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JP2010512765A - 選択方法 - Google Patents

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JP2010512765A
JP2010512765A JP2009541870A JP2009541870A JP2010512765A JP 2010512765 A JP2010512765 A JP 2010512765A JP 2009541870 A JP2009541870 A JP 2009541870A JP 2009541870 A JP2009541870 A JP 2009541870A JP 2010512765 A JP2010512765 A JP 2010512765A
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本発明は、哺乳動物細胞を、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含む核酸でトランスフェクトする工程、トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、レンズマメアグルチニン(LCA)の存在下で培養する工程、およびこれらの条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択する工程による、哺乳動物細胞の選択方法を含む。

Description

本発明はRNAiの分野に関する。より正確には、本発明は、細胞におけるポリペプチドの翻訳を低下させ、その後に、該細胞を選択する分野に関する。
発明の背景
RNAiを介した遺伝子サイレンシングの現象は線虫(Caenorhabditis elegans)系において初めて述べられ、この現象において、長い二本鎖RNA分子をマイクロインジェクションすることによって、それぞれの遺伝子が不活性化されることが報告された(US 6,506,559)。後に、脊椎動物(EP 1 114 784)、哺乳動物、特に、ヒト細胞(EP 1 144 623)において、RNAiを介した遺伝子サイレンシングが開示された。これらの系では、関心対象の特定の遺伝子を一過的にノックダウンするために、19〜29bpの短い二本鎖RNA分子がトランスフェクトされた場合、遺伝子不活性化が首尾よく達成される。
今までに調べられてきた様々な生物において、RNAを介した遺伝子不活性化の機序は若干の差があるように思われる。しかしながら、全ての系において、RNAを介した遺伝子サイレンシングは、いわゆるRISC複合体の一部であるエンドヌクレアーゼArgonaute2によって誘導される標的mRNAの転写後分解に基づいている(WO 03/93430)。分解の配列特異性は、RISC複合体に取り込まれた特定のアンチセンスRNA鎖のヌクレオチド配列によって決定される。
導入の可能性のある適切なものには、二本鎖RNA分子それ自体をトランスフェクトすること、またはDNAベクター構築物をインビボ発現させ、これにより標的RNA分子の一部に同一もしくは相補的な配列を有する短い二本鎖RNA化合物を直接生じさせることが含まれる。多くの場合、遺伝子サイレンシングには、いわゆるshRNA構築物が首尾よく用いられてきた。これらの構築物はステム-ループRNAをコードし、ステム-ループRNAは細胞に導入された後に二本鎖RNA化合物にプロセシングされ、二本鎖RNA化合物の配列は元のRNA分子のステムに対応することを特徴とする。
IgG1型免疫グロブリンには、2本のN結合型オリゴ糖鎖がFc領域のAsn297の位置に、場合によってはAsn298の位置に結合している。N結合型オリゴ糖は、一般的に、コアフコースを有するトリマンノースコア構造またはコアフコースを有さないトリマンノースコア構造から構成される複合二分岐型である(Rademacher, T.W., et al., Biochem. Soc. Symp. 51 (1986) 131-148; Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Shinkawa, T., et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473)。
LongmoreおよびSchachter(Longmore, G.D. and Schachter, H., Carbohydrate Res. 100 (1982) 365-392)は、ブタ肝臓から酵素α1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FuT8)を単離した。FuT8は細胞のグリコシル化経路に位置し、N結合型オリゴ糖の最も内側にあるN-アセチルグルコサミン残基のフコシル化を触媒する。この結合はα1,6-グリコシド結合である。
US 2004/0132140およびUS 2004/0110704では、組換え免疫グロブリンを発現する細胞株内でα1,6-フコシルトランスフェラーゼを阻害するための組換え方法および/または遺伝学的方法が報告されている。
LCA(Lens culinaris agglutinin)は、N結合型オリゴ糖のα1,6-フコシル化トリマンノースコア構造を認識するレクチンである。細胞表面上にフコース構造を提示している細胞はLCAによって認識され、溶解される(Ripka, J. and Stanley, P., Som. Cell Mol. Gen. 12 (1986) 51-62; Mori, K., et al., Biotechnol.Bioeng. 88 (2004) 901-908)。EP 1 705 251では、RNA阻害を用いて抗体組成物を生成するプロセスが報告されている。
本発明は、哺乳動物細胞を選択する方法を含む。この方法は、以下の工程を含む。
(a)哺乳動物宿主細胞を、SEQ ID NO:14、15、または16を含む第1の核酸を含む核酸でトランスフェクトする工程であって、該第1の核酸が、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含有する工程、
(b)トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、レンズマメアグルチニンの存在下で培養する工程、および
(c)工程(b)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択する工程。
1つの態様において、第1の核酸はショートヘアピン核酸(shRNA)に転写される。
本発明の方法による核酸は、1つの態様において、選択マーカーをコードする第2の核酸を含む。他の態様において、核酸は、異種ポリペプチドをコードする第3の核酸を含む。好ましくは、該異種ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートである。1つの態様において、第1の核酸は、SEQ ID NO:14〜SEQ ID NO:16を含む群より選択される核酸を含む。別の態様において、第1の核酸は、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21の核酸である。本発明は、哺乳動物細胞を選択する方法を含む。前記方法は、以下の工程を含む。
(a)哺乳動物宿主細胞を、SEQ ID NO:20または21の第1の核酸を含む核酸でトランスフェクトする工程であって、該第1の核酸が、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含有する工程、
(b)トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、レンズマメアグルチニンの存在下で培養する工程、および
(c)工程(b)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択する工程。
本発明のこの方法による核酸は、1つの態様において、選択マーカーをコードする第2の核酸を含む。他の態様において、核酸は、異種ポリペプチドをコードする第3の核酸を含む。好ましくは、該異種ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートである。
本発明による方法は、さらなる態様において、工程(a)と工程(b)の間に、以下の2つのさらなる工程を含む。
(a1)トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、選択薬剤の存在下で培養する工程、
(a2)工程(a1)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択する工程。
本発明による方法の1つの態様において、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培養は、増加する濃度の選択薬剤、および/または増加する濃度のLCAを用いて行われる。
1つの態様において、哺乳動物細胞は、ハイブリドーマおよびげっ歯類細胞を含む細胞、好ましくは、CHO細胞、BHK細胞、Sp2/0細胞、およびNS0細胞を含む細胞の群より選択される。
pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8の注釈づけしたベクター地図を示す。 pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8_stufferの注釈づけしたベクター地図を示す。 pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8の注釈づけしたベクター地図を示す。 異なるプラスミドから発現され、7日間の培養の後にネオマイシンおよび/またはLCAで選択された、細胞上清中の抗体の濃度を示す。Neo:400μg/mlのネオマイシンによる1週間の選択。LCA:0.05mg/mlのLCAによる2週間の選択、その後に、0.5mg/mlによる1週間の選択。Neo/LCA:400μg/mlのネオマイシンによる2週間の選択、その後に、0.5mg/mlのLCAによる1週間の選択。抗体-ベクター:pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8。抗体-スタッファー(stuffer)-ベクター:pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8_stuffer。X軸: 1:抗体-ベクター、Neo; 2:抗体-ベクター、Neo/LCA; 3:抗体-スタッファー-ベクター、Neo; 4:抗体-スタッファー-ベクター、Neo/LCA; 5:抗体-スタッファー-ベクター、LCA。Y軸:免疫グロブリン濃度(μg/ml)。 (a)抗体を発現するが、pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8でトランスフェクトされていないCHO DG44細胞;(b)抗体を発現し、さらに、pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8で安定にトランスフェクトされ、ネオマイシンで選択されたCHO DG44細胞;(c)抗体を発現し、さらに、pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8で安定にトランスフェクトされ、ネオマイシンで選択され、その後に、レンズマメアグルチニン(LCA)で選択されたCHO DG44細胞の、FACS分析を示す。 図5(a)〜5(c)のオーバーレイを示す。実線 図5(a)、破線 図5(b)、影付きの線 図5(c)。 LCA-クローン9から単離された、フコシル化が異なる抗体の量を示す質量スペクトル。 MS分析から導き出された、抗体のAsn297またはAsn298に結合している糖質構造の模式図(GlcNAc＝N-アセチルグルコサミン、Man＝マンノース、Gal＝ガラクトース、Fuc＝フコース、NeuAc＝N-アセチルノイラミン酸)を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、LCAの存在下で培養することができる哺乳動物細胞を選択する方法を提供する。この方法では、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードするmRNA、好ましくは、α1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするmRNAの哺乳動物細胞内での翻訳が、RNAiによって低下する。
