JP2010529868A - 過分極１３ｃ−ピルビン酸塩を含むｍｒ造影剤を用いて腫瘍のグレーディングを行うｍｒ方法 - Google Patents

Abstract

本願は、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いて腫瘍のグレーディングを行うＭＲ方法に関する。詳しくは、本願は、腫瘍のグレードを決定する方法であって、ａ）過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いて被験体における腫瘍のＭＲ検出を行う段階であって、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出する段階と、ｂ）前記信号及び任意には総炭素信号を用いて腫瘍の代謝プロファイルを生成する段階と、ｃ）段階ｂ）で生成した腫瘍の代謝プロファイルを特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルと比較する段階と、ｄ）腫瘍の前記代謝プロファイルと前記既知代謝プロファイルとの類似点及び相違点に基づいて腫瘍のグレードを決定する段階とを含んでなる方法に関する。
【選択図】図６

Description

本発明は、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含むＭＲ造影剤を用いて腫瘍のグレーディングを行うＭＲ方法に関する。

前立腺癌は、皮膚癌を除けば男性において最も普通の種類の癌であり、２番目に多い癌死の原因である。リスクファクターには年齢があり、発生率は６５歳を超えた男性において増加する。それは西洋においてよく見られ、１０％の症例は家系と関係づけることができる。前立腺癌は、限局期、局所進行期、進行期及びホルモン難治期を通って進む連続体である。一般に、それは主としてホルモン（即ち、テストステロン）の制御下でゆっくりと増殖する癌である。処置の選択は病期に依存し、早期に発見して適切に処置すれば、生存率は優秀である。

前立腺癌の表示徴候及び症状は、腺中におけるその原発部位及びその関与範囲に応じて変化する。大多数の癌は周辺領域で発生し、成長の初期には症状を示さない。移行領域で発生するもの、或いは拡大して尿道を侵害するものは、排尿躊躇、尿流の勢いの低下、間欠排尿及び排尿後漏れを生じることがある。しかし、これらの症状はすべて他の理由でも起こることがあり、前立腺癌を明確に特徴づけ得る診断症状や排尿パターンは存在しない。一般の人々の認識の高まり及びスクリーニング技法の向上のため、前立腺癌は、大抵は症状のない又は無症候性の男性において成長の初期段階で診断されている。

現在使用されているスクリーニング方法はＰＳＡ（前立腺特異抗原）測定である。ＰＳＡは前立腺から分泌される酵素であり、前立腺疾患に関するマーカーとして使用されている。通常、ＰＳＡは前立腺癌を有する可能性がある人を同定するプロセスの一部として測定される。特に、直腸内指診検査（ＤＲＥ）で触診できないほどに小さい腫瘍はＰＳＡ試験でしか見つからないことがある。

ＤＲＥ／ＰＳＡの所見を確認するため、経直腸超音波検査（ＴＲＵＳ）及びＴＲＵＳで案内される針生検が通常使用される。しかし、特に前立腺中の小さい限局性腫瘍に関しては、所見は偽陰性又は偽陽性であることがある。即ち、ＴＲＵＳで得られた低エコー源性画像の症例の２０〜２５％しか前立腺癌と確認されない。他方、２５％の前立腺腫瘍が等エコー源性である。生検では、前立腺の様々な領域から通常５〜８の等間隔試料が採取される。小さい腫瘍の場合には、生検針が腫瘍を簡単に「見逃す」ことがある。

国際公開第２００６／０１１８１０号には、健常組織と腫瘍組織（特に前立腺腫瘍組織）との識別を可能にするインビボＭＲイメージング方法が開示された。この方法では、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤が使用される。

ピルビン酸塩は、たとえ高濃度でも、人体によって非常によく容認される内因性化合物である。クエン酸回路中の前駆体として、ピルビン酸塩は人体内において重要な代謝的役割を果たす。ピルビン酸塩は様々な化合物に転化される。即ち、それのアミノ基転移はアラニンを生じ、酸化的脱炭酸反応によってピルビン酸塩はアセチルＣｏＡ及び重炭酸塩に転化され、ピルビン酸塩の還元は乳酸塩を生じ、それのカルボキシル化はオキサロ酢酸塩を生じる。

過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩からその代謝産物である過分極¹³Ｃ−乳酸塩、過分極¹³Ｃ−重炭酸塩（¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩、¹³Ｃ_1,2−ピルビン酸塩又は¹³Ｃ_1,2,3−ピルビン酸塩の場合のみ）及び過分極¹³Ｃ−アラニンへの代謝転化は、人体内における代謝過程のインビボＭＲ研究のために使用できる。¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩は、３７℃のヒト全血中で約４２秒のＴ₁緩和を有している。しかし、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩から過分極¹³Ｃ−乳酸塩、過分極¹³Ｃ−重炭酸塩及び過分極¹³Ｃ−アラニンへの転化は、¹³Ｃ−ピルビン酸塩母体化合物及びその代謝産物からの信号検出を可能にするのに十分速いことが判明している。アラニン、重炭酸塩及び乳酸塩の量は、検査対象である組織の代謝状態に依存する。過分極¹³Ｃ−乳酸塩、過分極¹³Ｃ−重炭酸塩及び過分極¹³Ｃ−アラニンのＭＲ信号強度は、これらの化合物の量及び検出時における分極の残存率に関係しているので、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩から過分極¹³Ｃ−乳酸塩、過分極¹³Ｃ−重炭酸塩及び過分極¹³Ｃ−アラニンへの転化をモニターすることにより、非侵襲的なＭＲイメージング又はＭＲ分光法を用いることでヒト又はヒト以外の動物の体内における代謝過程をインビボで調べることが可能である。

様々な¹³Ｃ−ピルビン酸塩代謝産物に由来するＭＲ信号振幅、したがって信号強度は、組織の種類に応じて変化することが判明している。アラニン、乳酸塩、重炭酸塩及びピルビン酸塩の信号強度の特異なＭＲ代謝パターンは、検査対象である組織の代謝状態に関するフィンガープリントとして使用でき、それによって健常組織と腫瘍組織との識別を可能にする。過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその代謝産物について取得された¹³Ｃ−ＭＲ画像中の腫瘍組織は、国際公開第２００６／０１１８１０号に詳しく記載されているように、最も高い乳酸塩信号或いはピルビン酸塩に比べて高い重み付き乳酸塩信号又はアラニンに比べて高い重み付き乳酸塩信号によって表される。

例えばＭＲイメージング（ＭＲＩ）及びＭＲ分光法（ＭＲＳ）のような磁気共鳴（ＭＲ）検出は、前立腺癌を検出するための有用なツールであり得よう。これらのツールは、非侵襲的にかつ患者及び医療従事者を潜在的に有害な放射線（例えば、Ｘ線）に暴露することなく患者の身体又はその一部の画像を得ることを可能にするため、医師にとって特に魅力的なものとなっている。高画質の画像並びに良好な空間的及び時間的分解能が得られるので、ＭＲＩは軟組織及び器官の好適なイメージング技法である。

このたび、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いた前立腺癌のインビボＭＲイメージング及び／又はＭＲ分光法は、健常組織と腫瘍組織との識別のために使用できるばかりでなく、前立腺癌の攻撃性の評価（即ち、腫瘍のグレーディング）のためにも使用できることが見出された。

前立腺癌の組織学的グレーディングは、疾患の結果（即ち、予後）を評価することの重要な一部である。前立腺癌の正確なグレーディングは、疾患の挙動及び攻撃性並びに患者について起こり得る結果を予測するために役立つ。

グレーディングシステムは、腫瘍における細胞の脱分化（サイズ、形状及び染色性の変動）及び分化の程度（即ち、どの程度まで分化した細胞であるか）を評価することができる。初期の癌では、細胞は通常は十分に分化しており、それが由来する組織に類似した機能を示す。癌が進行するに従い、細胞の分化程度は低くなり、その先祖とは異なる外観及び挙動を示し始める。

