JP2010524501A - 昆虫細胞のための合成の発現ベクター - Google Patents

Abstract

本発明は、昆虫細胞中での天然様異種タンパク質の発現のための最適化された発現ベクターに関する。本発明の組成物は、組み合わせられた場合に異種タンパク質の発現および分泌の増大を生じる発現ベクターの要素を提示するヌクレオチド配列である。要素には、昆虫細胞中で機能的である、転写活性化因子、コアプロモーター、分泌シグナル、および３’非翻訳領域を定義する配列が含まれる。最適化されたベクターに含まれる要素は、全て合成によって導かれるか、または自然界に存在している昆虫配列の修飾された変異体である。

Description

本発明は、一般的には、昆虫細胞中での異種タンパク質の生産のための改良された発現ベクターの設計に関する。改良された発現ベクターは、元来合成のものであるか、または最適化された要素一連の調節要素からなり、高レベルでの組み換え体タンパク質の発現を提供するように組み立てられる。加えて、本発明は、ワクチン処方物中での使用のためにこれらの改良された発現ベクターを利用する組換え体サブユニットタンパク質の生産に関する。

組み換え体タンパク質を発現させ、分泌させるための多数の異種細胞発現システムが、開発されている。一般的には、真核生物宿主細胞をベースとするシステムが、適切な折り畳みと翻訳後修飾が必要な真核生物タンパク質の発現のために使用され、それにより、「天然様」タンパク質の生産が可能となる。一般的に利用されている主要な真核生物宿主細胞のタイプには以下；酵母を含む真菌、昆虫、植物、および哺乳動物の４種類がある。

使用される組み換え体タンパク質発現システムの選択は、所望の用途に応じて様々である。選択されるシステムは、所望のタンパク質産物の適切な折り畳みとプロセシング、一貫性、および生産性（コスト効果）のような重要な基準を満たさなければならない（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）６５：３６３−３７２）。昆虫細胞をベースとする発現システムは、培養の容易さ、浸透圧に対する高い耐性、および大規模な培養の際の副産物の濃度、および一般的には高い発現レベルに基づいて必要生産能力を満たす可能性がある（Ｉｋｏｎｏｍｏｕら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）６２：１−２０）。最近、昆虫細胞をベースとする発現システムの使用がより一般的となっている。これらのシステムは真核生物システムの所望の特性のうちのほとんどを提供するが、より低い商品原価のような利点も追加する。昆虫細胞システムは、昆虫ウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス）での宿主細胞の感染、または宿主細胞のゲノムへの発現プラスミドの組み込みによる安定な細胞株の作成のいずれかに基づく。

バキュロウイルス発現システム（ＢＥＳ）は、組み換え体タンパク質の発現に利用される主要な昆虫細胞培養システムとして浮上してきた。このシステムは、バキュロウイルスとして知られている昆虫ウイルス由来のベクターの使用に基づく。これらのベクターは、所望のタンパク質産物をコードする組み換え体ウイルスを作成するために使用される。組み換え体ウイルスは宿主昆虫細胞を感染させるために使用され、宿主昆虫細胞は、次いで所望の組み換え体タンパク質を発現する。クローニングの容易さと「生産時間」に関してはこのシステムには利点があるが、いくつかの欠点もまた存在する。ＢＥＳの使用における主要な課題は、これが宿主細胞のウイルス感染をベースとすることである。これは、感染の７２〜９６時間後に細胞の溶解と細胞死を生じる（Ｆａｒｒｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｇｅｎ．（１９９８）６０：６５６−６６３；Ｄｅｏ ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００６）４３：１２９−１３５）。結果として、感染の後期には、昆虫細胞のプロセシング機構は、所望の産物のプロセシングも低下してしまう程度にまで低下する。これにより、細胞が生成物を生産できる時間が限られ、生産される産物の形態変化につながる可能性があることがさらに重要である。さらには、細胞の溶解によって、所望の産物の質に影響を及ぼす可能性もある細胞性の酵素が放出されてしまう。

組み換え体タンパク質の発現のための安定に形質転換された昆虫細胞の使用は、ＢＥＳの使用の代換手段である。安定に形質転換された昆虫細胞株をベースとする発現システムは非溶解性であり、適切な折り畳みと翻訳後修飾を必要とする分泌型産物の安定した長期にわたる生産を提供する。培養培地への産物の分泌は、精製プロセスのためのより純粋な出発材料を提供し、基本的な方法で最終的なタンパク質産物を精製するのを可能にする。これにより、より高品質な産物が導かれる（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ ａｎｄ Ｓｈａｔｚｍａｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｕｓｉｎｇ Ｎａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（１９９９）ｐｐ．２８９−３３０）。

Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞発現システム（「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現システム」）は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターを含む発現ベクターとＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞（「Ｓ２細胞」）の使用に基づく確立されている異種タンパク質発現システムである（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．（１９７２）２７：３５３−３６５）。Ｓ２細胞は、ベクターの中に導入された異種配列に対応するタンパク質を発現する安定な細胞株を確立するために、これらのベクターで形質転換される（Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｈ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８９）３：８８２−８８９；Ｉｖｅｙ−Ｈｏｙｌｅ，Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）２：７０４−７０７；Ｃｕｌｐ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）（１９９１）９：１７３−１７７；米国特許第５，５５０，０４３号；同第５，６８１，７１３号；同第５，７０５，３５９号；同第６，０４６，０２５号）。この昆虫細胞発現システムは、様々な供給源に由来する多数のタンパク質の生産に成功していることが示されている。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞システムの中で発現させることが成功しているタンパク質の例としては、ＨＩＶ ｇｐ１２０（Ｃｕｌｐ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）（１９９１）９：１７３−１７７；Ｉｖｅｙ−Ｈｏｙｌｅ，Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）２：７０４−７０７）、ヒトドーパミンβ−ヒドロラーゼ（Ｂｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９６）３１３：５７−６４）、ヒト血管細胞接着タンパク質（Ｂｅｒｎａｒｄら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９４）１５：１３９−１４４）が挙げられる。これらの例のそれぞれにおいて、発現レベルはこれまでに利用されてきた他の発現システムよりも高かった。

高レベルの発現に加えて、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現システムは、天然様の生物学的機能を維持している異種タンパク質を発現できることが示されている（Ｂｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９６）３１３：５７−６４）、（Ｉｎｃａｒｄｏｎａ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｒｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．（１９９６）７：５９５−６１１）。より近年の例によって、この発現システムが天然様の構造を持つ分子を生産できることがＸ線結晶学実験によって示された（Ｍｏｄｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３）１００：６９８６−６９９１）、（Ｍｏｄｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４２７：３１３−３１９）、（Ｘｕら、Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ（２００５）６１：９４２−９５０）。他の２つの最近の刊行物では、高品質な産物を生産するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現システムの能力も明らかにされている。第１の報告においては、Ｓｃｈｍｅｔｚｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．（２００５）１７４：９４２−９５２）は、タンパク質の折り畳みと天然の立体構造について、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現したＥｐＣＡＭタンパク質に対してバキュロウイルスで発現したＥｐＣＡＭタンパク質を比較した。具体的には、ＢＥＳで発現したＥｐＣＡＭとＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現したＥｐＣＡＭが、変性したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現したＥｐＣＡＭに対して比較された。ＢＥＳで発現したＥｐＣＡＭは、変性させられていないＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現したＥｐＣＡＭタンパク質および変性したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現したＥｐＣＡＭタンパク質と比較して部分的に折り畳まれた状態であることが決定された。これは、ＢＥＳで発現したタンパク質が不完全に折り畳まれた状態であることを示している。一方、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現したＥｐＣＡＭタンパク質はより完全に折り畳まれた状態をとっていた。この論文の著者らは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現したタンパク質は「天然の」状態であると考え、一方、バキュロウイルスで発現したタンパク質はそうではないと考えた。第２の報告において、Ｇａｒｄｓｖｏｌｌら（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．（２００４）３４：２８４−２９５）は、Ｓ２細胞中でのウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）の発現により、ＣＨＯ細胞中で発現されたｕＰＡＲよりもグリコシル化（５箇所のＮ結合部位）に関してより均質な産物が生じたことを明らかにしている。

異種タンパク質の発現のための宿主細胞としてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞を利用した多数の研究に基づくと、これらの細胞は発現システムにおいて所望の多くの特性を有していることが明らかである。組み換え体タンパク質を生産させるためにこれらの細胞を利用した報文を精査すると、タンパク質産物の発現レベルは、通常は５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの範囲である。バイオテクノロジー製造の要求の高まりを満たすことができるタンパク質生産システムには、高い発現レベルが所望の。一貫して高いレベルの発現を得るためには、以下の宿主細胞株、増殖培地、または発現ベクターのうちの任意のものあるいはすべての最適化が必要であろう。

任意の異種タンパク質発現システムの開発には、所望の組み換え体タンパク質産物の発現を駆動する発現ベクター中に様々な調節制御要素（あるいは本明細書中以後、「調節要素」もしくは「制御要素」、または単に「要素」と呼ばれ、これにはそれぞれの単数形も含まれる）の組み立てが必要である。これらの調節制御要素には、転写活性化因子およびエンハンサー、転写開始因子および終結要素、翻訳開始および停止要素、ならびに分泌シグナルリーダー配列が含まれる。組み換え体タンパク質産物の分泌のための発現ベクターの５つの主要な調節制御要素は以下である：１）近位プロモーター、２）コアプロモーター、３）５’非翻訳領域、４）分泌シグナルペプチド、および５）３’非翻訳領域。これらの要素のそれぞれについて、任意の最適化がまず最初に別々に行われなければならない。一旦個々の要素が最適化されると、これらは組み立てられ、所定の要素の組み立てが適合し、所望の組み換え体タンパク質産物の効率的な発現を指示できることを確実にするために試験されなければならない。要素の様々な組み合わせの組み立てにおいて、複数の要素が「動作可能であるように連結される」こともまた重要である。「動作可能であるように連結される」は、多くの転写機能および翻訳機能が１つ１つの要素の処理の結果であるように、それぞれの個々の要素の機能、さらには、組み合わせられた要素の機能を維持する様式での様々な要素間での機能的連結をいう。したがって、「動作可能であるように連結される」は、様々な要素のヌクレオチド配列が連結され、連続しており、必要である場合には、適切なタンパク質をコードするリーディングフレームを維持するために連続するように連結されることを意味する。

成功を収めている発現ベクターが多く開発されているが、完全に最適化されたシステムはあまり一般的ではない。さらに、最も進化したシステムは自然界に存在している配列の使用をベースとし、すなわち、様々な調節要素が既存の（自然界に存在している）遺伝子配列からとられる。過去数年間にわたっては、合成配列の使用が最適化された発現ベクターを開発するための手段として使用されてきた。

