JP2010530245A - αウイルス構造タンパク質の発現のためのプロモーターレスカセット - Google Patents

Abstract

本発明は、ａ）少なくとも１つの開始コドンが除去されているアルファウイルス５’複製認識配列と、ｂ）アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ｃ）アルファウイルス３’複製認識配列とを含む単離されたＲＮＡ分子であって、当該ＲＮＡ分子が、（ｂ）のヌクレオチド配列の転写を誘導するプロモーターを含まず、（ａ）および（ｃ）のアルファウイルス５’および３’複製認識配列が、アルファウイルス非構造タンパク質の存在下において、当該ＲＮＡ分子の複製を誘導する、ＲＮＡ分子を提供する。

Description

優先権の声明
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年６月２１日に出願された米国仮出願第６０／９３６，６３７号（この全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

政府の支援の声明
本発明の局面は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金第５ＵＯ１Ａ１０５７２８６−０３の下での資金拠出によって援助された。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、組換えアルファウイルス粒子のための改良された構築物およびその製造方法に関する。

アルファウイルスは、現在、感染性疾患および癌のワクチンを開発するためのベクタープラットフォームとして用いられている（例えば、特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２；非特許文献１、非特許文献２；非特許文献３を参照のこと）。アルファウイルスは、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科の属を含み、当該属のメンバーは、世界中の至る所で脊椎および無脊椎の双方の宿主において見出される。ベクタープラットフォームのためにアルファウイルスの中で最も研究されているのは、当該属のプロトタイプのメンバーであるＶｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ＶＥＥ）Ｖｉｒｕｓ、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ（ＳＦＶ）、およびＳｉｎｄｂｉｓ Ｖｉｒｕｓ（ＳＶ）である。

そのようなベクタープラットフォームの１つは、Ｇａｒｏｆｆらの米国特許第６，１９０，６６６号、Ｊｏｈｎｓｔｏｎらの特許文献１および特許文献２、Ｄｕｂｅｎｓｋｙらの米国特許第５，８１４，４８２，同第５，８４３，７２３号、特許文献１０、特許文献１１、同第６，１０５，６８６号、および同第６，３７６，２３６号、米国特許出願公開第２００２−００１５９４５号（Ｐｏｌｏら）、米国特許出願公開第２００１−００１６１９９（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら）、Ｆｒｏｌｏｖら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３７１−１１３７７、並びに非特許文献１に記載されているアルファウイルスレプリコンシステムである。アルファウイルスレプリコンベクターは、対象となる１つ以上の核酸を含有しかつ発現するように操作され、この場合、対象となる核酸は、例えば、抗原、サイトカイン、リボザイム、または酵素をコードし得る。アルファウイルスレプリコンベクターは、任意のアルファウイルス由来であってもよく、中でも、例えばＶｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ＶＥＥ）ウイルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、例えばＴＲ３３９株、Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ ＡｒｂｏウイルスＮｏ．８６、およびＳｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス由来であってもよい。当該ベクターは、次に培養中の細胞に導入され、それによってアルファウイルスの複製が可能になり、さらにこの細胞においてアルファウイルス構造タンパク質も発現され、その結果、当該ベクターは、アルファウイルス構造タンパク質によってアルファウイルスレプリコン粒子（ＡＲＰ）中にパッケージされる。次いで、ＡＲＰが培養物から収穫され、様々な治療目的のために被験体へと提供される。

ワクチン用途におけるＡＲＰシステムの免疫原性および有効性を高めるために、様々な構築物が開発されている。これらの構築物の多くは、さらに、ゲノム断片の組換えによって複製能力のあるアルファウイルスが形成される可能性を低減するように設計されている。Ｊｏｈｎｓｔｏｎら（特許文献１および特許文献２）は、単一のヘルパーシステム（このシステムにおいて、アルファウイルスの構造タンパク質遺伝子の完全なセットが１つのＲＮＡ分子上にあり、非構造タンパク質遺伝子および対象となる非相同核酸は別のレプリコンＲＮＡ上にある）からの組換えの可能性を認識しており、したがって、構造タンパク質をコードする２つのヘルパーＲＮＡを採用した「二重ヘルパー」システムを設計した。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（特許文献１０）およびＰｏｌｏら（米国特許第６，２４２，２５９号）は、パッケージング細胞の培養物中への複製性アルファウイルスベクターの導入に関してこれら構造タンパク質を発現するＲＮＡの産生によってアルファウイルスベクターをパッケージするための、パッケージング細胞株に安定してトランスフォームされる２つのＤＮＡアルファウイルス構造タンパク質発現カセットの使用について記載している。Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよび共同研究者は、「単一のヘルパーシステム」が、野生型アルファウイルス粒子を生成することを確認するデータを提示している（Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１（８）：９１６−９２０（１９９３））。スミスらは、構造タンパク質の発現を誘導する他の新規のＲＮＡヘルパーについて記載している（国際公開第２００４／０８５６６０号）。

上記のように、３つのうちの２つがヘルパーシステムを含む３つの核酸間にウイルスのコード配列を分配することにより、単一ヘルパーシステムと比較して、複製能力のあるウイルス（「ＲＣＶ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）」を生じる組換えの理論的頻度が著しく減少する。これらのシステムは、非依存性転写単位として機能する構造物を提供するために、しばしば２６Ｓプロモーターまたはウイルス接合領域プロモーターとも呼ばれるアルファウイルスサブゲノムプロモーターの使用、並びにアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識シグナルの使用を含み、それによって、当該ヘルパーシステムは、ヘルパー機能の増幅および効率的な発現のためにアルファウイルス複製機構の存在を利用することができる。

既存のシステムでは、既知のパッケージングシグナルは、通常はレプリコンＲＮＡに含まれており、ヘルパー構築物からは除かれる。しかしながら、それでもなお、ヘルパーＲＮＡは、低頻度ではあるがパッケージングまたは同時パッケージングされ（Ｌｕ ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９１（１）：５９−６５（２００１））、末端認識シグナルを有するヘルパー構築物が、レプリコンの存在下において増幅および発現され、他のヘルパー分子もしくはレプリコンＲＮＡの組換え現象を生じる可能性がある。

アルファウイルスレプリコン粒子による動物研究では、１０^５〜１０^８の範囲の投与量が採用されており、非ヒト霊長動物においては１０^７、５×１０^７、および１０^８が効果的に採用され、当該投与量は、ヒトの臨床試験において使用される。さらに、２×１０^８、５×１０^８、および１０^９などの多量の投与量も、ヒトに対する適用において有用である。そのような投与量は、大規模の製造手段を必要とし、そのような規模では、統計的に、複製能力のあるアルファウイルスが既存のＲＮＡヘルパーシステムによって生成され得る可能性がある。

したがって、複製能力のあるアルファウイルスの形成に対する予測される頻度をさらに減少させ、並びに製造戦略およびコストを最適化するために、アルファウイルスレプリコン粒子を製造するための改善されたシステムが当技術分野において依然として必要とされている。

本発明は、アルファウイルス構造タンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡヘルパー分子であって、プロモーター配列を欠失しているためにヘルパー分子とレプリコンベクターとの間で生じ得る機能的組換え現象の理論上の回数を著しく減少させ、結果として、組換えアルファウイルス粒子の製造中に複製能力のあるアルファウイルスが形成される割合の理論的予測が減少する、アルファウイルスＲＮＡヘルパー分子を提供する。

米国特許第５，７９２，４６２号明細書 米国特許第６，１５６，５５８号明細書 米国特許第５，８１１，４０７号明細書 米国特許第６，５３１，１３５号明細書 米国特許第６，５４１，０１０号明細書 米国特許第６，７８３，９３９号明細書 米国特許第６，８４４，１８８号明細書 米国特許第６，９８２，０８７号明細書 米国特許第７，０４５，３３５号明細書 米国特許第５，７８９，２４５号明細書 米国特許第６，０１５，６９４号明細書 米国特許第５，７３９，０２６号明細書

Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９７）２３９（２）：３８９−４０１ Ｆｒｏｌｏｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１（１）：２４８−２５８ ＳｍｅｒｄｏｕおよびＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３（２）：１０９２−１０９８

本発明は、ａ）開始コドンが除去されているアルファウイルス５’複製認識配列と、ｂ）アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ｃ）アルファウイルス３’複製認識配列とを含む単離されたＲＮＡ分子であって、当該ＲＮＡ分子が、（ｂ）のヌクレオチド配列の転写を誘導するプロモーターを含まず、アルファウイルス５’および３’複製認識配列がアルファウイルス非構造タンパク質の存在下において当該ＲＮＡ分子全体の複製を誘導する、ＲＮＡ分子を提供する。

さらに、本明細書において、本発明のＲＮＡ分子の１つ以上を細胞へ導入する工程を含む、アルファウイルスレプリコン粒子を製造する方法であって、当該導入によって、アルファウイルスレプリコン粒子が産生される条件下において、ＲＮＡ分子の組み合わせが、アルファウイルスレプリコンＲＮＡと共に、アルファウイルスレプリコン粒子の産生のために必要なすべてのアルファウイルス構造タンパク質をコードする方法が提供される。

さらに、ａ）アルファウイルスレプリコンＲＮＡと、ｂ）本発明のＲＮＡ分子の１つ以上と、ｃ）１つ以上のプロモーター補助アルファウイルスヘルパー構築物とを細胞へ導入する工程を含む、アルファウイルスレプリコン粒子を製造する方法であって、当該導入によって、アルファウイルスレプリコン粒子が産生される条件下において、（ｂ）のＲＮＡ分子と（ｃ）のヘルパー構築物の組み合わせが、アルファウイルスレプリコン粒子の産生のために必要なすべてのアルファウイルス構造タンパク質をコードする方法が提供される。

さらなる実施形態において、本発明は、アルファウイルスレプリコン粒子の集団であって、培養中の許容細胞での継代によって決定されるような、検出可能な複製能力のあるウイルス粒子を含有しない集団を提供する。

さらに本明細書において、培養における許容細胞での継代によって決定されるような、検出可能な複製能力のあるウイルス粒子を含まないアルファウイルスレプリコン粒子の集団であって、当該アルファウイルスレプリコン粒子が、アルファウイルス構造タンパク質またはアルファウイルス非構造タンパク質のいずれか、あるいはアルファウイルス構造タンパク質およびアルファウイルス非構造タンパク質の両方に、１つ以上の弱毒化突然変異（ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む集団が提供される。

さらに、本発明は、被験体において免疫応答を誘発する方法であって、有効量の本発明のアルファウイルスレプリコン粒子の集団を当該被験体に投与する段階を含む方法を提供する。

完全長（ＦＬ：ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）プロモーターレスヘルパー分子の５’複製認識配列（ＲＲＳ：ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の構築物を示す。５’複製認識配列内のカプシドまたは糖タンパク質（ＧＰ：ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）開始コドンの上流の出発コドンの位置を、枠線と黒線で示す。枠線は、カプシドまたはＧＰのためのコード配列とインフレームである出発コドンを示す。黒線は、カプシドまたはＧＰのためのコード配列とリーディングフレーム外である出発コドンを示す。線の真下の数値は、当該分子の５’末端から付番された、５’複製認識配列における推定上の出発コドンに対する最初のヌクレオチド配列の位置を示す。 プロモーターレスヘルパー分子における５’複製認識配列欠失の構造を示す。枠線のボックスは、各構築物に残存している５’複製認識配列を示し、ボックス内の数値は、配列のヌクレオチドの長さを示す。黒い細線は、各構造物から削除されている５’複製認識配列を示す。縞の斜線のボックスは、カプシドまたはＧＰのいずれかのためのコード配列の位置を表す。 ノーザンブロット分析を示す。全細胞ＲＮＡを、３０μｇのｐＥＲＫ／３４２／ＭＳ／ＢｏＮＴ ＡレプリコンＲＮＡおよび３０μｇのｄＨＥ１−６Ｍ１（プロモーターレスＥ１ヘルパー）もしくは２６Ｓプロモーター（１３．４．６）を含有する３０μｇのＧＰヘルパーＲＮＡのいずれかによってエレクトポレーションしたベロ細胞から抽出した。各試料（５μｇ）のＲＮＡを１％のグリオキサールゲル上で展開し、ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ（登録商標）膜（Ａｍｂｉｏｎ社；Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に転写した。ゲノムのセンスアルファウイルスＲＮＡ３’末端に特異的なプローブを使用して、ヘルパーの複製を検出した。レーン１：ＲＮＡ分子量マーカー、レーン２：ｄＨＥ１−６Ｍ１ヘルパー＋ＢｏＮＴ Ａレプリコン、レーン３：プロモーター補助ＧＰヘルパー＋ＢｏＮＴ Ａレプリコン。 ユビキチン化構築物（ｄＨｃａｐＵおよびｄＨｇｐＵ）または標準構築物（ｄＨｃａｐおよびｄＨｇｐ）の、ユビキチン単量体のＣ末端アミノ酸およびヌクレオチド配列、並びにアルファウイルスカプシドおよび糖タンパク質コード配列のＮ末端残基を示すダイヤグラムを示す。これらの配列の右端の「Ｍｅｔ Ｐｈｅ」、「Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｐｈｅ」、「Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ」、および「Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ」は、カプシドおよびＧＰタンパク質のＮ末端に見られるアミノ酸を表す。ユビキチン化構築物は、１３．２．２および１３．４．６ヘルパーには見られないさらなるＮ末端残基を有する。右側のボックスは、ヌクレオチド一次配列の結果としてコードされた３’ＲｓｒＩＩ制限部位およびアミノ酸を示す。左側のボックスは、ＶＥＥ構造タンパク質からのユビキチンの切断に重要な残基を表す。 パッケージングの実験（表１０）においてＶＲＰを作製するためにエレクトポレーションされた細胞から生じた細胞溶解物のウェスタンブロット分析（一方はカプシド−特異抗体を使用し、他方は糖タンパク質（ＧＰ）特異抗体を使用する）を示す。以下に示すように、レプリコンと共に２つのＲＮＡヘルパーを細胞中にエレクトポレーションした：レーン１、ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１および１３．４．６（ＧＰ）；レーン２、Ｈｃａｐ４およびｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１；レーン３、ｄＨｃａｐＵおよびｄＨｇｐＵ；レーン４、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ）；レーン５、Ｈｃａｐ４およびｄＨｇｐＵ；レーン６、Ｈｃａｐ４およびｄＨｇｐ（ＦＬ）；レーン７、ｄＨｃａｐＵおよび１３．４．６；レーン８、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）および１３．４．６；レーン９、Ｈｃａｐ４および１３．４．６レーン１０、分子量マーカー。 以下に示すように、レプリコンと共に２つのＲＮＡヘルパーを細胞中にエレクトポレーションしたベロ細胞で産生されたカプシドヘルパーＲＮＡのノーザンブロット分析を示す：レーン１、ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１および１３．４．６（ＧＰ）；レーン２、Ｈｃａｐ４およびｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１；レーン３、ｄＨｃａｐＵおよびｄＨｇｐＵ；レーン４、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ）；レーン５、Ｈｃａｐ４およびｄＨｇｐＵ；レーン６、Ｈｃａｐ４およびｄＨｇｐ（ＦＬ）；レーン７、ｄＨｃａｐＵおよび１３．４．６；レーン８、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）および１３．４．６。各レーンにおける翻訳可能なカプシドＲＮＡ分子は、アスタリスクでマークしてある。 以下に示すように、レプリコンに加えて、２つのＲＮＡヘルパーを細胞中にエレクトポレーションしたベロ細胞で産生された糖タンパク質（ＧＰ）ヘルパーＲＮＡのノーザンブロット分析を示す：レーン１、ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１および１３．４．６（ＧＰ）；レーン２、Ｈｃａｐ４およびｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１；レーン３、ｄＨｃａｐＵおよびｄＨｇｐＵ；レーン４、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ）；レーン５、Ｈｃａｐ４およびｄＨｇｐＵ；レーン６、Ｈｃａｐ４およびｄＨｇｐ（ＦＬ）；レーン７、ｄＨｃａｐＵおよび１３．４．６；レーン８、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）および１３．４．６。各レーンにおける翻訳可能な糖タンパク質ＲＮＡ分子は、アスタリスクでマークしてある。

本明細書で使用される場合、「１つの（”ａ”、”ａｎ”）」および「当該（”ｔｈｅ”）」は、それが使用される状況に応じて、１つまたは２つ以上を意味し得る。例えば、「１つの（“ａ”）」細胞は、１つの細胞または複数の細胞を意味し得る。

さらに、本明細書で使用される場合、「および／または（”ａｎｄ／ｏｒ”）」は、１つ以上の関連する列挙された項目の任意のかつ全ての可能な組み合わせ、並びに代替（「または」）において解釈される場合は組み合わせの欠如を意味しかつ包含する。

さらに、本明細書で使用される場合、「約（”ａｂｏｕｔ”）」なる用語は、例えば、本発明の化合物または薬剤の量、投与量、時間、温度などの測定可能な値を意味する場合、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動を包含することを意味する。

「５’アルファウイルス複製認識配列」、「３’アルファウイルス複製認識配列」、「５’複製認識配列」、および「３’複製認識配列」なる用語は、アルファウイルス中に見られるＲＮＡ配列、そこから誘導される配列、または様々なアルファウイルス間で保存される配列をベースとする合成配列を意味し、非構造アルファウイルスレプリカーゼタンパク質によって認識されてウイルスＲＮＡの複製を引き起こす。いくつかの実施形態において、これらの配列は、ＶＲＰを作製するための本発明の構築物、プラスミド、および核酸の調製、突然変異、および／または操作を容易にするために、ＤＮＡの形態であってもよい。これらの配列はさらに、「５’および３’末端」とも呼ばれ、非構造タンパク質媒介性増幅に必要な５’および３’ウイルス配列、非構造タンパク質媒介性増幅に必要な５’および３’配列、５’または３’保存配列要素（ＣＳＥ：ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）、５’または３’非コード領域、５’または３’非コード領域配列、複製のためにシス型において必要な５’または３’ウイルス配列、アルファウイルスの転写を開始する５’または３’配列、並びに／あるいはアルファウイルス５’および３’配列、を意味し、５’および３’の指定はアルファウイルスゲノムにおけるそれらの位置を意味している。本発明の核酸分子において、これらの５’および３’末端を使用して、２つの末端の間でコードされるＲＮＡ配列の複製および／または転写が行われる。これらの配列を標準的な分子生物学的技術によって修飾することにより（例えば、開始（すなわち、出発）コドンを除去するために、または翻訳性を高めるために、どちらかの末端で切端および／または修飾することにより）、組換えの可能性のさらなる最小化および／またはクローニング部位の導入などが可能であるが、ただし、当該配列は、依然としてアルファウイルス複製機構によって認識されなければならない。

