JP2010528261A - 前立腺癌および肺癌の診断および治療方法 - Google Patents

Abstract

前立腺癌および肺癌を検出して治療するための方法が開示される。当該方法を実施するに際して、被験者試料がＧＰＲ１１０タンパク質またはそのＲＮＡ転写物に関してアッセイされ、そして被験者が前立腺癌または肺癌と関連したＧＰＲ１１０レベル上昇を示すか否かを確定するに際して、観察されたＧＰＲ１１０または転写物レベルが用いられる。このようなレベル上昇を有する患者は、本発明に従って、種々のＧＰＲ１１０関連免疫療法薬で治療され得る。

Description

本発明は、前立腺癌および肺癌に関連した遺伝子およびコードタンパク質、ならびに前立腺癌および肺癌を検出して治療するための方法および試薬に関する。

以下に列挙するのは、本発明の背景をまたは本発明の実施に際して用いられる方法を裏づける参考文献である。
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前立腺癌は、北米男性における最も一般的な悪性癌である。毎年、約２００，０００の新症例、ならびに３１，５００例の前立腺癌関連死が米国で生じると概算される。前立腺癌は、目下、男性における癌死の第二の主因である（第一位は肺癌である）。それは全男性癌の２９％、男性癌関連死の１１％を占める。

現在、ＦＤＡは、前立腺癌スクリーニング実験室試験として用いるための血清ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）を承認している。多数の血清腫瘍マーカーと同様に、ＰＳＡは、正常および癌性の両方の前立腺により産生される。前立腺癌を有する男性において、血清レベルは、限局性ならびに進行性または播種性の疾患により引き上げられ得る。ＰＳＡレベルは、一般的に癌の体積に比例する。癌で確認されるＰＳＡレベルと良性前立腺肥大症におけるレベルとの間の有意の重複が認められるため、低いまたは境界線上の上昇値の逐次レベルを得ることが重要である。

遊離ＰＳＡ（ｆＰＳＡ）試験の導入は、早期前立腺癌の同定に、より高レベルの特異性を導入した。１９９８年、ＦＤＡは、４．０〜１０．０ｎｇ／ｍＬの総ＰＳＡ値を有する男性のための診断補助手段としてｆＰＳＡ試験を承認した。これはしばしば、総ＰＳＡ試験に関する診断的グレイゾーンであって、ｆＰＳＡは層別化を手助けし得る。概して、任意の遊離ＰＳＡレベルでは、前立腺が肥大するほど、前立腺は癌性になる可能性が大きくなり得る。しかしながら、これらの試験は依然としてせいぜい定性的なものであり、より信頼できる種類の検出ならびに癌治療を病期分類するための手段が必要とされる。

前立腺癌は、他の形態の癌と同様に、遺伝的異常、すなわち突然変異により引き起こされる。突然変異体細胞では、増殖を促す因子と抑制する因子との間の正常平衡が乱され、その結果、これらの突然変異体細胞（腫瘍細胞の特徴）が継続的に増殖する。突然変異は、自発的に、または外部因子、例えば、化学的突然変異誘発因子、放射線またはウイルス組込み（導入遺伝子を含有することもしないこともあるゲノム外ＤＮＡを挿入する）により生じ得る。細胞性遺伝子は、点突然変異、挿入およびフレームシフト（例えば切頭化）、（機能的）欠失（例えばサイレンシング）、または転位（時として、遺伝子融合を引き起こし得る）により修飾され得る。このようにして、癌原遺伝子は癌遺伝子になり、これが増殖を促して、腫瘍抑制遺伝子は不活性化されるようになり、腫瘍増殖を誘導し得る。ＤＮＡにおける上記の変化の任意の組合せは、腫瘍形成の一因となり得る。これらの変化の成行きは、免疫系によるチェックで抑制されることもあり、されないこともあり得る（免疫監視機構）。

今まで、ＧＰＲ１１０レベルの変化と前立腺癌または肺癌との間の関連は実証されていない。このような関連は、多数の重要な診断的および治療的用途を示し得る。本発明に従って、（ｉ）ＧＰＲ１１０レベルは前立腺癌および肺癌の細胞中で有意に増大し、そして（ｉｉ）この増大は患者の血液または尿液試料で測定され得る、ということがここに発見された。

本発明は、一態様において、ヒト被験者における肺癌または前立腺癌に関するスクリーニング方法を含む。当該方法は、（ａ）被験者試料中のヒトＧＰＲ１１０またはそのＲＮＡ転写物のレベルをアッセイするステップと、（ｂ）ヒトＧＰＲ１１０またはそのＲＮＡ転写物のアッセイレベルが、複数の正常ヒト試料から確定した場合の正常ヒト被験者におけるそれぞれＧＰＲ１１０またはその転写物のレベルの少なくとも３倍であるか否かを確定するステップとを含む。任意に、当該方法は、アッセイレベルが正常レベルの少なくとも３倍である場合、被験者におけるそれぞれ肺癌または前立腺癌に関する独立した試験により肺癌または前立腺癌の存在に関してスクリーニングすることを含み得るが、この場合、独立した試験は、ステップ（ａ）および（ｂ）の前、これらと同時またはこれらの後に実行され得る。

被験者試料が肺または前立腺の組織学的組織試料である場合、ステップ（ａ）は、試料を、ＧＰＲ１１０エピトープを有する細胞に抗体を結合させるのに有効な条件下で、ＧＰＲ１１０エピトープに対して特異的な抗ＧＰＲ１１０抗体と接触させること、ならびに前記試料と関連した抗体のレベルを検出することを含み、ステップ（ｂ）は、被験者の肺または前立腺組織試料と関連した抗体の検出レベルが、正常個体から得られるそれぞれヒト肺または前立腺組織試料と関連した抗ＧＰＲ１１０抗体のレベルの少なくとも３倍であるか否かを確定することを含み得る。抗体は、配列番号１内のアミノ酸残基により表されるＧＰＲ１１０エピトープに対して特異的であり得る。抗体は放射性標識ＧＰＲ１１０抗体であり、ステップ（ａ）は限局性放射性標識のレベルを前記組織中でシンチグラフィーにより検出することを含み得る。

被験者試料が被験者の血液または血清試料である場合、ステップ（ａ）は、試料を、ＧＰＲ１１０エピトープに抗体を結合させるのに有効な条件下で、ＧＰＲ１１０エピトープに対して特異的な抗ＧＰＲ１１０抗体と接触させること、ＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗体を非結合抗体から分離すること、ならびにＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗体のレベルを検出することを含み、ステップ（ｂ）は、ＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗体の検出レベルが、正常個体から得られる血液または血清試料中に存在するＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗ＧＰＲ１１０抗体のレベルの少なくとも３倍であるか否かを確定することを含み得る。ステップ（ａ）は、血液または血清試料体液を固相イムノアッセイ装置に適用することを含み得るが、この場合、試料中のＧＰＲ１１０のレベルは比色的指標または蛍光定量的指標により定性的に示され、確定ステップは、指標を既知の標準と比較することを含む。

被験者試料が肺または前立腺組織試料である場合、ステップ（ａ）は、試料を処理して、そこからＲＮＡ転写物を抽出すること、ならびにＧＰＲ１１０タンパク質の少なくとも断片をコードするＲＮＡ転写物のレベルを検出することを含み、ステップ（ｂ）は、ＲＮＡ転写物の検出レベルが、正常個体から得られる肺または前立腺組織試料中のＧＰＲ１１０タンパク質の少なくとも断片をコードする転写物の検出レベルの少なくとも３倍であるか否かを確定することを含む。

別の態様において、本発明は、肺癌または前立腺癌の存在の検出方法における、肺癌または前立腺癌の診断に役立つ生物学的マーカーのレベルの低下または上昇の検出による改善を含む。改善は、（ａ）被験者試料中のヒトＧＰＲ１１０またはその転写物のレベルをアッセイするステップ；ならびに（ｂ）ヒトＧＰＲ１１０またはその転写物のアッセイレベルが、それぞれ肺癌または前立腺癌の存在の付加的指標として、複数の正常ヒト試料から確定した場合の正常ヒト被験者におけるそれぞれＧＰＲ１１０またはその転写物のレベルの少なくとも３倍であるか否かを確定するステップを含む。上記の方法の種々の好ましい実施形態は、本発明のこの態様にも同様に当てはまる。

例えば、改善は、総前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、遊離ＰＳＡおよびグリピカン３タンパク質（ＧＰＣ３）のうちの１つから選択される少なくとも１つのマーカータンパク質に対して特異的な抗体と被験者体液試料を反応させ、そして前立腺癌の指標として、被験者が前記マーカータンパク質のうちの少なくとも１つのレベル増大を示すか否かを確定することにより、ヒト男性被験者における前立腺癌の検出方法に用いられ得る。