様々なグレーディングシステムが開発されてきたが、前立腺癌に関して最も広く使用されているものはグリーソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）システムである。グリーソングレーディングシステムは、腫瘍細胞が認識できる腺状構造に配列されている程度及び細胞の分化レベルに基づいている。グリーソンシステムは、攻撃性が最も小さい癌であるグレード１から攻撃性が最も大きい癌であるグレード５まで増加する５つの疾患攻撃性レベルを認定する。

大抵の前立腺癌は不均質性である（即ち、様々なグリーソングレードの細胞の混合物を有する）ので、２つの最も目立つグレードを合算してグリーソンスコアを得る。このスコアは有用な予後情報を提供し、他のパラメーターと共に前立腺癌の処置に関する決定を下すために使用される。４以上のグリーソンスコアは、さらに急速な疾患進行、転移の可能性の増加及び生存率の低下のリスクと関連づけられる。

グリーソングレーディングは客観的な定量化の試みであるが、組織学的グレーディングは本質的に主観的なものである。腫瘍の生検試料から得られた細胞から検体を調製し、次いで熟練した病理学者がそれを顕微鏡検査する。大きな問題点は、同一の検体を読み取る際における観察者間及び観察者内でのばらつきの程度である。複数の病理学者の見解を求めて個別の腫瘍グレードに関するコンセンサスに達することが必要となる場合がある。また、グリーソングレーディングは分析用の前立腺組織試料を必要とするが、これは（ＴＲＵＳで案内される）生検によって得なければならない。上述の通り、特に小さい腫瘍の場合には生検針が腫瘍を簡単に「見逃す」ことがあるので、生検からの結果は偽陰性となることがある。

したがって、前立腺組織の生検試料に関する現行の主観的病理学的分析よりもさらに一貫して前立腺癌の攻撃性を判定する方法に対するニーズが存在している。

前述の通り、前立腺組織の代謝状態は、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いる前立腺のインビボＭＲイメージングによって評価できる。腫瘍組織は健常組織より高い代謝活性によって特徴づけられ、ピルビン酸塩から乳酸塩への転化の増加を認めることができる。これはかかる腫瘍組織において高い¹³Ｃ−乳酸塩信号をもたらし、腫瘍組織を健常組織から識別して腫瘍組織を確認することを可能にする。

国際公開第２００６／０１１８１０号パンフレット

Howe, F. A.,et al.: Magnetic Resonance in Medicine, 49(2), 2003, 223-232

意外にも、我々はこのたび、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその代謝産物のＭＲ信号を用いて前立腺癌の攻撃性及び悪性度を評価し、かくして前立腺癌のグレードを決定できることを見出した。しかし、これらの発見は前立腺癌に限定されるわけではなく、他のタイプの癌にも転用できる。かくして、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いてＭＲ検出を行うことにより、腫瘍組織を同定するだけでなく前記腫瘍の攻撃性及び悪性度を予測すること、即ち完全に非侵襲性の方法を用いて腫瘍のグレードを決定することが可能となる。

かくして第１の態様では、本発明は、腫瘍のグレードを決定する方法であって、
ａ）過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いて被験体における腫瘍のＭＲ検出を行う段階であって、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出する段階と、
ｂ）前記信号及び任意には総炭素信号を用いて腫瘍の代謝プロファイルを生成する段階と、
ｃ）段階ｂ）で生成した腫瘍の代謝プロファイルを特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルと比較する段階と、
ｄ）腫瘍の前記代謝プロファイルと前記既知代謝プロファイルとの類似点及び相違点に基づいて腫瘍のグレードを決定する段階と
を含んでなる方法を提供する。

我々は、初期原発腫瘍（低グレード腫瘍）、後期原発腫瘍（高グレード腫瘍）及び転移が特有な代謝プロファイルを有すること、即ち過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いてＭＲ検出を行った場合に¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号が特有なパターンを示すことを見出した。したがって、腫瘍の代謝プロファイルを既知代謝プロファイルと比較することで腫瘍のグレードを決定することが可能となる。腫瘍が初期原発腫瘍から後期原発腫瘍に進行する場合、乳酸塩信号、総炭素信号（乳酸塩とアラニンとピルビン酸塩と（任意には）重炭酸塩の信号の和）及び（程度は低いが）アラニン信号は、初期腫瘍に比べて後期腫瘍で顕著に高くなる。さらに、補正乳酸塩信号（即ち、乳酸塩／ピルビン酸塩、乳酸塩／アラニン及び乳酸塩／総炭素）も、初期腫瘍より後期腫瘍で顕著に高くなる。乳酸塩信号及び総炭素信号から見た転移の所見は、初期腫瘍及び後期腫瘍で観察されるものの中間にある。これら特有な所見のため、腫瘍の代謝プロファイルを特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイル（即ち、初期原発腫瘍の既知代謝プロファイル、後期初期原発腫瘍の既知代謝プロファイル、又は転移の既知代謝プロファイル）と比較することにより、腫瘍のグレード（即ち、初期腫瘍か後期腫瘍か転移か）を決定することが可能である。

本発明ではまた、腫瘍を同定するのと同時にそのグレードを決定する方法も実現される。かかる方法は上述の方法に基づいており、腫瘍を有することが疑われる被験体が検査される。疑われる腫瘍の代謝プロファイルを特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルと比較することにより、被験体がいったい腫瘍を有するか否かを判定し、もし腫瘍が存在するならば前記腫瘍のグレードを決定することができる。

本発明の方法は、一般に腫瘍のグレードを決定するために使用できる。多くのタイプの癌については、確立された特定のグレーディングシステムが存在し、グレードは通常は数値的及び／又は記述的に評価される。腫瘍は、癌のタイプに応じ、数値的及び／又は記述的に評価された２段階ないし５段階のスケールで等級づけできる。一例としては、乳癌は伝統的にスカーフ−ブルーム−リチャードソン（Ｓ−Ｂ−Ｒ）システムで等級づけされており、Ｓ−Ｂ−Ｒシステムを用いる病理学者は乳癌のグレーディングに際して３つの構造的特徴、即ち（１）核多形性、（２）分裂指数及び（３）管腺分化に注目する。腫瘍は、各基準により、最も正常（分化）をＩとしかつ最も異常（未分化）をIIIとして個別に等級づけされる。３つの基準のスコアを合算して最終の腫瘍グレードを得る。したがって、スコアは３〜５（十分な分化）から６〜７（中等度の分化）及び８〜９（不十分な分化）までの範囲内にあり得る。別の例としては、前立腺癌は前述のグリーソンシステムによって等級づけされる。グリーソンシステムは、攻撃性が最も小さい癌であるグレード１から攻撃性が最も大きい癌であるグレード５まで増加する５つの疾患攻撃性レベルを認定する。腫瘍の不均質性を補償するため、２つの最も目立つ腫瘍グレードを合算してグリーソンスコアを得る。

２段階（低グレード対高グレード腫瘍）又は３段階（低グレード対中グレード対高グレード腫瘍）のグレーディングシステムにおいて結果を単にグループ分けするよりも一層詳細な結果を与えるグレーディングシステムに関しては、比較段階ｃ）及びグレード決定段階ｄ）を簡略化した本発明の実施形態を使用することが好ましい。したがって本発明の別の態様は、腫瘍のグレードを決定する方法であって、
ａ）過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いて被験体における腫瘍のＭＲ検出を行う段階であって、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出する段階と、
ｂ）前記信号及び任意には総炭素信号を用いることで、かかる信号と腫瘍グレードとの関係を示す標準曲線から腫瘍のグレードを決定する段階と
を含んでなる方法である。

かかる方法は、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を腫瘍の組織病理学的グレードと相互に関係づける１つ又は複数の標準曲線の使用に基づいている。前記１つ又は複数の標準曲線は、あるタイプの癌を有する患者集団から得ることができる統計的に有意な標準曲線である。

