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JP2010511598A - グルコース不耐症関連症状を予防若しくは治療するためのヒトｅｐｏ受容体アゴニスト、組成物、方法および用途 - Google Patents

グルコース不耐症関連症状を予防若しくは治療するためのヒトｅｐｏ受容体アゴニスト、組成物、方法および用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、治療的組成物、方法およびデバイスを包含する、グルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血を予防若しくは治療するための少なくとも１種のヒトＥＰＯ受容体アゴニストの方法に関する。
【選択図】図１Ａ−Ｂ

Description

本発明は、治療的組成物、方法およびデバイスを包含する、グルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血を予防若しくは治療方法のための少なくとも１種のヒトＥＰＯ受容体アゴニストに関する。
ある種の疾患症状は異常な赤血球形成を伴う。組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）は多数の国で治療的に使用されている。米国では、米食品医薬品局（ＦＤＡ）が末期腎疾患に関連する貧血の治療におけるｒＨｕＥＰＯ使用を承認した。この障害を治療するために血液透析を受けている患者は、典型的に、透析治療の結果としての赤血球の破裂および未熟な死により引き起こされる重篤な貧血に苦しむ。ＥＰＯはまた他の型の貧血の治療においても有用である。例えば、化学療法誘発性貧血、骨髄異形成に関連する貧血、多様な先天性障害と関連するもの、ＡＩＤＳ関連貧血、および未熟児関連貧血をＥＰＯで治療しうる。加えて、ＥＰＯは、骨髄移植患者、自己血輸血の準備をしている患者および鉄過負荷障害に苦しむ患者において正常ヘマトクリットをより迅速に復帰させることを助けることのような他の領域である役割を演じうる。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球前駆細胞の表面の特定の受容体に結合することにより赤血球形成の主制御因子として機能する、１６５アミノ酸および４本の炭水化物鎖から構成される糖タンパク質ホルモンである。この結合はそれらの増殖および成熟赤血球への分化の前兆となる。エリスロポエチン受容体はエリスロポエチンに対する高親和性をもつ４８４アミノ酸の糖タンパク質である。エリスロポエチン受容体について、リガンド誘発性のホモ二量体化が活性化を支配する重要な事象の１つでありうる。
エリスロポエチンは比較的短い半減期を有する。静脈内投与されたエリスロポエチンはＣＲＦを伴う患者でおよそ３から４時間までの範囲にわたる循環半減期をもつ一次キネティクスと矛盾しない速度で排泄される。治療的用量範囲内で、検出可能なレベルの血漿エリスロポエチンが少なくとも２４時間維持される。エリスロポエチンの皮下投与後のピーク血清濃度は５〜２４時間以内に達成され、そしてその後ゆっくりと低下する。
貧血管理市場は、赤血球の産生を刺激する増殖因子エリスロポエチン（ＥＰＯ）の受容体を標的とするエリスロポエチン刺激剤（ＥＳＡ）により占められている。組換えＥＰＯ、エポエチン−α（Ｅｐｏｇｅｎ；ＡｍｇｅｎおよびＰｒｏｃｒｉｔ／Ｅｐｒｅｘ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）ならびにエポエチン−β（ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ／Ｅｐｒｅｘ；Ｒｏｃｈｅ）が数年間市場にある。
アムジェン（Ａｍｇｅｎ）のダルベポエチン（Ａｒａｎｅｓｐ）は、ＥＰＯの過剰グリコシル化（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）バリアントであり、そしてエポエチンに比較してより長い半減期を有し、ダルベポエチンがより少なく頻繁な投薬で標的ヘモグロビン濃度を維持することを可能にする（ダルベポエチンで３〜４週ごとに１回対エポエチンで週１回）。ロッシェ（Ｒｏｃｈｅ）のペグ化エポエチンＣＥＲＡ（連続的赤血球形成受容体活性化因子（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ））は臨床試験を受けており、そしてまたＥＰＯより長い半減期を有する。ヘマチデ（Ｈｅｍａｔｉｄｅ）は天然の若しくは市販されているＥＰＯのいずれとも配列が無関係の二量体ペプチドを含んでなり、ＥＰＯ受容体に結合しかつ赤血球形成を刺激する。
エリスロポエチンの小ペプチド模倣物が、エリスロポエチン受容体に対する親和性についてのランダムファージディスプレイペプチドライブラリーのスクリーニングによりいくつかのグループにより同定された。これらの配列はエリスロポエチンとの相同性を有しない。機能アッセイでこれらのペプチドのいくつかが活性を示した（しかし組換えエリスロポエチンのもののわずか１／１００，０００のみ）。ペプチド模倣物の共有二量体若しくは多量体を製造することによりこれらのペプチドの効力を増大させるためにいくつかの試みがなされたとは言え、これらの化合物はモル基準でエリスロポエチンより１，０００〜１０，０００倍より少なく活性であり得、そして治療薬としての使用にそれらを適さなくしている非常に短い半減期を有する。
数種のＥＰＯ受容体アゴニストが現在貧血、ＣＨＦおよび他の適応症のためにで開発中である。
しかしながら、これらおよび当該技術分野で既知の他の問題の１種若しくはそれ以上を克服するＥＰＯ受容体アゴニストに新たな用途を提供すること、ならびに新たな適応症および治療を見出すことの必要性が存在する。
本発明は、当該技術分野で既知であるものと組合せの、本明細書で記述かつ／若しくは実施可能にされるところの、グルコース不耐症および関連症状ならびに／若しくは腎疾患関連の貧血を予防若しくは治療するための、小分子アゴニスト、ペプチド若しくはタンパク質アゴニストを包含するヒトＥＰＯＲアゴニスト、アゴニスト抗体若しくは改変免疫グ
ロブリン、それらの切断生成物および他の特定部分およびバリアント、さらには、それらをコードする核酸、ベクターおよび宿主細胞、ならびに、ＥＰＯＲアゴニスト組成物、製剤、併用療法など、コーディング若しくは相補核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、デバイス、ならびにそれらの作成および製造方法を提供する。
本発明は、本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところの少なくとも１種の単離されたＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを使用する、グルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血を予防若しくは治療するための組成物、方法およびデバイスもまた提供する。
ＥＰＯＲアゴニストは当該技術分野で公知であり、そして、限定されるものでないが、ＥＰＯ若しくはＥＰＯＲアゴニスト（またはＥＰＯＲを活性化するという影響を有するアゴニスト、例えばＨＩＦ）、すなわちペプチド、タンパク質、化合物若しくは小分子など、ならびに、限定されるものでないがＥＰＯ、改変ＥＰＯ、ＥＰＯタンパク質および小分子模倣物、ＥＰＯ若しくはＥＰＯＲアゴニスト抗体またはそれらのフラグメント若しくは融合物を挙げることができるこうしたペプチド若しくはタンパク質をコードする核酸、ベクターおよび宿主細胞を挙げることができる。
本発明は、（ａ）少なくとも１種の単離されたＥＰＯＲアゴニスト；および（ｂ）適する担体若しくは希釈剤を含んでなる、グルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血を予防若しくは治療するための少なくとも１種の組成物もまた提供する。該担体若しくは希釈剤は場合によっては既知の方法により製薬学的に許容でき得る。該組成物は場合によっては少なくとも１種のさらなる化合物、タンパク質若しくは組成物をさらに含み得る。
本発明は、当該技術分野で既知のところの、限定されるものでないが関連疾患の治療の前、後若しくは中を挙げることができる多くの異なる条件で必要とされるとおり、治療上有効な量で投与される場合にグルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血の少なくとも１種の症状を治療若しくは低減するための調節のための方法若しくは組成物において少なくとも１種のＥＰＯＲアゴニスト、特定部分若しくはバリアントをさらに提供する。（例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ、第１７版、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．、ニュージャージー州ホワイトハウスステーション（１９９９）（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい）。
本発明は、グルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血を予防若しくは治療するための本発明の少なくとも１種のＥＰＯＲアゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの治療上若しくは予防上有効な量の少なくとも１種の組成物、デバイスおよび／若しくは送達方法もまた提供する。
本発明は、グルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血を予防若しくは治療するための（ａ）本明細書に記述されるところの単離されたＥＰＯＲアゴニストをコードする核酸および／若しくはＥＰＯＲアゴニスト；ならびに（ｂ）適する担体若しくは希釈剤を含んでなる少なくとも１種の組成物もまた提供する。該担体若しくは希釈剤は場合によっては既知の担体若しくは希釈剤により製薬学的に許容でき得る。該組成物は、場合によっては少なくとも１種のさらなる化合物、タンパク質若しくは組成物をさらに含み得る。