本発明を実施するのに有用な、当業者に公知の方法および技法は、例えば、Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Glover, D.M.., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1995), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press (1986); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Second Edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)に記載されている。
組換えDNA技術を用いると、核酸および/またはポリペプチドの多数の誘導体の作製が可能になる。例えば、このような誘導体は、置換、変化、交換、欠失、または挿入により1つの単独のまたはいくつかの位置で改変されてもよい。改変または誘導体化は、例えば、部位特異的変異誘発によって行うことができる。このような改変は当業者によって容易に行うことができる(例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B. D., and Higgins, S. G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Englandを参照されたい)。
組換え技術を用いると、様々な宿主細胞を異種核酸で形質転換することが可能になる。異なる細胞の、すなわち発現である転写および翻訳の機序は同じ要素を用いるが、異なる種に属する細胞は、例えば、異なる、いわゆるコドン使用頻度を有することがある。これにより、(アミノ酸配列に関して)同一のポリペプチドが異なる核酸によってコードされることがある。また、遺伝暗号の縮重のために、異なる核酸が同じポリペプチドをコードすることがある。
「フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチド」は、触媒として活性のあるポリペプチド、すなわち、フコースの1位とN-アセチルグルコサミンの6位の間でα-グリコシド結合を形成することができる酵素である。好ましくは、N-アセチルグルコサミンそれ自体は、アミノ酸アスパラギン、好ましくは、免疫グロブリン重鎖のアスパラギン-297またはアスパラギン-298の、遊離アミド基(H2N-CO-)の窒素とN-グリコシド結合している(Kabatによる番号付け。例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい)。N-アセチルグルコサミンは、好ましくは、糖鎖の一端に位置し、すなわち、オリゴ糖の末端糖残基である。
本明細書で使用する「核酸」は、ポリヌクレオチド分子、例えば、DNA、RNA、またはその改変を意味する。このポリヌクレオチド分子は、天然のポリヌクレオチド分子、または合成ポリヌクレオチド分子、または1つもしくは複数の天然のポリヌクレオチド分子と1つもしくは複数の合成ポリヌクレオチド分子との組み合わせでもよい。この定義には、例えば、変異誘発、欠失、または付加によって1つまたは複数のヌクレオチドが変化している天然のポリヌクレオチド分子も含まれる。核酸は単離されていてもよく、または別の核酸、例えば、発現プラスミドもしくは宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよい。同様に、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって特徴付けられる。
アミノ酸配列、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換するための手順および方法は当業者に周知である。従って、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって特徴付けられ、同様に、核酸配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列によって特徴付けられる。
「ポリペプチドをコードする核酸の一部」という表現は、部分核酸、すなわち、完全核酸の小部分、好ましくは、mRNAの小部分である核酸を指す。完全核酸は、例えば、構造遺伝子である。完全核酸は、対応する遺伝子の全ての転写されるヌクレオチドを含む。核酸の一部または部分核酸は、5〜55ヌクレオチド、好ましくは、10〜40ヌクレオチド、好ましくは、19〜29ヌクレオチド、より好ましくは、19〜23ヌクレオチドの長さを有する、完全核酸の任意の連続した小部分を含む。
「プラスミド」という表現は、例えば、シャトルおよび発現ベクター/プラスミドならびにトランスフェクションベクター/プラスミドを含む。「プラスミド」および「ベクター」という用語は本出願において同義に用いられる。典型的に、「プラスミド」はまた、細菌におけるベクター/プラスミドの複製のために複製起点(例えば、ColE1またはoriP複製起点)を含み、細菌におけるベクター/プラスミドの選択のために選択マーカー(例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコール選択マーカー)を含む。
「発現カセット」は、宿主細胞において、少なくとも含有される核酸、例えば構造遺伝子の核酸を発現させるための必要な調節エレメント、例えば、プロモーターおよびポリアデニル化部位を含有する構築物を意味する。任意で、例えば、発現したポリペプチドの分泌を可能にする、さらなるエレメントが含まれてもよい。「発現カセット」という用語はまた、例えばshRNAの場合のように、発現カセットに含まれる核酸が転写されるだけで翻訳されない場合にも適用することができる。
「構造遺伝子」は、シグナル配列を有さない、遺伝子のコード領域を指す。
「遺伝子」は、ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な核酸セグメント、例えば、染色体上またはプラスミド上にある核酸セグメントを指す。コード領域に加えて、遺伝子は、プロモーター、イントロン、ターミネーター、および任意で、リーダーペプチドを含む他の機能エレメントを含む。
「選択マーカー」は、選択マーカーを有する細胞が、対応する選択薬剤の存在下で特異的に選択または除外されることを可能にする核酸である。有用なポジティブ選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。この選択マーカーを用いると、選択マーカーで形質転換された宿主細胞を、対応する選択薬剤、例えば、抗生物質の存在下でポジティブ選択することが可能になる。形質転換されていない宿主細胞は、培養における選択条件下で増殖または生存することができない。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性でもよい。ポジティブ選択マーカーはマーカーを有する細胞を選択できるのに対して、ネガティブ選択マーカーはマーカーを有する細胞を選択的に排除することができる。典型的に、選択マーカーは薬物耐性を付与するか、または宿主細胞の代謝欠損もしくは異化欠損を補う。真核細胞と共に用いられる選択マーカーには、例として、例えばハイグロマイシン(hyg)、ネオマイシン(neo)、およびG418選択マーカーなどのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子(APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR)、チミジンキナーゼ遺伝子(tk)、グルタミン合成酵素遺伝子(GS)、アスパラギン合成酵素遺伝子、トリプトファン合成酵素遺伝子(選択薬剤インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(選択薬剤ヒスチジノールD)等、ならびにピューロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Zeocin、およびミコフェノール酸に対する耐性を付与する核酸が含まれる。さらなるマーカー遺伝子は、例えば、WO 92/08796およびWO 94/28143に記載されている。
本明細書で使用する「発現」という用語は、細胞内で生じる、転写および/または翻訳プロセスを意味する。RNAi化合物の場合、「発現」は転写を意味し、異種ポリペプチドをコードする核酸の場合、転写および翻訳を意味する。宿主細胞における望ましい産物の転写レベルは、細胞に存在する対応するmRNAの量に基づいて決定することができる。例えば、関心対象の配列から転写されるmRNAは、PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量することができる(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照されたい)。関心対象の核酸によってコードされるポリペプチドは、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、ポリペプチドの生物学的活性をアッセイすることによって、またはこのような活性とは無関係のアッセイ、例えば、ポリペプチドを認識してこれに結合する免疫グロブリンを用いたウェスタンブロッティングもしくはラジオイムノアッセイを使用することによって定量することができる(Sambrook et al., 1989, 前記を参照されたい)。
「宿主細胞」は、核酸、例えば、異種ポリペプチドをコードする核酸またはshRNAを構成する核酸を導入することができる細胞を意味する。宿主細胞には、ベクター/プラスミドの増殖に用いられる原核細胞、および核酸の発現に用いられる真核細胞の両方が含まれる。好ましくは、真核細胞は哺乳動物細胞である。好ましくは、哺乳動物宿主細胞は、CHO細胞(例えば、CHO K1またはCHO DG44)、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6(登録商標)細胞、およびCOS細胞を含む哺乳動物細胞の群より選択される。好ましくは、哺乳動物細胞は、ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、およびげっ歯類細胞を含む群より選択される。骨髄腫細胞は、ラット骨髄腫細胞(例えば、YB2)およびマウス骨髄腫細胞(例えば、NS0、SP2/0)を含む。1つの態様において、宿主細胞はCHO細胞である。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によってつながったアミノ酸からなる天然または合成の重合体である。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドが「ペプチド」と呼ばれることがあるのに対して、2つもしくはそれ以上のポリペプチドからなる分子、または100を超えるアミノ酸残基からなる1つのポリペプチドを含む分子が「タンパク質」と呼ばれることがある。ポリペプチドはまた、炭水化物基、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分を含んでもよい。非アミノ酸成分は、ポリペプチドが産生される細胞によって付加されてもよく、細胞タイプによって異なってもよい。ポリペプチドは、これらのアミノ酸バックボーン構造によって、本明細書において明確にされる。炭水化物基などの付加は概して明記されないが、それにもかかわらず存在してもよい。
本出願の中で用いられる「アミノ酸」という用語は、カルボキシα-アミノ酸のグループを指す。これらは、直接または前駆体の形で核酸によってコードされてもよく、アラニン(三文字表記:ala、一文字表記:A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(ser、S)、スレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、およびバリン(val、V)を含む。