一例としては、患者集団は前立腺癌を有する患者集団であり得る。即ち、かかる患者は前立腺に腫瘍を有すると共に、これらの腫瘍は様々な程度の攻撃性／悪性度を有している。前記患者集団に対し、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を投与し、続いて¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩のＭＲ信号を検出して記録する前立腺のＭＲ検査が施される。この患者集団における腫瘍はまた、病理学者によりグリーソンシステムを用いて組織病理学的に等級づけされ、２つの最も目立つ腫瘍グレードを合算してグリーソンスコアが得られる。患者で決定されたグリーソンスコアが患者のＭＲ検査結果と相互に関係づけられる。このような関係づけを行うためには、当技術分野で知られる各種の統計的方法が使用できる。統計的に有意な標準曲線を得るため、前記の関係づけは統計的に適切な数の患者（即ち、患者集団）に関して実施される。

定義
本発明の文脈中における「腫瘍のグレード」という用語は、前記腫瘍の攻撃性及び／又は悪性度の認知される程度をいう。

「腫瘍のＭＲ検出を行って¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出する」という用語は、¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号を検出し、及び／又はその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニンの信号を検出し、及び／又はその¹³Ｃ含有代謝産物である乳酸塩の信号を検出し、及び任意にはその¹³Ｃ含有代謝産物である重炭酸塩の信号を検出することを意味する。これは、すべての信号（即ち、母体化合物である¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその¹³Ｃ含有代謝産物の全部の信号）を検出するか、或いは単一の化合物（即ち、母体化合物である¹³Ｃ−ピルビン酸塩又はその¹³Ｃ含有代謝産物の１種）の信号のみを検出するか、或いは全部ではないがそれより多くの化合物（即ち、例えば¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び¹³Ｃ−乳酸塩、又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び¹³Ｃ−アラニン、又は¹³Ｃ−乳酸塩又は¹³Ｃ−アラニン）を検出することを意味する。上述の用語は、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその¹³Ｃ含有代謝産物の信号のあらゆる組合せを包含する。

本発明の文脈中における「被験体」という用語は、任意の脊椎動物の生体又は非生体、好ましくはヒト又はヒト以外の動物の哺乳動物のような哺乳動物の生体又は非生体、好ましくは哺乳動物生体、最も好ましくはヒト生体をいう。

「過分極」という用語は、以後は「分極」という用語と互換的に使用され、０．１％を超え、さらに好ましくは１％を超え、最も好ましくは１０％を超える核分極レベルを意味する。

本発明の文脈中における「信号」という用語は、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びに／或いはその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩を表すＭＲスペクトル中のピークの、ノイズに対するＭＲ信号振幅又は積分又はピーク面積をいう。好ましい実施形態では、信号はピーク面積である。

本発明の文脈中における「総炭素信号」という用語は、¹³Ｃ−ピルビン酸塩、¹³Ｃ−乳酸塩、¹³Ｃ−アラニン及び任意には¹³Ｃ−重炭酸塩の信号の和を意味する。

本発明の文脈中における「腫瘍の代謝プロファイル」という用語は、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び／又はその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン及び／又はその¹³Ｃ含有代謝産物である乳酸塩及び任意にはその¹³Ｃ含有代謝産物である重炭酸塩の信号の特有なパターンを意味する。これは、一実施形態ではすべての信号（即ち、母体化合物である¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその¹³Ｃ含有代謝産物の全部の信号）を用いて腫瘍の代謝プロファイルを生成し、また別の実施形態では単一の化合物（即ち、母体化合物である¹³Ｃ−ピルビン酸塩又はその¹³Ｃ含有代謝産物の１種）の信号のみを用いて腫瘍の代謝プロファイルを生成することを意味する。さらに別の実施形態では、２以上の信号（例えば、母体化合物である¹³Ｃ−ピルビン酸塩の信号及び¹³Ｃ−乳酸塩の信号、又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び¹³Ｃ−アラニンの信号、又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩、¹³Ｃ−乳酸塩及び¹³Ｃ−アラニンの信号）を用いて腫瘍の代謝プロファイルを生成する。上述の代謝プロファイルは、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその¹³Ｃ含有代謝産物の信号のあらゆる組合せを用いて生成できる。本発明に係る「腫瘍の代謝プロファイル」はまた、処理信号データ（例えば、多重ＭＲ検出の信号パターン（即ち、スペクトル又は画像）から導き出される信号の比、補正信号或いは動力学的又は代謝速度定数情報）を含むか、或いはかかる処理信号データを用いて生成できる。

本発明の文脈中における「特定腫瘍グレードの既知代謝プロファイル」という用語は、特定グレードの腫瘍（例えば、初期原発腫瘍（低グレード腫瘍）、後期原発腫瘍（高グレード腫瘍）又は転移）に関する¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びに／或いはその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号の特有なパターンを意味し、前記特有なパターンは前の段落における「腫瘍の代謝プロファイル」の定義に記載したようにして生成したものである。

本発明の文脈中における「腫瘍のステージ」という用語は、癌の経時的な進行状態をいい、初期原発腫瘍、後期原発腫瘍又は転移を意味する。転移は、原発腫瘍の近傍（例えば、局所リンパ節）或いは原発腫瘍から一層遠い部位（例えば、非局所リンパ節、骨又はその他の部位）に起こり得る。

「腫瘍の組織病理学的グレード」という用語は、例えば腫瘍の生検で得られる腫瘍の一部分を顕微鏡検査した後に病理学者が与える腫瘍のグレードをいう。

「信号の標準曲線」という用語は、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びに／或いはその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号と腫瘍のグレードとの関係を示す統計的に有意な標準曲線をいう。それは、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を腫瘍の組織病理学的グレードと相互に関係づけることで得られる。単数形で書かれているが、それは単一の標準曲線又は１以上の標準曲線に関するものであり得る。

「特定腫瘍グレード」という用語は、そのグレードが既知である腫瘍をいう。

「過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩」、「¹³Ｃ−ピルビン酸塩」及び「ピルビン酸塩」という用語は、特記しない限り、以後は互換的に使用される。同じく、「過分極¹³Ｃ−乳酸塩」、「¹³Ｃ−乳酸塩」及び「乳酸塩」という用語、「過分極¹³Ｃ−アラニン」、「¹³Ｃ−アラニン」及び「アラニン」という用語、並びに「過分極¹³Ｃ−重炭酸塩」、「¹³Ｃ−重炭酸塩」及び「重炭酸塩」という用語は、特記しない限り、以後は互換的に使用される。

図１は、正常なマウス前立腺から採取した代表的なＴ₂重み付き軸方向画像（Ａ）、選択された病理学に対応する０．１３５ｃｍ³過分極¹³Ｃスペクトルを示すグリッドを重ね合わせたＴ₂重み付き画像（Ｂ）、対応するスペクトル（Ｃ）、及びＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）染色組織切片（Ｄ）を示している。 図２は、初期原発腫瘍（低グレード腫瘍）を有するＴＲＡＭＰマウス前立腺から採取した代表的なＴ₂重み付き軸方向画像（Ａ）、選択された病理学に対応する０．１３５ｃｍ³過分極¹³Ｃスペクトルを示すグリッドを重ね合わせたＴ₂重み付き画像（Ｂ）、対応するスペクトル（Ｃ）、及びＨ＆Ｅ染色組織切片（Ｄ）を示している。 図３は、後期原発腫瘍（高グレード腫瘍）を有するＴＲＡＭＰマウス前立腺から採取した代表的なＴ₂重み付き軸方向画像（Ａ）、選択された病理学に対応する０．１３５ｃｍ³過分極¹³Ｃスペクトルを示すグリッドを重ね合わせたＴ₂重み付き画像（Ｂ）、対応するスペクトル（Ｃ）、及びＨ＆Ｅ染色組織切片（Ｄ）を示している。 図４は、後期原発腫瘍（高グレード腫瘍）及びリンパ節転移領域を有するＴＲＡＭＰマウス前立腺から採取した代表的なＴ₂重み付き軸方向画像（Ａ）、選択された病理学に対応する０．１３５ｃｍ³過分極¹³Ｃスペクトルを示すグリッドを重ね合わせたＴ₂重み付き画像（Ｂ）、対応するスペクトル（Ｃ）、及びＨ＆Ｅ染色組織切片（Ｄ）を示している。 図５は、ＴＲＡＭＰモデルにおける前立腺腫瘍の発生及び進行に伴って起こった代謝変化及び組織学的変化をまとめて示しており、これらの変化を正常なマウス前立腺組織の代謝プロファイル及び組織と比較している。 図６は、正常なマウス前立腺、ＴＲＡＭＰマウスの初期前立腺腫瘍、ＴＲＡＭＰマウスの後期前立腺腫瘍、及びリンパ節転移の過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩／ノイズ比並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン／ノイズ比及び乳酸塩／ノイズ比をプロットした棒グラフを示している。 図７は、乳酸塩信号／ノイズ比を組織タイプ（即ち、正常なマウス前立腺組織、ＴＲＡＭＰマウスの初期前立腺腫瘍組織、ＴＲＡＭＰマウスの後期前立腺腫瘍組織、及びリンパ節転移）に対してプロットした箱グラフを示している。 図８は、各種の組織タイプ（即ち、正常なマウス前立腺組織、ＴＲＡＭＰマウスの初期前立腺腫瘍組織及びＴＲＡＭＰマウスの後期前立腺腫瘍組織）に関し、乳酸塩信号／ノイズ比を総過分極炭素に対してプロットしたグラフを示している。