「プロモーター」は、２つの基本的部分であるコアプロモーターと近位プロモーターからなる。プロモーターは所定の遺伝子のコード配列の上流に位置する。コアプロモーターは、所定の遺伝子の正確な転写開始を指示することができる最小ヌクレオチド配列と定義される。真核生物のコアプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体による開始の指示に関与している。コアプロモーターは、通常、転写開始部位（ＩＮＲ）をまたぐ配列、さらに具体的には、ＩＮＲの上流と下流の３５〜４５ヌクレオチドの配列（７０〜９０ヌクレオチドの全長）と線引きされる。コアプロモーターによって結合される領域には、以下の保存されている調節モチーフの１つ以上が含まれ得る：ＴＦＩＩＢ認識要素（ＢＲＥ）、ＴＡＴＡボックス、開始因子（ＩＮＲ）、モチーフテン要素（ｍｏｔｉｆ ｔｅｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＭＴＥ）、下流のプロモーター要素（ＤＰＥ）、および下流のコア要素（ＤＣＥ）。調節制御要素の中の特定のヌクレオチド配列は用語「要素」を含む当該分野で認識されている名称を持ち、そのような配列は、本明細書中では一般的な用語「モチーフ」と呼ばれ；特異的な当該分野で認識されている名称（例えば、ＢＲＥ、ＭＴＥ、ＤＰＥ、およびＤＣＥ）は引例での意味と同じ意味を本明細書中で持つが、それにもかかわらずこれらは本明細書中では「モチーフ」（例えば、「ＭＴＥモチーフ」）と呼ばれる。コアプロモーターの役割と組成、およびそれらの構成要素の個々のモチーフは、Ｏｈｌｅｒら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，（２００２）３：１−１２）、Ｓｍａｌｅ ａｎｄ Ｋａｄｏｎａｇａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３）７２：４４９−４７９），ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．（２００６）７：Ｒ５３）、Ｇｅｒｓｈｅｎｚｏｎら（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００６）７：１６１）、およびＪｕｖｅｎ−Ｇｅｒｓｈｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２００６）３４：１０４７−１０５０）によって概説されている。ＤＰＥモチーフ（Ｋｕｔａｃｈ ａｎｄ Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２０：４７５４−４７６４）とＭＴＥモチーフ（Ｌｉｍら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（２００４）１８：１６０６−１６１７）を定義している研究もまた報告されている。ほとんどの遺伝子のコアプロモーターにはこれらのモチーフの１つ以上が様々な組み合わせで含まれるが、これらのモチーフのいずれをも含まない遺伝子も小さい割合で存在する。いくつかの生物由来のコアプロモーターを精査すると、共通のコアプロモーター、またはコアプロモーターを含むモチーフの共通のサブセットは存在しないが、コアプロモーターの中に見られるモチーフであるＩＮＲモチーフがほぼ共通していることが明らかである（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．（２００６）７：Ｒ５３）。

真核生物の近位プロモーターは、一般的には、コアプロモーターのすぐ上流にある配列と定義される。近位プロモーターの長さには大きな開きがある。近位プロモーターはコアプロモーター領域に結合したポリメラーゼ開始複合体を順に活性化させる転写因子を動員する転写活性化因子モチーフからなる。転写活性化因子モチーフの性質と数は所定のプロモーターについて大きな開きがある。

プロモーターの最適化は、様々な要素もしくはモチーフの意図的置換および試験、合成のプロモーターライブラリーの使用、または個々の調節要素もしくはモチーフの無作為の置換によって行うことができる。最適化されたプロモーターまたは合成のプロモーターの開発のためのこれらの様々なアプローチの例が報告されている。Ｌｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１７：２４１−２４５）らの研究においては、筋肉特異的プロモーターの転写を駆動させるための、無作為に組み立てられた転写因子結合部位を評価するアプローチが報告された。Ｅｄｅｌｍａｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０００）９７：３０３８−３０４３）には、コアプロモーターの転写活性を強化する合成の近位プロモーターを選択するための、高スループットの選択手順が記載されている。Ｔｏｒｎｏｅら（Ｇｅｎｅ（２００２）２９７：２１−３２）は、ウイルスのプロモーター要素とヒトのプロモーター要素を組み合わせた、哺乳動物細胞中で使用される合成プロモーターのセットを構築した。合成の哺乳動物プロモーターは、様々な活性を持つプロモーターを得るために、コンセンサス配列が置換され、他の非コンセンサス配列が無作為化されることによってさらに最適化された。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ中での遺伝子発現のための合成のプロモーターの開発においては、Ｒｕｄら（Ｍｉｃｒｏｂ．（２００６）１５２：１０１１−１０１９）は、プロモーターの性能を改善するために、調節要素の間のスペーサー配列が無作為化された調節要素のコンセンサス配列を利用した。この様式で、彼らは高い活性を持つ合成のプロモーターを同定することができた。Ｊｕｖｅｎ−Ｇｅｒｓｈｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００６）３：９１７−９２２）らによる研究においては、最適化されたコアプロモーターの開発が、様々なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子とウイルス遺伝子に由来するコアプロモーターモチーフを組み合わせることによって行われた。この研究はコアプロモーターのＭＴＥモチーフ（Ｌｉｍら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（２００４）１８：１６０６−１６１７）の使用に集中していた。このストラテジーによって、高い転写活性を持つコアプロモーターが得られた。これらの報告に基づくと、どの調節要素および構成要素であるモチーフが機能性プロモーターを構成するかを実験により決定する必要があることが明らかである。これには、モチーフのどの組み合わせが使用されるか、どの順序でモチーフが組み立てられるか、モチーフと要素がどの方向で挿入されるかが含まれる。利用されるモチーフまたは要素が、合成配列をベースとするものであるか、または最適化された配列をベースとするものであるかは必須である。プロモーターの最適化によっては発現の改善が生じるが、プロモーターは完全に機能性である、最適化された発現ベクターに必要な調節要素の１つの態様を提示するにすぎない。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の配列は、真核生物ｍＲＮＡからの遺伝子発現の転写後調節において重要な役割を担っている。様々なモチーフの配列の可変性と重要性、ならびにｍＲＮＡの５’ＵＴＲ領域の特徴は報告されている（Ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）２３５：９５−１１０）およびＫｏｚａｋ，Ｇｅｎｅ（２００５）３６１：１３−３７）。５’ＵＴＲの性質はメッセージの安定性と翻訳効率において役割を担っている。所定のｍＲＮＡの安定性と翻訳可能性は、組み換え体タンパク質を効率よく発現する能力に影響を与えるであろう。したがって、組み換え体タンパク質の最適生産のための発現ベクターの設計には、５’ＵＴＲが、所定の宿主細胞システムにおいて効率的な様式で機能するその能力について評価されることが必要である。５’ＵＴＲは、記載されたようにｍＲＮＡの重要な部分であり、遺伝子プロモーターの３’末端に含まれるＤＮＡ配列によってコードされる。したがって、プロモーターのＤＮＡ配列を定義する状況においては、これには通常、５’ＵＴＲ配列（ＩＮＲから開始メチオニンコドンまでの領域）が含まれる。

５’ＵＴＲを伴うｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の配列は、遺伝子発現の転写後調節において重要な役割を担っている。３’ＵＴＲの性質は、メッセージの安定性、核から細胞質への輸送、および細胞内局在化において役割を担っている。これらの因子はそれぞれ、所定のメッセージの翻訳効率に対して、最終的にはタンパク質の発現レベルに対して影響を及ぼす可能性がある。したがって、組み換え体タンパク質の最適生産のための発現ベクターの設計には、３’ＵＴＲが所定の宿主細胞システムにおいて効率的な様式で機能するその能力について評価されることが必要である。

細胞から分泌されるほとんどのタンパク質は、タンパク質を細胞の分泌経路に向けるＮ末端シグナル配列を含む。真核生物細胞中では、分泌シグナルまたはシグナルペプチドは小胞体膜と相互作用して分泌プロセスを開始させる。真核生物のシグナル配列は、Ｎ末端から始まってＣ末端に向かって、それぞれ、塩基性領域、疎水性領域、および極性領域の３つの構造的領域に分けられている（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８６）１４：４６８３−４６９０）および（Ｂｅｎｄｔｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４）３４０：７８３−７９５）。長年にわたって、多数の分泌シグナルが同定され、組み換え体タンパク質の分泌を指示するために使用されている。多くの様々なシグナル配列が使用され、機能性であることが示されているが、所定の細胞のタイプについての最適な配列を定義している報告はわずかしかない。３つの構造領域に関する一般的特性と役割は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８６）１４：４６８３−４６９０）によって、およびＢｅｎｄｔｓｅｎら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４）３４０：７８３−７９５）によって詳細に記載されているように十分に確立されているが、どれが最適な分泌シグナルを構成するかに関して比較できる実験データはほとんど存在しない。ほとんどの報文では、グラム陽性細菌または酵母の分泌シグナルの特性決定と最適化が取り扱われている（Ｌｅ Ｌｏｉｒら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．（２００５）４：２、およびＨｏｆｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｇｅｎｅ（１９９１）１０１：１０５−１１１）。ＩＬ−２分泌シグナルの最適化が記載されている１つの報告では、最適化の利点が明確に示されている（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．（２００５）７：３５４−３６５）。

多量の高品質な組み換え体タンパク質を生産することができる安定な細胞株を作成するために昆虫細胞において使用される最適化された発現ベクターの開発には、発現させられる異種タンパク質の転写と翻訳を駆動させるために使用することができる適切な調節要素（コアプロモーター要素を含むがこれに限定されない）の同定が必要である。さらに、合成の調節要素を設計することができ、発現ベクターの機能をさらに最適化するために利用することができる。Ｌｉｍら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（２００４）１８：１６０６−１６１７，Ｋｕｔａｃｈ ａｎｄ Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２０：４７５４−４７６４）、およびＪｕｖｅｎ−Ｇｅｒｓｈｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２００６）３４：１０４７−１０５０の開示は、コアプロモーター要素、具体的には、ＴＡＴＡボックス、ＩＮＲ、ＭＴＥ、およびＤＰＥモチーフの新規の配列もしくは異種配列、および／またはそれらの間隔を明けることに限定されている。組み換え体タンパク質の発現の調節制御の完全な最適化には、コアプロモーターの中のモチーフだけではなく、複数の調節要素が最適化されることが必要である。

Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａならびに他の昆虫についての多くの調節要素が公知であるが、どれが昆虫細胞中での異種タンパク質の発現のための最適な要素を構成するかはわかっていない。現在の技術と方法により、現在の豊富な知識に基づいて発現ベクターになるように調節要素を組み立てられる可能性が提供される。可能性はあるが、全ての試みがそのような成功に至っていないことは良く知られていることである。１つの細胞のタイプにおいて機能する組み換え体発現調節要素は、必ずしも別の細胞のタイプにおいても機能するわけではない。例えば、Ｏｌｓｅｎら（非特許文献１）は、Ｓ２細胞中での異種タンパク質の発現を駆動するプロモーターのシリーズ能力を評価し、試験された全てのプロモーターが他の細胞のタイプにおいて機能することが示されているにもかかわらず、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＭｔｎＡだけがマイクログラム量の産物を生じたことを見出した。別の例においては、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒｏｎ細胞中で十分に機能するＩＥプロモーターをベースとするＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ発現ベクター（Ｆａｒｒｅｌｌら、非特許文献２）は、Ｓ２細胞中での異種タンパク質の発現を適切に駆動することができなかった（未公開データ）。したがって、Ｓ２細胞を使用して高レベルの高品質な異種タンパク質を一貫して発現する可能性を決定するための系統的評価が必要である。バイオテクノロジーの分野では、好ましい商品原価で組み換え体タンパク質を効率的に生産する能力が成功のための重要な鍵である。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞を使用してこの目的を達成するためには、適切な発現ベクターのさらなる開発が必要である。

付加的な利点が得られる適切な様式での複数の調節要素の組み合わせは、発現ベクターの有用性をさらに高めることができる。したがって、解決されるべき技術的問題点は以下である：（１）昆虫細胞中での多量の高品質な組み換え体タンパク質の発現を駆動することができる発現ベクターの中に含められる調節要素の同定、（２）機能が改善された機能的調節要素の合成バージョンの設計、および（３）組み合わせによりタンパク質発現の生産性の付加的増大を生じる複数の調節要素の最適な組み合わせの決定。安定な昆虫発現システムにおけるさらなる改良によっては、多量の高品質なタンパク質が必要である場合のタンパク質の製造に関する、例えば、感染性疾患（例えば、インフルエンザ）またはバイオ・テロリズムの可能性がある生物に対するサブユニットワクチンの生産のための細胞をベースとするシステムにおいて、新しい基本骨格を提供できる可能性がある。

Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９２）１０：１５７−１６７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９８）６０：６５６−６６３

本発明により、安定に形質転換された昆虫細胞中での異種組み換え体タンパク質の高レベルの発現を提供するように組み合わせられた合成の調節要素と最適化された調節要素からなる発現ベクターが提供される。具体的には、本発明は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｓ２細胞が宿主細胞として使用される場合の異種タンパク質の発現に関する。