さらに別の態様において、本発明は、前立腺癌の存在に関して被験者をスクリーニングするためのヒト被験者からの血液または血清試料中のＧＰＲ１１０の測定値ならびに総前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、遊離ＰＳＡおよびグリピカン３タンパク質（ＧＰＣ３）から選択される少なくとも１つのマーカー抗原の測定値の使用を意図する。

ヒト被験者における前立腺癌または肺癌に関してスクリーニングする、あるいは被験者における前立腺癌または肺癌を病期分類治療するために用いる診断装置であって、（ａ）被験者からの体液試料を受容するための構造と、（ｂ）ＧＰＲ１１０の選択ドメインまたはエピトープに対して特異的であり且つ前記構造と関連し、そして前記構造中に受容される体液と反応して、前記構造と関連した他の試薬と組合せて、エピトープまたはドメインを含有するＧＰＲ１１０試料タンパク質の存在を示す検出可能な反応を生じ得る抗体と、（ｃ）生じた検出可能な反応のレベルが前立腺癌または肺癌と関連したレベル増大として評価され得る既知の標準指標とを含む装置も開示される。装置は、より一般的には、ＧＰＲ１１０のレベル増大により特徴付けられる他の型のヒト癌をスクリーニングするかまたは病期分類するのに適用され得る。

装置中の構造は、試料がパッドに適用される場合に流体試料との反応のために、その中に包埋された抗体を有する多孔性パッドを含み、検出可能反応は比色的指標または蛍光定量的指標により示され、そして既知の標準指標は前立腺癌または肺癌と関連づけられるものに対応するエピトープまたはドメインを含有するＧＰＲ１１０のレベルを表す指示を含み得る。

装置は、産生されるＧＰＲ１１０のレベルに関連したシグナルを発生するための分光測光検出器、前記シグナルを前立腺癌または肺癌に関連した既知の標準シグナル値と比較するためのマイクロプロセッサー、ならびにマイクロプロセッサーの出力を表示するためのディスプレイを含み得る。

装置中の抗ＧＰＲ１１０結合タンパク質は、配列番号１または配列番号２内に含入されるエピトープに対して特異的な抗体であり得る。

ヒト被験者における前立腺癌に関してスクリーニングするのに用いるために、装置中の素子（ｂ）は、（ｉ）総前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、遊離ＰＳＡおよびグリピカン３タンパク質（ＧＰＣ３）のうちの１つから選択される少なくとも１つのマーカータンパク質に対して特異的であり、（ｉｉ）上記構造と関連した、そして（ｉｉｉ）前記構造中に受容される体液と反応して、前記構造と関連した他の試薬と組合せて、試料中のマーカータンパク質のレベルを示す検出可能な反応を生じ得る抗体をさらに含み、そして素子（ｃ）は、生じた検出可能なマーカータンパク質反応のレベルが前立腺癌の指標として、検出可能なＧＰＲ１１０のレベルと組合せて、評価され得る第二の既知の標準指標をさらに含み得る。２つの標準指標は、例えば値の組で整列され、各組は被験者における前立腺癌の予め決められた可能性を表す。

被験者における前立腺癌または肺癌の治療方法であって、（ａ）前立腺癌または肺癌の指標として、同一組織のヒト細胞中のそれぞれＧＰＲ１１０タンパク質またはＲＮＡ転写物の正常範囲と比較した場合、被験者からの癌組織細胞がＧＰＲ１１０タンパク質またはＲＮＡ転写物のレベル増大を示すか否かを確定することと、（ｂ）被験者がＧＰＲ１１０レベルのこのような増大を有する場合、細胞の増殖または成育可能性を抑制するために、それが前立腺癌細胞または肺癌細胞と免疫特異的に反応する場合に有効な治療的有効量のＧＰＲ１１０抗体を投与することとを含む方法も開示される。

ＧＰＲ１１０抗体は、配列番号１内に含入されるエピトープに対して特異的なヒトまたはヒト化抗ＧＰＲ１１０抗体であり得る。前立腺癌細胞または肺癌細胞の表面でＧＰＲ１１０と結合される場合に、前記抗体が抗体依存性細胞傷害性を促進するに際して有効であり得る。治療薬が前記細胞と結合されるかまたはその中に組み入れられるようになる場合、抗体は、癌細胞を殺すかまたは阻害するのに有効な治療薬をそこに接合し得る。

さらに、（ａ）被験者の抗原提示細胞をヒトＧＰＲ１１０ポリペプチドまたはその抗原性断片（単数または複数）に曝露するステップ、ならびに（ｂ）この曝露により、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８ Ｔｃ細胞傷害性リンパ球およびＣＤ８非細胞傷害性サプレッサーＴリンパ球のクローン拡張を刺激し、引き起こして、それにより、被験者におけるＧＰＲ１１０抗原特異的ＣＤ４ヘルパーＴ細胞、ＧＰＲ１１０抗原特異的ＣＤ８ Ｔｃ細胞傷害性リンパ球およびＧＰＲ１１０抗原特異的ＣＤ８非細胞傷害性サプレッサーＴリンパ球の拡張を生じるステップにより、前立腺癌または肺癌を有する被験者における腫瘍量を低減する方法が開示される。

曝露ステップは、細胞を活性化するのに有効な条件下で、ヒトＧＰＲ１１０ポリペプチドまたはその抗原性断片（単数または複数）に被験者の抗原提示細胞をｅｘ−ｖｉｖｏで曝露し、そして活性化細胞を被験者に注射することを含み得る。

代替的には、曝露ステップは、適切なアジュバント中に保有されたヒトＧＰＲ１１０ポリペプチドまたはその断片を被験者に注射することを含み得る。

一関連態様において、本発明は、適切なアジュバント中に保有されたヒトＧＰＲ１１０ポリペプチドまたはその断片（単数または複数）を被験者に注射することにより、前立腺癌または肺癌を有する被験者における腫瘍量を低減するための方法を含む。

さらに別の態様では、本発明は、前立腺癌または肺癌の治療に有効であり得る化合物に関するスクリーニング方法を含む。当該方法は、ＧＰＲ１１０タンパク質をその細胞表面に発現する細胞に一連の試験化合物の各々を付加するステップ（この場合、ＧＰＲ１１０アゴニストまたはアンタゴニストと細胞表面タンパク質との結合は、細胞状態の検出可能な変化を生じるために有効である）、そして付加された試験化合物の各々に関して、細胞状態のこのような検出可能な変化が起きたか否かを確定するステップを含む。

さらに別の態様において、本発明は、分析物ＧＰＲ１１０あるいはその断片または変異体に関する試験を含む。作用物質は、ＧＰＲ１１０または断片に対して特異的な抗ＧＰＲ１１０抗体、ならびに分析物ＧＰＲ１１０と結合される場合に存在する抗体の量を検出するかおよび／または定量するために用いられ得る、好ましくは抗体と共有結合されるアッセイタグまたは標識を含む。

本発明のこれらのおよびその他の態様、目的、利点および特徴は、以下でさらに十分に記載されるような本発明の詳細を読めば、当業者に明らかになる。

ＵＣＳＣゲノム・ウエブサイトブラウザのカスタマイズされたスクリーン印刷による図としての、マウスＧｐｒ１１０遺伝子座のゲノム解析機構を示す（ｍｍ８遺伝子アセンブリーの２００６年２月バージョン）。最上段：染色体１７上の塩基位置。「ＰｉｃｏＳＬ３」の下の緑色垂直ハンドルバーは、単一腫瘍（７５４Ｓ−２）から同定された遺伝子座中へのレトロウイルス組込みを表す。パブリックドメイン組込み部位（６８ＳＢ８_６５_Ｈ０７−１）を、「ＲＴＣＧＤ」の下に示す。 ヒト前立腺腫瘍（２Ａ）、良性前立腺肥大症（２Ｂ）および正常組織（２Ｃ）の免疫組織化学的染色（褐色）を示す。正常組織または良性前立腺肥大症では、一般的に、発現が全く認められないかまたは低発現が観察されたが、一方、腫瘍組織では、有意の過剰発現が認められた。ポリクローナルウサギ抗体血清は、配列番号１として本明細書中で定義されたヒトＧＰＲ１１０のアミノ酸残基１〜５９０内に見出されるエピトープと反応する。 抗ＧＰＲ１１０抗体（３Ａ）および抗ＰＳＡ抗体（３Ｂ）で染色されたヒト良性前立腺肥大症組織の免疫組織化学的染色（褐色）を示す。矢印は、ＧＰＲ１１０陽性およびＰＳＡ陰性である癌幹細胞の小群を指し示す。用いたＧＰＲ１１０ペプチド血清は、図２に記載したものと同一である。 ヒト肺腫瘍（４Ａ）および正常組織（４Ｂ）の免疫組織化学的染色（褐色）を示す。正常組織では発現は全く認められないかまたは低かったが、一方、腫瘍組織では、有意の過剰発現が認められた。用いたペプチド血清は、図２に記載したものと同一である。 アッセイの初期（５Ａ）および最終段階（５Ｂ）でのヒト被験者におけるＧＰＲ１１０レベルを確定するための固相診断装置を示す。 本発明に従って構築された前立腺癌または肺癌遺伝素質を診断するために有用な遺伝子チップの一部を示す。 正常および腫瘍肺組織の２つの異なる組において定量的ＰＣＲにより測定した場合のＧＰＲ１１０ ＲＮＡ発現を示す。遺伝子ＧＵＳＢを、内因性対照として測定した。各組の試料に関して、正常肺試料中の平均発現と比較して発現を算定した。