本明細書で使用される場合、「開始コドン」または「出発コドン」は、機能タンパク質の翻訳において使用されてもされなくてもよいコドンを意味し、これはＲＮＡではＡＵＧであり、ＤＮＡではＡＴＧである。

「アルファウイルス構造タンパク質／タンパク質（単数または複数）」なる用語は、アルファウイルスによってコードされる構造タンパク質の１つまたは組み合わせを意味する。これらは、ポリタンパク質として野生型ウイルスにより産生され、一般的に、文献においてＣ−Ｅ３−Ｅ２−６ｋ−Ｅ１として記載される。Ｅ３および６ｋは、２個の糖タンパク質であるＥ２およびＥ１の膜貫通／輸送シグナルとして機能する。したがって、本明細書におけるＥ１なる用語の使用は、Ｅ１、Ｅ３−Ｅ１、６ｋ−Ｅ１、またはＥ３−６ｋ−Ｅ１を意味し得、並びに本明細書でのＥ２なる用語の使用は、Ｅ２、Ｅ３−Ｅ２、６ｋ−Ｅ２、ＰＥ２、ｐ６２、またはＥ３−６ｋ−Ｅ２を意味し得る。「糖タンパク質ヘルパー」または「ＧＰヘルパー」なる用語は、通常、本明細書において、Ｅ２およびＥ１糖タンパク質の両方をコードするヘルパー分子を意味し、本発明のある特定の実施形態において、Ｅ１およびＥ２は、別々のヘルパー分子でコードされる。

「ヘルパー（単数または複数）」および「ヘルパー分子」なる用語は、互換的に使用され、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸を発現する核酸分子を意味する。

「ヘルパー細胞」および「パッケージング細胞」なる用語は、本明細書において互換的に使用され、アルファウイルスレプリコン粒子を産生する細胞を意味する。ヘルパー細胞は、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする、本明細書に記載されているようなヘルパー分子および／またはヘルパー構築物のセットを含む。ヘルパーは、ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよく、またはその両方であってもよい。ヘルパー細胞またはパッキング細胞は、アルファウイルス許容性の、すなわちレプリコンＲＮＡの導入においてアルファウイルス粒子を産生することができる任意の細胞であってもよい。アルファウイルス許容性細胞としては、これに限定されるものではないが、ベロ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、２９３細胞、２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１１２６８）細胞、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ：ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、ＵＭＮＳＡＨ／ＤＦ−１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１２２０３）細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞などが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、ＲＮＡ分子の転写を誘導する核酸配列である。

本明細書で使用される場合、「単離された細胞」は、細胞が天然環境から分離され、および／または細胞がその自然環境において発生した状態から変更もしくは修飾された細胞または細胞の集団である。本発明の単離された細胞は、例えば、細胞培養物中の細胞であってもよい。本発明の単離された細胞はさらに、動物の細胞および／または動物に導入された細胞であってもよく、この場合、当該細胞は、例えば、本発明のアルファウイルス粒子の細胞中への導入によって変更もしくは修飾されている。

本明細書で使用される場合、「アルファウイルスサブゲノムプロモーター」または「２６Ｓプロモーター」は、アルファウイルス複製プロセスの一部としてサブゲノムのメッセンジャーＲＮＡの転写を誘導する野生型アルファウイルスゲノムにおいて本来定義されるようなプロモーターである。

本発明のいくつかの実施形態において使用される非相同核酸（例えば、対象となる遺伝子もしくは「ＧＯＩ（ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、または対象となる核酸もしくは「ＮＯＩ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」）は、野生型アルファウイルスのゲノム内には存在しない核酸、および／または野生型アルファウイルスのゲノム内には本発明の組換え核酸中に存在する順序と同じ順序では存在しない核酸である。例えば、ある特定の実施形態において、ＮＯＩは、それらが、感染性の複製能欠損アルファウイルス粒子（例えば、アルファウイルスレプリコン粒子）のアセンブリにおいてヘルパー核酸として使用される場合、あるいは、ある特定のアルファウイルスによって引き起こされた疾病に対するワクチンのための免疫原として使用される場合に、１つ以上アルファウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、ＰＥ２／Ｅ２、Ｅ１、Ｅ３、６Ｋ）をコードし得る。

本発明は、アルファウイルス構造タンパク質（単数または複数）並びにアルファウイルス５’および３’配列をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子であって、この場合、開始コドンが５’複製認識配列から除去されており、しかし、プロモーター配列（例えば、サブゲノムアルファウイルスプロモーター配列であり、場合によって２６Ｓプロモーターもしくはウイルス接合領域プロモーターとも呼ばれる）を欠失しているＲＮＡ分子が、培養細胞株におけるアルファウイルスレプリコン粒子の産生に対して、完全長プラス鎖ＲＮＡが効率的に翻訳され、十分な量のアルファウイルス構造タンパク質がトランス型において産生されるように複製され得るという驚くべき予想されない発見に基づいている。場合によって本明細書で「Δ２６Ｓヘルパー」とも呼ばれるこれらの「プロモーターレス」ＲＮＡ分子は、ヘルパー分子とレプリコンベクターの間で生じる機能的組換え現象の発生の予測された理論上の頻度を減少させることにより、（例えば、ワクチンまたはアジュバントとしての使用のために製造された）アルファウイルスレプリコン粒子の集団における理論上の安全域を増加させる。

いずれのスプリットヘルパーシステムも、複製能力のあるアルファウイルス（ＲＣＶ）を生成するために、最小限の２つの独立した組換え現象を必要とする。相同組換えも報告されているが、アルファウイルスでは、組換えは主にＲＮＡ複製複合体によるランダムな鎖スイッチングの結果であると考えられている（Ｗｅｉｓｓら、１９９１）。第一の組換え現象では、複製複合体は、例えば、文献（例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎら米国特許第５，７９２，４６２号）において開示されているスプリットヘルパー／レプリコンパッケージングシステムにおけるＲＮＡヘルパー分子の３’末端であり得る。当該複合体が、２６Ｓまたはウイルス接合領域を介してこのヘルパーＲＮＡの複製を継続し、次いで、鋳型としてのレプリコンＲＮＡの外来ヌクレオチド配列にスイッチングし、レプリコン５’末端を介して複製を完了するのであれば、結果として得られる「組換えレプリコン中間体」は、すべての非構造タンパク質をコードする配列と、領域をコードする外来の対象となる核酸（ＮＯＩ）を含有する転写単位のいくつかまたはすべてと、アルファウイルス構造タンパク質の１つを発現する新しい挿入された転写単位とを含有するであろう。ＲＣＶが産生されるためには、続く第二の組換え現象が、（上に記載された）組換えレプリコン中間体の３’複製認識配列への鎖スイッチング現象によって生じなければならない。なぜなら、これが、挿入突然変異誘発を伴わないで、配列をコードする全ての非構造タンパク質および構造タンパク質のための機能的な転写単位が保持される唯一の位置であるからである。ヘルパーＲＮＡ分子が２６Ｓプロモーターを含有しているために、理論上、そのような２つの組換え現象によってＲＣＶが生じ得る。各組換え挿入体は、非依存性転写単位であろうから、正確な組み換え点は重要ではないだろう。

本発明のプロモーターレスヘルパー分子を使用したＲＣＶの生成も、最小限の２つの非依存性組換え事象を必要とするだろうが、機能的な遺伝子組換え体が得られる制約は、文献において知られているＲＮＡヘルパー分子の場合よりもはるかに高く、したがって、ＲＣＶが生成される理論上の頻度ははるかに低い。これは、２６Ｓプロモーターの不在下では、ほとんどの組換え現象により、結果として、アルファウイルス構造タンパク質を発現し得る機能的な転写単位が生じるためであろう。したがって、プロモーターレスヘルパー分子を使用するＲＣＶの生成は、構造的ポリプロテインのオープンリーディングフレームの再生を必要とするであろうし（すなわち、これらのヘルパーが由来する野生型ウイルスに見られる構造と実質的に同様に）、これ自体が、２回の必要な組換え現象が特異的な順序においてかつ非常に特異的なヌクレオチド位置において生じることを必要とする。最初の組換え現象は、カプシドヘルパーコード配列を伴わなければならない。なぜなら、それ自体が分裂し、機能的なカプシドタンパク質を生成するためには、糖タンパク質に対して適切な（すなわち、５’）位置になければならないためである。カプシドヘルパーは、レプリコン２６Ｓプロモーターからカプシドタンパク質が発現する遺伝子組換えを達成するために、ヌクレオチドの完全組換え現象またはヌクレオチドのほぼ完全組換え現象を介して、レプリコンベクターで組換えられなければならない。すなわち、１）レプリコン２６Ｓプロモーターのすぐ下流であり、２）非相同的ＧＯＩの任意の残りとインフレームであり、並びに３）結果としてＧＯＩ／アルファウイルスカプシド融合タンパク質を生成しない（したがって、不活発なアルファウイルスカプシドを産生する）組換えのみが、機能的であるだろう。アルファウイルス糖タンパク質ヘルパーによる第二の組換え現象は、３’複製認識配列での発生に制限されることに加えて、第一の組換え事象と同じ制約下にある。したがって、プロモーターレスヘルパー分子を用いて粒子を製造する本発明の方法では、ＲＣＶが生成される頻度は、理論上、文献において知られているヘルパー分子よりはるかに低いであろうし、非常に低い頻度であるために、本発明の方法ではそのようなＲＣＶが検出されなかった。

本発明の驚くべき特徴は、アルファウイルス粒子をアセンブルするためのヘルパー／レプリコンシステムを製造する従来の試みが、アセンブリのための構造タンパク質を翻訳するのに十分なＲＮＡ分子を得るために、強力なプロモーター、たいていの場合はアルファウイルス２６Ｓサブゲノムプロモーター、の使用に頼っていたという事実に存する。既存の文献との明確な対比において、本発明者は、通常、野生型アルファウイルスの増殖、および文献において知られているヘルパーＲＮＡシステムにおいて伴われる、２６Ｓプロモーターからのより小さなメッセンジャーＲＮＡの転写と当該メッセンジャーの増幅とがなくても、完全長分子として直接翻訳され得る新規のＲＮＡヘルパー分子を利用することができるということを発見した。したがって、本発明のヘルパーＲＮＡの直接翻訳は、細胞のリボソーム装置による完全長ＲＮＡの５’末端におけるキャップの認識を介して達成される。真核細胞内では、ｍＲＮＡに由来する翻訳の開始は、リボソームサブユニットのｍＲＮＡへの補充を可能にする厳しく制御された一連の現象を伴う。キャップ依存性翻訳の場合、「キャップ」として知られる、ｍＲＮＡの５’末端に存在するメチル−７−Ｇ（５’）ｐｐｐＮ構造が、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、およびｅＩＦ４Ａから構成される開始因子ｅＩＦ４Ｆによって認識される（Ｈｅｒｓｈｅｙ＆Ｍｅｒｒｉｃｋ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｐ．３３−８８．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．２０００において概説されている）。

アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、すなわち、ウイルスＲＮＡが細胞に入ると、このＲＮＡから非構造アルファウイルスタンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４）の翻訳が生じ、これらのタンパク質が、それぞれ、完全長マイナス鎖ＲＮＡ鋳型を生成する。次いで、マイナス鎖ＲＮＡが複製され、完全長（「ゲノム」）プラス鎖ＲＮＡと、２６Ｓプロモーターで始まるより小さい（「サブゲノム」）プラス鎖とを産生する。プラス鎖が産生される場合、アルファウイルスの非構造タンパク質も、ＲＮＡをキャップして、リボソームによる翻訳のために細胞質において利用できるようにする。「キャップ」は、ＲＮＡの５末端に付加したメチル化残基を意味する。本発明の特定の実施形態において、インビトロにおいて産生されるヘルパーＲＮＡ分子（これは、プラス鎖ＲＮＡである）は、キャップされていない。プラス鎖ヘルパーＲＮＡが、レプリコンＲＮＡを含有する真核細胞に導入されると、主にマイナス鎖の合成が最初に生じる。非構造タンパク質を合成するアルファウイルスレプリコンＲＮＡの存在下において、マイナス鎖鋳型（ヘルパーとレプリコンの両方）は、次にキャップされたプラス鎖ＲＮＡへと複製される。本発明の他の実施形態において、ヘルパーＲＮＡは、当技術分野において周知の試薬および、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＡｍｂｉｏｎ社（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）から市販の試薬を使用して、インビトロでキャップされ得る。キャップは、例えば、Ｇキャップ、Ｃキャップ、Ａキャップ、メチル化Ｇ（ｍ^７Ｇ（５’ｐｐｐ（５’）ｐｐｐＧ（５）Ａ）；非メチル化Ｇ（Ｇ（５’ｐｐｐ（５’）Ａ）；ＡＲＣＡ（抗−リバースキャップ類似物、３−Ｏ−Ｍｅ−ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ（５））；トリメチル化（ｍ^２、^２，７Ｇ（５’ｐｐｐ（５’）ｐｐｐＧ）、２ウェイキャップ（ｍ^７Ｇ（５’ｐｐｐ（５’）ｍ^７Ｇ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＲＰの最大収量のために、ＡＲＰを産生するために使用される本発明のすべてのヘルパーは、キャップされているかまたはキャップされていないかのいずれかである。最も高い収量は、キャップされたヘルパーＲＮＡによって記録されているが、ある特定の実施形態において、キャップされていないヘルパーＲＮＡも、著しく高い収量において生成し得るので、キャッピングのさらなるコストを避けることができる。ヘルパーＲＮＡの一方のみをキャップすることも可能であるが、これも、場合によってＡＲＰの収量を制限する場合がある。概して、本発明者は、キャップの使用、転写混合物中のＮＴＰに対するキャップ類似体の比率、およびＡＲＰを生成するために使用されるＲＮＡの比率の変更などの、いくつかの変数を調べる通常の実験によってＡＲＰ収量を最適化することができるということを示している。

したがって、特定の実施形態において、本発明は、ａ）少なくとも１つの開始コドンが除去されているアルファウイルス５’複製認識配列と、ｂ）アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ｃ）アルファウイルス３’複製認識配列とを含む、から実質的に成る、および／またはから成る単離されたＲＮＡ分子であって、ただし、当該ＲＮＡ分子は、（ｂ）のヌクレオチド配列の転写を誘導するプロモーターを含まず、アルファウイルス５’および３’複製認識配列が、アルファウイルス非構造タンパク質の存在下においてＲＮＡ分子全体の複製を誘導する、ＲＮＡ分子を提供する。

様々な核酸配列が、本発明の核酸構築物において５’末端および３’末端の機能を満たし得る。例えば、当該配列は、ＶＥＥアルファウイルスに対して、上で例示されているような、アルファウイルス５’複製認識配列および他の隣接する配列を含み得る。さらに、天然の５’アルファウイルスの末端において欠失を生じさせて、ある特定な二次構造要素、例えば、ステムループ構造など、を除去することもできる。ある特定の実施形態において、これらのステムループ構造の１つ以上が、本発明のヘルパー構築物から除去され得る。あるいは、例えばＳｉｎｄｂｉｓウイルスの場合の、ｔＲＮＡアスパラギンに対するヌクレオチド１０〜７５（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら、米国特許第５，０９１，３０９号）など、同様の機能的能力を維持しながら、この要素として非アルファウイルスまたは他の配列を利用することもできる。

いくつかの実施形態において、３’アルファウイルス複製認識配列は、長さが約３００ヌクレオチドであり得、実質的に天然のアルファウイルス３’複製認識配列を含有する。アルファウイルス間で保存される最小の３’複製認識配列は、１９ヌクレオチド配列である（Ｈｉｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６９３−２７０４（１９９７））。加えて、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスでは、３’複製認識配列のすぐ後に続くポリ（Ａ）テールは、長さが少なくとも１１〜１２の残基でなければならず、並びに、３’複製認識配列の３’１３ｎｔは、効率的なマイナス鎖ＲＮＡの合成にとって重要であるということが示されている（Ｈａｒｄｙ ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７９：４６３０−４６３９（２００５））。したがって、３’末端のための配列は、完全なアルファウイルス３’複製認識配列、または依然として認識配列としての機能を維持する３’複製認識配列の切端した領域、または長さが２５〜３２５ヌクレオチドでありかつ３’複製認識配列のすぐ後に続く最小長さ１１〜１２ｎｔのポリ（Ａ）ランを含む３’末端を含み得る。このコンテキストにおいて使用することができる配列の他の例としては、これらに限定されるものではないが、非アルファウイルス、または同様の機能的能力を維持してマイナス鎖ＲＮＡ合成の開始を可能にする他の配列（例えば、ＧｅｏｒｇｅらＪ Ｖｉｒｏｌ．７４：９７７６−９７８５（２０００）に記載されている配列）が挙げられる。

本発明のＲＮＡ分子において使用される５’および３’複製認識配列は、任意の組み合わせにおける同一のまたは異なるアルファウイルスに由来してもよく、これらは、同一のまたは異なるアルファウイルスに由来するレプリコンベクターとの任意の組み合わせにおいて使用することができる。

本発明のある特定の実施形態において、ヘルパーＲＮＡ分子の５’および３’配列は、ＶＲＰの生成においてヘルパーの性能を最大にし、かつＲＣＶの生成に対する理論上の可能性を最小にするように選択される。特定の実施形態は、５’および３’配列の修飾、並びに本明細書にその例が記載されている、アルファウイルス由来の元来の５’および３’配列の一部の欠失を含み得る。本発明に記載された５’および３’配列の、非常に多くの組み合わせがあり、各ヘルパー分子に対して様々な組み合わせを使用することができる。ＶＲＰの生成におけるそれらの性能を決定するために、本明細書において教示する修飾および欠失の様々な組み合わせを試験することは、当業者の範囲内である。

