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JP2010535015A - 免疫原性のポリペプチドおよびモノクローナル抗体 - Google Patents

免疫原性のポリペプチドおよびモノクローナル抗体 Download PDF

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Abstract

肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を発現させるための組成物および方法を提供する。さらに詳細には、本組成物および方法は、ＰｈｔＤのフラグメントおよびそれらの変異体、ならびに、ポリペプチドをコードまたは発現する、核酸、ベクター、およびトランスフェクト細胞を含む、免疫原性のポリペプチドに関する。免疫原性のポリペプチドの作製および使用方法についても記載する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照することによりその全体が本明細書に援用される、２００７年７月２３日に出願した米国仮特許出願第６０／９６１，７２３号の利益を主張する。
本発明は免疫学に関し、さらに詳細には、細菌に対する免疫応答の誘発に関する。
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）は、肺、中枢神経系（ＣＮＳ）、中耳、および鼻道を含む、幾つかの臓器に感染しうる、どこにでもある普遍的なヒト病原体である。感染は、気管支炎、肺炎、髄膜炎、副鼻腔感染症、および敗血症などのさまざまな症状をもたらす。 肺炎連鎖球菌はヒトにおける細菌性の髄膜炎の主な原因であり、抗生物質による治療にもかかわらず、著しく高い死亡率および罹患率と関わりがある（非特許文献１）。
現在、利用可能な肺炎球菌のワクチンは２種類存在する。１つは、肺炎球菌の感染を引き起こす莢膜型の菌株の約９０％を代表する、２３種類の異なる莢膜多糖類からなる成人用のワクチンである。しかしながら、このワクチンは、肺炎球菌の感染の影響を受けやすい年齢層である子供には免疫原性がない。成人では、ワクチンは、菌血症の肺炎に対して約６０％の有効性を示したが、年齢または内在する病状が原因で、肺炎球菌の感染の危険性の高い成人では有効性が低くなる（非特許文献２；非特許文献３）。このワクチンは、感染の最も一般的な病型である、非菌血症の肺炎球菌の肺炎に対しては効果を示さなかった。
２つ目の利用可能なワクチンは、２歳未満の子供における菌血症の肺炎球菌感染に対して有効な、７価結合型ワクチンである。該ワクチンの肺炎に対する効果も実証されている（非特許文献４）。このワクチンの生産は、７種類の異なる複合体の生産を必要とするため複雑であり、ワクチンが高価であることの原因となる（約２００米ドル／子供）。さらには、ワクチンは、非ワクチン型の肺炎連鎖球菌が非常に一般的である発展途上国世界における感染には上手く対処していない（非特許文献５；非特許文献６）。このワクチンは、感染病と同様、中耳炎およびコロニー形成に対しても効果がない。７価結合型ワクチンの使用は、ワクチンに含まれる７種類の多糖類によっては代表されない、コロニー形成の増大および莢膜型の菌株を伴う疾患の増大を引き起こすことが示されている（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
Quagliarelloらの（1992） N. Eng. J. Med. 327: 869-872 Fedson,およびMusher. 2004. "肺炎球菌の多糖 Vaccine", pp. 529-588. In Vaccine. S. A. PlotkinおよびW. A. Orenstein（eds.）、W. B. SaundersおよびCo., Philadelphia, PA； ShapiroらのN. Engl. J. Med. 325:1453-1460（1991） BlackらのArch. Pediatr. 11（7）:485-489（2004） Di FabioらのPediatr. Infect. Dis. J. 20:959-967（2001） Mulholland, Trop. Med. Int. Health 10:497-500（2005） BogaertらのLancet Infect. Dis. 4:144-154（2004） EskolaらのN. Engl. J. Med. 344:403-409（2001） MbelleらのJ. Infect. Dis. 180:1171-1176（1999）
したがって、肺炎連鎖球菌のための有効な治療が依然として必要とされている。
肺炎連鎖球菌に対する免疫応答を誘発するための組成物および方法について記載する。免疫原性のＰｈｔＤポリペプチド、特に、それらのフラグメント、誘導体、および変異体、ならびにそれらをコードする核酸が提供される。このようなポリペプチド、フラグメント、誘導体、または変異体について特異性を有するモノクローナル抗体（およびそれらを産生するハイブリドーマ）も提供する。さらには、免疫原性のポリペプチド、誘導体、変異体、およびモノクローナル抗体の生産および使用方法も提供する。
本発明は、
ａ）配列番号：２に対して少なくとも９０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸；
ｂ）配列番号：２に対して少なくとも９０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸に対して完全に相補的な核酸；および
ｃ）ＴがＵで置換された、（ａ）または（ｂ）のＲＮＡ
からなる群より選択される単離された核酸を提供する。
本発明の好ましい実施の形態によれば、配列の同一性は、少なくとも８５％、９０％、および、さらに好ましくは９５〜１００％である。
本発明は、配列番号：２に対して、少なくとも ８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号：２に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性 を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体とを含む単離されたポリペプチドも提供する。
本発明の別の態様によれば、
ａ）配列番号：３に対して少なくとも８０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸；
ｂ）配列番号：３に対して少なくとも８０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸に対して完全に相補的な核酸；および
ｃ）ＴがＵで置換された、（ａ）または（ｂ）のＲＮＡ
からなる群より選択される単離された核酸が提供される。
本発明の好ましい実施の形態によれば、配列の同一性は、少なくとも８５％、９０％、およびさらに好ましくは９５〜１００％である。
本発明は、配列番号：３に対して、少なくとも ８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号：３に対して、少なくとも ８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体とを含む、単離されたポリペプチドも提供する。
本発明の別の態様によれば、
ａ）配列番号：４に対して少なくとも８０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸；
ｂ）配列番号：４に対して少なくとも８０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸に対して完全に相補的な核酸；および
ｃ）ＴがＵで置換された（ａ）または（ｂ）のＲＮＡ
からなる群より選択される単離された核酸が提供される。
本発明の好ましい実施の形態によれば、配列の同一性は、少なくとも８５％、９０％、およびさらに好ましくは９５〜１００％である。
本発明は、配列番号：４に対して、少なくとも ８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号：４に対して、少なくとも ８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体と、を含む単離されたポリペプチドも提供する。
本発明のさらなる態様によれば、配列番号：４に示されたアミノ酸配列を有するペプチドの抗原決定基に特異的に結合するモノクローナル抗体も提供する。
本発明の好ましい実施の形態によれば、モノクローナル抗体が特異的に結合する抗原決定基は、アミノ酸１およびアミノ酸１０１にわたる領域において配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに配置される。
本発明は、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４、または、配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７からなる群より選択されるそれらの変異体からなる群より選択される免疫原性のフラグメントも提供する。
本発明の別の態様によれば、配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４、または、配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７からなる群より選択されるそれらの変異体からなる群より選択されるＰｈｔＤの少なくとも１種類のポリペプチドを宿主に投与することを含む、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌に対して宿主に免疫性を与える方法、およびストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌による感染を治療する方法も提供する。
本発明のさらなる態様によれば、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するハイブリドーマによって産生される抗体と同一の抗原結合特異性を有するモノクローナル抗体を提供する。
本発明の好ましい実施の形態では、モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１からなる群より選択される。
本発明は、宿主におけるストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌による感染を予防する方法および治療する方法であって、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１からなる群より選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体を、宿主に投与することを含む方法についても提供する。
本発明の好ましい実施の形態では、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌による感染の予防および／または治療するため、少なくとも２種類のモノクローナル抗体が投与される。
本発明の別の態様によれば、生物学的サンプルにおけるタンパク質の量を決定する方法であって、
生物学的試験サンプルを、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１、またはそれらの誘導体からなる群より選択されるモノクローナル抗体に曝露し、
サンプルに結合する抗体または誘導体の量を測定し、
生物学的試験サンプルに結合している量を対照の生物学的サンプルに観察される結合量と比較する、
各工程を有してなり、
対照の生物学的サンプルに対する生物学的試験サンプルにおける結合の増加が、その中のタンパク質の存在を示唆することを特徴とする方法を提供する。
本発明のさらなる態様によれば、生物学的サンプルにおけるストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌またはそれらのタンパク質を検出する方法が提供され、本方法は、
（ａ）特異性を有するサンプルの成分に対する抗体を考慮する条件下で、生物学的試験サンプルを、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１、またはそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体に曝露し、
（ｂ）生物学的試験サンプルの成分に結合する抗体の量を決定し、
（ｃ）対照サンプルへの結合量に対する生物学的試験サンプルに結合する抗体の量を比較する、
各工程を有してなり、
対照の生物学的サンプルと比較して、生物学的試験サンプル成分への抗体の結合量が顕著に多いことにより、サンプル中にストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌またはそれらのタンパク質の存在が示唆されることを特徴とする。
生物学的サンプルにおけるストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌またはそれらのタンパク質を検出するためのキットも本発明によって提供され、前記キットは、
ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１、またはそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体と、
使用説明書と、
を有してなる。
さらなる態様および実施の形態は、上述の典型的な態様および実施の形態に加えて、以下の詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。
モノクローナル抗体の結合部位を特定し、ポリクローナル血清に由来する交差反応性の抗体を吸収し、防御エピトープを取り囲むＰｈｔＤの領域を画成し、完全長タンパク質によって提供されるもの、および、製造の間に利点を提供しうるものよりも高い解像度で、ヒト免疫応答（臨床試験において）を特徴づける、免疫学的薬剤または手段として有用なポリペプチドおよび核酸を提供する。試験試薬としてのこのトランケート型のタンパク質の回収は、多価ワクチンに対してＰｈｔＤの個人の寄与の特徴付けを可能にするであろう。
１つの実施の形態では、ＰｈｔＤに対する免疫応答を刺激し、それによって有機体を治療することによる、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌などのＰｈｔＤを発現する有機体の存在に関係する病状の治療および／または予防に有用な組成物および方法を提供する。免疫応答は、ＰｈｔＤ、それらの免疫原性のフラグメント、またはそれらの変異体、またはそれらのいずれかをコードする核酸の宿主への投与後に起こることが示されている。このような事例では、ＰｈｔＤ、それらの免疫原性のフラグメント、またはそれらの変異体は、免疫原として作用する。本明細書では「免疫原」は、ポリペプチド、ペプチド、フラグメント、またはそれらの変異体であり、それぞれ、免疫原が投与される宿主において免疫応答を生じるＰｈｔＤに由来する。免疫応答は、免疫原の少なくとも１つのエピトープに結合する交代の産生、および／または、免疫原のエピトープを発現する細胞に対する細胞の免疫応答の発生を含みうる。反応は、例えば、抗体反応の増大（例えば 抗体の量、親和性／親和力（avidity）の増大）、または、細胞の反応の増大（例えば、Ｔ細胞の活性化数の増大、Ｔ細胞受容体の親和性／親和力の増大）を検出することによる、免疫原に対して存在する免疫応答の増強として検出されうる。免疫応答の他の測定は、当技術分野で既知であり、宿主における免疫応答の存在の決定に利用することができるであろう。これらを決定するための標準的な方法は、当技術分野で利用可能である。特定の実施の形態では、免疫応答は検出可能であるが、必ずしも防御的である必要はない。このような事例では、免疫原を含む組成物は、免疫学的組成物とみなされうる。特定の実施の形態では、免疫応答は防御的であり、ＰｈｔＤの発現生物（例えばストレプトコッカス（Streptococcus）属）の増殖を妨げるか、あるいは、ＰｈｔＤの発現生物を宿主から排除する能力を有することを特徴とすることを意味する。このような事例では、免疫原を含む組成物は、依然として免疫学的組成物とみなされる一方で、さらにワクチンと称される場合がある。特定の実施の形態では、複数の免疫原が、単一の組成物に用いられる。
ＰｈｔＤの免疫原性のフラグメント（例えば免疫原）は、フラグメントの作製および使用方法と共に、本明細書に記載されている。本明細書に記載される免疫原は、完全長のＰｈｔＤ（シグナル配列の有無に関わらず）、それらのＰｈｔＤフラグメント、およびそれらの変異体を含めたポリペプチドを含む。用いられるアミノ酸配列は、肺炎連鎖球菌のＰｈｔＤに由来し（ＧｅｎＢａｎｋ取得番号 ＡＦ３１８９５５； AdamouらのInfect. Immun. 69 (2), 949-958 (2001)）、下記のアミノ酸配列を有することが好ましい：
Figure 2010535015
好ましい免疫原性の組成物は、例えば、配列番号：２、３、４、１５、１６、または１７のアミノ酸配列を有する、１種類以上のポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、１種類以上のミノ酸の同類置換および／またはシグナル配列および／または、Ｈｉｓなどの検出可能な「タグ」（例えば、ＭＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号：１８）；例えば、配列番号：１５〜１７参照）を含みうる。 典型的には、好ましい免疫原性のフラグメントは、下記を含む：
トランケーション１
Figure 2010535015
トランケーション２
Figure 2010535015
および、
トランケーション３
Figure 2010535015
上述のように、本明細書が提供する免疫原性のポリペプチドは、免疫原性のＰｈｔＤのポリペプチド（例えば 配列番号：２、３、および／または４）への１種類以上のアミノ酸の同類置換を含みうる。例えば、本明細書が提供する免疫原は、１種類以上のアミノ酸配列が改変された、天然のＰｈｔＤのＣ−末端部分を含んでいて差し支えなく、それによって約６０〜約９９％の配列の同一性、または天然のＰｈｔＤとの類似性が維持されうる。 典型的な変異体は、配列番号：２、３、４、１５、１６、および／または１７と、約６０〜約９９％、約６０〜約６５％、約６５〜約７０％、約７０〜約７５％、約８０〜約８５％、約８５〜約９０％、約９０〜約９９％、または約９５〜約９９％が類似または同一のアミノ酸配列、および／または、フラグメントまたはそれらの誘導体を有する。変異体は、本明細書に教示される方法または当分野で使用可能なものを用いて、免疫原として機能する能力に関して選択することが好ましい。