以下に記載されるｐＨＢＩ−１０（配列番号１０）発現ベクターとｐＨＢＩ−１１（配列番号１１）発現ベクターは以下：近位プロモーター、コアプロモーター、５’ＵＴＲ、分泌シグナル配列、および３’ＵＴＲ、の５つの調節要素からなる。これらの５つの要素は、発現カセットを作るように動作可能であるように連結される。発現カセットに含まれるこれらの調節制御要素は、それぞれが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中での使用のために最適化される；しかしながら、本発明の調節要素を定義するヌクレオチド配列は、これらの配列の最適化された性質または合成の性質が原因で、自然界においてはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａゲノム配列中には見られない。

本発明の発現ベクターは、異種タンパク質の高レベルでの発現と、異種タンパク質の形質転換された細胞の培養培地中への分泌を指示することができる。具体的には、記載される発現ベクターには、１）合成の最適化された誘導性の近位プロモーター、２）合成の最適化されたＲＮＡポリメラーゼＩＩコアプロモーター、３）短縮型の最適化された５’ＵＴＲ配列、４）合成の最適化された分泌シグナル配列、および５）最適化された３’ＵＴＲ配列が含まれる。

本発明によって、異種遺伝子配列を最適化された発現ベクターにクローニングし、天然様の構造を維持している組み換え体タンパク質の高レベルの分泌を生じる昆虫細胞を形質転換するために最適化された発現ベクターを利用するための方法も提供される。

３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥ−ＳＣＰ１−ＴｏｌｌｏＭＴＥ−Δ１１１合成プロモーターの配列。近位プロモーター領域とコアプロモーター領域中にある調節モチーフがそれぞれ示される。 ３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥ−ＳＣＰ７合成プロモーターの配列。近位プロモーター領域とコアプロモーター領域中の調節モチーフがそれぞれ示される。 ｐＭＴｔＰＡ発現ベクター、ｐＨＢＩ−１０発現ベクター、およびｐＨＢＩ−１１発現ベクターの比較。それぞれのベクターについての調節制御要素が図３に列挙される。 ｐＨＢＩ−１０プラスミドマップ。完全なプラスミドのプラスミドマップが示される。ｐＨＢＩ−１０ベクターには、ＴｏｌｌｏＭＴＥ−Δ１１１合成コアプロモーターが含まれる。 ｐＨＢＩ−１１プラスミドマップ。完全なプラスミドのプラスミドマップが示される。ｐＨＢＩ−１１ベクターには、ＳＣＰ７合成コアプロモーターが含まれる。

本発明により、発現するタンパク質の遺伝子配列を持つこれらの発現ベクターで安定に形質転換された昆虫細胞からの高レベルの高品質なタンパク質の発現を駆動するために使用される発現ベクターになるように組み合わせられた、一連の最適化された調節要素が提供される。合成の調節要素と最適化された調節要素の単一の発現ベクター中での使用によっては、発現される産物について好ましい商品原価を提供するレベルで、安定な昆虫発現システム中で組み換え体タンパク質を確実に、かつ迅速に生産する能力が生じる。

用語「調節要素」（または「調節制御要素」もしくは「制御要素」もしくは単に「要素」）は、所定の遺伝子配列の結果であるタンパク質産物の発現に関与している転写プロセスおよび／または翻訳プロセスにおいて公知の機能を持つ、発現ベクター中のセグメントをいう。調節要素は、結合部位として、または移行部位をマークするかのいずれかとして作用する定義された配列をいう用語「調節モチーフ」（または単に「モチーフ」）とは区別される。一般的には、調節要素は複数の調節モチーフからなる。

用語「合成の」調節要素は、自然界に存在するとは認められていない配列をいう。さらに具体的には、本明細書中に記載される合成の要素は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのゲノム配列中には見られない。用語「最適化された」調節要素は、自然界に存在している配列から導かれ、それらの機能が高まるように変更された配列をいう。最適化された調節要素の特異的配列は、最適化された配列が導かれた配列の自然界に存在している変異体は示さない；したがって、最適化された調節要素（およびその中のモチーフ）もまた合成と呼ぶことができる。

「発現カセット」は、動作可能であるように連結される他の転写調節制御要素および翻訳調節制御要素とのプロモーター要素の組み合わせを意味する。異種遺伝子配列は、上記遺伝子配列の発現の目的のために発現カセットに挿入することができる。発現カセットは、所望の遺伝子産物のｍＲＮＡの生産を生じる転写を指示することができる。発現カセットは発現ベクターを生じるようにプラスミドに挿入される。そのような発現ベクターは、宿主細胞中での異種タンパク質の発現を指示する。

用語「形質転換された」は、細胞のＤＮＡを介する形質転換をいう。これは、導入されたＤＮＡの細胞のゲノムへの組み込みの後に安定な細胞株を生じるプロセスにおける、昆虫細胞へのプラスミドＤＮＡの導入をいう。この用語は、用語「トランスフェクション」の代わりに使用され、「トランスフェクション」は同じ状況でしばしば使用される。本発明者らは、もともとはトランスフェクションと呼ばれる培養された細胞へのウイルスＤＮＡ導入とは区別するために、培養された細胞へのプラスミドＤＮＡの導入について用語「形質転換」を使用する。本発明の発現ベクター中にはウイルスＤＮＡ配列は存在せず、これらの発現ベクターの細胞への導入によってはウイルス様粒子の生産または細胞の溶解は生じないので、用語「形質転換された」が好ましい。

「発現」または「発現された」は、細胞に付随する産物として、または培養培地中の分泌型産物として容易に検出することができる組み換え体タンパク質産物を生産させるための、発現ベクターと宿主細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞）を使用するタンパク質の生産を意味する。

「分泌」は、培養された宿主細胞から培養培地への発現された組み換え体タンパク質の分泌を意味する。発現され、分泌されたタンパク質は、配列が所定のタンパク質をコードするように発現カセットに動作可能であるように連結された所定の遺伝子配列の結果である。

用語「産物」は、その産物をコードする遺伝子配列を持つ発現ベクターがその中に導入された宿主細胞によって発現される、任意の組み換え体タンパク質、その全長またはサブユニットをいう。

昆虫細胞は、適切に折り畳まれた、翻訳後修飾されたタンパク質を発現する能力を提供するが、一方では簡単であり、比較的安価な増殖条件を提供する、別の真核生物発現システムである。安定に形質転換された昆虫細胞発現システムの使用によっては、宿主昆虫細胞のバキュロウイルス感染をベースとするものを上回る利点が提供される。これに基づいて、Ｓ２細胞が選択された昆虫細胞宿主として選択された。結果として、安定に形質転換された昆虫細胞について発現ベクターを最適化する試みは特異的なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子ならびに完全なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａゲノムの分析によって導かれたデータに基づいた。

本発明の好ましい実施形態においては、発現ベクターのコアプロモーターは、転写開始部位（ＩＮＲ）をまたぐ配列、さらに具体的には、ＩＮＲの上流と下流の３５〜４５ヌクレオチドの配列（７０〜９０ヌクレオチドの全長）と定義される。ＩＮＲモチーフの「Ａ」（アデニン）ヌクレオチドは＋１と指定される。本発明のコアプロモーターには、自然界には見られないモチーフの組み合わせが含まれる。これらのコアプロモーターは既知の調節モチーフからなる；しかしながら、モチーフの組み合わせは特有であり、本発明のコアプロモーター中のモチーフのうちのいくつかはコンセンサス配列に基づき、コアプロモーター調節要素を形成するように組み合わせられる場合には最適な機能になるようにさらに調整される。本明細書中に記載される発現ベクターのコアプロモーター中の既知の重要な領域は、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位（ＩＮＲ）、モチーフテン要素（ＭＴＥ）、および下流のプロモーター要素（ＤＰＥ）である。これらの４つのコア調節モチーフのうちの少なくとも３つを含む合成のコアプロモーターを持つ本発明のプロモーターが、配列番号１、配列番号２、および配列番号３に示される。本発明においては、合成のコアプロモーター（配列番号２および配列番号３）は、適切な上流の調節要素（例えば、近位プロモーター）と連結された場合には、高レベルの発現を駆動することができる。

本発明のなお別の好ましい実施形態においては、５’ＵＴＲ配列は、ＩＮＲモチーフの「Ａ」（アデニン」ヌクレオチドから開始メチオニンコドンの直前にある配列中のヌクレオチドまでの配列と定義される。本発明の５’ＵＴＲは比較的短い５’ＵＴＲを有しており、３’末端にはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａコンセンサスＫｏｚａｋ配列が含まれる。本発明の２つの合成のコアプロモーターによって指示される転写によって生じるｍＲＮＡの５’ＵＴＲを定義する配列は、配列番号４および配列番号５に示される。

本発明の別の好ましい実施形態においては、コアプロモーターの転写を駆動し、高レベルの発現を生じる近位プロモーターに含まれる上流の調節要素は、多数の金属応答要素（ｍｅｔａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＭＲＥ）からなる合成の配列である。この合成の近位プロモーターは、１１ヌクレオチドによって間隔を隔てられた２セットの３×ＭＲＥからなる。ＭＲＥは全て、図１および図２に示されるように、転写の開始方向に対して逆方向で配向されている。この合成の近位プロモーターの配列は配列番号６に示される。

本発明のなお別の好ましい実施形態においては、最適化された分泌シグナルペプチドの配列が提供される。全長、Ｎ末端の基本的な領域、および疎水性領域の組成を変化させることによって、最適化されたシグナルペプチド配列が設計され、発現されたタンパク質の形質転換細胞の培養培地中への分泌の指示に使用されるように合成された。分泌シグナルを持つ同じリーディングフレーム中へのタンパク質コード配列のクローニングを可能にし、分泌シグナル切断部位に対してネガティブな影響を与えることのない制限酵素部位もまた設計され、分泌シグナル配列の中に組み込まれた。合成の分泌シグナルのアミノ酸配列と、ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７および配列番号８に示される。

本発明のなお別の好ましい実施形態においては、本発明の発現ベクターによって生産されるｍＲＮＡ転写物の３’ＵＴＲ配列は、キチナーゼ様タンパク質と呼ばれる、高度に発現され、分泌されるタンパク質をコードする遺伝子に由来する天然のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ３’ＵＴＲ配列の最適化されたバージョンである（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋら、Ｇｅｎｅ（１９９５）１５３：１４７−１５４）。キチナーゼ様タンパク質は、Ｓ２細胞中で最も豊富に発現され、分泌されるタンパク質のうちの１つである。この理由から、キチナーゼ様タンパク質（ＣＬＰ）をコードする遺伝子が３’ＵＴＲの最適化のベースとして選択された。ＣＬＰ遺伝子由来の３’ＵＴＲには典型的なポリアデニル化シグナルモチーフであるＡＡＴＡＡＡは含まれない。この３’ＵＴＲに対して行われた修飾と短縮によって高レベルの発現が生じた。本発明の３’ＵＴＲの配列は配列番号９に示される。

本発明のより好ましい実施形態においては、Ｓ２細胞中での高レベルの発現を指示する機能性発現カセットになるような、転写要素と翻訳要素の両方を含む上記に記載された５つの調節要素の組み合わせが開示される。利用されたコアプロモーター配列の中でのみ異なる２種類の組み立てられた発現カセットの配列が、配列番号１０および配列番号１１に示される。

したがって、本発明により、異種タンパク質の高レベルの発現を駆動することができる合成の調節要素と最適化された調節要素からなる発現ベクターが提供される。これらの合成の発現ベクターは、Ｓ２細胞中で異種タンパク質を発現させるために使用される場合には、多量の高品質なタンパク質の経済的な生産が可能である。全てが合成のものである調節制御要素、あるいは、合成の調節制御要素と野生型の調節制御要素の組み合わせ、または合成の調節制御要素とコンセンサス調節制御要素の組み合わせ、または合成の調節制御要素と野生型の調節制御要素とコンセンサス調節制御要素の組み合わせを発現カセットにおいて使用することができる。以下の実施例は、全て合成の要素を使用することにより、高レベルの異種タンパク質の発現が生じる（または「駆動される」）ことを示す。一部の調節制御要素が合成のものである場合には、残りの要素は、所定のタイプの宿主細胞を用いて研究するための当該分野で公知の野生型要素（最適化されていない）であると仮定される。

上記に示された記載と以下の実施例は主にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞とともに最適化された発現ベクターを使用することに関するが、ベクターと方法は、プラスミドＤＮＡでの宿主細胞の形質転換後に安定な細胞株を生じる他の昆虫細胞株にも適用できる。