Ａ．定義
本明細書で特に示さない限り、以下の用語は、下記に示す定義を有する。

癌の「スクリーニング」とは、単独で、またはその他の診断情報と組み合わせてかのいずれかで、癌の有無、もしくは癌の可能性の増大を決定するか、または癌の種類、例えば、ＧＰＲ１１０発現のレベルの上昇を特徴とする肺癌を分類するのに使用することができる診断情報を意味する。

「肺癌または前立腺癌の診断となるその他の指標」とは、癌の存在もしくは程度もしくは種類を検出するかまたは特徴付けるのに使用することができる生物学的マーカー以外の診断テストを指す。例示的な指標として、Ｘ線、ＣＴスキャン、もしくはＭＲＩによる画像撮影法で得られる画像データ、または生検組織の組織学的観察結果が含まれる。

本発明による癌の「病期分類」処置は、検出されたＧＰＲ１１０のレベルに基づいて、個体の癌の段階を決定するステップ、および処置をその段階に合わせるステップを含む。４つの認められている癌の段階があり、これらは癌細胞の局在および組織化の程度によって定義される。さらに、癌を、多くのホルモンベースの治療に応答する早期、およびもっと後の、より重篤なアンドロゲン非依存期として定義してもよい。

「ＧＰＲ１１０のアッセイレベル」とは、野生型ヒトＧＰＲ１１０、または変異体（例えば、タンパク質のスプライス変異体もしくは突然変異型）、またはＧＰＲ１１０断片のアッセイレベルを指す。

「ヒトＧＰＲ１１０転写物のアッセイレベル」とは、野生型ヒトＧＰＲ１１０、または変異体（例えば、タンパク質のスプライス変異体もしくは突然変異型）、またはＧＰＲ１１０断片をコードするＲＮＡ転写物のアッセイレベルを指す。

ＧＰＲ１１０の「増大した」または「正常を超えた」レベルとは、例えば、免疫化学的な染色または検出によって決定されるような、正常な（癌でない）個体の個体群で測定されるタンパク質の検出可能なレベルの値よりも少なくとも約５０パーセント高い、タンパク質、またはその断片もしくは変異体のレベルを指す。好ましくは、ＧＰＲ１１０のレベルは、正常な患者由来の類似の試料についてのＧＰＲ１１０値よりも少なくとも３倍高い。

ＧＰＲ１１０ ＲＮＡ転写物の「増大した」または「正常を超えた」レベルとは、例えば、ＰＣＲ増幅および転写物の分離によって決定されるような、正常な（癌でない）個体の個体群で測定される転写物の検出可能レベルの値よりも少なくとも約５０パーセント高い、転写物のレベル量を指す。好ましくは、ＧＰＲ１１０のレベルは、正常な患者由来の類似の試料についてのＧＰＲ１１０値よりも少なくとも３倍高い。

「正常な（癌でない）個体の個体群で測定されるＧＰＲ１１０タンパク質またはそのＲＮＡ転写物の検出可能なレベルの値」とは、例えば、個体群、例えば５人以上、好ましくは１０人以上の正常な個体についてのそのような値の統計的平均もしくは平均値を指してもよく、または正常な個体の個体群における個体のＧＰＲ１１０タンパク質もしくは転写物について記録された最高値を指してもよい。そのような値は、下記のアッセイ法を用いて、選択された試料源、例えば、肺組織もしくは前立腺組織、または血液試料もしくは血清試料に由来するＧＰＲ１１０またはその転写物をアッセイすることによって容易に決定される。正常値は、ＧＰＲ１１０またはその転写物のレベルの上昇の存在についてアッセイされている組織または試料源と同じ種類の組織、例えば、肺組織もしくは前立腺組織、または試料源、例えば、血液試料もしくは血清試料から決定されるということが理解されよう。

「ＧＰＲ１１０アッセイ」とは、野生型もしくは変異体型のいずれかのＧＰＲ１１０タンパク質、もしくはそのエピトープのレベルもしくは存在を測定するか、またはＧＰＲ１１０タンパク質もしくはその断片をコードするＲＮＡ転写物のレベルを測定するアッセイを指す。

Ｂ．ＧＰＲ１１０タンパク質および発現
ヒトＧＰＲ１１０遺伝子は、生物学的機能および天然リガンドが未知である、推定上のオーファンの「接着クラス」Ｇタンパク質共役型受容体をコードする（参考文献１〜３）。ヒトＧＰＲ１１０遺伝子は、２つの公知のアイソフォームを有しており、染色体領域６ｐ１２．３に見出される。アイソフォーム１（ＮＭ＿１５３８４０．２）は、９１０アミノ酸（ＡＡ）および１０１２３４Ｄａの計算分子量（ＭＷ）を有する推定タンパク質（ＮＰ＿７２２５８２．２）をコードする。アイソフォーム２（ＮＭ＿０２５０４８．２）は、２１８ＡＡ、２４７４５Ｄａの計算ＭＷ、およびアイソフォーム１と比べて独特のＣ末端を有する推定タンパク質（ＮＰ＿０７９３２４．２）をコードする。マウスＧｐｒ１１０遺伝子（ＮＭ＿１３３７７６．１）は染色体領域１７Ｂ３に見出され、そのコードタンパク質（ＮＰ＿５９８５３７．１）は、９０８ＡＡおよび１０１３３８Ｄａの計算ＭＷを有する。ヒトＧＰＲ１１０タンパク質は、推定上の細胞表面７回膜貫通型タンパク質であり、Ｇタンパク質共役受容体のタンパク質分解部位（ＧＰＳ）ドメインおよびＳＥＡドメインだけでなく、Ｎ末端付近に数か所のＮ結合型グリコシル化部位と考えられる部位を含む。

Ｃ．癌遺伝子としてのＧＰＲ１１０の同定
癌遺伝子（癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子）は、プロウイルスタギングを用いることによって高スループットな方法で定義された。ウイルスは今のところヒトの癌の主要な原因として関係があるとされていないが、腫瘍ウイルスを用いた研究によって、多くの癌遺伝子およびプロト癌遺伝子の発見に至っている。プロウイルスタギングでは、癌遺伝子を含まないレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルスＭＬＶまたはマウス乳癌ウイルスＭＭＴＶ）をマウスに感染させる（４〜８）。最近、このアプローチの宿主範囲は、トランスポゾンの使用によって拡大されている（９，１０）。

レトロウイルス感染の間に、ウイルスは細胞ゲノムに組み込まれ、そのＤＮＡが遺伝子近傍または遺伝子内に挿入され、それによって様々な結果がもたらされる。すなわち、（ｉ）挿入部位がプロト癌遺伝子から離れ過ぎており、したがってそれを活性化しない。この場合、その細胞が選択されることはないと考えられる。（ｉｉ）プロウイルスが、プロト癌遺伝子の２００ｋｂ以内に挿入されるが、遺伝子内には挿入されない（タイプ１）。この場合、ウイルスプロモーターまたはウイルスエンハンサーのいずれかがプロト癌遺伝子の発現レベルを増大させる。（ｉｉｉ）ウイルスが遺伝子内に挿入され、その機能を破壊するかまたは変化させる（タイプ２）。プロト癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子でない遺伝子にタイプ１またはタイプ２の挿入事象のいずれかを含む細胞が選択されることはないと考えられる。組み込みによって腫瘍の形成がもたらされる場合、組み込み部位に隣接した遺伝子を同定し、プロト癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のいずれかとして分類することができる。この方法は、多くの新たなプロト癌遺伝子を同定するだけでなく、ウイルス癌遺伝子に対するそれらの相同性に基づいて発見された既知のプロト癌遺伝子を確認するのにも用いられている（７，８）。レトロウイルスが遺伝子内に着地し、遺伝子を切断または破壊する場合、腫瘍抑制因子をスコア化してもよい。これらの場合、抑制因子はハプロ不全であってもよく、または代わりに、もう一方の対立遺伝子上の突然変異がマウスによって自然発生的に与えられる。組み込み事象によって、切断された遺伝子産物のドミナントネガティブ効果またはアンチセンスもしくはマイクロＲＮＡの転写などの、より複雑な結果がもたらされる可能性もある。