適切なアミノ酸配列の改変としては、本明細書で述べるＰｈｔＤポリペプチドのアミノ酸に対して、置換、挿入、欠失または他の変化が挙げられる。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性のポリペプチドであるかぎり、単一の変異体に組み込まれて差し支えない。 挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端の融合、および単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、通常、アミノまたはカルボキシル末端の融合の場合よりも小さい挿入であり、例えば、約１〜４残基である。欠失は、タンパク質の配列からの１種類以上のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。典型的には、タンパク質分子内の１つの部位で、わずか約２〜６残基が削除される。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的な変異誘発によって調製され、それによって変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後、組換え細胞培養液にＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡにおける所定の部位に置換変異を作製するための技術は周知であり、限定はしないが、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発が挙げられる。アミノ酸置換は、典型的には単一の残基であるが、一度に多くの異なる位置に生じさせることができる。置換型の変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。このような置換は、一般に、下記表１に従って作製され、これらは同類置換と称され、一般に、その位置におけるアミノ酸残基の大きさ、極性、電荷、疎水性、または親水性にはほとんどあるいは全く影響せず、特に、免疫原性の低下を生じさせない。しかしながら、他についても当業者によく知られている。
Figure 2010535015
本明細書で用いられる変異体には、同族のＰｈｔＤ遺伝子内の１つ以上の部位で多型を発現する別の連鎖球菌（Streptococcus）株に由来する天然のＰｈｔＤ対立遺伝子も含みうる。変異体は、従来の分子生物学の技術によって産生させることができる。変異体は、天然の遺伝子と比較して同様または同一の配列に関連して、本明細書に記載されている。２つのポリペプチドまたは核酸の配列の類似性および同一性の決定方法は、当業者に容易に理解される。例えば、配列の類似性は、２つの配列を、同一性が最大レベルになるように位置合わせした後に計算することができる。アラインメント（位置合わせ）は、ある程度、アラインメントプログラムにおいて特定のアルゴリズムを使用することによって決まる。例えば、SmithおよびWatermanのAdv. Appl. Math. 2: 482 (1981)に記載される局所的相同性アルゴリズム；NeedlemanおよびWunschのJ. MoL Biol. 48: 443 (1970)に記載される相同性アラインメントアルゴリズム；PearsonおよびLipmanのPNAS USA 85: 2444 (1988) に記載される類似法の探求；これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Wisconsin Genetics Software Package社のGenetics Computer Group, 575 Science所属のマディソン博士（米国ウィスコンシン州所在））；およびAltschulらのNucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1977に記載されるＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０およびアルゴリズム；AltschulらのJ. Mol. Biol. 215:403-410, 1990；ZukerのM. Science 244:48-52, 1989；JaegerらのPNAS USA 86:7706-7710, 1989；およびJaegerらのMethods Enzymol. 183:281-306, 1989が挙げられる。複数の配列アラインメント法の最近の検討は、NuinらのBMC Bioinformatics 7:471, 2006に提供されている。これらの参照文献の各々は、少なくとも
、配列の類似性のアラインメントおよび計算に関する材料について、参照することにより本明細書に取り込まれる。配列の類似性または同一性を決定する方法は、典型的には使用可能であり、また、場合によっては、これらさまざまな方法の結果が異なりうるものと理解されよう。例えば９５％の配列類似性がもたらされる場合、これらの類似性は、計算に許容される方法の少なくとも１つを用いて探知可能でなければならない。
本明細書に記載される免疫原性のポリペプチドは、１種類以上のアミノ酸類似体または非天然の立体異性体を含みうる。これらのアミノ酸の類似体および立体異性体は、部位特異的な方法でペプチド鎖に類似のアミノ酸を挿入するため、選択するアミノ酸を有するｔＲＮＡ分子を帯電させること、および、例えばアンバー・コドンを活用する遺伝子構築物を設計することにより、ポリペプチド鎖に容易に取り込むことができる（少なくともアミノ酸の類似体に関する材料について、参照することによりそのすべてが本明細書に取り込まれる、ThorsonらのMethods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991)；ZollerのCurrent Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992)；IbbaのBiotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995)；CahillらのTIBS, 14(10):400-403 (1989)；BennerのTIB Tech, 12:158-163 (1994)；IbbaおよびHenneckeのBio/technology, 12:678-682 (1994)を参照）。ペプチドと似ているが、天然のペプチド結合を介した結合ではない、免疫原性のフラグメントを産生することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体の結合としては、ＣＨ2ＮＨ--、--ＣＨ2Ｓ--、--ＣＨ2-ＣＨ2--、--ＣＨ＝ＣＨ--（シスおよびトランス）、--ＣＯＣＨ2--、--ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2--、および-ＣＨＨ2ＳＯ-- が挙げられる（これらおよび／または他のものは、少なくとも結合に関する材料に関して、参照することによりそれぞれが本明細書に取り込まれる、Spatola, A. F.の“Peptide backbone modifications: A structure-activity analysis of Peptides containing amide bond surrogates, conformational constraints, and related backbone modifications.” In Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, pp. 267-357. Weinstein, B. editor, Marcel Dekker, New York, N.Y. (1983)；Morley, TrendsのPharm. Sci. 1(2):463-468 (1980)；HudsonらのInt J Pept Prot Res 14:177-185 (1979)（--ＣＨ2ＮＨ--、ＣＨ2ＣＨ2--）；SpatolaらのLife Sci 38:1243-1249 (1986)（--ＣＨ Ｈ2-Ｓ）；HannのJournal of the Chemical Society: Perkin Transactioins 1 pp.307-314 (1982)（--ＣＨ-ＣＨ--、シスおよびトランス）；AlmquistらのJ. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980)（--ＣＯＣＨ2--）；Jennings-WhiteらのTetrahedron Lett 23:2533 (1982)（--ＣＯＣＨ2--）；Szelkeらの欧州特許出願公開第００４５６６５号明細書(1982)（--ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2--）；HolladayらのTetrahedron. Lett 24:4401-3404 (1983)（--Ｃ（ＯＨ）ＣＨ2--）；およびHrubyのLife Sci 31:189-199 (1982)（--ＣＨ2-Ｓ--）；に記載されている）。
アミノ酸 類似体および立体異性体は、しばしば、さらに経済的な生産、より大きい化学安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効能、有効性など）、特異性の変化（例えば物活性の広域スペクトル）などの促進された、または望ましい特性を有する。例えばＤ−アミノ酸は、天然のペプチダーゼによって認識されないことから、さらに安定なペプチドを生成するために使用することができる。同型のＤ−アミノ酸を有する共通配列の１種類以上のアミノ酸の組織的置換（例えば、Ｌ−リジンに代えてＤ−リジン）を使用して、さらに安定なペプチドを生成することができる。システイン残基を使用して、２種類以上のペプチドを一緒に環化または付加することもできる。これは、ペプチドを特定の構造内に拘束するために有益でありうる（参照することにより本明細書に取り込まれる、RizoおよびGieraschのAnn. Rev. Biochem. 61:387 (1992)）。
他の変異体には、１種類以上の免疫標的配列（例えば、ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＴＡＴ；配列番号：１９）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ＡｎｔＰ；配列番号：２０）、ＳＲＲＨＨＣＲＳＫＡＫＲＳＲＨＨ（ＰＥＲ１−１；配列番号：２１）、またはＧＲＲＨＨＲＲＳＫＡＫＲＳＲ（ＰＥＲ１−２；配列番号：２２））が免疫原性のＰｈｔＤポリペプチドに連結しているものが含まれる。よって、免疫原性の融合タンパク質は、本発明の実施において、生成し、利用して差し支えない。
１つの実施の形態では、配列番号：２、３、または４などのＰｈｔＤポリペプチドをコードする核酸、もしくはそれらの変異体が提供される（例えば、配列番号：５〜１０）。縮重変異体（degenerate variants）を含む、これらの配列の変異体も提供される。特定の実施の形態では、ぺプチド配列をコードする核酸分子は、下記にさらに詳しく述べるように、発現ベクターに導入されて差し支えない。このような実施の形態では、ペプチド配列は、アミノ酸配列に対応するヌクレオチドによってコードされる。下記表２に示すように、さまざまなアミノ酸をコードするヌクレオチドの特定の組合せは、当業者が用いるさまざまな参照文献に記載される通り、当技術分野で周知である（例えば、Lewinの B. Genes V, Oxford University Press, 1994参照）。核酸変異体は、対象とするポリペプチドをコードするヌクレオチドの任意の組合せを使用して差し支えない。
Figure 2010535015
配列番号：２、３、４、１５、１６、および１７のポリペプチドをコードする典型的な核酸（例えば、Ｈｉｓタグの存在下および不存在下で）を以下に示す：
トランケーション１（Ｈｉｓタグなし）：
Figure 2010535015
トランケーション１（Ｈｉｓ−タグ化）：
Figure 2010535015
トランケーション２（Ｈｉｓタグなし）：
Figure 2010535015
トランケーション２（Ｈｉｓ−タグ化）：
Figure 2010535015
トランケーション３（Ｈｉｓタグなし）：
Figure 2010535015
トランケーション３（Ｈｉｓ−タグ化）：
Figure 2010535015
非常にストリンジェントな条件下で、配列番号：２、３、４、１５、１６、および／または１７のいずれか、または配列番号：５〜１０のいずれかをコードするヌクレオチド配列に対応するハイブリッド形成プローブの任意の部分にハイブリッドする単離された核酸も提供する。ハイブリッドする核酸のハイブリッド部位は、典型的には、少なくとも１５残基（例えば、１５、２０、２５、３０、４０、またはそれ以上）の長さのヌクレオチドである。ハイブリッド部位は、それがハイブリッドする配列の部位と、少なくとも６５％、８０％、９０％、９５％、または９９％一致している。ハイブリッドする核酸は、例えば、クローニング・プローブ、プライマー（例えばＰＣＲプライマー）、または診断用プローブとして有用である。核酸二重鎖またはハイブリッド安定性は、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である、融解温度Ｔｍとして表される。この融解温度は、必要とされるストリンジェンシー条件を定義するために用いられる。配列が関係し、プローブに対して、同一というよりはむしろ、実質的に同一であると判断される場合、最初に、同族のハイブリッド形成のみが特定の濃度の塩と共に生じる最低温度を確立するのに有用である（例えば、さまざまな濃度のＳＳＣまたはＳＳＰＥ緩衝剤を使用する）。１％の不適合によりＴｍが１℃低下すると仮定すると、ハイブリッド形成反応における最終的な洗浄温度はそれに応じて低下する（例えば、９５％を超える同一性を有する配列を探す場合、最終的な洗浄温度は５℃低下する）。実際には、Ｔｍの変化は、１％の不適合あたり、０．５〜１．５℃でありうる。非常にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳ中、６８℃でハイブリッドし、０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、室温で洗浄することを含む。「適度にストリンジェントな条件」は、３×ＳＳＣ中、４２℃で洗浄することを含む。塩の濃度および温度は、プローブおよび標的核酸の同一性の最適レベルを達成するために変化させうる。このようなストリンジェンシー条件に関するさらなる指導は、当技術分野において容易に入手することができ、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition by Sambrooket al. Cold Spring Harbor Press, 2001を参照のこと。
発現ベクターも、本発明の実施における用途に適しているであろう。発現ベクターは、典型的には、ポリペプチドをコードする非相同の核酸配列（「コード配列」）に機能的に結合するフランキング配列からなる。他の実施の形態では、またはこのような実施の形態と組み合わせて、フランキング配列はコード配列の複製、転写、および／または翻訳をもたらす能力を有することが好ましく、コード配列に機能的に結合する。「機能的に結合」されるとは、核酸配列がそれらの通常の機能を行うように構成されることを示している。例えば、プロモーターがコード配列の転写を導く能力がある場合、プロモーターは、コード配列に機能的に結合する。フランキング配列は、正確に機能するために、コード配列と接触する必要はない。よって、例えば、介在する、翻訳されていない、すでに転写された配列は、プロモーター配列とコード配列の間に存在し、プロモーター配列はコード配列に機能的に結合されているとみなされうる。フランキング配列は、同族の（例えば宿主細胞における同一の種および／または株から）、非相同の（例えば宿主細胞種または株以外の種から）、ハイブリッドの（例えば２つ以上の起源に由来するフランキング配列の組合せ）、または合成のものであって差し支えない。フランキング配列はまた、宿主のゲノムにおいてポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列の発現を制御する機能をする配列でありうる。
特定の実施の形態では、フランキング配列は、標的細胞において高水準に遺伝子を発現させる転写調節領域であることが好ましい。転写調節領域は、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、リプレッサー要素、またはそれらの組合せを含みうる。転写調節領域は、構造特異的であるか、あるいは、組織または細胞型特異的でありうる（例えば、領域は、別の型と比較して、組織また細胞の１つの型において高水準に転写する）。このようにして、転写調節領域の起源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎動物または無脊椎動物、または任意の植物であって差し支えなく、フランキング配列は宿主細胞機構において機能し、宿主細胞機構によって活性化されうる。本発明の実施では、広範な転写調節領域が利用されうる。
