JP2010518830A

JP2010518830A - 血友病ａの処置のための新規第ｖｉｉｉ因子

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Publication number: JP2010518830A
Application number: JP2009550317A
Authority: JP
Inventors: サブラール，ディディエ; プランティエ，ジャン−リュク; デルクール，マルク; ネグリエ，クロード; マンギー，ティエリー; ブルサ，ステファーヌ; マラン，シルヴィ
Original assignee: Biomethodes SA; Hospices Civils de Lyon HCL
Current assignee: Biomethodes SA; Hospices Civils de Lyon HCL
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2010-06-03
Anticipated expiration: 2028-02-22
Also published as: WO2008129180A2; US20100311659A1; CA2678190C; CA2678190A1; WO2008129180A3; US8623824B2; FR2913020A1; FR2913020B1; EP2125885B1; EP2125885A2; JP5618546B2

Abstract

本発明は、Ａ２および／またはＣ２ドメインに少なくとも一つの置換を有する、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体に関する。本発明はまた、特にインヒビターを有する患者における血友病Ａの処置にそれらを使用することに関する。

Description

発明の分野
本発明は、止血の分野、さらに具体的には血友病Ａの分野に関する。本発明はヒト第ＶＩＩＩ因子変異体およびその使用に関する。

技術的背景
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、主として肝細胞および類洞内皮細胞により合成される。ＦＶＩＩＩの血漿濃度は、０．１〜０．２mg/lに含まれるが、その循環型形態は不活性であり、フォンウィルブラント因子（ｖＷＦ）と会合している。ＦＶＩＩＩは、血液凝固の内因性経路（いわゆる内因系経路）に主な役割を果たす。血管が外傷によって損傷すると、出血がトリガーされる。これに応答して、傷害部位を塞ぐ凝血の形成をもたらす、複雑に連鎖した事象からなる止血過程が開始する。血液凝固は、傷害を受けた血管壁に血小板が接着したときに開始する。傷害が激しい場合、傷害部位の血小板凝集物では、血流を止めるための止血栓を形成するには不十分である。したがって、凝固因子が介入するが、その目的は、トロンビンの作用により可溶性フィブリノーゲン分子から生成したフィブリンネットワークを形成することである。不溶性線維から構成されるこのネットワークの形成は、凝血を固くつなぎ留めるために重要である。カスケードは、経時的に、そして各段階で、前駆タンパク質が活性化プロテアーゼに変換され、そのプロテアーゼがカスケードの次の前駆タンパク質を切断するか、またはその前駆タンパク質の切断のための補因子として作用することを意味すると理解されたい。したがって、ＦＶＩＩＩは、トロンビンおよび第Ｘａ因子の作用によってＦＶＩＩＩａにタンパク質分解的に切断される。この活性血液凝固促進形態（ＦＶＩＩＩａ）で、ＦＶＩＩＩは、因子ＦＸに対する因子ＦＩＸａのタンパク質分解効率を著しく増加させる。

血友病Ａは、ＦＶＩＩＩをコードする劣性遺伝子の突然変異を原因とする活性化ＦＶＩＩＩの欠乏を特徴とする出血性障害である。一部のまれな例では、血友病Ａは、ＦＶＩＩＩに対する自己抗体の自然発生に起因することがあり、これは、後天性血友病Ａとして知られている。

血友病は、出血に応答した血液凝固の欠損として出現する。未処置の血友病Ａは、外傷後に、時に自然出血の後にさえ、特に関節への過度の出血などの症状を示す。血友病Ａは、最もよくみられる凝固障害であり、男性出生５０００〜１００００人あたり１人に起こる。全ての血友病患者が同様または同程度に発症するわけではない。例えば、血友病Ａは、ｉ）ＦＶＩＩＩレベルが「正常な」循環レベルの１％以下の場合に重症で；ｉｉ）ＦＶＩＩＩレベルが「正常」の１〜５％範囲にある場合に中等度であり；そしてｉｉｉ）ＦＶＩＩＩレベルが正常の５〜３０％の場合に軽症とみなされる。これらの３種類の血友病Ａは、以下の頻度で起こる：血友病患者の５０％は重症の形態、１０％は中等度の形態、そして４０％は軽症の形態を有する。

多数の遺伝的異常が、ＦＶＩＩＩをコードする遺伝子に関連していた。該遺伝子は、Ｘ染色体長腕の先端（ローカスＸｑ２８）に位置する。血友病Ａは、この遺伝子の異常に起因する。その以上はＸ連鎖劣性遺伝障害であり、男性および女性がこの障害を伝えることができるが、男性のみが罹患する。この分子の欠損は、遺伝子の突然変異、欠失または逆位でありうる。ミスセンス点突然変異を有する大部分の患者は、軽症または中等度の疾患を有する。欠失は以下の２種類に分類される：ｉ）小欠失；ｉｉ）大欠失（＞１kb）。大部分の大欠失は重症表現型を付与する。遺伝的逆位に関して、イントロン２２の逆位が最も高頻度であり、重症血友病Ａ症例の多数（４５％）の原因である。別の逆位であるイントロン１は、頻度は低い（３％）ものの、重症の疾患を引き起こしうる。

要約すれば、これらの突然変異は、機能的に正常なＦＶＩＩＩ分子の産生減少または機能的に欠損したＦＶＩＩＩ分子の量的に正常な産生のいずれかをもたらす。

ＦＶＩＩＩ遺伝子は、アミノ酸（aa）２３５１個のポリペプチド鎖（配列番号２）をコードし、このポリペプチド鎖は、１９aaのシグナルペプチドおよび２３３２aaの成熟タンパク質（３３０kDa）（配列番号３）に対応する。ＦＶＩＩＩ前駆体のヌクレオチド配列を配列番号１に、対応するタンパク質配列を配列番号２に示す。ＦＶＩＩＩ前駆体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、以下の７個の機能的ドメインが連なったものからなる：Ａ１、ａ１、Ａ２、ａ２、Ｂ、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２（Vehar et al., 1984, Nature, 312:337-342）。

ＦＶＩＩＩは、アルギニン１３１３および１６４８で最初の細胞内タンパク質分解を受け、以下からなるＦＶＩＩＩヘテロ二量体を産生する：ｉ）Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ重鎖；ｉｉ）ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２軽鎖。ＦＶＩＩＩは、血漿中でヘテロ二量体として循環する。これら二つの鎖の間の相互作用は、とりわけ、ドメインＡ１およびＡ３にキレートした銅分子が存在することにより確実になる。血漿中に分泌された直後に、ＦＶＩＩＩは、プロテアーゼからＦＶＩＩＩを保護するフォンウィルブラント因子（ｖＷＦ）と非常に高親和性の会合を形成する。ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦは非共有結合性複合体を形成するが、この複合体において結合は、主にＦＶＩＩＩの以下の二つの領域を介して起こる：軽鎖のＮ末端領域および２３０３〜２３３２でのＣ末端領域（Ｃ２ドメイン）。凝固の間に、ＦＶＩＩＩは、以下の三つの部位でトロンビンおよび第Ｘａ因子によって切断される：ｉ）トロンビンは軽鎖のアルギニン１６８９ならびに重鎖のアルギニン３７２およびアルギニン７４０で切断する；ｉｉ）第ＸＡ因子は、アルギニン３３６、アルギニン３７２およびアルギニン７４０でＦＶＩＩＩを切断する。これらの切断のうち二つが共通である（アルギニン３７２およびアルギニン７４０）。アルギニン３７２およびアルギニン１６８９での切断は、ＦＶＩＩＩが凝固カスケードに参加するために不可欠である。これらの切断は、ＦＶＩＩＩを活性化（ＦＶＩＩＩａとも知られている）（「ａ」は「活性」の意）するが；ＦＶＩＩＩａの活性化に加えて、これらの切断の結果として、１７０kDaのＢドメインの除去およびｖＷＦからのＦＶＩＩＩａの解離が生じる。

アミノ酸７４１〜１６４８により規定されるＦＶＩＩＩのＢドメインは、場合によりヒトＦＶＩＩＩの代わりに使用することができるブタＦＶＩＩＩ（米国特許第６，４５８，５６３号；国際公開公報第０１／６８１０９号；米国特許第６，７７０，７４４号）を含めたリコンビナントＦＶＩＩＩの活性の損失なしに、完全または部分的に欠失させることができる（Toole et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 (16):5939-5942；Eaton et al., 1986, Biochemistry, 25 (26):8343-8347；Langer et al., 1988, Behring Inst. Mitt, 82:16-25；Meulien et al., 1988, Protein Eng, 2(4):301-6；および米国特許第４，８６８，１１２号）。

突然変異は、その大部分が点突然変異であるが、ＦＶＩＩＩの血液凝固促進活性を喪失せずにＦＶＩＩＩの異なる部位に挿入することができる（米国特許第５，７４４，４４６号；米国特許第５，８５９，２０４号；米国特許第６，０６０，４４７号；米国特許第６，１８０，３７１号；米国特許第６，２２８，６２０号；米国特許第６，３７６，４６３号；EP1561757；国際公開公報第０２／２４７２３号；国際公開公報第９７／４９７２５号）。EP1502921および国際公開公報第２００５／１１１０７４号は、安定性が向上したヒトＦＶＩＩＩＩ変異体を記載している。

動物細胞におけるＦＶＩＩＩ産生を増加させるためのＦＶＩＩＩｃＤＮＡの改変を記載している他の特許（US2003/0083257；国際公開公報第２００５／０４０２１３号；および米国特許第６，７８０，６１４号）を引用することもできる。ｃＤＮＡの改変は、US2002/165177；US2002/0182684；EP1048726；EP1283263に開示されている。

投与されるＦＶＩＩＩの単位数は、ＦＶＩＩＩに関するＷＨＯ標準を参照して国際単位（ＩＵ）で表現される。ＦＶＩＩＩ活性は、（正常なヒト血漿に対する）パーセンテージとして、または（国際標準に対する）国際単位のいずれかで表現される。ＦＶＩＩＩの活性の１国際単位（ＩＵ）は、正常なヒト血漿１mlに含有されるＦＶＩＩＩの量に等しい。血漿ＦＶＩＩＩアッセイは、クロノメトリック法または発色法のいずれかにより実施することができる。

血友病Ａ（重症および中等度形態）は、一般に、欠乏した凝固因子の反復注射またはその潅流に基づく予防的または治癒的補充療法により処置される。血友病Ａを有する患者は、以下の異なる種類の血漿由来ＦＶＩＩＩまたはリコンビナントＦＶＩＩＩで処置される：ｉ）リコンビナント；ｉｉ）半精製血漿産物；ｉｉｉ）従来のカラムまたはイムノアフィニティーカラムで精製された血漿産物。最初のリコンビナントＦＶＩＩＩ濃縮物は、安定化剤としてアルブミンを含有していた。これらには、Kogenate（登録商標）(Bayer)、Helixate（登録商標）(Bayer製造、Aventis販売)、およびRecombinate（登録商標）(Baxter)が挙げられる。Kogenate（登録商標）ＦＳ(Bayer)、Helixate（登録商標）FS(Bayer)、およびReFacto^MC(Wyeth)などの新しい無アルブミン製剤が開発された。それにもかかわらず、これらの製剤は、これらのリコンビナントタンパク質の製造段階の間に使用された細胞培養培地に起因する痕跡量のアルブミンを含有する。

リコンビナントヒトＦＶＩＩＩは、いっそう最適化する必要がある。実際に、ＦＶＩＩＩは、生理的条件で比較的不安定で、血中で低い活性を有し、非常に低濃度が存在し（０．１〜０．２μg/ml）、そして１０〜１２時間の半減期を有する。

重症血友病Ａの患者の約３０％では、補充療法は、通常使用される処置の失敗を導く、ＦＶＩＩＩに特異的な合併症を引き起こす。実際に患者は、補充療法後に外因性リコンビナントＦＶＩＩＩに対する抗体を生じるおそれがある。これらの抗ＦＶＩＩＩ抗体は、ＦＶＩＩＩの血液凝固促進活性を阻害することから、「阻害抗体」または「インヒビター」という名前である。さらなるＦＶＩＩＩの潅流は、これらの抗体により無効にされ、「既往反応」として知られている現象により阻害抗体の量の増加を生じる。

急速に患者がＦＶＩＩＩで処置不能になった場合、インヒビターの「力価」が測定される。この力価は、国際ベセスダ単位（ＢＵ）で表現される。１BUのインヒビターは、正常血漿１ml中のＦＶＩＩＩの半量を不活性化することに対応する。１０BU未満の場合に力価は「低」く、１０BUを超える場合に「高」い。

インヒビターの力価が比較的低い場合に、血友病の患者にKogenate（登録商標）FS、Helixate（登録商標）FS、Recombinate（登録商標）、およびReFacto^MCなどの前記ＦＶＩＩＩ濃縮物を与えてもよいが、これは、インヒビターの力価上昇を誘導するという重大なリスクをもつことから、これは厳密にモニターしなければならない。

阻害抗体をコントロールする方法の一つは、「de Bonn」プロトコールに準じて大用量のＦＶＩＩＩの投与により免疫トレランスを誘導することである。一部の患者では阻害抗体の力価が非常に高いため、毒性の理由から患者を大用量のＦＶＩＩＩで処置することができない。

「Bonn-Malmoプロトコール」として知られている第２のアプローチは、一方でインヒビターのex vivo免疫吸着直後の血液の再注入、そしてもう一方で免疫抑制剤と併用した大用量のＦＶＩＩＩの注入に基づく。これらの処置は、リコンビナントＦＶＩＩＩの点から見て極めて高価であり、そして部分的な成功を収めた。

別のアプローチは、内因系凝固経路におけるＦＶＩＩＩの必要性を「回避」するために、以下を使用することによって凝固因子を供給することにある：ｉ）第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ因子を含有する血漿由来活性化プロトロンビン複合体（FEIBA（登録商標） VH, Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity; Baxter）；ｉｉ）リコンビナント活性化第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ；NovoSeven（登録商標）／Niastase（登録商標）；NovoNordisk)。

該アプローチは、明らかな成功を収めているが、それにもかかわらず、この種の治療法に関連する副作用の発生（投与回数に関係した追加的な出血または逆に血栓事象など）により相殺される。

注射後に循環ＦＶＩＩＩレベルが増加し、次いでその半減期に関係して徐々に減少することに留意すべきである。ＦＶＩＩＩの半減期は、８〜１６時間の範囲で、平均は１２時間であり、反復注射の問題を提起する。

別の選択肢は、ヒトＦＶＩＩＩに対する抗体を避ける目的で、ブタＦＶＩＩＩを使用することにある。ヒトＦＶＩＩＩに対するインヒビターを発生した患者は、半精製ブタＦＶＩＩＩ（Hyate:C）でうまく処置された。それでも、US2004/0249134に言及されたように、ブタＦＶＩＩＩの数回の注射後に抗ブタＦＶＩＩＩインヒビターも発生したことから、この成功は単に部分的であった。この現象により、処置を終了せざるを得なくなるおそれがある。IpsenおよびOctagenは、現在、米国のEmory大学と共同して、ＯＢＩ−１として知られているリコンビナントブタＦＶＩＩＩをHyate:Cの代用として共同開発している（国際公開公報第２００５１０７７７６号）。

したがって、ブタＦＶＩＩＩの投与は、インヒビターを用いた血友病Ａ患者の処置のための決定的な解決法ではない。

以上のように、今日、インヒビターを用いた、または用いない、血友病Ａを有する個体のための理想的な処置はない。これらの阻害抗体の発生に関連した市販のＦＶＩＩＩに基づく処置に伴い遭遇される様々な問題は、血液凝固促進比活性を保持し、そして阻害抗体により認識されるエピトープを喪失した新規ＦＶＩＩＩを迅速に設計する努力を推進した。

少数の研究しか、「阻害」抗体のエピトープ特異性に取り組んでいない。一部の阻害抗体は、以下のＦＶＩＩＩ分子の小領域を認識すると思われる：ｉ）軽鎖のＣ２ドメイン（２１８１−２３２１）；ｉｉ）重鎖のＡ２ドメイン（４８４−５０９）；ｉｉｉ）Ａ３ドメイン（１６９４−２０１９）（Prescott et al., 1997, Blood, 89:3663-3671；Barrow et al., 2000, Blood, 95:557-561）。