本発明のＲＮＡヘルパー分子は、アルファウイルス構造タンパク質の翻訳をそれらの天然メチオニン出発コドンで開始するために、５’キャップ構造から５’複製認識配列までスキャンするリボソームに頼っている。これらの領域にさらなる開始コドンが存在すると、構造タンパク質に対して天然の出発コドン以外の部位で翻訳を開始することを可能にし、その結果、リボソームがｍＲＮＡに沿ってアルファウイルス構造タンパク質コード領域中へと移動する場合の融合タンパク質か、または続いてリボソームが５’複製認識配列の停止コドンに達した場合の短い非機能性ペプチドか、どちらかが産生されるため、これらのヘルパーの有効性が低下する。したがって、これらのヘルパーにおいて完全な５’アルファウイルス非コード領域（すなわち、野生型アルファウイルスの５’末端から２６Ｓサブゲノムプロモーターの最初のコドンまでの全配列）を使用することは、この領域に多く存在する出発コドンおよび停止コドンのために最適ではない。したがって、特定の実施形態において、本発明のＲＮＡ分子は、５’複製認識配列から除去される１つ以上の開始コドンを有し得る。１つ以上とは、当技術分野において標準的な方法に従って除去または不活性化される２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、１１つ、１２つ、またはそれ以上の開始コドン（すなわち、出発コドン）を意味する。

したがって、本発明は、例えばＡＵＧからＧＵＧへの変異によって、５’複製認識配列から１つ以上開始コドンが除去されている本発明のＲＮＡ分子を提供する。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、例えばＡＵＧからＧＵＧへの変異によって、５’複製認識配列から全ての開始コドンが除去されて提供される。例えば、図１に示されるような、以下の位置：１２、４５、１４８、１５４、１６０、２５８、２９４、２９９、３３１、３９０、４１１、４４１、および４９９での任意の組み合わせにおける１つ以上の開始コドンが除去、例えば変異、され得る。

開始コドンの除去とは、（例えば、本明細書に記載された方法および当技術分野において知られているような方法に従って）ヌクレオチド配列を修飾して、開始コドンを削除または変更し、その結果、その部位での開始または活性（例えば、翻訳活性）を除去または変更することを意味する。いくつかの実施形態において、開始コドンの大部分は、除去され得るが、特定のヘルパー構築物の５’領域のそのようなコドンのほんのいくつかだけを、リボソームによって通常認識されるコンテキストに存在させることが可能である。したがって、特定の５’配列では、可能な１０〜１２コドンの外側のそのような２〜３のコドンの除去により、結果として、すべての１０〜１２のコドンが除去されている構築物とあまり変わらないレベルの発現が生じ得る。本発明のヘルパー分子において使用される場合に、結果としてパッケージング細胞またはヘルパー細胞内において十分発現し、アルファウイルスレプリコン粒子の許容可能な収量を提供するであろう、野生型アルファウイルス配列に由来する多数の特定の５’配列が存在することは、本発明の範囲内である。

本発明のＲＮＡ分子は、１）アルファウイルスカプシドタンパク質、２）任意の順序のアルファウイルスＥ１およびＥ２タンパク質、３）任意の順序のアルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ１タンパク質、４）任意の順序のアルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ２タンパク質、５）アルファウイルスＥ２タンパク質、並びに／あるいは６）アルファウイルスＥ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、本発明の単一のＲＮＡ分子は、３つのアルファウイルス構造タンパク質、すなわち、順不同にカプシドタンパク質、アルファウイルスＥ１タンパク質、およびアルファウイルスＥ２タンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を特異的に排除することができる（例えば、当該分子は、カプシド、アルファウイルスＥ１タンパク質、アルファウイルスＥ２タンパク質、あるいはカプシド、Ｅ１タンパク質、およびＥ２タンパク質の任意の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を特異的に排除することができる）。

本発明の様々な実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、５’複製認識配列を含む、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ＶＥＥ）ウイルスの５’末端由来の配列を含み得る。Ｐｕｓｈｋｏら（１９９７）によって記載されているように、ＶＥＥプロモーター補助ヘルパーの５’複製認識配列は、通常、ＶＥＥ配列の５７５ヌクレオチド（ｎｔ）から成る。最初の５１９は接在し、４４ｎｔの非翻訳領域（ＵＴＲ：ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）およびｎｓＰ１の最初の４７５ｎｔを表す（４４＋４７５＝５１９）。残りの５６ｎｔは、ｎｓＰ４遺伝子の最後の２１ｎｔ（ＴＡＡ停止コドンを含む）、最小２６Ｓプロモーターの７ｎｔ（ｎｓＰ４遺伝子と部分的に重なる配列を有する）、およびＶＥＥ構造タンパク質遺伝子開始コドンの上流の２８ｎｔリーダー配列をコードする（２１＋７＋２８＝５６）。

したがって、Ｐｕｓｈｋｏら（１９９７）によって記載されているプロモーター補助ヘルパーに対する完全な５’複製認識配列は、ＶＥＥ配列の５７５ｎｔから成る。本発明のプロモーターレスヘルパーは、上に記載したプロモーター補助ヘルパーにおいて見られる最初の５１４のヌクレオチド（ｎｔ）の全てもしくは一部をコードする。上に記載した５１４ｎｔに加えて、ＲｓｒＩＩ制限酵素部位（７ｎｔ）をコードする配列も、構造タンパク質のコード配列開始部位（ＤＮＡではＡＴＧであり、ＲＮＡではＡＵＧである）のすぐ上流に存在する。これらのｎｔの封入体は、完全長カプシドヘルパー（ｄＨｃａｐ（ＦＬ）のための５’複製認識配列を５２１ｎｔ（開始コドンのＡ残基を含まない）に増加させる。

プロモーターレスカプシドヘルパーのいくつかの例およびプロモーターレス糖タンパク質ヘルパーのすべての例において、構造タンパク質コード配列開始コドンのすぐ上流の、しかしＲｓｒＩＩ配列の下流に近コンセンサスコーザック配列（３ｎｔ（ＡＣＣ））を含むためのさらなる修飾が加えてある。コーザック修飾のために、完全長糖タンパク質ヘルパー（ｄＨｇｐ（ＦＬ）は、５２４ｎｔの５’複製認識配列を有する。これらのヌクレオチド配列は、以下の説明のために、プロモーターレスカプシドおよび糖タンパク質ヘルパーに対して「完全長」（「ＦＬ」）５’ＶＥＥ配列として定義され、この配列における欠失は、結果として５’複製認識配列を包含する他の実施形態へとつながる。これらの実施形態は、少なくとも、ＶＥＥヌクレオチド配列のヌクレオチド１〜１４１（開始コドンのＡ残基を含まない）を含む。５’配列の最初の２００のヌクレオチド内に、ＲＮＡにおける４つのステムループ（ＳＬ：ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造が予測される。

本発明のヘルパー構築物において有用な５’配列の実施形態は、この領域において、ＳＬ構造の１、２、３、または全てを含み得る。ＳＬ２領域を取り除き、かつＳＬ１、ＳＬ３、およびＳＬ４構造を保有する実施形態は、本発明のヘルパー構築物において有用である。ＳＬ構造１およびＳＬ構造２は、最初の１４５のヌクレオチドに含まれており、すなわち、ＳＬ３およびＳＬ４は、ヌクレオチド１４５と２００との間に存在している。したがって、いくつかの実施形態において、５’複製認識配列は、長さが５２４ヌクレオチド（例えば、図２のｄＨｇｐ（ＦＬ））である構築物の５’非コード領域に含まれ、他の実施形態において、５’複製認識配列は、いずれかの、長さ７０ヌクレオチド（例えば、ＳＬ１、ＳＬ３、およびＳＬ４を含む）〜５２４ヌクレオチドである５’非コード領域に含まれ得る。例えば、５’複製認識配列は、長さ１４１、１４４（ｄＨ＃８）２００、２０３（ｄＨ＃７）、２４８、２４９（ｄＨ＃６）、３０９、３１２（ｄＨ＃５）、３５１、３５４（ｄＨ＃４）、４１２、４１５（ｄＨ＃３）４５０、４５２（ｄＨ＃２）、４９９、または５０２（ｄＨ＃１）ヌクレオチドであり得、本明細書において特に列挙はしていない７０〜５２４の間の任意の数（例えば、２３７、３７９、４４４など）を含む。正確なヌクレオチド番号と長さは、異なったアルファウイルス間、および所定のアルファウイルスの異種系統の間でいくらか変わることに注意するべきである。本明細書に記載されたヌクレオチドの対応する位置を、任意のアルファウイルスの対応する構造および／または機能並びに／あるいは本明細書に記載された二次構造の対応する構造および／または機能に基づいて特定し、任意のアルファウイルスの一次ヌクレオチド配列から、本発明のＲＮＡヘルパー分子並びに上に記載された修飾を作製することは、当業者の能力の範囲内である。

本発明のＲＮＡヘルパー分子はさらに、アルファウイルスの３’末端由来の配列を含み、当該アルファウイルスは、特定の実施形態において、アルファウイルス３’複製認識配列を含むＶｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルスであり得るが、これに限定されるものではない。全てのアルファウイルスの３’末端１９ヌクレオチドは高度に保存され、一方、Ｅ１糖タンパク質の最後のコドンと高度に保存された１９ヌクレオチドの間の３’配列は、アルファウイルス間において長さおよび配列の両方に関してほとんど保存されない。３’非コード領域の長さ（本明細書において、配列番号５２である、保存された１９ヌクレオチドを含む）は、２５〜３２５ヌクレオチドの範囲であり得る。本発明のある特定の実施形態において、３’配列は、ＶＥＥ３’末端の７３〜１１７ヌクレオチドの間である。特定の実施形態において、本発明のアルファウイルス３’複製認識配列は、配列番号５５（ｄＨｃａｐ（ＦＬ）からｄＨｃａｐ７まで；ｄＨｃａｐ（ＦＬ）ｍｍからｄＨｃａｐ７ｍｍまで、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）ｍｕｔ１からｄＨｃａｐ７−ｍｕｔ１まで）、配列番号５６（Ｈｇｐ（ＦＬ）からｄＨｇｐ７まで、ｄＨｇｐ（ＦＬ）ｍｍからｄＨｇｐ７−ｍｍまで、ｄＨｇｐ（ＦＬ）ｍｕｔ１からｄＨｇｐ７−ｍｕｔ１まで）、配列番号５７（ｄＨｃａｐ６ｍｕｔ１（Ｗ／停止）、配列番号５８（ｄＨｃａｐ７ｍｕｔ１（Ｗ／停止）＋１９ｎｔおよびｄＨｇｐ７ｍｕｔ１− Ｓ＋１９ｎｔ）、並びに配列番号５９（ｄＨｃａｐ６ｍｕｔ１（Ｗ−停止）のヌクレオチド配列を含み得、から実質的に成り得、および／またはから成り得る。

特定の実施形態において、本発明のアルファウイルス５’複製認識配列は、

のヌクレオチド配列を含み得、から実質的に成り得、および／またはから成り得る。これら５’配列の例が合成されている個別のヘルパーを括弧内に記載する。当該配列は、追加的なヌクレオチドの使用のために長さがわずかに変わり得、いくつかのヘルパー構築物において構造タンパク質コード配列の翻訳を高める、最適に近いコーザックコンセンサス配列が得られる（構造タンバク質コード配列のためのコード領域のＡＴＧ（ＲＮＡではＡＵＧ）は、これら５’配列には含まれない）。上記において特定されたヌクレオチド配列を含む本発明のＲＮＡ分子は、任意の組み合わせ、任意の順序、および／または任意の多様性において、アルファウイルスレプリコン粒子の製造のための本発明の方法で利用することができる。

本発明は、さらに、本発明のＲＮＡ分子を含むベクターおよび／または核酸構築物を提供する。さらに、本発明の１つ以上のＲＮＡ分子と１つ以上アルファウイルス複製単位ベクターとを含む細胞を提供する。１つ以上とは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つなどを意味する。本発明の細胞は、アルファウイルスタンパク質をコードする核酸構築物を発現させることができる任意の細胞である。本発明の細胞の例としては、これらに限定されるものではないが、ベロ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、２９３細胞、２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１１２６８）細胞、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、ＵＭＮＳＡＨ／ＤＦ−１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１２２０３）細胞、ＰＥＲＣ．６細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などが挙げられる。

さらに、本明細書において、本発明の１つ以上のＲＮＡ分子を細胞へ導入する工程を含む、アルファウイルスレプリコン粒子を製造する方法であって、当該導入によってＲＮＡ分子の組み合わせが、アルファウイルスレプリコン粒子が産生される条件下において、アルファウイルスレプリコンＲＮＡと共に、アルファウイルスレプリコン粒子の産生に必要なすべてのアルファウイルス構造タンパク質をコードする方法が提供される。本発明のいくつかの実施形態において、当該アルファウイルス粒子は、天然アルファウイルスの構造的な構成を模倣しており、ここでレプリコンＲＮＡがカプシドタンパク質によって覆われ、次いでアルファウイルス糖タンパク質を含有する細胞膜でエンベロープされる。このような実施形態において、アルファウイルス構造タンパク質は、すべて同じアルファウイルスに由来する。代替的な実施態様において、アルファウイルスタンパク質は、異なるアルファウイルスに由来していてもよく、ただし、これらの異なるタンパク質が、粒子アセンブリ中にお互いを「認識」するか、あるいは、それらが、お互いを認識できるように修飾される（文献に記載されているように）場合に限る。

本発明の方法のいくつかの実施形態において、本発明の２つのＲＮＡ分子が本発明の細胞に導入され、この場合、当該２つのＲＮＡ分子は、アルファウイルスレプリコン粒子を産生するために、パッケージング細胞において全ての必要な構造タンバク質が産生される組み合わせにおいて、異なるアルファウイルス構造タンパク質をコードする。したがって、本発明は、細胞に２つのＲＮＡ分子を導入し、当該２つのＲＮＡ分子の第一のＲＮＡ分子が、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードするが、構造タンパク質のすべてはコードせず、当該２つのＲＮＡ分子の第二のＲＮＡ分子が、第一のＲＮＡ分子によってコードされない１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする方法を提供する。

さらに、本発明は、本発明の３つのＲＮＡ分子を細胞に導入し、アルファウイルスレプリコン粒子を産生するために必要な構造タンパク質のすべてが当該細胞において産生される組み合わせにおいて、当該３つのＲＮＡ分子のそれぞれが、異なるアルファウイルス構造タンパク質をコードする方法を提供する。したがって、本発明の３つのＲＮＡ分子を細胞に導入し、当該３つのＲＮＡ分子の第一のＲＮＡ分子が、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードするが、構造タンパク質のすべてはコードせず、当該３つのＲＮＡ分子の第二のＲＮＡ分子が、第一のＲＮＡ分子によってコードされたアルファウイルス構造タンパク質とは異なる１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、当該３つのＲＮＡ分子の第三のＲＮＡ分子が、第一のＲＮＡ分子および第二のＲＮＡ分子によってコードされるアルファウイルス構造タンパク質とは異なる１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする方法を提供する。例えば、一実施形態において、当該第一のＲＮＡ分子は、アルファウイルスカプシドタンパク質をコードすることができ、当該第二のＲＮＡ分子は、アルファウイルス糖タンパク質Ｅ１をコードすることができ、並びに当該第三のＲＮＡ分子は、アルファウイルス糖タンパク質Ｅ２をコードすることができる。

いくつかの実施形態において、１つ以上ではあるが全てではないアルファウイルス構造タンパク質が、アルファウイルス構造タンパク質によってパッケージされるレプリコンＲＮＡによってコードされ得る。例えば、本明細書において特許請求されたアルファウイルスレプリコン粒子の製造方法において使用される組換えＲＮＡは、対象となる核酸として、および／または対象となる核酸に加えて、１つのアルファウイルス構造タンパク質または２つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。したがって、特定の実施形態において、レプリコンＲＮＡは、１つのアルファウイルス構造タンパク質または２つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする。このレプリコンＲＮＡは、本発明の１つ以上のＲＮＡヘルパー分子と一緒に細胞の集団中に導入され得る。このレプリコンＲＮＡは、当該レプリコンＲＮＡおよび本発明のＲＮＡヘルパー分子（単数または複数）が全てのアルファウイルス構造タンパク質を産生し、当該レプリコンＲＮＡが当該細胞において粒子内にパッケージされるように、本発明の１つ以上のＲＮＡヘルパー分子と一緒に細胞の集団中に導入することができる。

さらなる実施形態において、ａ）アルファウイルスレプリコンＲＮＡと、ｂ）本発明の１つ以上のＲＮＡ分子と、ｃ）１つ以上のプロモーター補助アルファウイルスヘルパー構築物とを細胞へ導入する工程を含む、アルファウイルスレプリコン粒子を製造する方法であって、当該導入により、（ｂ）のＲＮＡ分子と（ｃ）のヘルパー構築物の組み合わせが、アルファウイルスレプリコン粒子が産生される条件下においてアルファウイルスレプリコン粒子の産生に必要なすべてのアルファウイルス構造タンパク質をコードする方法が提供される。

したがって、本発明のさらなる実施形態において、「プロモーター補助ヘルパー構築物」、すなわち、例えば２６Ｓプロモーターなどのプロモーターの誘導の下で１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質を発現する組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、本発明のヘルパー分子と組み合わせて使用される。１セットのＲＮＡ分子の実施形態において、当該「プロモーター補助ヘルパー構築物」は、（ｉ）５’アルファウイルス複製認識配列と、（ｉｉ）転写プロモーターと、（ｉｉｉ）１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と、（ｉｖ）３’アルファウイルス複製認識配列とをコードする第一の核酸配列を含む。

別のセットのＲＮＡ分子の実施形態において、当該「プロモーター補助ヘルパー構築物」は、５’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸配列と、ＩＲＥＳ要素のすぐ上流にあるアルファウイルスサブゲノムプロモーターと、アルファウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸と、３’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸とを含む、国際公開第２００４／０８５６６０号（２００４年１０月７日に公開、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、組換えヘルパー核酸である。さらなる実施形態において、これらのプロモーター補助ヘルパー構築物は、サブゲノムプロモーターのすぐ下流かつＩＲＥＳ要素のすぐ上流に位置するスペーサー核酸を含み得る。当該スペーサー核酸は、構造タンパク質の翻訳の一部または全部が、次にＩＲＥＳによって誘導されるように、メッセンジャーＲＮＡの５’キャップからの少なくとも一部の翻訳、およびいくつかの実施形態では全部の翻訳を防止するのに十分な長さの任意のランダムもしくは特異的非コード核酸配列を含み得、またはから成り得る。あるいは、スペーサー核酸が、メッセンジャーＲＮＡの５’キャップからの少なくとも一部および可能であれば全部の翻訳活性を防止するのに十分な二次構造を核酸に付与する長さおよび配列構造であり得る。本発明において使用されるプロモーター補助ヘルパー構築物はさらに、ヘルパー細胞のゲノムに安定して組み込まれ得るＤＮＡ分子であり得るか、または有意に組み込まれること無しにエピソーム（例えば、プラスミド）から一過的に発現され得るＤＮＡ分子であり得る。本発明のＤＮＡ分子は、ＤＮＡベクターであってもよく、例えば、これに限定されるものではないが、プラスミドなどの非組み込み型ＤＮＡベクター、またはウイルスベクターが挙げられる。