少なくとも１種の単離されたヒトＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ（ｈｉｎｇｅ ｃｏｒｅ ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）および少なくとも１種の製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤を含んでなる組成物もまた提供される。該組成物は、場合によっては、検出可能な標識若しくはレポーター、抗感染薬、グルコース不耐症関連薬、腎性貧血関連薬、胃腸（ＧＩ）管薬、ホルモン薬、液体若しくは電解質バランスのための薬物、血液製剤、ＴＮＦαアンタゴニスト、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＴＨＥ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬、抗乾癬薬、コルチコステロイド、蛋白同化ステロイド、グルコースモジュレーター（ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制薬、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗うつ薬、抗精神病薬、興奮剤、喘息薬、βアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリン若しくはアナログ、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストの少なくとも１種から選択される少なくとも１種の化合物若しくはタンパク質の有効量をさらに含み得る。
（ａ）有効量の少なくとも１種のＥＰＯＲアゴニストを含んでなる組成物を細胞、組織、器官若しくは動物と接触若しくはそれらに投与すること
を含んでなる、細胞、組織、器官若しくは動物におけるグルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血の診断、予防若しくは治療方法もまた提供される。該方法は、場合によっては、細胞、組織、器官若しくは動物に対し０．００００１〜５００ｍｇ／キログラムの有効量を使用することをさらに含み得る。該方法は、場合によっては、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液包内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される少なくとも１様式により接触若しくは投与することを使用することをさらに含み得る。
本発明は本明細書に記述されるいかなる発明もさらに提供する。
［発明の詳細な記述］
本発明は、治療的組成物、方法およびデバイスを包含する、グルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血の予防若しくは治療方法のための少なくとも１種のヒトＥＰＯ受容体アゴニストに関する。
ＥＰＯＲアゴニストは当該技術分野で公知であり、そして、限定されるものでないがＥＰＯ若しくはＥＰＯＲアゴニスト（またはＥＰＯＲを活性化するという影響を有するアゴニスト、例えばＨＩＦ）、すなわち、限定されるものでないがＥＰＯ、改変ＥＰＯ、ＥＰＯタンパク質および小分子模倣物、ＥＰＯ若しくはＥＰＯＲアゴニスト抗体またはそれらのフラグメント若しくは融合物を挙げることができるペプチド、タンパク質、化合物若しくは小分子などを挙げることができる。
ＥＰＯＲアゴニストの作成および使用方法の制限しない例は、以下の表でそれに関する列挙されたＰＣＴ公開により提供され、それら刊行物はそれらが本発明の方法および治療のためのＥＰＯ受容体アゴニストの作成および使用方法に関する従来技術を示すために引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる。当該技術分野で既知のＥＰＯ受容体アゴニストの制限しない例は、ＥＰＯ、その活性フラグメントおよび模倣物、ならびに化学的ＥＰＯ受容体アゴニストを包含し、それらは引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる以下の刊行物にもまた開示される。
数種のＥＰＯ受容体アゴニストは、貧血、ＣＨＦおよび他の適応症についてで現在開発中であり、そして、本発明の方法でＥＰＯ受容体アゴニストとして使用し得る。
本発明の他のＥＰＯ受容体アンタゴニストは、ＥＰＯ受容体アゴニストペプチドを含有する抗体融合タンパク質を包含し、それらのいずれも本発明により使用し得る。制限しない例は、２００３年６月３０日に出願された米国特許出願第１０／６０９，７８３号、および２００４年９月３日に出願された同第１０／９３５，００５号（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）に開示されるところのＥＰＯミメティボディを包含する。本発明の方法で使用し得るＥＰＯＲアゴニストの別の制限しない一例、本発明はまた、本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところの少なくとも１種の単離されたＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディまたは特定部分若しくはバリアントも提供する。ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディは、少なくとも１種の可変抗体配列の少なくとも一部分（Ｖ）と場合によってはさらに直接連結された少なくとも１種の治療的ペプチド（Ｐ）に直接連結された任意のリンカー配列（Ｌ）と直接連結された少なくとも１個のヒンジ領域若しくはそのフラグメント（Ｈ）と直接連結された少なくとも１個のＣＨ２領域と直接連結された少なくとも１個のＣＨ３領域を場合によっては含み得る。
好ましい一態様において、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディは、限定されるものでないがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなど、若しくはそれらの組合せを挙げることができる異なるタイプの免疫グロブリン分子を模倣する、式（Ｉ）：

（（Ｖ（ｍ）−Ｐ（ｎ）−Ｌ（ｏ）−Ｈ（ｐ）−ＣＨ２（ｑ）−ＣＨ３（ｒ））（ｓ）

［式中、Ｖは免疫グロブリン可変領域のＮ末端の少なくとも一部分であり、Ｐは少なくとも１種の生物活性ペプチドであり、Ｌは該ミメティボディが代替の方向および結合特性を有することを可能にすることにより構造の柔軟性を提供するポリペプチドであり、Ｈは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２定常領域の少なくとも一部分であり、ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３定常領域の少なくと
も一部分であり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは独立に０、１若しくは２と１０の間の整数であり得る］
を含んでなる。ｍ＝１の場合の単量体を、会合、または限定されるものでないがＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合若しくは他の免疫グロブリン配列を挙げることができる共有結合により他の単量体に連結し得る。本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディは、治療的ペプチドおよびその固有の若しくは獲得されたｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｓｉｔｕ特性若しくは活性を提供しつつその固有の特性および機能をもつ抗体構造を模倣する。抗体の多様な部分および本発明の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディの治療的ペプチド部分は、当該技術分野で既知であるものとともに本明細書に記述されるとおり変動し得る。
本明細書で使用されるところの「ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ」、「ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ部分」若しくは「ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディフラグメント」および／または「ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディバリアント」ならびに類似の模倣物は、限定されるものでないが配列番号１〜３０の少なくとも１種を挙げることができる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕおよび／若しくは好ましくはｉｎ ｖｉｖｏのリガンド結合若しくは活性のような少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種のリガンド結合若しくは少なくとも１種の生物学的活性を有するか若しくは刺激する。例えば、本発明の適するＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ、特定部分若しくはバリアントは、少なくとも１種のタンパク質リガンドを結合し得、および少なくとも１種のタンパク質リガンド、受容体、可溶性受容体などを包含する。適するＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ、特定部分若しくはバリアントは、少なくとも１種のタンパク質受容体シグナル伝達または他の測定可能若しくは検出可能な活性もまた調節、増大、改変、活性化し得る。
本発明の方法および組成物で有用なミメティボディは、タンパク質リガンド若しくは受容体への適する親和性結合および場合によってはかつ好ましくは低毒性を有することを特徴とする。とりわけ、可変領域、定常領域（ＣＨ１部分を含まない）および枠組み、またはそれらのいずれかの部分（例えば可変Ｈ若しくはＬ鎖のＪ、Ｄ若しくはＶ領域の一部分；少なくとも１種のヒンジ領域の少なくとも一部分、定常Ｈ鎖若しくはＬ鎖など）の部分のような個々の成分が個別にかつ／若しくは集合的に場合によってはかつ好ましくは低免疫原性を有するＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディが本発明で有用である。本発明で使用し得るミメティボディは、症状の良好ないし優れた軽減および低毒性を伴い長期間患者を治療するそれらの能力を場合によっては特徴とする。低免疫原性および／若しくは高親和性ならびに他の定義されない特性が達成される治療成績に貢献しうる。「低免疫原性」は、治療される患者の約７５％未満、または好ましくは約５０、４５、４０、３５、３０、３５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２および／若しくは１％未満で有意のＨＡＭＡ、ＨＡＣＡ若しくはＨＡＨＡ応答を生じさせること、ならびに／あるいは治療される患者で低力価（二重抗原エンザイムイムノアッセイで測定される約３００未満、好ましくは約１００未満）を生じさせることと本明細書で定義する（例えばＥｌｌｉｏｔｔら、Ｌａｎｃｅｔ ３４４：１１２５−１１２７（１９９４）を参照されたい）。