セリン２１７３とチロシン２３３２の間の１８kDaのＣ２ドメインは、膜リン脂質結合ドメインおよびｖＷＦ結合ドメインの一部を有する。Ｃ２ドメインに対する阻害抗体は、血液凝固促進活性に必要なリン脂質への結合を主に遮断するが、ｖＷＦとの相互作用もまた遮断する。メチオニン２１９９、フェニルアラニン２２００、バリン２２２３、リシン２２２７、ロイシン２２５１およびロイシン２２５２という位置での突然変異は、ＦＶＩＩＩＩ活性ならびにリン脂質および／またはｖＷＦへの結合におけるこれらのアミノ酸の重要性を例示している（Pratt et al., 1999, Nature, 402:439-442）。

抗Ａ２抗体は、第Ｘ因子の補助因子としてＦＶＩＩＩａの機能を阻害する（Lollar et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:2497-2504）。Ａ２の主エピトープは、アルギニン４８４とロイシン５０８の間に位置した（Healey et al., 1995, J. Biol. Chem, 270:14505-14509）。

Ａ３および／またはＣ２ドメインに対する抗体は、ＦＶＩＩＩとｖＷＦの間の相互作用の安定化を阻止し、活性化ＦＩＸへのＦＶＩＩＩ軽鎖の結合もまた妨害する。

インヒビターは、患者によって非常に不均一であり、エピトープの特異性は経時的に変化しうる。ＦＶＩＩＩの阻害動態の研究から、以下の２種類の同種抗体が明らかとなった：外因性ＦＶＩＩＩを完全に中和するＩ型抗体、およびＦＶＩＩＩの活性を決して完全には阻害しないＩＩ型抗体。ＩＩ型抗体は、飽和しないか、またはその濃度に応じて漸減する親和性を示すことから、ＦＶＩＩＩの血液凝固促進活性を完全には遮断しない。

阻害抗体により認識することができる領域は、特許US2003/147900および国際公開公報第００／４８６３５号に引用されている。これらの露出した抗原性ＦＶＩＩＩ領域は、１６４９−２０１９位、１０８−３５５位、４０３−７２５位および２０８５−２２４９位である。

さらに、US2005/0256304は、置換が抗原性を減少させる見込みのあるヒトＦＶＩＩＩにおける以下の位置のセットを記載している：１９７、１９８、１９９、２０１、２０２、４０７、４１１、４１２、４１９、５１５、５１７、６１３、６１７、６３６、６３７、６３８、６３９、８２３、１０１１、１０１３、１２０８、１２０９、１２１０、１２５４、１２５５、１２５７、１２６２、１２６４、１２６８、１１１９、１１２０、１１２１、１１２２、および１１２３。

ヒトＦＶＩＩＩの抗原性は、インヒビターの認識部位のグリコシル化により減少しうる。該方法は、米国特許第６，７５９，２１６号およびJP2004141173に開示されている。

別の選択肢は、以下のドメインでインヒビターにより通常認識されるヒトＦＶＩＩＩエピトープを置換することにある：ｉ）Ａ２（４８４−５０９）；ｉｉ）Ａ３（１６９４−２０１９）、ａ３（１６４９−１６８７）；ｉｉｉ）Ｃ２（２１８１〜２３２１）。この解決は、ハイブリッドのリコンビナントタンパク質であるヒト／ブタＦＶＩＩＩの使用に基づく。

阻害抗体の主なターゲットは、ＦＶＩＩＩのＡ２およびＣ２ドメインに位置する（Saenko et al., Haemophilia, 2002）。実際に、阻害抗体の９０％は、一般に、ヒトＡ２およびＣ２ドメインに対すると考えられている（Barrow et al., 2000, Blood, 95:564-569）。そのうえ、ヒトインヒビターは、ブタＦＶＩＩＩに弱い活性を有することが示された（Koshihara et al., Blood, 1995）。

したがって、ブタ配列によるヒトＦＶＩＩＩエピトープの置換は、阻害抗体に対して反応性の低いハイブリッド分子を誘導すると予想される。したがって、ヒトＡ２およびＣ２ドメインが、対応するブタドメインに交換された（Lubin et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:8639-8641）。しかし、またしても抗ブタＦＶＩＩＩ抗体が、最終的に、患者をインヒビターで処置中に発生した。

多数の特許が、血液凝固促進活性を保持しているヒト／動物ＦＶＩＩＩハイブリッドについて記載している。本明細書に使用されるようなヒト／動物ハイブリッドは、ヒトＦＶＩＩＩ配列と動物起源のＦＶＩＩＩ配列の間の少なくとも一つのアミノ酸の任意の組み合わせ（置換）を意味する。該ハイブリッドは、一方で、領域（機能的サブユニットまたは構造ドメイン）を対応する動物領域により置換することによって製造された。例えば、米国特許第５，８８８，９７４号；米国特許第５，６６３，０６０号；米国特許第５，５８３，２０９号；EP1359222；米国特許第５，７４４，４４６号；国際公開公報第９３／２００９３号；および国際公開公報第９５／２４４２７号という特許は、ヒトおよび非ヒトＦＶＩＩＩの重鎖および軽鎖の組み合わせ由来の、ならびに／またはヒト／ブタＦＶＩＩＩドメインの組み合わせ由来のハイブリッドＦＶＩＩＩ分子を提供する。

米国特許第５，７４４，４４６号は、ヒトＡ２ドメインの配列が対応するマウスまたはブタの配列により置換されたヒト／ブタＦＶＩＩＩ変異体を記載している。Ａ２ドメインの置換されたフラグメントは、３７３−５４０、３７３−５０８、４４５−５０８、４８４−５０８、４０４−５０８、４８９−５０８および４８４−４８９である。

米国特許第５，３６４，７７１号は、ヒトおよび非ヒトＦＶＩＩＩ由来の軽鎖および重鎖の組み合わせの組み合わせから得られるＦＶＩＩＩハイブリッド、すなわちＡ２ドメインがブタＡ２ドメインに交換されたヒトＦＶＩＩＩを精製する方法を提供している。

他方で、いくつかの特許では、該ハイブリッドは、動物起源（ブタ、イヌまたはマウス）の対応するアミノ酸によるヒトＦＶＩＩＩの一つまたは数個のアミノ酸の点置換により形成される。例えば、US2004/0197875は、ヒトＦＶＩＩＩのある位置でチャージするコドンの改変を開示している。該位置は、ブタＦＶＩＩＩ配列に関して規定される。EP1454916は、ヒトｃＤＮＡへのブタのコドン導入を記載している。

これらの特許の間で、Ａ２ドメインの領域におけるヒト／ブタＦＶＩＩＩハイブリッドを開発するための研究が検討された。EP1359222は、このようなハイブリッドを作製する目的で、ブタＡ２ドメイン配列の研究を記載している。US2003/166536；米国特許第６，３７６，４６３号；国際公開公報第００／７１１４１号は、４８４〜５０８位での、すなわち国際公開公報第００／７１１４１号については４８６、４９０、４９１、４９３、４９４、４９６、４９８、４９９、５００、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７位、および米国特許第５，８５９，２０４号については４８５、４８７、４８８、４８９、４９２、４９５、５０１、５０８位での、Ａ２ドメインにおける主要なエピトープでのヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸置換を記載している。特に、アルギニン４８４、プロリン４８５、チロシン４８７、セリン４８８、アルギニン４８９、プロリン４９２、バリン４９５、フェニルアラニン５０１、およびイソロイシン５０８位にアラニン置換が加えられた。抗原性減少を付与するこれらの置換は、治療的見地から関心がもたれる。

同様に、米国特許第６，１８０，３７１号では、アルギニン４８４はセリンにより、プロリン４８５はアラニンにより、アルギニン４８９はグリシンにより、プロリン４９２はロイシンにより置換されている。これらの変異体を用いると、抗体によるＦＶＩＩＩの血液凝固促進機能の阻害は、軽減または全く消失した。アルギニン４８４、アルギニン４８９およびフェニルアラニン５０１で各コドンがアラニンで置換されている二重または三重突然変異体の治療的関心が示唆されている。

置換がＣ２ドメインにだけ及ぶＦＶＩＩＩ変異体を開示している特許もまたある。

US2004/249134；国際公開公報第０３／０４７５０７号；国際公開公報第０２／２４７２３号；米国特許第６，７７０，７４４号は、メチオニン２１９９、フェニルアラニン２２００、バリン２２２３、リシン２２２７、ロイシン２２５１およびロイシン２２５２位での置換を記載している。該置換は、Ｂドメインを欠如したＦＶＩＩＩに導入された。２２１５、２２２０、２３２０、２１９５、２１９６、２２９０および２３１３位のアミノ酸がアラニンで置換された。

２２２３位に関してヒトとブタＦＶＩＩＩを比較すると、バリンがアラニンに交換されている。この突然変異は、Prattの論文「Structure of the C2 domain of human FVIII」（Nature, 1999, 402:439-442）および米国特許第６，７７０，７４４号に挙げられている。

２１９９、２２００、２２２３および２２２７などの、ある突然変異位置の組み合わせは、いくつかの抗Ｃ２ドメイン阻害抗体に対するＦＶＩＩＩの抗原性を低下させるが、その全てがＦＶＩＩＩの血液凝固活性を保持することが記載されている。

国際公開公報第ＷＯ９９／４６２７４号およびUS2005/0079584において、J. Lollarのグループは、免疫原性がより低いＦＶＩＩＩを構成するために潜在的に関心がもたれる領域である２１８１〜２２４３を記載している。この領域は、ヒト／ブタハイブリッドの抗原性の研究によって、ごくおおまかに規定された。ヒトとブタの間のＦＶＩＩＩの配列２１８１〜２２４３のアライメントにより、以下の位置に１７個の差異が開示された：２１８１、２１８２、２１９５、２１９６、２１９７、２１９９、２２０７、２２１６、２２２２、２２２４、２２２５、２２２６、２２２７、２２２８、２２３４、２２３８、２２４３。J. Lollarのグループは、これらの１７個の位置でのアラニン、メチオニン、セリン、グリシンまたはロイシンによる置換により、阻害抗体を回避することができるＦＶＩＩＩタンパク質を生成しうると推測している。この仮説は、関心がもたれる突然変異体のどの抗原性研究によっても支持されていない。

最後に、米国特許第６，１８０，３７１号；US2002/182670；US2003/068785；US2005/079584；国際公開公報第９９／４６２７４号；米国特許第７，０１２，１３２号；国際公開公報第２００５／０４６５８３号などの特許は、ＦＶＩＩＩのＡ２およびＣ２ドメインの両方に置換をもつヒト／ブタハイブリッドを提供しているが、これは、両ドメインを認識する阻害抗体による阻害を低下させることを目的とする。特に、国際公開公報第２００５／０４６５８３号は、４８４、４８９、４９２、２１９９、２２００、２２５１および２２５２位でのＡ２およびＣ２ドメインにおけるアミノ酸置換を記載している。使用されたＦＶＩＩＩは、Ｂドメインを欠如している。４８４位だけは、アルギニンがアラニンにより置換されている。

要約すると、多数の研究が新規なＦＶＩＩＩ変異体について言及しているものの、インヒビターを有する患者を処置することができる現在市販の改変ＦＶＩＩＩ変異体がないことから、新規な、免疫原性のより低いＦＶＩＩＩの必要性が依然としてある。さらに、向上した比活性または向上した分泌能力を有する変異体もまた、リコンビナントＦＶＩＩＩの産生を促進するために、または患者の処置を向上するために大変関心深い。

発明の概要
したがって、本発明は、新規な改良ＦＶＩＩＩ変異体を提供する。該変異体は、全てがそれらの血液凝固促進活性のコアを保持しているものの、阻害抗体により認識されるエピトープを喪失しているか、または向上した比活性を有するか、または向上した分泌能を有する。該変異体は、これらの特徴の組み合わせもまた有しうる。例えば、本発明は、免疫原性がより低く、かつ向上した比活性および／または向上した分泌能を有する変異体に関する。同様に、本発明は、向上した比活性および／または向上した分泌能を有する変異体に関する。

本発明の第１の目的は、Ａ２ドメインの４６２、４０９、５０７、６２９、４００、５６２、４０３、５１８、４１４、４９６、４２１、４９３、４８６、および４９４位の残基、ならびにＣ２ドメインの２２０６、２２１２、２２２６、２２４４、２２６１、２２７５、２２８０、２２８１、２２８２、２２８９、２２９４、２３１１、２３１２、および２３１６位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体である。特定の態様では、ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体は、単一置換からなる。別の特定の態様では、ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体は、さらに、Ｃ２ドメインの２２０２位の残基およびＡ２ドメインの４３７位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含む。特定の態様では、ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体は、好ましくは前記群より選択される、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の置換を含む。好ましくは、そのアミノ酸は、アラニン、メチオニン、セリン、グリシン、およびロイシンより選択されるアミノ酸により置換される。さらに好ましくは、そのアミノ酸は、アラニンにより置換される。好ましくは、生物学的に活性なＦＶＩＩＩ誘導体は、Ｂドメインの部分欠失または全欠失にあるＦＶＩＩＩである。

特定の態様では、変異体は、阻害抗体に対して天然ヒトＦＶＩＩＩよりも減少した抗原性を有し、天然ヒトＦＶＩＩＩの血液凝固促進活性の５０％に少なくとも等しい血液凝固促進活性を保持する。好ましい態様では、本発明は、Ａ２ドメインの４６２、４０９、５０７および６２９位の残基、ならびにＣ２ドメインの２２８９、２２９４、２３１２、および２３１６位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。該変異体は、Ｃ２ドメインの２２０２位の残基およびＡ２ドメインの４３７位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換をさらに含みうる。さらに好ましい態様では、本発明は、Ａ２ドメインの４６２、４０９、５０７および６２９位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。別の態様では、本発明は、４０９＋４６２、４０９＋５０７、４６２＋５０７、４０９＋６２９、４６２＋６２９、５０７＋６２９からなる群より選択される二つの置換の組み合わせを含むか、またはそれからなる、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。なお別の態様では、本発明は、４０９＋４６２＋５０７、４６２＋５０７＋６２９、４０９＋４６２＋６２９、４０９＋５０７＋６２９からなる群より選択される三つの置換の組み合わせを含むか、またはそれからなる、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。別の特定の態様では、本発明は、４０９、４６２、５０７および６２９位の四つの置換の組み合わせを含むか、またはそれからなる改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。

さらに、阻害抗体による阻害を防止する（confer abolition）これらの突然変異は、これらの抗原性のより低い突然変異体の任意の相対的な活性喪失の補償を可能にする、より高い比活性を付与する突然変異と組み合わせると、大変興味深いことが判明しうる。特定の態様では、変異体は、天然ヒトＦＶＩＩＩよりも向上した比活性を有する。好ましい態様では、本発明は、Ｃ２ドメインの２１７７、２１８３、２１８６、２１９１、２１９６、２２０４、２２０５、２２１３、２２１７、２２３５、２２５８、２２６４、２２６８および２２６９位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換をさらに含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。

阻害抗体による阻害を防止する該突然変異はまた、分泌能の向上を賦与する突然変異と組み合わせると、これらの抗原性のより低い突然変異体の任意の相対的な分泌喪失の補償を可能にすることによって、大変興味深いことが判明しうる。特定の態様では、本発明は、Ｃ２ドメインの２１７５、２１９９、２２００、２２１５、２２５１、２２５２および２２７８位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換をさらに含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。ＦＶＩＩＩ活性の少なくとも５０％を保持した突然変異体の大規模製造はまた、それらの使用を、そのタンパク質の追加の機能を分析する状況で成し遂げることを可能にする。その免疫原性、分泌および比活性のモデュレーションに加えて、以下のＦＶＩＩＩの性質は、本明細書に記載された突然変異分子を使用することによって向上しうるであろう：
−フォンウィルブラント因子への結合による、ＦＶＩＩＩまたは循環ＦＶＩＩＩａの半減期の向上；
−Ａ２ドメインの安定化による分子の内因性安定性の向上によるその有効期間の増大；
−血小板、細胞表面または循環ミクロパーティクル由来のリン脂質への結合によるＦＸａの形成向上；
−ＦＩＸａおよびＦＸへの結合によるＦＸａの生成向上；
−例えば低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（ＬＲＰ）、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）、超低密度リポタンパク質レセプター（ＶＬＤＬＲ）、メガリン（megaline）または同定されうる任意の他のレセプターなどの、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａの異化を担う分子に対するその結合減少による循環ＦＶＩＩＩの半減期向上；
−例えば活性化プロテインＣ、ＦＸａ、ＦＩＸａなどの血管プロテアーゼによるＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａのタンパク質分解減少による有効期間の増大。