本明細書に記載されるような「ヘルパー細胞」または「パッケージング細胞」を利用しかつ本発明のプロモーターレスＲＮＡ分子を含む本発明の実施形態において、当該ヘルパー細胞は、本発明のアルファウイルスレプリコン粒子を産生するのに十分なアルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列の組み合わせを当該ヘルパー細胞が含むような任意の組み合わせにおいて、プロモーター補助ヘルパー構築物（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、Ｅ１およびＥ２糖タンパク質は、第一のヘルパー構築物によってコードされ、カプシドタンパク質は、第二のヘルパー構築物によってコードされる。別の実施形態において、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ２糖タンパク質、およびカプシドタンパク質は、それぞれ別個の（例えば、第一、第二、および第三の）ヘルパー構築物によってコードされる。さらに他の実施形態において、カプシドタンパク質および糖タンパク質Ｅ１もしくはＥ２のどちらかが、第一のヘルパー構築物によってコードされ、第一のヘルパー構築物に含まれない残りの糖タンパク質Ｅ１もしくはＥ２は、カプシドコード配列の有無にかかわらず、第二のヘルパー構築物によってコードされる。さらなる実施形態において、アルファウイルス糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、並びにカプシドタンバク質は、任意の順序および／または任意の多様性において、全て１つのヘルパー構築物でコードされ得る。本発明に含まれる実施形態では、所定のアルファウイルス構造タンパク質を、２つ以上のヘルパー構築物によって発現させることも可能である。本発明のプロモーターレスＲＮＡヘルパーは、必要に応じて本明細書に記載されているような他の既知のヘルパーとの組み合わせにおいて、任意の組み合わせ、任意の順序、および／または任意の多様性において、アルファウイルス−許容細胞中に導入することができる。

本発明のいくつかの実施形態において（例えば、プロモーターレスＲＮＡ分子またはプロモーターによって補助されるＲＮＡヘルパー構築物をコードするＤＮＡ構築物のための）、ＤＮＡからのＲＮＡの転写を誘導するためのプロモーター、すなわちＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、インビトロ転写反応においてＲＮＡを合成するために利用され、この使用のために好適な特定のプロモーターとしては、ＳＰ６、Ｔ７、およびＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の全ての実施形態において、プロモーターレスヘルパー分子および／またはプロモーター補助ヘルパー構築物および／またはレプリコンベクターによってコードされる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質および／または非構造タンパク質、並びにレプリコン核酸の非翻訳領域は、本明細書に記載されているように、任意の組み合わせにおいて、１つ以上の弱毒化突然変異を含有し得ることが想到される。

本発明はさらに、アルファウイルスレプリコン粒子１０^８個当たりに１個未満の複製能力のあるアルファウイルス粒子を含有するアルファウイルスレプリコン粒子の集団を提供する。さらなる実施形態において、当該集団は、アルファウイルスレプリコン粒子１０^９個、１０^１０個、１０^１１個、１０^１２個、または１０^１３個当たりに１個未満の複製能力のあるアルファウイルス粒子を含有する。本発明は、さらに、当技術分野で周知の方法に従って、培養中の許容細胞での継代によって決定されるような、検出可能な複製能力のあるウイルス粒子を含有しないアルファウイルスレプリコン粒子の集団を提供する。

さらに本明細書において、培養中の許容細胞での継代によって決定されるような、検出可能な複製能力のあるアルファウイルス粒子をアルファウイルスレプリコン粒子１０^８個、１０^９個、１０^１０個、１０^１１個、１０^１２個、または１０^１３個当たりに含まないかもしくは１個未満の複製能力のあるアルファウイルス粒子を含むアルファウイルスレプリコン粒子の集団であって、この場合、当該アルファウイルスレプリコン粒子は、アルファウイルス構造タンパク質またはアルファウイルス非構造タンパク質のいずれか、あるいはアルファウイルス構造タンパク質およびアルファウイルス非構造タンパク質の両方に、１つ以上の弱毒化突然変異を含む集団が提供される。さらに、アルファウイルスレプリコン粒子の集団であって、当該集団が、培養中の許容細胞での継代によって決定されるような、検出可能な複製能力のあるウイルス粒子を含まず、当該アルファウイルスレプリコン粒子が、アルファウイルス構造タンパク質またはアルファウイルス非構造タンパク質のいずれか、あるいはアルファウイルス構造タンパク質およびアルファウイルス非構造タンパク質の両方に、１つ以上の弱毒化突然変異を含む集団が提供される。

同定可能な「パッケージングシグナル」の欠失にもかかわらず、本発明のヘルパーＲＮＡ、並びに文献に記載されているヘルパーＲＮＡは、時に文献で報告される頻度よりかなり高い頻度で、培養細胞においてアルファウイルス構造タンパク質によってパッケージされる。したがって、本発明のアルファウイルスレプリコン粒子の集団は、本発明の新規のヘルパー分子がパッケージされる集団における粒子のサブセットの存在により、文献に記載されている粒子と区別される。

「アルファウイルスレプリコン粒子」、「ＡＲＰ」、「ウイルスレプリコン粒子」、または「組換えアルファウイルス粒子」なる用語は、本明細書において互換的に用いられ、１つ以上の非相同ＲＮＡ配列を発現するアルファウイルスレプリコンＲＮＡを取り込むビリオン様構造複合体を意味する。通常、ビリオン様構造複合体は、脂質エンベロープに包埋されている１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質を含み、当該脂質エンベロープはヌクレオカプシドを封入し、当該ヌクレオカプシドはＲＮＡを封入する。当該脂質エンベロープは、通常、当該粒子が産生される細胞の原形質膜に由来する。ある特定の実施形態において、当該アルファウイルスレプリコンＲＮＡは、アルファウイルスッカプシドタンパク質から成るヌクレオカプシド構造によって取り囲まれており、アルファウイルス糖タンパク質は細胞由来の脂質エンベロープに包埋されている。構造タンパク質およびレプリコンＲＮＡは、同じアルファウイルスまたは異なるアルファウイルスに由来してもよい。特定の実施形態において、レプリコンＲＮＡは、ＶＥＥ由来であり、構造タンパク質は、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス由来である（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、米国特許第６，３７６，２３６号を参照のこと）。アルファウイルスレプリコン粒子は、感染性であるが、伝播性が欠損しており、すなわち、レプリコンＲＮＡは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするヘルパー核酸（単数または複数）の不在下において粒子が最初に感染した宿主細胞を越えて伝播することができない。

「アルファウイルスＲＮＡレプリコン」、「アルファウイルスレプリコンＲＮＡ」、「アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン」、および「ベクターレプリコンＲＮＡ」なる用語は、互換的に用いられ、自身の複製（増幅）を誘導することができ、少なくとも、５’および３’アルファウイルス複製認識配列（当該配列は、上で定義されるように最小配列であり得るが、代わりに、アルファウイルス由来の領域全体であり得る）、アルファウイルス非構造タンパク質のコード配列、およびポリアデニル化トラクトを含むように非構造タンパク質遺伝子を発現するＲＮＡ分子を意味する。これはさらに、プロモーターおよび／またはＩＲＥＳを含有し得る。さらにこれは、アルファウイルス構造タンパク質を発現するように操作することもできる。ＪｏｈｎｓｔｏｎらおよびＰｏｌｏらは、このようなアルファウイルスＲＮＡレプリコンのための多くの構築物について記載しており、このような構築物は、参照により本明細書に組み込まれる。アルファウイルスレプリコンＲＮＡの一実施形態において、アルファウイルス非構造タンパク質は、米国特許出願公開第２００３−０１１９１８２号に記載されているように、２つの別々の翻訳単位に分離されている。なお、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。

非相同配列を持たないアルファウイルスレプリコンＲＮＡ、すなわち、空のレプリコンは、アジュバント組成物を産生するために、アルファウイルスレプリコン粒子において使用され得る。あるいは、アルファウイルスレプリコンＲＮＡは、アルファウイルス構造タンパク質および／または他の非相同核酸配列をコードする核酸を発現することができ、この後者は、ウイルス、原始核細胞、および／または真核細胞に由来する広範囲の配列から選択することができる。非相同配列のカテゴリの例としては、これらに限定されるものではないが、免疫原（例えば、天然、修飾または合成の抗原性タンパク質、ペプチド、免疫原性断片、またはエピトープ）、サイトカイン、トキシン、治療用タンパク質、酵素、アンチセンス配列、および免疫応答調節因子が挙げられる。特定の用途に適切かつ望ましい場合、当該転写されたｍＲＮＡは、翻訳され、すなわち、タンパク質が合成されるか、または機能性ＲＮＡが産生される。これらのｍＲＮＡは、真核細胞内に「キャップ」されており、すなわち、メチル−７−グアノシン（５’）ｐｐｐＮ構造が、ｍＲＮＡの５’末端に存在し（「キャップ」または「５’キャップ」）、このキャップが、ｍＲＮＡからタンパク質を合成する翻訳開始因子によって認識される。したがって、２６Ｓプロモーターが、転写を誘導し、「キャップ」が、翻訳のための開始シグナルを提供する。

いくつかの実施形態において、レプリコンＲＮＡは、任意のアルファウイルス構造タンパク質（単数または複数）をコードする核酸を欠失し得る。他の実施形態において、アルファウイルスレプリコンＲＮＡは、１つまたは２つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸を含み得るが、当該レプリコンＲＮＡは、アルファウイルス構造タンパク質の全てをコードする核酸を含有しない。したがって、結果として得られる本発明のアルファウイルスレプリコン粒子は、当該レプリコンＲＮＡがそのカプシド形成および感染性ビリオンのアセンブリに必要な全ての構造タンパク質をコードしないが故に、伝播性が欠損している。

特許請求される本発明において利用されるアルファウイルスＲＮＡレプリコンの特定の実施形態は、本明細書に詳細に記載されているような１つ以上の弱毒化突然変異を含み得る。弱毒化ヌクレオチド置換の例としては、本明細書に記載されているＶＥＥの５’末端におけるヌクレオチド３での突然変異、並びにアルファウイルスＳ．Ａ．ＡＲ８６におけるｎｓＰ１アミノ酸位置５３８、ｎｓＰ２アミノ酸位置９６、またはｎｓＰ２アミノ酸位置３７２での突然変異が挙げられる。

本発明のアルファウイルスレプリコン粒子は、任意のアルファウイルスに由来するレプリコンＲＮＡを含み得る。その上、本発明のアルファウイルスレプリコン粒子は、本発明のアルファウイルスのいずれかに由来するアルファウイルス構造タンパク質を含み得る。したがって、当該レプリコン粒子は、同じアルファウイルスあるいは異なるアルファウイルスに由来するレプリコンＲＮＡおよび構造タンパク質から製造することができ、これらの後者は、キメラアルファウイルスレプリコン粒子（例えば、ＶＥＥウイルスベースのレプリコンＲＮＡおよびＳｉｎｄｂｉｓウイルス構造タンパク質を含む粒子）であるであろう。

本発明の特定の実施形態において、本発明のアルファウイルス構造タンパク質は、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス構造タンパク質、ＳＦＶ構造タンパク質、ＶＥＥ構造タンパク質、ロスリバーウイルス構造タンパク質、ＥＥＥ構造タンパク質、および／またはＷＥＥ構造タンパク質であってもよい。これらは、お互いの任意の組み合わせにおいて存在し得、並びに、非構造タンパク質および他のアルファウイルス配列、例えば、５’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルスのサブゲノムプロモーター、および３’アルファウイルス複製認識配列など、の組み合わせにおいて存在し得、これらまたは他のアルファウイルスのいずれかから、本発明のキメラ組換えアルファウイルスレプリコン粒子および／またはキメラ組換え核酸を産生する。

本発明のいくつかの実施形態において、本発明は、アルファウイルス核酸、アルファウイルスタンパク質、アルファウイルスレプリコンＲＮＡおよび／または１つ以上の弱毒化突然変異を含むアルファウイルスレプリコン粒子、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド付加、および／または１つ以上のヌクレオチドの置換として定義される弱毒化突然変異、あるいは、適切な野生型アルファウイルスと比較して、突然変異を含有する生存ウイルスにおいて毒性が喪失されるに至る再構成またはキメラ構築物を含む突然変異を含み得る。

適切な弱毒化突然変異は、使用されるアルファウイルスに応じて変わり、そのような弱毒化突然変異は、当業者には既知であろう。代表的な弱毒化突然変異としては、これらに限定されるものではないが、Ｊｏｈｎｓｔｏｎらの米国特許第５，５０５，９４７号、Ｊｏｈｎｓｔｏｎらの米国特許第５，１８５，４４０号、Ｄａｖｉｓらの米国特許第５，６４３，５７６号、Ｊｏｈｎｓｔｏｎらの米国特許第５，７９２，４６２号、同第６，１５６，５５８号、および同第５，６３９，６５０号に記載されているものが挙げられ、なお、これらの各特許の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＶＥＥ Ｅ１糖タンパク質に対する特定の弱毒化突然変異は、Ｅ１アミノ酸位置８１，２７２または２５３の任意の１つでの弱毒化突然変異を含み得る。ＶＥＥ−３０４２突然変異体から製造されたアルファウイルスレプリコン粒子は、Ｅ１−８１にイソロイシン置換を含有し、ＶＥＥ−３０４０突然変異体から作製されたウイルスレプリコン粒子は、Ｅ１−２５３に弱毒化突然変異を含有する。ＶＥＥ Ｅ２糖タンパク質に対する特定の弱毒化突然変異は、Ｅ２アミノ酸位置７６、１２０、または２０９の任意の１つに弱毒化突然変異を含み得る。ＶＥＥ−３０１４突然変異体から製造されたアルファウイルスレプリコン粒子は、Ｅ１−２７２およびＥ２−２０９の両方に弱毒化突然変異を含有する（米国特許第５，７９２，４９２号を参照のこと）。ＶＥＥ Ｅ３糖タンパク質に対する特定の弱毒化突然変異は、Ｅ３アミノ酸５６〜５９の欠失からなる弱毒化突然変異を含む。ＶＥＥ−３５２６突然変異体から製造されたウイルスレプリコン粒子は、Ｅ３（ａａ５６〜５９）にこの欠失を含有し、Ｅ１−２５３に第二の弱毒化突然変異を含有する。Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ Ｅ２糖タンパク質に対する特定の弱毒化突然変異は、Ｅ２アミノ酸位置３０４、３１４、３７２、または３７６の任意の１つに弱毒化突然変異を含む。あるいは、当該弱毒化突然変異は、例えば、アミノ酸位置１５８、１５９、１６０、１６１、および１６２の任意の組み合わせにおける任意の１つ以上での、Ｅ２糖タンパク質におけるアミノ酸の置換、欠失、または挿入であってもよい（Ｐｏｌｏら国際公開第００／６１７７２号を参照のこと）。あるいは、本発明のＲＮＡ分子は、ＶＥＥのワクチン株であるＴＣ８３から誘導することもできる（国際公開第２００５／１１３７８２号を参照のこと。なお、当該特許は参照により本明細書に組み込まれる）。

本発明の別の弱毒化突然変異は、ＶＥＥゲノムＲＮＡのヌクレオチド３、すなわち、５’メチル化キャップの後の三番目のヌクレオチドでの弱毒化突然変異であってもよい（例えば、ｎｔ３でのＧ→Ｃ突然変異について記載されている米国特許第５，６４３，５７６号を参照のこと）。ウイルスまたはレプリコンの非コード配列に位置するこの突然変異は、いくつかの実施形態において、Ｇ→ＡまたはＧ→Ｕの突然変異であり得る。アルファウイルス構造タンパク質および／または非構造タンパク質が、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６に由来する場合、当該構造タンパク質および／または非構造タンパク質における代表的な弱毒化突然変異が、文献に記載されている（例えば、米国特許第５，６３９，６５０号および同第６，９８２，０８７を参照のこと。なお、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

本発明のアルファウイルスは、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス株（例えば、ＴＲ３３９）、ＶＥＥ（例えば、メチル化キャップまたはＴＣ８３に続くゲノムＲＮＡのヌクレオチド３に突然変異を有する）、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ウイルス、Ｇｉｒｄｗｏｏｄ Ｓ．Ａ．ウイルス、Ｏｃｋｅｌｂｏウイルス、および／またはそれらのキメラウイルスであってもよい。完全ゲノム配列、ならびに様々な構造タンパク質および非構造タンパク質の配列は、多数のアルファウイルスに対して文献から利用可能であり、その例としては、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２３６３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００１５４７）、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３８３０５）、ＶＥＥゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０４６５３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００１４４９）、ＶＥＥのＴＣ−８３ワクチン株（Ｋｉｎｎｅｙ ＲＭら（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：１９−３０；Ｋｉｎｎｅｙ ＲＭら（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（３）：１２６９−１２７７において補正）、Ｇｉｒｄｗｏｏｄ Ｓ．Ａゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３８３０４）、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルスゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０４１２９、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００３２１５）、およびＴＲ３３９ゲノム配列（Ｋｌｉｍｓｔｒａら（１９８８）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７３５７；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９９６）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１９８１）が挙げられる。

アルファウイルスレプリコン粒子は、当業者に公知の技術の組み合わせにおいて、本明細書に開示する方法に従って調製される。当該方法は、最初に、選択されたヘルパー（単数または複数）およびアルファウイルスレプリコンＲＮＡをアルファウイルス許容細胞の集団に導入する工程と、次いでアルファウイルスレプリコン粒子の産生を可能にする、当技術分野において周知の条件下において、細胞をインキュベートする工程とを含む。ヘルパー（単数または複数）およびアルファウイルスレプリコンＲＮＡをヘルパー細胞の集団に導入する工程は、本明細書に開示されているような、および一般的な当業者に公知のような、いずれかの好適な手段によって実施することができる。