以下の実施例は説明の目的のために提供され、限定を目的として提供されるものではない。

以下の実施例には、昆虫細胞中で使用される合成の発現ベクターの開発を記載する。これらの実施例は、製品開発に商業的に適しているレベルで、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中で異種タンパク質を効率的に発現させる能力を明らかにする。

これらの実施例は、Ｓ２細胞中でタンパク質を発現させる能力を高める個々の調節要素の能力と、どの変化がこれらの要素の機能の増強に寄与するかを決定するために行われた試みを明らかにする。以下に示される結果は、様々な要素とこれらの要素の修飾により、高レベルの発現、または極めて小さな発現を生じることができ、また検出できる発現を生じないこともできる。したがって、機能性であり、効果的な調節要素の選択は実験によって決定されなければならない。このように、本明細書中に記載される発明は、記載される発現カセットがその組成のほとんどが合成のものであり、高レベルのタンパク質発現を指示する点で特有である。

（実施例１）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中で異種タンパク質の発現を駆動するための非Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの使用
Ｓ２細胞中で高レベルの高品質な産物を駆動することができる別の発現ベクターを同定するための試みにおいて、他の昆虫に由来するプロモーターを含む発現ベクターを評価した。この研究には、標準的なＳ２細胞の培養および形質転換方法を利用した（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｒａｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９８９）１：１−８；Ｃｕｌｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）９：１７３−１７７；Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ ａｎｄ Ｓｈａｔｚｍａｎ，Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｕｓｉｎｇ Ｎａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ａｎｄ Ｈｏｅｆｆｌｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９９）２８９−３３０）。ＡＴＣＣから入手したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．（１９７２）２７：３５３−３６５）を利用した。Ｓ２細胞は、Ｅｘｃｅｌｌ ４２０培地（ＳＡＦＣ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で増殖するように適応しており、本明細書中に記載する全ての手順と培養は、Ｅｘｃｅｌｌ ４２０培地中で行った。培養物は、通常は、１×１０^６細胞／ｍｌの密度で播種し、５日〜７日間経過させた。全ての培養物を２６℃〜２７℃でインキュベートした。目的の遺伝子が挿入された発現プラスミドを、リン酸カルシウム法によってＳ２細胞に形質転換した。Ｓ２細胞をハイグロマイシンＢでの選択のために、１μｇのｐＣｏＨｙｇｒｏに対して２０μｇの発現プラスミドの割合で、ｐＣｏＨｙｇｒｏプラスミドで同時形質転換した。形質転換後、０．３ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンに耐性がある細胞を選択した。安定な細胞を選択したら、これらを適切な産物の発現について評価した。発現の評価のために、選択した細胞株の５ｍｌの培養物を２×１０^６細胞／ｍｌで播種し、０．２ｍＭの硫酸銅の存在下で、２６℃で７日間培養した。培養物を、細胞に付随する画分と培養培地の両方の中で、組み換え体タンパク質の発現について評価した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシーブルーで染色したか、またはニトロセルロース上にブロットしたかのいずれかを行った。発現されるタンパク質に特異的な抗体をウェスタンブロットをプローブするために使用した。１μｇ／ｍｌ（１ｍｇ／Ｌ）以上の発現レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色によってＳ２培養物中で容易に検出される。

試験した第１の昆虫プロモーターは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（カイコガ）細胞質アクチンＡ３プロモーターであった。このプロモーターは、安定に形質転換されたＢ．ｍｏｒｉ細胞の高レベルの発現のために設計された発現ベクターの中で使用されている。発現ベクターｐＩＥ１／１５３Ａには、アクチンＡ３プロモーターに加えて、Ｂ．ｍｏｒｉ核多角体病ウイルス（ＢｍＰＮＶ）前記初期（ｉｅ−１）転写因子と、ＢｍＮＰＶの相同反復３（ＨＲ３）領域が含まれている（Ｆａｒｒｅｌｌら、（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９８）６０：６５６−６６３）。鱗翅目細胞に形質転換された場合に、この発現ベクターが組み換え体タンパク質の高レベルの発現を駆動することが示されている。

インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）細胞外ドメイン（Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ）およびマラリアメロゾイト表面タンパク質１ ｐ４２ Ｃ末端断片（ＭＳＰ１−ｐ４２）のようなサブユニットタンパク質をコードする様々な遺伝子をｐＩＥ／１５３Ａベクターにクローニングし、その後、得られた組み換え体プラスミドを使用してＳ２細胞を形質転換した。Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ配列は、５６６アミノ酸残基のタンパク質をコードするＨ３Ｎ２インフルエンザ株Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／０２の全長ＨＡ遺伝子配列（ＨＡ０）から導いた。具体的には、利用した配列は受託番号ＩＳＤＮ３８１５７（ＩＳＤ，ｗｗｗ．ｆｌｕ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）のヌクレオチド配列から導いた。ＨＡ０タンパク質配列には、Ｎ末端の１６アミノ酸の分泌シグナル配列と、Ｃ末端の膜アンカーが含まれる。可溶性Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏの発現のために、全長タンパク質のＧｌｎ_１７〜Ｇｌｙ_５２６までの配列を含むＮおよびＣ短縮型分子（ＨＡ２の残基１７５、Ｘ３１結晶構造のＣ末端のアナログ、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２８９：３６６−３７３）を発現させた。Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏのヌクレオチド配列とアミノ酸配列、ならびに発現は、国際公開第２００７／０２２４２５号に詳細に開示されている。マラリアＭＳＰ１−ｐ４２配列は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＦＵＰ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３７２１３）から導いた。ＰＣＲ増幅によって得られたＭＳＰ−１ ｐ４２をコードする配列は、ＭＳＰ−１タンパク質のアミノ酸Ａｌａ_１３３３〜Ｓｅｒ_１７０５をコードする。ＭＳＰ１−ｐ４２のヌクレオチド配列とアミノ酸配列、および発現は、国際公開第２００６／０２６６２５号に詳細に開示されている。

インフルエンザのサブユニットタンパク質とマラリアのサブユニットタンパク質のいずれについても、発現レベルは、発現をｐＩＥ／１５３Ａベクターによって駆動させた場合には、Ｓ２細胞中では１μｇ／ｍｌ未満であった。これらの結果に基づくと、ｐＩＥ／１５３Ａベクターは、Ｓ２細胞を形質転換するために使用した場合には、組み換え体サブユニットタンパク質の高レベルの発現を指示しない。

試験した第２の昆虫プロモーターは、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ（蚊）のメタロチオネイン１プロモーターであった。Ｓ２細胞中で高レベルの発現を駆動するその能力についてこのプロモーターを試験するために、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのメタロチオネインプロモーター領域（ＭｔｎＡ）をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現ベクターｐＭＴｔＰＡから除去し、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓプロモーターで置き換えた。培養されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞中での組み換え体タンパク質の発現のためのｐＭＴｔＰＡ発現ベクターとその使用方法は、米国特許第５，５５０，０４３号；同第５，６８１，７１３号；同第５，７０５，３５９号；同第６，０４６，０２５号に記載されている。米国特許第５，６８１，７１３号に記載されているプラスミドｐＣｏＨｙｇｒｏを、Ｓ２細胞の同時形質転換後のハイグロマイシン選択のために使用した。ｐＭＴｔＰＡ発現ベクターには以下の要素が含まれている：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａメタロチオネインプロモーター（ＭｔｎＡ）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）プレ−プロシグナル配列、およびＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル（Ｃｕｌｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９：１７３−１７７）。ｐＣｏＨｙｇｒｏプラスミドによっては、ハイグロマイシンについての選択マーカーが提供される（ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｒａｔｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９８９）１：１−８）。ハイグロマイシン遺伝子は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＣＯＰＩＡ転位要素長末端反復の転写制御下にある。ｐＭＴｔＰＡベクターは、外来のＸｈｏＩ部位を含む１５塩基対のＢａｍＨＩ断片を欠失させることによって修飾した。この修飾したベクターをｐＭＴｔΔＸｈｏと呼び、これは、固有のＢｇｌＩＩ部位とＸｈｏＩ部位を利用して挿入断片の指向性クローニングを可能にする。このベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を付加し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ「コンセンサスＫｏｚａｋ配列」（Ｃａｖｅｎｅｒ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８７）１５：１３５３−１３６１）をｔＰＡプレ−プロシグナル配列の開始メチオニンコドンの直前に付加することによってさらに修飾した。具体的には、ＡＴＧの直前にあるｐＭＴｔＰＡ中の１２ヌクレオチドの配列ＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣをＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＡＣに変更した（最初の６ヌクレオチドはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を示し、第２の６ヌクレオチドはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのコンセンサスＫｏｚａｋ配列を示す）。このさらに修飾されたベクターをｐＭＴ−ＫｔΔＸｈｏと呼ぶ。ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位はｔＰＡプレ−プロシグナル配列の翻訳開始コドンの直前にあるプロモーター配列のクローニングを可能にする。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓのメタロチオネインプロモーター断片は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓゲノムデータベース（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ／）中の配列から導いた。具体的には、１８３３ヌクレオチドのプロモーター断片は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅのメタロチオネイン１遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬ登録名Ｑ５２Ｐ９２＿ＡＮＯＧＡ）の翻訳開始コドンの上流にある配列を示す。この遺伝子は、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２Ｒ上の位置１１，９１１，９９２−１１，９１２，３８４に見ることができ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＭｔｎＡ遺伝子のホモログである。このヌクレオチド配列は、５’末端のＫｐｎＩ制限酵素部位と３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位の付加を用いて化学合成した（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）。ｐＭＴ−ＫｔΔＸｈｏベクターをＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化してＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターを除去し、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓプロモーターで置き換えた。得られたプラスミドをｐＡｇＭＴ−ＫｔΔＸｈｏと呼ぶ。その後、Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ配列をｐＡｇＭＴ−ＫｔΔＸｈｏベクターにクローニングした。

Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏサブユニットタンパク質をコードするｐＡｇＭＴ−ＫｔΔＸｈｏ発現プラスミドを使用してＳ２細胞を形質転換した。安定な細胞株の選択の際には、細胞を、硫酸銅の存在下で培養した場合の分泌型のＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏタンパク質の発現についてスクリーニングした。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓメタロチオネインプロモーターによって駆動されたＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏサブユニットの発現によっては、予想した分子量の均質な産物が生じた。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓプロモーターによって駆動されたＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏの発現はＢｏｍｂｙｘプロモーターによって駆動された発現よりも大きかったが、発現レベルはなおも相当に低く、およそ１μｇ／ｍｌであった。このレベルは、およそ３０μｇ／ｍｌであったＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＭｔｎＡプロモーターを利用した場合のＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏの発現レベルよりもはるかに低い。

（実施例２）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞についての合成のコアプロモーターの設計
コアプロモーターは、所定の遺伝子の転写開始を指示できる最小ヌクレオチド配列と定義される。真核生物のコアプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体による開始の指示に関与している。コアプロモーターは、通常、転写開始部位（ＩＮＲ）をまたぐ配列、さらに具体的には、ＩＮＲの上流と下流の３５〜４５ヌクレオチドの配列（７０〜９０ヌクレオチドの全長）と定義される。５’ＵＴＲをコードする配列はＩＮＲで始まり、翻訳を開始するＡＴＧコドンまで続く。５’ＵＴＲをコードする配列は比較的短い５０ヌクレオチドから、さらに長い数百ヌクレオチドまでの範囲の長さで変化する。先に記載したように、コアプロモーターには通常、以下：ＴＦＩＩＢ認識要素（ＢＲＥ）、ＴＡＴＡボックス、開始因子（ＩＮＲ）、モチーフテン要素（ＭＴＥ）、下流のプロモーター要素（ＤＰＥ）、および下流のコア要素（ＤＣＥ）、の配列モチーフの１つ以上が含まれ得る。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａを含むいくつかの生物に由来するコアプロモーターを精査すると、共通のコア要素は存在しないことが明らかである；しかしながら、ＩＮＲモチーフはほぼ共通している（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．（２００６）７：Ｒ：５３）。組み換え体タンパク質の高レベルの発現を導く転写を指示することができる強いコアプロモーターを作成する試みにおいて、これらの要素を全て組み込んだＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの合成のコアプロモーターを設計した。コアプロモーターを構成する様々なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ調節モチーフのコンセンサス配列を利用した。これらのコンセンサス調節モチーフはＯｈｌｅｒら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３：１−１２；Ｋｕｔａｃｈ ａｎｄ Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２０：４７５４−４７６４；Ｓｍａｌｅ ａｎｄ Ｋａｄｏｎａｇａ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３）７２：４４９−４７９；Ｌｉｍら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（２００４）１８：１６０６−１６１７；ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．（２００６）７：Ｒ５３；Ｇｅｒｓｈｅｎｚｏｎら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００６）７：１６１）によって記載されている。

Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの合成プロモーターを構築するために、以下のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａコンセンサス調節モチーフ、ＧＧＧＣＧＣＣを含むＢＲＥ、ＴＡＴＡＡＡを含むＴＡＴＡ、ＴＣＡＧＴＣを含むＩＮＲ、ＣＧＡＡＣＧＧＡＡＣを含むＭＴＥ、およびＧＧＴＴＣＧを含むＤＰＥを含むコアプロモーターを設計した。この合成のコアプロモーターを、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓメタロチオネイン１ ５’ＵＴＲの部分に有用させた。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓメタロチオネイン１ ５’ＵＴＲのコアプロモーターへの融合により、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ ＭｔｎＡプロモーターのものと類似する、翻訳を開始するＡＴＧに対するＩＮＲの位置が生じる。この合成のプロモーターを化学合成し、これを合成のコアプロモーター１（ＳＣＰ１）と呼ぶ。ＳＣＰ１プロモーターの配列を配列番号１に列挙する。

化学合成したＳＣＰ１には、既存の発現ベクターへのクローニングのために、その５’末端にＸｂａＩ部位を、その３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含めた。

実施例１に記載したｐＭＴ−ＫｔΔＸｈｏ発現ベクターを、ＭｔｎＡプロモーターのＴＡＴＡボックス配列の７ヌクレオチド上流にＸｂａＩ制限酵素部位を挿入することによってさらに修飾した。このプラスミドをｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏと呼ぶ。これにより、ＸｂａＩ制限酵素とＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素での消化によるＭｔｎＡコアプロモーター（５’ＵＴＲを含む）の除去、および別のコアプロモーターと５’ＵＴＲ配列の挿入を可能にした。この様式で、ＳＣＰ１をｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏ発現ベクターに挿入した。

（実施例３）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中で異種タンパク質の発現を駆動できる転写活性化因子要素を含む近位プロモーターの設計
コアプロモーターにおいて転写レベルをアップレギュレートさせる（これは次いで、Ｓ２細胞中で高い発現レベルを生じる）試みにおいて、合成の近位プロモーターを、様々な転写活性化因子要素を含むように設計した。自然界に存在している近位プロモーターをＳ２細胞中での使用のために利用するのではなく、合成の近位プロモーターを開発することを選択することは、２つの昆虫プロモーターを用いた実施例１の結果に、哺乳動物のプロモーターとウイルス起源のプロモーターがＳ２細胞中では十分に機能しないことを明らかにしたＯｌｓｅｎら（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：１５７−１６７）の研究にも基づく。したがって、合成の近位プロモーターを、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーター由来の調節モチーフを含むように設計した。近位プロモーターの構成には、個々の調節モチーフコンセンサス配列の反復の組み立て、または異なるコンセンサス調節モチーフの組み合わせの組み立てを含めた。合成の近位プロモーターを、コアプロモーターに連結させた場合に高レベルの転写を指示するそれらの能力について評価した。評価した第１のタイプの転写調節要素は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＤＮＡ複製関連要素（ＤＲＥ）であった。ＤＮＡ複製関連タンパク質をコードするＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子のプロモーターは、コンセンサスＤＲＥ配列５’−ＴＡＴＣＧＡＴＡを含む。特異的ＤＲＥ結合因子であるＤＮＡ複製関連要素因子、すなわちＤＲＥＦはＤＲＥに結合し、対照ＤＲＥ下で複数の遺伝子をポジティブに調節し、高レベルの発現を生じる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターのコンピューターによる研究（Ｏｈｌｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３：１−１２）は、ＤＲＥ要素が多くのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーター中に見られることを示した。これは、事実上、最も一般的な転写要素である。Ｈｉｒｏｓｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３）２６８：２０９２−２０９９）の研究においては、ＤＲＥの複数のコピーが組み立てられ、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を制御するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＭｔｎＡコアプロモーターに連結した。ＤＲＥはルシフェラーゼの発現をアップレギュレートさせ、発現レベルは付加されたＤＲＥの数とともに増大した。近位プロモーターを含む合成のＤＲＥの構成においては、配列

（ＤＲＥコンセンサスを太字の斜体で示す）を使用した。合成のＤＲＥ近位プロモーターは以下：１×ＤＲＥ、２×ＤＲＥ、および４×ＤＲＥ、であった。近位プロモーターを含むＤＲＥをＭｔｎＡ近位プロモーターの除去（ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ）と、ＭｔｎＡコアプロモーターのすぐ上流の別の近位プロモーターの挿入によって、実施例２に記載したように、ｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏベクターにクローニングした。ＤＲＥ反復は全て、同じ正方向（５’〜３’方向）とした。これらのベクターをｐＤＲＥ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏと呼ぶ。これらのＤＲＥ発現プラスミドでの組み換え体タンパク質の発現を評価するために、実施例１に記載したＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ遺伝子配列をこれらのベクターに挿入し、発現レベルを評価するために使用した。

Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏサブユニットタンパク質をコードするｐＤＲＥ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏ発現プラスミドを使用してＳ２細胞を形質転換した。安定な細胞株の選択後、これらを分泌型のＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏタンパク質の発現についてスクリーニングした。ＤＲＥ近位プロモーター構築物は全て、測定可能なＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ発現を生じることが全くできなかった。

評価した第２のタイプの転写調節要素は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＧＡＧＡ要素であった。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＧＡＧＡ転写調節因子は、別の（ＧＡ）^ｎまたは（ＣＴ）^ｎ配列（ＧＡＧＡ要素）に結合するその能力について命名される。この転写因子は、影響を受ける遺伝子を取り巻くクロマチン構造を作り直すことにより、遺伝子発現を増大させると考えられている（Ｇｒａｎｏｋら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）５：２３８−２４１）。ＧＡＧＡ要素は、様々なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子のプロモーター中に見られる。これは、これらの遺伝子の遠位プロモーター、近位プロモーター、およびさらにはコアプロモーター中に見られる（Ｓｏｅｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９３）１３：７９６１−７９７０）。Ｓｏｅｌｌｅｒら（１９９３）の研究では、複数のＧＡＧＡ要素がコアプロモーターの転写を駆動できたことが明らかにされた。

１つのＧＡＧＡ要素をＤＲＥ要素と組み合わせた２つの近位プロモーターを設計した。これらの２つの構成は以下：ＧＡＧＡ−２×ＤＲＥおよび２×ＤＲＥ−ＧＡＧＡ−２×ＤＲＥ、であった。ＤＲＥ近位プロモーターと同様に、これらの近位プロモーターを発現ベクターｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏ中のＭｔｎＡコアプロモーターの上流に挿入した。これらのＤＲＥ−ＧＡＧＡ発現プラスミドでの組み換え体タンパク質の発現を評価するために、実施例１に記載したＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ遺伝子配列をプロモーターとして使用した。

Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏサブユニットタンパク質をコードするＤＲＥ−ＧＡＧＡ組み合わせプロモーターを持つ発現プラスミドを使用してＳ２細胞を形質転換した。安定な細胞株の選択の際には、細胞を、分泌型のＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏタンパク質の発現についてスクリーニングした。これらの構築物はいずれも、測定可能なタンパク質発現を全く生じることができなかった。

評価した第３のタイプの転写調節要素は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ金属応答要素（ＭＲＥ）であった。特異的なＭＲＥ結合因子である金属応答性転写因子、すなわち、ＭＴＦ−１はＭＲＥに結合し、ＭＲＥの制御下にある複数の遺伝子をポジティブに調節し、高レベルの発現を生じる。ＭＴＦ−１によって調節されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子のプロモーターには、コンセンサスＭＲＥ配列５’−ＴＧＣＡＣＡＣが含まれる。４コピーのＭＲＥが最小プロモーターの転写を駆動できることが明らかにされている（Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）２１：４５０５−４５１４）。

ｐＭＴｔＰＡΔＸｈｏ発現ベクター中のＭｔｎＡ近位プロモーターの欠失分析は、配列

（コンセンサス配列を太字の斜体で示す）を持つＭＲＥの欠失がＭｔｎＡプロモーターの強さに最も大きな影響を与えることを示していた。したがって、１コピー以上のＭＲＥ配列

を含む合成の近位プロモーターを設計した。合成のＭＲＥ近位プロモーターは以下の通りである：２×、３×、４×、５×、６×、８×のＭＲＥ。これらの近位プロモーターの構成の中のＭＲＥは全て、５’〜３’方向（正方向）で頭から尾の向きで配置した。ＤＲＥ近位プロモーターを用いた場合と同様に、ＭＲＥ近位プロモーターを発現ベクターｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏ中のＭｔｎＡコアプロモーターの上流に挿入した。これらの合成のＭＲＥプロモーター発現ベクターでの組み換え体タンパク質の発現を評価するために、実施例１に記載したＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ遺伝子配列を複数のベクターに挿入した。

Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏサブユニットタンパク質をコードするＭＲＥ近位プロモーターを持つ発現プラスミドを使用してＳ２細胞を形質転換した。安定な細胞株の選択の際には、細胞を、分泌型のＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏタンパク質の発現についてスクリーニングした。これらの構築物はＭＲＥを含むので、発現の評価には、培養物を０．２ｍＭのＣｕＳＯ_４で誘導することと、２６℃で７日間培養することが必要であった。

これらのＳ２形質転換体の分析により、ＭＲＥユニットの数が増えるにしたがい、遺伝子発現のレベルも増大し、６×ＭＲＥで最大に達することが明らかとなった。発現レベルは８×を用いた場合には低下した。したがって、合成のＭＲＥ近位プロモーターを利用したさらなる発現分析は、６×ＭＲＥの構成に基づいた。

６×ＭＲＥ合成近位プロモーターを使用して、天然のＭｔｎＡ近位プロモーターと合成の６×ＭＲＥ近位プロモーターの比較を可能にする発現構築物の１つのシリーズを作成した。発現構築物のこのシリーズにおいては、２つの近位プロモーターを、３つの異なる最小プロモーターまたはコアプロモーターに連結させた：１）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＭｔｎＡ、２）Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ＭｔｎＡ、および３）実施例２に記載したＳＣＰ１。得られた６つの構築物を、その後、Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏレポーター遺伝子と連結させた。６×ＭＲＥ近位プロモーターとＤｍＭｔｎＡ近位プロモーターはいずれも、所定の個々のコアプロモーターのそれぞれを比較した場合には、ｆｌｕ遺伝子の発現レベルを同等のレベルにまで駆動することができた。例えば、６×ＭＲＥ近位ＭｔｎＡコアとＤｍＭｔｎＡ近位ＭｔｎＡコアは、Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏタンパク質の同等のレベルの発現を生じた。６×ＭＲＥ近位プロモーターを用いたこのデータは、この実施例で試験した最初の２つの転写活性化因子を用いた場合には成功しなかったにもかかわらず、機能性の合成の近位プロモーターを設計できることを示している。

６×ＭＲＥ近位プロモーターとＤｍＭｔｎＡ近位プロモーターの比較によってはまた、ＭｔｎＡコアプロモーターを含む構築物中でのＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏの発現レベルが、ＳＣＰ１を含むそのような構築物よりもおよそ４倍高かったことが明らかになった。したがって、実施例４に記載するように、別のコアプロモーターを評価する試みを行い、また、実施例５に記載するように、合成のコアプロモーターをさらに最適化する試みも行った。