前述の通り、第１の態様で本発明は、腫瘍のグレードを決定する方法であって、
ａ）過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いて被験体における腫瘍のＭＲ検出を行う段階であって、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出する段階と、
ｂ）前記信号及び任意には総炭素信号を用いて腫瘍の代謝プロファイルを生成する段階と、
ｃ）段階ｂ）で生成した腫瘍の代謝プロファイルを特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルと比較する段階と、
ｄ）腫瘍の前記代謝プロファイルと前記既知代謝プロファイルとの類似点及び相違点に基づいて腫瘍のグレードを決定する段階と
を含んでなる方法を提供する。

段階ａ）では、被験体、好ましくは哺乳動物の生体、さらに好ましくはヒト又はヒト以外の動物の哺乳動物の生体、最も好ましくはヒト生体における腫瘍がＭＲによって検出される。

一実施形態では、前記ＭＲ検出は、ＭＲイメージング又はＭＲ分光法或いはＭＲイメージングとＭＲ分光法との組合せ（即ち、ＭＲ分光イメージング）である。別の実施形態では、前記ＭＲ検出は、様々な時点でＭＲ分光イメージングを行って母体化合物である¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び／又はその¹³Ｃ含有代謝産物の変化速度を測定することである。さらに別の実施形態では、前記ＭＲ検出は、代謝速度定数、動力学又は腫瘍進行の他の特性を導き出すように考案される。好ましい実施形態では、乳酸塩、ピルビン酸塩及びアラニンからの分解信号のスペクトルドメイン積分が¹³Ｃ−ＭＲ分光画像中の各空間点に関して求められる。別の好ましい実施形態では、特定の¹³Ｃ含有代謝産物の画像からの強度を用いることで、本発明の方法の段階ｂ）において代謝プロファイルが生成される。

本発明のＭＲ検出においては、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤が使用される。

本発明の方法で使用される前記造影剤中の過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩の同位体濃縮度は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上であり、９０％を超える同位体濃縮度が最も好ましい。理想的には、濃縮度は１００％である。本発明の方法で使用される造影剤中の¹³Ｃ−ピルビン酸塩は、Ｃ１位置（以下¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩と表示する）、Ｃ２位置（以下¹³Ｃ₂−ピルビン酸塩と表示する）、Ｃ３位置（以下¹³Ｃ₃−ピルビン酸塩と表示する）、Ｃ１及びＣ２位置（以下¹³Ｃ_1,2−ピルビン酸塩と表示する）、Ｃ１及びＣ３位置（¹³Ｃ_1,3−ピルビン酸塩と表示する）又はＣ１、Ｃ２及びＣ３位置（以下¹³Ｃ_1,2,3−ピルビン酸塩と表示する）において同位体濃縮することができる。¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩は他のＣ位置で同位体濃縮された¹³Ｃ−ピルビン酸塩に比べて３７℃のヒト全血中で高いＴ₁緩和（約４２秒）を有するので、Ｃ１位置での同位体濃縮が好ましい。

同位体濃縮された¹³Ｃ−ピルビン酸塩は、例えば¹³Ｃ−ピルビン酸ナトリウムとして商業的に入手できる。別法として、それはＳ．Ａｎｋｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７６，１９４８，１３３−１３３５に記載されたようにして合成できる。

国際公開第９９／３５５０８号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）にはいくつかの過分極技法が開示されており、その１つが¹³Ｃ−ピルビン酸塩の過分極のために好ましい動的核分極（ＤＮＰ）技法である。ＤＮＰでは、分極させるべき化合物（即ち、試料）中のＭＲ活性核の分極は、不対電子を含む化合物である分極剤又はいわゆるＤＮＰ剤によって達成される。ＤＮＰプロセス中には、通常はマイクロ波放射の形態でエネルギーが供給され、これがまずＤＮＰ剤を励起する。基底状態への崩壊に際して、ＤＮＰ剤の不対電子から試料のＮＭＲ活性核への分極の移動が起こる。一般に、ＤＮＰプロセスでは中程度の又は高い磁場及び非常に低い温度が使用されており、例えば、液体ヘリウム及び約１Ｔ以上の磁場中でＤＮＰプロセスが実施される。別法として、中程度の磁場及び十分な分極増強が達成される任意の温度を使用することもできる。ＤＮＰ技法は、例えば国際公開第９８／５８２７２号及び同第０１／９６８９５号に一層詳しく記載されており、これらの開示内容はいずれも援用によって本明細書の内容の一部をなしている。

ＤＮＰ法によって試料を分極させるためには、前記試料（即ち、分極させるべき化合物）とＤＮＰ剤との混合物を調製し、次いでこれを凍結して分極用のＤＮＰ分極装置内に挿入する。分極後、過分極した試料を含む混合物を、融解又は適当な溶解媒質中への溶解によって急速に液体状態に移行させる。溶解が好ましく、ＤＮＰ分極化合物を含む凍結混合物の溶解方法及びそのための好適な装置は国際公開第０２／３７１３２号に詳しく記載されている。融解方法及び融解用の好適な装置は、例えば国際公開第０２／３６００５号に記載されている。

高度に分極した試料を得るためには、ＤＮＰプロセス中に試料とＤＮＰ剤とが緊密に接触している必要がある。凍結又は冷却時に試料及びＤＮＰ剤を含む混合物が結晶化するならば、それに該当しない。結晶化を避けるためには、試料中にガラス形成剤を存在させる必要があり、或いは凍結時に結晶化せずにガラスを形成する化合物を分極用に選択する必要がある。

ＤＮＰ法によって過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を得るためには、¹³Ｃ−ピルビン酸又は¹³Ｃ−ピルビン酸塩が出発原料として好適に使用される。

¹³Ｃ₁−ピルビン酸の合成のためには、いくつかの方法が当技術分野で知られている。簡単に述べれば、Ｓｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０（２），１９７５，２３１−２３７には、カルボニル含有出発原料をＳ，Ｓ−アセタール（例えば、１，３−ジチアン又は２−メチル−１，３−ジチアン）として保護及び活性化することに基づく合成経路が記載されている。かかるジチアンをメタレート化し、メチル含有化合物及び／又は¹³ＣＯ₂と反応させる。この参考文献中に略述されているような適当な同位体濃縮¹³Ｃ−成分を使用することで、¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩、¹³Ｃ₂−ピルビン酸塩又は¹³Ｃ_1,2−ピルビン酸塩を得ることが可能である。次いで、文献中に記載されている通常の方法を用いてカルボニル官能基を遊離させる。異なる合成経路は酢酸から開始するが、酢酸をまず臭化アセチルに転化させ、次いでＣｕ¹³ＣＮと反応させる。得られたニトリルはアミドを介してピルビン酸に転化される（例えば、Ｓ．Ｈ．Ａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７６（１９４８），１３３３又はＪ．Ｅ．Ｔｈｉｒｋｅｔｔｌｅ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９７），１０２５を参照されたい）。さらに¹³Ｃ−ピルビン酸は、例えば米国特許第６，２３２，４９７号に記載された方法又は国際公開第２００６／０３８８１１号に記載された方法により、商業的に入手できる¹³Ｃ−ピルビン酸ナトリウムへのプロトン付加によって得ることができる。¹³Ｃ−ピルビン酸塩は商業的に入手できる化合物である。