利用性
本発明の単離された核酸は、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ、そのフラグメント若しくは指定されるバリアントの製造に使用することができ、該核酸（またはコードするＤＮＡ）は、限定されるものでないが少なくとも１種のグルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血、ならびに他の既知の若しくは指定されるタンパク質に関連した症状から選択される少なくとも１種の症状を調節、治療、軽減する、その発生を予防することを助ける、若しくはその症状を低下させるように細胞、組織、器官若しくは動物（哺乳動物およびヒトを包含する）で効果を発揮せしめるように使用し得る。
こうした方法は、症状、効果若しくは機構のこうした調節、治療、軽減、予防若しくは低下の必要な細胞、組織、器官、動物若しくは患者に少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディまたは特定部分若しくはバリアントを含んでなる組成物若しくは製薬学的組成物の有効量を投与することを含み得る。有効量は、本明細書に記述されるか若しくは関連技術分野で既知のところの既知の方法を使用して行われかつ決定されるとおり、単一若しくは複数投与あたり約０．０００１ないし５００ｍｇ／ｋｇの、または単一若しくは複数投与あたり０．０００１〜５０００μｇ／ｍｌ血清濃度の血清濃度あるいはその中のいずれかの有効範囲若しくは値を達成するための量を含み得る。
引用
本明細書で引用される全部の刊行物若しくは特許は、それらが本発明の時点での従来技術を示すためにかつ／若しくは本発明の記述および使用可能性を提供するために、引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる。刊行物は、いかなる学術的若しくは特許刊行物、または全部の記録、電子若しくは印刷形式を包含するいずれかの媒体形式で利用可能ないかなる他の情報も指す。以下の参考文献は引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる：Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７−２００３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４−２００６）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７−２００６）。
本発明のミメティボディ若しくはＥＰＯ受容体アゴニスト
ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディは、場合によっては、少なくとも１種の可変抗体配列の少なくとも一部分（Ｖ）と場合によってはさらに直接結合されている少なくとも１種の治療的ペプチド（Ｐ）に直接結合されている任意のリンカー配列（Ｌ）と直接結合されている少なくとも１種のコアヒンジ領域を含んでなるような少なくとも１種のヒンジ領域フラグメントの少なくとも一部分（Ｈ）と直接結合されている少なくとも１種のＣＨ２領域と直接結合されている少なくとも１種のＣＨ３領域を含み得る。好ましい一態様において、一対のＣＨ３−ＣＨ２−Ｈ−Ｌ−Ｖ、該対は会合若しくは共有結合により連結される。従って、本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディは、治療的ペプチドおよびその固有の若しくは獲得されたｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｓｉｔｕの特性若しくは活性を提供しつつその固有の特性および機能を伴う抗体構造を模倣する。抗体の多様な部分および本発明の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディの治療的ペプチド部分は、当該技術分野で既知であるものとともに本明細書に記述されるとおり変動し得る。
本発明のミメティボディは、従って、限定されるものでないが、延長された半減期、増大された活性、より特異的な活性、増大されたアビディティー、増大若しくは減少されたオフ速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）、活性の選択された若しくはより適するサブセット、より小さい免疫原性、少なくとも１種の所望の治療効果の増大された質若しくは持続期間、より少ない副作用などの少なくとも１種を挙げることができる、既知のタンパク質と比較して少なくとも１種の適する特性を提供する。
式（Ｉ）のミメティボディのフラグメントは、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところの酵素切断、合成若しくは組換え技術により製造し得る。ミメティボディはまた、１個若しくはそれ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して多様な切断型でも製造し得る。ミメティボディの多様な部分を慣習的技術により化学的に一緒に結合し得るか、若しくは遺伝子工学技術を使用して連続した１タンパク質として製造し得る。例えば、ヒト抗体鎖の定常領域の少なくとも１種をコードする核酸を発現させて本発明のミメティボディでの使用のための連続したタンパク質を製造し得る。例えば、一本鎖抗体に関してＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号明細書およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−４２６（１９８８）を参照されたい。
本明細書で使用されるところの「ヒトミメティボディ」という用語は、該タンパク質の実質的にすべての部分（例えばＥＰＯ模倣ペプチド、枠組み、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えばＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が、ただ小さな配列の変化若しくは変動を伴いヒトで実質的に非免疫原性であることが期待される抗体を指す。こうした変化若しくは変動は、場合によってはかつ好ましくは、改変されないヒト抗体若しくは本発明のミメティボディに関してヒトでの免疫原性を保持若しくは低下する。従って、本発明のヒト抗体および対応するＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディはキメラ若しくはヒト化抗体と異なる。ヒト免疫グロブリン（例えばＨ鎖および／若しくはＬ鎖）遺伝子を発現することが可能であるヒト以外の動物若しくは細胞によりヒト抗体およびＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディを製造し得ることが指摘される。
好ましい一態様において、本発明の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、少なくとも１種の細胞株、混合細胞株、不死化細胞、または不死化かつ／若しくは培養細胞のクローン集団により産生される。不死化タンパク質産生細胞は適する方法を使用して製造し得る。好ましくは、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、機能的に再配列されているか若しくは機能的再配列を受け得かつ限定されるものでないが式（Ｉ）［ここで当該技術分野で既知のとおりＣおよびＮ末端可変領域の部分をＶに、ヒンジ領域をＨに、ＣＨ２をＣＨ２におよびＣＨ３をＣＨ３に使用し得る］を挙げることができる本明細書に記述されるところのミメティボディ構造をさらに含んでなる少なくとも１種のヒト免疫グロブリン遺伝子座由来の若しくはそれに実質的に類似の配列を有するＤＮＡを含んでなる核酸若しくはベクターを提供することにより生成される。
核酸分子
多様なＥＰＯ Ｒペプチド若しくはタンパク質アゴニストをコードするヌクレオチド配列のような、本明細書に提供される情報ならびに当該技術分野で既知であるものを使用して、少なくとも１種のＥＰＯ Ｒアゴニストをコードする本発明の核酸分子を、本明細書に記述されるか若しくは当該技術分野で既知のところの方法を使用して得ることができる。
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ若しくはいずれかの他の形態のようなＲＮＡの形態、または、限定されるものでないがクローニングにより得られたか若しくは合成で製造されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを挙げることができるＤＮＡの形態、あるいはそれらのいずれかの組合せであり得る。ＤＮＡは三本鎖、二本鎖若しくは一本鎖、またはそれらのいずれかの組合せであり得る。ＤＮＡ若しくはＲＮＡの少なくとも１本の鎖のいずれの部分もセンス鎖としてもまた知られるコーディング鎖であり得るか、または、それはアンチセンス鎖ともまた称される非コーディング鎖であり得る。
本発明の単離された核酸分子は、場合によっては１個若しくはそれ以上のイントロンを含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでなる核酸分子、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントのコーディング配列を含んでなる核酸分子；および、上述されたものと実質的に異なるヌクレオチド配列を含んでなるがしかし遺伝暗号の縮重により本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところの少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストをなおコードする核酸分子を包含し得る。もちろん遺伝暗号は当該技術分野で公知である。従って、本発明の特定のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントをコードするこうした縮重核酸バリアントを生成させることは当業者に慣例であろう。例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたく、そしてこうした核酸バリアントは本発明に包含される。