（実施例４）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中で異種タンパク質の発現を駆動する「スーパーコアプロモーター」の評価
Ｊｕｖｅｎ−Ｇｅｒｓｈｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００６）３：９１７−９２２）には、後生動物である宿主細胞中でＲＮＡポリメラーゼＩＩによる高レベルのＲＮＡ転写を指示する「スーパーコアプロモーター」と呼ばれるコアプロモーターの構成と分析が記載されている。同じ「スーパーコアプロモーター」の使用はまた、ＰＣＴ公開番号ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２０３９４（Ｋａｄｏｎａｇａ ａｎｄ Ｇｅｒｓｈｏｎ、優先日２００５年５月２５日）にも開示されている。これらの刊行物に記載されている「スーパーコアプロモーター」は、「Ｋａｄｏｎａｇａコアプロモーター」または「ＫＣＰ」と呼ばれるであろう。Ｋａｄｏｎａｇａコアプロモーターは、ＩＮＲ要素とＭＴＥ要素を含み、状況に応じてＴＡＴＡ要素および／またはＤＰＥ要素を含む最小プロモーターからなり、これらはいくつかの異なるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子とウイルス遺伝子に由来する。構成に関しては、いずれもＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＭＴＥ調節モチーフを最初に記載したＧｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔの論文（Ｌｉｍら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（２００４）１８：１６０６−１６１７）に大きく依存するために、ＫＣＰコアプロモーターと、本明細書中に記載されるコアプロモーターに対して類似性がある。Ｋａｄｏｎａｇａコアプロモーターは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞を含む後生動物である宿主細胞中での異種タンパク質の発現に有用であると記載されている。したがって、本発明者らは、Ｈａｗａｉｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．において、安定に形質転換されたＳ２細胞中での異種タンパク質の発現の状況においてＫａｄｏｎａｇａコアプロモーターの機能性を試験するために、Ｋａｄｏｎａｇａコアプロモーターを含む３種類の構築物を作成した。

隣接する適切な制限酵素部位を持つＫａｄｏｎａｇａコアプロモーターを合成した。ＫＣＰ合成配列を、近位プロモーター配列とコアプロモーター配列を除去した、実施例９に記載する、配列番号１０によって定義する、ＨＢＩ−１０発現ベクターに挿入した。得られたＫＣＰ／ＨＢＩ−１０ハイブリッド発現ベクターには、１Ｒ５Ｌ（配列番号７）分泌シグナルに連結されたＫＣＰ、Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏレポーター遺伝子、およびＯｐ−ＣＬＰ−３’ＵＴＲ（配列番号９）が含まれる。ＫＣＰ／ＨＢＩ−１０ベクターには、近位プロモーターは含まれない。したがって、２つのさらなる構築物を、この「基本のＫＣＰ／ＨＢＩ−１０ハイブリッドベクター」から作成した。このＫＣＰに加えて、第１のさらなる構築物には６×ＭＲＥ近位プロモーターが含まれ（「６×ＭＲＥ／ＫＣＰ／ＨＢＩ−１０」）、第２のさらなる構築物にはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーが含まれる（「ＣＭＶ／ＫＣＰ／ＨＢＩ−１０」）；それぞれの近位プロモーターはＫＣＰ配列のすぐ上流に挿入した。ＣＭＶエンハンサーは、Ｊｕｖｅｎ−Ｇｅｒｓｈｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００６）３：９１７−９２２、これについてはＫａｄｏｎａｇａ博士が連絡先の著者である）によって使用されたものと同じである。これらの構築物を３連でＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞に形質転換し、Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏの発現レベルを決定した。

２つの構築物ＣＭＶ／ＫＣＰ／ＨＢＩ−１０およびＫＣＰ／ＨＢＩ−１０（近位プロモーターまたはエンハンサーは存在しない）は、単独で、最小レベルのＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ発現、すなわち、＜１μｇ／ｍｌを示した。したがって、このデータは、１）ＫＣＰは単独では低レベルの分泌型タンパク質しか提供しないこと、２）この発現レベルは形質転換されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞においてＣＭＶエンハンサーによっては増強または増大しないことを示している。６×ＭＲＥ／ＫＣＰ／ＨＢＩ−１０構築物は、粗上清中で、２〜３μｇ／ｍｌのＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏタンパク質の発現と分泌を生じた。６×ＭＲＥ−ＳＣＰ１の類似する構築物を使用した以前の実験では、１０ｕｇ／ｍｌの同じＨ３−ＨＡタンパク質の発現が得られており、同じ６×ＭＲＥ近位プロモーターに連結されたＫＣＰよりもおよそ２〜３倍高かった。２つの構築物の間ではコアプロモーターだけが異なるので、実施例２と実施例３に記載したＳＣＰ１は、形質転換されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中でのＫａｄｏｎａｇａコアプロモーターと６×ＭＲＥ近位プロモーターの使用によって生じる発現よりもおよそ２〜３倍大きい分泌型の異種タンパク質の発現レベルを提供すると結論付けることができる。ＭＲＥまたはＭＲＥをベースとする近位プロモーターの使用は、Ｌｉｍら（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（２００４）１８：１６０６−１６１７）またはＪｕｖｅｎ−Ｇｅｒｓｈｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００６）３：９１７−９２２）の参考文献には開示されていなかった。

Ｋａｄｏｎａｇａコアプロモーターを哺乳動物細胞中での使用のために最適化した。ＨｅＬａ Ｓ３細胞中でのＫＣＰの使用について示したデータは、一過性のトランスフェクションと高感度蛍光アッセイに限定されていた；したがって、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の安定な形質転換の際にＫＣＰコアプロモーターを用いて得られた結果に基づくと、一過性のトランスフェクションと高感度レポーターアッセイの使用は、全ての細胞のタイプにおいて高レベルで異種タンパク質を発現し、分泌する能力の指標ではない。ＫＣＰの構成には、哺乳動物細胞の中でのタンパク質の発現のために古くから使用されてきたＣＭＶおよびＡｄＭＬのようなウイルスプロモーターの要素が含まれる。それにもかかわらず、ＫＣＰを使用した場合に対して、ＳＣＰ１を使用した場合のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞中での分泌型の異種タンパク質の安定な発現の２倍〜３倍の増大は、注目に値し、予想以上である。

（実施例５）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中での異種タンパク質の発現のための合成のコアプロモーターの最適化
実施例２に記載した最初のＳＣＰ１の構成には、ＢＲＥ、ＴＡＴＡボックス、ＩＮＲ、ＭＴＥ、およびＤＰＥを持つコアプロモーターが含まれている。これらのモチーフをそれぞれ除去し、発現に対するそれらの除去の影響を評価した。それぞれの場合において、発現レベルはわずかに低くなるようであった。ＢＲＥ、ＴＡＴＡ、ＩＮＲ、ＭＴＥ、およびＤＰＥモチーフを所定の調節モチーフを提示する別の配列のいずれかを含む別の配列で、またはコアプロモーター中の同じ位置には調節モチーフを欠いている配列で、個別に交換することによって、ＳＣＰをのさらなる最適化を試みた。例えば、野生型のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＭｔｎＡコアプロモーターには、ＢＲＥ、ＭＴＥ、またはＤＰＥモチーフが欠けているが、なおも、実施例３に示したデータに基づくと、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＭｔｎＡコアプロモーターは、これまでに試験した中で最強の野生型コアプロモーターである。ＳＣＰ１中のＢＲＥ配列の除去と、これを「天然の」配列で置き換えることによっては、レポーター遺伝子産物の発現レベルには変化は生じず、ＢＲＥの存在が自然なことである、すなわち、これは転写に対して明らかな影響は与えないことを示している。ＴＡＴＡボックスの場合には、ＳＣＰ１のＴＡＴＡとＩＮＲの間の間隔を、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＭｔｎＡのＴＡＴＡボックスとその対応するＩＮＲとの間の間隔に適合するように３ヌクレオチド短くした。除去した３ヌクレオチド（ＡＣＡ）は、ＴＡＴＡボックスのすぐ３’側にあるヌクレオチドであった。この変化により、レポーター遺伝子の発現レベルのわずかな低下が生じ、これは、ＳＣＰ１中の間隔がＭｔｎＡ中の間隔よりも好ましいことを示している。ＳＣＰ１のＩＮＲ（ＴＣＡＧＴＣ）をＧＣＡＴＣＡに変え、６個のヌクレオチドのうちの３個を変化させた。この変化によっては、レポーター遺伝子産物の発現がおよそ５０％増大した。

ＳＣＰ１には、５’ＵＴＲをコードする配列が含まれ、これは１９０ヌクレオチドの長さである。ＳＣＰ１のこの部分はＡｎｏｐｈｅｌｅｓ Ｍｔｎ遺伝子に由来する。この配列が転写／発現に有用であるかまたは有害であるかは判っていない。この配列の寄与を決定するために、この配列について２種類の欠失構築物を作成した。第１のものは、３’末端から６０ヌクレオチドの配列を除去した。この変化によっては、発現レベルのわずかな増大が生じた。第２のものは、３’末端から１２７ヌクレオチドの配列を除去した。この変化によっては、およそ２倍の発現レベルの増大が生じた。このＳＣＰ１の短縮バージョンをＳＣＰ１Δ１１１と呼び、コアプロモーターに対する修飾をさらに評価するために使用した。

転写レベルに対するＴｏｌｌｏ ＭＴＥの効果は、Ｌｉｍら（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（２００４）１８：１６０６〜１６１７）に記載されている。したがって、ＳＣＰ１Δ１１１中で使用したコンセンサスＭＴＥを、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｔｏｌｌｏプロモーター中で見られるものに変えた。Ｔｏｌｌｏ ＭＴＥ配列でのコンセンサスＭＴＥの置換によっては、およそ２〜３倍の発現レベルの増大が生じた。ＳＣＰ１コアへのＴｏｌｌｏ ＭＴＥの挿入は、明らかに、発現レベルに対して極めてポジティブな影響を有していた。Ｔｏｌｌｏ ＭＴＥが挿入されたコアプロモーターを「ＳＣＰ１−ＴｏｌｌｏＭＴＥΔ１１１」と呼び、このコアプロモーターを含むプロモーター配列を配列番号２に列挙する。

コアプロモーターの更なる最適化を試験した。高い発現を生じた先の３つの段落に記載したポジティブな態様を組み込んだ３種類の新規のコアプロモーターのセットを設計した。３つの重要なモチーフと５’ＵＴＲ要素の特異的な組み合わせは以下である：１）ＴＡＴＡＡＡと、ＩＮＲに対してもともとのＳＣＰ１によって定義される間隔を含むＴＡＴＡモチーフ、２）ＩＮＲ配列モチーフＧＣＡＴＣＡ、３）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｔｏｌｌｏ由来のＭＴＥ配列モチーフ、および４）短縮型５’ＵＴＲ（Δ１１１）要素。３種類の新規のコアプロモーターＳＣＰ５、ＳＣＰ６、およびＳＣＰ７を設計した。３種類のこれらのコアプロモーターは全て、ＳＣＰ１由来のＢＲＥ配列モチーフ（存在する場合にはＧＧＧＣＧＣＣを含む）を欠いている。配列が異なる３種類の新規のコアプロモーターはＤＰＥモチーフによって占められている。ＳＣＰ５には、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｔｏｌｌｏ遺伝子由来のＤＰＥ（ＧＧＡＣＧＣ）が含まれており、ＳＣＰ６には、ＳＣＰ１で使用したコンセンサスＤＰＥ（ＧＧＴＴＣＧ）が含まれており、ＳＣＰ７はＤＰＥを欠いており、これには代わりに、ＳＣＰ５配列およびＳＣＰ６配列と同じ間隔を提供する「ニュートラルフィラー（ｎｅｕｔｒａｌ ｆｉｌｌｅｒ）」配列が含まれている。ＳＣＰ１、ＳＣＰ５、ＳＣＰ６、およびＳＣＰ７を、それらのＳＣＰ配列だけが異なる同じＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２発現構築物中で比較した場合には、ＳＣＰ７の構成によって最も高い発現レベルが生じた。ＳＣＰ７配列を配列番号３に列挙する。