本発明の第２の目的は、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体をコードする核酸、該核酸を含む発現カセット、該核酸または該発現カセットを含むベクター、好ましくは発現ベクター、および本発明に記載の核酸、発現カセットまたはベクターを含むホスト細胞に関する。好ましくは、このベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターより選択することができる。本発明はまた、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体を製造するための、本発明に記載の核酸、発現カセット、発現ベクターまたはホスト細胞の使用に関する。

本発明の第３の目的は、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体を含む薬学的組成物に関する。したがって、本発明は、医薬としての、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。本発明はさらに、血友病Ａの処置のための、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。この処置は、治療的または予防的でありうる。特定の態様では、処置される患者は、インヒビターを有する患者である。別の態様では、処置される患者は、インヒビターの任意の発生前の血友病患者である。本発明は、同時に、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体を投与することを含む、血友病Ａを処置するための方法に関する。

本発明の第４の目的は、血友病Ａの処置のための医薬を調製するための、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体の使用に関する。この処置は、治療的または予防的でありうる。特定の態様では、処置される患者は、インヒビターを有する患者である。別の態様では、処置される患者は、任意のインヒビターを発生する前の血友病患者である。本発明はまた、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体を投与することを含む、血友病Ａを処置するための方法に関する。

本発明の第５の目的は、血友病Ａを有する患者におけるインヒビターの型を診断するための、本発明に記載の一つもしくは複数のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体の使用に関する。

凝固カスケードの簡略スキームである。Ｃａ：カルシウム依存的段階。ＰＬ：血液血小板膜のリン脂質。ＴＦ：組織因子。ＴＦＰＩ：外因系凝固インヒビター。ＦＶＩＩＩａの役割は、ＦＩＸａがＦＸを活性化する触媒効率を増大させることである。ＦＸａとＦＶａの集合は、トロンビン形成の有意な増加をトリガーする。一次スクリーニングの結果を示す図である：産生した７９５個のうち３５９個のアラニン突然変異体の全活性＝これらの３５９個の位置のＦＶＩＩＩ活性の機能的マッピング。一次スクリーニングの結果を示す図である：産生した７９５個のうち３５９個のアラニン突然変異体の全活性＝これらの３５９個の位置のＦＶＩＩＩ活性の機能的マッピング。一次スクリーニングの結果を示す図である：産生した７９５個のうち３５９個のアラニン突然変異体の全活性＝これらの３５９個の位置のＦＶＩＩＩ活性の機能的マッピング。一次スクリーニングの結果を示す図である：産生した７９５個のうち３５９個のアラニン突然変異体の全活性＝これらの３５９個の位置のＦＶＩＩＩ活性の機能的マッピング。一次スクリーニングの結果を示す図である：産生した７９５個のうち３５９個のアラニン突然変異体の全活性＝これらの３５９個の位置のＦＶＩＩＩ活性の機能的マッピング。培地中のＦＶＩＩＩ産生を示す図である；８個の突然変異体は同条件で非突然変異ＦＶＩＩＩよりもずっと高い産生レベルを示した。同条件で非突然変異ＦＶＩＩＩと比べた最高比活性の１５個の突然変異体。ＦＶＩＩＩ突然変異体Ｅ５１８Ａによる阻害への血清ＴＤの防止の測定例を示す図である。阻害防止は、パーセンテージとして表現する：［（ｂ−ａ）／ａ］×１００；（式中、「ａ」は、ＷＴの残留活性パーセンテージ（血清＋ＩｇＧ／血清−ＩｇＧ）を表し、「ｂ」は、突然変異体の残留活性パーセンテージである（血清＋ＩｇＧ／血清−ＩｇＧ）。５人の患者（ＴＤ、ＧＣ、ＰＲ、ＳＬおよびＦＳ）からの阻害抗体による阻害への野生型ＦＶＩＩＩに対するＦＶＩＩＩ−４Ａ２の防止をベセスダアッセイで測定した図である。阻害抗体と共にインキュベーション後に測定した残留活性を、非免疫抗体と共にインキュベーション後の残留活性で除算する。このように残留活性パーセンテージを決定する。５人の患者（ＴＤ、ＧＣ、ＰＲ、ＳＬおよびＦＳ）からの阻害抗体による阻害への野生型ＦＶＩＩＩに対するＦＶＩＩＩ−４Ａ２の防止をベセスダアッセイで測定した図である。阻害抗体と共にインキュベーション後に測定した残留活性を、非免疫抗体と共にインキュベーション後の残留活性で除算する。このように残留活性パーセンテージを決定する。抗Ａ２ドメイン抗体（ＧＭＡ０１２）およびウサギポリクローナル抗体によるＦＶＩＩＩ−４Ａ２突然変異体の阻害減少を測定した図である。固体支持体上での抗Ｃ２ドメイン抗体（ＥＳＨ４）および抗Ａ２ドメイン抗体（ＧＭＡ０１２）を用いたＥＬＩＳＡによる野生型ＦＶＩＩＩに対するＦＶＩＩＩ−４Ａ２のタイトレーション比較を示す図である。トロンビンによるＦＶＩＩＩ−４Ａ２および野生型ＦＶＩＩＩ活性化の測定比較を示す図である。トロンビン（ＩＩａ）による活性化後のＦＶＩＩＩ−４Ａ２および野生型ＦＶＩＩＩについてのＡ２ドメインの解離およびその結果としての活性喪失の測定比較を示す図である。４人の患者（ＴＤ、ＧＣ、ＳＬおよびＦＳ）由来の阻害抗体による阻害への野生型ＦＶＩＩＩに対するＦＶＩＩＩ−３Ａ２の防止をベセスダアッセイにより測定したものを示す図である。阻害抗体と共にインキュベーション後に測定した残留活性を、非免疫抗体と共にインキュベーション後の残留活性で除算して、残留活性パーセンテージを得る。４人の患者（ＴＤ、ＧＣ、ＳＬおよびＦＳ）由来の阻害抗体による阻害への野生型ＦＶＩＩＩに対するＦＶＩＩＩ−３Ａ２の防止をベセスダアッセイにより測定したものを示す図である。阻害抗体と共にインキュベーション後に測定した残留活性を、非免疫抗体と共にインキュベーション後の残留活性で除算して、残留活性パーセンテージを得る。表１：一次スクリーニングの結果；非突然変異ＦＶＩＩＩ活性に比べて少なくとも５０％の全活性を保持し、二次スクリーニングのために選択された１５８個のアラニン突然変異体の表である。表１：一次スクリーニングの結果；非突然変異ＦＶＩＩＩ活性に比べて少なくとも５０％の全活性を保持し、二次スクリーニングのために選択された１５８個のアラニン突然変異体の表である。表１：一次スクリーニングの結果；非突然変異ＦＶＩＩＩ活性に比べて少なくとも５０％の全活性を保持し、二次スクリーニングのために選択された１５８個のアラニン突然変異体の表である。表２：二次スクリーニング：インヒビターを有する５人の血友病患者由来の血清に対して改変された抗原性を示す３０個の突然変異体に関するベセスダアッセイを示す表である。結果は、図５に例示するように各突然変異体についての阻害防止パーセンテージとして表現する。表２：二次スクリーニング：インヒビターを有する５人の血友病患者由来の血清に対して改変された抗原性を示す３０個の突然変異体に関するベセスダアッセイを示す表である。結果は、図５に例示するように各突然変異体についての阻害防止パーセンテージとして表現する。表２：二次スクリーニング：インヒビターを有する５人の血友病患者由来の血清に対して改変された抗原性を示す３０個の突然変異体に関するベセスダアッセイを示す表である。結果は、図５に例示するように各突然変異体についての阻害防止パーセンテージとして表現する。表２：二次スクリーニング：インヒビターを有する５人の血友病患者由来の血清に対して改変された抗原性を示す３０個の突然変異体に関するベセスダアッセイを示す表である。結果は、図５に例示するように各突然変異体についての阻害防止パーセンテージとして表現する。表３：インヒビターを有する５人の血友病患者由来の血清に対して改変された抗原性を示す３０個の突然変異体についての非突然変異ＦＶＩＩＩ活性に比べた比活性および全活性の比較を示す表である。表４：８個の単一突然変異体ＦＶＩＩＩ４０９Ａ、ＦＶＩＩＩ４６２Ａ、ＦＶＩＩＩ５０７Ａ、ＦＶＩＩＩ６２９Ａ、ＦＶＩＩＩ２２８９Ａ、ＦＶＩＩＩ２２９４Ａ、ＦＶＩＩＩ２３１２ＡおよびＦＶＩＩＩ２３１６Ａから産生した全てのＦＶＩＩＩ二重突然変異体の表である。表５：阻害抗体に対する４人の血友病患者ＴＤ、ＧＣ、ＳＬおよびＰＲの血清由来の阻害抗体に対する６個の二重Ａ２突然変異体の発色の比活性および阻害防止パーセンテージを示す表である。

発明の説明
本発明は、リコンビナントＦＶＩＩＩで処置された血友病Ａ患者の３０％に起こる重症合併症、すなわち処置により誘導される、外因性リコンビナントＦＶＩＩＩに対する免疫応答の発生を消散するための解決法を提供する。提供される解決法は、阻害抗体により通常認識されるエピトープの抗原性が減少したリコンビナントヒトＦＶＩＩＩ分子を生成させることにある。本発明のＦＶＩＩＩ変異体は、該抗体により通常認識される一つまたは複数のエピトープを喪失していた。

本発明は、天然ＦＶＩＩＩに比べて向上した比活性を有するヒトＦＶＩＩＩ変異体を生成させることにある他の解決法を提供する。

最後に、本発明は、リコンビナントＦＶＩＩＩの製造にとって、そして潜在的遺伝子療法の点で興味深い、より大きい分泌能を有するＦＶＩＩＩ変異体を提供する。

これらの変異体における突然変異により付与される、異なる性質は、組み合わせると大変興味深いことがある。非限定的な例では、突然変異が阻害抗体による阻害を防止する故に抗原性がより低下している変異体における任意の相対的な活性喪失を、変異体の比活性向上を付与する突然変異は、補償できよう。別の非限定的な例では、より高い分泌能を付与する突然変異は、阻害抗体による阻害を防止する突然変異と組み合わせると、例えば、抗原性がより低い該突然変異体の任意の相対的な分泌喪失の補償を可能にすることにより興味深い。

本明細書では、置換を表すために以下の用語を使用する：Ｓ４０９Ａは、配列番号３の４０９位のセリン残基のアラニンによる置換を示す。置換は、他の１９個のアミノ酸より選択される別の一つによる、または天然アミノ酸によるアミノ酸残基の交換を表す。「置換」および「突然変異」という用語は、互換性である。「＋」という記号は、置換の組み合わせを示す。

「含む」は、変異体またはそのフラグメントが、配列番号３を参照して示されるような一つまたは複数の置換を有するが、その変異体またはそのフラグメントが、他の改変、特に置換、欠失または挿入を有しうることを意味する。

「からなる」は、変異体またはそのフラグメントが、配列番号３を参照して示される置換のみを有することを意味する。

「変異体」は、特に、配列番号３の配列により表されるポリペプチドと少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の残基、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の残基が異なるポリペプチドを表す。

ＦＶＩＩＩのＡ２、Ａ３またはＣ２ドメインのアミノ酸を、アラニンにより系統的に置換した。これらのヒトＦＶＩＩＩ突然変異体の産生は、哺乳動物細胞で実施された。これらの変異体の一次スクリーニングは、それらの血液凝固促進活性に基づいた。各突然変異体の全活性は、発色アッセイにより測定し、参照としての非突然変異ヒトＦＶＩＩＩの発色アッセイと比較した。ＦＶＩＩＩ変異体の活性は、当業者に公知の任意の方法により、好ましくは本明細書後記の実施例３に記載された方法に準じて測定できる。次いで、一次スクリーニングで最も活性であると選択されたＦＶＩＩＩ変異体を、第２の特徴、すなわちＦＶＩＩＩ活性を阻害する能力から選択された血友病患者由来の血清に対する抗原性の喪失について評定した。該抗体を用いた該二次スクリーニングは、改変ベセスダアッセイに相当する。ＦＶＩＩＩ変異体の抗原性の改変は、当業者に公知の任意の方法により、好ましくは下記実施例４に記載された方法に準じて測定することができる。

改良された変異体を選択することができた。これらの候補医薬のいくつかは、血液凝固活性を保持しただけでなく、それらは、選ばれた血友病患者の血清由来の阻害抗体による阻害を部分的に回避した。これらのＦＶＩＩＩは、患者の血清由来の阻害抗体により通常認識される一つまたは複数のエピトープを喪失していた。さらに、候補医薬は、野生型ＦＶＩＩＩよりも高い比血液凝固活性を有した。別の興味深い特徴は、候補医薬が分泌能向上を示したことである。

したがって一態様では、本発明は、「インヒビター」として知られている抗ＦＶＩＩＩ抗体により通常認識される少なくとも一つのエピトープを喪失しているが、好ましくは非突然変異ＦＶＩＩＩよりも高い、それに類似した、または近い血液凝固活性を保持しているリコンビナントヒトＦＶＩＩＩ変異体に関する。

本発明は、Ｃ２およびＡ２ドメインにおけるアミノ酸のアラニンまたは他の任意のアミノ酸による少なくとも一つの置換を含むヒトＦＶＩＩＩ変異体を記載する。

特に、本発明は、ヒトＦＶＩＩＩの１５８個のアラニン突然変異体を記載する。本明細書に使用されるような「アラニン突然変異体」は、アラニン残基によるアミノ酸の置換を含む突然変異体を意味する。特に該突然変異体は、Ｃ２ドメインの２３１６、２１７７、２１８１、２１８２、２１８３、２１８６、２１８９、２１９１、２１９７、２１９９、２２００、２２０４、２２０５、２２０６、２２１２、２２１３、２２１４、２２１７、２２２１、２２２５、２２２６、２２３５、２２３９、２２４２、２２４４、２２５０、２２５１、２２５２、２２５３、２２５６、２２５８、２２６１、２２６３、２２６４、２２６８、２２６９、２２７０、２２７３、２２７４、２２７５、２２７７、２２７８、２２８０、２２８１、２２８２、２２８４、２２８９、２２９２、２２９４、２２９６、２３１１、２３１２、２３１７、２３２１および２３２４位ならびにＡ２ドメインの３７８、３８３、３９１、３９８、３９９、４００、４０３、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４２１、４２９、４３２、４４０、４４２、４４４、４４５、４４９、４５２、４５４、４５５、４６２、４６４、４６８、４８１、４８６、４９０、４９１、４９３、４９４、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０７、５１２、５１７、５１８、５１９、５２０、５２３、５２４、５２６、５３０、５３２、５３４、５３９、５４０、５４３、５５０、５５２、５５６、５５９、５６２、５６７、５６８、５７３、５７８、５８８、５９２、５９６、５９７、６００、６０１、６０２、６０４、６０７、６１１、６２１、６２４、６２８、６２９、６３２、６３３、６４０および６４２位に位置する残基にアラニン置換を有する。