本明細書に示されるとおり、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントをコードする核酸を含んでなる本発明の核酸分子は、限定されるものでないが、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストのフラグメントのアミノ酸配列を独力でコードするもの；ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニスト全体またはそれらの一部分のコーディング配列；ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニスト、フラグメント若しくは部分のコーディング配列、ならびに少なくとも１種のシグナルリーダー、または、限定されるものでないが転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを包含するｍＲＮＡプロセシングにおいてある役割（例えばｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性）を演じる転写され翻訳されない配列のような非コーディング５’および３’配列を挙げることができる付加的な非コーディング配列と一緒になった少なくとも１種のイントロンのような前述の付加的なコーディング配列を伴う若しくは伴わない融合ペプチドのコーディング配列のような付加的な配列；付加的な機能性を提供するもののような付加的なアミノ酸をコードする付加的なコーディング配列を挙げることができる。従って、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントをコードする配列は、融合されたＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニスト、またはＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストのフラグメント若しくは部分を含んでなる特定部分若しくはバリアントの精製を容易にするペプチドをコードする配列のようなマーカー配列に融合させ得る。
本明細書に記述されるところのポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、またはその指定されるバリアント若しくは部分を包含する本明細書に開示される他者に選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離された核酸を提供する。従って、本態様のポリヌクレオチドは、こうしたポリヌクレオチドを含んでなる核酸を単離、検出かつ／若しくは定量するために使用し得る。
低若しくは中程度の緊縮性のハイブリダイゼーション条件は、典型的に、しかし独占的にでなく相補配列に関して低下された配列同一性を有する配列とともに使用する。中程度および高緊縮性の条件は場合によってはより大きな同一性の配列に使用し得る。低緊縮性条件は、約４０〜９９％の配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、そしてオルソロガス若しくはパラロガス配列を同定するのに使用し得る。
場合によっては、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記述されるポリヌクレオチドによりコードされるＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体ア
ゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの少なくとも一部分をコードすることができる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントをコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションに使用し得る核酸配列を包含する。例えばＡｕｓｕｂｅｌ、上記；Ｃｏｌｌｉｇａｎ、上記（引用することより本明細書にそれぞれそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。
核酸の構築
本発明の単離された核酸は、当該技術分野で公知のところの（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、若しくはそれらの組合せを使用して作成し得る。
核酸は、便宜的に本発明のポリヌクレオチドに加えて配列を含み得る。例えば、１個若しくはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含んでなるマルチクローニング部位をポリヌクレオチドの単離で補助するために核酸に挿入し得る。また、翻訳可能な配列を本発明の翻訳されるポリヌクレオチドの単離で補助するために挿入し得る。例えばヘキサヒスチジンマーカー配列は本発明のタンパク質を精製するための便宜的手段を提供する。本発明の核酸（コーディング配列を除外する）は、場合によっては本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび／若しくは発現のためのベクター、アダプター若しくはリンカーである。
付加的な配列を、クローニングおよび／若しくは発現においてそれらの機能を最適化するため、ポリヌクレオチドの単離で補助するため、または細胞中へのポリヌクレオチドの導入を向上させるためにこうしたクローニングおよび／若しくは発現配列に付加し得る。クローニングベクター、発現ベクター、アダプターおよびリンカーの使用は当該技術分野で公知である。例えばＡｕｓｕｂｅｌ、上記；若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい。
核酸の組換え構築方法
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ若しくはそれらのいずれかの組合せのような本発明の単離された核酸組成物は、当業者に既知のいずれかの数のクローニング方法論を使用して生物学的供給源から得ることができる。いくつかの態様において、適する緊縮性の条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の配列を同定する。ＲＮＡの単離ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築は当業者に公知である。（例えばＡｕｓｕｂｅｌ、上記；若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）。
核酸の合成構築方法
本発明の単離された核酸は既知の方法による直接化学合成によってもまた製造し得る（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい）。化学合成は一般に一本鎖オリゴヌクレオチドを生じ、それを相補配列とのハイブリダイゼーションにより、若しくは鋳型として該一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼでの重合により二本鎖ＤＮＡに転化し得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成は約１００若しくはそれ以上の塩基の配列に制限され得る一方で、より長い配列をより短い配列の連結により得ることができることを認識するであろう。
組換え発現カセット
本発明は本発明の核酸を含んでなる組換え発現カセットをさらに提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントをコードするｃＤＮＡ若しくはゲノム配列を使用して、少なくとも１種の所望の宿主細胞に導入し得る組換え発現カセットを構築し得る。組換え発現カセットは、典型的に、意図している宿主細胞中での本発明のポリヌク
レオチドの転写を指図することができる転写開始制御配列に作動可能に連結されている該ポリヌクレオチドを含むことができる。異種および非異種（すなわち内因性）双方のプロモーターを本発明の核酸の発現を指図するのに使用し得る。
いくつかの態様において、プロモーター、エンハンサー若しくは他の要素としてはたらく単離された核酸を、本発明のポリヌクレオチドの発現を上方若しくは下方制御するように非異種の形態の本発明のポリヌクレオチドの適切な位置（上流、下流若しくはイントロン中）に導入し得る。例えば、内因性プロモーターは当該技術分野で既知のところの突然変異、欠失および／若しくは置換によりｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで変えることができる。本発明のポリヌクレオチドは所望のとおりセンス若しくはアンチセンスいずれの向きでも発現させ得る。センス若しくはアンチセンスいずれかの向きでの遺伝子発現の制御が、観察可能な特徴に対する直接の影響を有し得ることが認識されるであろう。別の抑制方法はセンス抑制である。センスの向きに構成された核酸の導入は、標的遺伝子の転写を阻害するための有効な手段であることが示されている。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を包含するベクター、該組換えベクターで遺伝子的に工作されている宿主細胞、および当該技術分野で公知であるのところの組換え技術による少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの製造にも関する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。
ポリヌクレオチドは、場合によっては宿主中での増殖のための選択可能なマーカーを含有するベクターに結合し得る。一般に、プラスミドベクターは電気穿孔法などのような適する既知の方法を使用して細胞に導入され、他の既知の方法は、リン酸カルシウム沈殿のような沈殿物として、若しくは荷電した脂質との複合体中でのベクターの使用を包含する。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してそれをｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングし得、そしてその後宿主細胞中に形質導入し得る。