ＤＮＰによる¹³Ｃ−ピルビン酸の過分極は、国際公開第２００６／０１１８０９号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳しく記載されている。簡単に述べれば、¹³Ｃ−ピルビン酸は凍結時にガラスを形成するので、それはＤＮＰのためにそのまま使用できる。ＤＮＰ後、凍結過分極¹³Ｃ−ピルビン酸を液化（例えば、溶解）して中和すること（即ち、¹³Ｃ−ピルビン酸塩に転化させること）が必要である。転化のためには、強塩基が必要である。さらに、¹³Ｃ−ピルビン酸は強酸であるので、この強酸中で安定なＤＮＰ剤を選択する必要がある。

別法として、¹³Ｃ−ピルビン酸塩（即ち、¹³Ｃ−ピルビン酸の塩）をＤＮＰのために使用できる。好ましい塩は、国際公開第２００７／１１１５１５号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳しく記載されているように、ＮＨ₄ ⁺、Ｋ⁺、Ｒｂ⁺、Ｃｓ⁺、Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺及びＢａ²⁺、好ましくはＮＨ₄ ⁺、Ｋ⁺、Ｒｂ⁺及びＣｓ⁺、さらに好ましくはＫ⁺、Ｒｂ⁺及びＣｓ⁺、最も好ましくはＣｓ⁺からなる群からの無機陽イオンを含む¹³Ｃ−ピルビン酸塩である。これらの好ましい¹³Ｃ−ピルビン酸塩の合成法もまた、国際公開第２００７／１１１５１５号に開示されている。

さらに他の好ましい塩は、国際公開第２００７／０６９９０９号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に詳しく記載されているように、有機アミン又はアミノ化合物の¹³Ｃ−ピルビン酸塩（好ましくは、ＴＲＩＳ−¹³Ｃ₁−ピルベート又はメグルミン−¹³Ｃ₁−ピルベート）である。これらの好ましい¹³Ｃ−ピルビン酸塩の合成法もまた、国際公開第２００７／０６９９０９号に開示されている。

過分極（核分極）のレベルは、例えば、固体過分極試料（例えば、凍結過分極試料）中のＮＭＲ活性核の固体状態ＮＭＲ測定によって決定できる。¹³Ｃ−ピルビン酸塩に関しては、過分極試料中のＮＭＲ活性核は¹³Ｃであり、かくして¹³Ｃ−ピルビン酸塩又は¹³Ｃ−ピルビン酸の固体状態¹³Ｃ−ＮＭＲが取得できる。固体状態¹³Ｃ−ＮＭＲ測定は、好ましくは小さいフリップ角を用いる単パルス取得ＮＭＲシーケンスからなる。ＮＭＲスペクトル中の過分極試料の信号強度を、過分極前に取得したＮＭＲスペクトル中の試料の信号強度と比較する。次いで、過分極前後における信号強度の比から分極レベルを計算する。

同様に、液体状態の過分極試料（溶解されたもの又は所定温度で液体のもの）に関する分極レベルは、液体過分極試料中のＮＭＲ活性核の液体状態ＮＭＲ測定によって決定できる。この場合にも、溶解過分極試料の信号強度を過分極前の溶解試料の信号強度と比較する。次いで、過分極前後における試料の信号強度の比から分極レベルを計算する。

本発明の方法で使用する過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤は、好ましくは国際公開第２００６／０１１８０９号に記載されるようにして処方されるが、これには好適な投与プロトコル及び投与量も開示されている。

造影剤の投与後４００秒未満、好ましくは１２０秒未満、さらに好ましくは投与後６０秒未満、特に好ましくは２０〜５０秒、最も好ましくは３０〜４０秒に、検査対象体積（即ち、腫瘍）をエンコードするＭＲイメージングシーケンスを複合した周波数及び空間選択的な方法で印加する。かくして前記検査対象体積の直接¹³Ｃ−ＭＲ画像及びＭＲスペクトルを取得することで、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその代謝産物である¹³Ｃ−乳酸塩、¹³Ｃ−アラニン及び任意には¹³Ｃ−重炭酸塩の信号強度が得られる。

好ましい実施形態では、ＭＲ検出のために専用の高周波コイル、好ましくは専用の¹³Ｃ−コイルが使用される。使用するコイルのタイプは、もちろん、腫瘍の位置／癌のタイプに依存する。一例としては、脳内の腫瘍のＭＲ検出のためにはバードケージコイルが使用でき、前立腺中の腫瘍のＭＲ検出のためには直腸内コイルが使用できる。

本発明の方法の段階ｂ）では、上述した¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその代謝産物である¹³Ｃ−乳酸塩、¹³Ｃ−アラニン及び任意には¹³Ｃ−重炭酸塩の信号並びに任意には総炭素信号を用いて腫瘍の代謝プロファイルが生成される。

一実施形態では、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその代謝産物である¹³Ｃ−乳酸塩、¹³Ｃ−アラニン及び任意には¹³Ｃ−重炭酸塩（以後は「¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその代謝産物」という）のスペクトル信号強度を用いて腫瘍の代謝プロファイルが生成される。別の実施形態では、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその代謝産物のスペクトル信号積分を用いて腫瘍の代謝プロファイルが生成される。別の実施形態では、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその代謝産物の個別画像からの信号強度を用いて腫瘍の代謝プロファイルが生成される。さらに別の実施形態では、２以上の時点で信号強度を求めることで¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び／又はその代謝産物の変化速度が計算される。

一実施形態では、すべての信号（即ち、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び¹³Ｃ−乳酸塩及び¹³Ｃ−アラニン及び任意には¹³Ｃ−重炭酸塩の信号）を用いて腫瘍の代謝プロファイルが生成される。さらに、総炭素信号（即ち、¹³Ｃ−乳酸塩、¹³Ｃ−アラニン、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び任意には¹³Ｃ−重炭酸塩の信号の和）を用いて腫瘍の代謝プロファイルを生成することもできる。別の実施形態では、１以上の選択された信号を用いて腫瘍の代謝プロファイルが生成される。かくして好ましい実施形態では、乳酸塩信号及び／又はアラニン信号及び／又は総炭素信号を用いて腫瘍の代謝プロファイルが生成される。さらに別の好ましい実施形態では、乳酸塩信号及び／又は総炭素信号を用いて腫瘍の代謝プロファイルが生成される。

別の実施形態では、腫瘍の代謝プロファイルは処理信号データ（例えば、多重ＭＲ検出の信号パターン（即ち、スペクトル又は画像）から導き出される信号の比、補正信号或いは動力学的又は代謝速度定数情報）を含むか、或いはかかる処理信号データを用いて生成される。かくして好ましい実施形態では、補正乳酸塩信号（即ち、乳酸塩／アラニン信号及び／又は乳酸塩／ピルビン酸塩信号及び／又は乳酸塩／総炭素信号）を用いて腫瘍の代謝プロファイルが生成される。別の好ましい実施形態では、処理信号は各画像点に関して前記各画像点の代謝プロファイルに特有な数を与える。

本発明の方法の段階ｃ）では、段階ｂ）で得られた腫瘍の代謝プロファイルが特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルと比較される。

