得られた発現された融合タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、および、アミノ末端のフランキングジペプチドであるＧｌｕ−Ａｌａを含む。酵母の発現系中で生産された特に好ましい本発明の阻害剤ポリペプチド種は、配列番号２のアミノ酸配列を有する：

一実施態様において、ｐＫａｌを阻害する上記ポリペプチドは、例えば、１種またはそれより多くの部分が含まれるように修飾されていてもよく、例えば、上記ポリペプチドの半減期を延長する１種またはそれより多くの部分が含まれるように修飾されていてもよく、このような部分としては、例えば、米国特許公報第２００５／００８９５１５号で説明されているようなポリマー部分または複数のポリマー部分が挙げられる。例えば、このようなポリペプチドは、複数のポリエチレングリコール部分を含んでいてもよく、例えば、Ｎ末端のアミンに存在するもの、および、上記ポリペプチドの各リシンに結合したものを含んでいてもよい。このようなポリエチレングリコール部分は、１０ｋＤａ未満、８ｋＤａ未満、７ｋＤａ未満、または、６ｋＤａ未満の平均分子量を有していてもよい。その他の実施態様において、このような部分は、例えば血清アルブミンであってもよく、例えば、ヒト血清アルブミンである。その他の典型的な修飾は、標識を含み、このような標識としては、例えば、放射性標識、または、ＭＲＩによって検出可能な標識が挙げられる。いくつかの実施態様において、上記ポリペプチドは、修飾された、および、修飾されていないカリクレインを阻害するポリペプチドを含む混合物の一部である。例えば、このような混合物は、１種またはそれより多くの、カリクレインを阻害し、ポリエチレングリコール部分のようなポリマー部分を含む修飾されたポリペプチド、および、１種またはそれより多くの、カリクレインを阻害し、ポリマー部分を含まない修飾されていないポリペプチドを含んでいてもよい。一実施態様において、上記混合物中の、上記カリクレインを阻害するポリペプチドの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または全てが修飾されている。

本方法、組成物およびキットにおいて有用な本ｐＫａｌ阻害剤ポリペプチドは、本明細書において説明される非天然クニッツドメインのポリペプチドであってもよいし、または、標準的な分析において決定した場合にｐＫａｌ阻害剤ポリペプチドがｐＫａｌと結合しそれらを阻害するのであればどのような上記クニッツドメインのいずれかを含むより大きいポリペプチドであってもよい。

本明細書において説明される方法は、上記非天然ｐＫａｌ阻害剤の有効量を投与することを含む。このような量は、当業者であれば検出可能な改善を生じるのに十分な量であってもよいし、少なくとも１種の症状を改良するのに十分な量であってもよいし、またはは、少なくとも１種の生理学的なパラメーターを例えば統計学的に有意な程度に調節する（例えば、改善する）のに十分な量であってもよい。

例えば本明細書において説明されるいずれかの方法またはキットで用いられる好ましい組成物は、１種またはそれより多くの製薬上許容できる緩衝液、キャリアーおよび賦形剤をさらに含んでいてもよく、このような物質は、これらに限定されないが、例えば本組成物の患者への強化された投与、本阻害剤の強化された循環半減期、本組成物の強化された患者の血液化学との適合性、本組成物の強化された貯蔵、および／または、本組成物の患者に投与する際における強化された有効性などの望ましい特徴を本組成物に提供する可能性がある。

本発明の１種またはそれより多くの実施態様の詳細は、添付の図面、および、以下の説明に記載される。本発明のその他の特徴、目的および利点は、説明および図面、ならびに請求項から明らかであると予想される。

図１は、プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３中の典型的なカリクレイン阻害剤ポリペプチドに関するＤＮＡ、および、それに応じて推測されたアミノ酸の一部を示す。挿入されたＤＮＡは、フレーム内でボックスで囲った領域に含まれるアミノ酸配列を有するＰＥＰ−１ポリペプチドのアミノ末端に融合した、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｍａｔαプレプロシグナルペプチドをコードする（下線で示した）。そのボックスで囲った領域に示されるＰＥＰ−１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２であり、それに対応するヌクレオチドのコード配列は、配列番号３である。破線の矢印は、配列解析用テンプレートを生産するのに用いられたＡＯＸ領域中の２種のＰＣＲプライマー配列の位置および方向を示す。この図の全ヌクレオチド配列に関するＤＮＡ配列は、上記融合タンパク質に関する構造的なコード配列を含み、配列番号２７と指定されている。配列の二重下線で示した部分は、診断プローブ配列を示す。ＢｓｔＢＩおよびＥｃｏＲＩは、上記配列中におけるそれら個々のパリンドロームの６量体制限エンドヌクレアーゼ部位の位置を示す。星印は、翻訳停止コドンを意味する。詳細についてはテキストを参照。 図２Ａ（Ｆｉｇ．２Ａ）および図２Ｂ（Ｆｉｇ．２Ｂ）は、典型的なアミノ酸配列、これらの変異体が誘導された天然型のＬＡＣＩ配列（配列番号３２）、および、その他の既知のクニッツドメイン（配列番号２９〜３１および３３〜５３）のアライメントを示す。システイン残基を強調表示した。 図２Ａの続き。

発明者等は、本明細書において、非天然ｐＫａｌ阻害剤を投与することによって、関節の病変（例えば、（一次性（特発性）または二次性）変形性関節症、リウマチ様関節炎、関節の傷害（例えば、反復動作による傷害）、軟骨の病変（軟骨軟化症）、および、関節炎前の状態）を治療する新規の方法を示す。

クニッツドメインｐＫａｌ阻害剤
多数の有用なｐＫａｌ阻害剤は、クニッツドメインを含む。
本明細書で用いられるように、「クニッツドメイン」は、少なくとも５１個のアミノ酸を有し、少なくとも２個、および、好ましくは３個のジスルフィドを含むポリペプチドドメインである。このドメインは、第一および第六のシステイン、第二および第四、ならびに第三および第五のシステインがジスルフィド結合を形成するように折り畳まれているか（例えば、５８個のアミノ酸を有するクニッツドメイン中で、システインは、以下に示すＢＰＴＩ相同配列の番号に従って、アミノ酸５、１４、３０、３８、５１および５５に相当する位置に存在する可能性があり、ジスルフィドは、５位のシステインと５５位のシステインとの間、１４位のシステインと３８位のシステインとの間、ならびに３０位のシステインと５１位のシステインとの間に形成される可能性がある）、または、２つのジスルフィドが存在する場合、それらは、それらのシステインによって生じる部分集合間で形成される可能性がある。それぞれのシステイン間の間隔は、以下に示すＢＰＴＩ配列の番号付けに従って、５〜５５、１４〜３８および３０〜５１に相当する位置間の間隔の７、５、４、３、２、１個以内または０個のアミノ酸であってもよい。ＢＰＴＩ配列は、あらゆる一般的なクニッツドメインにおいて特定の位置を述べるための参照として用いることができる。対象のクニッツドメインとＢＰＴＩとの比較は、並べられたシステインの数を最大にした最もよく適合するアライメントを同定することによって行うことができる。