ＤＮＡ挿入断片は適切なプロモーターに効果的に連結すべきである。発現構築物は、場合によっては転写開始、終止の少なくとも一方のための部位、および転写された領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することができる。該構築物により発現される成熟転写物のコーディング部分は、好ましくは翻訳されるべきｍＲＮＡの初めの翻訳開始および終わりに適切に配置された終止コドン（例えばＵＡＡ、ＵＧＡ若しくはＵＡＧ）を包含することができ、ＵＡＡおよびＵＡＧが哺乳動物若しくは真核生物細胞発現に好ましい。
発現ベクターは、好ましくは、しかし場合によっては少なくとも１種の選択可能なマーカーを包含することができる。こうしたマーカーは、限定されるものでないが、真核生物細胞培養物のためのメトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；同第４，６５６，１３４号；同第４，９５６，２８８号；同第５，１４９，６３６号；同第５，１７９，０１７号明細書、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ミコフェノール酸若しくはグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号明細書）耐性、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌若しくは原核生物中で培養するためのテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性遺伝子（上の特許はここに引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）を挙げることができる。上述された宿主細胞に適切な培地および培養条件は当該技術分野で既知である。適するベクターは当業者に容易に明らかであろう。ベクター構築物の宿主細胞中への導入は、
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染若しくは他の既知の方法により遂げることができる。こうした方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１〜４および１６〜１８章；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１、９、１３、１５、１６章のような当該技術分野で記述されている。
本発明の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、融合タンパク質のような改変された形態で発現させ得、そして分泌シグナルのみならずしかしまた付加的な異種機能領域も包含し得る。例えば、付加的なアミノ酸、とりわけ荷電したアミノ酸の一領域を、宿主細胞中、精製の間、若しくはその後の取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および難分解性を向上させるためにＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントのＮ末端に付加し得る。また、精製を容易にするために、本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントにペプチド部分を付加し得る。こうした領域はＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたはその少なくとも１種のフラグメントの最終調製前に除去し得る。こうした方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、（２００３）上記、第１７．２９〜１７．４２および１８．１〜１８．７４章；Ａｕｓｕｂｅｌ（２００３）、上記、第１６、１７および１８章のような多くの標準的実験室手引書に記述されている。
当業者は、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系を知っている。
ミメティボディ、それらの特定部分若しくはバリアントの製造に有用な細胞培養物を具体的に説明するのは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系はしばしば細胞の単層の形態にあることができるとは言え、哺乳動物細胞懸濁液若しくはバイオリアクターもまた使用し得る。無傷のグリコシル化されたタンパク質を発現することが可能な多数の適する宿主細胞株が当該技術分野で開発されており、そして、ＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０、ＤＧ−４４）およびＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６）細胞株、ｈｅｐＧ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などを包含し、これらは例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサスから容易に入手可能である。好ましい宿主細胞は骨髄腫およびリンパ腫細胞のようなリンパ系起源の細胞を包含する。とりわけ好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８０）およびＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１８５１）である。
これらの細胞の発現ベクターは、限定されるものでないが複製起点；プロモーター（例えば後期若しくは初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば米国特許第５，１６８，０６２号；同第５，３８５，８３９号明細書）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１ αプロモーター（例えば米国特許第５，２６６，４９１号明細書）、少なくとも１種のヒト免疫グロブリンプロモーター；エンハンサー、および／若しくはリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えばＳＶ４０ラージＴ ＡｇポリＡ付加部位）のようなプロセシング情報部位、ならびに転写終止配列を挙げることができる発現制御配列の１種若しくはそれ以上を包含し得る。例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい。本発明の核酸若しくはタンパク質の製造に有用な他の細胞は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの細胞株およびハイブ
リドーマのカタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）または他の既知の若しくは商業的供給源から既知かつ／若しくは入手可能である。
真核生物宿主細胞を使用する場合、ポリアデニル化若しくは転写終止配列が典型的にベクターに組み込まれる。終止配列の一例はウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列もまた包含し得る。スプライシング配列の一例は、ＳＶ４０からのＶＰ１イントロン（Ｓｐｒａｇｕｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３−７８１（１９８３））である。加えて、宿主細胞中での複製を制御するための遺伝子配列を当該技術分野で既知のとおりベクターに組み込み得る。
ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたはその特定部分若しくはバリアントの精製
ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、限定されるものでないがプロテインＡ精製、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを挙げることができる公知の方法により組換え細胞培養物から回収かつ精製し得る。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）もまた精製に使用し得る。例えばＣｏｌｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、若しくはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７−２００６）、例えば第１、４、６、８、９、１０章（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。
本発明のミメティボディまたは特定部分若しくはバリアントは、天然に精製された産物、化学合成治療の生成物、ならびに例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を包含する真核生物宿主から組換え技術により製造される生成物を包含する。組換え製造治療で使用される宿主に依存して、本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントはグリコシル化され得るか、若しくはグリコシル化されないことができ、グリコシル化が好ましい。こうした方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１７．３７〜１７．４２節；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１０、１２、１３、１６、１８および２０章、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、上記、第１２〜１４章（全部は引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）のような多くの標準的実験室手引書に記述されている。
ミメティボディ、指定されるフラグメントおよび／若しくはバリアント