特定グレードの腫瘍の既知プロファイルは、好ましくはあるタイプの癌を有する統計的な有意な数の患者のＭＲ検査に基づいている。一例としては、前立腺癌を有する統計的な有意な数の患者（即ち、前立腺中に腫瘍を有する患者）を用いて特定グレードの前立腺腫瘍の既知プロファイルが生成される。一実施形態では、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を患者に投与し、続いて¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩のＭＲ信号を検出して記録する。これらの信号及び任意には総炭素信号を用いることで、前の段落に記載したようにして各患者の腫瘍の代謝プロファイルが生成される。これらの患者における腫瘍はまた、病理学者によりグリーソンシステムを用いて組織病理学的に等級づけされ、２つの最も目立つ腫瘍グレードを合算してグリーソンスコアが得られる。同一のグリーソンスコアを有する患者の代謝プロファイルをプールし、当技術分野で知られる統計的方法により、所定のグリーソンスコアと相互に関係するこれらのプールプロファイルの「平均」代謝プロファイルが生成される。かかる「平均」代謝プロファイルが特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルである。

一実施形態では、既知代謝プロファイルはすべての信号（即ち、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び¹³Ｃ−乳酸塩及び¹³Ｃ−アラニン及び任意には¹³Ｃ−重炭酸塩の信号）を含む。さらに、それは総炭素信号（即ち、乳酸塩、アラニン、ピルビン酸塩及び任意には重炭酸塩の信号の和）を含み得る。別の実施形態では、既知代謝プロファイルは１以上の選択された信号を含む。かくして好ましい実施形態では、乳酸塩信号及び／又はアラニン信号及び／又は総炭素信号が前記既知代謝プロファイル中に存在する。さらに別の好ましい実施形態では、乳酸塩信号及び／又は総炭素信号が前記既知代謝プロファイル中に存在する。

さらに別の好ましい実施形態では、既知代謝プロファイルは処理信号データ（例えば、多重ＭＲ検出の信号パターン（即ち、スペクトル又は画像）から導き出される信号の比、補正信号或いは動力学的又は代謝速度定数情報）を含む。かくして好ましい実施形態では、既知代謝プロファイルは補正乳酸塩信号（即ち、乳酸塩／アラニン信号及び／又は乳酸塩／ピルビン酸塩信号及び／又は乳酸塩／総炭素信号）を含む。別の好ましい実施形態では、処理信号は各画像点に関して前記各画像点の代謝プロファイルに特有な数を与える。

既知代謝プロファイルは、表（即ち、上述した信号の１以上に関する信号値を表示する表）の形態を有し得る。別の実施形態では、かかる既知プロファイルはグラフの形態を有し得る。さらに別の実施形態では、かかる既知プロファイルはデータセットの形態を有し得るが、前記データセットはコンピューター読取り可能な媒体上に記憶される。

最も簡単な実施形態では、比較は、本発明の方法の段階ｂ）で生成された腫瘍の代謝プロファイルと特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルとの目視比較によって行うことができる。別の実施形態では、比較は、例えば２つの代謝プロファイルを比較する好適なソフトウェアを使用することで自動的に行われる。一実施形態では、段階ｂ）で生成された腫瘍の代謝プロファイルが特定グレードの腫瘍の単一の既知代謝プロファイルと比較される。一例としては、段階ｂ）で生成された腫瘍（例えば、前立腺腫瘍）の代謝プロファイルがグリーソンスコア４（２＋２）を有する前立腺腫瘍の単一の既知代謝プロファイルと比較される。検査対象の前立腺腫瘍の代謝プロファイルとグリーソンスコア４（２＋２）を有する前立腺腫瘍の既知代謝プロファイルとが極めて類似していれば、前記代謝プロファイルと、他のグリーソンスコア（例えば、グリーソンスコア８（４＋４））を有する前立腺腫瘍の他の既知代謝プロファイルとを比較することは早急には必要でない。しかし、通常は段階ｂ）で生成された腫瘍の代謝プロファイルが複数の特定グレードの腫瘍の複数の既知代謝プロファイルと比較される。好ましい実施形態では、段階ｂ）で得られた代謝プロファイルは、腫瘍グレードに関連した色及び／又は数字を用いて解剖学的画像上にパラメーター画像オーバーレイとして表示される。そうすることにより、得られた画像オーバーレイは腫瘍グレード及び腫瘍ステージに関する総合情報（即ち、腫瘍の程度及び位置）を与える。別の好ましい実施形態では、解剖学的画像（例えば、プロトン解剖学的画像）中に腫瘍領域が画定され、次いでこの腫瘍領域が段階ｂ）で得られたその代謝プロファイルと共に腫瘍グレードの自動計算のための基礎をなす。したがって、グレーディングは表、データベースなどの中でグレードを自動検索することに依存する。

本発明の方法の段階ｄ）では、腫瘍の代謝プロファイルと特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルとの類似点及び相違点に基づいて検査対象の腫瘍のグレードが決定される。簡単には、既知代謝プロファイルと検査対象の腫瘍の代謝プロファイルとの類似性が高くなるほど、検査対象の腫瘍は既知代謝プロファイルの基礎をなす腫瘍と同じグレードを有する可能性が高くなる。腫瘍の代謝プロファイルと特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルとの類似性又は相違性の程度を評価しかつ計算するための当技術分野で公知の統計的方法が存在することは自明であり、かかる統計的方法を使用することが好ましい。

本発明の第２の態様は、腫瘍のグレードを決定する方法であって、
ａ）過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いて被験体における腫瘍のＭＲ検出を行う段階であって、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出する段階と、
ｂ）前記信号を用いることで、かかる信号と腫瘍グレードとの関係を示す標準曲線から腫瘍のグレードを決定する段階と
を含んでなる方法である。

前述の通り、上記方法は、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその¹³Ｃ含有代謝産物の信号を腫瘍の組織病理学的グレードと相互に関係づける１つ又は複数の標準曲線の使用に基づいている。前記１つ又は複数の標準曲線は、あるタイプの癌を有する患者集団から得ることができる統計的に有意な標準曲線である。

上記方法は、２段階（低グレード対高グレード腫瘍）又は３段階（低グレード対中グレード対高グレード腫瘍）のグレーディングシステムにおいて結果を単にグループ分けするよりも一層詳細な結果を与える確立されたグレーディングシステムを有するタイプの癌に対して特に好適である。好ましい実施形態では、上記方法は前立腺癌のグレーディング（即ち、前立腺中の腫瘍のグレーディング）のために使用される。

上記方法の段階ａ）は本発明の第１の態様の方法の段階ａ）と全く同じであり、したがって本発明の第１の態様の方法の段階ａ）に関連して記載したすべての実施形態及び好ましい実施形態は、本発明の第２の態様の方法の段階ａ）にも適用される。

上記方法の段階ｂ）では、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその代謝産物である¹³Ｃ−乳酸塩、¹³Ｃ−アラニン及び任意には¹³Ｃ−重炭酸塩の信号を用いることで、かかる信号と腫瘍グレードとの関係を示す標準曲線から腫瘍のグレードが決定される。

かくして一実施形態では、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその代謝産物である¹³Ｃ−乳酸塩、¹³Ｃ−アラニン及び任意には¹³Ｃ−重炭酸塩（以後は「¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその代謝産物」という）のスペクトル信号強度を用いることで、かかる信号と腫瘍グレードとの関係を示す標準曲線から腫瘍のグレードが決定される。別の実施形態では、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその代謝産物のスペクトル信号積分が使用される。別の実施形態では、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及びその代謝産物の個別画像からの信号強度が使用される。さらに別の実施形態では、２以上の時点で信号強度を求めることで¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び／又はその代謝産物の変化速度が計算される。

一実施形態では、すべての信号（即ち、¹³Ｃ−ピルビン酸塩及び¹³Ｃ−乳酸塩及び¹³Ｃ−アラニン及び任意には¹³Ｃ−重炭酸塩の信号）を用いることで、かかる信号と腫瘍グレードとの関係を示す標準曲線から腫瘍のグレードが決定される。さらに、総炭素信号（即ち、乳酸塩、アラニン、ピルビン酸塩及び任意には重炭酸塩の信号の和）も使用できる。別の実施形態では、１以上の選択された信号を用いることで、かかる信号と腫瘍グレードとの関係を示す標準曲線から腫瘍のグレードが決定される。かくして好ましい実施形態では、乳酸塩信号及び／又はアラニン信号及び／又は総炭素信号が使用される。さらに別の好ましい実施形態では、乳酸塩信号及び／又は総炭素信号が使用される。