ＢＰＴＩのクニッツドメインの三次元構造（高解像度における）が既知である。そのＸ線構造の１つは、ブルックヘブン・プロテイン・データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）に「６ＰＴＩ」として寄託されている。いくつかのＢＰＴＩ相同体の三次元構造（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ等（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（７）：５９１−５９８；Ｈｙｎｅｓ等（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：１００１８−１００２２）が既知である。少なくとも８１種のクニッツドメイン配列が既知である。既知のヒト相同体としては、ＬＡＣＩの３種のクニッツドメイン（Ｗｕｎ等（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１３）：６００１−６００４；Ｇｉｒａｒｄ等（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３３８：５１８−２０；Ｎｏｖｏｔｎｙ等（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（３１）：１８８３２−１８８３７）、インターα−トリプシン阻害剤の２種のクニッツドメイン、ＡＰＰ−Ｉ（Ｋｉｄｏ等（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３（３４）：１８１０４−１８１０７）、コラーゲン由来のクニッツドメイン、ＴＦＰＩ−２の３種のクニッツドメイン（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ等（１９９４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９１：３３５３−３３５７）、肝細胞増殖因子活性化因子阻害剤１型のクニッツドメイン、肝細胞増殖因子活性化因子阻害剤２型のクニッツドメイン、米国特許公報第２００４０１５２６３３号で説明されているクニッツドメインが挙げられる。ＬＡＣＩは、３種のクニッツドメインを含む３９ｋＤａの分子量を有するヒト血清リン糖タンパク質である（表１に記載のアミノ酸配列）。

上記のクニッツドメインは、ＬＡＣＩ−Ｋ１（残基５０〜１０７）、ＬＡＣＩ−Ｋ２（残基１２１〜１７８）、および、ＬＡＣＩ−Ｋ３（２１３〜２７０）と称される。ＬＡＣＩのｃＤＮＡ配列は、Ｗｕｎ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６３（１３）：６００１−６００４）で報告されている。Ｇｉｒａｒｄ等（Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３８：５１８−２０）は、３種のクニッツドメインそれぞれのＰ１残基を修飾した突然変異の研究を報告している。ＬＡＣＩ−Ｋ１は、第ＶＩＩａ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）を阻害し、その際にＦ．ＶＩＩａが組織因子と複合体化すると、ＬＡＣＩ−Ｋ２が第Ｘａ因子を阻害する。

典型的なクニッツドメインを含むタンパク質としては、以下が挙げられる（括弧内にスイスプロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）受託番号を共に示す）：

配列データベースからクニッツドメインを同定するために様々な方法を用いることができる。例えば、クニッツドメインの既知のアミノ酸配列、コンセンサス配列、または、モチーフ（例えば、プロサイト（ＰｒｏＳｉｔｅ）モチーフ）は、例えばＢＬＡＳＴを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ），国立健康研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ），メリーランド州ベセスダ）に対して；ＨＭＭ（隠れマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ））のＰｆａｍデータベースに対して（例えば、Ｐｆａｍ検索のデフォルトパラメーターを用いて）；ＳＭＡＲＴデータベースに対して；または、ＰｒｏＤｏｍデータベースに対して検索することができる。例えばＰｆａｍリリース９（Ｐｆａｍ Ｒｅｌｅａｓｅ ９）のＰｆａｍ受託番号ＰＦ０００１４は、多数のクニッツドメインを提供するものであり、ＨＭＭは、クニッツドメインを同定する。Ｐｆａｍデータベースの説明は、Ｓｏｎｈａｍｍｅｒ等（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２８（３）：４０５−４２０で見ることができ、ＨＭＭの詳細な説明は、例えば、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ等（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ等（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４３５５−４３５８；Ｋｒｏｇｈ等（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１；および、Ｓｔｕｌｔｚ等（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２：３０５−３１４で見ることができる。ＨＭＭのＳＭＡＲＴデータベース（シンプル・モジュラー・アーキテクチャー・リサーチ・ツール（Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ），ＥＭＢＬ，ハイデルベルグ，ドイツ）は、Ｓｃｈｕｌｔｚ等（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：５８５７、および、Ｓｃｈｕｌｔｚ等（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：２３１で説明されている。ＳＭＡＲＴデータベースは、ＨＭＭｅｒ２検索プログラムの隠れマルコフモデルを用いたプロファイリングによって同定されたドメインを含む（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ等（１９９８）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。またこれらのデータベースには注釈も付され、さらにモニターされている。ＰｒｏＤｏｍタンパク質ドメインデータベースは、相同ドメインの自動コンパイルからなる（Ｃｏｒｐｅｔ等（１９９９），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２６３−２６７）。ＰｒｏＤｏｍの最新バージョンは、スイスプロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）３８、および、ＴＲＥＭＢＬタンパク質データベースの帰納的ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｇｏｕｚｙ等（１９９９）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：３３３−３４０．）を用いて構築されている。このようなデータベースは、各ドメインに対してコンセンサス配列を自動的に生成する。ＰｒｏＳｉｔｅは、クニッツドメインをモチーフとして列挙し、クニッツドメインを含むタンパク質を同定する。例えば、Ｆａｌｑｕｅｔ等．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：２３５−２３８（２００２）を参照。

クニッツドメインは、主として２つのループ領域（「結合ループ」）中のアミノ酸を用いて標的のプロテアーゼと相互作用する。第一のループ領域は、ＢＰＴＩのアミノ酸１３〜２０に対応するおよその残基間にある。第二のループ領域は、ＢＰＴＩのアミノ酸３１〜３９に対応するおよその残基間にある。クニッツドメインの典型的なライブラリーにおいて、第一および／または第二のループ領域における１個またはそれより多くのアミノ酸の位置を変化させる。このように変化させるのに特に有用な位置としては、カリクレインと相互作用するクニッツドメインに関してスクリーニングする場合、または、改善された親和性を有する変異体を選択する場合、以下が挙げられる：ＢＰＴＩ配列に従って、１３位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、３１位、３２位、３４位、および、３９位。これらの位置のうち少なくともいくつかは、標的のプロテアーゼと密接に接触していることが予想される。また、その他の位置を多様化することも有用であり、例えば、三次元構造において上述の位置に隣接する位置を多様化することも有用である。

クニッツドメインの「フレームワーク領域」は、クニッツドメインの一部であるが、特に、第一および第二の結合ループ領域中の残基、すなわちＢＰＴＩのアミノ酸１３〜２０、および、ＢＰＴＩのアミノ酸３１〜３９に対応するおよその残基以外の残基と定義される。逆に言えば、結合ループ中に含まれない残基は、より広範囲のアミノ酸置換（例えば、保存的および／または非保存的置換）に対して耐性を有する可能性がある。

一実施態様において、これらのクニッツドメインは、ヒトリポタンパク質関連凝固阻害剤（ＬＡＣＩ）タンパク質のクニッツドメイン１を含むループ化された構造の変異型である。ＬＡＣＩは、パラダイムクニッツドメインである３種の内部の特定のペプチドループ構造を含む（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．等，１９８９．Ｎａｔｕｒｅ，３３８：５１８−５２０）。本明細書において説明されるＬＡＣＩのクニッツドメイン１の変異体は、すでにスクリーニングされて、単離されており、これらは、カリクレインと強化された親和性および特異性で結合する（例えば、米国特許第５，７９５，８６５号、および、６，０５７，２８７を参照、これらはこの参照により開示に含まれる）。またこれらの方法は、カリクレインと相互作用するその他のクニッツドメイン（例えば、血漿カリクレイン）を得るために、その他のクニッツドメインのフレームワークにも適用することができる。カリクレインの結合および阻害分析を用いて決定したところ、カリクレイン機能の有用な調節因子は、典型的には、カリクレインと結合し、および／または、それらを阻害する。

カリクレインを阻害するクニッツドメインを含む典型的なポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸３〜６０で定義されたアミノ酸配列を有する。
典型的なポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：