先に議論したように、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の配列は、真核生物のｍＲＮＡからの遺伝子発現の翻訳後調節において重要な役割を担っている。５’ＵＴＲは、ＩＮＲから開始メチオニンコドンまでの領域によって定義される；したがって、プロモーターのＤＮＡ配列の定義の状況においては、これには通常、５’ＵＴＲ配列が含まれる。これは、ＳＣＰ１−ＴｏｌｌｏΔ１１１プロモーターとＳＣＰ７プロモーターについて列挙された配列についてもその通りである。ＳＣＰ１−ＴｏｌｌｏＭＴＥΔ１１１プロモーターから得られた５’ＵＴＲをΔ１１１ ５’ＵＴＲと呼び、配列番号４として列挙する；ＳＣＰ７プロモーターから得られた５’ＵＴＲをΔ１１１−７ ５’ＵＴＲと呼び、配列番号５として列挙する。

（実施例６）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中での異種タンパク質の発現のための合成のＭＲＥ転写活性化因子の最適化
自然界では、転写活性化因子の様々な組み合わせが近位プロモーター中で見られる。これに基づいて、実施例３に記載したＧＡＧＡ要素とＭＲＥ要素の組み合わせを作成して、モチーフのこの組み合わせによって高レベルの転写が、最終的には高レベルの発現が生じるかどうかを決定した。２種類のＧＡＧＡ−ＭＲＥ近位プロモーターの構成を試験した。これらは以下：ＧＡＧＡ−２×ＭＲＥおよび２×ＭＲＥ−ＧＡＧＡ−２×ＭＲＥ、の通りである。

２種類のＧＡＧＡ−ＭＲＥ近位プロモーターを、実施例３に記載したベクターｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏ中のＸｂａＩ制限酵素部位を利用して実施例３に記載した様々なコアプロモーターの直前の領域にクローニングした。ＧＡＧＡ−ＤＲＥ近位プロモーターを含むプラスミドでの安定なＳ２細胞株の形質転換と選択の後、Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ産物の発現を評価した。利用したＭＲＥへのＧＡＧＡ要素の付加によっては、ＧＡＧＡ要素を含まない同様のＭＲＥ構築物と比較して、発現レベルは増大も低下もしなかった。

多くの近位プロモーターにおいては、同じタイプの複数の転写因子結合部位を、多くの場合には、正方向と逆方向の両方において見ることができる。これは、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＭｔｎ遺伝子ファミリーの近位プロモーターにおいて見られる内因性のＭＲＥについてもその通りである。したがって、ＭＲＥの方向によって近位プロモーターの機能を改善することができるかどうかを決定する試みにおいて、合成のＭＲＥ近位プロモーターの１つのシリーズを、正方向ＭＲＥ配列と逆方向ＭＲＥ配列の様々な組み合わせを使用して作成した。逆方向（Ｒ）ＭＲＥは、単に、実施例３に記載した正方向（Ｆ）ＭＲＥ配列の逆方向の構成成分である。逆方向ＭＲＥは配列

（コンセンサスＭＲＥ配列を太字の斜体で示す）を有する。新規の近位プロモーターのこのシリーズは、様々な組み合わせで配置された正方向ＭＲＥおよび／または逆方向ＭＲＥの３×反復から構成されている。これらの組み合わせは以下：３×Ｆ ＭＲＥ、３×Ｒ ＭＲＥ、３×Ｆ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥ、３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｆ ＭＲＥ、３×Ｆ ＭＲＥ−３×Ｆ ＭＲＥ、および３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥ、の通りとした。３×ＭＲＥ反復単位の間の間隔は１１ヌクレオチドとした。スペーサーの配列はＡＴＣＡＡＡＣＴＡＧＡである。

実施例３と同様に、正方向および逆方向でＭＲＥを含む近位プロモーターを、発現ベクターｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏ中に、ＭｔｎＡコアプロモーターの上流に挿入した。ＳＣＰ１コアを含む同様の発現プラスミドもまた構築した。これらの合成のＭＲＥプロモーター発現ベクターを用いた組み換え体タンパク質の発現を評価するために、実施例１に記載したＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ遺伝子配列をベクターに挿入した。

Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏサブユニットタンパク質をコードするＭＲＥ近位プロモーターを持つ発現プラスミドを使用してＳ２細胞を形質転換した。正方向ＭＲＥと逆方向ＭＲＥの組み合わせを含むプラスミドでの安定なＳ２細胞株の形質転換と選択の後、Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ産物の発現を評価した。これらの構築物にはＭＲＥが含まれているので、発現の評価には、０．２ｍＭのＣｕＳＯ_４での培養物の誘導と、２６℃で７日間の培養が必要であった。

これらのＳ２形質転換体の分析により、様々な正方向と逆方向の組み合わせを使用した場合には、これらが様々なレベルの発現を生じ、その全てが実施例３の６×ＭＲＥよりも大きかったことが明らかになった。３×Ｆ ＭＲＥ−３×Ｆ ＭＲＥでさえ、６×ＭＲＥよりもわずかに高い発現を生じた（約２倍大きい）。これは、６×ＭＲＥ近位プロモーター配列と３×Ｆ ＭＲＥ−３×Ｆ ＭＲＥ近位プロモーター配列との間にわずかな相違しかない１１ヌクレオチドのスペーサーの結果であり得る。３×Ｆ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥによって指示された発現は、３×Ｆ ＭＲＥ−３×Ｆ ＭＲＥによって指示された発現とほぼ等しかった。３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｆ ＭＲＥによって指示された発現は６×ＭＲＥよりもおよそ３倍大きく、３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥによって指示された発現は６×ＭＲＥよりもおよそ４〜５倍大きかった。したがって、３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥを、実施例９に記載するように、合成の要素または最適化された要素だけからなる完全な発現カセットを作成するために、選択した調節要素を組み合わせたさらなる構築物において使用するための近位プロモーターとして選択した。合成の近位プロモーター３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥを配列番号６に列挙する。

（実施例７）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中での異種タンパク質の発現のための合成の分泌シグナルの構成と最適化
分泌シグナルペプチドは、細胞からの分泌のために標的化されるタンパク質の発現において重要な役割を担っている。したがって、生産の間に培養培地中に分泌されるように組み換えタンパク質を指示する発現ベクター中での最適な配列の使用は、そのような発現ベクターの有用性にとって重要である。Ｚｈａｎｇら（Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．（２００５）７：３５４−３６５）によって示された分泌シグナルの最適化の例は、分泌シグナルの最適化の利点を明らかに示している；しかしながら、この特異的な例は植物に適用されており、記載された分泌シグナルの変更を他の真核生物細胞のタイプに適用できるかは明らかではない。したがって、３種類の分泌シグナルの１つのシリーズを、どのタイプの配列の変更によって、安定に形質転換されたＳ２細胞の培養培地へのタンパク質産物の発現の増大を生じるかを確立するために設計した。合成の分泌シグナルの構成は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８６）１４：４６８３−４６９０）によって最初に記載され、Ｂｅｎｄｔｓｅｎら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４）３４０：７８３−７９５）によってさらに詳細に論じられたマトリックスの表に従った。試験した３種類の分泌シグナルの第１のセットには全て、切断領域に同じ配列を含め、疎水性領域の配列の長さを変えて塩基性領域中の電荷を持つ残基の数を変えた。試験した３種類のシグナルペプチドのアミノ酸配列は以下の通りであり、括弧内に名称を示す：

１Ｒ５Ｌ配列は、疎水性コアの長さが長くなっているので、１Ｒ４Ｌ配列のアミノ酸長よりも１アミノ酸長く（付加された「Ｌ」は太字の斜体の書体で示した）、２Ｒ５Ｌ配列は、さらに電荷を持つ残基が、同じ疎水性コアを維持したまま塩基性領域に付加されているので、１Ｒ５Ｌ配列よりも１残基長い（付加された「Ｒ」は太字の斜体の書体で示した）。１Ｒ４Ｌ配列、１Ｒ５Ｌ配列、および２Ｒ５Ｌ配列の長さはそれぞれ、１７アミノ酸、１８アミノ酸、および１９アミノ酸である。これらの３種類の分泌シグナルを、ｐＭｔａｆ発現ベクター中に、Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏドメイン遺伝子に動作可能であるように連結させた。これらの３種類の分泌シグナルを利用したＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ産物の発現と分泌を、ｔＰＡ分泌シグナルを利用した同様のＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏドメイン構築物と比較した。実施例１に記載したように、Ｓ２細胞の形質転換、安定な細胞株の選択、および培養培地中の産物の発現レベルについてのスクリーニングの際には、１Ｒ５Ｌが最も高い発現レベルを生じ、ｔＰＡを含む構築物よりもおよそ２倍大きく、２Ｒ５Ｌを含む構築物よりもおよそ３倍大きく、１Ｒ４Ｌ（ｔＰＡと同じ）を含む構築物よりもおよそ２倍大きかったことを決定した。さらに、１Ｒ５Ｌ配列中での偶然の突然変異Ｑ〜Ｈ（−２位）によっては、発現の予想以上のさらなる増大が生じ、これはもともとの１Ｒ５Ｌ配列のおよそ２倍であった。Ｈ残基を含む１Ｒ５Ｌ配列を１Ｒ５Ｌ（Ｈ）と呼び、実施例９に開示する最終的な発現ベクターにおいて使用した。

これらの分泌シグナル配列の構成において、ヘキサヌクレオチド配列ＡＡＣＡＡＣを、開始メチオニンコドンの直前に配置した。これは、Ｃａｖｅｎｅｒ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８７）１５：１３５３−１３６１）によって記載されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのコンセンサスＫｏｚａｋ配列を示す。

分泌シグナル配列の構成もまた、切断部位のＧのすぐ後ろにあるＴアミノ酸残基またはＳアミノ酸残基の使用について評価した。適切なコドンがこれらの残基について選択されれば、Ｇ／ＴおよびＧ／Ｓ切断部位の配列は、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩをコードする。これらの切断部位配列はいずれも十分に機能した。これらはいずれも、分泌シグナルと同じリーディングフレームに融合する、所望のタンパク質コード配列の便利な挿入を提供する。

１Ｒ５Ｌ（Ｈ）最適化分泌シグナルの配列はＭＲＴＩＩＡＬＬＬＬＬＴＶＳＧＡＨＧである。切断部位の後ろにある好ましいアミノ酸はＳである。最適化された分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８に列挙する。

（実施例８）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中での異種タンパク質の発現のための別の３’ＵＴＲ要素の評価
遺伝子の３’ＵＴＲとｍＲＮＡは、それぞれ、遺伝子発現の転写レベルおよび翻訳レベルで重要な役割を担っている（Ｋｌｏｃら、Ｃｅｌｌ（２００２）１０８：５３３−５４４によって概説されている）。したがって、ポリアデニル化の改善を助け、核から細胞質へのｍＲＮＡの転位を改善し、ｍＲＮＡの安定性を改善し、ｍＲＮＡの粗面小胞体への局在化を妨害しない、発現ベクター中での最適な３’ＵＴＲ配列の使用は、培養培地中への生成物の放出を指示する発現ベクターの有用性にとって重要である。これらの理由から、発現プラスミドの設計において３’ＵＴＲが最適化のために考慮されることが推奨されているからである。（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００１）３１：５７２−５８２）。

Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐＭＴｔＰＡ発現プラスミドは、ウイルスＳＶ４０初期３’ＵＴＲ配列を終結とポリアデニル化のために利用する。これは機能的ではあるが、このＳＶ４０配列が使用される際には改善の余地があると思われる。例えば、昆虫システム中での異種発現のための３’ＵＴＲの最適化はＶａｎ Ｏｅｒｓら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）２２５３−２２６２）によって報告されている。彼らはＳＶ４０初期３’ＵＴＲをバキュロウイルスの３’ＵＴＲで置換し、発現レベルを増大させた。彼らはどの部分が発現の増大に寄与しているかを決定するために新規の３’ＵＴＲを細かく調べることは行わなかったが、この研究により３’ＵＴＲの中での変化が異種タンパク質の発現を改善できることが明らかとなった。残念なことに、個々の発現システムは特有のものであり、何がＳ２細胞中での分泌型産物の発現のための最適な３’ＵＴＲを構成するかを決定することが必要である。