適切な転写調節領域としては、とりわけ、ＣＭＶプロモーター（例えばＣＭＶ−前初期プロモーター）；真核細胞遺伝子に由来するプロモーター（例えばエストロゲン誘発性のニワトリ卵白アルブミン遺伝子、インターフェロン遺伝子、グルココルチコイド誘発性チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、およびチミジンキナーゼ遺伝子）；主要な早期および晩期のアデノウイルス遺伝子プロモーター；ＳＶ４０早期プロモーター領域（BernoistおよびChambonの1981, Nature 290:304-10）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’−長端末反復（ＬＴＲ）に含まれるプロモーター（Yamamotoらの1980, Cell 22:787-97）；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）・プロモーター（Wagnerらの1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45）；メタロチオニン遺伝子の制御配列（Brinsterらの1982, Nature 296:39-42）；またはβ−ラクタマーゼ・プロモーターなどの原核生物発現ベクターに認められる制御配列において（Villa-Kamaroffらの1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-31）、ｔａｃプロモーター（DeBoerらの1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25）、またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、ｐＢＡＤアラビノースプロモーター、またはｐＴｒｃプロモーターにおけるものなどが挙げられる。組織および／または細胞型特異的転写調節領域としては、例えば、膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swiftらの1984, Cell 38:639-46；Ornitzらの1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986)；MacDonaldの1987, Hepatology 7:425-515）；膵β細胞において活性なインスリン遺伝子調節領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-22）；リンパ球様細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（Grosschedlらの1984, Cell 38:647-58；Adamesらの1985, Nature 318:533-38；Alexanderらの1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44）；睾丸細胞、乳腺細胞、リンパ球様細胞、および肥満細胞におけるマウス乳癌ウイルス調節領域（Lederらの1986, Cell 45:485-95）；肝臓におけるアルブミン遺伝子調節領域（Pinkertらの1987, GenesおよびDevel. 1:268-76）；肝臓におけるα−フェト−タンパク質遺伝子調節領域（Krumlaufらの1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48；Hammerらの1987, Science 235:53-58）；肝臓におけるα1−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Kelseyらの1987, GenesおよびDevel. 1:161-71）；骨髄性細胞におけるβ−グロブリン遺伝子調節領域（Mogramらの1985, Nature 315:338-40；Kolliasらの1986, Cell 46:89-94）；脳の乏突起膠細胞におけるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readheadらの1987, Cell 48:703-12）；骨格筋におけるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Sani, 1985, Nature 314:283-86）；および、視床下部における性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Masonらの1986, Science 234:1372-78）、およびメラノーマ細胞におけるチロシナーゼプロモーター（HartのI. Semin Oncol 1996 Feb;23(1):154-8；SidersらのCancer 遺伝子Ther 1998 Sep-Oct;5(5):281-91）が挙げられる。他の適切なプロモーターは、当技術分野で既知である。
標的とする免疫原をコードする核酸分子は、ウイルスまたは非ウイルスのベクターの一部として投与されうる。１つの実施の形態では、ＤＮＡベクターは、標的とする免疫原および／または関連する分子（例えば、同時刺激分子、サイトカインまたはケモカイン）をコードする核酸を患者に送達するために利用される。こうすることで、さまざまな戦略を用いて、このような機構の効率性を改善することができ、例えば、自己複製するウイルスレプリコン（Caleyらの1999. Vaccine, 17: 3124-2135；Dubenskyらの2000. Mol. Med. 6: 723-732；Leitnerらの2000. Cancer Res. 60: 51-55）、コドンの最適化（Liuらの2000. Mol. Ther., 1: 497-500；Dubensky, 上記参照；Huangらの2001. J. Virol. 75: 4947-4951）、インビボにおけるエレクトロポレーション（Wideraらの2000. J. Immunol. 164: 4635-3640）、同時刺激分子、サイトカインおよび／またはケモカインをコードする核酸の取り込み（Xiangらの1995. Immunity, 2: 129-135；Kimらの1998. Eur. J. Immunol., 28: 1089-1103；Iwasakiらの1997. J. Immunol. 158: 4591-3601；Sheerlinckらの2001. Vaccine, 19: 2647-2656）、ＣｐＧなどの促進モチーフの取り込み（Gurunathan、上記参照；Leitner、上記参照）、環内のまたはユビキチン処理経路を標的とする配列（Thomsonらの1998. J. Virol. 72: 2246-2252；Veldersらの2001. J. Immunol. 166: 5366-5373）、プライム‐ブースト法（Gurunathan、上記参照；Sullivanらの2000. Nature, 408: 605-609；Hankeらの1998. Vaccine, 16: 439-445；Amaraらの2001. Science, 292: 69-74）、プロテアソーム感受性の切断部位、および、サルモネラ属などの粘膜送達ベクターの使用（Darjiらの1997. Cell, 91: 765-775；Wooらの2001. Vaccine, 19: 2945-2954）の使用が挙げられる。他の方法は当技術分野で既知であり、その一部を下記に記載する。
核酸を宿主へ導入するために使用が成功しているさまざまなウイルスベクターとしては、とりわけ、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスが挙げられる。このようなウイルスベクターの多くは当分野で入手可能であることが、当分野で理解されよう。本発明のベクターは、当業者に広く利用可能である標準的な組換え技術を用いて構築されうる。このような技術は、下記のような一般的な分子生物学の参考文献に見出すことができる：Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrookらの1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）；Gene Expression Technology（Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA）；およびPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Innisらの1990. Academic Press, San Diego, CA）。
好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスの誘導体、およびマウスまたは鳥レトロウイルスの誘導体である。適当なレトロウイルスベクターの例としては、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。いくつかのレトロウイルスベクターは、複数の外因性の核酸配列を組み込むことができる。組換えレトロウイルスは不完全であるため、それらは感染性ベクター粒子を生じるためには補助を必要とする。この補助は、例えば、レトロウイルス構造遺伝子をコードするヘルパー細胞系によって提供することができる。適当なヘルパー細胞系としては、とりわけ、Ψ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２が挙げられる。そのような細胞系を用いて産生したベクターウイルス粒子を、次いで、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のような組織細胞系を感染させるのに使用し、大量のキメラレトロウイルス粒子を生成することができる。レトロウイルスベクターは、従来の方法（例えば注入）によって、または標的細胞集団の近傍への「産生細胞系」を移植することによって投与されうる（Culver, K.らの1994, Hum. Gene Ther., 5 (3): 343-79；Culver, K.らのCold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59: 685-90）；Oldfield, E., 1993, Hum. Gene Ther., 4 (1): 39-69）。産生細胞系は、ウイルスベクターを産生し、ウイルス粒子を標的細胞付近に放出するように操作されている。放出されたウイルス粒子の一部は標的細胞と接触し、それらの細胞に感染し、そのようにして本発明の核酸を標的細胞に送達する。標的細胞の感染後、ベクターの核酸の発現が起こる。
アデノウイルスベクターは、真核細胞中への遺伝子運搬（Rosenfeld, M.らの1991, Science, 252 (5004): 431-3；Crystal, R.らの1994, Nat. Genet., 8 (1): 42-51）、真核細胞の遺伝子発現研究（Levrero, M.らの1991, Gene, 101 (2): 195-202）、ワクチン開発（Graham, F.およびPrevec, L.の1992, Biotechnology, 20: 363-90）、および動物モデルにおいて（Stratford-Perricaudet, L.らの1992, Bone Marrow Transplant., 9 (Suppl. 1): 151-2 ；Rich, D.らの1993, Hum. Gene Ther., 4 (4): 461-76）、特に有用であることが証明されている。組換えＡｄをインビボにおけるさまざまな組織に投与するための実験的経路は、とりわけ、気管内導入（Rosenfeld, M.らの1992, Cell, 68 (1): 143-55）、筋肉内注射（Quantin, B.らの1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89 (7): 2581-3）、末梢静脈注射（Herz, J.およびGerard, R.の1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90 (7): 2812-6）および脳への定位接種（Le Gal La Salle, G.らの1993, Science, 259 (5097): 988-90）が挙げられる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、宿主細胞ゲノムへの一体化において、高レベルの感染性、広い宿主域および特異性を示す（Hermonat, P.らの1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (20): 6466-70）。また、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１） は、その神経親和性に起因して、特に神経系における使用にとって、さらに別の魅力的なベクター系である（Geller, A.らの1991, Trends Neurosci., 14 (10): 428-32； Gloriosoらの1995, Mol. Biotechnol., 4 (1): 87-99；Gloriosoらの1995, Annu. Rev. Microbiol., 49: 675-710）。
ポックスウイルスは別の有用な発現ベクターである（Smithらの1983, Gene, 25 (1): 21-8；Moss, et al, 1992, Biotechnology, 20: 345-62；Moss, et al, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38；Mossらの1991. Science, 252: 1662-1667）。有用であることが分かっているポックスウイルスとしては、とりわけ、ワクシニア、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、鶏痘、カナリヤポックス、ＡＬＶＡＣ、およびＡＬＶＡＣ（２）が挙げられる。
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）は、既知のまたは可能性のある病原性因子をコードするゲノムの必須ではない６つの領域を欠失することによって、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株から得られた（たとえば、米国特許第５，３６４，７７３号および第５，４９４，８０７号明細書を参照）。欠失した遺伝子座はまた、外来遺伝子の挿入のための受容体遺伝子座として設計された。欠失した領域は、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；および、大サブユニットであるリボヌクレオチド還元酵素の（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６である。ＮＹＶＡＣは、病原性および宿主域に関連する遺伝子産物をコードする、１８個のオープンリーディングフレームの特異的欠失によって作製された、遺伝子操作されたワクシニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣはＴＡを発現するために有用であることが示されている（例えば、米国特許第６，２６５，１８９号明細書を参照）。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）、ｖＰ９９４、ｖＣＰ２０５、ｖＣＰ１４３３、ｐｌａｃＺＨ６Ｈ４Ｌreverse、ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３およびｐＣ３Ｈ６ＦＨＶＢもまたブダペスト条約の条項に従ってＡＴＣＣに寄託されており、登録番号はそれぞれＶＲ−２５５９、ＶＲ−２５５８、ＶＲ−２５５７、ＶＲ−２５５６、ＡＴＣＣ−９７９１３、ＡＴＣＣ−９７９１２、およびＡＴＣＣ−９７９１４である。
ＡＬＶＡＣ系組換えウイルス（例えば、ＡＬＶＡＣ−１およびＡＬＶＡＣ−２）もまた、本発明の実施における使用に適している（例えば、米国特許第５，７５６，１０３号明細書を参照）。ＡＬＶＡＣ（２）は、ＡＬＶＡＣ（２）ゲノムがワクシニアプロモーターの制御下にあるワクシニアＥ３ＬおよびＫ３Ｌ遺伝子を含む以外は、ＡＬＶＡＣ（１）と同一である（米国特許第６，１３０，０６６号明細書；Beattieらの１９９５ａ，１９９５ｂ，１９９１； Ｃｈａｎｇらの１９９２； Daviesらの１９９３）。ＡＬＶＡＣ（１）およびＡＬＶＡＣ（２）の両方が、ＴＡなどの外来ＤＮＡ配列の発現に有用であることが実証されている（Tartagliaらの１９９３ ａ，ｂ； 米国特許第５，８３３，９７５号明細書）。ＡＬＶＡＣはブダペスト条約の条項に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国２０１１０−２２０９，バージニア州マナサス、ユニバーシティ・ブルバード１０８０１所在）に寄託されており、ＡＴＣＣ登録番号はＶＲ−２５４７であった。
別の有用なポックスウイルスベクターはＴＲＯＶＡＣである。ＴＲＯＶＡＣとは、１日齢の雛のワクチン接種用に認可されている鶏痘ウイルスのＦＰ−１ワクチン株に由来する、プラーククローニングされた単離株である、弱毒化鶏痘をいう。ＴＲＯＶＡＣは同様に、ブダペスト条約の条項に従ってＡＴＣＣに寄託され、登録番号は２５５３であった。
「非ウイルス」プラスミドベクターもまた、特定の実施の形態において適切でありうる。好ましいプラスミドベクターは、細菌、昆虫、および／または哺乳類宿主細胞に適合する。そのようなベクターとしては、例えば、ＰＣＲ−ＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在））、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在））、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎｅ社製（米国ウィスコンシン州マディソン所在））、ｐＧＥＸ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在））、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製（米国カリフォルニア州パロアルト所在））、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃｉｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））、ｐＤＳＲ−α（国際公開第９０／１４３６３号パンフレット）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製（米国ニューヨーク州グランドアイランド所在））、ならびにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数のＣＯＬＥ１系ファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在））、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物のクローニング用に設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯ（商標）ＴＡクローニング（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（米国カリフォルニア州カールズバッド所在）））が挙げられる。細菌性のベクターもまた本発明と共に用いることができる。これらのベクターとしては、例えば、赤痢菌（Shigella）、サルモネラ菌（Salmonella）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、乳酸桿菌属（Lactobacillus）、カルメット・ゲラン桿菌（Bacille calmette guerin）（ＢＣＧ）、および連鎖球菌（Streptococcus）（例えば、国際公開第８８／６６２６号；同第９０／０５９４号；同第９１／１３１５７号；同第９２／１７９６号；および同第９２／２１３７６号の各パンフレット参照）が挙げられる。他の多くの非ウイルス性のプラスミド発現ベクターおよび系が当技術分野で既知であり、本発明と共に用いることができる。