残基の位置は、配列番号３に例示されるようなアミノ酸２３３２個のヒトＦＶＩＩＩのタンパク質配列を参照して示される。

本発明は、２３１６、２１７７、２１８１、２１８２、２１８３、２１８６、２１８９、２１９１、２１９７、２１９９、２２００、２２０４、２２０５、２２０６、２２１２、２２１３、２２１４、２２１７、２２２１、２２２５、２２２６、２２３５、２２３９、２２４２、２２４４、２２５０、２２５１、２２５２、２２５３、２２５６、２２５８、２２６１、２２６３、２２６４、２２６８、２２６９、２２７０、２２７３、２２７４、２２７５、２２７７、２２７８、２２８０、２２８１、２２８２、２２８４、２２８９、２２９２、２２９４、２２９６、２３１１、２３１２、２３１７、２３２１および２３２４位の残基からなる群より選択される、Ｃ２ドメインの少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。この変異体は、さらに、２１７５、２１９５、２１９６、２２０２、２２１５および２２２２位に少なくとも一つの残基の置換を含みうる。この残基は、アラニン、メチオニン、セリン、グリシン、およびロイシンより選択されるアミノ酸、好ましくはアラニンにより置換されうる。該アミノ酸は、２０種の天然アミノ酸のうちでタンパク質の抗原性を減少させることが知られている。これらの位置での、特にアラニンによる一つまたは複数の置換の結果として、特に阻害抗体により認識される一つまたは複数のエピトープを喪失し、かつその血液凝固促進活性を保持している改良されたＦＶＩＩＩ変異体が生じる。本発明はまた、２３１６、２１７７、２１８１、２１８２、２１８３、２１８６、２１８９、２１９１、２１９７、２１９９、２２００、２２０４、２２０５、２２０６、２２１２、２２１３、２２１４、２２１７、２２２１、２２２５、２２２６、２２３５、２２３９、２２４２、２２４４、２２５０、２２５１、２２５２、２２５３、２２５６、２２５８、２２６１、２２６３、２２６４、２２６８、２２６９、２２７０、２２７３、２２７４、２２７５、２２７７、２２７８、２２８０、２２８１、２２８２、２２８４、２２８９、２２９２、２２９４、２２９６、２３１１、２３１２、２３１７、２３２１および２３２４位の残基からなる群より選択される、Ｃ２ドメインの少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むＦＶＩＩＩ軽鎖に関する。この軽鎖は、さらに、２１７５、２１９５、２１９６、２２０２、２２１５および２２２２位の少なくとも一つの残基の置換を含みうる。

本発明はさらに、好ましくは３７８、３８３、３９１、３９８、３９９、４００、４０３、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４２１、４２９、４３２、４４０、４４２、４４４、４４５、４４９、４５２、４５４、４５５、４６２、４６４、４６８、４８１、４８６、４９０、４９１、４９３、４９４、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０７、５１２、５１７、５１８、５１９、５２０、５２３、５２４、５２６、５３０、５３２、５３４、５３９、５４０、５４３、５５０、５５２、５５６、５５９、５６２、５６７、５６８、５７３、５７８、５８８、５９２、５９６、５９７、６００、６０１、６０２、６０４、６０７、６１１、６２１、６２４、６２８、６２９、６３２、６３３、６４０および６４２位の残基からなる群より選択される、Ａ２ドメインの少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むか、または有するヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。この変異体はさらに、３７７、３７９、４０５、４３４、４３７、４８５、４８８、４８９、４９２、４９５、５０１、５０８および６２３位に少なくとも一つの残基の置換を含みうる。この残基は、アラニン、メチオニン、セリン、グリシン、およびロイシンより選択されるアミノ酸、好ましくはアラニンにより置換されうる。これらの位置での、特にアラニンによる一つまたは複数の置換の結果として、特に阻害抗体により認識される一つまたは複数のエピトープを喪失し、かつその血液凝固促進活性を保持している改良されたＦＶＩＩＩ変異体が生じる。本発明はまた、場合によりＢドメインを完全または部分的に欠如したＦＶＩＩＩ重鎖に関し、この重鎖は、３７８、３８３、３９１、３９８、３９９、４００、４０３、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４２１、４２９、４３２、４４０、４４２、４４４、４４５、４４９、４５２、４５４、４５５、４６２、４６４、４６８、４８１、４８６、４９０、４９１、４９３、４９４、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０７、５１２、５１７、５１８、５１９、５２０、５２３、５２４、５２６、５３０、５３２、５３４、５３９、５４０、５４３、５５０、５５２、５５６、５５９、５６２、５６７、５６８、５７３、５７８、５８８、５９２、５９６、５９７、６００、６０１、６０２、６０４、６０７、６１１、６２１、６２４、６２８、６２９、６３２、６３３、６４０および６４２位の残基からなる群より選択される、Ａ２ドメインの少なくとも一つのアミノ酸の置換を含む。この変異体はさらに、３７７、３７９、４０５、４３４、４３７、４８５、４８８、４８９、４９２、４９５、５０１、５０８および６２３位に少なくとも一つの残基の置換を含みうる。

本発明はさらに、Ｃ２ドメインの２３１６、２１７７、２１８１、２１８２、２１８３、２１８６、２１８９、２１９１、２１９７、２１９９、２２００、２２０４、２２０５、２２０６、２２１２、２２１３、２２１４、２２１７、２２２１、２２２５、２２２６、２２３５、２２３９、２２４２、２２４４、２２５０、２２５１、２２５２、２２５３、２２５６、２２５８、２２６１、２２６３、２２６４、２２６８、２２６９、２２７０、２２７３、２２７４、２２７５、２２７７、２２７８、２２８０、２２８１、２２８２、２２８４、２２８９、２２９２、２２９４、２２９６、２３１１、２３１２、２３１７、２３２１および２３２４位の残基、ならびにＡ２ドメインの３７８、３８３、３９１、３９８、３９９、４００、４０３、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４２１、４２９、４３２、４４０、４４２、４４４、４４５、４４９、４５２、４５４、４５５、４６２、４６４、４６８、４８１、４８６、４９０、４９１、４９３、４９４、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０７、５１２、５１７、５１８、５１９、５２０、５２３、５２４、５２６、５３０、５３２、５３４、５３９、５４０、５４３、５５０、５５２、５５６、５５９、５６２、５６７、５６８、５７３、５７８、５８８、５９２、５９６、５９７、６００、６０１、６０２、６０４、６０７、６１１、６２１、６２４、６２８、６２９、６３２、６３３、６４０および６４２位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むかまたは有する、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。特定の態様では、ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体は、さらに、Ｃ２ドメインの２１７５、２１９５、２１９６、２２０２、２２１５および２２２２位の残基、ならびにＡ２ドメインの３７７、３７９、４０５、４３４、４３７、４８５、４８８、４８９、４９２、４９５、５０１、５０８および６２３位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含む。特定の態様では、ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体は、前記群より好ましくは選択される、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の置換を含む。

好ましい態様では、本発明は、低下した抗原性を有し、かつＣ２ドメインの２２０６、２２１２、２２２６、２２４４、２２６１、２２７５、２２８０、２２８１、２２８２、２２８９、２２９４、２３１１、２３１２、および２３１６位の残基、ならびにＡ２ドメインの４００、４０３、４０９、４１４、４２１、４６２、４８６、４９３、４９４、４９６、５０７、５１８、５６２、および６２９位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。別の態様では、該変異体は、さらに、Ｃ２ドメインの２２０２位の残基およびＡ２ドメインの４３７位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つの置換を含みうる。この残基は、アラニン、メチオニン、セリン、グリシン、およびロイシンより選択されるアミノ酸、好ましくはアラニンにより置換されうる。特定の態様では、該ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体は、単一置換を有する。該単一置換は、好ましくは、Ａ２ドメインにおけるＬ４００Ａ、Ｌ４００Ｍ、Ｌ４００Ｓ、Ｌ４００Ｇ、Ｄ４０３Ａ、Ｄ４０３Ｍ、Ｄ４０３Ｓ、Ｄ４０３Ｇ、Ｄ４０３Ｌ、Ｓ４０９Ａ、Ｓ４０９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ、Ｎ４１４Ａ、Ｎ４１４Ｍ、Ｎ４１４Ｓ、Ｎ４１４Ｇ、Ｎ４１４Ｌ、Ｒ４２１Ａ、Ｒ４２１Ｍ、Ｒ４２１Ｓ、Ｒ４２１Ｇ、Ｒ４２１Ｌ、Ｌ４６２Ａ、Ｌ４６２Ｍ、Ｌ４６２Ｓ、Ｌ４６２Ｇ、Ｌ４８６Ａ、Ｌ４８６Ｍ、Ｌ４８６Ｇ、Ｋ４９３Ｍ、Ｋ４９３Ｓ、Ｋ４９３Ｇ、Ｋ４９３Ｌ、Ｇ４９４Ａ、Ｇ４９４Ｍ、Ｇ４９４Ｌ、Ｋ４９６Ａ、Ｋ４９６Ｓ、Ｋ４９６Ｇ、Ｋ４９６Ｌ、Ｅ５０７Ａ、Ｅ５０７Ｍ、Ｅ５０７Ｓ、Ｅ５０７Ｌ、Ｅ５１８Ａ、Ｅ５１８Ｍ、Ｅ５１８Ｓ、Ｅ５１８Ｇ、Ｅ５１８Ｌ、Ｒ５６２Ａ、Ｒ５６２Ｍ、Ｒ５６２Ｓ、Ｒ５６２Ｇ、Ｒ５６２Ｌ、Ｖ６２９Ａ、Ｖ６２９Ｍ、Ｖ６２９Ｓ、Ｖ６２９ＧおよびＶ６２９Ｌという置換、ならびにＣ２ドメインにおけるＳ２２０６Ａ、Ｓ２２０６Ｇ、Ｓ２２０６Ｍ、Ｓ２２０６Ｌ、Ｌ２２１２Ａ、Ｌ２２１２Ｍ、Ｌ２２１２Ｓ、Ｌ２２１２Ｇ、Ｐ２２２６Ａ、Ｐ２２２６Ｍ、Ｐ２２２６Ｓ、Ｐ２２２６Ｇ、Ｐ２２２６Ｌ、Ｔ２２４４Ａ、Ｔ２２４４Ｍ、Ｔ２２４４Ｓ、Ｔ２２４４Ｇ、Ｔ２２４４Ｌ、Ｌ２２６１Ａ、Ｌ２２６１Ｍ、Ｌ２２６１Ｓ、Ｌ２２６１Ｇ、Ｆ２２７５Ａ、Ｆ２２７５Ｍ、Ｆ２２７５Ｓ、Ｆ２２７５Ｇ、Ｆ２２７５Ｌ、Ｖ２２８０Ａ、Ｖ２２８０Ｍ、Ｖ２２８０Ｓ、Ｖ２２８０Ｇ、Ｖ２２８０Ｌ、Ｋ２２８１Ａ、Ｋ２２８１Ｍ、Ｋ２２８１Ｓ、Ｋ２２８１Ｇ、Ｋ２２８１Ｌ、Ｖ２２８２Ａ、Ｖ２２８２Ｍ、Ｖ２２８２Ｓ、Ｖ２２８２Ｇ、Ｖ２２８２Ｌ、Ｓ２２８９Ａ、Ｓ２２８９Ｍ、Ｓ２２８９Ｇ、Ｓ２２８９Ｌ、Ｖ２２９４Ａ、Ｖ２２９４Ｍ、Ｖ２２９４Ｓ、Ｖ２２９４Ｇ、Ｖ２２９４Ｌ、Ｑ２３１１Ａ、Ｑ２３１１Ｍ、Ｑ２３１１Ｓ、Ｑ２３１１Ｇ、Ｑ２３１１Ｌ、Ｓ２３１２Ａ、Ｓ２３１２Ｍ、Ｓ２３１２Ｇ、Ｓ２３１２Ｌ、Ｑ２３１６Ａ、Ｑ２３１６Ｍ、Ｑ２３１６Ｓ、Ｑ２３１６ＧおよびＱ２３１６Ｌという置換からなる群より選択される。別の態様では、本発明は、Ａ２ドメインにおけるＬ４００Ａ、Ｌ４００Ｍ、Ｌ４００Ｓ、Ｌ４００Ｇ、Ｄ４０３Ａ、Ｄ４０３Ｍ、Ｄ４０３Ｓ、Ｄ４０３Ｇ、Ｄ４０３Ｌ、Ｓ４０９Ａ、Ｓ４０９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ、Ｎ４１４Ａ、Ｎ４１４Ｍ、Ｎ４１４Ｓ、Ｎ４１４Ｇ、Ｎ４１４Ｌ、Ｒ４２１Ａ、Ｒ４２１Ｍ、Ｒ４２１Ｓ、Ｒ４２１Ｇ、Ｒ４２１Ｌ、Ｌ４６２Ａ、Ｌ４６２Ｍ、Ｌ４６２Ｓ、Ｌ４６２Ｇ、Ｌ４８６Ａ、Ｌ４８６Ｍ、Ｌ４８６Ｇ、Ｋ４９３Ｍ、Ｋ４９３Ｓ、Ｋ４９３Ｇ、Ｋ４９３Ｌ、Ｇ４９４Ａ、Ｇ４９４Ｍ、Ｇ４９４Ｌ、Ｋ４９６Ａ、Ｋ４９６Ｓ、Ｋ４９６Ｇ、Ｋ４９６Ｌ、Ｅ５０７Ａ、Ｅ５０７Ｍ、Ｅ５０７Ｓ、Ｅ５０７Ｌ、Ｅ５１８Ａ、Ｅ５１８Ｍ、Ｅ５１８Ｓ、Ｅ５１８Ｇ、Ｅ５１８Ｌ、Ｒ５６２Ａ、Ｒ５６２Ｍ、Ｒ５６２Ｓ、Ｒ５６２Ｇ、Ｒ５６２Ｌ、Ｖ６２９Ａ、Ｖ６２９Ｍ、Ｖ６２９Ｓ、Ｖ６２９ＧおよびＶ６２９Ｌという置換、ならびにＣ２ドメインにおけるＳ２２０６Ａ、Ｓ２２０６Ｇ、Ｓ２２０６Ｍ、Ｓ２２０６Ｌ、Ｌ２２１２Ａ、Ｌ２２１２Ｍ、Ｌ２２１２Ｓ、Ｌ２２１２Ｇ、Ｐ２２２６Ａ、Ｐ２２２６Ｍ、Ｐ２２２６Ｓ、Ｐ２２２６Ｇ、Ｐ２２２６Ｌ、Ｔ２２４４Ａ、Ｔ２２４４Ｍ、Ｔ２２４４Ｓ、Ｔ２２４４Ｇ、Ｔ２２４４Ｌ、Ｌ２２６１Ａ、Ｌ２２６１Ｍ、Ｌ２２６１Ｓ、Ｌ２２６１Ｇ、Ｆ２２７５Ａ、Ｆ２２７５Ｍ、Ｆ２２７５Ｓ、Ｆ２２７５Ｇ、Ｆ２２７５Ｌ、Ｖ２２８０Ａ、Ｖ２２８０Ｍ、Ｖ２２８０Ｓ、Ｖ２２８０Ｇ、Ｖ２２８０Ｌ、Ｋ２２８１Ａ、Ｋ２２８１Ｍ、Ｋ２２８１Ｓ、Ｋ２２８１Ｇ、Ｋ２２８１Ｌ、Ｖ２２８２Ａ、Ｖ２２８２Ｍ、Ｖ２２８２Ｓ、Ｖ２２８２Ｇ、Ｖ２２８２Ｌ、Ｓ２２８９Ａ、Ｓ２２８９Ｍ、Ｓ２２８９Ｇ、Ｓ２２８９Ｌ、Ｖ２２９４Ａ、Ｖ２２９４Ｍ、Ｖ２２９４Ｓ、Ｖ２２９４Ｇ、Ｖ２２９４Ｌ、Ｑ２３１１Ａ、Ｑ２３１１Ｍ、Ｑ２３１１Ｓ、Ｑ２３１１Ｇ、Ｑ２３１１Ｌ、Ｓ２３１２Ａ、Ｓ２３１２Ｍ、Ｓ２３１２Ｇ、Ｓ２３１２Ｌ、Ｑ２３１６Ａ、Ｑ２３１６Ｍ、Ｑ２３１６Ｓ、Ｑ２３１６ＧおよびＱ２３１６Ｌという置換からなる群より選択される、少なくとも一つの置換を含むヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。該ＦＶＩＩＩ変異体は、該抗体により通常認識される一つまたは複数のエピトープを喪失していることから、非突然変異ヒトＦＶＩＩＩに比べて減少した抗原性を有する。さらに、これらは、非突然変異ヒトＦＶＩＩＩに比べて少なくとも５０％、好ましくは６０または７５％の全活性を保持している。