本明細書で使用する「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる、1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。この定義には、変異型、すなわち、1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を有する型、切断型、融合型、キメラ型、ならびにヒト化型などの変異体が含まれる。認められている免疫グロブリン遺伝子には、例えば、霊長類およびげっ歯類に由来する、異なる定常領域遺伝子および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。免疫グロブリンは、例えば、Fv、Fab、および(Fab)2、ならびに一本鎖(scFv)を含む様々な形式で存在してもよい(例えば、Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426;一般的には、Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984)およびHunkapiller, T., and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16)。モノクローナル免疫グロブリンが好ましい。
免疫グロブリンのポリペプチド重鎖およびポリペプチド軽鎖がそれぞれ、少しでも存在する場合、定常領域(一般的に、カルボキシル末端部分)を含んでもよい。重鎖の定常領域は、免疫グロブリンが、(i)Fc-γ受容体(FcγR)を有する細胞、例えば、食細胞、または(ii)Brambell受容体としても知られる新生児Fc受容体(FcRn)を有する細胞に結合するのを媒介する。重鎖の定常領域はまた、成分(C1q)などの古典的補体系の因子を含む、いくつかの因子に結合するのを媒介する。
免疫グロブリンのポリペプチド重鎖およびポリペプチド軽鎖がそれぞれ、少しでも存在する場合、可変ドメイン(一般的に、アミノ末端部分)を含んでもよい。免疫グロブリンの、軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なる領域、すなわち、4つのフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(CDR)を含んでもよい。
本明細書で使用する「モノクローナル免疫グロブリン」という用語は、実質的に均一な免疫グロブリンの集団から得られた免疫グロブリンを意味する。すなわち、集団を構成する個々の免疫グロブリンは、微量に存在し得る、天然に存在しうる変異以外は同一である。モノクローナル免疫グロブリンは高度に特異的であり、1つの抗原部位に対して作られている。さらに、異なる抗原部位(決定基またはエピトープ)に対して作られた異なる免疫グロブリンを含むポリクローナル免疫グロブリン調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル免疫グロブリンは抗原上の1つの抗原部位に対して作られている。モノクローナル免疫グロブリンはその特異性に加えて、他の免疫グロブリンに汚染されずに合成できる点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、免疫グロブリンが実質的に均一な免疫グロブリン集団から得られているという特徴を示しており、任意の特定の方法による免疫グロブリンの作製が必要であると解釈すべきでない。
「ヒト化」型の非ヒト(例えば、げっ歯類)免疫グロブリンは、非ヒト免疫グロブリンに由来する部分配列およびヒト免疫グロブリンに由来する部分配列を含有するキメラ免疫グロブリンである。ほとんどの部分についてヒト化免疫グロブリンはヒト免疫グロブリン(レシピエント免疫グロブリン)に由来し、超可変領域に由来する残基は、望ましい特異性および親和性を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー免疫グロブリン)の超可変領域に由来する残基で置換されている(例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natal. Acad. Sci.USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238; US 5,204,244を参照されたい)。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化免疫グロブリンは、さらなる改変、例えば、レシピエント免疫グロブリンまたはドナー免疫グロブリンでは見出されないアミノ酸残基を含んでもよい。このような改変は、対応する親配列と類似しているが同一でない、このようなレシピエント免疫グロブリンの変異体またはドナー免疫グロブリンの変異体をもたらす。これらの改変は、免疫グロブリンの性能をさらに改善するために行われる。
一般的に、ヒト化免疫グロブリンは、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。可変ドメインにおいて、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒトドナー免疫グロブリンのものに相当し、かつ、FRの全てまたは実質的に全てがヒトレシピエント免疫グロブリンのものである。任意で、ヒト化免疫グロブリンはまた、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部を含む。
非ヒト免疫グロブリンをヒト化する方法は当技術分野において述べられている。好ましくは、ヒト化免疫グロブリンには、非ヒトの供給源から1つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「インポート(import)」残基と呼ばれ、典型的には、「インポート」残基は「インポート」可変ドメインから選ばれる。ヒト化は、基本的に、Winterおよび共同研究者(Jones, P.T., et al., Nature 321 (1986) 522-525; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Verhoeyen, M., et al., Science 239 (1988) 1534-1536; Presta, L.G., Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992) 593-596)の方法に従って、ヒト免疫グロブリンの対応する配列について超可変領域配列を置換することによって行うことができる。従って、このような「ヒト化」免疫グロブリンはキメラ免疫グロブリンであり(例えば、US 4,816,567を参照されたい)、ここでは、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に小さな配列が非ヒト種に由来する対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化免疫グロブリンは、典型的に、一部の超可変領域残基、場合によっては一部のフレームワーク領域残基がげっ歯類または非ヒト霊長類の免疫グロブリンの類似部位に由来する残基で置換されたヒト免疫グロブリンである。
組換えによる免疫グロブリンの作製は最先端技術分野において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160;およびWerner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説論文において報告されている。
好ましくは、本発明による方法における第3の核酸は異種ポリペプチドをコードする。好ましくは、異種ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートより選択される。好ましくは、該免疫グロブリン、該免疫グロブリン断片、または該免疫グロブリンコンジュゲートは、モノクローナル免疫グロブリン、モノクローナル免疫グロブリン断片、またはモノクローナル免疫グロブリンコンジュゲートである。
本明細書で使用する「免疫グロブリン断片」という用語は免疫グロブリンの一部を指す。免疫グロブリン断片は、Fv、Fab、(Fab)2、一本鎖(scFv)、ならびに一本鎖重鎖および一本鎖軽鎖、ならびにフレームワーク領域1、フレームワーク領域2、フレームワーク領域3、フレームワーク領域4、超可変領域1、超可変領域2、超可変領域3、軽鎖および重鎖のそれぞれ、Fab領域、ヒンジ領域、可変領域、重鎖定常ドメイン1、重鎖定常ドメイン2、重鎖定常ドメイン3、重鎖定常ドメイン4、および軽鎖定常ドメインを含む群より選択された少なくとも1つの領域および/またはドメインが欠失している免疫グロブリンを含む。
本明細書で使用する「免疫グロブリンコンジュゲート」という用語は、免疫グロブリンおよびポリペプチドの融合を指す。「免疫グロブリンコンジュゲート」という用語は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片と、1〜8つのポリペプチド、好ましくは、2〜4つのポリペプチドとの融合タンパク質を含み、それによってそれぞれのポリペプチドは、介在するリンカーポリペプチドを伴って、または介在するリンカーポリペプチドを伴わずに、異なるN末端またはC末端アミノ酸とアミド結合によって融合している。免疫グロブリンコンジュゲートが複数の非免疫グロブリンポリペプチドを含む場合、コンジュゲートした非免疫グロブリンポリペプチドのそれぞれは、同じまたは異なるアミノ酸配列および/または長さを有し得る。
本明細書で使用する「細胞」という表現は、対象細胞およびその子孫を含む。従って、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、トランスファーの回数に関係なく、初代対象細胞およびそれから得られる培養物を含む。全ての子孫は、故意または偶然の変異のためにDNA内容が正確に同一でなくてもよいことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。
本発明は概して、いわゆる二本鎖RNAヌクレアーゼDicerおよびRISC複合体を発現する全ての生細胞において適用可能であり、言い換えると、RNAを介した遺伝子サイレンシングを観察することができる全ての細胞において適用可能である。従って、本発明は、主に哺乳動物細胞に適用されるが、全てのタイプの真核細胞にも適用することができる。しかしながら、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、例えば、CHO K1(Jones, C., et al., Cytogenet. Cell Genet. 16 (1976) 387-390)、またはCHO DG44(Urlaub, G, et al., Cell 33 (1983) 405-412; Urlaub, G., et al., Somat Cell Mol Genet. 12 (1986) 555-566)、ヒト胎児腎臓細胞、例えば、HEK 239細胞(Graham, F.L., et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59-74)、またはHEK 239 EBNA細胞、ハイブリドーマ細胞、例えば、NS0細胞(Barnes L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270)、またはSP2/0細胞(Shulman, M., et al., Nature 276 (1978) 269-270)、またはベビーハムスター腎臓細胞、例えば、BHK21細胞などの細胞が好ましい。
「ポリペプチドの翻訳の低下」という用語は、RNAi化合物によって媒介された、ポリペプチドをコードする特定の標的mRNAの分解を指す。RNAi化合物それ自体は、該RNAi化合物転写用の適切な発現カセットでトランスフェクトされた後に合成されるか、またはRNAi化合物前駆体でトランスフェクトされた後に合成され、この前駆体は、その後、内因性細胞ヌクレアーゼにより活性RNAi化合物にプロセシングされる。
インビトロ研究のために、2つの主な、遺伝子RNAiサイレンシング戦略:低分子干渉RNA(siRNA)およびスモールヘアピンRNA(shRNA)(Tuschl, T., Nat. Biotechnol. 20 (2002) 446-448)が生まれている。