例えば、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注入、ＣａＰＯ4沈殿物、遺伝子銃の技術、エレクトロポレーション、およびコロイド分散系などの他の送達技術もまた本発明の実施に十分であろう。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、および、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベ−ス系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、インビトロおよびインビボにおける送達媒体として有用な人工膜小胞である、リポソームである。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクト（無傷）なビリオンは、水溶液（aqueous）内部にカプセル化され、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（Fraley, R.らの1981, Trends Biochem. Sci., 6: 77）。リポソームの組成物は、通常、リン脂質、特に相転移温度が高いリン脂質の組合せであり、通常、ステロイド、特に、コレステロールとの組合せである。他のリン脂質または他の脂質も使用して差し支えない。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価陽イオンの存在に応じて決まる。リポソーム産生において有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが挙げられる。特に有用なのは、ジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここで脂質部分は、１４〜１８個の炭素原子、特には１６〜１８個の炭素原子を含み、飽和している。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
ベクターを含む培養細胞も提供される。培養細胞は、ベクターをトランスフェクトされた培養細胞、またはその細胞の子孫であって差し支えなく、ここで、細胞は免疫原性のポリペプチドを発現する。適切な細胞系は当業者に既知であり、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）を通じて市販されている。トランスフェクト細胞は、免疫原性のポリペプチドの産生方法に使用することができる。その方法は、免疫原性のポリペプチドを発現させる条件下、随意的に発現配列の制御下で、ベクターを含む細胞を培養する工程を含む。免疫原性のポリペプチドは、標準的なタンパク質精製方法を用いて、細胞または培地から単離することができる。
免疫原性のポリペプチドは、より大きいポリペプチドまたはタンパク質の標準的な酵素的開裂を使用して作出することができ、または、タンパク質の化学的技術によって、２種類以上のペプチドまたはポリペプチドを連結させることにより作出することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、今日利用可能な実験装置を使用し、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）の化学（Applied Biosystems, Inc.社製（米国カリフォルニア州フォスターシティ所在））のいずれかを用いて、化学合成することができる。ペプチドの縮合反応、ネイティブケミカルライゲーション、固相化学、または酵素的ライゲーションによって、２つのフラグメントを、それらのカルボキシル末端およびアミノ末端において、ペプチド結合を介して共有結合させて、免疫原性のＰｈｔＤポリペプチドを形成することができる（そこに記載される方法を参照することにより、そのすべてが本明細書に取り込まれる、Synthetic Peptides: A User Guide., Grant, ed., W.H. Freeman and Co., New York, N.Y. (1992)；Principles of Peptide Synthesis., Bodansky and Trost, eds. Springer-Verlag Inc., New York, N.Y. (1993)；Abrahmsen LらのBiochemistry, 30:4151 (1991)；DawsonらのScience, 266:776-779 (1994)；Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, Stewart, ed., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, (1984)）。
免疫原性のポリペプチド、および１種類以上のポリペプチドを含む組成物を用いて、抗体を産生させてもよい。よって、被験体においてＰｈｔＤに特異的な抗体を産生させる方法は、該被験体に本明細書に記載される免疫原性のＰｈｔＤフラグメントを投与することを含む。ＰｈｔＤポリペプチドと結合する抗体（あるいはフラグメントまたはそれらの誘導体）も本明細書で提供する。
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であって差し支えなく、完全ヒトまたはヒト化抗体であって差し支えなく、天然の抗体および一本鎖抗体が挙げられる。抗体は、免疫原性のＰｈｔＤポリペプチドまたはフラグメント、またはそれらの誘導体を、被験体に投与することによって、インビボにおいて作製することができる。インビトロにおける抗体産生は、ハイブリドーマ法を用いてモノクローナル抗体を作製することを含む。ハイブリドーマ法は当技術分野で周知であり、are described by そこに記載される方法を参照することにより、そのすべてが本明細書に取り込まれる、KohlerおよびMilsteinのNature, 256:495 (1975)、およびHarlowおよびLaneのAntibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)に記載されている。
一本鎖抗体の産生方法は、当業者に周知である。例えば、米国特許第５，３５９，０４６号明細書参照（参照することによりこれらの方法の全体を本明細書に援用する）。一本鎖抗体は、短いペプチドリンカーを使用し、重鎖および軽鎖の可変領域を一緒に融合させることにより作出され、それによって単一分子上に抗原結合部位が再構成される。１つの可変領域のＣ末端が１５〜２５のアミノ酸ペプチドまたはリンカーを介して他の可変領域のＮ末端につながれている、一本鎖抗体の可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）は、抗原の結合または結合の特異性を顕著に崩壊させることなく、開発されてきた。リンカーは、それらの適切な立体構造の配向性（conformational orientation）において、重鎖および軽鎖が互いに結合するように選択される。例えば、リンカーに関する材料について参照することにより本明細書に取り込まれる、Huston, J. S.らのMethods in Enzym. 203:46-121 (1991)を参照されたい。
ＰｈｔＤポリペプチドに対する完全ヒトおよびヒト化抗体は、本明細書に記載される方法に使用されうる。ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（受容体抗体）を含み、ここで 、受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基は、所望の特異性、親和性、および受容能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置換される。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換される。免疫を付与する際に、ヒト抗体のすべて（full repertoire）（例えば 完全ヒト抗体）を産生する能力のある、トランスジェニック動物（例えばマウス）が用いられうる。キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける抗体の重鎖の連結領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全阻害をもたらす。生殖細胞系変異マウスなどにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じさせる（例えば、JakobovitsらのPNAS USA, 90:2551-255 (1993)；JakobovitsらのNature, 362:255-258 (1993)；BruggemannらのYear in Immuno., 7:33 (1993)）。ヒト抗体 can also be produced in phage display libraries（HoogenboomらのJ. Mol. Biol., 227:381 (1991)；MarksらのJ. Mol. Biol., 222:581 (1991)）。CoteらおよびBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製方法について記載している（Coleらの“The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer”, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Volume 27, Reisfeld and Sell, eds., pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., New York, N.Y., (1985)；BoernerらのJ. Immunol., 147 (1):86-95 (1991)）。これらの参照文献は、そこに記載される方法について参照することによりその全体が本明細書に援用される。
本明細書では、抗体フラグメントは、ハイブリッドフラグメントを含む、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、およびＦａｂフラグメントを含む。抗体のこのようなフラグメントは特定のＰｈｔＤポリペプチドを結合する能力を保持する。方法を用いて、（ａｂ）発現ライブラリーを構築し（例えば、Huseらの1989 Science 246: 1275-1281参照）、ＰｈｔＤポリペプチドについて所望の特異性を有するモノクローナルＦ（ａｂ）フラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にすることができる。ポリペプチドに対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、限定はしないが、（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を低減することによって生じるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生じるＦ（ａｂ）フラグメント、および（ｉｖ）Ｆ（ｖ）フラグメントを含む、当技術分野で既知の技術によって産生されうる。
ＰｈｔＤの免疫原性のポリペプチドを含む組成物、および薬学的に許容される担体についてここに述べる。随意的に、組成物はさらにアジュバントを含む。免疫原性のポリペプチドを含む組成物は、他の免疫原性のポリペプチドの組合せを含んでもよく、例えば、免疫原性の連鎖球菌（Streptococcus）ポリペプチドまたは、ＰｓｐＡ、ＮａｎＡ、ＰｓａＡ、ニューモリシン、ＰｓｐＣ、またはそれらの任意の組合せの免疫原性のフラグメントが挙げられる。
随意的に、本明細書に記載される組成物は粘膜面への投与に適している。組成物は、例えば、スプレー式点鼻薬、ネブライザー溶液、または噴霧吸入用エアロゾルでありうる。したがって、組成物は容器内に存在して差し支えなく、その容器はスプレー式噴霧器、ネブライザー、または吸入器であって構わない。
薬学的に許容される担体とは、生物学的に、またはその他の望ましくないものではない材料のことをいい、すなわち、材料は、望ましくない生物学的作用を生じることなく、またはそれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互に作用することなく、ＰｈｔＤの免疫原性のフラグメントと共に、被験体に投与されうる。担体は、当然ながら、 当業者に周知のように、活性成分の分解を最小限に抑え、かつ、被験体における有害副作用を最小限に抑えるように選択されよう。
適切な担体およびそれらの製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005) に記載されている。典型的には、適切な量の薬学的に許容される塩を製剤に用いて、その製剤を等張にする。薬学的に許容される担体の例としては、限定はしないが、滅菌水、生理食塩水、リンガー溶液のような緩衝液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、一般に約５〜約８、または約７〜約７．５である。 他の担体としては、免疫原性のＰｈｔＤポリペプチドを含む、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出製剤が挙げられる。マトリックスは、例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子など、成形品の形態をしている。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度などに応じて、特定の担体がさらに好ましくなりうることは、当業者にとって明らかであろう。担体はヒトまたは他の被験体へのＰｈｔＤ免疫原性のフラグメントの投与に適したものである。
医薬組成物は、免疫原性のポリペプチドに加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存料、表面活性剤、アジュバント、免疫賦活剤を含みうる。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症薬、および麻酔剤などの１種類以上の活性成分を含みうる。アジュバントも、ＰｈｔＤに対する免疫応答を刺激または促進するために含めてもよい。適切な種類のアジュバントの 非限定的な例としては、とりわけ、ゲル型（例えば 水酸化アルミニウム／リン酸アルミニウム（「ミョウバン・アジュバント」）、リン酸カルシウム、微生物起源（ムラミルジペプチド（ＭＤＰ））、細菌性の外毒素（コレラ毒素（ＣＴ）、天然コレラトキシンサブユニットＢ（ＣＴＢ）、大腸菌（E. coli）不安定毒素（ＬＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＢＣＧ配列、破傷風トキソイド、例えば、大腸菌（E. coli）、 サルモネラ菌（Salmonella minnesota）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、または赤痢菌（Shigella exseri））などのモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ））、微粒子アジュバント（生体分解性の高分子ミクロスフィア）、免疫賦活性の複合体（ＩＳＣＯＭ））、油性エマルション、および界面活性剤系のアジュバント（フロイント不完全アジュバント （ＦＩＡ）、流動体状エマルション（ＭＦ５９、ＳＡＦ）、サポニン（ＱＳ−２１））、合成（ムラミルペプチド誘導体（ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰ）、非イオン性ブロック共重合体（Ｌ１２１）、ポリホスファゼン（ＰＣＣＰ）、合成ポリヌクレオチド（ポリＡ：Ｕ、ポリＩ：Ｃ）、サリドマイド誘導体（ＣＣ−４４０７／ＡＣＴＩＭＩＤ））、ＲＨ３−リガンド、またはポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）ミクロスフィアが挙げられる。これらの毒素のいずれかのフラグメント、同族体、誘導体、および融合体もまた、それらがアジュバント活性を保持することを条件として、適している。アジュバントの適切な突然変異体または変異体は、例えば、国際公開第９５／１７２１１号パンフレット（Ａｒｇ−７− Ｌｙｓ ＣＴ突然変異体）、国際公開第９６／６６２７号パンフレット（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ ＬＴ突然変異体）、および国際公開第９５／３４３２３号パンフレット（Ａｒｇ−９−ＬｙｓおよびＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ ＰＴ突然変異体）に記載されている。本発明の方法および組成物に利用可能なさらなるＬＴ突然変異体としては、例えば、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓ、Ａｌａ−６９−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−１１０−Ａｓｐ、およびＧｌｕ−１１２−Ａｓｐ突然変異体が挙げられる。
ミョウバン・アジュバントなどの金属塩アジュバントは、アジュバント活性を有する安全な賦形剤を提供するものとして、当技術分野で周知である。これらのアジュバントの活性の機構は、抗原が投与後３週間に至るまで、注入部位に留まりうる、抗原デポーの形成、および、細胞に存在する抗原によってさらに容易に吸収される、抗原／金属塩の複合体の形成をも含むと考えられている。アルミニウムに加えて、亜鉛、カルシウム、セリウム、クロム、鉄、およびベリリウムの塩を含む、他の金属塩も、抗原の吸収に使用されている。アルミニウムの水酸化物塩およびリン酸塩が最も一般的である。アルミニウム塩、抗原、および、追加の免疫賦活剤を含む製剤または組成物は、当技術分野で既知である。免疫賦活剤の１つの例は、３−Ｏ−脱アシル化（3-de-O-acylated）モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。