「Ｘａａ」は、ペプチド鎖中の位置を意味し、多種多様なアミノ酸のいずれでもよい。第一の実施例において、Ｘａａは、システイン以外のあらゆるアミノ酸であってもよい。その他の実施例において、以下のうち１種またはそれより多くが適用される：Ｘａａ１０は、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく；Ｘａａ１１は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＴｈｒであってもよく；Ｘａａ１３は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＬｙｓまたはＧｌｎであってもよく；Ｘａａ１５は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、または、Ｇｌｎであってもよく；Ｘａａ１６は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、または、Ａｓｎであってもよく；Ｘａａ１７は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、または、Ｔｈｒであってもよく；Ｘａａ１８は、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＧｌｎまたはＡｌａであってもよく；Ｘａａ１９は、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、または、Ｉｌｅであってもよく；Ｘａａ２１は、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、または、Ｉｌｅであってもよく；Ｘａａ３１は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、または、Ｔｈｒであってもよく；Ｘａａ３２は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または、Ｖａｌであってもよく；Ｘａａ３４は、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、または、Ｌｅｕであってもよく；Ｘａａ３５は、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであってもよく；Ｘａａ３９は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、または、Ａｓｐであってもよい。アミノ酸Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３、および、Ｘａａ５４は、どのようなアミノ酸であってもよい。

加えて、配列番号１の最初の４個、および、最後の３個のアミノ酸はそれぞれ、任意に存在していてもよいし、または存在していなくてもよく、これらは、存在する場合はどのようなアミノ酸であってもよく、例えばシステイン以外のあらゆるアミノ酸であり得る。

一実施態様において、上記ポリペプチドは、１またはそれより多くの以下の特性を示す配列を有する：Ｘａａ１１は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、または、Ｖａｌであってもよく；Ｘａａ１３は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ａｓｎであってもよく；Ｘａａ１５は、ＡｒｇまたはＬｙｓであってもよく；Ｘａａ１６は、ＡｌａまたはＧｌｙであってもよく；Ｘａａ１７は、Ａｌａ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＩｌｅであってもよく；Ｘａａ１８は、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＧｌｎであってもよく；Ｘａａ１９は、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＬｅｕであってもよく；Ｘａａ２１は、ＴｒｐまたはＰｈｅであってもよく；Ｘａａ３１は、Ｇｌｕであり；Ｘａａ３２は、ＧｌｕまたはＧｌｎであってもよく；Ｘａａ３４は、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＳｅｒであってもよく；Ｘａａ３５は、Ｔｙｒであり；および、Ｘａａ３９は、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＡｌａであってもよい。

典型的なポリペプチドは、以下のアミノ酸を含んでいてもよい：Ｘａａ１０は、Ａｓｐであり；Ｘａａ１１は、Ａｓｐであり；Ｘａａ１３は、ＰｒｏまたはＡｒｇであってもよく；Ｘａａ１５は、Ａｒｇであり；Ｘａａ１６は、ＡｌａまたはＧｌｙであってもよく；Ｘａａ１７は、Ａｌａであり；Ｘａａ１８は、Ｈｉｓであり；Ｘａａ１９は、Ｐｒｏであり；Ｘａａ２１は、Ｔｒｐであり；Ｘａａ３１は、Ｇｌｕであり；Ｘａａ３２は、Ｇｌｕであり；Ｘａａ３４は、ＩｌｅまたはＳｅｒであってもよく；Ｘａａ３５は、Ｔｙｒであり；および、Ｘａａ３９は、Ｇｌｙである。

また、本明細書において説明されるポリペプチドの一部を用いることも可能である。例えば、このようなポリペプチドは、特定のカリクレインエピトープに関する結合ドメインを含んでいてもよい。例えば、クニッツドメインの結合ループは、環化される可能性もあり、別々で用いられる可能性もあり、または、その他のドメイン（例えばその他のクニッツドメインのフレームワーク）にグラフト化される可能性もある。また、本明細書において説明されるアミノ酸配列のＮ末端から１、２、３または４個のアミノ酸を除去することも可能であり、および／または、本明細書において説明されるアミノ酸配列のＣ末端から１、２、３、４または５個のアミノ酸を除去することも可能である。

以下で、配列番号１に包含される配列の例を説明する（ここで、特に指定されなければ、「Ｘａａ」は、あらゆるアミノ酸、システイン以外のあらゆるアミノ酸、または、配列番号１に関して認められているアミノ酸と同じ群から選択されるあらゆるアミノ酸を意味する）：

さらなる配列の例としては、本明細書において説明されるアミノ酸配列（例えば上で示したアミノ酸配列）と比べて、少なくとも１個のアミノ酸が異なっているが、異なるアミノ酸が７、６、５、４、３または２個未満である配列が挙げられる。一実施態様において、結合ループの一方において、３、２個未満または１個が異なっている。例えば、第一の結合ループは、本明細書において説明されるアミノ酸配列（例えば上で示したアミノ酸配列）と比べて差がなくてもよい。その他の実施例において、第一の結合ループも第二の結合ループも、本明細書において説明されるアミノ酸配列（例えば上で示したアミノ酸配列）と比べて異なっていない。

図２Ａおよび２Ｂは、これらの配列のアミノ酸配列アライメント、これらの変異体が誘導された天然型のＬＡＣＩ配列（配列番号３２）、および、その他の既知のクニッツドメイン（配列番号２９〜３１および３３〜５３）を示す。さらにその他のカリクレインを阻害するポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸３〜６０の約５８個のアミノ酸の配列、または、配列番号２の６０個のアミノ酸の配列を有するＰＥＰ−１ポリペプチドを含む。本明細書で用いられる用語「ＰＥＰ−１」および「ＤＸ−８８」は、配列番号２の６０個のアミノ酸の配列を意味する。配列番号３に、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す（例えば、図１に記載のヌクレオチド３０９〜４８８を参照）。当然のことながら、既知の遺伝子コードに基づいて、配列番号３のヌクレオチド配列の縮重形態は、単に、そのヌクレオチド配列によってコードされた各アミノ酸を１種またはそれより多くの既知の縮重コドン置換することにより得ることができる。配列番号３のヌクレオチド７〜１８０およびそれらの縮重形態は、配列番号２のアミノ酸３〜６０の５８個のアミノ酸配列、それらの関連配列または機能的なフラグメントを含む非天然クニッツドメインポリペプチドをコードする。

一実施態様において、上記ポリペプチドは、アプロチニン以外のポリペプチドであり、例えば、アプロチニンとは少なくとも１、２、３、５、１０個、または、１５個のアミノ酸が異なるポリペプチドである。

本明細書において説明されるポリペプチドは、あらゆる標準的なポリペプチド合成プロトコールおよび器具を用いて合成によって製造することができる。例えば、ポリペプチドの段階的合成は、最初の（すなわちカルボキシ末端の）アミノ酸からアミノ（Ｎ）末端の保護基を除去し、それらに、そのポリペプチドの配列において次のアミノ酸のカルボキシル末端をカップリングすることによって行うことができる。さらにこのアミノ酸も、適切に保護される。その後に続くアミノ酸のカルボキシル基が活性化されて、反応性基に形成されることによって、例えば、カルボジイミド、対称な酸無水物または「活性エステル」基、例えばヒドロキシベンゾトリアゾール、または、ペンタフルオロフェニルエステルに形成されることによって、結合したアミノ酸のＮ末端と反応する可能性がある。好ましい固相ペプチド合成法としては、ＢＯＣ法が挙げられ、これは、Ι−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを利用する方法であり、さらに、ＦＭＯＣ法が挙げられ、これは、アミノ酸残基のアルファ−アミノを保護するために９−フルオレニルメトキシカルボニルを利用する方法である。これら両方の方法は当業者周知である（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ １９８９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．，１９６３．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８４））。必要に応じて、このようなアミノ酸配列に追加のアミノおよび／またはカルボキシ末端のアミノ酸を設計して、ポリペプチド合成中に付加することができる。