Ｔリンパ向性ウイルスＳＬ３−３を用いたスクリーニングでは、Ｇｐｒ１１０遺伝子のイントロン１にプロウイルスの組み込みを含むマウス腫瘍を回収した（図１）。この組み込みによって、Ｇｐｒ１１０遺伝子の過剰発現が引き起こされる。この遺伝子のヒトオーソログがヒトＧＰＲ１１０遺伝子である。

Ｄ．ヒト腫瘍および正常組織におけるＧＰＲ１１０およびＲＮＡ転写物の発現
ＧＰＲ１１０抗体に対する抗原性エピトープがヒト前立腺の腫瘍で過剰発現しているのに対し（図２Ａ）、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）細胞および前立腺腫瘍細胞の正常対応物はＧＰＲ１１０タンパク質を発現していないかまたは弱くしか発現しておらず（図２Ｂ、２Ｃ）、このタンパク質の分布および／または局在量（密度）の増大がヒト前立腺癌の診断となるということを示している。時々、ＢＰＨ細胞の小さいサブセットがＧＰＲ１１０抗体で染色される（図３Ａ、矢印）。これらのＧＰＲ１１０陽性細胞はＰＳＡ発現を欠いており（図３Ｂ、矢印）、前立腺癌幹細胞として分類されていることと一致する。

さらに、ＧＰＲ１１０抗体に対する抗原性エピトープがヒトの肺の腫瘍でも過剰発現しているのに対し（図４Ａ）、これらの腫瘍細胞の正常対応物はＧＰＲ１１０タンパク質を発現していないかまたは弱くしか発現しておらず（図４Ｂ）、このタンパク質の分布および／または局在量（密度）の増大がヒト肺癌の診断となるということを示している。

より一般的に、本発明は、通常は弱くしかＧＰＲ１１０を発現または含有しない組織またはその他の被験者試料、例えば、血液または血清を、癌の存在および程度について検討するための方法を提供する。本方法は、前立腺組織および肺組織を検討するのに、例えば、ヒト被験者の前立腺癌および肺癌のサブタイプを決定するのに特に有用である。前立腺組織および肺組織を検討するために行なわれる１つの方法において、ＧＰＲ１１０の選択されたドメインまたはエピトープに特異的な標識抗体、例えば、蛍光標識抗体（下記Ｅ項参照）で組織を染色し、マーカーを組織細胞に付着させる。あるいは、未標識のＧＰＲ１１０抗体で組織を染色し、細胞に結合した抗体複合体を二次標識抗体、例えば、蛍光レポーター、比色レポーター、または金粒子レポーターを持つ二次抗体で標識する。その後、組織中の前立腺癌または肺癌の存在、程度、および段階を、正常な前立腺細胞または肺細胞におけるマーカーの分布および程度に関する検出可能マーカーの分布および／または程度の増大、ならびに典型的にはその両方に基づいて決定する。組織学的組織試料に対する抗体結合の度合いおよび程度をスコア化するためのスコア化法が周知である（例えば、「Ｌｏｄａシステム」）。本方法では、強度スコア２＋または３＋および％細胞染色スコア２または３が、抗ＧＰＲ１１０抗体で標識された肺腫瘍の３５〜４０％で観察された。前立腺腫瘍については、腫瘍の２０％が強度スコア１および％細胞染色スコア２を有していた。良性前立腺肥大症の試料については、抗ＧＰＲ１１０抗体で標識した場合、７０％が強度スコアおよび％細胞染色スコア共に０を有し、３０％が強度スコア「微弱」または１、％細胞染色スコア１を有していた。

肺癌におけるＧＰＲ１１０の役割を裏付けるために、（エキソン接合部（ＥｘＪ２−３）Ｔａｑｍａｎプローブを用いて）２つの異なる組の正常肺組織および腫瘍肺組織でＧＰＲ１１０ ＲＮＡ転写物のレベルを測定した。１組目の組織では、アッセイした１５の肺腺癌腫瘍のうちの４つ（２、３、６、および１３）が、正常肺試料よりも８倍から１００倍を超えて高いＧＰＲ１１０ ＲＮＡレベルを示した（図７Ａ）。２組目の組織では、４０の肺癌試料のうちの６つが、正常肺試料と比べた場合、５倍から３５倍までのＧＰＲ１１０の過剰発現を有していた（図７Ｂ）。これら６つの上昇した試料うちの４つ（２７、３３、３４、および３９）は、肺腺癌由来であったが、残りの２つ（２６および４０）は扁平上皮癌であった。全体として、両方の発現実験から、ＧＰＲ１１０発現の上昇はアッセイした肺腫瘍の約２０％で見られた。

Ｅ．抗ＧＰＲ１１０抗体の調製
この項は、下記の項でさらに記載されるように、診断および治療の目的のために有用な抗ＧＰＲ１１０抗体の産生を記載する。本発明で使用される抗ＧＰＲ１１０抗体を、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および／または組み換え抗体を産生するための任意の多様な従来法により得ることができる。特に診断的使用のための、１つの好ましい抗体は、周知のハイブリドーマ技法に従って調製されるマウスモノクローナル抗体である。簡潔に述べると、例えば、ＧＰＲ１１０遺伝子を発現させることによって、ヒトＧＰＲ１１０を最初に得てもよい。精製したＧＰＲ１１０タンパク質は免疫原として働く。あるいは、ＧＰＲ１１０の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。特に、ＧＰＲ１１０の選択されたエピトープまたはドメインに特異的な抗体を作製するために、そのドメインまたはエピトープを規定するペプチドを免疫原として使用してもよい。例示的な免疫原として、配列番号１内のアミノ酸残基によって表されるＧＰＲ１１０エピトープが含まれる。

診断的適用で有用な抗ＧＰＲ１１０抗体を、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）用の酵素などの検出可能レポーター、金粒子およびレポーター運搬リポソームなどの検出可能粒子、比色レポーターまたは蛍光レポーター、量子ドットナノ結晶粒子などの標識、放射性標識、ならびにレポーターで標識されたストレプトアビジン標識などの二次検出可能標識を付着させることができるビオチン標識などの標識を含む、多様な検出可能標識で標識してもよい。あるアッセイ形式では、未標識の抗ＧＰＲ１１０抗体、例えば、マウスＩｇＧ抗体を、標識抗体、例えば、標識抗マウスＩｇＧ抗体との反応により検出する。

治療的使用のために、ｉｎ−ｖｉｔｒｏでヒトリンパ球をＧＰＲ１１０で感作し、感作リンパ球を、永久分裂能を有するヒト由来ミエローマ細胞と融合させることによって、ＧＰＲ１１０に対する結合活性を有するヒトモノクローナル抗体を産生することができる。あるいは、抗原としてのＧＰＲ１１０をヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に投与して、抗ＧＰＲ１１０抗体産生細胞を得ることができ、その後ＧＰＲ１１０に対するヒト抗体を不死化した抗ＧＰＲ１１０抗体産生細胞から得てもよい。

また、治療的使用のために、細胞の表面での抗体キャリアの局在が、例えば、キャリアの細胞膜との融合による細胞膜の崩壊、および細胞内への治療薬剤の放出を引き起こすのに有効である場合、抗体を、毒素などの治療薬剤、錯体形態で固定された放射性標識金属、または抗腫瘍薬剤が充填されたリポソームなどのキャリア体に結合させてもよい（これらで誘導体化してもよい）。

さらにその他の方法において、報告されているような組み換え技術（例えば、米国特許第６，０９０，３８２号および第６，２５８，５６２号参照）によって、ＧＰＲ１１０抗原に特異的なヒト抗体またはヒト化抗体を調製することができる。

Ｆ．診断法および試薬
１つの態様において、本発明は、（ａ）被験者試料中のヒトＧＰＲ１１０またはそのＲＮＡ転写物のレベルをアッセイすること、および（ｂ）ヒトＧＰＲ１１０またはそのＲＮＡ転写物のアッセイレベルが、それぞれ、複数の正常ヒト試料から決定された正常ヒト被験者中のＧＰＲ１１０またはその転写物のレベルよりも少なくとも３倍大きいか否かを決定することによって、ヒト被験者の前立腺癌または肺癌をスクリーニングする方法を含む。アッセイレベルが正常レベルよりも少なくとも３倍大きい場合、本方法は、それぞれ、被験者中の肺癌または前立腺癌についての独立した試験によって、肺癌または前立腺癌の存在を検出するステップをさらに含んでもよく、その場合、独立した試験は、ステップ（ａ）および（ｂ）の前か、これらのステップと同時か、またはこれらのステップの後に行なわれてもよい。