本発明による方法の核酸は第1の核酸を含み、この第1の核酸は、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含む。好ましくは、該第1の核酸は、SEQ ID NO:14、15、または16を含む。より好ましくは、第1の核酸は、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21の核酸である。好ましくは、アスパラギン結合N-アセチルグルコサミンは多糖のアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンである。好ましくは、該第1の核酸はRNAi化合物に転写され、より好ましくは、shRNAに転写される。
本発明によるRNAi化合物は、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドまたはタンパク質をコードするmRNAに対する核酸である。好ましくは、ポリペプチドは、α1,6-フコシルトランスフェラーゼである。細胞がRNAi化合物によってトランスフェクトされると、低レベルの該mRNA、従って、低レベルの対応するポリペプチドを有し、同時に低レベルの対応する酵素活性を有する細胞が得られる。mRNAレベルは、対応する野生型細胞のレベルの5％〜20％、好ましくは、5％〜15％、より好ましくは、5％〜10％である。野生型細胞は、RNAi化合物の核酸を導入/トランスフェクションする前の細胞である。
発現カセットから得られる、RNAi化合物を構成する転写物は、CMVプロモーターなどのPol IIプロモーターから転写されてもよく、またはH1、U6、もしくは7SKプロモーターのようなPol IIIプロモーターから転写されてもよい(Zhou, H.,et al., Nucleic Acids Res. 33 (2005) e62; Brummelkamp, T.R.およびBernards, R., Nat. Rev. Cancer 3 (2003) 781-789; Czauderna, F., et al., Nucleic Acids Res. 31 (2003) e127)。Pol IIIを介した転写の場合、前駆体RNA産物が適切に3'プロセシングされるために、転写されたRNAの3'末端にPol IIIターミネーター配列TTTT、好ましくは、TTTTTTを有することが不可欠である(Dykxhoorn, D., et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 (2003) 457-467)。
本発明によるRNAi化合物は、好ましくは、ヘアピンコンホメーションを有するRNA、すなわち、shRNAである。活性のあるRNAi化合物として、このような分子はその5'末端がGヌクレオチドから始まってもよい。これは、H1およびU6プロモーターからの転写が通常Gから始まるという事実による。分子のステムは逆方向反復配列に起因する。これらはそれぞれ、19〜29ヌクレオチド長、好ましくは19〜23ヌクレオチド長である。好ましくは、これらの逆方向反復配列は互いに完全に相補的であり、いかなる内部ミスマッチも無く二本鎖ハイブリッドを形成することができる。逆方向反復配列の1つは、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部である。「アスパラギン結合N-アセチルグルコサミン」という用語は、N-アセチルグルコサミンの1位がアスパラギンアミノ酸のγカルボキシルアミド基の窒素にNグリコシド結合しているN-アセチルグルコサミンを指し、これにより該アスパラギンアミノ酸はポリペプチドまたはタンパク質に含有される。
分子の内部ループは、4〜40ヌクレオチド、好ましくは、4〜9ヌクレオチドの一本鎖である。このループのために、分子自体が、shRNA分子として作用できない別の二次構造に折り畳まれるのを防ぐためにいかなる逆方向反復配列も避けることが重要である。
shRNAの3'末端には、オーバーハングがあってもよい。Pol IIIプロモーターを使用する場合、オーバーハングは、Pol IIIプロモーターのターミネーターシグナルのために2〜4個のU残基でもよい。これらのヘアピン構築物は細胞内で発現されると、遺伝子サイレンシングを媒介することができる、活性のある二本鎖分子に迅速にプロセシングされる(Dykxhoorn, D., et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 (2003) 457-467)。
様々な生物から、α1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する様々なタンパク質およびこれらをコードする遺伝子が特定されている。
（表１）様々な生物に由来するα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質およびコード遺伝子
Figure 2010512765
本発明によるRNAi化合物の逆方向反復配列(＝ステム)は、表1のタンパク質に対応する遺伝子によってコードされる翻訳される核酸の任意の小部分を含み得る。1つの態様において、ポリペプチドをコードする核酸の一部は、SEQ ID NO:01〜SEQ ID NO:11のアミノ酸配列に対応する核酸配列ならびに核酸配列SEQ ID NO:12および13を含む核酸の群より選択される核酸の一部である。
第1の核酸は、1つの態様において、以下の配列:
Figure 2010512765
を含む核酸の群より選択される核酸を核酸部分として含む。すなわち、第1の核酸は、SEQ ID NO:14、またはSEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16のいずれかを含む。
SEQ ID NO:14〜16の核酸はshRNAのステムと表される。今や驚くべきことに、SEQ ID NO:14、15、または16の核酸を含む第1の核酸を用いると、第1の核酸を含む細胞において、α1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の酵素活性が低下し、同時に、このような細胞において発現される異種ポリペプチドのフコシル化が90％またはそれ以上低下することが見出されている。1つの態様において、第1の核酸は、好ましくは、SEQ ID NO:14および15を含む核酸の群より選択される核酸を含む。別の態様において、第1の核酸は、SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:16の核酸配列を含む。
第1の核酸は、長さが9残基のさらなる核酸を含んでもよい。好ましくは、該さらなる核酸はSEQ ID NO:17の配列を有する。
TTCAAGAGA (SEQ ID NO:17)
SEQ ID NO:17の核酸はshRNAのループと表される。従って、1つの態様において、第1の核酸は、5'→3'方向に、SEQ ID NO:14、15、または16の核酸、およびSEQ ID NO:17の核酸を含む。好ましい態様において、第1の核酸は、5'→3'方向に、SEQ ID NO:14、15、または16の核酸、そのすぐ後にSEQ ID NO:17の核酸、そのすぐ後にSEQ ID NO:14、15、または16の完全配列に相補的な核酸を含む。本出願の中で用いられる「そのすぐ後に」という用語は、2つの核酸分子が互いに融合している、すなわち、第1の核酸の最後の3'末端ヌクレオチドが第2の核酸の最初の5'末端ヌクレオチドと直接かつ共有結合によって連結していることを指す。相補的な配列は、SEQ ID NO:17の核酸のすぐ前にある核酸の配列に相補的になるように選択される。
プラスミドに由来するshRNAが本発明において用いられる。本発明による細胞形質転換体は、当業者に公知の実質的に任意の種類のトランスフェクション法を用いて得ることができる。例えば、プラスミドDNAは、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによって細胞に導入されてもよい。または、FuGENE6(Roche Diagnostics GmbH)、X-tremeGENE(Roche Diagnostics GmbH)、ヌクレオフェクション(nucleofection)(AMAXA GmbH、Germany)、およびLipofectamine(商標)(Invitrogen Corp.)などのリポフェクション試薬が用いられてもよい。または、shRNA化合物を構成する発現カセットを含むベクターDNAが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに基づく適切なウイルスベクター系によって細胞に導入されてもよい(Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (2004) 5313-5314)。好ましくは、エレクトロポレーションおよびリポフェクションが用いられる。
「異種DNA」または「異種ポリペプチド」は、所与の宿主細胞中に天然には存在しない、DNA分子もしくはポリペプチド、またはDNA分子の集団、またはポリペプチドの集団を意味する。ある特定の宿主細胞に対して異種のDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA(すなわち外来DNA)と組み合わされている限り、宿主細胞種に由来するDNA(すなわち内在性DNA)を含有してもよい。例えば、プロモーターを含む宿主DNAセグメントに機能的に連結されたポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含有するDNA分子は、異種DNA分子とみなされる。逆に、異種DNA分子は、外来性プロモーターと機能的に連結された内在性構造遺伝子を含んでもよい。非宿主DNA分子によってコードされるポリペプチドは「異種」ポリペプチドである。「機能的に連結された」は2つまたはそれ以上の成分が近位にあることを意味し、ここで、このように述べられる成分は、意図された様式で機能する関係にある。例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーは、連結された配列の転写を制御または調節するようにシスで作用する場合、コード配列に機能的に連結されている。一般的なものであり、必ずしもそうとは限らないが、「機能的に連結された」DNA配列は連続しており、2つのタンパク質コード領域、例えば、分泌リーダー/シグナル配列およびポリペプチドをつなげるのに必要な場合、連続しかつ読み枠の中にある。転写がコード配列からポリアデニル化配列に進むように、ポリアデニル化部位がコード配列の下流末端に配置されている場合、ポリアデニル化部位はコード配列に機能的に連結されている。連結は、当技術分野において公知の組換え法によって、例えば、PCR法を用いて、および/または便利な制限部位での連結によって達成される。便利な制限部位が存在しない場合、慣行に合わせて合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが用いられる。
「生存可能な」という表現は、細胞がレンズマメアグルチニン(LCA)および/または選択薬剤の存在下で培養された場合に増えることができる、すなわち増殖および生存することができる細胞を指す。好ましくは、細胞はLCAの存在下で培養される。LCAは、0.001mg/ml〜10mg/ml、好ましくは、0.005mg/ml〜5mg/ml、好ましくは、0.01mg/ml〜1mg/ml、好ましくは、0.015mg/ml〜0.5mg/ml、好ましくは、0.02mg/ml〜0.4mg/mlの濃度で培地に添加することができる。LCAの濃度は、少なくとも、本発明による核酸でトランスフェクトされていない哺乳動物細胞が生存できない濃度であるべきである。LCAの濃度は、好ましくは、培養中に一定である。また、好ましくは、LCAの濃度は培養中に増加する。この増加は直線的でもよく、または段階的でもよい。
本発明は、哺乳動物細胞を選択する方法を含む。前記方法は、以下の工程を含む。
(a)哺乳動物細胞を、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含む第1の核酸を含む核酸でトランスフェクトする工程、
(b)トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、レンズマメアグルチニン(LCA)の存在下で培養する工程、および
(c)工程(b)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択する工程。