また、組換え技術を用いてポリペプチドも生産することができる。組換え方法は、多数の細胞およびそれに対応する発現ベクターのどれを用いてもよく、このような発現ベクターとしては、これらに限定されないが、細菌発現ベクター、酵母発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクター、哺乳動物ウイルス発現ベクターなどが挙げられる。本明細書において説明されるポリペプチドは、トランスジェニック動物によって生産することができ、例えば、トランスジェニック動物の乳腺で生産することができる。場合によっては、発現ベクター中でカリクレインを阻害するポリペプチド（例えば、クニッツドメインを含むポリペプチド）に関するコード配列をその他のコード配列に融合させて、宿主細胞中で容易に発現される融合ポリペプチドを形成することが必要であるか、または、有利である可能性がある。追加の配列の一部または全部は、例えばプロテアーゼ消化によって除去してもよい。

カリクレインを阻害するポリペプチド（例えば、クニッツドメインを含むポリペプチド）を生産するための典型的な組換え発現系は、酵母発現ベクターであり、これは、上記阻害剤ポリペプチドに関するアミノ酸配列をコードする核酸配列を、同じリーディングフレーム内で、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＭＡＴαプレプロリーダーペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と連結させ、これを順に、作動可能な酵母プロモーターの制御下に置くことが可能にする。このようにして得られた組換え酵母発現プラスミドは、標準的な方法によって適切な性質の合う酵母宿主の細胞に形質転換することができ、このような細胞は、組換え酵母発現ベクターから組換えタンパク質を発現することができる。好ましくは、このような組換え発現ベクターで形質転換された宿主の酵母細胞はまた、融合タンパク質をプロセシングして、活性な阻害剤ポリペプチドを提供することもできる。組換えポリペプチドを生産するためのその他の典型的な酵母宿主は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

上述したように、カリクレインを阻害するポリペプチドは、本明細書において説明されるクニッツドメインのポリペプチドを含んでいてもよい。いくつかのポリペプチドは、アミノおよび／またはカルボキシ末端において、好ましくは長さが１〜６個のアミノ酸の追加のフランキング配列を含んでいてもよく、ただしこのような追加のアミノ酸は、本明細書において説明される方法および組成物における使用が不可能になるような、カリクレインの結合親和性またはカリクレインの阻害活性の有意な減少を起こさないものとする。このような追加のアミノ酸は、特定の組換え宿主細胞中でポリペプチドが発現されるように意図的に付加することができ、または、追加の機能が提供されるように付加することができ、例えば、その他の分子へのリンカーが提供されるように、または、ポリペプチドの精製を容易にする親和性部分が提供されるように付加することができる。このような追加のアミノ酸はシステインを含まないことが好ましく、このようなシステインはクニッツドメインのジスルフィド結合に干渉する可能性があるためである。

典型的なクニッツドメインのポリペプチドは、配列番号２の残基３〜６０のアミノ酸配列を含む。酵母の融合タンパク質発現系（例えば、組み込み発現プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２をベースとしたもの）中で発現されプロセシングされた場合、このようなクニッツドメインのポリペプチドは、Ｓ．セレビジエのＭＡＴアルファ−プレプロリーダーペプチド配列との融合による追加のアミノ末端Ｇｌｕ−Ａｌａジペプチドを保持する。酵母宿主細胞から分泌される場合、リーダーペプチドの多くは融合タンパク質からプロセシングされ、配列番号２のアミノ酸配列を有する機能的なポリペプチド（本明細書では「ＰＥＰ−１」と称される）を得ることができる（図１に記載のボックスで囲った領域を参照）。

典型的なクニッツドメイン、例えば配列番号１を含むクニッツドメインは、多数の不変の位置を含み、例えば、ＢＰＴＩの番号付けスキームに従って、５位、１４位、３０位、３３位、３８位、４５位、５１位、および、５５位に相当する位置がシステインである。これらの位置間の間隔は、クニッツドメインの折り畳み内部で許容できる程度に様々であってよく、例えば３個のジスルフィド結合が形成される程度の間隔である。その他の位置、例えば、６位、７位、８位、９位、２０位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、４１位、４２位、４４位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５２位、５３位、および、５４位、または、これらの位置に相当する位置は、どのようなアミノ酸であってもよい（非遺伝学的にコードされて生じるアミノ酸も含む）。特に好ましい実施態様において、１個またはそれより多くのアミノ酸は、天然型の配列を有するアミノ酸に相当する（例えば、配列番号３２、図２Ａおよび２Ｂを参照）。その他の実施態様において、少なくとも１つの可変の位置が、天然型の配列のその可変の位置とは異なる。さらにその他の好ましい実施態様において、このようなアミノ酸は、保存的または非保存的アミノ酸置換によってそれぞれ個々に置換されていてもよいし、または、集合的に置換されていてもよい。

保存的アミノ酸置換は、アミノ酸を類似の化学的性質を有するその他のアミノ酸で置き換え、タンパク質の機能に影響を与えない可能性がある。非保存的アミノ酸置換は、アミノ酸を類似していない化学構造を有するその他のアミノ酸で置き換える。保存されたアミノ酸置換の例としては、例えば、ＡｓｎのＧｌｎでの置換、ＡｒｇのＬｙｓでの置換、および、ＳｅｒのＴｈｒでの置換が挙げられる。その他の好ましい実施態様において、これらのアミノ酸のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および／または２１個が、独立して、または、集合的に、あらゆる組み合わせで、配列番号２のそれに相当する位置に一致するように選択することができる。

その他の位置、例えば、１０位、１１位、１３位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２１位、２２位、２３位、３１位、３２位、３４位、３５位、３９位、４０位、４３位、および、４５位、または、これらの位置に相当する位置は、選択されたアミノ酸群のいずれでもよい。例えば、配列番号１は、可能な配列群を定義する。この群の各要素は、例えば、５位、１４位、３０位、５１位および５５位にシステインを含み、さらに、１０位、１１位、１３位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２１位、２２位、２３位、３１位、３２位、３４位、３５位、３９位、４０位、４３位および４５位、または、これらの位置に相当する位置に特定のアミノ酸群のいずれか一種を含む。その他の好ましい実施態様において、これらのアミノ酸のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および／または１９個は、独立して、または、集合的に、あらゆる組み合わせで、それに相当する配列番号２の位置に一致するように選択することができる。上記ポリペプチドは、好ましくは、配列番号２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、９７、９８、または、９９％の同一性を有する。

本明細書で用いられる用語「実質的に同一な」（または「実質的に相同な」）は、本明細書において、十分な数の第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一または等価な（例えば、類似の側鎖、例えば保存されたアミノ酸で置換された）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含んでおり、第一および第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列が類似の活性を有するような、第一のアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味するものとして用いられる。抗体の場合、第二の抗体は同じ特異性を有し、元の抗体の少なくとも５０％の親和性を有する。

２つの配列間の「相同性」の計算は、以下のように行うことができる。それらの配列を最もよく比較できるように並べる（例えば、最適なアライメントが得られるように第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよいし、比較のために非相同配列を無視してもよい）。その他の好ましい実施態様において、比較目的で並べられた参考配列の長さは、参考配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、および、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。続いて、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列におけるある位置が、第二の配列におけるそれに対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、その分子はその位置において同一である（本明細書で用いられるアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性のパーセントは、それらの配列が共有する同一な位置の数の関数であり、それら２つの配列を最適に並べるために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さが考慮される。