本発明の単離されたミメティボディは、本明細書により完全に論考されるところの本発明のポリヌクレオチドのいずれか１種によりコードされるＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント、あるいはいずれかの単離若しくは製造されたＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたはその特定部分若しくはバリアントを含んでなる。
好ましくは、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたはリガンド結合部分若しくはバリアントは少なくとも１種のＥＰＯタンパク質リガンド若しくは受容体を結合し、そしてそれにより対応するタンパク質若しくはそのフラグメントの少なくとも１種のＥＰＯの生物学的活性を提供する。多様な治療上若しくは診断上意義のあるタンパク質が当該技術分野で公知であり、また、こうしたタンパク質の適するアッセイ若しくは生物学的活性もまた当該技術分野で公知である。
本発明の適するＥＰＯ模倣ペプチドの制限しない例が下の表１に出現する。これらのペプチドは当該技術分野で開示されかつ／若しくは既知の方法により製造し得る。一文字アミノ酸略語を大部分の場合で使用する。これらの配列（および特定の例において別の方法で明記されない限り本明細を通じて）中のＸは、２０種の天然に存在するすなわち既知のアミノ酸残基またはそれらの既知の誘導体、あるいはそれらのいずれかの既知の修飾アミノ酸のいずれかが存在しうることを意味している。これらのペプチドのいずれも、リンカーを伴い若しくは伴わずにタンデムに（すなわち続けて）連結されることができ、そして、数個のタンデム結合された例が該表に提供される。リンカーは「Δ」として列挙され、そして本明細書に記述されるリンカーのいずれでもありうる。タンデムリピートおよびリンカーは明瞭さのためダッシュにより分離されて示される。システイニル残基を含有するいかなるペプチドも、別のＣｙｓ含有ペプチドで場合によっては架橋されることができ、それらのいずれか若しくは双方がベヒクルに連結されうる。いくつかの架橋された例が該表に提供される。１個以上のＣｙｓ残基を有するいかなるペプチドも同様にペプチド内ジスルフィド結合を形成することができ；例えば表１中のＥＰＯ模倣ペプチドを参照されたい。ペプチド内ジスルフィド結合したペプチドのいくつかの例が表中に明記される。これらのペプチドのいずれも本明細書に記述されるとおり誘導体化することができ、そしていくつかの誘導体化された例が表に提供される。カルボキシル末端がアミノ基でキャッピングされうる誘導体について、キャッピングするアミノ基を−ＮＨ２として示す。アミノ酸残基がアミノ酸残基以外の部分により置換されている誘導体について、該置換は、例えばＢｈａｔｎａｇａｒら（１９９６）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９およびＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎら（１９９７）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２８７６−８２（引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）に記述されるところの当該技術分野で既知の部分のいずれかを表すδにより示される。Ｊ置換基およびＺ置換基（Ｚ５、Ｚ６、．．．Ｚ４０）は米国特許第５，６０８，０３５号、同第５，７８６，３３１号および同第５，８８０，０９６号明細書（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）に定義されるとおりである。ＥＰＯ模倣配列（表１）について、置換基Ｘ２からＸ１１および整数「ｎ」は第ＷＯ ９６／４０７７２号明細書（引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）に定義されるとおりである。太字で出現する残基はＤ−アミノ酸であるがしかし場合によってはＬ−アミノ酸であり得る。全部のペプチドは別の方法で示されない限りペプチド結合により連結される。略語は本明細の最後に列挙する。「配列番号」欄で、「ＮＲ」は配列表が所定の配列に必要とされないことを意味している。
ＥＰＯの生物学的活性は当該技術分野で公知である。例えば、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ Ａら Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｈａｓ ａ ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）８７：５９７８−８２（１９９０）；Ｆａｎｄｒｅｙ ＪとＪｅｌｋｍａｎ ＷＥ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｉｎｈｉｂｉｔ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６２８：２５０−５（１９９１）；Ｇｅｉｓｓｌｅｒ Ｋら Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：Ａ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｏｎｔｒｉｂ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．８７：１−１０（１９９０）；Ｇｒｅｇｏｒｙ ＣＪ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｓ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ８９：２８９−３０１（１９７６）；Ｊｅｌｋｍａｎ Ｗら Ｍｏｎｏｋｉｎｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｒａｔ ｋｉｄｎｅｙｓ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５０：３０１−８（１９９２）；Ｋｉｍａｔａ Ｈら Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｒｙｔ
ｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｂ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８５：１５１−６（１９９１）；Ｋｉｍａｔａ Ｈら Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．５９：４９５−５０１（１９９１）；Ｋｉｍａｔａ Ｈら Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＩｇＥ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８３：４８３−７（１９９１）；Ｋｏｕｒｙ ＭＪとＢｏｎｄｕｒａｎｔ
ＭＣ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｔａｒｄｓ ＤＮＡ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ
ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：３７８−８１（１９９０）；Ｌｉｍ ＶＳら Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｏｎ ｒｅｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ３７：１３１−６（１９９０）；Ｍｉｔｊａｖｉｌａ ＭＴら Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ａｎｄ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ８８：７８９−９７（１９９１）；Ａｎｄｒｅ Ｍら Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｆｒｏｍ ａｎｅｍｉｃ ａｎｄ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：７５８−６３（１９９２）；Ｈａｎｋｉｎｓ ＷＤら Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｆｏｒ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５５４：２１−８（１９８９）；Ｋｅｎｄａｌｌ ＲＧＴら Ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １３：１８９−９６（１９９１）；Ｋｒｕｍｖｉｅｈ Ｄら Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．６９：１５−２２（１９８８）；Ｍａ ＤＤら Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ＥＩＡ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＲＩＡ ａｎｄ ａｎ ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｂｉｏａｓｓａｙ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ８０：４３１−６（１９９２）；Ｎｏｅ Ｇら Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ８０：２８５−９２（１９９２）；Ｐａｕｌｙ ＪＵら Ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ
ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３（ＩＬ３）ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）ｉｎ ｓｅｒｕｍ．Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇｅｎ ９０：１１２−２５（１９９１）；Ｓａｋａｔａ ＳとＥｎ