例えば、独立した試験がＧＰＲ１１０アッセイに先行する場合、独立した試験が肺癌または前立腺腫瘍の存在を示す可能性があり、ＧＰＲ１１０アッセイは、癌の存在を確認するためにおよび／または癌がＧＰＲ１１０もしくはその転写物のレベルの増大を特徴とする種類であることを示すために、後で使用される。独立した試験がＧＰＲ１１０アッセイと同時に行なわれる場合、本方法は、ＧＰＲ１１０またはその転写物を含む２つ以上の癌マーカーを用いて被験者中の肺癌または前立腺癌を検出するアッセイ結果を提供する。第３の実施形態において、独立した試験は、肺癌もしくは前立腺癌の診断を検証するために、および／または癌がＧＰＲ１１０もしくはその変異体のレベルの上昇の存在を特徴とする種類であることを示すために、ＧＰＲ１１０アッセイの後に行なわれてもよい。

被験者試料が肺または前立腺の組織学的組織試料である方法の実施形態は上で記載されている。この実施形態では、試料を組織学的検討用に調製し、ＧＰＲ１１０エピトープを有する細胞に抗体を結合させるのに有効な条件下で、ＧＰＲ１１０エピトープに特異的な抗ＧＰＲ１１０抗体で染色する。試料と関連した抗体のレベルは、標準的な組織学的方法、例えば、全体的な染色もしくは蛍光の測定、または抗ＧＰＲ１１０抗体が放射性マーカーで標識されている場合、放射能レベルの測定により決定することができる。

被験者試料が血液試料または血清試料である方法の実施形態を下記に詳述する。この実施形態は、ＧＰＲ１１０エピトープに抗体を結合させるのに有効な条件下で、試料をＧＰＲ１１０エピトープに特異的な抗ＧＰＲ１１０抗体と接触させるステップ、ＧＰＲ１１０エピトープに結合した抗体を結合していない抗体から分離するステップ、およびＧＰＲ１１０エピトープに結合した抗体のレベルを検出するステップを含む。試料中のＧＰＲ１１０を捕捉するための固定化された抗ＧＰＲアッセイ物を有する固体ストリップアッセイ装置を下記に考察する。好ましい体液試料は、血液、尿、および唾液である。尿をアッセイする場合、前立腺癌または肺癌の徴候を示すＧＰＲ１１０のアッセイレベルは、典型的には約１ｎｇ／ｍｌ試料液よりも大きい範囲にある。

被験者試料が、ＧＰＲ１１０転写物のアッセイのための、肺組織または前立腺組織である、第３の一般的な実施形態は、図７Ａおよび７Ｂに関連して上で詳述されている。この実施形態では、組織試料を処理して、そこからＲＮＡ転写物を抽出し、少なくともＧＰＲ１１０タンパク質の断片をコードするＲＮＡ転写物のレベルを、ＰＣＲによる配列特異的増幅などの標準的な方法、または配列特異的プロープを含むその他の方法で、周知の方法に従って決定する。

より一般的には、前立腺癌または肺癌の存在、程度、または段階についての診断の補助としてのＧＰＲ１１０またはその転写物の検出を、単独でまたは前立腺癌もしくは肺癌と関連する追加のマーカータンパク質の検出およびスクリーニングと組み合わせて使用することができる。バイオマーカーまたはマーカータンパク質とは、バイオマーカーのその変化した発現、分布、または特定の形態が、疾患状態などの生理学的状況の存在、程度、または段階と相関する任意の検出可能な生物学的分子を指す。当業者によって理解されるように、バイオマーカーと生理学的状況の間に厳密な関連があることが必要なのではなく、バイオマーカーと生理学的状況の間に統計的に有意な関連が存在することだけが必要なのである。追加のバイオマーカーを、とりわけ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（総ＰＳＡもしくは遊離ＰＳＡまたはその両方を含む）、グリピカン３タンパク質（ＧＰＣ３）、およびその組み合わせより選択することができる。

追加のバイオマーカーがＰＳＡである場合、ＰＳＡのレベルまたは分布を、上で特筆したように、総ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、またはその組み合わせについて、当技術分野における方法に従って決定することができる。場合によっては、通常当技術分野では総ＰＳＡに対するｆＰＳＡの比として表される総ＰＳＡおよびｆＰＳＡのレベルを、ＧＰＲ１１０の検出と組み合わせて用いることができる。ＰＳＡの検査は、ＧＰＲ１１０を検出するのに使用されるのと同じかまたはそれとは異なる生物学的標本に対して行なうことができる。例えば、男性ヒト被験者の前立腺癌をスクリーニングする際に使用するために、上記方法のステップ（ａ）には、試料を前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に特異的な抗体と反応させて、試料中のＰＳＡのレベルに関連する反応産物を産生するステップが含まれてもよく、ステップ（ｂ）には、癌でないヒト試料中の正常範囲のＰＳＡと比較した場合のＰＳＡのレベルを決定するステップが含まれてもよい。

追加のバイオマーカーＧＰＣ３は、グリコシルホスファチジルイノシトールを介して細胞膜に固定されたヘパリン硫酸プロテオグリカンとして特徴付けられる。このタンパク質は６５．６ｋＤａの分子量を有し、ポリペプチド鎖は５８０アミノ酸残基を有する。プロテオグリカンのヘパリン硫酸鎖は、ヘパリン結合性成長因子と相互作用し、したがって細胞シグナル伝達における共受容体としての役割を果たすが、ＧＰＣ３は異なる方法でも結合し得る。胚発生において、ＧＰＣ３は、腎臓の分岐形態形成の間のＢＭＰおよびＥＧＦを介する効果を調整する。それは、四肢のパターン形成および骨格の発達におけるＢＭＰに対する細胞応答をも制御する。ＧＰＣ３タンパク質のレベルは前立腺癌組織で増大する。前立腺の特異的バイオマーカーとしてのその使用およびＧＰＣ３に特異的に結合する抗体によるようなその検出の方法は、共同所有された米国特許出願第１１／３２５，８４７号に記載されている。ＧＰＣ３を検出するための方法は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組み換え抗体などの、ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体を利用することができる。特に診断的使用のための、例示的な抗体として、周知のハイブリドーマ技法に従って調製されるマウスモノクローナル抗体が含まれる。簡潔に述べると、例えば、Ｌａｇｅ，Ｈら(Gene 188 (1997), 151-156)によって開示されたようなＧＰＣ３（ＭＸＲ７）遺伝子を発現させることによって、ヒトＧＰＣ３を最初に得てもよい。精製したＧＰＣ３タンパク質を免疫原として使用する。あるいは、ＧＰＣ３の部分ペプチドを感作抗原として使用することができる。部分ペプチドは、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸配列から化学合成によって得ることができる。限定ではなく、例として、利用し得る例示的なＧＰＣ３配列には、とりわけ、ＤＬＦＩＤＫＫＶＬＫＶＡＨＶＥＨＥＥＴ、配列番号３（エキソン４によりコードされた、アミノ酸残基３６５〜３８３）およびＬＡＹＤＬＤＶＤＤＡＰＧＮＳＱＱ、配列番号４（エキソン８によりコードされた、アミノ酸残基５２６〜５４１）が含まれる。ＧＰＣ３に対する抗体を産生するためのその他のペプチドは、ＧＰＣ３の公知の配列を考慮すれば、当業者には明白であると考えられる。

アッセイは、ＥＬＩＳＡ技術、ホモジニアスアッセイ（例えば、蛍光クエンチングを伴うもの）、およびＧＰＲ１１０抗原を固体支持体上にある抗ＧＰＲ１１０抗体で捕捉し、固定化された抗原−抗体複合体を二次抗ＧＰＲ１１０抗体、例えば、比色レポーターまたは金粒子レポーターを持つ二次抗体で標識する固相サンドイッチアッセイを含む、体液抗原を検出するのに用いられる多様なアッセイ法のいずれかによって実行してもよい。

図５Ａおよび５Ｂは、本発明の実施形態によって構築された、今述べた種類のサンドイッチ免疫アッセイを実行するのに好適な固相アッセイストリップを図解しており、このアッセイストリップが、それぞれ、最初と最後のアッセイの状態で示されている。通常１０で示されるストリップは、支持体の上流領域に試料適用域１４を有する多孔性の支持体またはパッド１２を、および下流領域に試料検出域１６を含む。試料適用域は、検出可能な抗ＧＰＲ１１０抗体試薬、例えば、金粒子で標識され、かつ結合していない、すなわち固定化されていない形でこの区域内に置かれた、抗ＧＰＲ１１０抗体を含む。この試薬を、１８のように、黒丸で示す。標識抗体試薬中の抗体と同じであるかまたはそれとは異なる可能性がある抗ＧＰＲ１１０抗体は、検出域内の固体支持体に固定化され、２０のように、「Ｙ字」形で示される。