なおさらに好ましい態様では、本発明は、減少した抗原性を有し、かつ非突然変異ヒトＦＶＩＩＩに比べて少なくとも１００％の全活性を保持し、かつＡ２ドメインの４０９、４６２、５０７、および６２９位の残基、ならびにＣ２ドメインの２２８９、２２９４、２３１２、および２３１６位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つアミノ酸の置換を含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。別の態様では、該変異体は、さらに、Ｃ２ドメインの２２０２位の残基、ならびにＡ２ドメインの４３７位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つアミノ酸の置換を含みうる。この残基は、アラニン、メチオニン、セリン、グリシン、およびロイシンより選択されるアミノ酸、好ましくはアラニンにより置換されうる。特定の態様では、該ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体は、単一置換を有する。該置換は、好ましくは、Ｓ４０９Ａ、Ｓ４０９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ、Ｌ４６２Ａ、Ｌ４６２Ｍ、Ｌ４６２Ｓ、Ｌ４６２Ｇ、Ｅ５０７Ａ、Ｅ５０７Ｍ、Ｅ５０７Ｓ、Ｅ５０７Ｌ、Ｖ６２９Ａ、Ｖ６２９Ｍ、Ｖ６２９Ｓ、Ｖ６２９Ｇ、Ｖ６２９Ｌ、Ｓ２２８９Ａ、Ｓ２２８９Ｍ、Ｓ２２８９Ｇ、Ｓ２２８９Ｌ、Ｖ２２９４Ａ、Ｖ２２９４Ｍ、Ｖ２２９４Ｓ、Ｖ２２９４Ｇ、Ｖ２２９４Ｌ、Ｓ２３１２Ａ、Ｓ２３１２Ｍ、Ｓ２３１２Ｇ、Ｓ２３１２Ｌ、Ｑ２３１６Ａ、Ｑ２３１６Ｍ、Ｑ２３１６Ｓ、Ｑ２３１６ＧおよびＱ２３１６Ｌという置換からなる群より選択される。別の態様では、本発明は、Ｓ４０９Ａ、Ｓ４０９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ、Ｌ４６２Ａ、Ｌ４６２Ｍ、Ｌ４６２Ｓ、Ｌ４６２Ｇ、Ｅ５０７Ａ、Ｅ５０７Ｍ、Ｅ５０７Ｓ、Ｅ５０７Ｌ、Ｖ６２９Ａ、Ｖ６２９Ｍ、Ｖ６２９Ｓ、Ｖ６２９Ｇ、Ｖ６２９Ｌ、Ｓ２２８９Ａ、Ｓ２２８９Ｍ、Ｓ２２８９Ｇ、Ｓ２２８９Ｌ、Ｖ２２９４Ａ、Ｖ２２９４Ｍ、Ｖ２２９４Ｓ、Ｖ２２９４Ｇ、Ｖ２２９４Ｌ、Ｓ２３１２Ａ、Ｓ２３１２Ｍ、Ｓ２３１２Ｇ、Ｓ２３１２Ｌ、Ｑ２３１６Ａ、Ｑ２３１６Ｍ、Ｑ２３１６Ｓ、Ｑ２３１６ＧおよびＱ２３１６Ｌという置換からなる群より選択される、少なくとも一つの置換を含むヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。

さらなる態様では、本発明は、減少した抗原性を有し、かつ４０９＋４６２、４０９＋５０７、４６２＋５０７、４０９＋６２９、４６２＋６２９および５０７＋６２９、好ましくは４０９＋４６２、４０９＋５０７および４６２＋５０７からなる群より選択される二つの置換の組み合わせを含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。特定の態様では、該ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体は、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９ＧおよびＥ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌからなる群より選択される、好ましくはＳ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７ＧおよびＬ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌからなる群にある、二つの置換の組み合わせを含む。

なお別の態様では、本発明は、４０９＋４６２＋５０７、４６２＋５０７＋６２９、４０９＋４６２＋６２９、４０９＋５０７＋６２９からなる群より選択される三つの置換の組み合わせ、好ましくは４０９＋４６２＋５０７を含む改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。特定の態様では、該ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体は、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｌ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ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別の特定の態様では、本発明は、４０９、４６２、５０７および６２９位の四つの置換の組み合わせを含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。特定の態様では、該ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体は、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ａ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｍ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｓ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｍ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｓ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｇ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｇ、Ｓ４０９Ｍ＋Ｌ４６２Ｇ＋Ｅ５０７Ｌ＋Ｖ６２９Ｌ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ａ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｍ、Ｓ４０９Ｇ＋Ｌ４６２Ａ＋Ｅ５０７Ａ＋Ｖ６２９Ｓ、Ｓ４０９Ｇ＋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さらなる好ましい態様では、本発明は、改良された比活性を有し、かつＣ２ドメインの２１７７、２１８３、２１８６、２１９１、２２０４、２２０５、２２０６、２２１３、２２１７、２２３５、２２５８、２２６４、２２６８および２２６９位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。該変異体は、さらに、Ｃ２ドメインの２１９６位でアミノ酸の置換を含みうる。さらに、より高い比活性を付与する該突然変異は、阻害抗体による阻害を防止する突然変異と組み合わせると、例えばより低い抗原性の該突然変異体の任意の相対的な活性喪失の補償を可能にすることによって、大変興味深いことが判明しうる。したがって、特定の態様では、本発明は、Ａ２ドメインの４００、４０３、４０９、４１４、４２１、４６２、４８６、４９３、４９４、４９６、５０７、５１８、５６２、および６２９位の残基、ならびにＣ２ドメインの２２０６、２２１２、２２２６、２２４４、２２６１、２２７５、２２８０、２２８１、２２８２、２２８９、２２９４、２３１１、２３１２、および２３１６位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、かつＣ２ドメインの２１７７、２１８３、２１８６、２１９１、２２０４、２２０５、２２１３、２２１７、２２３５、２２５８、２２６４、２２６８および２２６９位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換をさらに含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。好ましくは、該変異体は、Ａ２ドメインの４０９、４６２、５０７および６２９位の残基、ならびにＣ２ドメインの２２８９、２２９４、２３１２および２３１６位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、かつＣ２ドメインの２１７７、２１８３、２１８６、２１９１、２２０４、２２０５、２２１３、２２１７、２２３５、２２５８、２２６４、２２６８および２２６９位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換をさらに含む。

追加の好ましい態様では、本発明は、向上した分泌能を有し、かつＣ２ドメインの２１９９、２２００、２２１５、２２５１、２２５２、２２７８、および２３１６位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つアミノ酸の置換を含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。該変異体は、さらに、Ｃ２ドメインの２１７５位にアミノ酸の置換を含みうる。さらに、より高い分泌能を付与する該突然変異は、阻害抗体による阻害を防止する突然変異と組み合わせると、例えばより低い抗原性の該突然変異体の任意の相対的な分泌喪失の補償を可能にすることによって、大変興味深いことが判明しうる。したがって、特定の態様では、本発明は、Ａ２ドメインの４００、４０３、４０９、４１４、４２１、４６２、４８６、４９３、４９４、４９６、５０７、５１８、５６２、および６２９位の残基、ならびにＣ２ドメインの２２０６、２２１２、２２２６、２２４４、２２６１、２２７５、２２８０、２２８１、２２８２、２２８９、２２９４、２３１１、２３１２、および２３１６位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、かつＣ２ドメインの２１７５、２１９９、２２００、２２１５、２２５１、２２５２および２２７８位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換をさらに含む、改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体に関する。好ましい方法で、該変異体は、Ａ２ドメインの４０９、４６２、５０７および６２９位の残基、ならびにＣ２ドメインの２２８９、２２９４、２３１２および２３１６位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、そしてＣ２ドメインの２１７５、２１９９、２２００、２２１５、２２５１、２２５２および２２７８位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換をさらに含む。

ＦＶＩＩＩ活性の少なくとも５０％を保持する突然変異体の広い産生はまた、それらの使用を、そのタンパク質の追加の機能を分析する状況で成し遂げることを可能にする。その免疫原性、分泌および比活性のモデュレーションに加えて、以下のＦＶＩＩＩの性質は、記載された突然変異体分子を使用することにより向上しうる：
−フォンウィルブラント因子への結合によるＦＶＩＩＩまたは循環ＦＶＩＩＩａの半減期の向上；
−Ａ２ドメインの安定化による、分子の内因性安定性の向上によるその有効期間の増大；
−血小板、細胞表面または循環ミクロパーティクル由来のリン脂質への結合によるＦＸａの形成向上；
−ＦＩＸａおよびＦＸへの結合によるＦＸａの生成向上；
−例えば低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（ＬＲＰ）、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）、超低密度リポタンパク質レセプター（ＶＬＤＬＲ）、メガリンまたは同定されうる任意の他のレセプターなどの、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａの異化を担う分子に対するその結合減少による循環ＦＶＩＩＩの半減期向上；
−例えば活性化プロテインＣ、ＦＸａ、ＦＩＸａなどの血管プロテアーゼによるＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａのタンパク質分解減少による有効期間の増大。

好ましくは、生物学的に活性なＦＶＩＩＩ誘導体は、Ｂドメインの完全または部分的欠失にあるＦＶＩＩＩである。本発明のヒトＦＶＩＩＩ変異体は、ハイブリッドＦＶＩＩＩではない。それは、Ａ２もしくはＣ２ドメインまたはその少なくとも１５個の連続するアミノ酸のセグメントの、別の種のＦＶＩＩＩドメインによる置換を有さない。特に、Ａ２ドメインのセグメント３７３−５４０、３７３−５０８、４４５−５０８、４８４−５０８、４０４−５０８、４８９−５０８および／または４８４−４８９は、別の種のセグメントにより置換されていない。特定の態様では、この変異体のポリペプチド配列は、任意の欠失または切断を含まずに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の置換が、好ましくは１、２、３、４、５、６、７または８個の置換が、配列番号３に記載されるようなヒトＦＶＩＩＩの配列と異なる。特定の態様では、この変異体は、単一置換を含む。別の特定の態様では、この変異体は、本発明に記載の群より選択される１〜８個の置換の組み合わせを含む。

「阻害抗体」または「インヒビター」は、ＦＶＩＩＩを認識またはそれに結合し、かつその生物学的活性、特にその血液凝固促進活性を阻害する任意の抗体を表す。特に、該抗体は、好ましくはｉ）軽鎖のＣ２ドメイン（２１８１−２３２１）；ｉｉ）重鎖のＡ２ドメイン（４８４−５０９）；またはｉｉｉ）Ａ３ドメイン（１６９４−２０１９）を認識することができる。市販の阻害抗体の例には、ＥＳＨ−８（強インヒビター；領域２２４８／２２８５を認識；６３００BU/mg；抗Ｃ２；America Diagnostica）、ＧＭＡ−８０１５（抗Ａ２；Green Mountain）、抗Ｃ２ＥＳＨ−４抗体（強インヒビター；領域２３０３／２３３２；AmericaDiagnostica）、抗Ｃ２Ｂｏ２Ｃ１１抗体（Jacquemin et al., 1998、Blood, 92(2):496-506）が含まれる。

「インヒビターを有する患者」は、血清中にＦＶＩＩＩ阻害抗体を有する患者である。該抗体の認識プロファイルは、患者毎に異なる。本発明に記載の改良されたＦＶＩＩＩは、一つまたは複数の種類の阻害抗体を少なくとも部分的に避けるＦＶＩＩＩである。

「ＦＶＩＩＩの生物学的に活性な誘導体」は、ＦＶＩＩＩの血液凝固促進活性を保持するヒトＦＶＩＩＩ由来の任意のタンパク質またはペプチドを表す。例えば、このような生物学的に活性なＦＶＩＩＩ誘導体は、Ｂドメイン（７４１−１６４８）が部分的または全体的に欠失したＦＶＩＩＩでありうる（Toole et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 (16):5939-5942；Pittman, 1993, Blood, 81:2925-2935；Eaton et al., 1986, Biochemistry, 25 (26):8343-8347；Langer et al., 1988, Behring Inst. Mitt, 82:16-25；Meulien et al., 1988, Protein Eng, 2(4):301-6；および米国特許第４，８６８，１１２号）。さらに、この用語はまた、安定化されたＡ２ドメインを有するＦＶＩＩＩ突然変異体（国際公開公報第９７／４０１４５号）、より高く発現させるＦＶＩＩＩ突然変異体（Swaroop et al., 1997, JBC, 272:24121-24124）、減少した抗原性を有するＦＶＩＩＩ突然変異体（Lollar, 1999, Thromb. Haemost. 82:505-508）、別々に発現した軽鎖および重鎖から再構成されたＦＶＩＩＩ（Oh et al., 1999, Exp. Mol. Med. 31:95-100）、ＨＳＰＧ（ヘパラン硫酸プロテオグリカン）およびＬＲＰ（低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質）などのＦＶＩＩＩ異化関連レセプターへの減少した結合を示すＦＶＩＩＩ突然変異体（Ananyeva et al., 2001, TCM, 11:251-257）、向上した比活性を示すＦＶＩＩＩ突然変異体（US2004/0249134）を表す。同様に考慮されるのは、ＦＶＩＩＩセグメントが第Ｖ因子の対応するセグメントにより交換されているＦＶＩＩＩ変異体である（Marquette et al., 1995, JBC, 270:10297-10303、Oertel et al., 1996, Thromb. Haemost., 75:36-44）。さらに、該用語は、一つまたは複数の置換、欠失または挿入を含む任意のＦＶＩＩＩを表す。例えば、この用語には、本出願の緒言に記載された変異体、特に点突然変異を含む変異体が含まれる。特に、この用語には、出願である国際公開公報第２００６／０２７１１１号に記載されたように、アルギニン３３６および５６２の、そして２００１〜２０２０位に含まれる領域に突然変異を含む、ＡＰＣ（活性化プロテインＣ）による切断にさらに低感受性のＦＶＩＩＩが含まれる。この用語には、さらに、例えばＡ２ドメインとＡ３ドメインの間に一つまたは複数のジスルフィド結合を作るように一つまたは複数のシステインが導入された、安定化されたＦＶＩＩＩ突然変異体が含まれる（国際公開公報第０２１０３０２４号；Gale et Pellequer, 2003, J Thromb Haemost, 1(9):1966-71）。特許JP2005112855およびRU2244556/RU2253475は、それぞれ、単独でまたはｖＷＦと会合してＦＶＩＩＩを安定化させる、生物学的に安定でアルブミンを有さない組成物を提供する。この用語はまた、官能基の結合、例えばＰＥＧ化、グリコシル化により改変された任意のＦＶＩＩＩを表す(例えばUS2005009148、US2003077752など)。さらに、この変異体は、加水分解に耐えるように改変されたペプチド結合を含みうる。

特に、この変異体は、天然ヒトＦＶＩＩＩに比べて、阻害抗体に対して低下した抗原性を有し、そして天然ヒトＦＶＩＩＩの活性の少なくとも５０％に等しい血液凝固促進活性を保持する。例えば、一つの適切なアッセイは、Rizzaらに記載された一段階または二段階凝固アッセイである（Rizza et al., 1982, Coagulation assay of Factor VIIIa and FIXa, Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992）。好ましい態様では、この変異体は、天然ヒトＦＶＩＩＩに等しい血液凝固促進活性を保持する。さらに好ましい態様では、この変異体は、天然ヒトＦＶＩＩＩよりも高い血液凝固促進活性を有する。

ＦＶＩＩＩの血液凝固促進活性は、当業者に公知の任意の方法により測定される。好ましくは、該血液凝固促進活性はクロノメトリックアッセイまたは発色アッセイにより測定される。なおさらに好ましくは、ＦＶＩＩＩ活性は、例えばVon Clauss（A. Acta Haematologica, 1957, 17:237）により記載されたようなクロノメトリックアッセイにより、またはRosen（Scand. J. Haematol. 1984, 33 (Suppl 40):139-145）により記載されたようなクロノメトリックアッセイにより測定される。

本発明は、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体をコードする核酸に関する。本発明はまた、本発明に記載の核酸の発現カセットに関する。本発明はさらに、本発明に記載の核酸または発現カセットを含むベクターに関する。このベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターより選択することができる。