ほとんどの真核生物の３’ＵＴＲ要素の主要な特徴は、ポリアデニル化シグナル配列（ポリＡシグナル）であり、これはＡＡＴＡＡＡである。ポリＡシグナルは、核の中に、ポリアデニル化が起こる場所にある、新しく転写されたｍＲＮＡの３’末端切断部位の定義に関与する。いくつかの３’ＵＴＲにおいては、保存された配列は、切断部位のすぐ下流で観察される。これらの配列は下流配列要素（ＤＳＥ）と呼ばれ、３’ＵＴＲ切断部位の定義を助けると考えられる。

ｐＭＴｔＰＡベクターおよび誘導体の中に存在するＳＶ４０初期３’ＵＴＲは１３８塩基長であり、これには２つの推定のポリＡシグナルが含まれる。ポリＡテールの付加のための切断部位はヌクレオチド９６に存在する。ヌクレオチド９６〜ヌクレオチド１３８の間の配列中には、切断を助けるであろうＤＳＥモチーフを提示すると考えられる配列が存在する。

高レベルの発現を生じるであろう３’ＵＴＲ配列を同定する試みにおいて、多くのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子上の３’ＵＴＲを評価した。重要な基準は３’ＵＴＲがおよそ１００ヌクレオチドの長さであり、分泌型の産物をコードする遺伝子に由来することである。Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋら（Ｇｅｎｅ（１９９５）１４３：１４７−１５４）によって記載されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのキチナーゼ様タンパク質（ＣＬＰ）はＳ２細胞に由来する最も豊富に存在する分泌型タンパク質のうちの１つであり、これらの基準を満たす。この３’ＵＴＲはＡＡＴＡＡＡ配列を構成するポリＡシグナルを持たない。Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋらは、ポリＡシグナルがＡＡＴＡＴＡまたはＣＡＴＡＡＡのいずれかであると示唆している。

Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋら（１９９５）においては、ＣＬＰ ３’ＵＴＲ切断部位は、ポリＡ配列がｍＲＮＡに対して付加された位置（ヌクレオチド１０６）によって定義されている。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子コレクション（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ，ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ＤＧＣ／）に由来するＣＬＰ ｃＤＮＡクローンＬＤ２１６１９に基づくと、切断部位は、７〜１１ヌクレオチドさらに下流にある。Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋらの配列、ＬＤ２１６１９配列、および対応するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａゲノム配列由来の配列の配列アラインメントにより、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋらの配列中のヌクレオチド４３位にある１ヌクレオチドの誤りが同定され、Ａ〜Ｇへの変化であった。この変化は、ＡＡＡＡＡＡＡではなくＡＡＧＡＡＡＡ（「変異体ポリＡシグナル」）の配列を生じる。ＣＬＰ ３’ＵＴＲ中には別のＡＡＧＡＡＡ配列も存在する。これらのＡＡＧＡＡＡ配列の位置に基づいて、本発明者らは、これらのうちの１つがポリＡシグナルとして作用する可能性があり、２番目のものが最も可能性が高いと仮定した。発現ベクター中のＣＬＰ ３’ＵＴＲの最初の試験のために、１１７ヌクレオチドの長さの断片を選択した。この断片には、ＡＡＧＡＡＡ変異体ポリＡシグナルの両方が含まれている。また、様々な供給源のＣＬＰ配列のアラインメントに基づくと、この１１７ヌクレオチドの断片は、示唆された切断部位（すなわち、２つの変異体ポリＡシグナルのそれぞれの付近）のいずれかで切断できるであろう。

１１７ヌクレオチドのＣＬＰ ３’ＵＴＲ配列を、ＳＶ４０初期３’ＵＴＲを除去した発現ベクターｐＭＴｔＰＡΔＸｈｏに付加した。１１７ヌクレオチドのＣＬＰ ３’ＵＴＲの挿入によっては、レポーターＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏタンパク質の発現において１．５倍の増大が生じた。ＡＡＧＡＡＡ配列がポリＡシグナルとして作用するかどうかを明らかにするための試みにおいて、２つの推定されるシグナル中のＧ残基をＴ残基に突然変異させて、コンセンサスポリＡ配列に適合させた。この変化によっては、ＳＶ４０初期３’ＵＴＲを持つ同じ発現ベクターと比較して、発現の３倍の増大が生じた。さらなる実験においては、ＣＬＰ ３’ＵＴＲ中の推定されるポリアデニル化部位を両方変異させて配列を破壊した（第１のＡＡＧＡＡＡをＡＣＧＣＡＡに変化させ、第２のＡＡＧＡＡＡをＡＡＴＧＡＡに変化させた）。これらの変化によっては、発現レベルに劇的な低下が生じた。これは、これらの推定されるポリアデニル化シグナルのうちの少なくとも１つがポリＡシグナルとして作用することをさらにサポートする。

さらなる下流の配列がＤＳＥとして機能するために必要であるかどうかを決定するために、３’ＵＴＲを、対応する位置にあるゲノム配列に基づいてさらに２０ヌクレオチド伸張させた。伸張させた３’ＵＴＲは、発現レベルを２倍〜３倍低下させ、これは予想以上であった。

これらの結果に基づいて、Ｇ〜Ｔへの２つの突然変異を持つ１１７ヌクレオチドのＣＬＰ−３’ＵＴＲを、実施例９に記載する複数の調節要素を組み合わせた発現ベクターの組み立てるにおける使用のために選択した。この最適化された３’ＵＴＲはより高い発現レベルを生じ、これをＯｐ−ＣＬＰ−３’ＵＴＲと呼ぶ。Ｏｐ−ＣＬＰ−３’ＵＴＲの配列を配列番号９に列挙する。

（実施例９）
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞中での異種タンパク質の発現の増大のための調節要素の組み合わせを含む発現ベクターの評価
Ｓ２細胞中での組み換え体タンパク質産物の発現のための最適化された発現ベクターを作成するためには、以下の５つの調節要素のそれぞれが必要である：近位プロモーター、コアプロモーター、５’ＵＴＲ、分泌シグナル、および３’ＵＴＲ。理想的には、これらの５つの要素のそれぞれが最適化され、それらの要素の組み合わせによって、より高レベルの産物の発現を生じる発現カセットが得られるであろう。先の実施例では、以下の最適化した要素を同定した：合成の近位プロモーター３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥ、合成のコアプロモーターＳＣＰ１−ＴｏｌｌｏＭＴＥΔ１１１およびＳＣＰ７、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を持つ短縮型５’ＵＴＲ、合成の分泌シグナル１Ｒ５Ｌ（Ｈ）、および最適化した３’ＵＴＲ Ｏｐ−ＣＬＰ−３’ＵＴＲ。

これらの最適化した調節要素の組み合わせを評価するための第１の工程として、１Ｒ５Ｌ分泌シグナルとＯｐ−ＣＬＰ−３’ＵＴＲを、実施例３に記載したｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏ中の、それぞれｔＰＡ分泌シグナルとＳＶ４０初期３’ＵＴＲを置換するために使用した。これらの２つの最適化した要素を含む発現ベクターをｐＨＢＩ−５と呼ぶ。レポーター遺伝子（例えば、Ｈ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ）をｐＨＢＩ−５にクローニングし、それらの発現を評価した。一般的には、発現レベルは、ｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏにクローニングした同じレポーター遺伝子について見られた発現レベルよりも１．５倍高く、１Ｒ５Ｌ分泌シグナルおよびＯｐ−ＣＬＰ−３’ＵＴＲによって個々に見られた改善は付加的ではなかったことを示している；しかしながら、発現レベルは、ｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔＸｈｏベクターによって駆動されたレベルよりもなお高かった。

５つの要素を全て含む２つの発現カセットを組み立てた。２つのカセットは、２つのコアプロモーターをそのために使用したことに関して異なる。第１のカセットにはＳＣＰ１−ＴｏｌｌｏＭＴＥΔ１１１コアプロモーターが含まれており、第２のカセットにはＳＣＰ７コアプロモーターが含まれている。これらの発現カセットを、それぞれＨＢＩ−１０およびＨＢＩ−１１と呼ぶ。カセット全体の配列を配列番号１０（ＨＢＩ−１０）と配列番号１１（ＨＢＩ−１１）に列挙する。図１および図２は、ＨＢＩ−１０とＨＢＩ−１１の、それぞれの近位プロモーター領域とコアプロモーター領域の配列を示し、全てに注釈をつけた。ｐＭＴｔＰＡと比較したＨＢＩ−１０およびＨＢＩ−１１の相違を、図３に表の形式でまとめた。

ＨＢＩ−１０発現カセットとＨＢＩ−１１発現カセットを、ｐＢＲ３２２クローニングベクターに挿入して、Ｓ２細胞発現ベクターｐＨＢＩ−１０およびｐＨＢＩ−１１を作成した。これらの２つのＳ２細胞発現ベクターについてのプラスミドマップを、それぞれ図４と図５に示す。

ｐＨＢＩ−１０発現ベクターとｐＨＢＩ−１１発現ベクターを利用したＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ産物の発現の評価により、ｐＨＢＩ−１１が、ｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔベクターと比較しておよそ３倍高い発現レベルが生じ、ｐＨＢＩ−１０によっては、ｐＭＴ−Ｘ−ＫｔΔベクターによって指示された同じＨ３ ＨＡ−Ｅｃｔｏ産物の発現と比較しておよそ２倍高い発現レベルが生じたことが明らかになった。

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Claims (14)

1. 発現カセットを含む、培養された昆虫細胞中での異種タンパク質の発現および分泌のための発現ベクターであって、前記発現カセットには、異種遺伝子配列の挿入によって発現ベクターで安定に形質転換された細胞からのタンパク質の発現を生じるように、発現カセットの中に動作可能であるように連結された近位プロモーター要素とコアプロモーター要素からなる合成のプロモーターが含まれる、発現ベクター。
2. 配列番号６に示される近位プロモーター３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥ配列および、配列番号２に示される合成のコアプロモーターＳＣＰ１−ＴｏｌｌｏＭＴＥΔ１１１配列をさらに含む、請求項１に記載の合成のプロモーター。
3. 配列番号６に示される近位プロモーター３×Ｒ ＭＲＥ−３×Ｒ ＭＲＥ配列および配列番号３に示される合成のコアプロモーターＳＣＰ７配列をさらに含む、請求項１に記載の合成のプロモーター。
4. 組み合わせにより異種タンパク質の発現を駆動できるように、合成の近位プロモーターとコアプロモーターに動作可能であるように連結された合成の５’ＵＴＲ要素をさらに含む、請求項２または３に記載の発現ベクター。
5. 組み合わせにより異種タンパク質の発現と分泌を駆動できるように、合成の近位プロモーター、コアプロモーター、および５’ＵＴＲ要素に動作可能であるように連結された合成の分泌シグナル配列をさらに含む、請求項４に記載の発現ベクター。
6. 組み合わせにより異種タンパク質の発現と分泌を駆動できるように、合成の近位プロモーター、コアプロモーター、５’ＵＴＲ、および合成の分泌シグナル配列要素に動作可能であるように連結された合成の３’ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項５に記載の発現ベクター。
7. 配列番号４に示される配列を含む、請求項４に記載の合成の５’ＵＴＲ。
8. 配列番号５に示される配列を含む、請求項４に記載の合成の５’ＵＴＲ。
9. 配列番号７に示される１Ｒ５Ｌ（Ｈ）をコードする配列を含む、請求項５に記載の合成の分泌シグナル配列。
10. 配列番号９に示されるＯｐ ＣＬＰ ３’ＵＴＲ配列を含む、請求項６に記載の合成の３’ＵＴＲ。
11. 配列番号１０に示される発現カセットを含む、培養された昆虫細胞中での異種タンパク質の発現と分泌のための発現ベクター。
12. 配列番号１１に示される発現カセットを含む、培養された昆虫細胞中での異種タンパク質の発現と分泌のための発現ベクター。
13. 前記昆虫細胞がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２に記載の発現ベクターの使用。
14. 前記昆虫細胞がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２に記載の発現ベクターの使用。

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