検出域に隣接して位置し、体液試料中のＧＰＲ１１０の異なるアッセイレベルと対応する１つまたは複数の色付きまたは影付きの領域を有する参照域２２も示す。示した実施形態において、区域２２は、それぞれ、（ａ）癌と関連するレベルよりも小さいＧＰＲ１１０のアッセイレベル、（ｂ）癌と関連する、より低い閾値レベル、および（ｃ）領域２２の閾値層よりも実質的に高い、例えば、２〜３倍高いレベルと対応する３つの領域２２ａ、２２ｂ、および２２ｃを含む。これら３つの領域は、産生される検出可能な反応物のレベルを前立腺癌または肺癌と関連するレベルとして評価することができる公知の標準指標を提供する。全体的に、アッセイストリップおよび参照域は、ヒト被験者中の前立腺癌もしくは肺癌のスクリーニングでの使用のための、またはヒト被験者中の前立腺癌もしくは肺癌の病期分類処置のためのアッセイ装置を構成している。

作業では、試験されるべき公知の容量の体液試料を、ストリップの試料適用域（体液試料はこの区域内に拡散する）に添加し、抗体試薬を試料中のＧＰＲ１１０抗原と反応させて、抗原−抗体複合体を形成させる。その後、この複合体および結合していない抗体試薬は、毛細管現象によって検出域に向かって下流に移動し、そこで抗原−抗体複合体は、固定化抗体によって捕捉され、結合していない試薬は、２４で示されるような支持体の端まで運ばれる。理解できるように、体液中の抗原の濃度が高ければ高いほど、検出域内の捕捉される試薬の密度は高く、この区域の色または彩度は大きい。検出域で生み出されるこの色または彩度を、参照域の標準と比較し、前立腺癌または肺癌の有無と関連するＧＰＲ１１０の定量的レベルを決定する。閾値を超えるレベルのＧＰＲ１１０がアッセイで観察された場合、被験者をより高い確率で癌が存在するカテゴリーに分類することができ、被験者に追加の検査および／またはより頻繁な検査を推奨してもよい。

別の実施形態において、アッセイ装置は、上記のアッセイストリップと同様であるが、公知の参照指標が、（ｉ）アッセイストリップを受容するためのリーダースロット、（ｉｉ）アッセイストリップの検出域でアッセイ関連の光学条件を検出するための光源および光学検出、例えば、分光学的検出器、（ｉｉｉ）光学検出器からのシグナルを記録および処理し、このシグナルをＧＰＲ１１０のアッセイレベルに変換するエレクトロニクスまたはプロセッサーユニット、ならびに（ｉｖ）ユーザー用のディスプレイスクリーンまたはウィンドウを有するストリップ−リーダー型機器のリーダーによって提供されるアッセイストリップを含む。この機器は、検出された実際のＧＰＲ１１０体液試料を知らせ、オペレーターが、ディスプレイされた値をアッセイストリップまたは機器と共に提供された公知の標準指標レベルと比較して、被験者が前立腺癌もしくは肺癌と関連するＧＰＲ１１０レベルの増大を有するか否かということを評価するか、または処置設計の目的のために、考えられる癌の段階を評価するのを可能にし得る。あるいは、この機器自体が、蓄えられた公知の標準指標レベルを含んでもよく、それをアッセイレベルと内部比較して、前立腺癌もしくは肺癌と関連するＧＰＲ１１０レベルの増大が検出されているか否かを表示する出力を生み出すか、または癌の段階を表示することができる。

今記載したアッセイ装置を、多数のマーカータンパク質、特に、前立腺癌のスクリーニングまたは検出のために、総ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、および／またはＧＰＣ３と組み合わせてＧＰＲ１１０タンパク質を検出するためにどのように修正し得るかということが理解されよう。各マーカーをマーカー特異的抗体が収容された別々のストリップで測定してもよく、装置は、前立腺癌の指標としての検出可能なＧＰＲ１１０のレベルと組み合わせて、各々産生される検出可能なマーカータンパク質反応物のレベルを評価することができる公知の標準指標を提供する、多数の参照域をさらに含んでもよい。

あるいは、電子的なアッセイ装置で、多数のマーカーの参照値を、値の組、例えば、値の対として蓄えるかまたは表してもよく、その場合、組の中の各々の値は、蓄えられた組値に対して多値のアッセイ結果を解析することによって、この装置がより多くのマーカーとの相関に基づいて癌リスクを決定することができるように、所与のマーカーについての癌の指標値を表す。

Ｇ．癌と関連する遺伝子突然変異の同定
別の態様において、本発明は、ヒト被験者中の、前立腺癌または肺癌などの癌のリスクの増大と関連する突然変異を同定するための方法を提供する。下記の項は、前立腺癌または肺癌に関して記載されている。しかしながら、本方法を、ＧＰＲ１１０の発現の増大を伴うその他の癌に対して実施し得るということが理解されよう。本方法を実施する際、好ましくは異なる人種群および年齢群を代表する男性または女性由来の患者を含む、前立腺癌または肺癌を有するヒト被験者からゲノムＤＮＡを抽出する。検討されるＤＮＡの配列または領域は、特に（ｉ）ヒトＧＰＲ１１０遺伝子のエキソン１の１５ｋＢ以下の範囲内のプロモーターまたは５'ＵＴＲ領域、（ｉｉ）同遺伝子のエキソン１５の５ｋＢ以下の範囲内の３'ＵＴＲ領域、および（ｉｉｉ）同遺伝子のエキソン１〜１５の範囲内である。

この領域に沿った１つまたは複数の部位での遺伝子重複を含む突然変異を、正常な（野生型の）前立腺組織または肺組織から得られた同じ領域由来の配列と各々の配列を比較することによって同定する。好ましくは多くの野生型個体由来の配列を決定して、真の野生型配列を確保する。各々の抽出されたＤＮＡについて、患者および野生型の配列を比較し、患者配列中の突然変異、したがって前立腺癌または肺癌のリスクの増大と関連する可能性が高い突然変異を同定する。

多数のこれらの突然変異（例えば、少なくとも５０〜２００またはそれより多く）がひとたび同定されれば、それらを、個体の前立腺癌または肺癌に対する遺伝的素因をスクリーニングするのに有用な遺伝子スクリーニング装置、例えば、遺伝子チップを構築する際に使用し得る。１つの実施形態において、装置は、各々領域３４の断片３７のような結合した公知の配列断片を含む領域３４、３６などの一連の領域を有する図６の３０で示すような遺伝子チップを含む。この断片またはプローブは、好ましくは長さ２５〜７０塩基であり、各々前立腺癌または肺癌と関連する上で同定されたＧＰＲ１１０遺伝子の上流の突然変異のうちの１つを含む。遺伝子チップの構築およびそのようなチップを用いた突然変異配列の検出は周知である。

典型的な遺伝子スクリーニング手順では、患者細胞を入手し、ゲノムＤＮＡを抽出し、対象の配列領域を、蛍光化プローブを用いた標準的なＰＣＲで増幅する。その後、増幅した材料を、好適なハイブリダイゼーション条件下でチップアレイ配列と反応させ、アレイ表面を洗浄して、結合していない材料を取り除き、その後好適なチップリーダーでスキャンして、前立腺癌または肺癌と関連する任意の突然変異した配列を同定する。図は、４２に示した標識ゲノムＤＮＡ断片の、結合したプローブ分子４０を有するアレイ領域３８への結合を示す。このアレイ領域での蛍光シグナルの検出は、決定的に重要な意味を持つ上流ＧＰＲ１１０領域内の公知の遺伝子突然変異の診断となり、前立腺癌または肺癌に対する遺伝的素因の診断となり得る。

代わりの実施形態において、上記のように同定される突然変異を用いて、ゲノム突然変異の存在を同定することができる１組の分子反転プローブ（ＭＩＰ）を構築する。遺伝子突然変異を同定するためのＭＩＰの構築および使用が記載されている（例えば、参考文献１１参照）。

Ｈ．治療方法および製剤
本発明には、癌細胞内でのＧＰＲ１１０の発現上昇を特徴とする癌を、たとえばヒト被験者における腫瘍量を軽減させるなどして、治療するための方法も含まれる。下記のセクションでは前立腺癌または肺癌に関して説明するが、ＧＰＲ１１０の発現上昇を特徴とする他の癌にもこの方法を実施できることが理解されよう。