核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、またはこれら二つの混合物でありうる。核酸は、一本鎖形態もしくは二本鎖形態またはこれら二つの混合物でありうる。核酸は、例えば改変された結合、改変されたプリンもしくはピリミジン塩基、または改変された糖を含む改変されたヌクレオチドを含みうる。核酸は、化学合成、組換え、突然変異誘発などを含めた当業者に公知の任意の方法により調製することができる。

発現カセットは、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体の発現に必要な全てのエレメント、特にホスト細胞での転写および翻訳に必要なエレメントを含む。ホスト細胞は、原核または真核でありうる。特に、発現カセットは、プロモーターおよびターミネーターと、場合によりエンハンサーを含む。プロモーターは、原核または真核でありうる。好ましい原核プロモーターの例には：Ｌａｃｌ、ＬａｃＺ、ｐＬａｃＴ、ｐｔａｃ、ｐＡＲＡ、ｐＢＡＤ、バクテリオファージＴ３またはＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、λファージのＰＲまたはＰＬプロモーターが挙げられる。好ましい真核プロモーターの例には：ＣＭＶ初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーター、およびいくつかのレトロウイルスのＬＴＲ領域が挙げられる。一般に、適切なプロモーターを選択するために、当業者は、Sambrookらの研究（1989）またはFullerらにより記載された技法（1996; Immunology in Current Protocols in Molecular Biology）を都合よく参考にしてもよい。

本発明は、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体をコードする核酸または発現カセットを有するベクターに関する。このベクターは、好ましくは発現ベクターであり、すなわちそれは、ホスト細胞における変異体の発現に必要なエレメントを含む。ホスト細胞は原核生物例えばE. coli、または真核生物でありうる。真核生物は、酵母（例えば、S. cerevisiae）または真菌類（例えばAspergillus属由来）などの下等真核生物、または昆虫、哺乳動物または植物細胞などの高等真核生物でありうる。細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ、ＣＨＯ（米国特許第４，８８９，８０３号；米国特許第５，０４７，３３５号）でありうる。特定の態様では、この細胞は非ヒトおよび非胚性である。このベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、Agrobacterium由来ｐＴｉプラスミドなどでありうる。このベクターは、好ましくは、複製起点、多重クローニング部位および選択遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数のエレメントを含む。好ましい態様では、このベクターはプラスミドである。原核ベクターの例には、非限定的に以下が挙げられる：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Qiagen）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Stratagene）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＢＲ３２２、およびｐＲＩＴ５（Pharmacia）、ｐＥＴ（Novagen）。真核生物ベクターの例には、非限定的に以下が挙げられる：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＰＩＣＺ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇ（Invitrogen）、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Stratagene）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Stratagene）、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Pharmacia）；およびｐＱＥ−３０（QLAexpress）。ウイルスベクターの例には、非限定的に、アデノウイルス、ＡＡＶ、ＨＳＶ、レンチウイルスなどが挙げられる。好ましくは、発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターである。

本発明に記載のＦＶＩＩＩについてのコード配列は、シグナルペプチドを含んでも含まなくてもよい。コード配列がシグナルペプチドを含まないとき、場合によりメチオニンをＮ末端に付加することができる。または、異種シグナルペプチドを導入することができる。該異種シグナルペプチドは、E. coliなどの原核生物または真核生物由来、特に哺乳動物、昆虫または酵母細胞由来でありうる。さらに、ヌクレオチド配列はまた、イントロンセグメント、特に異種イントロンを含みうる。該イントロンセグメントは、ＦＶＩＩＩ変異体の発現向上を可能にすることができる。そのような構築物は、出願である国際公開公報第２００５／０４０２１３号に記載されている。例えば、ヌクレオチド配列は、本発明に記載の一つまたは複数の置換を含むＦＶＩＩＩ変異体をコードするように配列番号５の改変された配列を含みうる。

本発明は、細胞をトランスフォーメーションまたはトランスフェクションするために、本発明に記載の核酸、発現カセットまたはベクターを使用することに関する。本発明は、ヒトＦＶＩＩＩ変異体をコードする核酸、発現カセットまたはベクターを含むホスト細胞、および本発明に記載のリコンビナントヒトＦＶＩＩＩ変異体を製造するためのその使用に関する。特定の態様では、この細胞は、非ヒトおよび非胚性である。本発明はまた、本発明に記載のリコンビナントヒトＦＶＩＩＩ変異体を製造するための方法に関し、その方法は、本発明に記載の核酸、発現カセットまたはベクターにより細胞をトランスフォーメーションまたはトランスフェクションすること；トランスフォーメーション／トランスフェクションされた細胞を培養すること；および細胞により産生されたヒトＦＶＩＩＩ変異体を収集することを含む。代替の態様では、本発明に記載のリコンビナントヒトＦＶＩＩＩ変異体を製造するための方法は、本発明に記載の核酸、発現カセットまたはベクターを含む細胞を提供すること；トランスフェクション／トランスフォーメーションされた細胞を培養すること；およびその細胞により産生されたヒトＦＶＩＩＩ変異体を収集することを含む。特に、この細胞は、その変異体をコードする核酸により一過的または安定的な方法でトランスフォーメーション／トランスフェクションすることができる。該核酸は、エピソーム形態または染色体形態でその細胞内に含まれていてもよい。リコンビナントタンパク質の製造方法は、当業者に周知である。例えば、不死化ヒト細胞系における製造のための国際公開公報第０１７０９６８号に記載された特異的方法、植物における製造のための国際公開公報第２００５／１２３９２８号、トランスジェニック動物の乳汁における製造のためのUS2005/229261などを挙げることができる。

本発明は、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体を含む薬学的組成物、および血友病Ａの処置のための医薬を調製するための該ＦＶＩＩＩ変異体の使用に関する。好ましくは血友病Ａは、重症および中等度である。該処置は、治癒的または予防的でありうる。特定の態様では、処置される患者は、インヒビターを有する患者である。

したがって、本発明に記載のＦＶＩＩＩ変異体は、二つの主要な種類の血友病患者、すなわち、変異体が該阻害抗体を避ける能力のせいでＦＶＩＩＩ阻害抗体を発生した患者、および変異体が阻害抗体の発生を誘導するリスクが現在使用されている分子よりも低いせいで、そのようなインヒビターをまだ発生していない患者に使用することができる。該ＦＶＩＩＩ変異体は、血友病Ａを有する全ての患者により利用可能であろう。

したがって、本発明は、本発明に記載のＦＶＩＩＩ変異体を含む薬学的組成物に関する。この薬学的組成物は、さらに、突然変異ＦＶＩＩＩを安定化するための化合物、例えば血清アルブミン、ｖＷＦ（フォンウィルブラント因子）またはＦＶＩＩＩ結合部位を含むそのフラグメント、ビタミンＫ依存性凝固因子、およびスクロースなどの多糖を含みうる。本発明はまた、本発明に記載のＦＶＩＩＩ突然変異体をコードする核酸、本発明に記載のベクターまたはホスト細胞を含む薬学的組成物に関する。そのような組成物は、遺伝子療法の状況で有用でありうる。薬学的組成物は、さらに、薬学的に許容される賦形剤または担体を含んでもよい。そのような賦形剤および担体は、当業者に周知であり［Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000);およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)］、生理食塩水およびリン酸緩衝液を含む。本発明に記載のＦＶＩＩＩ変異体はまた、リン脂質または等価物を用いて薬学的組成物に、例えばリポソーム、ナノパーティクルなどの形態に製剤化することができる（国際公開公報第２００４／０７１４２０号；国際公開公報第２００４／０９１７２３号）。薬学的組成物は、さらに、一つまたは複数の他の活性成分を含みうる。

本発明はまた、医薬としての本発明に記載のＦＶＩＩＩ変異体に関する。本発明はさらに、医薬としての、本発明に記載のＦＶＩＩＩ突然変異体をコードする核酸、発現カセット、ベクターまたはホスト細胞に関する。

本発明のヒトＦＶＩＩＩ変異体は、重症および中等度の血友病Ａの場合の補充療法として使用することができる。阻害抗体を発生するリスクがより低く、連続的に使用可能なことは、異なる現存のリコンビナントヒトまたはハイブリッドＦＶＩＩＩよりも大きな長所である。

該改良されたヒトＦＶＩＩＩ変異体は、好ましくは、すでにインヒビターを発生した患者を処置することだけでなく、予防的処置にも向けられる。

加えて、該ＦＶＩＩＩの系統的投与は、血友病Ａを有する任意の患者における予防的処置のために成し遂げることができよう。したがって、例えば外科的手技の間に出血のリスクを減らすこと、またはインヒビターの発生を予防することを想像できよう。該ＦＶＩＩＩの投与はまた、例えば事故、病的な出血の間の、または外科手技により引き起こされる緊急処置の場合に考慮できよう。

本発明の薬学的組成物は、経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所（topical）、局部（local）、気管内、鼻腔内、経皮、直腸内、眼内、耳介内投与に適し、該活性成分は１回用量として投与することができる。好ましくは、薬学的組成物は、静脈内、皮下または筋肉内投与に適する。

処置の投薬量は、ＦＶＩＩＩ欠乏の重症度に応じて変化させることができる。通常、投薬量は、考慮される患者の出血エピソードの重症度および長さに関して回数、期間および単位が調整される。ＦＶＩＩＩは、例えば標準的な凝固アッセイを用いて、出血を抑止するように用量決定される。本発明に記載のＦＶＩＩＩ変異体の有効量には、非限定的に、体重１kgあたり約５〜５０、好ましくは１０〜５０、なおさらに好ましくは２０〜４０単位が含まれうる。投与回数は、例えば８〜２４時間毎でありうる。処置期間は、例えば１〜１０日、または出血が停止するまででありうる。［例えば:Roberts, H. R., and M. R. Jones, Hemophilia and Related Conditions--Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII), "Ch. 153, 1453-1474,1460, Hematology, Williams, W. J. et al., ed. (1990)を参照されたい。］

この処置は、単回静脈内注射または必要に応じて長期にわたる定期的もしくは連続投与の形態でありうる。この処置はまた、リポソームを異なる時間間隔で１回または複数回皮下または経口経路により施行してもよい。

本発明は、凝固障害、特に血友病Ａの処置のための医薬を調製するための、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体の使用に関する。この処置は、治癒的または予防的でありうる。特定の態様では、処置される患者は、インヒビターを有する患者である。本発明はまた、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体を投与することを含む、血友病Ａを処置するための方法に関する。

本発明はさらに、凝固障害、特に血友病Ａの処置のための医薬を調製するための、本発明に記載のＦＶＩＩＩ変異体をコードする核酸の使用に関する。

本発明のＦＶＩＩＩ変異体はまた、別の活性化合物と組み合わせてもよい。例えば、本発明はまた、凝固障害、特に血友病ＡまたはＢの処置のための、第ＩＸａ因子と組み合わせた、本発明に記載のＦＶＩＩＩ変異体の使用に関する。該組み合わせは、国際公開公報第２００４／１０３３９７号に記載されている。

本発明はさらに、血友病Ａを有する患者におけるインヒビターの種類を診断するための、本発明に記載の一つもしくは複数のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体の使用に関する。特に、阻害抗体の存在は、血清試料または体液（リンパ液、尿など）からアッセイされる。阻害抗体の検出は、ＥＬＩＳＡ、電気泳動的ブロッティング、ラジオイムノアッセイによる免疫学的検出、およびＦＶＩＩＩ活性アッセイ（例えば凝固アッセイ）により実施することができる。

実際に本発明者らは、インヒビターにより特異的に認識される位置を野生型ヒトＦＶＩＩＩから同定した。該位置は、血友病に存在する阻害抗体の種類を明らかにするために、個別に、同じドメイン内で組み合わせて、またはＡ２およびＣ２ドメインの間で組み合わせて使用することができる。実際に、阻害抗体を診断する必要性は重大である。該インヒビターのタイトレーションは、あらゆる補充療法に先行して必要である。したがって、本発明者らは、阻害抗体を判断するために本発見を使用することを提案する。血友病患者におけるベセスダアッセイ（インヒビター力価のアッセイ）は、ＥＬＩＳＡに移行する前後に実施することができるが、ＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗原は、別々または組み合わせて採用された本発明のＦＶＩＩＩ変異体に対応する。インヒビターの力価は、野生型ＦＶＩＩＩを用いて実施された対照では有意に減少するであろう。インヒビターの力価が不変のままであるような一つまたは複数の変異体の組み合わせは、インヒビターを用いた血友病患者のための処置として使用される。したがって、この診断は、本発明に記載のヒトＦＶＩＩＩ変異体の送達をコントロールおよびターゲティングすることを可能にする。

したがって、本発明は、以下を含む処置のための方法に関する：
本発明に記載の一つまたは複数のＦＶＩＩＩ変異体に対する、患者の血清試料に含有される阻害抗体の認識検査；
該阻害抗体により認識されない一つまたは複数のＦＶＩＩＩ突然変異体の選択；および
ｂ）より選択される一つまたは複数のＦＶＩＩＩ突然変異体の投与。

好ましい方法で、患者の試料と本発明に記載のＦＶＩＩＩ変異体の間の認識検査は、ベセスダアッセイにより実施される。対照として、認識検査は好ましくは野生型ＦＶＩＩＩで実施される。

本発明は、本発明に記載の一つまたは複数のＦＶＩＩＩ変異体を含む診断キットに関する。

本発明はまた、インヒビターを有する患者における血友病Ａの処置のための医薬を調製するための、本発明に記載の一つもしくは複数のヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体の使用に関し、その患者の血清は、該ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体を認識する抗体を含有しない。

本明細書に引用される全ての参考文献は、参照により本出願に含まれる。本発明の他の特徴および長所は、限定のためではなく例示のために提供される以下の実施例で明らかとなろう。

実施例
実施例１：分子生物学
１および１３位に第ＩＸ因子の二つの切断されたイントロンを有するＦＶＩＩＩ相補ＤＮＡ（５０１２bp）（配列番号４）を、ベクター（pcDNA3.1 GS, Invitrogen）のＮｏｔＩとＸｈｏ１制限部位の間にクローニングし、哺乳動物細胞にこのタンパク質を発現させた。ｐｃＤＮＡ／ＦＶＩＩＩ構築物は、１０４３９bpのプラスミドに相当した。この遺伝子は、ＦＶＩＩＩの活性に不可欠な五つの機能的ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２を含む。ＢドメインがＦＶＩＩＩの血液凝固促進機能に何ら優れた役割を果たさないことが以前に示されたが、本発明者らは、このドメインの欠失を有するＦＶＩＩＩを産生させることを選択した。Ａ１およびＡ２ドメインをコードする領域は、それぞれイントロンを有する。コードしているエキソンの間にこれら二つのイントロン領域を挿入すると、ヒトＦＶＩＩＩの発現が有意に向上する。この遺伝子によりコードされるタンパク質配列を配列番号５に示す。

突然変異誘発戦略は、ＦＶＩＩＩのターゲティングされたドメイン、すなわちＡ２、Ａ３およびＣ２に単一アラニン突然変異体の全てを系統的に生成することにあった。該突然変異体は、US2004/0048268に記載されたMassive Mutagenesis（登録商標）法により生成された。

先に述べたように、ドメインＡ２、Ｃ２およびＡ３は、阻害抗体によるＦＶＩＩＩ認識の優先的なターゲットであることが示された。これらの機能的ドメインにおける各アミノ酸を、Ａ２ドメインのイントロンセグメントとは別にアラニンにより置換した。以下の位置にアラニン突然変異を導入するように、一連の７９５個のオリゴヌクレオチド（３２塩基長）を設計および製造した：ｉ）３７６−７１９［Ａ２］；ｉｉ）２１７３−２３２５［Ｃ２］；ｉｉｉ）１６９１−２０２５［Ａ３］。本発明に使用されるヒトＦＶＩＩＩの突然変異についての付番システムは、Woodら（Nature, 1984, 312:330-337）により定義されたものである。部位特異的突然変異誘発の後に、本発明者らは、考慮された位置でアラニン突然変異をライブラリーの各突然変異体が有したことをチェックするために、２回の連続的配列決定を行った。ＦＶＩＩＩのＣ２、Ａ２およびＡ３ドメインにおけるアラニン突然変異体のこの集合は、この分子についてこれまでに実施された最初の包括的部位特異的突然変異体ライブラリーである。