1つの態様において、哺乳動物細胞は、第1の核酸を含む核酸でトランスフェクトされ、この第1の核酸は、ショートヘアピン核酸(shRNA)に転写され、これは、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含む。別の態様において、哺乳動物細胞は、第1の核酸を含む核酸でトランスフェクトされ、この第1の核酸は、ショートヘアピン核酸(shRNA)に転写され、これは、(i)フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部と、(ii)(i)の核酸と同じ長さでありかつ(i)の完全核酸に相補的な核酸とを含む。
別の態様において、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドは、α1,6-フコシルトランスフェラーゼである。
1つの態様において、第1の核酸は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする完全核酸の部分核酸を含み、完全核酸は、SEQ ID NO:01〜11のアミノ酸配列に対応する核酸配列ならびにSEQ ID NO:12および13の核酸配列を含む核酸の群より選択される。別の態様において、第1の核酸は、SEQ ID NO:14〜16の核酸配列を含む核酸の群より選択される核酸を含む。
1つの態様において、核酸は、選択マーカーをコードする第2の核酸を含む。別の態様において、核酸は、異種ポリペプチドをコードする第3の核酸を含む。
本発明は、異種ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を選択する方法をさらに含む。ここで、前記方法は、以下の工程を含む。
(a)哺乳動物細胞を、
(i)ショートヘアピン核酸(shRNA)に転写され、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含む、第1の核酸、
(ii)選択マーカーをコードする、第2の核酸、
(iii)異種ポリペプチドをコードする、第3の核酸
を含む核酸でトランスフェクトする工程、
(b)トランスフェクトされた哺乳動物細胞をレンズマメアグルチニン(LCA)の存在下で培養する工程、および
(c)工程(b)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択し、それによって、異種ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を選択する工程。
好ましくは、前記方法は、工程(a)の後および工程(b)の前に、以下の2つのさらなる工程(a1)および(a2)、
(a1)前記トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を、選択薬剤の存在下で培養する工程、
(a2)工程(a1)の条件下で生存可能なトランスフェクトされた哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、工程(a2)において選択されたトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、工程(b)においてLCAの存在下でさらに培養される。工程(a1)において用いられる選択薬剤は、第2の核酸によってコードされる選択マーカーに対応する。
トランスフェクトされた細胞の培養は、LCAおよび/または選択薬剤の非存在下で、トランスフェクトされた細胞の増殖に適した条件下で行われる。従って、これらの条件は、LCAまたは選択薬剤の非存在下、すなわち、培地に選択薬剤もLCAも添加されることなく細胞を培養することによって決定される。これらの条件は、当業者に既知でなければ、当業者によって容易に決定することができる。
好ましくは、前記の第1の核酸は発現カセットの中に含まれる。好ましくは、前記の第2の核酸は発現カセットの中に含まれる。好ましくは、前記の第3の核酸は発現カセットの中に含まれる。
さらに、本発明は、
(a)ショートヘアピン核酸(shRNA)に転写され、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含む、第1の核酸、
(b)選択マーカーをコードする、第2の核酸、
(c)異種ポリペプチドをコードする、第3の核酸
を含む核酸を含む。
1つの態様において、ショートヘアピン核酸に転写される第1の核酸は、SEQ ID NO:14、15、16の核酸の群より選択される核酸を含む。好ましくは、第1の核酸は、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21の核酸である。さらなる態様において、異種ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、免疫グロブリンコンジュゲートを含む異種ポリペプチドの群より選択される。別の態様において、第1の核酸は、SEQ ID NO:14、15、または16の完全核酸に相補的なさらなる核酸を含む。この態様において、相補的な核酸は、第1の核酸に含まれるSEQ ID NO:14、15、または16の核酸とミスマッチすることなく結合する。この態様において、相補的な核酸は、相補する核酸と同じ長さを有する。
本発明の方法によるLCAの存在下での培養は様々な方法で行うことができる。1つの態様において、細胞は、トランスフェクションの後、予め決められた細胞密度が得られるまでLCAの非存在下で培養され、その後に、その細胞は、LCAの存在下で培養される。1つの態様において、細胞は、トランスフェクションの後、細胞密度が予め決められた率だけ増加するまでLCAの非存在下で培養され、その後に、その細胞は、LCAの存在下で培養される。好ましくは、細胞密度は、培養開始時の細胞密度の2倍、5倍、または10倍まで増加している。他の態様において、トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクションの後、およびLCAの存在下での培養の前に、トランスフェクトされた核酸が第2の核酸として選択マーカーも含むのであればLCAと異なる選択薬剤、例えば、抗生物質の存在下で培養される。好ましくは、該選択マーカーはネオマイシン選択マーカーである。ネオマイシンは、50μg/ml〜1000μg/ml、好ましくは、100μg/ml〜800μg/ml、好ましくは、200μg/ml〜600μg/mlの濃度で培地に添加される。1つの態様において、細胞は、一定の時間、すなわち、3〜28日間、4〜21日間、好ましくは、7〜14日間、ネオマイシンの存在下で培養され、その後、一定の時間、すなわち、3〜28日間、4〜21日間、好ましくは、7〜14日間、LCAの存在下で培養される。
第1の核酸の発現は、好ましくは、Pol IIIプロモーター、好ましくは、U6プロモーターによって媒介される。
1つの態様において、哺乳動物細胞は、異種ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸でトランスフェクトされる。従って、本発明は、異種ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を選択する方法をさらに含む。ここで、発現された異種ポリペプチドは、フコース修飾の程度が低下しており、前記方法は、以下の工程を含む。
(a)哺乳動物細胞を、
(i)ショートヘアピン核酸(shRNA)に転写され、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含む、核酸、
(ii)異種ポリペプチドをコードする核酸
を含む核酸でトランスフェクトする工程、
(b)トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、レンズマメアグルチニン(LCA)の存在下で培養する工程、および
(c)工程(b)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択する工程。
好ましくは、異種ポリペプチドは、免疫グロブリン、または免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートである。また、好ましくは、前記核酸は、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21の核酸である。
「フコース修飾の程度が低下している異種ポリペプチド」という用語およびその文法上の同義語は、本発明の第1および第3の核酸を含む核酸でトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞において発現された異種ポリペプチドであって、その、アスパラギン結合N-アセチルグルコサミンの6位でのフコシル化が、本発明の第3の核酸を含む核酸でトランスフェクトされているが、本発明の第1の核酸ではトランスフェクトされていない哺乳動物宿主細胞において発現されたポリペプチドと比較して低下している、異種ポリペプチドを指す。好ましくは、非フコシル化異種ポリペプチドとフコシル化異種ポリペプチドの比は0.15またはそれ以下、例えば、0.12である。
好ましい態様において、トランスフェクトされた細胞の培養は異なる濃度のLCAの存在下で行われる。LCAは、0.001mg/ml〜10mg/ml、好ましくは、0.005mg/ml〜5mg/ml、好ましくは、0.01mg/ml〜1mg/ml、好ましくは、0.015mg/ml〜0.5mg/ml、好ましくは、0.02mg/ml〜0.4mg/mlの濃度で培地に添加される。1つの態様において、培養は一定濃度のLCAを用いて行われる。さらなる態様において、培養は、最初、一定の時間、0.001mg/ml〜0.1mg/mlの低濃度のLCAを用いて行われる。後で、濃度は、一定の時間、0.2mg/ml〜0.5mg/mlの最終濃度まで上げられる。
選択薬剤の濃度の増加は、段階的な増加、連続的な増加、または段階的な増加および連続的な増加の組み合わせによって達成することができる。段階的な増加が行われる場合、濃度は、多段階、例えば、5〜10段階、または数段階、例えば、1〜3段階で最終濃度まで上げることができる。連続的な増加の場合、濃度は、直線的、指数的、または漸近的に最終濃度まで上げてもよい。
1つの態様において、第1の核酸は、SEQ ID NO:20および21の核酸の群より選択され、すなわち、SEQ ID NO:20の核酸配列またはSEQ ID NO:21の核酸配列のいずれかを有する。
組換え発現された細胞表面マーカーによる選択もまた、単独で、または本発明の方法と組み合わせて、トランスフェクタントの単離に使用することができる。発現産物が細胞表面上にある任意の種類の遺伝子を、高レベルのshRNA化合物を発現するトランスフェクタントの濃縮および選択用のマーカーとして使用することができる。切断型低親和性神経成長因子受容体であり、従って、シグナル伝達について不活性なl-NGFRは細胞表面上に発現し、細胞生物学的分析に極めて有用なマーカーであることが分かっている(Philipps, K., et al., Nat. Med. 2 (1996) 1154-1156およびMachl, A.W., et al., Cytometry 29 (1997) 371-374)。
本発明の方法において用いられる哺乳動物細胞は、好ましくは、ハイブリドーマ細胞およびげっ歯類細胞を含む群より選択される。また、好ましくは、げっ歯類細胞は、ハムスター細胞、マウス細胞、およびラット細胞からなる群より選択される。
以下の実施例、配列表、および図面は本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順に変更が加えられることが理解される。
実施例
実施例1 pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8のベクタークローニング
実施例2 pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8_stufferのベクタークローニング
実施例3 pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8のベクタークローニング
実施例4 FuT8発現が低下したCHO DG44シングルクローンの選択および単離
実施例5 2個のベクター:pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8および抗体発現ベクターを含有するCHO DG44シングルクローンの選択および単離
実施例6 1個のベクターpSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8またはpSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8_stufferを含有するCHO DG44シングルクローンの選択および単離