ポリペプチドとして、または本発明の組成物内に含まれる核酸によってコードされた、１種類以上のサイトカインもまた、本発明の実施に適した同時刺激成分でありうる（ParmianiらのImmunol Lett 2000 Sep 15；74 (1): 41-3；BerzofskyらのNature Immunol. 1: 209-219）。適切なサイトカインとしては、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（RosenbergらのNature Med. 4: 321-327 (1998)）、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（Pardoll, 1992；HarriesらのJ. Gene Med. 2000 Jul-Aug;2 (4):243-9；RaoらのJ. Immunol. 156: 3357-3365 (1996)参照）、ＩＬ−１５（XinらのVaccine, 17:858-866, 1999）、ＩＬ−１６（CruikshankらのJ. Leuk Biol. 67 (6): 757-66, 2000）、ＩＬ−１８（J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2001. 127 (12): 718-726）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ（DisisらのBlood, 88: 202-210 (1996)）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、またはインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）が挙げられる。当技術分野で周知のように、他のサイトカインも本発明の実施に適しているであろう。
ケモカインもまた、免疫応答の誘発または促進を補助するために使用されうる。例えば、腫瘍自己抗原と融合させるＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）およびＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）を含む融合タンパク質は、抗腫瘍免疫を誘発することが示されている（BiragynらのNature Biotech. 1999, 17: 253-258）。ケモカインＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）およびＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）（BoyerらのVaccine, 1999, 17 (Supp. 2): S53-S64）もまた、本発明の実施に役立つであろう。他の適切なケモカインは当技術分野で既知である。
特定の実施の形態では、標的とする免疫原は、核酸分子として、単独で、またはウイルスベクターなどの送達媒体の一部として、用いられうる。このような事例では、標的とする免疫原を、本発明の組成物における細胞表面タンパク質、サイトカインまたはケモカインなどの１種類以上の同時刺激成分と組み合わせることが有利であろう。同時刺激成分は、例えば、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸として組成物中に含まれうる。適切な同時刺激分子としては、例えば、ＣＤ２８結合ポリペプチドＢ７．１（ＣＤ８０；Schwartz, 1992；Chen et al, 1992；EllisらのJ. Immunol., 156（8）: 2700-9）およびＢ７．２（ＣＤ８６；EllisらのJ. Immunol., 156 (8): 2700-9）など、ＣＤ２８ファミリーと結合するポリペプチド（例えばＣＤ２８、ＩＣＯＳ；HutloffらのNature 1999, 397: 263-265；PeachらのJ Exp Med 1994, 180: 2049-2058）；ＩＣＡＭファミリー（例えばＩＣＡＭ−１、−２または−３）を含む、インテグリンファミリーと結合するポリペプチド（例えばＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）；SedwickらのJ Immunol 1999, 162: 1367-1375；WuelfingらのScience 1998, 282: 2266-2269；LubらのImmunol Today 1995, 16: 479-483）；ＣＤ５８（ＬＦＡ−３；ＣＤ２リガンド；DavisらのImmunol Today 1996, 17: 177-187）またはＳＬＡＭリガンド（SayosらのNature 1998, 395: 462-469）など、ＣＤ２ファミリーと結合するポリペプチド（例えばＣＤ２、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＣＤｗ１５０または「ＳＬＡＭ」；AversaらのJ Immunol 1997, 158: 4036-4044）；熱安定性の抗原と結合するポリペプチド（ＨＳＡまたはＣＤ２４；ZhouらのEur J Immunol 1997, 27: 2524-2528）；４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢリガンド；VinayらのSemin Immunol 1998, 10: 481-48；DeBenedetteらのJ Immunol 1997, 158: 551-559）、ＴＮＦＲ関連因子−１（ＴＲＡＦ−１；４−１ＢＢリガンド；SaoulliらのJ Exp Med 1998, 187: 1849-1862, ArchらのMol Cell Biol 1998, 18: 558-565）、ＴＲＡＦ−２（４−１ＢＢおよびＯＸ４０リガンド；SaoulliらのJ Exp Med 1998, 187: 1849-1862；OshimaらのInt Immunol 1998, 10: 517-526, KawamataらのJ Biol Chem 1998, 273: 5808-5814）、ＴＲＡＦ−３（４−１ＢＢおよびＯＸ４０リガンド；ArchらのMol Cell Biol 1998, 18: 558-565；JangらのBiochem Biophys Res Commun 1998, 242: 613-620；Kawamata SらのJ Biol Chem 1998, 273: 5808-5814）、ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド；GramagliaらのJ Immunol 1998, 161: 6510-6517）、ＴＲＡＦ−５（ＯＸ４０リガンド；ArchらのMol Cell Biol 1998, 18: 558-565；KawamataらのJ Biol Chem 1998, 273: 5808-5814）、およびＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド；CoudercらのCancer Gene Ther., 5 (3): 163-75）など、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーと結合するポリペプチド（例えば ４−１ＢＢ（ＣＤ１３７；VinayらのSemin Immunol 1998, 10: 481-489）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４；WeinbergらのSemin Immunol 1998, 10: 471-480；HigginsらのJ Immunol 1999, 162: 486-493）、およびＣＤ２７（LensらのSemin Immunol 1998, 10: 491-499））が挙げられる。ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンドまたは「ＣＤ４０Ｌ」；GurunathanらのJ. Immunol., 1998, 161: 4563-4571；SineらのHum. Gene Ther., 2001, 12: 1091-1102）もまた適しているであろう。ＣｐＧモチーフなどの同時刺激分子自体以外の刺激モチーフを、ＴＡをコードする核酸に取り込ませてもよい（GurunathanらのAnn. Rev. Immunol., 2000, 18: 927-974）。これらの試薬および方法は、当業者に周知の他のものと同様、本発明の実施に利用して差し支えない。
本発明の実質的に毒性のない生物活性のあるアジュバントの他の例としては、ホルモン、酵素、増殖因子、またはそれらの生物活性のある部位が挙げられる。このようなホルモン、酵素、増殖因子、またはそれらの生物活性のある部位は、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、または鳥類起源であってよく、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、プロラクチン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、ソマトトロピン（成長ホルモン）またはインスリン、またはその受容体が免疫系の細胞に発現される任意の他のホルモンまたは増殖因子でありうる。
本明細書に記載される免疫原性のポリペプチドの調製方法および使用方法、ならびにそのような方法に有用な組成物を提供する。ポリペプチドは、標準的な分子生物学の技術および発現系を用いて生成することができる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 2001を参照のこと）。例えば、免疫原性のポリペプチドをコードする遺伝子のフラグメントを同定し、免疫原性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを任意の市販されている発現ベクター（ｐＢＲ３２２およびｐＵＣ ベクターなど（New England Biolabs, Inc.社製（米国マサチューセッツ州イプスウィッチ所在）））、または発現／精製ベクター（融合ベクターなど（Pfizer, Inc.社製（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）））にクローン化し、その後、適切な原核生物、ウイルス、または真核生物の宿主において発現させて構わない。次いで、従来の手段によって、または、市販の発現／精製系の場合には、メーカーの使用説明書に従って、精製を達成して差し支えない。
肺炎球菌の肺炎を他の形態の肺炎と区別するため、ＰｈｔＤの発現を検出する方法を提供する。世界中において、肺炎球菌の主な保有宿主は、鼻腔内保菌である。感染は、一般に担体から獲得し、常に鼻腔内保菌が先行する。鼻咽頭のコロニー形成は、より低い気道、副鼻腔、および中耳への肺炎球菌の蔓延のための必須条件と見られている。
肺炎球菌のワクチンの有効性を判断するためには、どの被験体が肺炎球菌の肺炎を有し、どの被験体が有していないかを知ることが必要である。肺炎を診断するための標準的な手順は、Ｘ線または他の診断、および、肺炎連鎖球菌の陽性の血液培養液によるものである。これらの基準を満たす被験体は、肺炎球菌の肺炎を有すると仮定される。残念なことに、この方法は、肺炎を患う患者のわずか１５〜２５％が菌血症も有すると推定されていることから、肺炎球菌の肺炎を患う患者の７５〜８５％を見過ごしてしまう（FedsonらのVaccine 17:Suppl. 1:S11-18 (1999)；Ostergaard and Andersen, Chest 104:1400-1407 (1993)）。この問題を解決するための１つの試みは、尿中の細胞壁の多糖を検出する抗原検出法を用いることであった。このアッセイはさらに感受性であるが、残念なことに、１２％の成人、および最大で６０％に上る子どもにおいて偽陽性を有する。これは、肺または血液に肺炎球菌による疾患を有しない患者では、肺炎球菌を伴う鼻のコロニー形成が原因で、時折尿中に検査標的が存在することによる。よって、被験体から得られたサンプルについて、ＰｈｔＤの存在を検出することを含む、被験体における肺炎球菌による肺炎を検出する方法についても提供し、ここでＰｈｔＤの存在は、被験体における肺炎球菌を示唆する。ＰｈｔＤ濃度は、当業者に周知の方法によって、体液などの生物学的サンプルについて検査することができる。本方法の用途に適切な体液としては、血液、血清、粘膜、および尿が挙げられるが、これらに限定されない。
ＰｈｔＤの免疫原性のフラグメント、もしくはそれらの誘導体または変異体を、被験体に投与することを含む、被験体における肺炎球菌の感染の危険性を低減する方法についても開示する。肺炎球菌の感染としては、例えば、髄膜炎、中耳炎、肺炎、敗血症、または溶血性の尿毒症が挙げられる。よって、これらの感染のうち任意の１種類以上の危険性は、本明細書に記載される方法によって低減されうる。
ＰｈｔＤポリペプチドを含む組成物は、経鼻投与または呼吸器系の任意の部分への投与を含めて、経口的に、非経口的に（例えば静脈注射で）、筋肉内、腹腔内、経皮、または局所的に、投与されうる。本明細書では、呼吸器系への投与は、エアゾール適用または挿管を通じた噴霧装置または滴下装置による送達を含む、鼻孔の一方または両方を通じた、または口を介した、組成物の鼻内および鼻孔への送達を意味する。
必要とされる組成物およびＰｈｔＤポリペプチドの正確な量は、被験体の種、年齢、体重、および一般条件、用いるポリペプチド、およびその投与方法に応じて、被験体それぞれによって変化するであろう。したがって、組成物ごとに正確な量を特定することはできない。しかしながら、適切な量は、本明細書の記載を所与として、当業者によって決定されうる。さらには、例えばプライム・ブースト法を含めた、ＰｈｔＤポリペプチドの複数回投与が用いられうる。
「抗体」という用語は、未精製またはある程度精製された形態（例えば、ハイブリドーマ上清、腹水、ポリクローナル抗血清）、または精製された形態の抗体の全体またはフラグメントを含む。「精製された」抗体とは、最初に見られるタンパク質の少なくとも約５０％から分離されるものである（例えばハイブリドーマの上清または腹水調製物の一部として）。精製抗体は、それが最初に認められるタンパク質の少なくとも約６０％、７５％、９０％、または９５％から分離されることが好ましい。適切な誘導体は、当技術分野で既知のように、フラグメントを含みうる（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ2または一本鎖抗体（例えばＦｖ））。抗体は、任意の適切な起源であるか、または、例えばマウス（例えばマウスのハイブリドーマ細胞によって生成する）を含む、あるいはヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体などとして発現される、形態でありうる。
さまざまな種類の抗体の調製および使用方法は当業者に周知であり、本発明の実施に適しているであろう（例えば、HarlowらのAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988；HarlowらのUsing Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Protocol No. 1, 1998；KohlerおよびMilsteinのNature, 256:495 (1975)；JonesらのNature, 321:522-525 (1986)；RiechmannらのNature, 332:323-329 (1988)；PrestaのCurr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)；VerhoeyenらのScience, 239:1534-1536 (1988)；HoogenboomらのJ. Mol. Biol., 227:381 (1991)；MarksらのJ. Mol. Biol., 222:581 (1991)；ColeらのMonoclonal Antibodiesand Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；BoernerらのJ. Immunol., 147 (1):86-95 (1991)；MarksらのBio/Technology 10, 779-783 (1992)；LonbergらのNature 368 856-859 (1994)；MorrisonのNature 368 812-13 (1994)；FishwildらのNature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；NeubergerのNature Biotechnology 14, 826 (1996)；LonbergおよびHuszarのIntern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)；ならびに米国特許第４，８１６，５６７号；同第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；および同第５，６６１，０１６号の各明細書参照）。特定の用途では、抗体は、ハイブリドーマの上清または腹水内に含まれ、それを直接利用するか、あるいはその後に標準的な技術を使用して濃縮して利用されうる。他の用途では、抗体は、例えば、塩分別（salt fractionation）および、アガロースビーズなどの固相担体に共有結合する、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、および／またはタンパク質Ｌリガンドを使用したイオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーまたはこれらの技術の組合せを使用して、さらに精製されうる。抗体は、冷凍調製物（例えば−２０℃または−７０℃）として、凍結乾燥の形態で、または通常の冷蔵条件（例えば４℃）下を含む、任意の適切な形式で貯蔵されうる。液体の形態で貯蔵される場合は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの適切な緩衝剤が用いられることが好ましい。