配列の比較、および、２つの配列間の相同性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。その他の好ましい実施態様において、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３に記載のアルゴリズムを用いて、ブロッサム（Ｂｌｏｓｓｕｍ）６２マトリックス、または、ＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイト、ならびに、１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを用いて決定される（このアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに包含されている）。さらにその他の好ましい実施態様において、２つのヌクレオチド配列間の相同性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに、４０、５０、６０、７０または８０のギャップウェイト、および、１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを用いて決定される。特に好ましいパラメーター群（および、分子が相同性の限定の範囲内であるかどうかを決定するために、どのパラメーターを適用すべきか専門家がわからない場合に用いられると予想されるパラメーター群）は、１２のギャップペナルティー、４のギャップ伸長ペナルティー、および、５のフレームシフトギャップペナルティーのブロッサム６２のスコア行列である。

また有用なポリペプチドは、本明細書において説明されるポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされていてもよい。このような核酸は、中程度の、高い、または、極めて高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる。本明細書で用いられる用語「低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高いストリンジェンシー、または、極めて高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を説明している。ハイブリダイゼーション反応を行うための指針は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ジョン・ワイリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ），ニューヨーク（１９８９），６．３．１−６．３．６（これは、参照により開示に含まれる）に見ることができる。この参考文献中に水性および非水性の方法が説明されており、そのいずれも使用可能である。本明細書で述べられた特定のハイブリダイゼーション条件は、以下の通りである：（１）約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、それに続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄少なくとも５０℃で（洗浄温度は、低いストリンジェンシー条件の場合、５５℃まで高めることができる）；（２）約４５℃、６×ＳＳＣ中での中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、それに続いて、６０℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれより多くの洗浄；（３）約４５℃、６×ＳＳＣ中での高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、それに続いて、６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれより多くの洗浄；および、（４）６５℃、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中での、極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、それに続いて、６５℃、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中での１回またはそれより多くの洗浄。

修飾
クニッツドメインを阻害するポリペプチドを様々な方法で修飾することが可能である。例えば、上記ポリペプチドは、１種またはそれより多くのポリエチレングリコール部分に結合してその化合物を安定化させたり、または、保持時間を、例えば、少なくとも２、４、５、８、１０、１５、２０、５０、１００、５００または１０００倍延長させたりすることができる。

カリクレインを阻害するポリペプチドは、ポリマーに会合させる（例えば、結合させる）ことができ、例えば、ポリアルキレンオキシド、または、ポリエチレンオキシドのような実質的に非抗原性のポリマーに会合させることができる。適切なポリマーは、重量によって実質的に異なると予想される。約２００〜約３５，０００（または、約１，０００〜約１５，０００、および、２，０００〜約１２，５００）の範囲の数平均分子量を有するポリマーが使用可能である。１つのポリペプチドに複数のポリマー部分が結合していてもよく、例えば、例えば、約２，０００〜７，０００ダルトンの平均分子量を有する、少なくとも３または４つのこのような部分が結合していてもよい。

例えば、上記ポリペプチドは、水溶性ポリマー、例えば親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコール、および、ポリビニルピロリドンに結合していてもよい。このようなポリマーの非限定的な例としては、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーが挙げられる（ただし、ブロックコポリマーの水溶性は維持される）。追加の有用なポリマーとしては、ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、および、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ））；ポリメタクリラート；カルボマー；糖類の単量体Ｄ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアリン酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸、または、アルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコース、および、ノイラミン酸を含む、分枝状または非分枝状の多糖類、例えば、ホモ多糖類、および、ヘテロ多糖類、例えばラクトース、アミロペクチン、スターチ、ヒドロキシエチルスターチ、アミロース、デキストラン硫酸塩、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または、酸ムコ多糖類の多糖類サブユニット、例えばヒアルロン酸；糖アルコールのポリマー、例えばポリソルビトール、および、ポリマンニトール；ヘパリン、または、ヘパランが挙げられる。

またその他の化合物も、上記のポリマーに結合することができ、このような化合物としては、例えば、細胞毒素、標識、または、その他の標的となる物質もしくは関連のない物質が挙げられる。架橋を形成するためには、モノ活性化アルコキシ末端ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えば、モノメトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）；Ｃ_１〜４アルキル末端ポリマー；および、ビス活性化ポリエチレンオキシド（グリコール）を用いることができる。例えば、米国特許第５，９５１，９７４号を参照。

方法
本発明において、関節の病変を有する、または、関節の病変を有する疑いのある被検体に、非天然カリクレイン阻害剤を投与することによって、関節の病変を有する被検体を治療し、このような病変に伴う痛みおよび不快感を低減させる方法および組成物を提供する。このような関節の病変の例としては、（一次性（特発性）または二次性）変形性関節症、リウマチ様関節炎、関節の傷害（例えば、反復動作による傷害）、軟骨の病変（軟骨軟化症）、および、関節炎前の状態が挙げられる。本明細書で用いられる用語「治療」および「〜を治療すること」は、関節の病変の改善、重症度の低減、または、症状の安定化を意味する。

本方法は、関節の病変の治療が必要なヒトにおいて実施してもよいし、または、ヒト以外の被検体において実施してもよい。
一実施態様において、治療方法は、ｐＫａｌ阻害剤としての、非天然クニッツドメインを含むポリペプチドの投与を含む。本方法の一実施態様は、広範なセリンプロテアーゼの親和性よりも約３０倍またはそれよりも高いカリクレインへの親和性を有する配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用し、このようなポリペプチドは、例えばアプロチニンであり、これは、ウシの肺から単離されたものであり、現在のところ冠状動脈バイパス移植術法での使用に承認されている（トラジロール（ＴＲＡＳＹＬＯＬ^ＴＭ），バイエル社医薬部門（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ），ウェストヘブン，コネティカット州）。

非天然ｐＫａｌ阻害剤を投与すると、変形性関節症、リウマチ様関節炎、関節の傷害、軟骨の病変、または、関節炎前の状態のような関節の病変の少なくとも１種の症状の改善、重症度の低減、または、安定化が起こる。

関節の病変（例えば、変形性関節症、リウマチ様関節炎、関節の傷害、軟骨の病変、または、関節炎前の状態）の症状としては、痛み、具体的には関節痛、および、関節の機能（例えば、可動域、握力）の損失が挙げられる。

関節の病変の症状は、あらゆる適切な技術またはテクノロジーを用いて測定することもできる。例えば、痛みは、疼痛スケール、例えば視覚的疼痛スケール（ＶＡＳ）を用いて測定することもできる。その他の有用な測定としては、関節の機能の測定、例えば可動域、握力などの測定が挙げられる。より一般的に全体的な機能を説明するその他の測定、例えば、被検体が立った姿勢を維持することができる時間、または、特定の距離を歩くのに要する時間の測定が有用である。また、患者の関節炎関連の機能に関する質問票およびその他の測定、または、全般的な性能の測定も有用であり、このような測定としては、例えば関節炎影響測定尺度（ＡＩＭＳ）、改訂および増補された関節炎影響測定尺度健康状態質問票（ＡＩＭＳ２）、健康状態質問票（ＨＡＱ）、日常生活動作のカッツ（Ｋａｔｚ）インデックス（ＫＩＡＤＬ）、または、日常生活の手段的動作（ＩＡＤＬ）が挙げられる。その治療効果はまた、機能的な欠陥の程度における改善を測定することによって評価することもできる。機能的な欠陥（およびそれらの改善）は、特定の人種に対する確認済み多次元インデックス（ＳＭＩ：ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ，ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｉｎｄｅｘ）、例えば、臀部およびひざのＯＡに関するウェスタンオンタリオおよびマックマスター大学（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ’ｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ）（ＷＯＭＡＣ^ＴＭ）のＯＡインデックス、または、集計された多次元インデックス（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｉｎｄｅｘ：ＡＭＩ）、例えば、臀部またはひざのためのアルゴファンクショナルインデックス（Ａｌｇｏ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｄｅｘ：ＡＦＩ）（Ｌｅｑｕｅｓｎｅ等（１９８７）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，６５：８５−８９）を用いることによって測定することができる。