実施例２：ＣＯＳ−７哺乳動物細胞におけるヒトＦＶＩＩＩアラニン突然変異体の発現
ＦＶＩＩＩは通常、哺乳動物細胞に発現される（Toole et al., 1984, Nature, 312:342-347；Gitschier et al., 1984, Nature, 312:326-330；Wood et al., 1984, Nature, 312:330-337；Vehar et al., 1984, Nature, 312:337-342；国際公開公報第８７０４１８７号；国際公開公報第８８０８０３５号；国際公開公報第８８０３５５８号；米国特許第４７５７００６号）。

ネイティブまたは突然変異ｐｃＤＮＡ／ＦＶＩＩＩ構築物でＣＯＳ−７細胞をトランスフェクションするために、該細胞が９０％集密度に達したときにトリプシン処理した。ＣＯＳ−７細胞を１／４の比で再度捲種した（すなわち細胞が表面にいったん接着したときに約２５％の集密度が得られるように）。細胞が７０〜８０％集密度に達したときに、ＣＯＳ−７細胞の一過性トランスフェクションを９０mm培養プレートで実施した（ウェル１個あたり６ml）。トランスフェクションは、体積１８μlのFuGENE-6（Roche, Meylan, France）について約６μgのDNAを用いて実施した。

トランスフェクションの前に、FuGENE-6を、無血清ＩＭＤＭ培地で希釈し、室温で５分間インキュベーションした。FuGENE-6／ＤＮＡ混合物を室温で１５分間放置し、次いで完全培地中の細胞に滴加した。トランスフェクションの２４時間後にＦＶＩＩＩを含有する最初の上清を収集し；次いで新鮮培地６ｍｌを細胞に注いだ。４８時間後に培養上清（６ml）を収集し、小分けし、凝固（発色）アッセイまで−２０℃で保存した。野生型ＦＶＩＩＩの平均発現レベルをＥＬＩＳＡ（Stago販売のＥＬＩＳＡキット）により予測し、そのレベルは、２０〜６０ng/mlに含まれた。

全ての細胞培養試薬をInvitrogenから入手した。ＣＯＳ−７細胞（ＳＶ４０をトランスフォーメーションされたアフリカミドリザル腎細胞）を、イソコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を使用した標準的な培養条件（３７℃、湿潤５％ＣＯ_２雰囲気中）で成長させた。ＩＭＤＭにＬ−グルタミンアナログ（glutamax）、非働化ウシ胎児血清（終濃度１０％）および抗生物質（ペニシリン４０U/mlおよびストレプトマイシン０．１mg/ml）を添加した。

実施例３：一次スクリーニング：ヒトＦＶＩＩＩアラニン突然変異体の機能分析
一次スクリーニングは、同体積のＣＯＳ−７細胞培養上清で得られた全凝固活性の測定値と関連する（図１）。凝固活性測定の二つの異なるアッセイであるクロノメトリックアッセイおよび発色アッセイを一次スクリーニングに使用した。

クロノメトリック活性は、被験ＦＶＩＩＩ分子を希釈したものをＦＶＩＩＩ欠乏血漿（Stago）の存在下のイミダゾール緩衝液中でインキュベーションした後に測定した。カルシウムの添加により凝固が開始し、血餅が形成するまでの時間をMDA-II装置（BioMerieux, Marcy-l' Etoile）で測定した。７９５個のアラニン突然変異体の血液凝固活性は、National Hemophilia Treatment Center（Hospices Civils de Lyon）のロボット工学プラットフォームでのクロノメトリックアッセイにより測定した。全てのアラニン突然変異体のクロノメトリック活性を、各トランスフェクションについての内部標準として使用した野生型ＦＶＩＩＩの活性と比較した。非突然変異ＦＶＩＩＩに対する全活性のこれらの測定の結果は、以下の２種類の突然変異体を識別した：Ｉ）野生型ＦＶＩＩＩの活性の少なくとも５０％を保持した突然変異体；ｉｉ）野生型ＦＶＩＩＩの活性の５０％未満を有する突然変異体。図２に、分析した７９５個のアラニン突然変異体のうち３５９個の凝固活性を示す。これらのデータは、血液凝固活性についてこれらのＦＶＩＩＩ残基のそれぞれの機能マッピングを表し；アラニン突然変異により抑制される血液凝固活性は、検討された残基がＦＶＩＩＩの血液凝固活性に不可欠であることを示す。

非突然変異ＦＶＩＩＩの全活性の５０％超を保持した１５８個の突然変異体を、二次スクリーニングのためにこのクロノメトリックアッセイにより選択した。それらの活性は、最初に第２の凝固アッセイ、すなわち上記発色アッセイによりまず確認した。このアッセイはまた、National Hemophilia Treatment Center（Hospices Civils de Lyon）のロボット工学プラットフォームで行った。１５８個の選択されたアラニン突然変異体の発色活性は、Coamatic Factor VIIIキット（Chromogenix, Instrumentation Laboratory, Milan, Italy）を用いて、製造業者の説明書に準じて実施した。簡潔には、提供された希釈緩衝液で培養上清（５０μl）を希釈し、３７℃で４分間予備インキュベーションした。次いで、３７℃で予熱した反応媒質（５０μl）を４分間加え、その後、３７℃で顕色媒質５０μlを添加した。マイクロタイタープレートを振盪後直ちに、経時的な生成物の形成を分光光度計を用いて４０５nmで測定した。生成物の形成はmUOD/minで表した。値が２００mUOD/minよりも大きかった場合、より高い希釈倍率を使用してアッセイを繰り返した。

表１は、非突然変異ＦＶＩＩＩ活性の５０％超を保持した１５８個の突然変異体の活性を示す。該１５８個の突然変異体は、二次スクリーニングのために選択した。

実施例４：二次スクリーニング：ヒトＦＶＩＩＩ阻害抗体に対する抗原性喪失の評価
二次スクリーニングは、一次スクリーニング後に選択された１５８個の突然変異体に関して下記のように実施された、ベセスダアッセイ類似のアッセイに関連する；該アッセイは、阻害血清（または抗体）を被験ＦＶＩＩＩ分子または参照標準と接触させる段階およびクロノメトリックアッセイによりＦＶＩＩＩの血液凝固活性を測定する段階を含む。

異なるＦＶＩＩＩ構築物によりトランスフェクションされたＣＯＳ細胞と４８時間接触した後に得られた培養上清を使用した。該上清は、完全培地［(ＩＭＤＭ、Invitrogen)、１０％ウシ胎児血清、２mM Ｌ−グルタミン、１００U/mlペニシリン、１００mg/mlストレプトマイシン］中で産生した。上清を新鮮完全培地に希釈して、約１０〜２０％（１FVIII単位＝１００％活性＝２００ng/ml）の範囲に含まれる最終クロノメトリック活性を得た。希釈または無希釈の培養上清（１４０μl）を１５０μlのＦＶＩＩＩ枯渇ヒト血漿（Stago, Asnieres, France）に添加した。次いで、抗体希釈物（１０μl）をこの混合物に添加した。これらの抗体は、インヒビターを有する血友病患者からプロテインＡを用いて精製されたＩｇＧ画分である。非血友病対照からのＩｇＧ画分を同様に得た。ベセスダインヒビター力価は、血漿由来のインヒビター活性と同一であった。したがって、精製プロトコールは、抗体のインヒビター活性に影響しなかった。最初に抗体を新鮮完全培地で希釈し、一定の抗体希釈物または系列希釈物のいずれかを用いて測定を行った。使用された一定の抗体濃度は、１２．５％活性を有するリコンビナントＦＶＩＩＩ標準溶液の５０％阻害を生じる濃度であった。試料を３７℃の水浴中で１時間３０分間インキュベーションした。次いで、MDA-II装置（BioMerieux, Marcy-l' Etoile）で血液凝固活性を測定し、ＣＨＯ細胞系で安定的に産生された同一のＦＶＩＩＩから樹立した標準曲線と対比した。結果は、患者の血清由来の阻害抗体による所与の突然変異体の血液凝固活性の阻害の防止を表すパーセンテージとして表現する。該パーセンテージは、ＦＶＩＩＩ突然変異体Ｅ５１８Ａについて図５に示すように計算した。表された阻害防止は、パーセンテージ＝−［（ｂ−ａ）／ａ］×１００であり；式中、「ａ」は、ＷＴの残留活性パーセンテージ（血清＋ＩｇＧ／血清−ＩｇＧ）であり、「ｂ」は、突然変異体の残留活性パーセンテージ（血清＋ＩｇＧ／血清−ＩｇＧ）である。

表２に、３０個の単一突然変異体について、５人の血友病患者由来の血清についての阻害への防止のパーセンテージを示す。該突然変異体を、一次スクリーニングで選択された１５８個の突然変異体の二次スクリーニングで選択した。血清ＴＤおよびＳＬについての突然変異体２３１６、血清ＧＣについての突然変異体２２９４、血清ＦＳについての突然変異体４０３ならびに血清ＰＲについての突然変異体２２７５などのように、いくつかの突然変異体は、ある種の血清を用いた阻害に対して高パーセンテージの防止を示す。

患者の血清を、それらの高いベセスダ力価（１０BU超）およびそれらの異なるインヒビタープロファイルから選択した。これらの患者は、もはやＦＶＩＩＩ注射で処置することができず、バイパス製剤を必要とする。したがって、これらの患者の一人の阻害抗体によるＦＶＩＩＩ活性阻害をたとえ部分的であっても向こうにするＦＶＩＩＩアラニン突然変異体を得ることは、インヒビターを有する血友病患者を処置する将来的なアプローチに向けた大きな一歩である。多数の突然変異体および異なる検査血清で得られた種々のデータから、大部分の阻害抗体を避けることができるが、その血液凝固促進活性は保持しているような改良されたＦＶＩＩＩを誘導する突然変異の組み合わせを作り出すことが可能になるであろう。

トランスフェクションに関するＦＶＩＩＩの発現レベルの再現性は、以下の野生型ＦＶＩＩＩの比活性により照査された。実際に、抗原の測定（Stago製市販ＥＬＩＳＡキット）から計算された比活性は、異なるトランスフェクションで産生した野生型ＦＶＩＩＩと同一であった。同様に、野生型ＦＶＩＩＩの活性の少なくとも５０％を保持した突然変異体について抗原濃度を測定し、それからそれらの比活性を決定した。比活性は、ＥＬＩＳＡキット（Stago FVIIIキット）で得られたタンパク質濃度（ng/ml）に対する、発色アッセイで測定された全活性（mUOD/min）に相当する。表３は、二次スクリーニングで選択された３０個の突然変異体の全活性および比活性の比較データを示す。

８個のＦＶＩＩＩアラニン突然変異体２１７５、２１９９、２２００、２２１５、２２５１、２２５２、２２７８および２３１６は、本発明の範囲内で使用されるＣＯＳ細胞産生培地への平均分泌能力を遙かに超える平均能力を示した。図３は、これら８個の突然変異体について得られたデータを示す。これらの突然変異体の全凝固活性を、発色アッセイにより測定した。それらの濃度は、野生型ＦＶＩＩＩの約２〜４倍であった。この性質は、リコンビナントＦＶＩＩＩの製造のために興味深く、新世代ＦＶＩＩＩの製造コストを下げることを可能にすることができよう。また、それは、血友病患者のための遺伝子療法に好都合でありうる。さらに、より大きい分泌能を付与するこれらの突然変異は、阻害抗体による阻害を防止する突然変異と組み合わせると、例えば該抗原性のより低い突然変異体の任意の相対的な分泌喪失の補償を可能にすることによって、大変興味深くなりうる。

１５個の突然変異体２１７７、２１８３、２１８６、２１９１、２１９６、２２０４、２２０５、２２０６、２２１３、２２１７、２２３５、２２５８、２２６４、２２６８および２２６９は、野生型ＦＶＩＩＩよりもはるかに高い比活性を示したが、野生型ＦＶＩＩＩに近い高い産生レベル（１０ng/ml超の濃度）を維持した。これらの１５個の突然変異体の比活性を図４に示す。これらの突然変異体の全凝固活性を、発色アッセイにより測定した。この性質は、患者に注射されるＦＶＩＩＩのより少量または回数の少ない投与を可能にすると思われることから、興味深い。さらに、より高い比活性を付与するこれらの突然変異は、阻害抗体による阻害を防止する突然変異と組み合わせると、抗原性のより低い該突然変異体の任意の相対的な活性喪失の補償を可能にすることによって、大変興味深くなりうる。

実施例５：二次スクリーニングで選択された最良の単一突然変異体の選択および組み合わせ
二次スクリーニングで選択された３０個の単一突然変異体のうち、それらの各突然変異を組み合わせるために８個を選び、それぞれの注目すべき性質の累積／相加効果を得た。これらの突然変異体についての選択基準は複雑であり、以下のパラメーターを考慮した：
−インヒビターを有する血友病患者由来の検査血清の少なくとも一つについて少なくとも２５％の阻害防止；
−非突然変異ＦＶＩＩＩに対して少なくとも１００％の血液凝固全活性；および
−再現性的に良好なレベルの発現。

８個の選択された突然変異体は、Ａ２ドメインにおける突然変異体４０９、４６２、５０７および６２９ならびにＣ２ドメインにおける突然変異体２２８９、２２９４、２３１２および２３１６であった。以前に言及したように、選択基準は、表３に示すような高い比活性（発現レベルに対する血液凝固活性）を考慮に入れた。この比活性レベルは、異なる実験で一定でなければならなかった。

当業者に公知の突然変異誘発法により、８個の単一突然変異４０９、４６２、５０７、６２９、２２８９、２２９４、２３１２および２３１６の組み合わせから生じた２８個の二重突然変異体（表４に示す６個のＡ２二重突然変異体＋６個のＣ２二重突然変異体＋１６個のＡ２−Ｃ２二重突然変異体）を構築した。これらの突然変異体を、実施例２に記載されたようにＣＯＳ−７哺乳動物細胞に一過性発現させた。前の実施例に記載したように、それらの発現レベルおよびそれらの活性レベルをそれぞれＥＬＩＳＡおよび発色アッセイ（mUOD/min）により測定した。次いで、これら２８個の突然変異体を、血友病患者由来の抗体による阻害へのそれらの防止について評定した。Ａ２二重突然変異体は、患者の血清由来の抗体の一つまたは全てについて有意な阻害防止を示したが、Ｃ２ドメイン突然変異を有する組み合わせ（６個のＣ２二重突然変異体＋１６個のＡ２−Ｃ２二重突然変異体）は、有意でない、またはゼロの阻害防止を示した。

表５は、６個のＡ２二重突然変異体の比活性、および実施例４と同様に計算した、４人の血友病患者ＴＤ、ＧＣ、ＳＬおよびＰＲ由来の血清による阻害へのそれらの防止のパーセンテージを示す。特に好ましい二重突然変異体は、４人の患者のうち最低３人由来の抗体を有意に防止した。これは、Ａ２ドメインにおける４個の単一突然変異の累積効果を例示している。したがって、選択は、４つの突然変異４０９、５０７、４６２および６２９の組み合わせに基づいた。三重突然変異体およびこれら４個の突然変異４０９、５０７、４６２および６２９を含む四重突然変異体もまた構築した。

実施例６：四重突然変異体（ＦＶＩＩＩ−４Ａ２）の構築および特徴付け
４個の選択されたＡ２突然変異４０９、４６２、５０７、６２９の組み合わせから得られた四重突然変異体を、当業者に公知の古典的突然変異誘発法により構築した。実施例９に記載されるように得られたＣＨＯ細胞系で四重突然変異体を製造した。５人の血友病患者ＦＳ、ＴＤ、ＧＣ、ＰＲおよびＳＬ由来の抗体による阻害へのそれの防止についてもまた、この突然変異体を特徴づけた。阻害抗体と共にインキュベーション後に測定された残留活性を、非免疫抗体と共にインキュベーション後に残った残留活性で除算する。このように残留活性のパーセンテージを測定したが、これを図６のグラフに表示する。これらのグラフに、インヒビターを有する、異なる患者由来の抗体に異なる希釈を行ったものと接触した後のＦＶＩＩＩ−４Ａ２の残留活性を図示する。阻害抗体と共にインキュベーションされた後に、ＦＶＩＩＩ−４Ａ２突然変異体がずっと高いクロノメトリック活性を保持したことが明らかに分かる。したがって、最高の阻害抗体濃度についての残留活性の増加は２３０〜４５０％の範囲であり、残留活性の該パーセンテージは、阻害抗体の起源と使用される濃度の両方に依存した。