典型的な抗体としては、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（the Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganism for the Purposes of Patent Procedure）の規定の下、特許寄託指定番号（Patent Deposit Designation）ＸＸＸＸＸに従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（米国２０１１０−２２０９，バージニア州マナサス、ユニバーシティ・ブルバード１０８０１所在） にＸＸＸＸＸで寄託されたマウスのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体１Ｂ１２；特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（the Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganism for the Purposes of Patent Procedure）の規定の下、特許寄託指定番号（Patent Deposit Designation）ＸＸＸＸＸに従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（米国２０１１０−２２０９，バージニア州マナサス、ユニバーシティ・ブルバード１０８０１所在）にＸＸＸＸＸで寄託されたマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５；および、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（the Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganism for the Purposes of Patent Procedure）の規定の下、特許寄託指定番号（Patent Deposit Designation）ＸＸＸＸＸに従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（米国２０１１０−２２０９，バージニア州マナサス、ユニバーシティ・ブルバード１０８０１所在）にＸＸＸＸＸで寄託されたマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１が挙げられる。例えばこれらの抗体を含有する、腹水、ポリクローナル抗血清または他の調製物を含む他の抗体もまた意図されている。
これらの抗体を含む調製物としてはハイブリドーマ上清または腹水調製物に見られるような未精製の抗体、ある程度精製された調製物、または精製された調製物が挙げられよう。よって、本明細書では、約５０％、６０％、７５％、９０％、または９５％純度に生成された抗体を含む抗体調製物を提供する。典型的には、このような調製物は、リン酸またはトリス緩衝生理食塩水（それぞれ、ＰＢＳまたはＴＢＳ）などの緩衝液を含む。フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ2または一本鎖抗体（例えばＦｖ））、ヒト化抗体、キメラ 抗体、ヒト抗体などを含む、このような抗体の誘導体も提供する。抗体の可変および超可変部分をコードする遺伝子は、発現ベクター内でクローン化された同一物を発現するハイブリドーマから単離されて、特定の抗体調製物（例えばヒト化抗体）を産生しうる。このような調製物の産生方法は当技術分野で周知である。
当分野の熟練者は、本明細書に記載される抗体を使用して、それに結合するタンパク質を含む生物学的サンプルを同定する、多くの適切な技術を有する。例えば、抗体を使用して、例えば免疫沈降または他の捕捉型のアッセイを用いて、ＰｈｔＤタンパク質を同定して差し支えない。この周知の技術は、抗体を、固相担体またはクロマトグラフ材料（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、および／またはタンパク質Ｌでコーティングされたビーズ）に取り付けることによって行われる。結合した抗体を、次に、ＰｈｔＤタンパク質を含む、または含むと考えられる溶液に導入する。次いで、ＰｈｔＤタンパク質を抗体に結合し、ＰｈｔＤタンパク質が抗体に結合されたまま維持される条件下で、結合していない材料を洗浄する。その後、結合タンパク質を抗体から分離し、所望の通りに分析する。抗体を使用してタンパク質を単離する同様の方法は、当技術分野で周知である。
抗体はまた、生物学的サンプル内のＰｈｔＤタンパク質を検出するために用いられうる。例えば、抗体は、例えば、流動細胞分析法、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法（例えば ウェスタンブロット）、その場（in situ）検出、免疫細胞化学、および／または免疫組織化学などのアッセイに使用されうる。このようなアッセイを行う方法は、当技術分野で周知である。
抗体の使用において、熟練者を補助するため、同一のものを、キットの形式で提供してもよい。１Ｂ１２、４Ｄ５、および／または９Ｅ１１を含み、随意的に、抗体を使用してＰｈｔＤを発現する細胞を検出するために必要な他の成分を含む、キットが提供される。キットの抗体は、冷凍、凍結乾燥、または、ＴＢＳまたはＰＢＳなどの薬学的に許容される緩衝剤を含む、任意の適切な形態で提供されうる。キットはまた、緩衝剤（例えばＴＢＳ、ＰＢＳ）、遮断薬（脱脂粉乳、正常血清、Ｔｗｅｅｎ−２０界面活性剤、ＢＳＡ、またはカゼインを含む溶液）、および／または検出試薬（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧビオチン、ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体、アロフィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ペルオキシダーゼ、蛍光検出試薬（fluors）（例えばＤｙＬｉｇｈｔ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７）、および／または染色キット（例えばＡＢＣ染色キット（Ｐｉｅｒｃｅ社製））など、インビトロまたはインビボにおいて抗体を使用するために必要とされる他の試薬を含みうる。キットはまた、他の試薬、および／または、例えば、流動細胞分析法、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法（例えばウェスタンブロット）、その場（in situ）検出、免疫細胞化学、免疫組織化学など、上述した一般に用いられるアッセイにおける、抗体を使用するための説明書を含みうる。
１つの実施の形態では、キットは、精製した形態の抗体を提供する。別の実施の形態では、抗体は、単独で、またはアビジン複合化検出試薬（例えば抗体）と共に、ビオチン化された形態で提供される。別の実施の形態では、キットは、ＰｈｔＤタンパク質を直接検出するために用いられうる、蛍光標識化された抗体を含む。これらの系のいずれかを用いるのに必要とされる緩衝剤などは当技術分野で周知であり、末端利用者によって調製されるか、またはキットの成分として提供されうる。キットはまた、陽性対照および陰性対照のタンパク質および／または組織サンプルを含む、固相担体を含みうる。例えば、スポット・アッセイまたはウェスタンブロット型のアッセイを行うためのキットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用するための対照の細胞または組織溶解物、または、実験サンプル用の追加のスペースを有する前固定した対照サンプルを含む、ナイロンまたは他の膜を含みうる。スライド上の細胞のＰｈｔＤを視覚化するためのキットは、実験サンプル用の追加のスペースを有する、対照の細胞または組織サンプルを含む、フォーマット済みのスライドを含みうる。
抗体および／またはそれらの誘導体はまた、インビトロまたはインビボにおいて使用するため、本発明の組成物内に取り込まれうる。抗体またはそれらの誘導体はまた、とりわけ、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなど、細胞毒性薬または毒素、もしくはそれらの活性フラグメントなどの官能基に結合しうる。官能基は放射化学物質を含みうる。
本明細書に記載される抗体を、薬剤スクリーニングにおける試薬として使用することも可能である。試薬は、例えば、患者の生物学的サンプルにおいて、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌の存在下における薬剤候補の効果を解明するために用いられうる。発現解析技術は、ハイスループット・スクリーニング技術と組み合わせて、有用な化合物を迅速同定し、薬剤候補での治療の有効性をモニタすることができる（例えば、ZlokarnikらのScience 279, 84-8 (1998)参照）。医薬品候補は、天然または合成に由来する、化合物、核酸、タンパク質、抗体、またはそれらの誘導体でありうる。したがって、同定される医薬品候補は、他の用途の中でもとりわけ、患者に投与するため、またはさらなるスクリーニングに使用するための医薬組成物として用いられうる。
本明細書に記載される抗体は、毒性のない、非経口投与が許容される希釈剤または溶媒における懸濁液など、注入可能な調製物として調製されうる。用いられうる適切な賦形剤および溶媒としては、とりわけ、水、リンガー溶液、および生理食塩水、ＴＢＳおよびＰＢＳが挙げられる。特定の用途では、抗体は、インビトロにおける使用に適している。他の用途では、抗体はインビボにおける使用に適している。いずれかの場合における使用に適している調製物は、当技術分野で周知であり、特定の用途に応じて変化するであろう。
明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、抗原性のフラグメントへの言及は、抗原性のフラグメントの混合物を含み、医薬担体またはアジュバントへの言及は、そのような担体またはアジュバントの２種類以上の混合物を含む。
本明細書では、被験体または宿主は、個体であることを意味する。被験体としては、ネコおよびイヌ、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ）などの飼育動物、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）および鳥類が挙げられる。１つの態様では、被験体は、霊長類またはヒトなどの哺乳動物である。
随意的な、または随意的に、とは、実質的に記載した事象または状況が生じ得るか、または生じ得ないこと、および、その記載が、前記事象または状況が生じる場合、および生じない場合の両方を含むことを意味する。例えば、その語句が、随意的に、組成物が、その記載が組合せおよび組合せの不存在の両方を含むように、組成物が異なる分子の組合せを含むか、または組合せを含まない、組合せ手段を含みうる（例えば、組合せの個々のメンバー）。
範囲は、本明細書では、約１つの特定の値から、および／または、約別の特定の値までとして表されうる。このような値が表される場合、別の態様は、その１つの特定の値から、および／または、他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞である約を用いて、特定の値が別の態様を形成することもさらに理解されよう。さらには、その範囲のそれぞれの終点は、他の終点に関して、および、他の終点とは別に、有意であるものと理解されよう。
防ぐ、という用語は、本明細書では、所定の状態についての所定の処置（例えば、ストレプトコッカス（Streptococcus）属による感染を防ぐ）に関して用いられ、処置される患者が、病状の臨床的に観察されるレベルをまったく発現しないか、またはさらにゆっくりと、および／または、彼／彼女がその処置をされていない場合より少ない程度に発現することを意味する。これらの用語は、単に、患者がいかなる病状の態様も経験しない状況に限定されない。例えば、処置は、患者が病状の所定の徴候を生じることが予想されるであろう刺激に曝露される間に行われる場合、その病状を防ぐといい、患者は、別の方法で予想されるよりも少ない、および／または、穏やかな病状を体験することになる。処置は、患者が感染の穏やかな明らかな症状のみを表すことにより、感染を「防ぐ」ことができる；感染微生物による任意の細胞への侵入が無かったに違いないということを意味するのではない。
同様に、本明細書では、所定の治療を伴う感染の危険性に関して、低減（例えば、肺炎球菌の感染の危険性の低減）とは、感染をさらにゆっくり、または、対照、または処置をしない場合における感染の発現する基礎レベルと比較してより少ない程度に、発現する被験体のことをいう（例えば、免疫原性のポリペプチドの投与）。感染の危険性の低減は、患者が感染の穏やかな明らかな症状または感染の遅延された症状のみを表す結果となりうる；感染微生物による任意の細胞への侵入が無いに違いないことを意味するのではない。
本発明のさらなる実施の形態および特徴を、次の非限定的な例において提供する。
上記開示は、一般に、本発明を説明するものである。次の特定の実施例を参照することにより、完全な理解を提供することができる。これらの実施例は、単に説明の目的で記載されるのであって、本発明の範囲を限定することは意図されていない。等価物の形態および置換における変化は、状況が示唆するか、あるいは好都合になるように意図されている。
形態の変化および等価物の置換は、状況が好都合であることを示唆するか、好都合になるであろうことが意図されている。本明細書では特定の用語が用いられるが、このような用語は、記述的意味で意図されているのであって、限定の目的ではない。
本発明の１つの実施の形態では、１９９７年６月２７日に、ＡＴＣＣ５５９８７として寄託された、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneuomoniae）血清型６株１４４５３に由来する、および／または、配列番号：１に記載する配列を有する、単離され、トランケートされたＰｈｔＤポリペプチドを提供する。本発明に記載されるＰｈｔＤのトランケーションは、ＰｈｔＢの領域と同様の領域および異なる領域の両方である、タンパク質の領域を包含し、よって、それぞれ、可能な交差反応性および独特のエピトープを含む。トランケート型のタンパク質は、精製を促進するため、組換えＨｉｓ−タグ化誘導体として大腸菌において発現され、次いで、Ｎｉ2+−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。
実施例１：組換えＰｈｔＤトランケート型のタンパク質のクローニングおよび産生
この実施例は、発現産物がＮ末端６×Ｈｉｓ−タグを有するように、肺炎連鎖球菌・血清型６株１４４５３からプラスミドｐＥＴ２８ａ（＋）へのトランケート型のＰｈｔＤのクローニングについて記載する。トランケート型のＰｈｔＤはまた、配列番号：２、３および４（タンパク質）、ならびに 配列番号：５、７および９（ＤＮＡ）に示されるように、Ｎ末端６×Ｈｉｓ−タグなしに発現されうる。
本明細書に記載される配列の増幅に用いられるプライマーを表３に示す：
Figure 2010535015
トランケーション番号：１
簡潔にいえば、ＰｈｔＤ Ｔ１遺伝子は、Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ（ＢＤ社製）を用いて、肺炎連鎖球菌の血清型６株１４４５３ゲノムから増幅されたＰＣＲであった。ＰＣＲプライマーＳｐｎ０２１５およびＳｐｎ０１７６により、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を、それぞれ５’および３’末端に導入した（表３参照）。５’プライマーＳｐｎ０２１５は、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグも導入した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲ産物を精製した後、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製するため、アガロース・ゲルに負荷した。ＰＣＲ産物およびｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化させた後、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてアガロース・ゲルから精製した。次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、消化されたベクターと遺伝子をライゲーションさせた。ライゲーション混合物を化学的コンピテントな大腸菌（E. coli）ＤＨ５αに転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むルリア寒天上に塗布することによって陽性クローンを選択した。構築物あたり４つのコロニーを選択し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、選択されたクローンからプラスミドＤＮＡを単離した。ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化を行い、どのクローンが正確な大きさのフラグメントを有しているかを決定した。４つのコロニーのすべてを限定解析に従って修正し、ＱＩＡフィルタプラスミドＭｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、ＭｉｄｉｐｒｅｐＤＮＡを陽性クローン（＃１）の１つから単離し、クローニングされた人工物が導入されないことを確保した。このクローンはｐＢＡＣ３０に指定されていた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、およそ５６．１ｋＤａの正確な大きさの強いバンドが示すように、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）において、ＰｈｔＤ Ｔ１タンパク質を高濃度で発現した。１ｍＭのＩＰＴＧで２時間、タンパク質の発現を誘発した。
トランケーション番号：２