アルファウイルスレプリコン粒子の集団は、例えば、米国特許第７，０７８，２１８号に記載されているような方法に従って、ヘルパー細胞またはパッケージング細胞から収集する。なお当該米国特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。あるいは、当業者に公知の他の技術を用いてパッケージング細胞から収集することもできる（例えば、米国特許第５，４９２，４６２号および同第６，１５６，５５８号）。これらの集団は、本明細書に記載されているような方法および文献において公知のような方法に従って、複製能力のあるウイルス（ＲＣＶ）の存在に対して評価される。本発明の集団は、培養中のアルファウイルス許容細胞での継代により特定されるような、検出可能なＲＣＶを含有しない。

いくつかの実施形態において、本発明は、被験体において免疫原性ポリペプチドをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコンをパッケージするため（例えば、ワクチン接種のため）、免疫療法のため（例えば、癌もしくは腫瘍を有する被験体を治療する）、または免疫調節因子のため（例えば、ＡＲＰまたは他のワクチン様相をアジュバンドするため）に用いることができる。本発明は、被験体において免疫応答を誘発するまたは高める方法であって、本発明のヘルパー構築物によって粒子内にパッケージされた有効量の核酸を当該被験体に投与する段階を含む方法を提供する。

本明細書で使用される場合、「免疫応答を誘発する」および「被験体を免疫化する」には、被験体における、本発明のタンパク質および／またはポリペプチド（例えば、免疫原、抗原、免疫原性ペプチド、および／または１つ以上のエピトープ）に対する体液性および／または細胞性免疫反応の発生が含まれる。「体液性」免疫反応は、この用語が当分野において周知であるように、抗体を含む免疫反応を意味するが、一方で「細胞性」免疫反応は、この用語が当分野において周知であるように、Ｔ−リンパ球および他の白血球を含む免疫反応、特に、ＨＬＡ拘束性細胞溶解性Ｔ細胞、すなわち「ＣＴＬ」による免疫原特異的応答を意味する。

さらに、本発明の核酸、粒子、集団、および医薬組成物は、被験体における細胞であり得る細胞へ、対象となるＮＯＩを送達する方法において採用され得ることも想到される。したがって、本発明は、非相同核酸を細胞に送達する方法であって、本発明のヘルパー構築物でパッケージされた有効量の粒子、集団、および／または組成物を当該細胞内に導入する段階を含む方法を提供する。さらに、被験体において非相同核酸を細胞に送達する方法であって、本発明のヘルパー構築物でパッケージされた有効量の粒子、集団、および／または組成物を被験体に送達する段階を含む方法が提供される。当該細胞は、外因性の核酸を取り込みかつ発現する任意の細胞であり得る。当該細胞は、非相同核酸が発現して非相同核酸によってコードされるタンパク質、ペプチド、または他のコード配列生成物（例えば、機能性ＲＮＡ配列）を産生する条件下で維持される。免疫療法および／または遺伝子療法のための周知のプロトコールに従って、本発明の細胞および／または被験体に治療効果を与えるために、このような方法を利用することができる。

本発明の「被験体」としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ブタ、ラット、およびマウスなどの温血動物が挙げられる。

本発明はさらに、薬学的に許容される担体中に本発明の粒子および／または粒子の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。「薬学的に許容される」とは、生物学的でない物質または他の点で不所望でない物質、すなわち、実質的に有害な生物学的効果を引き起こさずに、またはそれが含有される組成物の他の成分のいずれとも有害な方法で相互作用することなく、選択された粒子および／またはその集団と一緒に被験体に投与することができる物質を意味する。薬学的に許容される担体は、ヒトおよび本発明の他の被験体への投与または送達に好適である。当該担体は、当然のことながら、当業者に周知であるように、有効成分の任意の分解を最小にするように、並びに被験体において任意の有害な副作用を最小にするように選択されるであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ； 最新版を参照のこと）。本発明の、例えばワクチンまたは別の免疫原性組成物などの医薬製剤は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、本発明のヘルパー構築物を使用して作製された免疫原性量の感染性の伝播欠損性アルファウイルスレプリコン粒子を含む。代表的な薬学的に許容される担体としては、これに限定されるものではないが、滅菌パイロジェン非含水および滅菌パイロジェン非含生理食塩水が挙げられる。

「免疫原性量」は、投与または送達される被験体において、免疫応答を誘起するのに十分な、本発明の集団における感染性アルファウイルス粒子の量である。本明細書に記載されたアッセイによって特定されるような、投与量当たり約１０^４〜約１０^９、特に１０^６〜１０^８の量の感染ユニットまたは「ＩＵ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｕｎｉｔ）」が、治療される被験体の年齢および種に応じて好適であると考えられる。投与は、例えば、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、腟内、静脈内、皮内（例えば、遺伝子銃により）、直腸内、および／または皮下などの任意の好適な方法によって行われ得る。本明細書の組成物は、皮膚乱切法、および／またはパッチもしくは液体により経皮的に投与してもよい。当該組成物は、ある期間にわたって組成物を放出する生分解性物質の形態において皮下により送達することができる。

本明細書で使用される場合、「有効量」は、治療効果であり得る所望の効果を得るのに十分な、本発明の集団または組成物または製剤の量を意味する。当該有効量は、被験体の年齢、全身状態、治療される状態の重症度、投与される特定の薬剤、治療の期間、任意の併用治療の性質、使用される薬学的に許容される担体、当業者の知識および専門的技術の範囲内の因子などにより変わるであろう。必要に応じて、任意の個々の場合における「有効量」は、適切な教示書および文献を参照することにより、および／または通常の実験により、当業者が決定することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ ｅｄ．２０００）を参照のこと）。

あるいは、本発明の医薬製剤は、被験体の粘膜への投与（例えば、鼻腔内投与、口腔内投与、および／または吸入）に好適であり得る。当該製剤は、単位投与剤形において好都合に調製され得、並びに当技術分野において周知の任意の方法によって調製され得る。

さらに、本発明の当該組成物は、当技術分野において周知の方法に従って被験体の細胞から単離または増殖された樹枝状細胞、またはバルク末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）、あるいは被験体に由来するそれらの様々な細胞サブフラクションに感染またはトランスフェクトするために使用され得る。

エキソビボ法を用いる場合、細胞または組織は、当技術分野において周知の標準的なプロトコールに従って、体外に取り出され、本発明の組成物を当該細胞または組織中に導入する間、維持され得る。

本発明の粒子の集団を含む免疫原性組成物（当該粒子は、当該組成物がヒトまたは動物に投与された場合に、対象となる核酸配列（単数または複数）の発現を誘導する）は、当技術分野において公知の任意の方法によって製剤化され得る。そのような組成物、特にワクチンは、通常、注射液として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製される。さらに注射前の液体への溶解または懸濁に好適な固体形態も調製され得る。凍結乾燥された製剤も好適である。

活性免疫原性成分（例えば、アルファウイルスレプリコン粒子）は、多くの場合、有効成分に対して薬学的に許容されるおよび／または適合する賦形剤および／または担体と混合される。好適な賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、滅菌水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合せ、並びに安定化剤、例えばＨＳＡまたは他の適切なタンパク質および還元糖が挙げられる。

さらに、所望の場合、当該ワクチンは、少量の、例えば湿潤剤および／または乳濁剤などの補助物質、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの有効性を高めるアジュバントを含み得る。効果的であり得るアジュバントの例としては、これらに限定されるものではないが、ＱＳ−２１、フロイントアジュバント（完全および不完全）、アルミニウム塩（ミョウバン）、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ− トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）；Ｎ−アセチル−ノルームラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも呼ばれる）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３ヒドロキシホスホリルオキシ））−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも呼ばれる）；およびバクテリアから抽出された３つの成分のモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ ８０エマルジョン中に含有するＲＩＢＩが挙げられる。

アジュバントのさらなる例には、これらに限定されるものではないが、水中油エマルジョン配合物、免疫促進物質、例えばバクテリア細胞壁成分もしくは合成分子など、またはオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ）、および、例えばポリビニルポリマーなどの別の骨格部分を組み込むことのできる核酸ポリマー（二本鎖および一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡの両方）が含まれ得る。

アジュバントの有効性は、アジュバンドもしくはアジュバンドの組み合わせも含むワクチン製剤中の当該粒子含有組成物の投与によって生じる、アルファウイルスレプリコン粒子の免疫原性産物に対する抗体または細胞障害性Ｔ細胞の量を測定することによって決定され得る。当該技術分野において既知の、そのようなさらなる製剤および投与の様式も使用され得る。

アジュバントは、本発明の組成物、または本発明の組成物と組み合わせて使用できる他のワクチン配合物のどちらかと組み合わせることができる。

本発明の組成物は、さらに、他の薬剤、医薬品、担体、および希釈剤を含み得る。

本発明の組成物を、最適化し、他のワクチン接種レジメンと組み合わせることにより、広範囲の（すなわち、上記に記載された機能を含む、免疫応答の全ての態様を網羅する）可能な細胞応答および体液応答を得ることができる。ある特定の実施形態において、これは、病原菌または腫瘍に由来する免疫原、組換え免疫原、裸の核酸、脂質含有成分により調製された核酸、非アルファウイルスベクター（これらに限定されるものではないが、痘疹ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、パポーバウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含む）、および他のアルファウイルスベクターの１つ以上を含む組成物との組み合わせにおいて本発明の組成物が使用される非相同プライムブースト法の使用を含み得る。当該ウイルスベクターは、ウイルス様粒子もしくは核酸であり得る。代表的なアルファウイルスベクターは、レプリコン含有粒子、ＤＮＡベースのレプリコン含有ベクター（場合によって「ＥＬＶＩＳ」システムとも呼ばれ、例えば、米国特許第５，８１４，４８２号を参照のこと）、および／または裸のＲＮＡベクターであり得る。

本発明の免疫原性（またはそうでなければ、生理的に活性な）アルファウイルス粒子含有集団および組成物は、投与剤形と適合する方法において、並びに予防上および／または治療上有効なそのような量において投与される。投与される量は、一般的に、投与量１ｍＬ当たり約１０^４〜１０^９感染ユニットの範囲であり、治療される被験体、当該粒子が投与または送達される経路、発現産物の免疫原性、所望されるエフェクター免疫応答のタイプ、並びに所望される予防の程度に応じて変わる。いくつかの実施形態において、約１０^６、１０^７、および１０^８Ｉ．Ｕ．（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｕｎｉｔ）の投与量は、ヒト被験体において特に効果的である。投与または送達に必要とされる有効成分の有効量は、医師、獣医師、または別の保健実務者の判断に応じて変わり、所定の被験体に対して固有であり得るが、そのような決定は、そのような実務者の技術の範囲内である。

本発明の組成物および配合物は、１回投与または複数回投与のスケジュールにおいて与えられ得る。複数回投与スケジュールは、投与の初回治療単位が、１〜１０またはそれ以上の分割投与量を含み、その後に、所望する効果（例えば、免疫応答）を維持および／または増強するために必要とされるような時間間隔、例えば、毎週または第二の投与に対して１〜４ヶ月目に他の投与量が投与され、並びに必要であれば、さらに数ヶ月（例えば、４または６ヶ月）／数年後に次の投与量（単数または複数）が投与されるスケジュールである。

本発明の治療方法の効果は、本発明の障害の治療効果を評価するための周知のプロトコールに従って決定され得る。治療効果の決定因子としては、これらに限定されるものではないが、当技術分野において周知であるように、全生存率、無病生存率、症状の改善、進行までの期間、および／または生活の質などが挙げられる。

「治療する」または「治療すること」または「治療」は、障害、疾病、もしくは病気で苦しむ被験体に、例えば有益効果であり得る調節作用を付与する任意の種類の処置を意味し、当技術分野において周知であるような、被験体の状態（例えば、１つ以上症状）の改善、状態の進行の遅延または軽減、障害、疾病、もしくは病気の兆候の予防または遅延、並びに／あるいは障害、疾病、もしくは病気に関する臨床的指標のいずれかにおける変化などが挙げられる。

前述の詳細な説明は、単に例示のために提供されるものであり、本発明の精神および範囲から逸脱せずに修飾および変更を加えることができることは理解される。

（実施例１）
ｄＨｃａｐおよびｄＨｇｐヘルパーの構築
米国特許第５，７９２，４６２号、Ｐｕｓｈｋｏら、１９９７（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１）、および国際公開第０２／０３９１７号（Ｏｌｍｓｔｅｄら）に記載されているように、ＶＥＥヘルパープラスミド（カプシドヘルパーに対しては「１３．２．２」とも呼ばれ、糖タンパク質ヘルパーに対しては「１３．４．６」とも呼ばれる）からカプシドおよび糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子を増幅するようにプライマーを設計した（カプシドＦ（配列番号９８）、ＧＰ Ｆ（配列番号６０）、および１３−１０１．ｐｒ４（配列番号６１）（表１）。これらのプライマーは、ＲｓｒＩＩ制限部位を提供し、さらに、それぞれ、カプシドまたは糖タンパク質コード配列の開始位置に結合する。上記に引用された参照文献に記載されているＤＮＡプラスミドは、例えばＰＣＲ増幅により構造タンパク質コード断片を得るための便利な供給源であり得る。あるいは、これらのコード断片は、ＶＥＥの完全長クローンまたはその弱毒化変異体から得ることができる（米国特許第５，１８５，４４０号；同第５，５０５，９４７号を参照のこと）。

これらのプライマーによる増幅は、結果として、ＰＣＲ産物の５’末端から３’末端へと列挙される以下の要素：５’〜ＲｓｒＩＩ制限部位、ＶＥＥ構造タンパク質コード配列ＯＲＦ、３’ＵＴＲ、ＳｐｈＩ制限部位〜３’、を有する断片を生じる。次いで、当該ＰＣＲ産物は、米国特許第５，７９２，４６２号、Ｐｕｓｈｋｏら、１９９７（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１）、および国際公開第０２／０３９１７号（Ｏｌｍｓｔｅｄら）に記載されるように、ＲｓｒＩＩおよびＳｐｈＩ制限酵素によって消化され、空のＶＥＥレプリコンベクターにライゲーションする。このレプリコンＲＮＡは、ＶＥＥ非構造遺伝子および後に多重クローニング部位（ＭＣＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）が続く２６ＳサブゲノムＲＮＡプロモーターの単一のコピーを含む。ワクチン構築物では、免疫原をコードする１つ以上のコード配列がこのクローニング部位に挿入される。このベクターは、ＲｓｒＩＩおよびＳｐｈＩによって消化され（ｎｓＰｌの大部分およびｎｓＰｓ２〜４のすべてを除去する）、ライゲーションにより、完全なアルファウイルス５’および３’末端、すなわち「完全長」末端を含むヘルパーが生成する。したがって、これら２つのヘルパーは、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ）と称され、それぞれ、配列番号１および配列番号１０の５’配列、並びにそれぞれ、配列番号５５および配列番号５６の３’配列を有する（図１）。

続いて、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ）ヘルパーの両方に存在する５５２ｎｔ５’末端に、それぞれおよそ５０ｎｔの８つの連続した欠失部位を作製した（図２）。この手順は、２段階にて実施した。第一に、８つの異なるリバースプライマー（ｄＨｅｌｐ１〜８Ｒ、配列番号６３〜７０）を、（上に記載された）１３．２．２および１３．４．６ヘルパーの位置５０２までに、５’末端に対して相補的に設計し、ＲｓｒＩＩ制限部位をさらに含有するように、それぞれを操作した（表１）。任意のリバースプライマーと組み合わせた場合に、以下の要素（５’から３’へと列挙）：５’〜ＸｂａＩ制限部位、Ｔ７プロモーター、５’の切断された末端、ＲｓｒＩＩ制限部位〜３’、を有する断片を増幅するように、フォワードプライマー（３−１６．１．１（配列番号６２）を設計した。第二に、増幅された５’の切断された末端断片を、ＸｂａＩおよびＲｓｒＩＩによって直線化されたｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ）ヘルパー中にクローン化した。これにより、それぞれ配列番号２〜９および配列番号１１〜１８の５’配列を有する、ｄＨｃａｐ１〜８およびｄＨｇｐ１〜８と称される５’の切断された末端ヘルパー構築物の８つのセットが生成した。ｄＨｃａｐシリーズの各メンバーの３’配列は、本明細書において配列番号５５として提供され、ｄＨｇｐシリーズの各メンバーの３’配列は、本明細書において配列番号５６として提供される。

（実施例２）
プロモーターレスヘルパー発現カセットの発現解析方法
本明細書に記載されたΔ２６Ｓヘルパー構造体がＶＥＥ構造タンパク質をどの程度発現するかを決定するために、上に記載されたようなＶＥＥレプリコンベクターと一緒に各ヘルパーをベロ細胞中にエレクトポレーションした。本発明の新規のプロモーターレス構造タンパク質発現カセットの能力を実証するために、ＧＦＰまたはボツリヌス神経毒素コード配列を、ＶＥＥレプリコンベクターのクローニング部位に挿入することにより、ＶＥＥレプリコンを構築した。本明細書に記載されたプロモーターレス構造タンパク質発現カセットの様々な組み合わせによって作製された粒子からのこれらのコード配列の発現により、これらのカセットの有用性および新規性が実証される。

メーカーの指示に従ってＲｉｂｏＭＡＸ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ラン−オフ転写により、各ヘルパーおよびレプリコンベクターからＲＮＡを転写した。エレクトロポレーションの前に、ヘルパーおよびレプリコンＲＮＡを、シリカベースのクロマトグラフィによって精製した。３０マイクログラム（３０μｇ）の各ヘルパーおよびレプリコンＲＮＡを混合し、３〜５Ｘ１０^７のベロ細胞中にエレクトポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を培地で希釈し、２５ｃｍ^２のフラスコまたは９６ウェルプレートに播種した。次いで、エレクトロポレーションした細胞を３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。

Ａ．ＩＦＡ分析
９６ウェルプレート中に播種されたエレクトロポレーションした細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で１回洗浄し、次いで、室温で５時間かけてアセトン：メタノール（１：１）で固定化した。次に、当該細胞を、構造タンパク質に特異的なマウス抗体を使用して、ＶＥＥカプシドまたはＧＰタンパク質の発現について分析した。一次抗体をＰＢＳ：ＦＢＳ（１：１）で希釈し、各ウェルに１００μｌを加えた。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、１５０μｌのＰＢＳで３回洗浄し、次いでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を上に記載されているように再び洗浄し、各ウェルに最終容積が１００μｌになるようにＰＢＳを加え、紫外蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００）によって検査した。