一つのアプローチのでは、ＧＰＲ１１０抗原を用いて、前立腺または肺の癌細胞に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に関与する免疫細胞を活性化させる。ＧＰＲ１１０抗原の例としては、全長のＧＰＲ１１０ペプチドや、たとえば配列番号１のうち１つからのアミノ酸配列を含むペプチドなど上記開示したＧＰＲ１１０ペプチドのうち１つのような抗原性ペプチドが挙げられる。これは、一実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦの存在下など細胞の活性化に有効な条件下、ｅｘ−ｖｉｖｏで、患者から得られた抗原提示細胞をＧＰＲ１１０抗原と曝露することによって行うこともできる。ｅｘ−ｖｉｖｏで活性化させた後に、細胞を患者の中に再導入する。このとき、これらの活性化細胞は腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞のクローン増殖の刺激に有効である。この免疫療法は、たとえば、米国特許第６０８０４０９号およびそれに引用されている関連文献に記載されている。

あるいは、ＧＰＲ１１０抗原を、ＧＭ−ＣＳＦを含むアジュバントなど、一般的には適切なアジュバント中に入れて、ワクチンとして患者に投与することもできる。このペプチドワクチンは、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８細胞傷害性Ｔｃリンパ球、およびＣＤ８非細胞傷害性サプレッサーＴリンパ球のクローン増殖を刺激して引き起こすのに有効であり、被験者の中でＧＰＲ１１０抗原特異的ＣＤ４ヘルパーＴ細胞、ＧＰＲ１１０抗原特異的ＣＤ８細胞傷害性Ｔｃリンパ球、およびＧＰＲ１１０抗原特異的ＣＤ８非細胞傷害性サプレッサーＴリンパ球の増殖を引き起こす。

注射に適した抗原含有組成物の調製法および細胞傷害性Ｔ細胞の免疫刺激に適した抗原用量は、免疫療法によるＴ細胞誘導についてのいくつかの特許および文献刊行物に記載されてきた。それらの方法を、前立腺癌または肺癌の治療用のＧＰＲ１１０抗原に関する本方法に適用できる。治療後に、一般的には、ＭＲＩまたはＣＡＴスキャンのような腫瘍を可視化する方法の組合せおよびＧＰＲ１１０自体を含む前立腺癌関連抗原または肺癌関連抗原のレベルによって、患者の癌の状態における変化をモニタリングする。

第２の一般的な免疫療法では、まず、上記の試験方法に従って、前立腺癌または肺癌と診断された患者のＧＰＲ１１０の値が上昇していることを確認する。被験者がこの試験で陽性を示す場合、その被験者に抗ＧＰＲ１１０抗体を投与して治療する。抗体は上記のように調製されたヒト抗体またはヒト化抗体であることが好ましく、適切な生理学的担体中で静脈注射または皮下注射によって投与される。抗体用量は１〜１０ｍｇ／注射であることが好ましく、１４日毎またはその程度の間隔で患者に治療を行う。治療期間中、上記のように、一般的には腫瘍を可視化する方法の組合せおよび前立腺癌関連抗原または肺癌関連抗原のレベルによって、患者の癌の状態における変化をモニタリングする。この治療は、薬剤療法または放射性同位元素療法を含む、前立腺癌または肺癌の他の治療と併用して行うことも可能であり、腫瘍の大きさに望ましい縮小がみられるまで続けることができる。そのＧＰＲ１１０抗体は、前立腺または肺の癌細胞の表面にあるＧＰＲ１１０と結合するときに抗体依存性の細胞の細胞傷害性を促進するために有効な、ヒトまたはヒト化の抗ＧＰＲ１１０抗体とすることもできる。抱合体が細胞に結合するまたは取り込まれるときに癌細胞を殺すかまたは阻害するために有効な毒素のような治療薬でこの抗体を誘導体化することもできる。

Ｉ．細胞に基づいた化合物スクリーニング
一般的に複数の発現系および試験を用いて、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の機能評価ならびにアゴニストおよびアンタゴニストとして働く化合物の同定を行う。参照１２〜１４には、ＧＰＣＲの薬剤化合物スクリーニングのための一般的で高処理な現行の手法が概説されている。大規模なスクリーニング計画では、一般的に、酵母、昆虫（バキュロウイルス）、アフリカツメガエル卵母細胞、および哺乳動物細胞系を含む、細胞に基づく組換え発現系を使用してＧＰＣＲを発現させてきた。ＧＰＣＲの薬理活性の測定は放射線標識したリガンドの結合を試験する手法で伝統的に行われてきたが、簡単な受容体結合は蛍光偏光法および蛍光共鳴エネルギー移動などの非放射性の方法を用いて検出することもできる。

下流のシグナル伝達経路へのＧＰＣＲの機能的な共役は、細胞内カルシウム動員などの下流事象を測定する標準的な試験によって評価することもできる。これらの細胞に基づく試験を用いて、目的とするＧＰＣＲを、たとえば、Ｇ_{ｑ１５／１６}（またはこれらの組合せ）のような天然に生じるプロミスカスＧタンパク質または改変したキメラのプロミスカスＧタンパク質と共に哺乳動物細胞内で発現させる。これら両方のＧタンパク質は多くのＧＰＣＲと共役してシグナル伝達事象を変換することができる。標準的なカルシウム感受性蛍光色素を使用して、細胞内カルシウムの増加を測定することができる。ｃＡＭＰやアラキドン酸など、より直接の二次メッセンジャーシグナル伝達分子を測定するために、ｃＡＭＰ結合部位がたとえばルシフェラーゼ融合遺伝子と連結しているような遺伝子リポーターベクターを使用することもできる。あるいは、蛍光に基づく系を使用して、Ｂ−アレスチン２など、ＧＰＣＲの脱感作に関与するタンパク質の移動を測定することもできる。その他の種類の発現系にはアフリカツメガエルのメラニン細胞内でのＧＰＣＲ発現が含まれ、この系ではメラニン細胞内に存在する内因性色素の分散または濃縮を検出することによってＧＰＣＲ活性を測定する。

本発明を特定の実施形態および適用例について記載したが、特許請求する本発明から逸脱しない様々な変更および修正が可能であることが理解されよう。

配列番号：１ ヒトＧＰＲ１１０タンパク質のＮ末端細胞外ドメイン（アイソフォーム１）（残基１〜５９０）
MKVGVLWLISFFTFTDGHGGFLGKNDGIKTKKELIVNKKKHLGPVEEYQLLLQVT
YRDSKEKRDLRNFLK
LLKPPLLWSHGLIRIIRAKATTDCNSLNGVLQCTCEDSYTWFPPSCLDPQNCYL
HTAGALPSCECHLNNL SQSVNFCERTKIWGTFKINERFTNDLLNSSSAIYSKYANGIEIQLKKAYERIQGFE
SVQVTQFRNGSIVA
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配列番号：２ ヒトＧＰＲ１１０タンパク質（アイソフォーム１）（残基１〜９１０）
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59849-8015.WO00/LEGAL14257934.1 26
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TGDSSDNIMLTQFVSNE

配列番号：３（アミノ酸残基３６５〜３８３、エキソン４にコードされる）
DLFIDKKVLKVAHVEHEET

配列番号：４（アミノ酸残基５２６〜５４１、エキソン８にコードされる）
LAYDLDVDDAPGNSQQ

Claims (24)