別の実施形態では、処理信号データ（例えば、多重ＭＲ検出の信号パターン（即ち、スペクトル又は画像）から導き出される信号の比、補正信号或いは動力学的又は代謝速度定数情報）を使用することで、かかる信号と腫瘍グレードとの関係を示す標準曲線から腫瘍のグレードが決定される。かくして好ましい実施形態では、補正乳酸塩信号（即ち、乳酸塩／アラニン信号及び／又は乳酸塩／ピルビン酸塩信号及び／又は乳酸塩／総炭素信号）を用いることで、かかる信号と腫瘍グレードとの関係を示す標準曲線から腫瘍のグレードが決定される。別の好ましい実施形態では、処理信号は各画像点に関して前記各画像点の代謝プロファイルに特有な数を与える。

最も簡単な実施形態では、標準曲線は信号と（例えば、グリーソングレーディングシステムに関する）組織病理学的腫瘍グレード又はスコアとの直線的な相関関係であり得る。かかる実施形態では、段階ｂ）の決定は、検出信号又はこれらの信号を処理することで得られるデータを使用し、これらを前記標準曲線の一方の軸をなす標準曲線中の対応信号と比較することにより、「手作業」で行うことができる。標準曲線を使用することにより、対応する腫瘍グレード又はスコアは他方の軸上に見出すことができる。

別の実施形態では、標準曲線は、段階ａ）で検出した信号に基づいて腫瘍グレード又は腫瘍スコアの決定を自動的に実行するアルゴリズムの形態を有することが予想される。かかるアルゴリズムはさらに、腫瘍グレード決定の信頼レベルの評価を可能にする他の統計的分析を含むことがある。

第３の態様では、本発明は、ある癌タイプの腫瘍グレードを決定するための上述のようなアルゴリズム及び使用説明書を含むキットを提供する。

前立腺癌の発生及び進行に伴って起こる代謝変化を調べるためにはマウス前立腺のトランスジェニック腺癌（ＴＲＡＭＰ）モデルが特に有用である。これは、ＴＲＡＭＰマウスがヒトの疾患を模倣する組織病理学的疾患進行及び関連する代謝変化を実証するからである。以下の研究は、切除した悪性組織の組織病理学を参照基準として使用しながらＴＲＡＭＰマウスにおける前立腺癌の進行に伴う過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩代謝の変化を定量化することを示している。

ＭＲ検出
正常マウス（Ｎ＝５）及びＴＲＡＭＰマウス（Ｎ＝４初期原発腫瘍（低グレード腫瘍）、Ｎ＝５後期原発腫瘍（高グレード腫瘍）に関するすべての研究は、ＵＣＳＦ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコル（１）の下で実施した。この研究に含まれるすべてのマウスについては、過分極ＭＲ検査の１日以上前に、頸部の背面から延びる２８ｇのポートを一方の頸静脈中に外科的に植え込んだ。ＭＲ実験に際しては、マウスを１〜１．５％のイソフルランで麻酔し、硬質プラスチックコネクター（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、リバティービル、米国イリノイ州）を用いて長さ９０ｃｍの２４ｇ延長チューブを頸静脈ポートに連結した。この特殊延長チューブは、チューブ中に小さい死容積を維持しながら人体ＭＲスキャナー内で過分極剤を急速に注入することを可能にした。次に、循環水によって約３７℃に加熱した水充填式の恒温パッド上にマウスを載せ、特注の二重同調プロトン−炭素Ｔ／Ｒコイル内に配置した。コイルデザインは、５ｃｍの内径、８ｃｍの長さ、及びコイル内にいる間にマウスの目視監視を可能にするため上面に設けられた開放溝穴を有する¹Ｈ直交コイル内の直交¹³Ｃコイルからなっていた。装置全体を患者テーブル上に載せ、多核分光法パッケージを備えた３Ｔヒト用ＧＥスキャナーの内腔に配置した。

６ｃｍのＦＯＶ、１２８×１２８のマトリックス、１．５ｍｍのスライス厚さ（スライス間隔はゼロ）及びＴＥ＝１０２ミリ秒／ＴＲ＝４秒を有するＴ₂重み付き高速スピンエコーシーケンスを用いて矢状方向、軸方向及び冠状方向に沿って¹Ｈ−ＭＲ画像を取得した。国際公開第２００６／０１１８０９号に記載されているようにして¹³Ｃ₁−ピルビン酸塩を過分極させ（２１．７±２．０％）かつ溶解した（７．９±０．２）後、溶液を手早くＭＲスキャナーに輸送し、７９ｍＭ過分極ピルビン酸塩の３５０±５０μＬを１２秒かけてマウスに注入した。注入後直ちに、１５０μＬの食塩水でフラッシュして頸静脈カテーテル及びチューブから過分極ピルビン酸塩を排除した。小フリップ角励起、断熱再集束及びフライバックエコー−プレーナリードアウト軌道を有する二重スピン−エコーパルスシーケンスを用いて、６頭のＴＲＡＭＰマウス（３例の初期腫瘍及び３例の後期腫瘍）の頸静脈中へのピルビン酸塩注入開始から３５秒後にインビボ３Ｄ過分極¹³Ｃ−ＭＲＳＩデータを取得した（１〜２）。３Ｄ−ＭＲＳＩデータは、１４０／２１５のＴＥ／ＴＲ、８×８×１６のマトリックス、４０ｍｍ×４０ｍｍ×８６．４ｍｍのＦＯＶ（０．１３５ｃｍ³分解能）及び１４秒の取得時間を用いてマウスの腹部から取得した。

ＴＲＡＭＰマウスの病理学をプロトン画像と相互に関係づけるため、解剖に際してラップトップコンピューター上に矢状方向、冠状方向及び軸方向画像を表示した。解剖中にはデジタル写真及びビデオを撮影し、切除した組織は直ちに１０％緩衝ホルマリン中で固定した。続いて、固定した組織検体を７０％エタノール中に移動し、パラフィンブロックに加工した。組織ブロックをＬｅｉｃａミクロトーム上で５ミクロンの厚さに切片化した。切片をスライドガラス上で乾燥し、標準的なヘマトキシリン及びエオシンプロトコルを用いて染色した。正常、十分な分化（ＷＤ）、中程度の分化（ＭＷＤ）及び不十分な分化（ＰＤ）の％を用いて、腫瘍を初期（低グレード）及び後期（高グレード）のカテゴリーに分類した（表１）。また、％壊死も記録した（表１）。

データ分析及び腫瘍代謝プロファイルの生成
カスタムソフトウェアを用いてＭＲＩ／¹³Ｃ−ＭＲＳＩデータを処理しかつ整頓した。病理学に基づいて同定した前立腺癌の原発領域及び転移領域を、対応する高空間分解能の解剖学的画像上にトレースした。検査対象の組織タイプに関連するすべてのボクセルを、各々の代謝産物に関し、所定の周波数範囲にわたって積分した。すべての積分は、いかなる代謝産物も含まないスペクトル領域から計算したノイズによってスケーリングした。所定の代謝産物及び組織タイプに関するスケーリング済み積分を各検査についてまとめて平均することで、１つの代謝プロファイル（即ち、各検査についての乳酸塩、アラニン及びピルビン酸塩数の集合）を得た。ＪＭＰを用いて様々な検査からの平均値を統計的に比較することで、データに関する分散分析を行った。統計的な有意差が見出された場合には、多重比較のためのターキィ（Ｔｕｋｅｙ）補正を含むｔ検定を用いて４つの組織タイプをペア単位で比較した。加えて、同一動物からの多重検査を含むことによって導入されることがある何らかの相関関係を補正するため、すべての統計的検定中にランダムエフェクツ（Ｒａｎｄｏｍ Ｅｆｆｅｃｔｓ）モデルを組み込んだ。