Ｂ．ノーザン分析
エレクトロポレーションした細胞を、２５ｃｍ^２のフラスコに播種し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、ＲＮＡｗｉｚＲＮＡ（登録商標）単離試薬（Ａｍｂｉｏｎ社、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用し、メーカーの提案するプロトコールに従って全細胞ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度は吸光分光分析法によりで決定した。各試料の５マイクログラム（５μｇ）を、１％グリオキサールアガロースゲルにより電気泳動して、ＲＮＡをＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ社）膜に受動移入させた。ノーザン分析は、ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ ＢｉｏＤｅｔｅｃｔ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用し、メーカーの提案するプロトコールに従って、ＶＥＥの３’複製認識配列のブラス鎖に特異的なビオチニル化ＤＮＡオリゴで実施した。化学発光は、処理された膜をフィルムに露光して検出した。

Ｃ．ｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ）発現の分析
完全長Δ２６Ｓヘルパー（ｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ））が複製され、タンパク質を発現し得ることを実証するために、これらのヘルパーＲＮＡを、ヘルパーＲＮＡの複製を促進するアルファウイルス非構造タンパク質を得るために必要なレプリコンベクターと一緒に、細胞中へエレクトポレーションした。ベロ細胞を、３０μｇのレプリコンＲＮＡと組み合わせた３０μｇまたは６０μｇのｄＨｃａｐ（ＦＬ）またはｄＨｇｐ（ＦＬ）ヘルパーＲＮＡによりエレクトポレーションした。当該エレクトポレーションした細胞を、上に記載されたようなＩＦＡ、ウエスタンブロット、およびノーザン分析ために処理した。

（実施例３）
完全長および切端されたΔ２６Ｓヘルパーの発現分析
ｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ）ヘルパーは、ＩＦＡおよびウエスタンブロットによって決定されるように、タンパク質を発現し、ノーザンブロットによって図示されるように、効率的に複製された。

カプシドおよびＧＰの両方に対する切端されたΔ２６Ｓヘルパー（欠失１〜８）の完全なセットが、それぞれがどの程度良好に発現されかつ複製されるかを評価するため、ＩＦＡおよびノーザンブロットにより当該セットのタンパク質発現を分析した。それぞれのｄＨｃａｐヘルパーＲＮＡをＶＥＥレプリコンＲＮＡおよび１３．４．６糖タンパク質ヘルパーＲＮＡと組み合わせて、３つのＲＮＡをベロ細胞中にエレクトロポレーションした。ノーザン分析およびＩＦＡは、上に記載されたようにして実施した。カプシド特異的抗体を使用したＩＦＡの結果を表２に示す。すべてのｄＨｃａｐヘルパーは、ＩＦＡによりカプシド発現に対して陽性であったが、ｄＨｃａｐ８ヘルパーのみは、弱い陽性であった。

エレクトポレーションした細胞から抽出されたＲＮＡのノーザン分析は、切端されたカプシドΔ２６Ｓヘルパーが、ｄＨｃａｐ８を除いて、全てよく複製することを示した。

ｄＨｇｐヘルパーについても同様の方法で実験したが、この実験には１３．２．２カプシドヘルパーは含めなかった。各ｄＨｇｐヘルパーをＶＥＥレプリコンＲＮＡ組み合わせて、細胞中にエレクトポレーションし、ＩＦＡおよびノーザン分析のために上記と同様にして試料を作製した。抗−ＧＰ ＩＦＡの結果を表３に示す。ｄＨｃａｐヘルパーと同様に、ｄＨｇｐ８を除いて、全てのｄＨｇｐヘルパーが陽性であった。ｄＨｇｐ８を除いて、全てのｄＨｇｐヘルパーが、良好に複製した。

（実施例４）
修飾されたプロモーターレスヘルパー構築物
本発明者は、ウェスタンブロット法によって明らかにされたように、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ）ヘルパーが融合タンパク質を発現する点に注目した。このような融合タンパク質は、Δ２６Ｓヘルパーの転写の際に、カプシドまたはＧＰのための出発コドンの上流にあるインフレームの出発コドンで翻訳が開始された結果であり得る。そのような上流のコドンの１つは、ＶＥＥ ｎｓＰ１に対する天然の出発コドン（ＶＥＥウイルスゲノムのヌクレオチド４５に位置する）であり、これは、ｄＨｃａｐヘルパーおよびｄＨｇｐヘルパーの両方の５’末端に存在し、翻訳の開始に対して有利なコンテキストにある（例えば、コーザック共通配列）。有利なコーザック環境の出発コドンは、これらのヘルパーのキャップされた５’末端からのリボソームのスキャンによって使用され得、それによって、機能的ではない融合タンパク質が生成され、さらなる下流に位置する適切な出発コドンからの機能的カプシドおよび糖タンパク質ポリペプチドの産生が減少する可能性がある。

そのような融合タンパク質の産生量を減少させ、かつ完全長カプシドおよび糖タンパク質の発現を増加させるために２つのアプローチを用いた。第一に、上に記載された有利な出発コドンを、ＴＡＧ停止コドンへ変異させ、残りの出発コドンは変更せずそのまま残した。このアプローチは、５’末端配列を天然のＶＥＥゲノムに存在する配列のできるだけ近くに維持して、これらのヘルパーにとって必要とされる複製要素を維持するために実施した。第二に、ｎｔ３の下流の全ての出発コドン（ｎｓＰ１（有利な）出発コドンを含む）およびカプシドもしくはタンパク質コード配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を、ＡＵＧからＧＵＧに変更した（全部で１２のそのような変更があった）。このアプローチは、有利なＡＧＴコドン（ＲＮＡではＡＵＧ）が、完全長カプシドもしくは糖タンパク質発現の産生に対して有害効果を有していないかどうかを調べるために実施した。

Ａ．ｄＨｃａｐ−ｍｕｔ１およびｄＨｇｐ−ｍｕｔ１ヘルパーの構築
有利なｎｓＰ１出発コドンをＴＡＧ停止コドンへと変えるｄＨｃａｐ−ｍｕｔ１およびｄＨｇｐ−ｍｕｔ１ヘルパーを生成するために、各ｄＨｃａｐヘルパーおよびｄＨｇｐヘルパーに部位特異的変異を実施し、ｄＨｃａｐ−ｍｕｔ１ヘルパーおよびｄＨｇｐ−ｍｕｔ１ヘルパーと称される、それぞれ配列番号３５〜４２および４３〜５０として本明細書において提供されるような５’配列を有する変異したヘルパーの完全なセット（ＦＬおよび切端物１〜７）を生成させた。部位特異的変異は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ ＸＬ（登録商標）部位特異的変異キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）により、メーカーのプロトコールに従って、表４のフォワード（配列番号７１）プライマーおよびリバース（配列番号７２）プライマーを使用して実施した。

Ｂ．ｄＨｃａｐ−ｍｍヘルパーおよびｄＨｇｐ−ｍｍヘルパーの構築
ｎｔ３およびカプシドもしくはＧＰ ＯＲＦ出発コドンの下流に出発コドンを持たない５’末端を有するｄＨｃａｐヘルパーおよびｄＨｇｐヘルパーを生成させるため、部位特異的変異を実施して、介在する全てＡＴＧ（ＲＮＡではＡＵＧ）をＧＴＧ（ＲＮＡではＧＵＧ）コドンに変えた。ｄＨｇｐ（ＦＬ）構築物を、部位特異的変異のための鋳型として使用した。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）複数部位特異的変異キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用し、メーカーのプロトコールに従ってコドン変更を導入した。コドン変更を導入するために使用したプライマーを表５に示す（配列番号７３〜８２）。全てのコドン変更を含有するｄＨｇｐ（ＦＬ）構築物を、ｄＨｇｐ（ＦＬ）−ｍｍ（配列番号１９として本明細書において提供される５’配列を有する）と称した。全てのコドン変更が存在することを配列確認した後に、このＤＮＡを使用して、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）５’複製認識配列をｄＨｇｐ−ｍｍに由来する５’複製認識配列で置換することにより、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）−ｍｍ構築物を生成させた。これは、両方のＤＮＡをＲｓｒＩＩおよびＮｏｔＩ酵素で消化することにより達成した。次いで、ｄＨｇｐ（ＦＬ）−ｍｍ ＲｓｒＩＩ／ＮｏｔＩ５’複製認識配列断片を、直線化されたｄＨｃａｐ（ＦＬ）ＤＮＡでライゲーションさせ、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）−ｍｍ（配列番号２７として本明細書において提供される５’配列を有する）を生成させた。さらに、ｄＨｇｐ（ＦＬ）−ｍｍＤＮＡを鋳型として使用して、ｄＨｃａｐ１〜７およびｄＨｇｐ１〜７に対して上に記載された方法およびプライマーを使用してカプシドヘルパーおよびＧＰヘルパーの両方に対する切端された５’末端のセットを生成させた。新規のヘルパーは、ｄＨｃａｐ１ｍｍ 〜ｄＨｃａｐ７ｍｍ（配列番号２０〜２６として本明細書において提供される５’配列を有する）およびｄＨｇｐ１ｍｍ〜ｄＨｇｐ７ｍｍ（配列番号２８〜３４として本明細書において提供される５’配列を有する）と称した。

Ｃ．ｍｕｔ１およびｍｍのプロモーターレスヘルパーの発現分析
上に記載されたΔ２６Ｓヘルパーのｍｕｔ１およびｍｍの様々な変形からのタンパク質産生を分析した。この実験において、ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１（配列番号４１として本明細書において提供される５’配列を有する）、ｄＨｃａｐ６−ｍｍ（配列番号２５として本明細書において提供される５’配列を有する）、ｄＨｃａｐ７−ｍｍ（配列番号２６として本明細書において提供される５’配列を有する）、およびｄＨｇｐ７−ｍｍ（配列番号２７として本明細書において提供される５’配列を有する）、並びに１３．２．２および１３．４．６ヘルパーを、ウエスタンブロットによって分析した。ｍｍ変異を含むΔ２６Ｓヘルパーは、わずかな検出可能な融合タンパク質を伴ってまたは伴わずに、主に完全長のカプシドタンパク質またはＧＰタンパク質を発現する。ｍｕｔ１ヘルパーは、かなりの量の完全長構造タンパク質を発現したが、依然としていくらかの融合タンパク質も発現した。

ｍｕｔ１およびｍｍΔ２６Ｓヘルパーの複製特性を分析するために、同じ試料についてノーザン解析を行った。結果は、ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１ヘルパーが、１３．２．２カプシドヘルパーと同様に複製することを示している。対照的に、ｄＨｃａｐ６−ｍｍ、ｄＨｃａｐ７−ｍｍ、およびｄＨｇｐ７−ｍｍヘルパーの複製は、１３．２．２またはｍｕｔ１ヘルパーより少ない程度のようである。

（実施例５）
Δ２６ＳヘルパーによるＶＥＥレプリコン粒子の生成
表６に列挙されているのは、ＶＥＥレプリコンＲＮＡと様々なプロモーターレスカプシドヘルパーおよびＧＰヘルパーとを組み合わせてＶＥＥ複製粒子（ＶＲＰ：ＶＥＥ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ）を産生させる多くの実験である。さらに、細胞中に導入された各ヘルパーＲＮＡの量も、いくつかの実験において変えた。ＶＲＰは、５×１０^７〜１×１０^８個のベロ細胞を、指示された量のヘルパーＲＮＡ並びに３０μｇのレプリコンＲＮＡでエレクトポレーションすることによって生成された。概して、粒子が生成される全ての実験に対し、エレクトポレーションした細胞を、血清不含培地が入った３００ｃｍ^２のフラスコに播種し、１６〜２４時間インキュベートした後、ＶＲＰを収穫した。

ＶＲＰ力価は、試料の十倍の階段希釈により、９６ウェルプレートで増殖させたベロ細胞に感染させて、当該細胞を１６〜１８時間インキュベートし、当該細胞を固定化し、ＶＥＥのｎｓＰ２タンパク質または対象となる核酸の産物に特異的な抗体によってＩＦＡを実施することによって決定した。ＶＲＰ収量は、実験からの全収量、または２０ｍｌの調製物からの１ｍｌ当たりの量のいずれかとして示されている（表７、９〜１３、１５、および１６）。

これらの調製物は、さらに、細胞変性効果（ＣＰＥ：ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）アッセイにより複製能力のあるウイルス（ＲＣＶ）の存在を試験した。当該ＣＰＥアッセイは、ＲＣＶの存在をスクリーンするための、細胞培養における２つの盲継代で構成された。継代１では、ＶＲＰ調製物由来の試料を、ベロ細胞単層により３７℃で１時間インキュベートし、次いで、試料液体を除去し、新鮮な培地と交換して、当該培養物を２４時間インキュベートして、存在し得る任意のＲＣＶの増幅を可能にした。継代２では、継代１の終了時の細胞培養の上清を新鮮なベロ細胞単層に加え、３７℃で７２時間インキュベートした。継代２の終了時に、倒立型光学顕微鏡を使用して、培養物のＣＰＥを検査した。このアッセイは標準化されており、大過剰のＶＲＰの存在下での生存ウイルスの検出における感度について評価した。このアッセイにおいてＶ３０１４またはＴＣ−８３ウイルスのいずれかを用いたスパイク試験により、１×１０^８個のＶＲＰをバックグランドとした３〜８ＰＦＵの検出の下限を明らかにした。このアッセイを、本発明のプロモーターレスヘルパーによって産生された１０^１３個を超えるＶＲＰに対して実施したところ、ＲＣＶは検出されなかった。このアッセイの検出限界にもかかわらず、ＲＣＶの産生に対する可能な組換え頻度の理論計算は、この検出限界の使用を大きく下回り、すなわち、１０^１０、１０^１１、１０^１２、または１０^１３のＶＲＰに１個、であろう。

（実施例６）
「スプリット糖タンパク質」プロモーターレスヘルパー
Ａ．別々のＥ２および１Ｅのプロモーターレスヘルパーの構築
Ｅ２およびＥ１コード配列が別々のヘルパー上に存在する糖タンパク質のプロモーターレスヘルパーの構築は、Ｅ２および１Ｅの糖タンパク質カセットを、別々に、ｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１ヘルパーのバックボーンにクローニングすることによって実施した。プライマーは、ＰＣＲによってｐＨＣＭＶ−Ｖｓｐ由来のＶＥＥ構造上タンパク質コード領域のカプシド−Ｅ３−Ｅ２領域を増幅するように設計した（米国特許第７，０４５，３３５号を参照のこと。なお、この特許は参照により本明細書に組み入れられる）。増幅された断片は、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中にクローン化され、ｐＣＲ−ＣＥ３Ｅ２を生成した。ＣＥ３Ｅ２カセットを配列決定して、ＰＣＲ増幅中にエラーが導入されなかったことを確認した。ＣＥ３Ｅ２構造領域を含有するプロモーター補助ヘルパーを作製するため、ｐＣＲ−ＣＥ３Ｅ２ ＤＮＡをＳｐｅＩ制限酵素で消化し、Ｅ３Ｅ２断片を放出させた。次いで、当該Ｅ３Ｅ２（ＳｐｅＩ）断片を、ＳｐｅＩ酵素で直線化したカプシドヘルパー（１３．２．２）でライゲーションした。ｐＨＣＥ３Ｅ２由来のＥ３−Ｅ２コドン領域を消化することによって、プロモーターレスＥ２ヘルパー（ｄＨＥ２−６Ｍ１と称する）を調製した。ｐＨＣＥ３Ｅ２ＤＮＡプラスミドは、最初に、ＡｓｃＩ制限酵素によって直線化し、次いで、平滑末端を作成するためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理した。同様に、ｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１ ＤＮＡプラスミドは、ＳｐｈＩ制限酵素で直線化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理して、平滑末端を作成した。両方の直線化されたＴ４−ポリメラーゼ処理ＤＮＡは、ＳｐｅＩ制限酵素によって消化され、結果として生じた３．６ｋｂのｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１ベクター断片および１．４ｋｂのＥ３−Ｅ２断片を、それぞれゲル精製した。次いで、当該２つの精製された断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて一緒にライゲーションさせて、ｄＨＥ２−６Ｍ１プロモーターレスヘルパーを作製した。

プロモーターレスＥ１ヘルパーの生成は、数段階において達成した。プライマーは、次の２つの構造タンパクコード配列断片の１）カプシドＥ３（ＣＥ３）、および２）６Ｋ−Ｅ１（６ＫＥ１）を増幅するように設計した。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中にクローン化し、ｐＣＲ−ＣＥ３およびｐＣＲ−６ＫＥ１を生成させた。当該クローンを配列決定して、増幅中にエラーが導入されなかったことを確認した。Ｅ１糖タンパク質の上流にＥ３および６Ｋリーダー配列の両方を含有するカセットを作製するために、別の中間構築物を作製した。これは、ＢａｍＨＩ酵素でｐＣＲ−６ＫＥ１ ＤＮＡを消化して、６ＫＥ１断片を精製することによって達成した。次いで、６ＫＥ１（ＢａｍＨＩ）断片を、ＢａｍＨＩ酵素で直線化したｐＣＲ−ＣＥ３ ＤＮＡでライゲーションし、ｐＣＲ−ＣＥ３６ＫＥ１を生成させた。ＣＥ３６ＫＥ１カセットを含有するプロモーター補助ヘルパーを生成するために、ｐＣＲ−ＣＥ３６ＫＥ１ ＤＮＡを、ＳｐｅＩおよびＳｐｈＩ酵素で消化させ、構造タンパク質コード配列カセットを放出させた。次いで、ＣＥ３６ＫＥ１（ＳｐｅＩ／ＳｐｈＩ）断片を、ＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで直線化したカプシドヘルパー（１３．２．２）でライゲーションして、ｐＨＣＥ３６ＫＥ１を作製した。プロモーターレスＥ１ヘルパー（ｄＨＥ１−６Ｍ１と称する）の生成は、ｐＨＣＥ３６ＫＥ１プラスミド由来のＥ３−６Ｋ−Ｅ１コード領域を消化することによって達成した。ｐＨＣＥ３６ＫＥ１およびｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１ ＤＮＡプラスミドを、ＳｐｅＩおよびＳｐｈＩ制限酵素で消化させ、結果として得られた３．６ ｋｂの ｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１ベクター断片および１．７ｋｂの Ｅ３−６Ｋ−Ｅ１断片をゲル精製した。次いで、２つの精製した断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して一緒にライゲーションさせて、ｄＨＥ１−６Ｍ１プロモーターレスヘルパーを作製した。