1. ヒト被験者における肺癌または前立腺癌に関するスクリーニング方法であって、
   （ａ）被験者試料中のヒトＧＰＲ１１０またはそのＲＮＡ転写物のレベルをアッセイするステップと、
   （ｂ）ヒトＧＰＲ１１０またはそのＲＮＡ転写物のアッセイレベルが、複数の正常ヒト試料から確定した場合の正常ヒト被験者におけるそれぞれＧＰＲ１１０またはその転写物のレベルの少なくとも３倍であるか否かを確定するステップと、
   を含む方法。
2. 前記被験者試料が肺または前立腺の組織学的組織試料であり、ステップ（ａ）が、前記試料を、ＧＰＲ１１０エピトープを有する細胞に前記抗体を結合させるのに有効な条件下で、ＧＰＲ１１０エピトープに対して特異的な抗ＧＰＲ１１０抗体と接触させること、ならびに前記試料と関連した抗体のレベルを検出することを含み、ステップ（ｂ）が、前記被験者の肺または前立腺組織試料と関連した抗体の検出レベルが、正常個体から得られるそれぞれヒト肺または前立腺組織試料と関連した抗ＧＰＲ１１０抗体のレベルの少なくとも３倍であるか否かを確定することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗体が配列番号１内のアミノ酸残基により表されるＧＰＲ１１０エピトープに対して特異的である、請求項２に記載の方法。
4. ステップ（ａ）における抗ＧＰＲ１１０抗体が放射性標識ＧＰＲ１１０抗体であり、ステップ（ａ）が限局性放射性標識のレベルを前記組織中でシンチグラフィーにより検出することを含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記被験者試料が被験者の血液または血清試料であり、ステップ（ａ）が、前記試料を、ＧＰＲ１１０エピトープに前記抗体を結合させるのに有効な条件下で、ＧＰＲ１１０エピトープに対して特異的な抗ＧＰＲ１１０抗体と接触させること、ＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗体を非結合抗体から分離すること、ならびにＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗体のレベルを検出することを含み、ステップ（ｂ）が、ＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗体の検出レベルが、正常個体から得られる血液または血清試料中に存在するＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗ＧＰＲ１１０抗体のレベルの少なくとも３倍であるか否かを確定することを含む、請求項１に記載の方法。
6. ステップ（ａ）が、血液または血清試料体液を固相イムノアッセイ装置に適用することを含み、前記試料中のＧＰＲ１１０のレベルが比色的指標または蛍光定量的指標により定性的に示され、前記確定ステップが前記指標を既知の標準と比較することを含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記被験者試料が肺または前立腺組織試料であり、ステップ（ａ）が、前記試料を処理して、そこからＲＮＡ転写物を抽出すること、ならびにＧＰＲ１１０タンパク質の少なくとも断片をコードするＲＮＡ転写物のレベルを検出することを含み、ステップ（ｂ）が、ＲＮＡ転写物の検出レベルが、正常個体から得られる肺または前立腺組織試料中のＧＰＲ１１０タンパク質の少なくとも断片をコードする転写物の検出レベルの少なくとも３倍であるか否かを確定することを含む、請求項１に記載の方法。
8. 肺癌または前立腺癌の存在に関するスクリーニング方法における、肺癌または前立腺癌の診断に役立つ生物学的マーカーまたは他の指標のレベル低下または上昇を検出することによる改善であって、
   （ａ）被験者試料中のヒトＧＰＲ１１０またはその転写物のレベルをアッセイすることと、
   （ｂ）ヒトＧＰＲ１１０またはその転写物のアッセイレベルが、それぞれ肺癌または前立腺癌の存在の付加的指標として、複数の正常ヒト試料から確定した場合の正常ヒト被験者におけるそれぞれＧＰＲ１１０またはその転写物のレベルの少なくとも３倍であるか否かを確定することと、
   を含む改善。
9. 前記被験者試料が被験者の肺または前立腺の組織学的組織試料であり、ステップ（ａ）が、前記試料を、ＧＰＲ１１０エピトープを有する細胞に前記抗体を結合させるのに有効な条件下で、ＧＰＲ１１０エピトープに対して特異的な抗ＧＰＲ１１０抗体と接触させること、ならびに前記試料と関連した抗体のレベルを検出することを含み、ステップ（ｂ）が、前記被験者の肺または前立腺組織試料と関連した抗体の検出レベルが、正常個体から得られるそれぞれヒト肺または前立腺組織試料と関連した抗ＧＰＲ１１０抗体のレベルの少なくとも３倍であるか否かを確定することを含む、請求項８に記載の改善。
10. 前記抗体が配列番号１内のアミノ酸残基により表されるＧＰＲ１１０エピトープに対して特異的である、請求項９に記載の改善。
11. ステップ（ａ）における抗ＧＰＲ１１０抗体が放射性標識ＧＰＲ１１０抗体であり、ステップ（ａ）が限局性放射性標識のレベルを前記組織中でシンチグラフィーにより検出することを含む、請求項９に記載の改善。
12. 前記被験者試料が被験者の血液または血清試料であり、ステップ（ａ）が、前記試料を、ＧＰＲ１１０エピトープに前記抗体を結合させるのに有効な条件下で、ＧＰＲ１１０エピトープに対して特異的な抗ＧＰＲ１１０抗体と接触させること、ＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗体を非結合抗体から分離すること、ならびに、ＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗体のレベルを検出することを含み、ステップ（ｂ）が、ＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗体の検出レベルが、正常個体から得られる血液または血清試料中に存在するＧＰＲ１１０エピトープに結合された抗ＧＰＲ１１０抗体のレベルの少なくとも３倍であるか否かを確定することを含む、請求項９に記載の改善。
13. ステップ（ａ）が、血液または血清試料体液を固相イムノアッセイ装置に適用することを含み、前記試料中のＧＰＲ１１０のレベルが比色的指標または蛍光定量的指標により定性的に示され、前記確定ステップが前記指標を既知の標準と比較することを含む、請求項１２に記載の改善。
14. 前記被験者試料が肺または前立腺組織試料であり、ステップ（ａ）が、前記試料を処理して、そこからＲＮＡ転写物を抽出すること、ならびにＧＰＲ１１０タンパク質の少なくとも断片をコードするＲＮＡ転写物のレベルを検出することを含み、ステップ（ｂ）が、ＲＮＡ転写物の検出レベルが、正常個体から得られる肺または前立腺組織試料中のＧＰＲ１１０タンパク質の少なくとも断片をコードする転写物の検出レベルの少なくとも３倍であるか否かを確定することを含む、請求項８に記載の改善。
15. ヒト男性被験者における前立腺癌の検出方法における、総前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、遊離ＰＳＡおよびグリピカン３タンパク質（ＧＰＣ３）のうちの１つから選択される少なくとも１つのマーカータンパク質に対して特異的な抗体と被験者体液試料を反応させ、そして前立腺癌の指標として、被験者が前記マーカータンパク質のうちの少なくとも１つのレベル増大を示すか否かを確定することによる、請求項８に記載の改善。
16. 前立腺癌の存在に関して前記被験者をスクリーニングするためのヒト被験者からの血液または血清試料中のＧＰＲ１１０の測定値ならびに総前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、遊離ＰＳＡおよびグリピカン３タンパク質（ＧＰＣ３）から選択される少なくとも１つのマーカー抗原の測定値の使用。
17. ヒト被験者における前立腺癌または肺癌に関してスクリーニングする、あるいは被験者における前立腺癌または肺癌を病期分類治療するのに用いる診断装置であって、
    （ａ）被験者からの体液試料を受容するための構造と、
    （ｂ）ＧＰＲ１１０の選択ドメインまたはエピトープに対して特異的であり且つ前記構造と関連し、そして前記構造中に受容される体液と反応して、前記構造と関連した他の試薬と組合せて、エピトープまたはドメインを含有するＧＰＲ１１０試料タンパク質の存在を示す検出可能な反応を生じ得る抗体と、
    （ｃ）生じた検出可能な反応のレベルが前立腺癌または肺癌と関連したレベル増大として評価され得る第一の既知の標準指標と、
    を含む装置。
18. 前記装置中の前記構造が、前記試料が前記パッドに適用される場合に流体試料との反応のためにその中に包埋された抗体を有する多孔性パッドを含み、前記検出可能反応が比色的指標または蛍光定量的指標により示され、前記既知の標準指標が前立腺癌または肺癌と関連づけられるものに対応するエピトープまたはドメインを含有するＧＰＲ１１０のレベルを表す指示を含む、請求項１７に記載の装置。
19. 産生されるＧＰＲ１１０のレベルに関連したシグナルを発生するための分光測光検出器、前記シグナルを前立腺癌または肺癌に関連した既知の標準シグナル値と比較するためのマイクロプロセッサー、ならびにマイクロプロセッサーの出力を表示するためのディスプレイをさらに含む、請求項１８に記載の装置。
20. 前記装置中の前記抗ＧＰＲ１１０結合タンパク質が配列番号１または配列番号２内に含入されるエピトープに対して特異的な抗体である、請求項１８に記載の装置。
21. 被験者における前立腺癌または肺癌の治療方法であって、
    （ａ）前立腺癌または肺癌の指標として、同一組織のヒト細胞中のＧＰＲ１１０またはその転写物の正常範囲と比較した場合、前記被験者からの癌組織細胞がＧＰＲ１１０タンパク質またはＲＮＡ転写物のレベル増大を示すか否かを確定することと、
    （ｂ）前記被験者がＧＰＲ１１０または転写物レベルのこのような増大を有する場合、細胞の増殖または成育可能性を抑制するために、それが前立腺癌細胞または肺癌細胞と免疫特異的に反応する場合に有効な治療的有効量のＧＰＲ１１０抗体を投与することと、
    を含む方法。
22. 前記ＧＰＲ１１０抗体が配列番号１内に含入されるエピトープに対して特異的なヒトまたはヒト化抗ＧＰＲ１１０抗体である、請求項２１に記載の方法。
23. 前立腺癌細胞または肺癌細胞の表面でＧＰＲ１１０と結合される場合に、前記抗体が抗体依存性細胞傷害性を促進するのに有効である、請求項２１に記載の方法。
24. 治療薬が前記細胞と結合されるかまたはその中に組み入れられるようになる場合、前記抗体が癌細胞を殺害するかまたは阻害するのに有効な治療薬をそこに接合した、請求項２１に記載の方法。