実施例7 一選択方法
実施例8 FuT8-shRNAおよび抗体を発現するCHO細胞の培養上清からの抗体の精製
実施例9 実施例6で得られた細胞のFACS分析
実施例10 RNA単離およびcDNA合成および定量RT-PCR
実施例11 サイレンシング効果の安定性および免疫グロブリン発現の安定性
実施例12 抗体糖鎖構造の質量分析
実施例1
pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8のベクタークローニング
pSilencer2.1_U6neoベクター(Ambion Inc.、カタログ番号5764)の位置184に、XhoI部位を部位特異的変異誘発によって導入した。AscI部位およびFseI部位を含有するポリリンカーを作製するために、以下のオリゴヌクレオチドをアニールし、XhoI/HindIII制限部位の間に連結した。

Polylinker_top
Figure 2010512765
Polylinker_bot
Figure 2010512765
その後に、例として、ヒトインシュリン様成長因子受容体1に結合する免疫グロブリンをコードする、ゲノム的に構成された発現カセットを、AscI/FseI制限部位の間にクローニングした(配列については、例えば、WO 2005/005635を参照されたい)。FuT8 shRNAを作製するために、以下のオリゴヌクレオチドをアニールした。

F8shRNA4top
Figure 2010512765
F8shRNA4bot
Figure 2010512765
アニールしたFuT8 shRNAを、対応するベクター断片(BamHI/HindIII消化)に連結した。完成したベクターを、pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8と呼んだ。注釈づけしたベクター地図を図1に示した。
実施例2
pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8_stufferのベクタークローニング
pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8中のネオマイシン耐性遺伝子の発現カセットおよび抗体をコードする発現カセットは異なる方向に配向させた。スタッファー配列を、XhoI制限部位を介して、これらの発現カセットのプロモーター間に導入した。ベクターpSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8_stufferの注釈づけしたベクター地図を図2に示した。
実施例3
pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8のベクタークローニング
pSilencer2.1_U6neoベクター(Ambion Inc.、カタログ番号5764)の位置184に、XhoI部位を部位特異的変異誘発によって導入した。その後に、l-NGFR(低親和性神経成長因子;例えば、Philipps, K., et al., Nat. Med. 2 (1996) 1154-1156およびMachl, A.W., et al., Cytometry 29 (1997) 371-374を参照されたい)発現カセットをXhoI/HindIII制限部位の間にクローニングした。FuT8 shRNAを作製するために、以下のオリゴヌクレオチドをアニールした。

F8shRNA4top
Figure 2010512765
F8shRNA4bot
Figure 2010512765
アニールしたFuT8 shRNAを、対応するベクター断片(BamHI/HindIII消化)に連結した。ベクターを、pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8と示した。注釈づけしたベクター地図を図3に示した。
実施例4
FuT8発現が低下したCHO DG44シングルクローンの選択および単離
FuGENE試薬(Roche Applied Science、Germany)を使用し、製造業者のマニュアルに従って、CHO DG44細胞をベクターpSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8でトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞を、1％(v/v)の200mMのL-グルタミン(Gibco)、10％の透析ガンマ線照射胎仔ウシ血清(カタログ番号1060-017; Gibco(登録商標)、Invitrogen GmbH、Germany)、および10mlのHT-Supplement(カタログ番号41065-012; Gibco(登録商標)、Invitrogen GmbH、Germany)を添加したMEM Alpha Minus Medium(カタログ番号32561; Gibco(登録商標)、Invitrogen GmbH、Germany)中で培養した。トランスフェクトされた細胞を、400μg/mlのネオマイシンを用いて2週間選択した。その後に、ネオマイシン耐性プールを、0.5mg/mlのLCA(レンズマメアグルチニン)を用いてさらに1週間選択した。シングルクローンを限界希釈によって回収した。
ネオマイシンでのみ選択されたpSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8発現細胞におけるl-NGFRの状態と、ネオマイシンおよびLCAで選択された細胞におけるl-NGFRの状態との比較から、これは組換え細胞の選択に非常に有効な薬剤であることが分かった。
実施例5
2個のベクター:pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8および抗体発現ベクターを含有するCHO DG44プールの選択および単離
CHO DG44細胞を、抗体発現ベクターで安定にトランスフェクトした。より正確には、最初に、マウスDHFR遺伝子(Noe, V., et al., Eur. J. Biochem. 268 (2001) 3163-3173)およびゲノム的に構成された抗体核酸をコードするベクターを用いたDHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)による選択を使用して、抗体を産生するCHO DG44クローンを作製した(例えば、WO 2005/005635を参照されたい)。シングルクローンを限界希釈によって回収した。
次いで、抗体を産生するCHO DG44クローンを、FuGENE試薬(Roche Diagnostics GmbH、Germany)を使用し、製造業者のマニュアルに従って、ベクターpSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8でトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞を、1％(v/v)の200mMのL-グルタミン(Gibco)および10％の透析ガンマ線照射胎仔ウシ血清(カタログ番号1060-017; Gibco)を添加したMEM Alpha Medium(カタログ番号22561-021; Gibco(登録商標)、Invitrogen GmbH、Germany)中で培養した。トランスフェクトされた細胞を、400μg/mlのネオマイシンを用いて2週間選択した。その後に、ネオマイシン耐性プールを、0.5mg/mlのLCA(レンズマメアグルチニン)を用いてさらに1週間選択した。
実施例6
1個のベクターpSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8またはpSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8_stufferを含有するCHO DG44プールの選択および単離
FuGENE試薬(Roche Diagnostics GmbH、Germany)を使用し、製造業者のマニュアルに従って、CHO DG44細胞を、ベクターpSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8またはpSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8_stufferでトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞を、1％(v/v)の200mMのL-グルタミン(Gibco)、10％の透析ガンマ線照射胎仔ウシ血清(カタログ番号1060-017; Gibco(登録商標)、Invitrogen GmbH、Germany)、および10mlのHT-Supplement(カタログ番号41065-012; Gibco)を添加したMEM Alpha Minus Medium(カタログ番号32561; Gibco(登録商標)、Invitrogen GmbH、Germany)中で培養した。トランスフェクトされた細胞を、400μg/mlのネオマイシンを用いて2週間選択した。その後に、ネオマイシン耐性細胞を、0.5mg/mlのLCA(レンズマメアグルチニン)を用いてさらに1週間選択した。
ネオマイシンでのみ選択されたpSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8発現細胞における抗体価と、ネオマイシンおよびLCAで選択された細胞における抗体価との比較から、LCAとshRNAFuT8発現ベクターの組み合わせは組換えタンパク質発現細胞の選択に非常に有効な薬剤であることが確かめられた。
実施例7
選択方法
CHO DG44細胞を抗体発現プラスミドで安定にトランスフェクトし、次いで、抗体を産生するCHO DG44クローンを、実施例4に記載のようにベクターpSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8でトランスフェクトした。
トランスフェクトされた細胞を、0.05mg/mlの低濃度LCA(レンズマメアグルチニン)の存在下で2週間増殖させた。その後に、低濃度LCAに耐性のプールを、0.5mg/mlのLCAでさらに1週間増殖させた。
任意で、LCA選択の前に、400μg/mlのネオマイシンの存在下で2週間の増殖を行ってもよい。
実施例8
FuT8-shRNAおよび抗体を発現するCHO細胞の培養上清からの抗体の精製、ならびに免疫グロブリン濃度の測定
FuT8のshRNAも発現するCHO細胞によって産生された抗体(濃度約5〜20μg/ml)を含有する培養上清約5〜10mlを、プロテインA-Sepharose(商標)CL-4B(30mg/100μl;Amersham Pharmacia Biotech AB)の懸濁液約100μlと4℃で一晩、バイアルを反転させながらインキュベートした。その後に、免疫グロブリンが結合しているプロテインA-Sepharose(商標)を沈殿させるために、試料をEppendorf遠心機5810Rで15分間、約400xgで遠心分離した。培養上清を完全に取り除き、ペレットを3回、それぞれ約50μlの二重に蒸留した水で洗浄した。その後に、溶液を完全に取り除いた。100mMのクエン酸緩衝液、pH2.8、約30〜50μlをペレットに添加し、これをその後、プロテインAに結合している抗体タンパク質を遊離させるために、振盪しながら室温で15分間インキュベートした。インキュベーションの後、懸濁液をEppendorf遠心機で5分間14,000rpmで遠心分離し、結果として生じた上清を第二のバイアルに集めた(注:上清は、遊離した免疫グロブリンを含有する)。100mMのクエン酸緩衝液、pH2.8、30〜50μlを添加し、室温で約15分間振盪し、5分間14,000rpmの遠心分離によってプロテインA-Sepharose(商標)を遠心沈殿することによって、プロテインAペレットをもう1回洗浄した。上清を注意深く取り出し、最初の遊離工程の各溶液と組み合わせた。プロテインA-Sepharose(商標)ペレットは廃棄した。