結果
図１ないし図４は、正常なマウス前立腺（図１）、ＴＲＡＭＰマウス前立腺中の初期原発腫瘍（図２）、後期原発腫瘍（図３）及びリンパ節転移領域（図４）から採取した代表的なＴ₂重み付き軸方向画像（Ａ）、選択された病理学に対応する０．１３５ｃｃ過分極¹³Ｃスペクトルを示すグリッドを重ね合わせたＴ₂重み付き画像（Ｂ）、対応するスペクトル（Ｃ）、及びＨ＆Ｅ染色組織切片（Ｄ）を示している。図１に見られる通り、正常なマウス前立腺は非常に小さな器官（約０．０２２ｃｃ）であり、周囲組織からのスペクトル寄与を最小にしながらマウス前立腺を包囲するボクセルを選択するように注意しなければならない。これは、ゼロ充填スペクトルデータ（ダッシュドボックス、真の分解能は実線である）がマウス前立腺に最大限に重なり合うまでそれをボクセルシフトさせることによる後処理で達成された（１Ｂ）。対応する過分極¹³Ｃスペクトル（１Ｃ）は、ピルビン酸塩（１７３ｐｐｍ）並びにその代謝産物である乳酸塩（１８５ｐｐｍ）及びアラニン（１７８ｐｐｍ）に関する共鳴を示した。ピルビン酸塩共鳴が最大であり、それに続いて乳酸塩、アラニン、及びピルビン酸塩水和物に関する小共鳴が見られた。健常なヒト前立腺と同じく、マウス前立腺は、Ｈ＆Ｅ切片で示されるように管を包囲する腺上皮細胞が支質組織により結合されてなる腺器官である（１Ｄ）。

ＴＲＡＭＰマウスにおける初期前立腺腫瘍の発生に伴い（図２）、前立腺のサイズは顕著に増大し、２以上の０．１３５ｃｃボクセルを完全に腫瘍内に配置することが可能になった（２Ｂ）。対応する過分極¹³Ｃスペクトルでは、乳酸塩がピルビン酸塩以上のレベルにまで劇的に増加すると共に、ピルビン酸塩及びアラニン共鳴のピーク面積／ノイズ比が正常なマウス前立腺に比べて増加した。対応する組織病理学（２Ｃ）は、小さい腺細胞数の特徴的な増加及び管容積の減少並びに前立腺癌に伴う支質の肥厚を示した。

後期原発疾患（図３）では、腫瘍は非常に大きくなり、病理学では不規則な核及び核を取り巻く非常に少ない細胞質をもった多形性細胞の脱分化シートとなって現れると共に、管形態のほぼ完全な喪失及び壊死領域を示した（３Ｄ）。これらの腫瘍からは過分極¹³Ｃスペクトルのアレイを取得することが可能であり、スペクトルは非常に高い乳酸塩レベルを示し、乳酸塩／ピルビン酸塩比は初期疾患より顕著に大きかった（３．４対１．２）。また、これらの大きい腫瘍では代謝の不均質性が存在し、乳酸塩／ピルビン酸塩比の変動性及び壊死領域での非常に低下した代謝レベルが見られた（３Ｃ）。

図４は、後期腫瘍におけるリンパ節転移の代表的な症例を示している。過分極乳酸塩、アラニン及びピルビン酸塩レベルから見たリンパ節転移に関する過分極代謝所見は、初期腫瘍及び後期腫瘍で観察された所見の中間であった。これは、後期原発腫瘍に比べてリンパ節転移の不均質性が大きいことに原因するものであったろう（表１）。

図５は、ＴＲＡＭＰモデルにおける癌の発生及び進行に伴って起こった代謝変化及び組織学的変化をまとめて示している。図６は、正常な前立腺、初期腫瘍、後期腫瘍、及びリンパ節転移における過分極代謝産物／ノイズ比をプロットした棒グラフを示している。初期腫瘍は、乳酸塩の顕著な増加及び総過分極炭素信号（過分極乳酸塩、アラニン及びピルビン酸塩の和）の増加を示した。腫瘍が初期原発腫瘍から後期原発腫瘍に進行した場合、過分極乳酸塩信号／ノイズ比及び総過分極炭素信号は再び顕著に増加した。さらに重要なことには、図７中に乳酸塩Ｓ／Ｎ比を組織タイプに対してプロットした箱グラフは、正常組織、初期組織及び後期組織の間には個々の乳酸塩値の重なりが極めてわずかであるが、初期組織とリンパ節転移との間には重なりがあることを示していた。正常組織、初期腫瘍及び後期腫瘍の最良の分離は、過分極乳酸塩を総過分極炭素に対してプロットすることで得られた（図８）。ただ１つの正常検査例が初期腫瘍と重なっていたが、この正常検査例は他の正常例よりも高い乳酸塩及び総過分極炭素を有していた。

Claims (9)

1. 腫瘍のグレードを決定する方法であって、
   ａ）過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いて被験体における腫瘍のＭＲ検出を行う段階であって、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出する段階と、
   ｂ）前記信号及び任意には総炭素信号を用いて腫瘍の代謝プロファイルを生成する段階と、
   ｃ）段階ｂ）で生成した腫瘍の代謝プロファイルを特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルと比較する段階と、
   ｄ）腫瘍の前記代謝プロファイルと前記既知代謝プロファイルとの類似点及び相違点に基づいて腫瘍のグレードを決定する段階と
   を含んでなる方法。
2. 段階ｂ）において乳酸塩の信号及び／又は総炭素信号が使用される、請求項１記載の方法。
3. 既知代謝プロファイルが、過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いて被験体における腫瘍のＭＲ検出を行って、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出し、前記信号及び任意には総炭素信号を用いて腫瘍の代謝プロファイルを生成することで得られたものである、請求項１及び請求項２記載の方法。
4. 腫瘍のグレードを決定する方法であって、
   ａ）過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いて被験体における腫瘍のＭＲ検出を行う段階であって、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出する段階と、
   ｂ）前記信号及び任意には総炭素信号を用いることで、かかる信号と腫瘍グレードとの関係を示す標準曲線から腫瘍のグレードを決定する段階と
   を含んでなる方法。
5. 段階ｂ）において乳酸塩の信号及び／又は総炭素信号が使用される、請求項４記載の方法。
6. 当該方法が前立腺腫瘍のグレードを決定する方法である、請求項１ないし請求項５記載の方法。
7. 腫瘍のグレードを決定する方法で使用されるＭＲ造影剤を製造するための過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩の使用であって、前記方法が
   ａ）過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む前記造影剤を用いて被験体における腫瘍のＭＲ検出を行う段階であって、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出する段階と、
   ｂ）前記信号及び任意には総炭素信号を用いて腫瘍の代謝プロファイルを生成する段階と、
   ｃ）段階ｂ）で生成した腫瘍の代謝プロファイルを特定グレードの腫瘍の既知代謝プロファイルと比較する段階と、
   ｄ）腫瘍の前記代謝プロファイルと前記既知代謝プロファイルとの類似点及び相違点に基づいて腫瘍のグレードを決定する段階と
   を含んでなる、使用。
8. 腫瘍のグレードを決定する方法で使用されるＭＲ造影剤を製造するための過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩の使用であって、前記方法が
   ａ）過分極¹³Ｃ−ピルビン酸塩を含む造影剤を用いて被験体における腫瘍のＭＲ検出を行う段階であって、¹³Ｃ−ピルビン酸塩並びにその¹³Ｃ含有代謝産物であるアラニン、乳酸塩及び任意には重炭酸塩の信号を検出する段階と、
   ｂ）前記信号及び任意には総炭素信号を用いることで、かかる信号と腫瘍グレードとの関係を示す標準曲線から腫瘍のグレードを決定する段階と
   を含んでなる、使用。
9. 前記方法が前立腺腫瘍のグレードを決定する方法である、請求項７及び請求項８記載の使用。