Ｂ．スプリット糖タンパク質プロモーターレスヘルパーの分析
個々の糖タンパク質ヘルパーをインビトロで転写させ、ＲＮＡ転写物を精製した後、ＶＥＥレプリコンＲＮＡと一緒にベロ細胞中にエレクトポレーションした。ヘルパー複製を、ノーザンブロットによって分析し、タンパク質発現は、Ｅ１およびＥ２糖タンパク質特異的抗体を用いてＩＦＡによって分析した。ノーザン分析の結果は、ｄＨＥ１−６Ｍ１ヘルパーおよびｄＨＥ２−６Ｍ１ヘルパーの両方が、効率的に複製することを示している。代表的なノーザンブロットを図３に示す。

レプリコンＲＮＡをパッケージしてＶＲＰを作製するために２つの別々の糖タンパク質発現プロモーターレスヘルパーをΔ２６Ｓカプシドヘルパーと組み合わせられるかどうかを決定するために、三つのヘルパーを、ボツリヌス神経毒素Ａ断片を発現するＶＥＥレプリコンＲＮＡと組み合わせて、ベロ細胞中にエレクトロポレーションした。一実験からのＶＲＰ収量を表７に示す。

（実施例７）
修飾した５’末端および３’末端プロモーターレスヘルパーカセット
Ａ．修飾した５’末端ヘルパーカセットの構築
ほとんどのアルファウイルスのＲＮＡ５’末端（およそ最初の２５０ｎｔ）に予測される二次構造は、４つのステムループ（ＳＬ）構造（ＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、およびＳＬ４）を含有する。Ｆｒｏｌｏｖら（ＲＮＡ、７：１６３８−１６５１（２００１））は、ＳＬ２をコードするヌクレオチド配列をＳｉｎｄｂｉｓウイルスヘルパーＲＮＡから除去することによって、そのヘルパーの複製が増加することを実証した。

（Ｍ倍のプログラムに基づく）ＶＥＥ５末端のＳＬ２領域であるｎｔ４６〜ｎｔ１１６を、以下のようにＰＣＲによってｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１から除去した。２つの断片を、ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１ ＤＮＡから増幅した。およそ１キロベース（ｋｂ）の５’断片を、ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１の５’末端の４５ヌクレオチドとバックボーンプラスミド配列をコードするヌクレオチドとを含有するプライマー１３−８２．１．９［配列番号８３］およびｄＬＳ２（ＥｃｏＲＶ）Ｒ［配列番号８４］によって増幅させた（表８）。およそ１．５ｋｂ）の３’断片を、ヌクレオチド１１７で始まるＶＥＥ５’末端の一部とＶＥＥ３’末端を介してカプシド配列全体をコードするヌクレオチドとを含有するプライマーｄＳＬ２（ＥｃｏＲＶ）Ｆ［配列番号８５］および３−８．ｐｒ４［配列番号８６］によって増幅させた（表８）。５’の約１ｋｂのＰＣＲ断片を、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶ制限酵素によって消化させた。３’の約１．５ｋｂのＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩ制限酵素によって消化させた。プラスミドｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩによって消化することによって直線化し、結果として得られる約２．５ｋｂのベクターバックボーンを精製した。本明細書において「ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１（ｄＳＬ２）」と呼ばれる、ＳＬ２領域が削除された新しいヘルパーを生成させるため、５’（ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ）断片、３’（ＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ）断片、およびＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ直線化ベクターを一緒にライゲーションさせた。配列が本明細書において配列番号５１として提供される５’末端を有するｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１（ｄＳＬ２）ヘルパーを完全に配列決定し、ＰＣＲ増幅中にエラーが導入されなかったことを確認した。マッチングｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１（ｄＳＬ２）ヘルパーを生成させるため、ｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１ ＤＮＡをＸｈｏＩおよびＲｓｒＩＩ制限酵素で消化させ、５．４ｋｂの断片を精製した。ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１（ｄＳＬ２）由来の修飾された５’末端は、このＤＮＡをＸｈｏＩおよびＲｓｒＩＩで消化し、１．１ｋｂの断片を精製することにより収集した。これら二つの断片を一緒にライゲーションさせ、ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１（ｄＳＬ２）として同じ５’末端［配列番号５１］を有するｄＨｇｐ６− ｍｕｔ１（ｄＳＬ２）を生成させた。

Ｂ．短縮された３’末端プロモーターレスヘルパーカセットの構築
これらの実施例において、カプシドヘルパー構築物のｄＨｃａｐ（ＦＬ）、ｄＨｃａｐ１〜ｄＨｃａｐ７、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）ｍｍ、ｄＨｃａｐ１ｍｍ〜ｄＨｃａｐ７ｍｍ、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）ｍｕｔ１、およびｄＨｃａｐ１ｍｕｔ１〜ｄＨｃａｐ７ｍｕｔ１に対し、３’末端配列は、配列番号５５として本明細書において提供される。本発明のＶＥＥカプシドヘルパーは、完全な糖タンパク質コード領域を欠失しているが、Ｅ３タンパク質の小さな部分がカプシドヘルパー上に残っており、成熟カプシドタンパク質を産生するためにパッケージング細胞内においてキモトリプシン様切断が生じることを可能にしている。糖タンパク質ヘルパー構築物のｄＨｇｐ（ＦＬ）、ｄＨｇｐ１〜ｄＨｇｐ７、ｄＨｇｐ（ＦＬ）ｍｍ、ｄＨｇｐ１ｍｍ〜ｄＨｇｐ７ｍｍ、ｄＨｇｐ（ＦＬ）ｍｕｔ１、およびｄＨｇｐ１ｍｕｔ１〜ｄＨｇｐ７ｍｕｔ１に対して、成熟カプシドタンパク質を生成するための切断部位を含む３’末端配列は糖タンパク質ヘルパー構築物において必要でないため、当該配列は、より短い配列であった。これらの実施例においてこれらの糖タンパク質構築に使用される３’配列は、本明細書において配列番号５６として提供される。

さらに、より短い長さの３末端を有するプロモーターレスＲＮＡヘルパーを構築した。アルファウイルス３’末端配列の量を減らすことにより、増殖性ＶＥＥウイルスの生成に必要であろう二次組換え現象の理論的可能性がさらに減少する。最初に、アルファウイルスの３’高度に保存された配列［配列番号５２］を含む１９ヌクレオチドのみを含有する機能的な２６Ｓプロモーターを有する糖タンパク質ヘルパーを、以下の二つの段階において作製した。最初に、ユニーク５’制限部位および３’制限部位を有する糖タンパク質（ＧＰ）コード配列カセットを含有したプラスミドを作製した。３’末端のＥ１終止コドンのすぐ後のユニークＳｐｈＩ部位（「ＧＰ（ＳｐｈＩ）Ｒ」、配列番号８７、表８）、および５’末端の既存の内部ＳｐｅＩ部位（「３−１６．１．３」、配列番号８８、表８）でＶＥＥ ＧＰを増幅するようにプライマーを設計した。増幅された断片は、ｐＣＲ２．１／ＧＰ １９ｎｔ ５’を生成するｐＣＲ２．１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にＴＡクローニングした。次に、ＶＥＥ３’末端（３’ ｔｒｕｎｃ（ＳｐｈＩ）Ｆ、配列番号８９、表８）の１９ヌクレオチド保存配列のすぐ上流にＳｐｈＩ部位を導入するようにフォワードプライマーを設計した。３’末端にユニークＡｆｌＩＩ制限部位（３’ｔｒｕｎｃ（ＡｆｌＩＩ）Ｒ、配列番号９０、表８）を含有するであろう断片を増幅するように、プラスミドバックボーン配列に特異的なリバースプライマーを設計した。これらのプライマーの増幅から得られた断片は、ＳｐｈＩおよびＡｆｌＩＩで消化され、ＳｐｈＩおよびＡｆｌＩＩ制限酵素で直線化されている（実施例１に記載された）１３．４．６糖タンパク質ヘルパーとライゲーションし、これによって、結果としてｐＧＰヘルパー−ｉｎｔ１が構築された。ｐＧＰヘルパー−ｉｎｔ１構築物は、（１９ｎｔ保存配列を含む）当該ヘルパーのＧＰ停止コドンと３’末端の間に７２ヌクレオチド領域を有している。１９ヌクレオチド３’末端のみによりＧＰヘルパーを生成させるために、ｐＣＲ２．１／ＧＰ １９ｎｔ５’ＤＮＡをＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで消化させ、当該ＧＰコード配列を、ＳｐｅＩおよびＳｐｈＩ制限酵素で消化されたｐＧＰヘルパーｉｎｔ１にライゲーションさせた。結果として得られた構築物は、ｐＧＰヘルパー１９ｎｔと命名した。

次いで、ｐＧＰヘルパー１９ｎｔ構築物を使用して、可変長の３’複製認識配列を有するΔ２６Ｓヘルパーを作製した。当該ｐＧＰヘルパー１９ｎｔ構築物を、ＮｃｏＩ制限酵素およびＮｏｔＩ制限酵素によって消化し、１９ｎｔ３’末端領域を有する糖タンパク質コード配列を含有する２５１５塩基対断片をゲル精製した。次に、この２５１５塩基対（ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ）断片を、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素によって消化されたｄＨｇｐ構築物でライゲーションし、様々なｄＨｇｐ１９ｎｔ構築物を生成させた。

Ｃ．アルファウイルスカプシドタンパク質を発現する修飾されたプロモーターレスヘルパーカセットの構築
ＶＥＥウイルス感染細胞において、ＶＥＥＥカプシドタンパク質は、２６ＳサブゲノムｍＲＮＡから翻訳される構造ポリタンパク質から自身を切断する。本発明のＶＥＥカプシドヘルパーは、完全な糖タンパク質コード領域を欠失しているが、Ｅ３タンパク質の小さな部分がカプシドヘルパー上に残っており、成熟カプシドタンパク質を産生するためにパッケージング細胞内においてキモトリプシン様切断が生じることを可能にしている。キモトリプシン様切断部位の代わりに、カプシドの３’末端での停止コドンの導入は、糖タンパク質ヘルパーによる機能的な遺伝子組換え体の産生の困難さを増加させるであろう。すなわち、本発明のｄＨｇｐヘルパーによって生じる機能的な組換え（すなわち、複製能力のあるウイルスを産生する組換え）に対して、当該組換え現象は、カプシドコード配列において、操作された停止コドンを置換して活性なカプシド切断部位を維持するために完全なヌクレオチドでなければならない。３’末端に組み込まれた停止コドンを有するｄＨｃａｐヘルパーの２つの変形を作製した。１つの変形は、天然カプシドタンパク質のＣ末端トリプトファン残基を停止コドンで置換した、本明細書において配列番号５７として提供されるｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１−ｄＳＬ２（停止）であり、他方の変形は、Ｃ末端トリプトファン残基を保有し（本明細書において配列番号５９として提供される３’配列を有するｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１（Ｗ−停止））、トリプトファン残基のすぐ下流に停止コドンを挿入した。カプシドコード配列を、５’末端のユニークＲｓｒＩＩ部位（カプシド（ＲｓｒＩＩ−コーザック）Ｆ、配列番号：９１、表８）および３’末端のユニークＳｐｈＩ部位カプシド（停止）ＳｐｈＩ Ｒ、配列番号：９２またはカプシド（Ｗ−停止）ＳｐｈＩ Ｒ、配列番号：９３、表８）を操作するために設計されたプライマーで複製した。さらに、フォワードプライマーを操作して、カプシド出発コドンをほぼ最適なコーザック共通配列に配置して（Ｋｏｚａｋ，Ｃｅｌｌ，４４（２）：２８３−２９２（１９８６））、カプシドｍＲＮＡの翻訳のリボソーム開始を高めた。増幅されたカプシドコード配列を、ＲｓｒＩＩ制限酵素およびＳｐｈＩ制限酵素で消化し、ＲｓｒＩＩおよびＳｐｈＩで直線化されたΔ２６Ｓヘルパープラスミドにライゲーションさせて、ｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１−ｄＳＬ２（ｓｔｏｐ）およびｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１（Ｗ−ｓｔｏｐ）構築物を作製した。

Ｄ．アルファウイルス糖タンパク質を発現する修飾されたプロモーターヘルパーカセットの構築
ＶＥＥカプシドタンパク質は、カプシドＣ末端トリプトファン残基の後で切断するキモトリプシン様プロテアーゼである。キモトリプシンの切断特異性に基づいて、すべてのアミノ酸残基が、メチオニンおよびプロリン以外のトリプトファンのすぐ下流の位置において許容されることが予想される。トリプトファンのすぐ下流にこれらのアミノ酸のいずれかを有することは、キモトリプシン切断活性を著しく減じることが予想される。天然ＶＥＥウイルスには、ＶＥＥ Ｅ３シグナル配列を含む１８のアミノ酸がある。Ｅ３シグナル配列のアミノ酸の数を減じると同時に、Ｅ３配列のシグナリング機能は維持するように構築物を設計した。Ｅ３配列を含む１８のアミノ酸のうちの１６は、カプシドＣ末端トリプトファンの下流の位置において許容されることが予想されるため、Ｅ３シグナル配列のアミノ酸の数を減らすことにより、切断部位として機能するであろう部位がＶＥＥ構造ポリタンパク質コード配列を再構成するヌクレオチド完全組換え現象の発生の際にＣ末端トリプトファンのすぐ下流に位置する場合、当該部位の数が減少するであろう。そのようなアプローチの例として、通常、Ｅ３シグナル配列に存在するＮ末端セリン残基をＰＣＲによって除去し、Ｎ末端基残留物としてのロイシン残基を残して、そのような修飾されたｇｐヘルパーがＶＲＰをパッケージするために機能するかどうかを決定するためにｄＨｇｐのプロモーターレスヘルパーを構築した。

Ｅ３のＮ末端セリン残基を除去し、ユニークＲｓｒＩＩ制限部位を維持するように、フォワードＰＣＲプライマー（Ｇｐ（ＲｓｒＩＩ−Ｓｅｒ）Ｆ、配列番号９４）を設計した（表８）。ユニークＳｎａＢＩ制限部位を含有するであろうｇｐ断片を増幅するように、リバースＰＣＲプライマー（３−１６．２．１４、配列番号９５）を設計した（表８）。結果として得られたｇｐＰＣＲ断片をＲｓｒＩＩおよびＳｎａＢＩで消化させ、ＲｓｒＩＩおよびＳｎａＢＩ消化ｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１ＤＮＡにライゲーションして、ｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１（−Ｓ）を生成させた。

Ｅ．５’および３’修飾Δ２６Ｓヘルパーを使用したＶＲＰ生成実験
上記の修飾の組み合わせを含有するヘルパーも調製した。ｄＨｃａｐおよびｄＨｇｐプロモーターレスヘルパーの様々な組み合わせおよびＲＮＡ濃度を、ＶＲＰ産生実験において分析し、それらが、ＶＥＥレプリコンＲＮＡ（ボツリヌス神経毒素断片ＡまたはインフルエンザＨＡのどちらかを発現するもの）のパッケージングにおいてどの程度効果的であるかを決定した。さらに、ＶＲＰ収量に関するΔ２６Ｓヘルパーのキャッピングの効果を、当該ヘルパーの組み合わせのサブセットに対して分析した。ＶＲＰ収量の代表例は、Δ２６Ｓヘルパーの様々な組み合わせと共に表９〜１３に示す。ＶＲＰの感染力および収量を定量化する力価アッセイは、４８ウェルプレートのベロ細胞単層培養物において、ＶＲＰを段階的に希釈し、ベロ細胞と共に５％のＣＯ_２中において３７℃で一晩インキュベートすることによって実施した。一晩インキュベート（１８〜２０時間）した後、当該細胞を洗浄し、固定化し、当該固定化された単層を抗原特異的一次抗体で染色した後、ＦＩＴＣ結合二次抗体で染色した。紫外蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００）により、ＦＩＴＣ標識化抗原−抗体を含有する細胞を検出した。個々の抗原陽性細胞をカウントし、ＩＵ／ｍＬで表される力価を、既知の希釈および接種量から計算する。

（実施例８）
ユビチキン単量体を取り込むプロモーターレスヘルパー
Ａ．ユビキチン単量体を含有するΔ２６Ｓヘルパーの構築
真核細胞において、ユビチキンによって縮合またはタグ付けされたタンパク質は、細胞のユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ：ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）によってＣ末端グリシンのすぐ後ろで切断される（Ｐｉｃｋａｒｔ ａｎｄ Ｒｏｓｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６０：７９０３−７９１０（１９８５））。ユビチキンコード配列の単量体を、カプシドおよび糖タンパク質コード配列のすぐ上流のインフレームに配置することにより、本発明のある特定のプロモーターレスヘルパー構築物によって産生される融合タンパク質を排除する（そのような融合体は、各構造タンパク質コード配列に対してＡＴＧの上流にある複数の翻訳開始部位によって生じる）。全てのインフレーム融合タンパク質は、ユビキチン単量体を含むことになり、そのため、それらがＵＣＨによって切断され、その結果、上流に外因性タンパク質配列を有さない完全長ＶＥＥ構造タンパク質が放出されるため、当該排除が生じる。増幅されたユビチキン単量体コード配列の５’および３’末端にＲｓｒＩＩ部位を導入すると共に、ＵＣＨによるユビチキン単量体の切断に必要なＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列（図４）を維持するように、プライマーであるｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｆ（配列番号９６）およびｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｒ（配列番号９７）（表１４）を設計した。これらの特定の構築物により、切断の後に得られる構造タンパク質のそれぞれに、天然の構造タンパク質には存在しないさらなるＮ末端アミノ酸残基（単数または複数）が生じた（すなわち、カプシドヘルパーに対しては余分なプロリンであり、糖タンパク質ヘルパーに対しては、余分なプロリンおよびトレオニンである）（図４）。