併用療法
上記非天然ｐＫａｌ阻害剤は、関節の病変のための併用療法の一環として、関節内補充薬と共に投与してもよい。

本発明に係るｐＫａｌ阻害剤との併用療法で用いられる関節内補充薬は、好ましくは、ヒアルロン酸ベースの関節内補充薬である。用語「ＨＡ」、「ヒアルロナート」、「ヒアルロナン」は、同じ意味で用いられ、特に他の指定がない限り、源（細菌によって発酵したものか、または、動物によって誘導されたもの）、分子量、その物理的形状（例えば、ゲルまたは流体）、または、化学修飾（例えば、架橋、または、別の方法での誘導体化）の存在もしくは非存在または製造方法に関係なく、あらゆるＨＡを意味する。

様々な関節内補充薬が使用されている（ただし、利用可能性は国によって様々である）。典型的な関節内補充薬は、ヒアルロン酸（ＨＡ）の塩、典型的にはヒアルロン酸ナトリウム、または、それらの誘導体（例えばヒラン）を含む。ＨＡベースの関節内補充薬としては、例えば、オルソビスク（ＯＲＴＨＯＶＩＳＣ（Ｒ））、アニカ・セラピューティックス社（Ａｎｉｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）；オステニル（ＯＳＴＥＮＩＬ（Ｒ））、ＴＲＢケメディカＳＡ（ＴＲＢ Ｃｈｅｍｅｄｉｃａ ＳＡ）；デュロラン（ＤＵＲＯＬＡＮＥ（Ｒ）），Ｑ−Ｍｅｄ ＡＢ）；フェルマトロン（ＦＥＲＭＡＴＨＲＯＮ^ＴＭ）、バイオメット（Ｂｉｏｍｅｔ）；スプラシン（ＳＵＰＬＡＳＹＮ^ＴＭ）、バイオニケ・ファーマ社（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）；および、シンビスク（ＳＹＮＶＩＳＣ（Ｒ））、ジェンザイム社（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ）が挙げられる。ヒランＡおよびヒランＢなどのヒランおよび関節内補充薬の製剤は、例えば、米国特許第５，１４３，７２４号；４，７１３，４４８号；５，０９９，０１３号；および、５，３９９，３５１号で説明されている。

非天然ｐＫａｌ阻害剤との併用療法で用いられる実例となる関節内補充薬は、ヒランＧ−Ｆ２０（シンビスク（Ｒ））である。シンビスク（Ｒ）は、２つの形態のＨＡ、すなわち可溶性の形態のヒランＡ（平均分子量は６，０００ｋＤａ）、および、生理学的に許容できる溶液中での水和ゲルの形態のヒランＢ１を、それぞれ８＋２ｍｇ／ｍｌで含む。ヒラン流体は、水和物ヒランＡであり、これは、少数のアルデヒドで形成された架橋で修飾された（それにより平均分子量が増加し、粘弾性が増大する）ヒアルロナンの形態である。ヒランのゲルは、ヒランＢの水和した形態であり、これは、二官能価の架橋試薬としてジビニルスルホンを用いて連続した高分子ネットワークにヒランＡを架橋させることによって製造される。
シンビスク（Ｒ）におけるヒランＡ/ヒランＢの比率は、ＨＡの重量に基づき９：１である。

本発明の方法に適したその他の生成物としては、米国特許第５，１４３，７２４号；４，７１３，４４８号；５，０９９，０１３号；５，３９９，３５１号；６，５２１，２２３号；および、５，８２７，９３７号；および、米国公開特許公報番２００５／０１４２１５２号で説明されている関節内補充薬が挙げられる。

いくつかの実施態様において、本発明に係る併用療法で用いられる関節内補充薬はさらに、約２０ｍｇ／ｍｌ未満のＨＡを含むことを特徴とする場合があり、例えば、１〜１５、１〜１０、１〜５、５〜１５、５〜１０、１０〜１５、６〜１０、または、７〜９ｍｇ／ｍｌの範囲のＨＡを含むことを特徴とする。ヒアルロナートは、様々な技術を用いて測定することもでき、このような技術としては、ヘキスロン酸を定量するための比色によるカルバゾール法が挙げられる（Ｄｉｓｃｈｅ等（１９４７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６７：１８９−１９８）。

また関節内補充薬は、追加の活性成分または不活性成分を含んでいてもよく、このような成分としては、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばアスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン ナトリウム、ジクロフェナク、または、ピロキシカム、鎮痛薬、例えばアセトアミノフェン、麻酔薬、例えばリドカイン、または、ブピバカイン、オピオイド鎮痛薬、例えばコデイン、または、モルヒネ、および／または、コルチコステロイド、例えばデキサメタゾン、および、プレドニゾンが挙げられ；さらに関節内補充薬は、細胞（例えば、軟骨細胞、または、間葉幹細胞）、タンパク質、ＤＮＡ、ビタミンのような成分、または、その他の望ましい生物学的に活性な物質を含んでいてもよい。

多くのＨＡベースの関節内補充薬は、比較的少量で（例えば、注射１回あたり２ｍｌ）週３〜５回の関節内注射で投与することを目的とする（ただしデュロラン（Ｒ）以外であり、これは１回の注射で投与される）。しかしながら、その他の投与スケジュール、例えば米国特許公報第２００６／０１４８７５５号で開示された一回で大量（例えば、４ｍｌより多く、または、約６ｍｌ）の注射技術も、本発明の方法において有用である。

ｐＫａｌ阻害剤と関節内補充薬との併用療法は、多種多様な構成で提供することができる。本ｐＫａｌ阻害剤を関節内注射によって投与しようとする状況において、本ｐＫａｌ阻害剤および関節内補充薬を一つの組成物として共投与してもよいし、または、それらを別々の注射で投与してもよい。ある種の状況において、本ｐＫａｌ阻害剤および関節内補充薬は、併用療法のこれら２種の構成要素に関して望ましい投与スケジュールに応じて、短い時間間隔で投与されるか（例えば、注射間の時間間隔が短いこと、例えば同じ治療期間中に行われること）、または、より長い間隔で投与される。本ｐＫａｌ阻害剤を全身（非経口）投与で投与しようとする場合、本ｐＫａｌ阻害剤と関節内補充薬とは、併用療法のこれら２種の構成要素に関して目的とする投与スケジュールに応じて、短い時間間隔で投与してもよいし、または、より長い間隔で投与してもよい。

投与
本ｐＫａｌ阻害剤（単独で、または、併用療法の一部として）は、関節の病変の臨床症状が発病する前に、その際に、および／または、その後に患者に投与することができる。患者は、一般的にはヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。ヒト患者は、成人の患者、例えば、年齢１９〜２５歳、２６〜４０歳、４１〜５５歳、５６〜７５歳、および、７６歳の患者、および、それより高齢の患者、さらに、小児患者、例えば、年齢０〜２歳、３〜６歳、７〜１２歳、および、１３〜１８歳の患者を含む。

用語「製薬上許容できる」組成物は、本明細書において説明されるｐＫａｌ阻害剤と共に患者に投与することができる非毒性のキャリアーまたは賦形剤を意味する。このようなキャリアーまたは賦形剤は、本組成物の生物学的な活性または薬理活性に適合するように選択される。本明細書において説明されるｐＫａｌ阻害剤（および、併用療法の場合は、関節内補充薬）は、本阻害剤および／または関節内補充薬の阻害的な量を患者に送達するためのあらゆる適切な手段によって、局所的に投与してもよいし、または、全身投与してもよく、このような手段としては、これらに限定されないが、例えば、静脈内および吸入のような全身投与が挙げられる。本ｐＫａｌ阻害剤にとって特に好ましくは、非経口投与である。