ｏｋｉ Ｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｌａｓｍａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＣＦＵ−Ｅ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ６４：２２４−３０（１９９２）；Ｓａｎｅｎｇｅｎ Ｔら Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ｓ）
ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｆｒｏｍ ｈｙｐｅｒｔｒａｎｓｆｕｓｅｄ ｎｅｏｎａｔａｌ
ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ ａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１３５：１１−６（１９８９）；Ｗｉｄｎｅｓｓ ＪＡら Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１９：２８５−９４（１９９２）を参照されたく；さらなる情報については個々のバイオアッセイで使用される個々の細胞株もまた参照されたい。上の参考文献のそれぞれは引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる。ＥＰＯは該因子に応答するＨＣＤ５７、ＮＦＳ−６０、ＴＦ−１およびＵＴ−７のような細胞株を使用することによりアッセイし得る。ＥＰＯ活性は、骨髄細胞からのＣＦＵ−Ｅの数を測定することによりコロニー形成アッセイでもまた評価し得る。代替のかつ全く異なる検出方法はサイトカインのＲＴ−ＰＣＲ定量である。
少なくとも１種のタンパク質若しくはフラグメントの少なくとも１種のＥＰＯの生物学的活性を部分的に若しくは好ましくは実質的に提供するＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたはその特定部分若しくはバリアントは、該タンパク質若しくはフラグメントのリガンドを結合し得、そしてそれにより、少なくとも１種のタンパク質リガンド若しくは受容体へのタンパク質の結合または他のタンパク質依存性若しくは媒介性の機構により別の方法で媒介される少なくとも１種の活性を提供し得る。本明細書で使用されるところの「ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニスト活性」という用語は、少なくとも１種のタンパク質依存性の活性をアッセイに依存して約２０〜１０，０００％、好ましくは少なくとも約６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００％若しくはそれ以上調節し得るか若しくは引き起こし得るＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストを指す。
少なくとも１種のタンパク質依存性の活性を提供するＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの能力は、好ましくは、本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところの少なくとも１種の適するタンパク質の生物学的アッセイにより評価される。本発明のヒトＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、いずれかのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）若しくはアイソタイプに類似であり得、そしてκ若しくはλ Ｌ鎖の少なくとも一部分を含み得る。一態様において、ヒトＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、ＩｇＧ Ｈ鎖可変フラグメント、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３、例えばアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４の少なくとも１種を含んでなる。
本発明の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受
容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、少なくとも１種のタンパク質、サブユニット、フラグメント、部分若しくはそれらのいずれかの組合せに特異的な少なくとも１種の指定されるリガンドを結合する。本発明の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニスト、特定部分若しくはバリアントの少なくとも１種のＥＰＯ模倣ペプチドは、リガンドの少なくとも１種の指定されるエピトープを場合によっては結合し得る。該結合エピトープは、ＥＰＯ受容体若しくはその部分のようなタンパク質リガンドよりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸の少なくとも１〜３アミノ酸ないし特定部分全体の少なくとも１種のアミノ酸配列のいかなる組合せも含み得る。
こうしたミメティボディは、既知の技術を使用してＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストの式（Ｉ）の多様な部分を一緒に結合することにより、組換えＤＮＡ技術の既知技術を使用してＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストをコードする少なくとも１種の（すなわち１種若しくはそれ以上の）核酸分子を製造かつ発現することにより、または化学合成のようないずれかの他の適する方法を使用することにより製造し得る。
ヒトＥＰＯリガンド若しくは受容体に結合しかつ少なくとも１つの一部分で規定されるＨ若しくはＬ鎖可変領域を含んでなるミメティボディは、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところのファージディスプレイ（Ｋａｔｓｕｂｅ，Ｙ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ、１（５）：８６３−８６８（１９９８））のような適する方法若しくはトランスジェニック動物を使用する方法を使用して製造し得る。ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニスト、特定部分若しくはバリアントは、適する宿主細胞中でコードする核酸若しくはその部分を使用して発現させ得る。
好ましくは、こうしたミメティボディ若しくはそのリガンド結合フラグメントは、高親和性（例えば約１０−７Ｍ未満若しくはそれに等しいＫＤ）でヒトＥＰＯリガンド若しくは受容体を結合し得る。本明細書に記述される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換ならびにアミノ酸の欠失および／若しくは挿入を含んでなる配列を包含する。保存的アミノ酸置換は、第一のアミノ酸の特性に類似である化学および／若しくは物理特性（例えば電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第二のアミノ酸による第一のアミノ酸の置換を指す。保存的置換は以下の群、すなわちリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＤおよびＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）およびグリシン（Ｇ）；Ｆ、ＷおよびＹ；Ｃ、ＳおよびＴ内の別のものによる１アミノ酸の置換を包含する。
アミノ酸記号
本発明のミメティボディまたは特定部分若しくはバリアントを構成するアミノ酸はしばしば略記される。アミノ酸の呼称は、表に提示されるとおり、当該技術分野で十分に理解されるところのその一文字記号、その三文字記号、名称、若しくは３ヌクレオチコドン（１種若しくは複数）によりアミノ酸を呼称することにより示し得る（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第３版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９９４を参照されたい）。
本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、本明細書に明記されるところの天然の突然変異若しくは人的操作のいずれかからの１個若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは付加を包含し得る。本発明で使用し得るこうした若しくは他の配列は、限定されるものでないが、対応する配列番号３１〜７２を伴い２００４年６月１７日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１９７８３号明細書（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）の図１〜４１に対応する２００３年９月３０日に出願された米国仮出願第６０／５０７，３４９号明細書（本明細書に引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）の図１〜４２にさらに記述されるところの、表３に提示される以下の表を挙げることができる。これらの参照される図１〜４２（配列番号３１〜７２）、すなわち第ＰＣＴ ＵＳ０４／１９７８３号明細書の図１〜４１は、Ｈ／Ｌ鎖可変／定常領域配列、枠組み／サブドメインおよび置換の例を示し、それらの部分を本明細書に教示されるとおり本発明のＩｇ由来タンパク質で使用し得る。
もちろん、当業者が行うであろうアミノ酸置換の数は上に記述されたものを包含する多くの因子に依存する。一般的に言って、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストの少なくとも１種のアミノ酸置換、挿入若しくは欠失の数は、本明細書に明記されるとおり、１〜３０またはその中のいずれかの範囲若しくは値のよう
な、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１アミノ酸より大きくないことができる。
本発明のＥＰＯヒンジコアミメティボディの要素の以下の記述は、限定されるものでないがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなど、若しくはそれらのいずれかのサブクラス、またはそれらのいずれかの組合せを挙げることができる異なるタイプの免疫グロブリン分子を模倣する、本発明の式Ｉ