ＦＶＩＩＩ−４Ａ２への抗体の直接結合が改変されたかどうかを測定するために、上記と同じプロトコールに準じて患者の血清の代わりに以下の三つの追加的な抗体を使用した：患者の抗体のために使用されたものと同じプロトコールから生成された抗Ａ２ドメイン抗体（ＧＭＡ０１２、Green Mountain Antibodies）、抗Ｃ２ドメイン抗体（ＥＳＨ４、American Diagnostica）およびウサギポリクローナル抗体。二つの抗Ａ２ドメイン抗体、ウサギポリクローナル抗体およびＧＭＡ０１２についてのこれらの対照実験の結果を図７に示す。明らかに、ＦＶＩＩＩ−４Ａ２のＡ２ドメインにおける突然変異は、ＦＶＩＩＩ−４Ａ２が抗Ａ２ドメイン抗体ＧＭＡ０１２およびウサギポリクローナル抗体を回避できるようにした（図に示す）。他方、ＥＳＨ４については野生型ＦＶＩＩＩに対するＦＶＩＩＩ−４Ａ２の阻害の有意差はみられなかった（データは示さず）。これらの結果を阻害防止のデータと関連させると、一方でＡ２ドメインにおける突然変異導入により患者の抗体を回避させ、他方で認識が野生型ＦＶＩＩＩに類似していることから、ＦＶＩＩＩ−４Ａ２のＣ２ドメインは損傷していないことが示される。フォンウィルブラント因子との、および完全なＦＶＩＩＩ活性（カルシウムおよびリン脂質の結合）に必要な補因子との相互作用を担うのがＣ２ドメインであることから、後者のポイントは、ＦＶＩＩＩ−４Ａ２活性に重要である。

実施例７：ＦＶＩＩＩ−４Ａ２突然変異体の特徴付け
ａ）ＥＬＩＳＡ
実施例９に記載されたプロトコールに準じて野生型ＦＶＩＩＩと同じＣＨＯ細胞系でＦＶＩＩＩ−４Ａ２を製造した。これを同じプロトコールで精製したことから（実施例９にも記載）、機能的分析でＦＶＩＩＩと比較した。ＥＬＩＳＡキットでＦＶＩＩＩ−４Ａ２の濃度を測定した（下記プロトコール参照）。導入された突然変異がこのキットを用いた突然変異ＦＶＩＩＩの定量を変化させなかったことをチェックするために、一連のモノクローナル抗体を使用して追加の対照実験を行った。これによって、類似した濃度の野生型ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ−４Ａ２が、軽鎖Ｃ２ドメインに対する抗体ＥＳＨ−４により等しく認識されたことが示された。阻害防止のデータに一致して、野生型ＦＶＩＩＩに比べてＧＭＡ０１２抗体によるＦＶＩＩＩ−４Ａ２の認識は大きく減少した。これらのデータを図８に示す。

これらの実験のためのＥＬＩＳＡアッセイのプロトコールを下に記載する。

試薬を５０mM ＣＡＰＳ（ｐＨ９．０）で少なくとも５倍希釈し、４℃で一晩インキュベーションして、対象となる生成物をＥＬＩＳＡプレート支持体（Nunc Maxisorb）上にコーティングした。次いで、ウェルをＴＢＳ−Ｔ緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ_２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％ＢＳＡ）で２回洗浄し、次いで、ＴＢＳ−３％ＢＳＡ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ_２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、３％ＢＳＡ）で１時間ブロッキングした。次いで、プレートにコーティングされたものに結合する試薬をＴＢＳ−３％ＢＳＡで希釈し、室温で１時間３０分インキュベーションし、次いで、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。一次抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した二次抗体をＴＢＳ−３％で希釈し、それぞれ室温で１時間３０分添加した。二次抗体を２０００倍希釈した。二つの抗体のインキュベーションの合間にプレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いで、もう一度洗浄してから、基質であるＯＰＤ／尿素混合物（Sigma）を添加した。２．５ＭＨ_２ＳＯ_４を添加することにより酵素反応を停止させた。吸光度を４９０nmで読み取った。

ｂ）比活性の測定
ＦＶＩＩＩ−４Ａ２突然変異体の比活性は、発色活性を濃度で除算することによって決定した。これらの比活性を野生型と比較した。野生型ＦＶＩＩＩの発色活性は約１５±１ODU/min・μgであり、ＦＶＩＩＩ−４Ａ２の発色活性は約２７±１１ODU/min・μg、すなわちより高い活性であった。

ｃ）トロンビンによる活性化
野生型ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ−４Ａ２（０．１２５Ｕまたは２５ｎg）を１０μMのホスファチジルコリン：ホスファチジルセリンの８０：２０混合物および０．１mg/ml ＢＳＡを含有する４０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＣａＣｌ２に希釈し、次いで、３７℃で５分間インキュベーションした。トロンビン（０．０５Ｕ）を加え、その作用を異なる時間に測定した。各時間に一定分量を取り出し、ＦＸａを生成させるために同緩衝液に希釈したヒルジン（０．５Ｕ）、第ＩＸａ因子（５０nM）および第Ｘ因子（２００nM）の混合物と共にインキュベーションした。ＦＸａ基質ｐＮＡＰＥＰ−２５を直ちに加え、発色産物の形成を４０５nmで測定した。初速度を測定し、１分間あたりに形成したＦＸａの量を計算した。

野生型ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ−４Ａ２は、トロンビン添加の１〜２分後にピークに達するＦＶＩＩＩ活性の急速な増加に続いて約２〜３分の半減期での該活性の急速な減少を伴う同一のトロンビン応答プロファイルを示した。図９に示された結果は、ＦＶＩＩＩ−４Ａ２が、野生型ＦＶＩＩＩと同じく、トロンビンによって認識されるが、４個の突然変異の一つにより引き起こされたおそれのある活性の相対的な減少を伴うことを示している。

ｄ）Ａ２ドメインの解離
野生型ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ−４Ａ２を上記のように１分間活性化させた。次いで、ヒルジンを添加し、ＦＶＩＩＩａを３７℃で異なる時間放置した。該時間に一定分量を取り出し、リン脂質、ＦＩＸａおよびＦＸの混合物と共にインキュベーションした。ＦＸａを５分間形成させ、次いで、停止緩衝液を加えた（Ｔｒｉｓ５０mM（ｐＨ８．８）、４７５mM ＮａＣｌ、９mM ＥＤＴＡ）。形成したＦＸａの量を上記のように測定した。

ＦＶＩＩＩａを異なる時間インキュベーションしてから、その残留活性を測定した。経時的な活性の喪失は、Ａ２ドメインの解離に対応した。野生型ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ−４Ａ２の活性喪失プロファイルは同様であったが、それぞれの動態は異なった。実際に、野生型ＦＶＩＩＩは３分という半減期を有したが、ＦＶＩＩＩ−４Ａ２の半減期は１１分であった。この増加した安定性から、発色アッセイで観察されたより高い比活性を説明できよう。この検査では、ＦＶＩＩＩａを４分間インキュベーションしてから、基質を加えた。このように野生型ＦＶＩＩＩは、この検査の間にＦＶＩＩＩ−４Ａよりも速くその活性を喪失した。結果を図１０に示す。

実施例８：ＦＶＩＩＩ−３Ａ２突然変異体の構築および特徴付け
以下の４個の三重ＦＶＩＩＩ−３Ａ２突然変異体を構築した：ＦＶＩＩＩ−３Ａ２（４０９−４６２−５０７）、ＦＶＩＩＩ−３Ａ２（４６２−５０７−６２９）、ＦＶＩＩＩ−３Ａ２（４０９−４６２−６２９）、ＦＶＩＩＩ−３Ａ２（４０９−５０７−６２９）。

ＦＶＩＩＩ−３Ａ２（４０９−４６２−５０７）の比活性の測定
ＦＶＩＩＩ−３Ａ２突然変異体（４０９−４６２−５０７）の比活性は、発色活性またはクロノジェニック活性を濃度で除算することによって決定した。これらの比活性を野生型ＦＶＩＩＩと比較した。ＦＶＩＩＩ−３Ａ２（４０９−４６２−５０７）の発色活性は、野生型ＦＶＩＩＩの発色活性の９８％であった。これらの結果は、ＦＶＩＩＩ−３Ａ２の６２９位に突然変異が不在であることが、ＦＶＩＩＩ−４Ａ２よりも高い血液凝固活性をもたらすことを示している。

ＦＶＩＩＩ−３Ａ２（４０９−４６２−５０７）の阻害防止
この突然変異体をまた、４人の血友病患者ＦＳ、ＴＤ、ＧＣおよびＳＬ由来の抗体による阻害へのそれの防止について分析した。阻害抗体と共にインキュベーション後に測定された残留活性を、非免疫抗体と共にインキュベーション後に残留した活性により除算した。このように残留活性のパーセンテージを決定し、図１１の曲線に表した。これらの曲線は、インヒビターを有する、異なる患者由来の抗体に異なる希釈を行ったものと接触した後のＦＶＩＩＩ−３Ａ２（４０９−４６２−５０７）の残留活性を示している。ＦＶＩＩＩ−３Ａ２突然変異体（４０９−４６２−５０７）を使用すると、阻害抗体と共にインキュベーションした後にずっと高いクロノメトリック活性を保持できるようになることが明らかに見てとれる。したがって、突然変異４０９−４６２−５０７の組み合わせは、残留活性の増加を招く、より大きい阻害防止をもたらす。残留活性のこのパーセンテージは、阻害抗体の起源と使用される濃度の両者に依存する。

実施例９：ＦＶＩＩＩ−４Ａ２を発現しているＣＨＯ細胞系の製造およびＦＶＩＩＩの精製／製造
ＣＨＯ細胞系の製造
ＦＶＩＩＩを発現しているＣＨＯ細胞系（ＥＣＡＣＣ８５０５０３０２）は、Plantierら（Thrombosis and Haemostasis 2001; 86 p.596）に記載されたように生成させた。簡潔には、加湿５％ＣＯ_２雰囲気中で細胞を３７℃で維持した。１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＩＭＤＭ培地で細胞を成長させた。細胞（７×１０^６個）をトリプシン処理し、ＰＢＳに再懸濁し、次に、対象のｃＤＮＡ（７μg)の存在下でエレクトロポレーションに供した。次いで、ゲネチシン（geneticin）（０．６mg/ml）の存在下で細胞を再播種した。個別のクローンを選択し、継代し、増幅させた。細胞がＦＶＩＩＩを合成する能力は、培地の発色活性を測定することによって決定した。最良産生性のクローンを増幅させ、３個のフラスコに成長させた。産生を５日間かけて行い、その間に細胞を１日中完全培地中でインキュベーションし、３回洗浄し、次いで、血清の代わりに１％ＢＳＡを含有するＩＭＤＭ培地で一晩インキュベーションした。ＢＳＡ含有培地を収集し、２５００rpm、４℃で１０分間遠心分離し、−３０℃で保存した。その日のうちに細胞を完全培地に戻した。

ＦＶＩＩＩ突然変異体（ＦＶＩＩＩ−３Ａ２およびＦＶＩＩＩ−４Ａ２）の精製および製造
精製プロトコールは、Jenkinsら（Blood, 2004）により記載される技法に基づいた。培地を解凍し、４０％(m/V)（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を添加した。培地を４℃で一晩振盪し、次いで、１４０００rpm、４℃で３０分間遠心分離した。ペレット１容を１０容の２０mM ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＣａＣｌ_２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液に再懸濁し、同様であるが２００mM ＮａＣｌを含有する緩衝液で一晩透析した。透析液を１３，０００rpm、室温で１０分間遠心分離し、次いで、２ml/minでFLPC Sepharose FFカラムにロードした。このカラムは、同緩衝液で予め平衡化しておいた。ＦＶＩＩＩを０．２〜１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出させた。最高の発色活性を有する画分をプールし、５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＮａＣｌおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液で透析した。透析液を小分けし、−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％アクリルアミドで泳動した後に、硝酸銀染色およびイムノブロットによりタンパク質の質を評定した。ＦＶＩＩＩ濃度をAsserachrom FVIII:Agキット（Stago, Asnieres, France）により測定した。

Claims

ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体が、Ａ２ドメインの４６２、４０９、５０７、６２９、４００、５６２、４０３、５１８、４１４、４９６、４２１、４９３、４８６、および４９４位の残基、ならびにＣ２ドメインの２２０６、２２１２、２２２６、２２４４、２２６１、２２７５、２２８０、２２８１、２２８２、２２８９、２２９４、２３１１、２３１２、および２３１６位の残基からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、該位置が配列番号３に示されることを特徴とする、ヒトＦＶＩＩＩ変異体またはその生物学的に活性な誘導体。
変異体が、Ａ２ドメインの４６２、４０９、５０７、および６２９位の残基、ならびにＣ２ドメインの２２８９、２２９４、２３１２、および２３１６位の残基からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、該位置が配列番号３に示されることを特徴とする、請求項１記載の変異体。
変異体が、Ａ２ドメインの４６２、４０９、５０７、および６２９位の残基からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、該位置が配列番号３に示されることを特徴とする、請求項１記載の変異体。
単一置換を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の変異体。
変異体が、Ｃ２ドメインの２２０２位の残基およびＡ２ドメインの４３７位の残基からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸の置換をさらに含み、該位置が配列番号３に示されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の変異体。
変異体が、４０９＋４６２、４０９＋５０７、４６２＋５０７、４０９＋６２９、４６２＋６２９および５０７＋６２９からなる群より選択される二つの置換の組み合わせを含むか、またはそれからなり、該位置が配列番号３に示されることを特徴とする、請求項１記載の変異体。
変異体が、４０９＋４６２＋５０７、４６２＋５０７＋６２９、４０９＋４６２＋６２９および４０９＋５０７＋６２９からなる群より選択される三つの置換の組み合わせを含むか、またはそれからなり、該位置が配列番号３に示されることを特徴とする、請求項１記載の変異体。
変異体が、４０９、４６２、５０７および６２９位の四つの置換の組み合わせを含むか、またはそれからなり、該位置が配列番号３に示されることを特徴とする、請求項１記載の変異体。
変異体が、Ｃ２ドメインの２１７７、２１８３、２１８６、２１９１、２１９６、２２０４、２２０５、２２１３、２２１７、２２３５、２２５８、２２６４、２２６８および２２６９位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換をさらに含み、該位置が配列番号３に示されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項記載の変異体。
変異体が、Ｃ２ドメインの２１７５、２１９９、２２００、２２１５、２２５１、２２５２および２２７８位の残基からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸の置換をさらに含み、該位置が配列番号３に示されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載の変異体。
変異体のポリペプチド配列が、任意の欠失または切断を含まずに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の置換により配列番号３の配列と異なることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項記載の変異体。
ドメインＢの部分的または全体的欠失にあることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項記載の変異体。
アミノ酸が、アラニン、メチオニン、セリン、グリシン、およびロイシンより選択されるアミノ酸、好ましくはアラニンにより置換されていることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項記載の変異体。
請求項１〜１３のいずれか一項記載の変異体をコードする核酸。
請求項１４記載の核酸の発現ベクターまたはカセット。
請求項１〜１３のいずれか一項記載の変異体を含む薬学的組成物。
血友病Ａの処置のための医薬を調製するための、請求項１〜１３のいずれか一項記載の変異体の使用。
処置される患者が、インヒビターを有する血友病患者であることを特徴とする、請求項１７記載の使用。
処置される患者が、インヒビターの発生前の血友病患者であることを特徴とする、請求項１７記載の使用。
医薬としての、請求項１〜１３のいずれか一項記載の変異体。
血友病Ａの処置に使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項記載の変異体。
処置される患者が、インヒビターを有する血友病患者であることを特徴とする、請求項２１記載の変異体。
処置される患者が、インヒビターの発生前の血友病患者であることを特徴とする、請求項２２記載の変異体。
血友病Ａを有する患者におけるインヒビターの種類の診断のための、請求項１〜１３のいずれか一項記載の一つまたは複数の変異体の使用。