ＰｈｔＤ Ｔ２遺伝子は、Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ（ＢＤ社製）を使用して、肺炎連鎖球菌の血清型６株の１４４５３ゲノムから増幅されたＰＣＲであった。ＰＣＲプライマーＳｐｎ０２１６およびＳｐｎ０１７６により、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を、それぞれ５’および３’末端に導入した（表３参照）。５’プライマーＳｐｎ０２１６は、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグも導入した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲ産物を精製した後、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製するため、アガロース・ゲルに負荷した。ＰＣＲ産物およびｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化させた後、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてアガロース・ゲルから精製した。次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、消化されたベクターと遺伝子をライゲーションさせた。ライゲーション混合物を化学的コンピテントな大腸菌（E. coli）ＤＨ５αに転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むルリア寒天上に塗布することによって陽性クローンを選択した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、選択されたクローンからプラスミドＤＮＡを単離した。ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化を行い、どのクローンが正確な大きさのフラグメントを有しているかを決定した。ＱＩＡフィルタプラスミドＭｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、ＭｉｄｉｐｒｅｐＤＮＡを陽性クローンの１つから単離し、クローニングされた人工物が導入されないことを確保した。このクローンはｐＢＡＣ３１に指定されていた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、およそ１９．３ｋＤａに走る強いバンドが示すように、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）において、ＰｈｔＤ Ｔ２タンパク質を高濃度で発現した。１ｍＭのＩＰＴＧで２時間、タンパク質の発現を誘発した。
トランケーション番号：３
ＰｈｔＤ Ｔ３遺伝子は、Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼ（ＢＤ社製）を使用して、肺炎連鎖球菌の血清型６株の１４４５３ゲノムから増幅されたＰＣＲであった。Ｓｐｎ０２１７およびＳｐｎ０１７６により、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を、それぞれ５’および３’末端に導入した（表３参照）。５’プライマーＳｐｎ０２１７は、Ｎ末端６×Ｈｉｓ−タグも導入した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲ産物を精製した後、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製するため、アガロース・ゲルに負荷した。ＰＣＲ産物およびｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化させた後、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてアガロース・ゲルから精製した。次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、消化されたベクターと遺伝子をライゲーションさせた。ライゲーション混合物を化学的コンピテントな大腸菌（E. coli）ＤＨ５αに転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むルリア寒天上に塗布することによって陽性クローンを選択した。コロニーを選択し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化を行い、どのクローンが正確な大きさのフラグメントを有していたかを決定した。ＱＩＡフィルタプラスミドＭｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、ＭｉｄｉｐｒｅｐＤＮＡを陽性クローンの１つから単離し、クローニングされた人工物が導入されないことを確保した。このクローンはｐＢＡＣ３２に指定されていた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、およそ１６．７ｋＤａに走る強いバンドが示すように、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）において、ＰｈｔＤ Ｔ３タンパク質を高濃度で発現した。１ｍＭのＩＰＴＧで２時間、タンパク質の発現を誘発した。
トランケートしたポリペプチドのアミノ酸配列を以下に示す：
ｐＢＡＣ３０から発現されたＨｉｓタグ（下線部）を含む、ＰｈｔＤのトランケーション１：
Figure 2010535015
ｐＢＡＣ３１から発現されたＨｉｓタグ（下線部）を含む、ＰｈｔＤのトランケーション２：
Figure 2010535015
ｐＢＡＣ３２から発現されたＨｉｓタグ（下線部）を含む、ＰｈｔＤのトランケーション３：
Figure 2010535015
ＰｈｔＤのトランケーションの構造解析および完全長ＰｈｔＤとの比較
精製したＰｈｔＤのトランケーション１、２、および３を生物学的および生物物理学的手段によって特徴づけ、得られた結果を完全長ＰｈｔＤタンパク質（シグナル配列が欠けている）のロットの分析から得られた特徴データと比較した。次のアッセイを行った：円二色性（ＣＤ）分光法、真性蛍光分光法、分析的超遠心分離（ＡＵＣ）、多角光散乱検出（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）を伴うサイズ排除クロマトグラフィー、および示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）。これらの分析結果を下記表４にまとめた。
Figure 2010535015
表４にまとめた分析結果に基づくと、ＰｈｔＤのトランケーション１は、完全長ＰｈｔＤに似ているが同一ではない全体的な溶液構造を有する一方、ＰｈｔＤのトランケーション２および３の構造は異なっている。ＰｈｔＤのＤＳＣ分析に観察される複数の温度遷移 は、複数の（すなわち３つの）ドメインの存在を示唆する。ＰｈｔＤのトランケーション１のＤＳＣ結果は、トランケーションがこれらのドメインの１つを除去したことを示唆する、２つの遷移を示している。ＰｈｔＤのトランケーション２および３は同様の全体的な構造を有し、ＤＳＣの結果は、非常に熱的に安定な単一のドメインの存在を示している。これらの結果は、トランケーションが折り畳み構造をしていることを示している。
実施例２：モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、標準的な手法を用いて、ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅ社（カナダ国ブリティッシュコロンビア州ビクトリア所在）製の多くのＰｈｔタンパク質（すなわちＰｈｔＤ、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ）に対して、産生される。モノクローナルを産生させるため、さまざまなタンパク質を用いてマウスに免疫性を付与し、標準的な手法を用いて、特異性を有するハイブリドーマ分泌抗体を単離した。ＰｈｔＤ、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、およびＰｈｔＥのそれぞれについて、多くのハイブリドーマ・クローンを産生させた。
ＰｈｔＤに関しては、組換え産生したＰｈｔＤ完全長タンパク質（Ｈｉｓ−タグ化され、シグナル配列を欠いている）を用いて、マウスに免疫性を付与した。肺炎連鎖球菌株 ＴＩＧＲ４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３３４）から組換え産生したＰｈｔＤタンパク質を誘導した。マウスに免疫性を付与するために用いられるＰｈｔＤタンパク質のアミノ酸配列、配列番号：２４は下記に記載されており、対応するヌクレオチド配列は配列番号：２３である。
組換えＰｈｔＤタンパク質の配列：
Figure 2010535015
ａ．交差反応
ハイブリドーマから得られた上清を用いて、異なるＰｈｔタンパク質に産生されるモノクローナル抗体の交差反応をＥＬＩＳＡによって評価した。ＥＬＩＳＡの結果を下記表５に示す。産生されたモノクローナル抗体のそれぞれ（例えばＰｈｔＤ）を、惹起させた（表５に「Self」として分類される）、および、Ｐｈｔタンパク質と組合せた（例えば、表５に「Ａ、Ｅ」として分類される、ＰｈｔＡおよびＰｈｔＥ）、特定のＰｈｔタンパク質に対する反応性について、ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。各Ｐｈｔタンパク質について産生されるハイブリドーマ・クローンの総数を、表５の「免疫タンパク質」の列の適切なＰｈｔタンパク質の下の大括弧内に記載する（例えば、ＰｈｔＤに対して、１４のハイブリドーマ・クローンが産生された）。スクリーニングに用いられたＰｈｔタンパク質は、組換え全タンパク質であった。
Figure 2010535015
交差反応スクリーニング（ＥＬＩＳＡによる）から得られた結果に基づいて、ハイブリドーマ・クローン９Ｅ１１、４Ｄ５、およびＩＢ１２を含む複数の抗体を、さらなる分析用に選択した。ＰｈｔＤに対して、クローン９Ｅ１１、４Ｄ５、およびＩＢ１２のそれぞれが産生されたが、交差反応スクリーニングではＰｈｔＤのみに特異性を有するものとしてクローン９Ｅ１１を決定したのに対し、クローン４Ｄ５およびＩＢ１２のそれぞれは、ＰｈｔＡ、Ｂ、およびＤに特異性を有することが判明した。
ｂ．エピトープマッピング
変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットを用いて、エピトープマッピングを行った。クローン４Ｄ５および９Ｅ１１のそれぞれが、ＰｈｔＤのトランケーション３フラグメントの線形エピトープに結合する、ｍＡｂｓを産生することが判定された。ＰｈｔＤのトランケーション３フラグメントのタンパク分解の後、ウェスタンブロットは、ｍＡｂ ９Ｅ１１によって認識される線形エピトープがトランケーション３フラグメントのアミノ酸１〜１０１（配列番号：２６）に対応する配列（および、完全長ＰｈｔＤタンパク質の対応するアミノ酸配列）内に存在することを示した。ＰｈｔＤのトランケーション１、２、および３を用いた、各クローン（すなわちクローン９Ｅ１１, ４Ｄ５およびＩＢ１２）のｍＡｂｓのＥＬＩＳＡによるさらなる試験は、各クローンについて判明したウェスタンブロットによる特異性を立証し、ｍＡｂクローン（１Ｂ１２）がＴ３トランケーションについて特異性を有するものと確認された。
ｃ．消極防護
本発明のさらなる実施の形態では、各クローン９Ｅ１１、４Ｄ５、およびＩＢ１２によって産生されたｍＡｂｓを、肺炎連鎖球菌を用いたチャレンジから動物を保護する能力について評価した。
肺炎連鎖球菌の感染に対する消極防護を提供する、完全長ＰｓｐＡ、ＰｈｔＢまたはＰｈｔＤのいずれかに対する、ウサギにおけるそれぞれ向上した抗体の能力を試験するため、最初の実験を行った。この研究では、ＣＢＡ／ｎマウスの群を、肺炎連鎖球菌株Ａ６６．１の５０ｃｆｕの静脈内投与の前に、ウサギ非ＰｓｐＡ、抗ＰｈｔＢ、または抗ＰｈｔＤ血清（１：１０に希釈）の１時間の腹腔内投与で前処理した。抗体（すなわちＰｓｐＡ、ＰｈｔＢまたはＰｈｔＤのいずれか）で前処理した各群について、動物の生存率は１００％であった。それと対照的に、前採血したウサギＰｓｐＡ血清で前処理した動物の１／２０が生存し、前採血したウサギＰｈｔＢ血清で前処理した動物の０／１０が生存し、および前採血したウサギＰｈｔＤ血清で前処理した動物の１／２５が生存した。
以前に開発した消極防護モデルを用いて、消極防護研究を行った。モデルは、肺炎連鎖球菌による感染に対して非常に感受性の高いことが知られている、ＣＢＡ／ＣａＨＮ−Ｂｔｋｘｉｄ／Ｊマウスを用い、５０ｃｆｕの肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）株Ａ６６．１の静脈内投与の１時間前に、研究下、抗体の腹腔内投与を行った。投与されるチャレンジ用量は、チャレンジ前後に検証した。死亡率を１４日間モニタし、生存マウスから得た血液を塗布して細菌性のクリアランスを確認した。
１つの実験では、クローン４Ｄ５および９Ｅ１１によって産生されたｍＡｂｓを、受動免疫モデルを用いてそれぞれ試験した。５つのマウス群を用いた。３つの群には、リン酸−緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４Ｄ５ ｍＡｂまたはＰＢＳ中９Ｅ１１ ｍＡｂのいずれかを４００μｇ、またはＰＢＳ（すなわち陰性対照群）を腹腔内投与した。陽性対照群にはウサギ抗ＰｈｔＤを投与した。各群に、５０ｃｆｕのチャレンジ用量の肺炎連鎖球菌株Ａ６６．１を投与した。クローン４Ｄ５によって産生されたｍＡｂで免疫性を与えられた動物の８０％がチャレンジ用量を生き延び、ｍＡｂ ９Ｅ１１で免疫性付与された動物の１００％がチャレンジ用量を生き延びた。ＰＢＳで「免疫付与」された後に生存した動物はいなかったのに対し、ウサギ抗ＰｈｔＤで免疫性を与えられた動物の１００％がチャレンジ用量を生き延びた。
別の実験では、受動免疫モデルを用いて、ｍＡｂ ＩＢ１２を試験した。ＰＢＳ中の１Ｂ１２ ｍＡｂ４００μｇを、腹腔内経路を通じて投与した後、５０ｃｆｕのチャレンジ用量の肺炎連鎖球菌株Ａ６６．１を投与した。ｍＡｂ ＩＢ１２で免疫付与された群に関しては、１００％の動物が、３日目の終わりまでチャレンジ用量を生き延び、８０％の動物が１４日目の終わりまで（すなわち試験終了まで）チャレンジ用量を生き延びた。ＰＢＳで「免疫性を与えられた」群では１日目を生き延びた動物はいなかったのに対し、陽性対照群における（すなわちウサギ抗ＰｈｔＤ血清で免疫性を与えられた）動物の各々は、１４日目の終わりまでチャレンジ用量を生き延びた。
用量研究も行った。同一のチャレンジモデルを用いて、５０ｃｆｕのチャレンジ用量の肺炎連鎖球菌株Ａ６６．１を投与する１時間前に、動物に、ＰＢＳ中、４００μｇ、２００μｇ、１００μｇ、または５０μｇのｍＡｂ ９Ｅ１１で免疫性を付与した。陰性対照群には、チャレンジの前にＰＢＳを投与し、陽性対照群には、チャレンジの前にウサギ抗ＰｈｔＤ血清（１：１０の希釈で）を投与した。１４日間の後、４００μｇ用量ではマウスの６０％が生存し；２００μｇ用量では２０％が生存し；１００μｇまたは５０μｇ用量では生存した動物はいなかった。４００μｇ用量を投与した群に関しては、生存率は６日目には８０％に落ち、９日目には６０％に落ちた。２００μｇ用量を投与した群に関しては、生存率は３日目には６０％に落ち、５日目には２０％に落ちた。１００μｇ用量を投与した群に関しては、生存率は２日目には２０％に落ち、３日目には０％に落ちた。よって、 １４日目の生存率の上昇は、４００μｇ（６０％生存）用量を投与した群、および２００μｇ用量（２０％生存）を投与した群の両方について観察された。
ｍＡｂ ４Ｄ５を用いて、同様の用量研究を行った。５０ｃｆｕのチャレンジ用量の肺炎連鎖球菌株Ａ６６．１の投与１時間前に、動物に、４００μｇ、２００μｇ、１００μｇ、または５０μｇのＰＢＳ中ｍＡｂ ４Ｄ５を投与し、免疫性を与えた。１４日間の後、４００μｇ用量では１００％のマウスが生存し、より低い用量または対照（ＰＢＳ）の群では生存したマウスはいなかった。２００μｇ用量では、１００％の動物が２日目まで生存し、６０％が２日目まで生存し、２０％が３日目まで生存した。よって、１４日目の生存率の上昇は、４００μｇ用量を投与した群（１００％生存）、および２００μｇ用量を投与した群（２０％が３日目まで生存）の両方で見られた。
ｄ．ｍＡｂｓの相乗効果
ｍＡｂｓの相乗的に作用する能力を試験する研究を行った。左記の研究におけるものと同一の消極防護モデルを用いた。８つのマウス群（各５匹ずつ）を用い、チャレンジ用量の投与前に、１００μｇの４Ｄ５ｍＡｂｓ、２００μｇの４Ｄ５ｍＡｂｓ、１００μｇの９Ｅ１１ｍＡｂｓ、２００μｇの９Ｅ１１ｍＡｂｓ、各１００μｇの９Ｅ１１および４Ｄ５で構成される２００μｇのプール、ＰＢＳ（すなわち陰性対照）、ウサギ非ＰｓｐＡ血清（すなわち陽性対照）、または４００μｇのＩＢ１２ｍＡｂｓのいずれかを投与した。４Ｄ５および９Ｅ１１抗体をそれぞれ１００μｇずつ含む２００μｇの総投与量では、１４日目（すなわち試験終了まで）まで１００％の保護をもたらすことが判明した。対照的に、２００μｇのｍＡｂｓ ４Ｄ５または９Ｅ１１単独では、１４日目には、それぞれ、わずかに２０％および４０％の生存率しか得られなかった。１００μｇ用量の４Ｄ５では、１日目の終わりには１００％の生存率が得られ（ＰＢＳがそうだったように）、２日目の終わりには６０％の生存率が得られたが、３日目には生存率は２０％まで落ちた（これは１４日目の終わりまで継続した）。１００μｇ用量のｍＡｂ ９Ｅ１１は、１日目の終わりには１００％の生存率をもたらし（ＰＢＳがそうだったように）、２日目の終わりには８０％の生存率をもたらし、３日目の終わりには６０％の生存率をもたらし、４〜６日目には２０％の生存率をもたらし、次いで生存率は０まで落ちた。その後の実験では、下記表６に記載されたデータは、この相乗効果を追認した。この研究では、動物群に、さまざまな濃度のｍＡｂのプール（すなわち９Ｅ１１と４Ｄ５ｍＡｂｓの等量のプール）用量を投与した。
Figure 2010535015
表６に示すように、各用量について相乗効果を観察した。２５μｇ用量は予備試験しなかったが、２５μｇのプール用量は、２０％の３日目までの生存率をもたらした。予備実験では、５０μｇ用量のｍＡｂ ４Ｄ５または９Ｅ１１は、用量（すなわち陰性対照）のものと実質的に同一の結果を有した。
これらの実験は、４Ｄ５および９Ｅ１１ｍＡｂｓのそれぞれの使用が、肺炎連鎖球菌による感染からの保護をもたらしうることを実証している。これらの実験はまた、個別の抗体の組合せ効果の期待される相加効果を超える、４Ｄ５と９Ｅ１１の併用投与によって生じる驚くべき相乗効果を実証している。本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、別々に、または組み合わせて使用して差し支えない。
本発明を、好ましい実施の形態に関して説明してきたが、当業者には、変形および変更が想起されよう。したがって、添付の特許請求の範囲が、特許請求する本発明の範囲内にあるこれらの等価の変形のすべてを包含することが意図されている。
参考文献
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Hamel J, Charland N, Pineau I, Ouellet C, Rioux S, Martin D, Brodeur BR. 2004. “Prevention of Pneumococcal Disease in Mice Immunized with Conserved Surface-Accessible Proteins.” Infect Immun. 72:2659-2670.