免疫グロブリンを含有するクエン酸緩衝液を、免疫グロブリン濃度の測定のためにさらに用いた。細胞培養上清中の抗体濃度は、HiTrap(商標)rProtein Aff(GE healthcare、注文番号17-5079-01)によるアフィニティクロマトグラフィーによって測定した。細胞培養上清250マイクロリットルを、緩衝液A(50mmol/lのK2HPO4、300mmol/lのNaCl、pH7.4)で平衡化した1mlカラムにロードした。6カラム体積の緩衝液Aで洗浄し、その後に、6カラム体積の緩衝液B(100mmol/lの酢酸ナトリウム、pH5.0)で洗浄することによって、結合しなかった物質を溶出した。結合した抗体を、6カラム体積の緩衝液C(500mmol/lの酢酸ナトリウム、pH2.5)で溶出した。マトリックスから溶出したタンパク質を、UV吸光度および蛍光分光法によって定量した。カラムは3ml/分で操作した。
図4では、実施例6および実施例7に従って得られた5種類のクローンが培養上清中の抗体の産生について分析されている。7日間の培養時間の後に、培養上清中に2.7μg/ml〜3.2μg/mlの免疫グロブリン濃度が得られた。
実施例9
実施例5において得られた細胞のFACS分析
実施例5に記載の細胞を6ウェルプレートに播種し、実施例5に従う培地中でコンフルエンスになるまで増殖させた。上清を集め、FACSチューブに入れて対応するトリプシン処理細胞と組み合わせた。遠心分離(10分間、1,500rpm)の後、上清を取り除いて破棄した。細胞ペレットを、30μg/mlのモノクローナルマウス抗l-NGFR-抗体溶液(Boehringer Mannheim、Germany)に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。氷冷培地1.5mlを用いた洗浄工程後、細胞を10分間1,500rpmで遠心分離した。上清を取り除いて破棄した。ペレットを、20μg/mlのヤギ(Fab')2抗マウス-IgG-(H+L)-PE-抗体溶液(Calltag Laboratories; M350004-3)に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。氷冷培地1.5mlを用いた洗浄工程後、細胞を10分間遠心分離した(1,500rpm)。上清を取り除いて破棄した。ペレットを培地1mlに再懸濁し、その後に、BD-LSRを用いたFACS分析に使用した。結果を図5および6に示した(ソフトウェアCell Quest Proを用いてデザインした)。
図5にFACS分析の結果を示した。グラフのX軸には蛍光強度を示したのに対し(左から右に増加する)、Y軸には、対応する蛍光強度を示した細胞の検出数を示した。
図5(a)では、参照として抗体の標準の発現ベクターでトランスフェクトされたCHO DG44が分析されている。参照細胞の検出された蛍光の98％超は、l-NGFR陽性細胞のM1と指定したl-NGFR-PE-蛍光領域の外側に位置することが分かる。
図5(b)には、抗体発現ベクターおよびベクターpSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8でトランスフェクトされたCHO DG44細胞のFACS分析の結果を示した。これらの細胞は、分析前に、ネオマイシンの存在下で1週間培養されている。検出された蛍光強度は、細胞表面に結合したヤギ(Fab')2-抗マウス-IgG-(H+L)-PE-抗体の数に比例し、従って、FuT8に対するshRNAの発現に比例する。図5(b)から、ネオマイシンによる選択の後に、細胞の90％超が、l-NGFR陽性細胞のプリセットしたl-NGFR-PE-蛍光領域M1の内部に蛍光を示すことが分かる。
図5(c)では、ネオマイシンの存在下で1週間、LCA(レンズマメアグルチニン)の存在下でさらに1週間培養された細胞が分析されている。分析された細胞の98％超が、l-NGFR陽性細胞のプリセットしたl-NGFR-PE-蛍光領域M1の内部に蛍光強度を示している。さらに、ネオマイシンの存在下でのみ増殖させた細胞と比較して、最大蛍光強度は高い方の絶対蛍光強度にシフトした。
実施例10
RNA単離およびcDNA合成および定量RT-PCR
トータルRNAを、DNアーゼ消化を含むRNeasy Mini Kit(Qiagen GmbH、Germany)を用いて単離した。等量のトータルRNA(400ng)を、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche Diagnostics GmbH、Germany)とアンカーオリゴ(dT)18プライマーを用いて逆転写した。
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Iキット(Roche Diagnostics GmbH、Germany)を用いたcDNA合成後に、試料をリアルタイムPCRによって分析した。FuT8(フコシルトランスフェラーゼ8)およびALAS(5-アミノレブリン酸合成酵素)cDNAの増幅および検出のために、以下のような配列特異的プライマーを使用した。

Figure 2010512765
増幅は、以下の条件下:95℃で10分間のプレインキュベーション工程、その後に、10秒95℃、10秒52℃、8秒72℃の45サイクル(温度勾配20℃/秒)で行った。FuT8 cDNAレベルは、LightCycler Relative Quantification Softwareを用いて、ハウスキーピング遺伝子ALASのcDNAレベルと比べて標準化した。
結果を以下の表2に示した。LCAで選択されたプールは実施例5に記載のように回収した(サイレンサーベクター＝pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8)。このLCAプールを、実施例9に記載のようにさらに分析した。
（表２）FuT8 mRNA発現のRT-PCR分析
Figure 2010512765
CHO野生型細胞は、トランスフェクション前の、ベクターがトランスフェクトされているCHO細胞である。野生型から得られた値を100％に設定した。さらなる結果を以下の表3に示した。LCAクローン1〜11は実施例5に記載のように回収した。LCA-クローン1およびLCA-クローン9を、実施例11および12においてさらなる分析に使用した。
（表３）FuT8 mRNA発現のRT-PCR分析
Figure 2010512765
（表４）FuT8 mRNA発現のRT-PCR分析(サイレンサーベクター＝pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8;抗体ベクター＝pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8;抗体-スタッファーベクター＝pSilencer2.1_U6neo_antibody_shRNAFuT8_stuffer)
Figure 2010512765
プールは実施例6および7に記載のように回収した。回収したプールを、免疫グロブリンの精製および免疫グロブリン濃度の測定のために実施例8に記載のように使用した。
実施例11
サイレンシング効果の安定性および免疫グロブリン発現の安定性
どちらも抗体を発現する、CHO DG44細胞およびLCA-クローン9を、選択圧なしで、すなわち、選択薬剤の非存在下で4週間培養した。毎週、1x106細胞を直径6cmの培養皿に蒔き、24時間インキュベートした。細胞を採取した。RNA単離、cDNA合成、定量RT-PCR、およびデータ分析を実施例10のように行った。結果を表5に示した。
（表５）LCA-クローン9におけるFuT8発現
Figure 2010512765
どちらも抗体を発現する、CHO DG44細胞およびCHO DG44-クローン1を、6ウェルプレートに蒔いた(1x106細胞、各6回)。72時間後および168時間後に、3つのウェルの上清を採取し、免疫グロブリン含有量について分析した。結果を表6に示した。
（表６）LCA-クローン1およびCHO DG44における免疫グロブリン発現
Figure 2010512765
実施例12
抗体糖鎖構造の質量分析
グリコシル化されたインタクトな重鎖(HC)において、抗体重鎖の、Asn297および/またはAsn298にある糖鎖アイソフォームの相対含有率を、それぞれ、質量分析によって以下に記載のように求めた。
(A)抗体およびFuT8-shRNAを発現する細胞の培養上清からの抗体の精製
FuT8 shRNAも発現する細胞によって産生された抗体(濃度約5〜20μg/ml)を含有する培養上清約5〜10mlを、プロテインA-Sepharose(商標)CL-4Bの懸濁液(30mg/100μl; Amersham Pharmacia Biotech AB)約100μlと4℃で一晩、バイアルを反転させながらインキュベートした。その後に、抗体が結合しているプロテインA-Sepharoseを沈殿させるために、試料をEppendorf遠心機5810Rで15分間、約400xgで遠心分離した。培養上清を完全に取り除き、ペレットを3回、約50μlの二重に蒸留した水で洗浄した。3回目の洗浄の後に溶液を完全に取り除き、プロテインAに結合している抗体を遊離するために、100mMのクエン酸緩衝液、pH2.8、約30〜50μlをペレットに添加し、振盪しながら室温で15分間インキュベートした。インキュベーションの後、懸濁液をEppendorf遠心機で5分間14,000rpmで遠心分離し、結果として生じた上清を注意深く取り出した。100mMのクエン酸緩衝液、pH2.8、約30〜50μlを再添加し、室温で約15分間振盪し、Eppendorf遠心機で5分間14,000rpmの遠心分離によってプロテインA-Sepharoseを遠心沈殿することによって、プロテインAペレットを1回洗浄した。上清を注意深く取り出し、最初の遊離工程の各溶液と組み合わせた。プロテインAペレットは廃棄した。
(B)ESI質量分析によるFc糖鎖構造の分析
抗体溶液が3〜4Mの塩酸グアニジンおよび250mMのTCEPになるように、6Mの塩酸グアニジン溶液100μlおよびTCEP-グアニジン溶液(6Mの塩酸グアニジンに溶解した1Mのtris-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン塩酸塩)60μlを添加することによって、工程(A)において得られた抗体試料(約60μl、20〜50μg含有)を、軽鎖(LC)およびグリコシル化重鎖(HC)に変性および還元した。試料を37℃で1.5時間インキュベートした。還元および変性した試料を、ランニングバッファーとして2％のギ酸(v/v)および40％のアセトニトリル(v/v)を用いたG25ゲル濾過によって脱塩し、WatersのQ-Tof2質量分析計またはLCT質量分析計において、約10000の分解能で、ナノスプレーニードル(nanospray needle)(Proxeonカタログ番号ES 387)を用いたオフラインスタティックESI-MS分析にかけた。計器は、製造業者の説明書に従って調整し、500〜2000の質量範囲で、一次多項式フィットを使用してナトリウムヨウ素(sodium iodine)を用いて校正した。LCA-クローン9の結果を図7に示した。
試料測定中に、日常的に、700〜2000の質量範囲で30〜40回のシングルスキャンを記録し、10〜30回のシングルスキャンを追加して、評価に用いる最終m/zスペクトルを得た。
得られたm/zスペクトルから、HCに結合している糖質構造を特定し、個々の糖構造アイソフォームの相対含有率を計算した。Watersのmass lynxソフトウェアのデコンボリューションツールを使用して、検出された個々のグリコシル化HC種の質量を計算した。
個々のグリコシル化HC種について得られた質量とDNA配列から導き出した非グリコシル化HCの質量との質量差を計算し、これらの質量差と抗体の公知のN結合型グリコール構造の理論質量を比較することによって、HCに結合しているそれぞれの糖質構造を指定した。
オリゴ糖アイソフォームの比を求めるために、選択したいくつかの単一電荷(m/z)状態から、異なってグリコシル化された個々のHC種のピーク高を求めた。これらの単一電荷(m/z)状態は、LCなどのような他の分子種の他のシグナルと重複しない。オリゴ糖アイソフォームの比を求めるために、選択した単一電荷(m/z)状態からG0+FucおよびG0(図8を参照されたい)のピーク高を求めた。フコシル化が低下した糖構造の相対含有率は、G0構造+フコース(GO+Fuc;末端ガラクトース残基を欠き、コアフコシル化を有する複合二分岐構造)を含有するHC種のピーク高と、G0構造-フコース(GO-Fuc)を含有するHC種のピーク高の比からのみ導き出した。この測定のために、同じ電荷(m/z)状態の中の対応するピークを用いた(例えば、m/z45のG0+フコースのピークおよびフコースを有さないGOのピーク)。これらの種は他の構造から十分に分離していた。定量結果を表7に示した。
（表７）質量分析によって求められたフコシル化のパーセント