非経口投与の場合、本ｐＫａｌ阻害剤は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または、皮下に注射してもよい。非経口投与の好ましい経路は、皮下注射および静脈内投与である。また、特に関与する関節が、中型から大型の関節（例えば、臀部、ひざ、肘、足首、手首）である場合、局所（関節内）注射も有用である。

典型的には、注射による投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液（例えば、ナトリウム／カリウムリン酸緩衝生理食塩水）中の溶液である。その他の製薬上許容できるキャリアーとしては、これらに限定されないが、滅菌水、食塩水、および、緩衝食塩水（リン酸塩または酢酸塩のような緩衝剤を含む）、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パラフィンなどが挙げられる。必要に応じて、本組成物はまた、活性な化合物と有害な反応を起こさない限り、可溶化剤、および、注射部位の痛みを軽減するための局所麻酔剤（例えばリドカイン）、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、塩、潤滑剤などを含んでいてもよい。同様に、本組成物は従来の賦形剤を含んでいてもよく、例えば、非経口、経腸または鼻腔内への適用に適した、活性な化合物と有害な反応を起こさない製薬上許容できる有機または無機物質キャリアー物質を含んでいてもよい。一般的に、このような成分は、別々に供給されるか、または、活性物質の量を活性単位で示した密封容器（例えばアンプル、小袋またはバイアル）中で、例えば乾燥凍結乾燥粉末、または、水分を含まない濃縮物として１回投与量中に一緒に混合されるかのいずれかであると予想される。本組成物を点滴によって投与しようとする場合、滅菌した医薬品グレードの「注射用水」または塩類溶液を含む点滴ボトルを用いて分配することができる。本組成物を注射によって投与しようとする場合、滅菌注射用水または塩類溶液の容器（例えば、アンプルまたはバイアル）は、上記成分を投与の前に混合できるように提供することができる。

非天然ｐＫａｌ阻害剤を皮下投与するための典型的な調合物は、緩衝剤（例えば、ヒスチジンまたはリン酸緩衝液）を含む緩衝液、および、凍結保護物質（例えば、スクロース、または、スクロースおよびマンニトール、任意にデキストラン４０のようなデキストランを含んでいてもよい）を含み、さらに、２００７年３月９日付けで出願された米国出願第１１／７１６，２７８号で説明されているように、貯蔵および分配のために凍結乾燥してもよい。

一実施態様において、本ｐＫａｌ阻害剤は、あらゆる承認された手法に従って、静脈内注射として患者に投与される。その他の実施態様において、本ｐＫａｌ阻害剤は、大量皮下注射剤として患者に投与される。その他の実施態様において、本ｐＫａｌ阻害剤は、関節内注射によって患者の影響を受けた関節に投与される。静脈内および関節内投与は、典型的には、健康管理の専門家によって臨床条件下（例えば、病院、応急処置、または、医師の診療室）で行われるが、皮下注射は、自分で投与してもよいし、または、健康管理の専門家によって投与してもよい。

全身投与の場合にカリクレイン阻害剤の用量を決定するために評価することができるパラメーターを、以下でＤＸ−８８（非天然カリクレイン阻害剤、配列番号２）に関して説明する。血漿中の循環するプレカリクレインの総量は、約５００ｎＭ〜６００ｎＭであると報告されている（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ等，“Ｔｈｅ Ｃｏｎｔａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，” ｉｎ Ｂｌｏｏｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｄｉｎ，Ｒ．等編集，Ｊ Ｂ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）。全てのプレカリクレインが活性化された場合、カリクレインを化学量論的に阻害するのに約５２０ナノモル／ＬのＤＸ−８８を用いることができる。５Ｌの血漿を有する個体は、ＤＸ−８８の分子量が７，０５４ダルトンであることに基づいて、２．６マイクロモル、または、約１８ｍｇのＤＸ−８８の用量を必要とすると予想される。これは、以下のようにして計算した：ＤＸ８８のＫｉは、０．０４４ｎＭである。例えば血漿カリクレイン（ＰＫ）の濃度が１ｎＭであることが望ましい場合、式Ｋｉ＝０．０４４ｎＭ＝［ＤＸ８８］×［ＰＫ］／［ＤＸ８８−ＰＫ］＝［ＤＸ８８］×１ｎｍ／４９９ｎＭから、遊離のＤＸ−８８の濃度が、２２．０ｎＭであることが示される。従って、必要なＤＸ−８８の総量は、４９９＋２２または５２１ｎＭと予想される。この用量は、全てのプレカリクレインが活性化されたとは限らない場合、または、カリクレインの一部が、内因性の阻害剤、例えばＣ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）によって不活性化された場合、比例的に減少する可能性がある。従って、具体的な実施態様において、約５、１０、１５、２０、３０、４０、６０，８０、１２０、２５０、５００、６００、７００、８００、１０００ｍｇのＤＸ−８８を、単回投与で、または、２４時間にわたり１回またはそれより多くの用量で被検体に投与することができる。患者の年齢、体重、および、関節の病変および付随する症状の重症度のような数種のその他の要因を考察することによって、実際に必要なＤＸ−８８の用量をより正確に推定できる可能性がある。

いくつかの実施態様において、本カリクレイン阻害剤ポリペプチドは、約１〜５００ｍｇ／ｍ^２の用量で、好ましくは約１〜２５０ｍｇ／ｍ^２、１〜１００ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

装置およびキット
本カリクレイン阻害剤を含む医薬組成物は、医療用装置を用いて投与してもよい。本装置は、病院または緊急処置室／応急処置施設以外の環境（例えば、自宅または医師の診療室で患者または治療奉仕者によって）で用いることができるように、携帯できること、室温で貯蔵できること、および、使用が容易であることといった特徴を持つように設計することができる。本装置は、非天然カリクレイン阻害剤を含む医薬配合物を貯蔵するための１個またはそれより多くのハウジングを含んでいてもよく、さらに、１回またはそれより多くの物質または物質群の単位用量が送達されるように設計することができる。

静脈内投与は、１回で大量に投与してもよいし、または、適切な注射または点滴装置（例えば、カテーテル、点滴ポンプ、インプラントなど）を用いて点滴によって行ってもよい。皮下注射は、例えばカテーテルおよび点滴ポンプ、または、埋め込み可能な装置を用いた点滴として行ってもよい。その他の多くの装置、インプラント、送達システムおよびモジュールもよく知られている。

本ｐＫａｌ阻害剤が凍結乾燥粉末として分配される場合、それらを使用前に再溶解させなければならない。手動での再溶解（例えば、希釈剤を、凍結乾燥製剤を含む容器に注入ポートを介して注射することによって凍結乾燥製剤に手動で添加すること）を用いてもよいし、または、本ｐＫａｌ阻害剤は、自動的に再溶解されるように（例えば、自動的に凍結乾燥製剤に希釈剤が添加されるように）設計された装置中に提供してもよく、このような装置としては、例えばベクトン・ディッキンソン（ＢＥＣＴＯＮ−ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）のＢＤ^ＴＭリキッド・ドライ・インジェクター（ＢＤ^ＴＭ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｒｙ Ｉｎｊｅｃｔｏｒ）が挙げられる。

非天然カリクレイン阻害剤は、キット中に提供することができる。一実施態様において、本キットは、（ａ）非天然カリクレイン阻害剤を含む組成物を含む容器、および、（ｂ）本明細書において説明される方法、および／または、治療的有用性に関する物質の用途について述べた資料を含む。

具体的な実施態様において、本キットはさらに、関節内補充薬も含む。例えば、本キットは、非天然カリクレイン阻害剤を含む組成物を含む第一の容器、および、関節内補充薬を含む第二の容器を含む。本ｐＫａｌ阻害剤および関節内補充薬が単一の組成物として投与される方法で使用するために、非天然カリクレイン阻害剤および関節内補充薬が同じ容器に供給されていてもよい。