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Guilmi, et al. New approaches towards the identification of antibiotic and vaccine targets in Streptococcus pneumoniae. EMBO reports 3, 8, 728-734 (2002)

米国特許第７，１２２，１９４号明細書：Johnsonら、２００６年１０月１７日
発明の名称：Vaccine compositions comprising Streptococcus pneumoniae polypeptides having selected structural motifs

米国特許第６，５８２，７０６号明細書：Johnsonら、２００３年６月２４日
発明の名称：Vaccine compositions comprising Streptococcus pneumoniae polypeptides having selected structural motifs

米国特許出願公開第２００５／０２１４３２９号明細書：Laferriere, Craig Anthony Josephら、２００５年９月２９日
発明の名称：Vaccine

米国特許出願公開第２００４／００８１６６２号明細書：Hermand, Philippe ら、２００４年４月２９日
発明の名称：Vaccine

Claims (83)

  1. 配列番号：２に対して少なくとも９０％の同一性を有する 肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする単離された核酸。
  2. 転写制御要素に機能的に結合した請求項１記載の核酸を包含する組換え発現ベクター。
  3. 請求項２記載の組換え発現ベクターを包含する細胞。
  4. 前記肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドが免疫応答を誘発することを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  5. ａ）配列番号：２に対して少なくとも９０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸、
    ｂ）配列番号：２に対して少なくとも９０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸に対して完全に相補的な核酸、および
    ｃ）ＴがＵで置換されている、（ａ）または（ｂ）のＲＮＡ
    からなる群より選択される単離された核酸。
  6. 転写制御要素に機能的に結合した請求項５記載の核酸を包含する組換え発現ベクター。
  7. 請求項６記載の組換え発現ベクターを包含する細胞。
  8. 肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドが免疫応答を誘発することを特徴とする請求項５記載の単離された核酸。
  9. 配列番号：２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を包含する単離されたポリペプチド。
  10. 配列番号：２に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体。
  11. 配列番号：３に対して少なくとも９０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする単離された核酸。
  12. 転写制御要素に機能的に結合した請求項１１記載の核酸を包含する組換え発現ベクター。
  13. 請求項１２記載の組換え発現ベクターを包含する細胞。
  14. 肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドが免疫応答を誘発することを特徴とする請求項１１記載の単離された核酸。
  15. ａ）配列番号：３に対して少なくとも９０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸、
    ｂ）配列番号：３に対して少なくとも９０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸に対して完全に相補的な核酸、
    ｃ）ＴがＵで置換されている、（ａ）または（ｂ）のＲＮＡ
    からなる群より選択される単離された核酸。
  16. 転写制御要素に機能的に結合した請求項１５記載の核酸を包含する組換え発現ベクター。
  17. 請求項１６記載の組換え発現ベクターを包含する細胞。
  18. 肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドが免疫応答を誘発することを特徴とする請求項１５記載の単離された核酸。
  19. 配列番号：３に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を包含する単離されたポリペプチド。
  20. 配列番号：３に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体。
  21. 配列番号：４に対して少なくとも９０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする単離された核酸。
  22. 転写制御要素に機能的に結合した請求項２１記載の核酸を包含する組換え発現ベクター。
  23. 請求項２２記載の組換え発現ベクターを包含する細胞。
  24. 肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドが免疫応答を誘発することを特徴とする請求項２１記載の単離された核酸。
  25. ａ）配列番号：４に対して少なくとも９０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸、
    ｂ）配列番号：４に対して少なくとも９０％の同一性を有する肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドをコードする核酸に対して完全に相補的な核酸、および
    ｃ）ＴがＵで置換されている、（ａ）または（ｂ）のＲＮＡ
    からなる群より選択される単離された核酸。
  26. 転写制御要素に機能的に結合した請求項２５記載の核酸を包含する組換え発現ベクター。
  27. 請求項２６記載の組換え発現ベクターを包含する細胞。
  28. 肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のポリペプチドが免疫応答を誘発することを特徴とする請求項２５記載の単離された核酸。
  29. 配列番号：４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を包含する単離されたポリペプチド。
  30. 配列番号：４に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体。
  31. アミノ酸１およびアミノ酸１０１にわたる領域において配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに配置される抗原決定基に特異的に結合するモノクローナル抗体。
  32. 請求項３０記載の抗体を包含する組成物を宿主に投与することを含む、宿主における連鎖球菌感染を阻害する方法。
  33. 配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４、または、配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７からなる群より選択されるそれらの変異体からなる群より選択される、免疫原性のフラグメント。
  34. 請求項３３記載の免疫原性のフラグメントを少なくとも１種類と、薬学的に許容される担体とを含んでなる組成物。
  35. アジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項３３記載の組成物。
  36. 少なくとも１つの他の免疫原性の連鎖球菌タンパク質またはそれらのフラグメントをさらに含むことを特徴とする請求項３３記載の組成物。
  37. 前記組成物が、粘膜面への投与に適していることを特徴とする請求項３３記載の組成物。
  38. 前記組成物がスプレー式点鼻薬であることを特徴とする請求項３７記載の組成物。
  39. 前記組成物がネブライザー溶液であることを特徴とする請求項３７記載の組成物。
  40. 前記組成物が噴霧吸入用エアロゾルであることを特徴とする請求項３７記載の組成物。
  41. 請求項３３〜４０いずれか１項記載の免疫原性のフラグメントまたは組成物を被験体に投与することを含む、被験体におけるＰｈｔＤに特異的な抗体を産生する方法。
  42. 請求項３３〜４０いずれか１項記載の免疫原性のフラグメントまたは組成物を被験体に投与することを含む、被験体における肺炎球菌の鼻腔内保菌を低減する方法。
  43. 請求項３３〜４０いずれか１項記載の免疫原性のフラグメントまたは組成物を被験体に投与することを含む、被験体における肺炎球菌の感染の危険性を低減する方法。
  44. 前記肺炎球菌の感染が髄膜炎であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
  45. 前記肺炎球菌の感染が中耳炎であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
  46. 前記肺炎球菌の感染が肺炎であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
  47. 前記肺炎球菌の感染が溶血性の尿毒症であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
  48. 前記免疫原性のフラグメントの投与が、肺炎球菌の鼻腔内保菌を排除しないことを特徴とする請求項４３記載の方法。
  49. 配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４、または、配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７からなる群より選択されるそれらの変異体からなる群より選択されるＰｈｔＤの少なくとも１つのフラグメントを宿主に投与することを含む、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌による感染に対して宿主に免疫性を与える方法。
  50. ２つ以上のフラグメントが前記宿主に投与されることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  51. 配列番号：２、配列番号：３、および配列番号：４、または配列番号：１５、配列番号：１６、および、配列番号：１７からなる群より選択されるそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１種類のポリペプチドを含む組成物を宿主に投与することを含む、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌による宿主の感染を治療する方法。
  52. ２つ以上のポリペプチドが前記宿主に投与されることを特徴とする請求項５１記載の方法。
  53. ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１からなる群より選択されるモノクローナル抗体。
  54. 固定可能に取り付けられた検出可能なラベルをさらに含むことを特徴とする請求項５３記載のモノクローナル抗体。
  55. 請求項５３記載のモノクローナル抗体の誘導体。
  56. 固定可能に取り付けられた検出可能なラベルをさらに含むことを特徴とする請求項５５記載の誘導体。
  57. ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するハイブリドーマによって産生される抗体と同一の抗原結合特異性を有するモノクローナル抗体。
  58. 前記モノクローナル抗体が、配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする請求項５７記載のモノクローナル抗体。
  59. 請求項５７記載のモノクローナル抗体の誘導体。
  60. 固定可能に取り付けられた検出可能なラベルをさらに含む請求項５９記載のモノクローナル抗体の誘導体。
  61. 請求項５３〜６０いずれか１項記載のモノクローナル抗体を含む組成物。
  62. 前記抗体が、少なくとも約６０％、７５％、９０％、または９５％の純度に精製されることを特徴とする請求項６１記載の組成物。
  63. ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１からなる群より選択される少なくとも１種類のモノクローナル抗体を宿主に投与することを含む、宿主におけるストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌による感染を防ぐ方法。
  64. ２つ以上のモノクローナル抗体を前記宿主に投与することを特徴とする請求項６３記載の方法。
  65. ＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１からなる群より選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体を宿主に投与することを含む、宿主におけるストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌による感染を治療する方法。
  66. ２つ以上のモノクローナル抗体を前記宿主に投与することを特徴とする請求項６５記載の方法。
  67. 生物学的サンプルにおけるタンパク質の量を決定する方法であって、
    前記生物学的試験サンプルを、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１、またはそれらの誘導体からなる群より選択されるモノクローナル抗体に曝露し、
    前記サンプルに結合する抗体または誘導体の量を測定し、
    前記生物学的試験サンプルにおける結合量を、対照の生物学的サンプルに見られる結合量と比較する、
    各工程を有してなり、
    前記対照の生物学的サンプルと比較した前記生物学的試験サンプルにおける結合の増大が、その中の前記タンパク質の存在を示唆することを特徴とする方法。
  68. 前記生物学的試験サンプルが哺乳動物の組織であることを特徴とする請求項６７記載の方法。
  69. 前記組織が血液であることを特徴とする請求項６８記載の方法。
  70. 生物学的サンプルにおけるタンパク質の存在の有無を判断する方法であって、
    前記サンプルにおいて、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、および、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１、またはそれらの誘導体からなる群より選択されるモノクローナル抗体と反応するタンパク質を検出する工程を含む、方法。
  71. 生物学的サンプルにおけるストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌またはそれらのタンパク質を検出する方法であって、前記方法が：
    （ａ）生物学的試験サンプルを、特異性を有する前記サンプルの成分に対する前記抗体を考慮した条件下で、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１、またはそれらの誘導体からなる群より選択される、少なくとも１種類のモノクローナル抗体に曝露し、

    （ｂ）前記生物学的試験サンプルの成分に結合する前記抗体の量を決定し、
    （ｃ）前記生物学的試験サンプル前記抗体の量を、対照サンプルに結合する量と比較する、
    各工程を有してなり、
    前記対照生物学的サンプルと比較して、前記生物学的試験サンプルの成分への顕著に多い結合量が、前記サンプルにおけるストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌またはそれらのタンパク質の存在を示唆することを特徴とする方法。
  72. 前記生物学的サンプルが哺乳動物の組織であることを特徴とする請求項７１記載の方法。
  73. 前記生物学的サンプルが哺乳動物の血液であることを特徴とする請求項７２記載の方法。
  74. 前記生物学的サンプルがヒトの血液であることを特徴とする請求項７３記載の方法。
  75. 生物学的サンプルにおけるストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌またはそれらのタンパク質を検出するためのキットであって、前記キットが、
    ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１、またはそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体と、
    使用説明書と
    を含んでなるキット。
  76. 前記モノクローナル抗体が凍結乾燥の形態であることを特徴とする請求項７５記載のキット。
  77. ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１からなる群より選択される少なくとも２種類のモノクローナル抗体を宿主に投与することを含む、宿主におけるストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌による感染を防ぐ方法。
  78. 前記モノクローナル抗体が４Ｄ５および９Ｅ１１であることを特徴とする請求項７７記載の方法。
  79. ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される１Ｂ１２、ＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される４Ｄ５、およびＡＴＣＣ指定番号ＸＸＸＸを有するマウスのハイブリドーマによって産生される９Ｅ１１からなる群より選択される少なくとも２種類のモノクローナル抗体を宿主に投与することを含む、宿主におけるストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌による感染を治療する方法。
  80. 前記モノクローナル抗体が４Ｄ５および９Ｅ１１であることを特徴とする請求項７９記載の方法。
  81. 配列番号：２４に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体。
  82. 前記モノクローナル抗体が配列番号：２６からなるペプチドに特異的に結合することを特徴とする請求項８１記載のモノクローナル抗体。
  83. 配列番号：２６に対して少なくとも９０％の同一性を有するペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体。
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