Figure 2010512765

Claims (34)

  1. 哺乳動物細胞を選択する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法:
    (a)哺乳動物細胞を、SEQ ID NO:14、15、または16を含む第1の核酸を含む核酸でトランスフェクトする工程、
    (b)工程(a)のトランスフェクトされた哺乳動物細胞を、レンズマメ(Lens culinaris)アグルチニンの存在下で培養する工程、および
    (c)工程(b)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択する工程。
  2. 第1の核酸がSEQ ID NO:14またはSEQ ID NO:15の核酸を含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
  3. 第1の核酸がSEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:16の核酸を含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
  4. 第1の核酸がショートヘアピン核酸に転写されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  5. 第1の核酸がSEQ ID NO:17のさらなる核酸を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  6. 第1の核酸が、SEQ ID NO:14、15、または16に完全に相補的な、さらなる核酸を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  7. 第1の核酸が、5'→3'方向に、SEQ ID NO:14、15、または16の核酸、そのすぐ後にSEQ ID NO:17の核酸、そのすぐ後にSEQ ID NO:14、15、または16の完全配列に相補的な核酸を含み、SEQ ID NO:14、15、または16の完全配列に相補的な核酸の配列が、SEQ ID NO:17の核酸のすぐ前にある核酸の配列に相補的になるように選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  8. 核酸が、選択マーカーをコードする第2の核酸を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  9. 工程(a)の後および工程(b)の前に、以下の工程:
    (a1)工程(a)の哺乳動物細胞を、選択薬剤の存在下で培養する工程、
    (a2)工程(a1)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択する工程
    を含むことを特徴とする、請求項8記載の方法。
  10. 核酸が、異種ポリペプチドをコードする第3の核酸を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  11. 異種ポリペプチドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートより選択されることを特徴とする、請求項10記載の方法。
  12. 哺乳動物細胞が、CHO細胞、またはBHK細胞、またはHEK細胞、またはPER.C6(登録商標)細胞、またはSp2/0細胞、またはNS0細胞であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  13. 第1の核酸がSEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21の核酸であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  14. 第1の核酸が、SEQ ID NO:01〜SEQ ID NO:11のアミノ酸配列に対応する核酸配列、ならびに核酸配列SEQ ID NO:12および13を含む核酸の群より選択される核酸の一部であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  15. LCAの存在下での培養が、0.015mg/ml〜0.5mg/mlのLCA濃度で行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  16. LCAの存在下での培養が、一定濃度のLCAの存在下で行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  17. LCAの存在下での培養が、増加する濃度のLCAの存在下で行われることを特徴とする、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
  18. 増加が直線的または段階的であることを特徴とする、請求項17記載の方法。
  19. 工程(b)におけるトランスフェクトされた哺乳動物細胞の培養が、予め決められた細胞密度が得られるまでLCAの非存在下で行われ、その後に、細胞がLCAの存在下で培養されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  20. 工程(b)におけるトランスフェクトされた哺乳動物細胞が、トランスフェクションの後、LCAの存在下での培養の前に、LCAと異なる選択薬剤の存在下で培養されることを特徴とする、請求項7〜18のいずれか一項記載の方法。
  21. 選択薬剤がネオマイシンであることを特徴とする、請求項20記載の方法。
  22. 哺乳動物細胞を選択する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法:
    (a)哺乳動物細胞を、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含む第1の核酸を含む核酸でトランスフェクトする工程、
    (b)トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、レンズマメアグルチニン(LCA)の存在下で培養する工程、および
    (c)工程(b)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択する工程。
  23. 哺乳動物細胞が、第1の核酸を含む核酸でトランスフェクトされ、この第1の核酸が、ショートヘアピン核酸(shRNA)に転写され、これがフコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含むことを特徴とする、請求項22記載の方法。
  24. 哺乳動物細胞が、第1の核酸を含む核酸でトランスフェクトされ、この第1の核酸が、ショートヘアピン核酸(shRNA)に転写され、これが(i)フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部と、(ii)(i)の核酸と同じ長さでありかつ(i)の完全核酸に相補的な核酸とを含むことを特徴とする、請求項22または23記載の方法。
  25. フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドがα1,6-フコシルトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項22〜24のいずれか一項記載の方法。
  26. 第1の核酸が、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする完全核酸の部分核酸を含み、完全核酸が、SEQ ID NO:01〜11のアミノ酸配列に対応する核酸配列ならびにSEQ ID NO:12および13の核酸配列を含む核酸の群より選択されることを特徴とする、請求項22〜25のいずれか一項記載の方法。
  27. 第1の核酸が、SEQ ID NO:14、15、または16の核酸より選択される核酸を含むことを特徴とする、請求項22〜25のいずれか一項記載の方法。
  28. 第1の核酸がSEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21の核酸であることを特徴とする、請求項22〜25のいずれか一項記載の方法。
  29. 異種ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を選択する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (a)哺乳動物細胞を、
    (i)ショートヘアピン核酸(shRNA)に転写され、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含む、第1の核酸、
    (ii)選択マーカーをコードする、第2の核酸、
    (iii)異種ポリペプチドをコードする、第3の核酸
    を含む核酸でトランスフェクトする工程、
    (b)トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、レンズマメアグルチニン(LCA)の存在下で培養する工程、および
    (c)工程(b)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を選択し、それによって、異種ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を選択する工程。
  30. 工程(a)の後および工程(b)の前に、以下の2つのさらなる工程(a1)および(a2):
    (a1)トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、選択薬剤の存在下で培養する工程、
    (a2)工程(a1)の条件下で生存可能なトランスフェクトされた哺乳動物細胞を選択する工程
    を含み、
    工程(a2)において選択されたトランスフェクトされた哺乳動物細胞が、工程(b)においてLCAの存在下でさらに培養され、工程(a1)において用いられる選択薬剤が、第2の核酸によってコードされる選択マーカーに対応することを特徴とする、請求項29に記載の方法。
  31. 異種ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を選択する方法であって、発現された異種ポリペプチドのフコース修飾の程度が低下しており、かつ該方法が以下の工程を含む、方法:
    (a)哺乳動物細胞を、
    (i)ショートヘアピン核酸(shRNA)に転写され、フコースとアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンとのα1,6-グリコシド結合形成を触媒するポリペプチドをコードする核酸の一部を含む、核酸、
    (ii)異種ポリペプチドをコードする核酸
    を含む核酸でトランスフェクトする工程、
    (b)トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、レンズマメアグルチニン(LCA)の存在下で培養する工程、および
    (c)工程(b)の条件下で生存可能な哺乳動物細胞を、異種ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞として選択する工程。
  32. ショートヘアピン核酸に転写される核酸がSEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21の核酸であることを特徴とする、請求項31記載の方法。
  33. 以下を含む核酸:
    (a)ショートヘアピン核酸に転写される、SEQ ID NO:14、15、または16の核酸より選択される核酸を含む、第1の核酸、
    (b)選択マーカーをコードする、第2の核酸、
    (c)免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、免疫グロブリンコンジュゲートを含む異種ポリペプチドの群より選択される異種ポリペプチドをコードする、第3の核酸。
  34. 第1の核酸が、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21の核酸であることを特徴とする、請求項33記載の核酸。
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