当該ユビキチンコード配列を、Ｐｆｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用してＰＣＲ増幅し、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）およびｄＨｇｐ（ＦＬ）のユニークＲｓｒＩＩ部位にクローン化した。ユビキチン挿入の方向を決定するために、形質転換体をスクリーニングした。カプシドおよび糖タンパク質に対する陽性ユビキチンクローンは、それぞれｄＨｃａｐＵおよびｄＨｇｐＵと称し（それぞれ、本明細書において配列番号５３および５４として提供される５’末端配列を有する）、これらを単離し、配列決定して、増幅されたユビチキンコード配列中にエラーが導入されていないことを確認した。エレクトロポレーションのためのＲＮＡは、ＲｉｂｏＭａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡ（登録商標）キットを使用して、ｄＨｃａｐＵ、ｄＨｇｐＵ、ｄＨｃａｐ（ＦＬ）、ｄＨｇｐ（ＦＬ）、Ｈｃａｐ４、および１３．４．６プラスミドから別々の反応において転写し、塩化リチウムで沈殿させた。

Ｂ．ユビキチン修飾されたΔ２６Ｓヘルパーを使用したＶＲＰ生成実験
ベロ細胞を、ＨＩＶクレードＣ糖タンパク質（「ＤＵ１５１ｇｐ１６０」）を発現するＶＥＥレプリコンＲＮＡでエレクトロポレーションし、指示されたＲＮＡ量でプロモーターレスカプシドおよびＧＰヘルパーの組み合わせを選択した。いくつかの実験において、「Ｈｃａｐ４」カプシドヘルパーを使用した。これは、切端された５’末端を有するが（上述のｄＨｃａｐ４切端物に相当する）、２６Ｓサブゲノムのプロモーター配列を保有するヘルパーであり、米国特許第７，０４５，３３５号に詳細に記載されている。なお、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。約０．８ｍｌの容積の０．４ｃｍのキュベットにおいて、５００Ｖ、２５μＦ、４パルスでエレクトロポレーションを実施した。各エレクトロポレーションは、１００ｍｌのＯｐｔｉｐｒｏ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と共に１つの８５０ｃｍ^２ローラーボトル中に播種した。１８時間後に、２５ｍｌの０．５ＭのＮａＣｌで洗浄しながら０．２μｍフィルタによりＶＲＰを収穫した。ＶＲＰ塩水洗浄物質を、（ＨＩＶ ｇｐ１６０タンパク質を認識する）抗−ｇｐ１２０ヤギ抗体により１：４００で力価決定した。パッケージング実験の結果を表１５に示す。

続いてエレクトロポレーションを実施して、ｄＨｇｐ６−ｍｕｔ１と組み合わされたカプシドヘルパーのｄＨｃａｐＵまたはｄＨｃａｐ６−ｍｕｔ１（Ｗ−ｓｔｏｐ）でパッケージされた様々な核酸の力価量を比較した。ＶＥＥ ｎｓＰ２特異的ポリクロナール抗体を使用してＶＲＰの力価を決定した（表１６）。

Ｃ．エレクトポレーションした細胞におけるウエスタン分析による構造タンパク質の発現
表１６にまとめられたパッケージング実験においてＶＲＰを生成するために使用した細胞から細胞溶解物を調製した。各試料からの細胞溶解物を、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｎｏｖｅｘゲルにおいて、１×ＭＯＰＳ中２００Ｖ、４００ｍＡにて４５分間電気泳動した後、１×移行緩衝液中４００ｍＡで４０分間、ＰＶＤＦに半乾燥移行させた。膜を、１×ＢＭＢブロック／ＴＢＳ中で一晩ブロッキングした。一次抗体は、１×ＢＭＢブロック／ＴＢＳ中１Ａ４Ａ抗−ＶＥＥ ＧＰの１：５００希釈および抗−ＶＥＥカプシドの１：１５００希釈であった。ウエスタンブロット結果を図５に示す。ｄＨｇｐＵから発現した糖タンパク質は、ｄＨｇｐ（ＦＬ）から発現した糖タンパク質よりもより完全なＰＥ２およびＥ２ＧＰ形態へとプロセシングされる。これは、ｄＨｇｐ（ＦＬ）にユビキチンが存在しない場合に見られる融合タンパク質のパターンにおける違いによって実証される（図５、ＧＰ抗体を使用したウエスタンブロットのレーン３及び４を比較）。ｄＨｃａｐＵヘルパーにおけるカプシドタンパク質のＮ末端でのユビキチンタンパク質の置換により、結果として、カプシド融合タンパク質が消失し（図５）、１３．４．６糖タンパク質ヘルパーでパッケージングされた場合にｇｐ１６０の力価において２桁以上増加する（表１５）。

Ｄ．エレクトロポレーションした細胞のノーザン分析による構造タンパク質ＲＮＡの発現
全細胞ＲＮＡを、表１５にまとめられたパッケージング実験においてＶＲＰを生成するために使用された細胞から抽出した。当該細胞をＲＮＡｗｉｚ（登録商標）試薬（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ社、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で溶解させ、クロロホルムで抽出し、沈殿させて、カプシド特異的プローブおよびＧＰ特異的プローブを使用してノーザン分析に供した（それぞれ、図６および図７）。すべてのＲＮＡ種が、様々な構築物から予想されるサイズと一致している。

（実施例９）
キャップおよび非キャップΔ２６Ｓヘルパー構築物を使用したＶＲＰ生成
Ａ．様々なアルファウイルスの糖タンパク質を発現するＶＲＰ
ＶＲＰは、対象となる核酸（ＮＯＩ）として、それぞれフューリン切断部位が欠失したＶＥＥ（３０２２）、Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス（ＥＥＥ）（４２００）、またはＷｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス（ＷＥＥ）（２１００）のいずれかの糖タンパク質に対するコード配列を発現するＶＥＥレプリコンを使用して作製した。ＶＲＰを生成するために使用されたヘルパーをコードするＤＮＡプラスミドは、ＮｏｔＩにより直線化し、インビトロで、Ｔ７ＲｉｂｏＭａｘ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、メーカーの指示に従い、指示された場合には７．５ｍＭのＰＡＰ類似物（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で補って転写した。キャップ類似物で作製したヘルパーは、「＋Ｃａｐ」として示し、キャップ類似物無しで作製されたヘルパーは「−Ｃａｐ」として示した（表１７）。レプリコンの組み合わせを用いてベロ細胞をエレクトロポレーションし、上述の実施例５に記載したようにしてＧＰヘルパーＲＮＡおよびＶＲＰを作製した。三つの別々の実験の結果を表１７〜１９に示す。

Ｂ．インフルエンザ株ウィスコンシンのＨＡコード配列を発現するＶＲＰ
この実験において、ＶＥＥカプシドまたはＶＥＥ糖タンパク質のいずれかをコードするΔ２６ＳヘルパーＲＮＡを作製するために、転写反応においてＣａｐ類似物とＧＴＰのモル比を変更した。当該転写反応は次のように構成した：Ｐｒｏｍｅｇａ ５×転写緩衝液；ｒＮＴＰミックス（６ｍＭのＵＴＰ、ＣＴＰ、ＡＴＰ）；ＧＴＰ（表に示されるように、０〜６ｍＭで）；（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｌｏｗ Ｒｄ．社， Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、カタログ番号＃Ｐ１３００）およびＲｉｂｏｍ^７ＧＣａｐ（登録商標）類似物（６ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｌｏｗ Ｒｄ．社， Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、カタログ番号＃Ｐ１７１２）。メーカーによって指定された、通常、キットによって供給される２×緩衝液で実施されるＲｉｂｏＭａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＲＮＡ転写キット条件（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｌｏｗ Ｒｄ．社， Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、カタログ番号＃Ｐ１３２０）を模倣するために、７．５ｍＭのＲｉｂｏｍ^７ＧＣａｐ（登録商標）類似物の有無において、Ｐｒｏｍｅｇａ社の５×緩衝液および７．５ｍＭのｒＮＴＰにより、さらなる反応を行った。この実験でパッケージングされたＶＥＥレプリコンは、インフルエンザＨＡ（Ａ／ＷＩ／０５）タンパク質をコードした。各エレクトロポレーションに対して、３０μｇのレプリコンＲＮＡ；１０μｇのΔ２６ＳカプシドヘルパーＲＮＡ、および６０μｇグラムのΔ２６Ｓ糖タンパク質ヘルパーＲＮＡを使用した。ベロ細胞を増殖させ、次いで洗浄し、スクロース緩衝液中に再懸濁させて１．２×１０^８細胞／ｍＬとした。これらの細胞をＲＮＡと混合し、次いで、５００ボルト、２５μＦｄ、および４パルスに設定したＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅ ＩＩ（登録商標）装置でエレクトロポレーションした。細胞を１００ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ（登録商標）と共にローラーボトルに移し、３７℃でインキュベートした。エレクトロポレーション後２４時間で、ＶＲＰを収穫した。当該ＶＲＰを、ベロの４８ウェルプレートで力価を決定した。その結果を表２５に示す。

（実施例１０）
Δ２６Ｓヘルパー構築物によって作製したＶＲＰを使用したネズミにおけるボツリヌス神経毒素に対する防御
ボツリヌス神経毒素血清型ＡまたはＢ（それぞれ、ＢｏＮＴ ＡまたはＢｏＮＴ Ｂ）のいずれかの重鎖の無毒のＣ末端断片を発現するＶＥＥレプリコンベクターを、実施例５で記載されているように、次のいずれか：（ｉ）それぞれ３０μｇのキャップされていない１３．２．２および１３．４．６ヘルパー、または（ｉｉ）２０μｇのキャップされたカプシドΔ２６Ｓヘルパーおよび６０ｇのキャップされた糖タンパク質Δ２６Ｓヘルパー、を使用してＶＲＰ中にパッケージングした。これらのＶＲＰを、０日〜２８日に二回、スイスマウスにワクチン接種するために１×１０^７ＩＵの投与量で使用した。当該マウスを、２回目の免疫処置後１カ月において、ＢｏＮＴ ＡまたはＢｏＮＴ Ｂ神経毒のいずれかの、動物の５０パーセントが死亡するのに必要な投与量（１０００ＬＤ_５０）の１０００倍を用いてチャレンジ感染させた。当該チャレンジ感染実験の結果を表２０にまとめる。

（実施例１１）
天然痘ウイルス由来の抗原を発現するＶＲＰによる免疫原生および防御実験
Ａ．Δ２６Ｓヘルパー構築物を使用して生成させたＶＲＰの、マウスおよび霊長動物における免疫原生
４つのワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ：ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）遺伝子（Ｌ１Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ａ２７Ｌ、およびＡ３３Ｒ）を発現するために最適化されたＶＥＥレプリコンベクターを、Ｋａｍｒｕｄらによって記載された方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６０（２）：３７６−８７（２００７））を使用して構築した。当該４つのＶＡＣＶ遺伝子は、まとめて「４ｐｏｘ」と呼ばれる。１つは３０１４株をベースとし、もう一つはＴＣ−８３ワクチン株をベースとする二つの異なるＶＥＥレプリコンベクターシステム中に、当該４ｐｏｘ遺伝子をクローン化した。各最適化されたＶＡＣＶコード配列発現レプリコンベクターを、３０μｇのレプリコン、２０μｇのΔ２６ＳカプシドヘルパーＲＮＡ、および６０μｇのΔ２６ＳＧＰヘルパーＲＮＡを組み合わせて、それらをベロ細胞中にエレクトロポレーションすることによってＶＲＰを生成するために使用した。粒子は、実施例５に記載されているようにして作製し収集した。次いで、個々のＶＧＡＣＶ ＶＲＰを組み合わせて、ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはカニクイザルのいずれかを免疫化するために使用する４ｐｏｘＶＲＰ混合物を作製し、ＶＡＣＶ抗原特異的ＥＬＩＳＡ分析により、体液性応答を測定した。ワクチン接種したネズミにおいて検出されるＶＡＣＶ特異的ＥＬＩＳＡ反応を表２１に示し、予ワクチン接種したカニクイサルで検出されるＶＡＣＶ特異的ＥＬＩＳＡ反応を表２２に示す。

Ｂ．４ｐｏｘ ＶＲＰを使用した、ネズミおよび非ヒト霊長動物における防御
１．マウス
ワクシニアウイルス（ＩＨＤ−Ｊ株）の２×１０^６ＰＦＵを鼻腔内経路によりマウスにチャレンジ感染させ、その結果を表２３に示す。

２．非ヒト霊長動物
サル痘ウイルスの５×１０^６ＰＦＵを静脈内経路により、非ヒト霊長動物にチャレンジ感染させた。世界保健機構の病巣数採点システムを使用して、重症度を判定し、その結果を表２４に示す。

当業者に理解されるように、特許請求する発明の各態様に対していくつかの実施形態および要素があり、異なる要素の全ての組み合わせが、本発明の実施形態として本明細書に組み込まれ、したがって、本明細書に例示する特定の組み合わせは、特許請求する発明の範囲の限定として解釈されない。特定の要素を除去するかまたはある組み合わせに利用できる要素の群に加える場合、要素の当該群は、そのような変更が組み込まれていると解釈される。

非特許出版物、特許出願、および特許などの本明細書で引用されたすべの参照文献は、それぞれが個々におよび具体的に、その全部が参照文献に組み込まれていることが示される場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれ、その全てが本明細書で再現された。

Claims (24)

1. ａ）少なくとも一つの開始コドンが除去されているアルファウイルス５’複製認識配列と、
   ｂ）アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
   ｃ）アルファウイルス３’複製認識配列と
   を含み、（ｂ）の該ヌクレオチド配列の転写を誘導するプロモーターを含まないことを条件とする、単離されたＲＮＡ分子であって、
   （ａ）および（ｃ）の該アルファウイルス５’および３’複製認識配列が、アルファウイルス非構造タンパク質の存在下において該ＲＮＡ分子全体の複製を誘導する、ＲＮＡ分子。
2. 前記アルファウイルス構造タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、１）アルファウイルスカプシドタンパク質、２）任意の順序のアルファウイルスＥ１およびＥ２タンパク質、３）任意の順序のアルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ１タンパク質、５）任意の順序のアルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ２タンパク質、６）アルファウイルスＥ２タンパク質、並びに７）アルファウイルスＥ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
3. 前記アルファウイルス５’複製認識配列が、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルスの５’複製認識配列である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
4. 前記５’複製認識配列が、７０ヌクレオチドと５２４ヌクレオチドの間の長さである、請求項３に記載のＲＮＡ分子。
5. 前記アルファウイルス３’複製認識配列が、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルスの３’複製認識配列である、請求項１または３に記載のＲＮＡ分子。
6. 前記３’複製認識配列が、１９ヌクレオチドから３２５ヌクレオチドまでの長さである、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
7. 前記少なくとも一つの開始コドンが、非構造タンパク質１（ｎｓｐ１）のための開始コドンである、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
8. 全ての開始コドンが、前記５’複製認識配列から除去されている、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
9. 前記ＲＮＡが、５’末端でキャップされている、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
10. アルファウイルスレプリコン粒子を製造する方法であって、該方法は、請求項１に記載のＲＮＡ分子の１つ以上を細胞に導入する工程を含み、これによって、ＲＮＡ分子の組み合わせが、アルファウイルスレプリコン粒子が産生される条件下において、アルファウイルスレプリコンＲＮＡと共に、アルファウイルスレプリコン粒子の産生に必要な全てのアルファウイルス構造タンパク質をコードする、方法。
11. ２つのＲＮＡ分子が前記細胞中に導入され、該２つのＲＮＡ分子の第一のＲＮＡ分子が、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、該２つのＲＮＡ分子の第二のＲＮＡ分子が、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、そのうちの少なくとも１つが、該第一のＲＮＡ分子によってコードされる該アルファウイルス構造タンパク質とは異なる、請求項１０に記載の方法。
12. ３つのＲＮＡ分子が前記細胞中に導入され、該３つのＲＮＡ分子の第一のＲＮＡ分子が、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、該３つのＲＮＡ分子の第二のＲＮＡ分子が、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、そのうちの少なくとも１つが、該第一のＲＮＡ分子によってコードされる該アルファウイルス構造タンパク質とは異なり、第三のＲＮＡ分子が、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、そのうちの少なくとも１つが、該第一のＲＮＡ分子および該第二のＲＮＡ分子によってコードされる該アルファウイルス構造タンパク質とは異なる、請求項１０に記載の方法。
13. 前記１つ以上のＲＮＡ分子の少なくとも１つが、５’末端でキャップされている、請求項１０に記載の方法。
14. アルファウイルスレプリコン粒子を製造する方法であって、該方法は、
    ａ）アルファウイルスレプリコンＲＮＡと、
    ｂ）請求項１に記載のＲＮＡ分子の１つ以上と、
    ｃ）１つ以上のプロモーター補助アルファウイルスヘルパー構築物と
    を細胞に導入する工程を含み、
    これによって、（ｂ）のＲＮＡ分子と（ｃ）のヘルパー構築物との組み合わせが、アルファウイルスレプリコン粒子が産生される条件下において、アルファウイルスレプリコン粒子の産生に必要な全てのアルファウイルス構造タンパク質をコードする、方法。
15. 前記１つ以上のＲＮＡ分子の少なくとも１つが、５’末端でキャップされている、請求項１４に記載の方法。
16. 請求項１に記載のＲＮＡ分子を含む粒子のサブセットを含む、アルファウイルスレプリコン粒子の集団であって、該集団が、培養における許容細胞での継代によって決定されるような、アルファウイルスレプリコン粒子１０^８個当たりに検出可能な複製能力のあるアルファウイルスウイルス粒子を含まない、集団。
17. 請求項１に記載のＲＮＡ分子を含む粒子のサブセットを含む、アルファウイルスレプリコン粒子の集団であって、該集団が、培養における許容細胞での継代によって決定されるような、アルファウイルスレプリコン粒子１０^８個当たりに検出可能な複製能力のあるアルファウイルス粒子を含まず、該アルファウイルスレプリコン粒子が、アルファウイルス構造タンパク質またはアルファウイルス非構造タンパク質のいずれか、あるいはアルファウイルス構造タンパク質およびアルファウイルス非構造タンパク質の両方に、１つ以上の弱毒化突然変異を含む、集団。
18. 薬学的に許容される担体中に、請求項１６または１７に記載の集団を含む組成物。
19. 被験体において免疫応答を誘起する方法であって、該被験体に請求項１６または１７に記載の集団の有効量を投与する工程を含む、方法。
20. 請求項１に記載のＲＮＡ分子を含む細胞。
21. 請求項１に記載のＲＮＡ分子を含むベクター。
22. 請求項１に記載のＲＮＡ分子を含む核酸構築物。
23. 請求項２１に記載のベクターを含む細胞。
24. 請求項２２に記載の核酸構築物を含む細胞。

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