本キットの資料は、その形態において限定されない。一実施態様において、このような資料には、化合物の生産に関する情報、化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチ、または、生産場所の情報などが含まれていてもよい。一実施態様において、このような資料は、例えば、関節の病変、例えば（一次性（特発性）または二次性）変形性関節症、リウマチ様関節炎、関節の傷害（例えば、反復動作による傷害）、軟骨の病変（軟骨軟化症）、または、関節炎前の状態を有する被検体を治療するのに適切な用量、投薬形態または投与様式（例えば、本明細書において説明される用量、投薬形態または投与様式）で非天然カリクレイン阻害剤を投与する方法について述べられている。このような情報は様々な様式で提供することができ、印刷された文章、コンピューターで読取り可能な資料、ビデオ録画もしくは音声録音、または、重要な資料へのリンクまたはアドレスを提供する情報を含む。

非天然カリクレイン阻害剤（および、存在する場合、関節内補充薬）に加えて、本キット中の組成物は、溶媒もしくは緩衝液、安定剤、または、保存剤のようなその他の成分を含んでいてもよい。非天然カリクレイン阻害剤（および、存在する場合、関節内補充薬）は、あらゆる形態で提供することができ、例えば、液体、乾燥した形態または凍結乾燥形態で提供することができ、好ましくは実質的に純粋な、および／または、滅菌された形態で提供することができる。このような物質が液体溶液中に提供される場合、このような液体溶液は、好ましくは水溶液である。このような物質が乾燥した形態として提供される場合、一般的に、再溶解は適切な溶媒の添加によってなされる。任意に、このような溶媒、例えば滅菌水または緩衝液を本キット中に提供してもよい。

本キットは、上記物質を含む組成物または組成物群に応じて１個またはそれより多くの容器を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本キットは、本組成物および資料に応じて別個の容器、仕切りまたは区画を含む。例えば、本組成物は、ボトル、バイアルまたは注射器に入れてもよく、資料は、プラスチック製のスリーブまたは小箱に入れてもよい。その他の実施態様において、本キットの別個の要素は、単一の分割されていない 容器内に入れられる。例えば、本組成物は、ボトル、バイアルまたは注射器に入れられ、そこに、資料がラベルの形態で貼付けられる。いくつかの実施態様において、本キットは、複数の（例えば一群の）個々の容器を含み、それらそれぞれに、上記物質の１またはそれより多くの１回投与量（例えば、本明細書において説明される投薬形態）が含まれる。このような容器は、組み合わせの投与単位を含んでいてもよく、例えば、非天然カリクレイン阻害剤と関節内補充薬との両方を例えば望ましい比率で含む単位を含んでいてもよい。例えば、本キットは、複数の注射器、アンプル、金属箔の包み、ブリスターパック、または、医療用装置を含み、例えば、これらはそれぞれ、単一の組み合わせの単位用量を含む。本キットの容器は、気密性、防水性（例えば、水分蒸発における変化に対して不浸透性）、および／または、耐光性を有していてもよい。

本キットは、任意に、本組成物の投与に適した装置を含んでいてもよく、例えば、注射器、またはその他の適切な送達装置を含んでいてもよい。本装置は、上記物質の一方または両方を予め充填して提供することもでき、または、空の状態（ただし、充填に適した状態）であってもよい。

多数の本発明の実施態様が説明されている。それにもかかわらず、当然のことながら、本発明の本質および範囲から逸脱することなく様々な改変を施すことが可能である。従って、その他の実施態様は、以下の請求項の範囲内である。

Claims (25)

1. 関節の病変を治療する方法であって、該方法は、関節の病変を有する個体に、非天然血漿カリクレイン阻害剤の有効量を投与することを含む、上記方法。
2. 前記血漿カリクレイン阻害剤が、以下のアミノ酸配列：
   

   

   を含むポリペプチドを含み、
   ここでＸａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７またはＸａａ５８は、それぞれにアミノ酸であるか、または、存在せず；
   Ｘａａ１０が、ＡｓｐおよびＧｌｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ１１が、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、および、Ｔｈｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ１３が、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、および、Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ１５が、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、および、Ｇｌｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ１６が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、および、Ａｓｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ１７が、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、および、Ｔｈｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ１８が、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、および、Ａｌａからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ１９が、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、および、Ｉｌｅからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ２１が、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、および、Ｉｌｅからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ２２が、Ｔｙｒ、および、Ｐｈｅからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ２３が、Ｔｙｒ、および、Ｐｈｅからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ３１が、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、および、Ｔｈｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ３２が、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、および、Ｖａｌからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ３４が、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、および、Ｌｅｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ３５が、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、および、Ｐｈｅからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ３９が、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、および、Ａｓｐからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ４０が、Ｇｌｙ、および、Ａｌａからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ４３が、Ａｓｎ、および、Ｇｌｙからなる群より選択されるアミノ酸であり；
   Ｘａａ４５が、Ｐｈｅ、および、Ｔｙｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；および、ここでこれらのポリペプチドは、カリクレインを阻害する、請求項１に記載の方法。
3. Ｘａａ１０が、Ａｓｐである、請求項２に記載の方法。
4. Ｘａａ１１が、Ａｓｐである、請求項２に記載の方法。
5. Ｘａａ１３が、Ｐｒｏであり、Ｘａａ１５が、Ａｒｇであり、Ｘａａ１６が、Ａｌａであり、Ｘａａ１７が、Ａｌａであり、Ｘａａ１８が、Ｈｉｓであり、および、Ｘａａ１９が、Ｐｒｏである、請求項２に記載の方法。
6. Ｘａａ２１が、Ｔｒｐである、請求項２に記載の方法。
7. Ｘａａ３１が、Ｇｌｕである、請求項２に記載の方法。
8. Ｘａａ３２が、Ｇｌｕである、請求項２に記載の方法。
9. Ｘａａ３４が、Ｉｌｅである、請求項２に記載の方法。
10. Ｘａａ３５が、Ｔｙｒである、請求項２に記載の方法。
11. Ｘａａ３９が、Ｇｌｕである、請求項２に記載の方法。
12. 前記ポリペプチドが、
    

    

    を含む、請求項２に記載の方法。
13. 前記ポリペプチドが、アミノ末端のＭｅｔ残基の前にＧｌｕ−Ａｌａ配列をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記関節の病変が、変形性関節症、リウマチ様関節炎、関節の反復動作による傷害、軟骨の病変、および、関節炎前の状態からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
15. 前記関節の病変が、一次性変形性関節症である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記関節の病変が、二次性変形性関節症である、請求項１４に記載の方法。
17. 関節内補充薬を関節内注射によって投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
18. 前記関節内補充薬が、ヒアルロン酸（ＨＡ）ベースの関節内補充薬である。、請求項１７に記載の方法
19. 関節内補充薬を関節内注射によって投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
20. 前記関節内補充薬が、ヒアルロン酸（ＨＡ）ベースの関節内補充薬である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ポリペプチドが、
    

    

    を含む、請求項１４に記載の方法。
22. 前記ポリペプチドが、アミノ末端のＭｅｔ残基の前にＧｌｕ−Ａｌａ配列をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 治療有効量の請求項１に記載の非天然血漿カリクレイン阻害剤、および、治療有効量のＨＡベースの関節内補充薬を含む組成物。
24. 非天然血漿カリクレイン阻害剤を含む容器；および、
    関節の病変を治療するための前記カリクレイン阻害剤の使用説明書、
    を含むキット。
25. 関節内補充薬を含む容器をさらに含む、請求項２４に記載のキット。

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