（（Ｖ（ｍ）−Ｐ（ｎ）−Ｌ（ｏ）−Ｈ（ｐ）−ＣＨ２（ｑ）−ＣＨ３（ｒ））（ｓ）
［ここで、Ｖは免疫グロブリン可変領域のＮ末端の少なくとも一部分であり、Ｐは少なくとも１種の生物活性ペプチドであり、Ｌは少なくとも１種のリンカーポリペプチドでありＨは少なくとも１種の免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２定常領域の少なくとも一部分であり、ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３定常領域の少なくとも一部分であり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは独立に０、１若しくは２と１０の間の整数である］
の使用に基づく。
本発明のヒンジコアミメティボディ中で、任意のＮ末端Ｖ部分は、２００４年６月１７日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１９７８３号明細書（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）の図１〜４１に対応する２００３年９月３０日に出願された米国仮出願第６０／５０７，３４９号明細書（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）の例えば図１〜９（配列番号３１〜３９）に提示されるところの少なくとも１種のＨ鎖可変枠組み１（ＦＲ１）領域若しくは例えば図１０〜３１（配列番号４０〜６１）に提示されるところの少なくとも１種のＬＣ可変領域（これらの図に提示されるところの置換、欠失若しくは挿入を包含する）の１〜２０アミノ酸を含み得、図５、６および８のものが好ましい。配列Ｑ−Ｘ−Ｑを含んでなる可変配列もまた好ましい。
Ｐ部分は、限定されるものでないが表１、配列番号１〜３０に提示されるもの、または当該技術分野で既知のところの、またはそれらのいずれかの組合せ若しくはコンセンサス配列、あるいはそれらのいずれかの融合タンパク質を挙げることができる、当該技術分野で既知若しくは本明細書に記述されるところの少なくとも１種のいずれかの治療的ペプチドを含み得る。
任意のリンカー配列は当該技術分野で既知のところのいずれの適するペプチドリンカーでもあり得る。好ましい配列は、ＧおよびＳのいずれかの組合せ、例えばＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘｎ（ここでＸはＧ若しくはＳであり得、そしてｎは５〜３０であり得る）を包含する。制限しない例はＧＳ、ＧＧＧＳ、ＧＳＧＧＧＳ、ＧＳＧＧＧＳＧＧなどを包含する。
本発明において、ＣＨ１部分は使用されず、そして、例えば２００４年６月１７日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１９７８３号明細書（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）の図１〜４１に対応する２００３年９月３０日に出願された米国仮出願第６０／５０７，３４９号明細書（本明細書に引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）の図１〜４２、および表３に言及されるとおり、ヒンジ領域のＮ末端から変動可能な数のアミノ酸が欠失される。本発明のミメティボディのヒンジコア部分に使用される変動可能な数のアミノ酸は、限定されるものでないが、例えば２００４年６月１７日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１９７８３号明細書（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）の図１〜４１に対応する２００３年９月３０日に出願された米国仮出願第６０／５０７，３４９号明細書（本明細書に引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）の図３２〜４０、若しくは上の表３に提示される
ところの少なくとも１個のヒンジ領域のＮ末端のアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７若しくは１〜３、２〜５、２〜７、２〜８、３〜９、４〜１０、５〜９、５〜１０、５〜１５、１０〜２０、２〜３０、２０〜４０、１０〜５０またはその中のいずれかの範囲若しくは値のいずれかの欠失、例えば、限定されるものでないが２００４年６月１７日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１９７８３号明細書（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）の図１〜４１に対応する２００３年９月３０日に出願された米国仮出願第６０／５０７，３４９号明細書（本明細書に引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）の図３２〜４０に記述される置換、挿入若しくは欠失を包含する、配列番号６２〜７０に対応する２００４年６月１７日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１９７８３号明細書（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）の図１〜４１に対応する２００３年９月３０日に出願された米国仮出願第６０／５０７，３４９号明細書（本明細書に引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）の図３２〜４０のアミノ酸９９〜１０５、９９〜１０８、９９〜１１１、９９〜１１２、９９〜１１３、９９〜１１４、９９〜１１５、９９〜１１９、９９〜１２５、９９〜１２８、９９〜１３４、９９〜１４０、９９〜１４３、９９〜１４９、９９〜１５５および９９〜１５８のアミノ酸９９〜１０１ないし１０５〜１５７のいずれかないし全部の欠失を挙げることができる。好ましい態様において、本発明のヒンジコア領域は、１個のＣｙｓ残基までしかしそれを包含しない若しくは配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓまでしかしそれを包含しない欠失を包含するヒンジコア領域を提供するためのヒンジ領域のＮ末端の欠失を包含する。さらなる好ましい態様において、本発明のヒンジコアミメティボディで使用されるこうしたヒンジコア配列は、アミノ酸１０９〜１１３若しくは１１２〜１１３（配列番号６６）（ＩｇＧ１）；１０５〜１１０若しくは１０９〜１１０（配列番号６７）（ＩｇＧ２）；１１１〜１６０、１１４〜１６０、１２０〜１６０、１２６〜１６０、１２９〜１６０、１３５〜１６０、１４１〜１６０、１４４〜１６０、１５０〜１６０、１５６〜１６０および１５９〜１６０（配列番号６８）（ＩｇＧ３）；または１０６〜１１０若しくは１０９〜１１０（配列番号６９）（ＩｇＧ４）を包含する。
ＣＨ２、ＣＨ３および任意のＣＨ４配列は、例えば、２００４年６月１７日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ０４／１９７８３号明細書（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）の図１〜４１に対応する２００３年９月３０日に出願された米国仮出願第６０／５０７，３４９号明細書（本明細書に引用することによりそっくりそのまま組み込まれる）の図１〜４２、および表３に提示されるところの、若しくは当該技術分野で既知のところのいずれかの適するヒト若しくはヒトｃｏｍｐａｔａｂｌｅ配列、または当該技術分野で既知のところの、あるいはそれらのいずれかの組合せ若しくはコンセンサス配列、あるいはそれらの融合タンパク質であり得る。
機能に不可欠である本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント中のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発若しくはアラニンスキャニング突然変異誘発（例えばＡｕｓｕｂｅｌ、上記、第８、１５章；ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））のような当該技術分野で既知の方法により同定し得る。後者の治療は分子中のすべての残基で単一アラニン突然変異を導入する。生じる変異体分子をその後、本明細書に明記されるか若しくは当該技術分野で既知のところの限定されるものでないが少なくとも１種のタンパク質関連の活性を挙げることができる生物学的活性について試験する。ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの結合に決定的に重要である部位は、結晶化、核磁気共鳴
若しくは光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））のような構造解析によってもまた同定し得る。
本発明のミメティボディまたは特定部分若しくはバリアントは、式（Ｉ）のＰ部分として、限定されるものでないが配列番号１〜３０の少なくとも１種の３ないし全部から選択される少なくとも１つの部分、配列若しくは組合せを含み得る。上の列挙された活性の少なくとも１種を高め若しくは維持し得る制限しないバリアントは、限定されるものでないが、前記ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストの適する生物学的活性若しくは機能に大きく影響を及ぼさない少なくとも１個の置換、挿入若しくは欠失に対応する少なくとも１個の突然変異をさらに含んでなる上のポリペプチドのいずれも挙げることができる。
ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、式（Ｉ）のＰ部分として少なくとも１種のポリペプチドの少なくとも１個の機能的部分、配列番号１〜３０の９０〜１００％の少なくとも１種をさらに場合によっては含み得る。ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストは、配列番号１〜３０の１種若しくはそれ以上から選択される式（Ｉ）のＰ部分のアミノ酸配列をさらに場合によっては含み得る。
一態様において、Ｐアミノ酸配列若しくはその部分は、配列番号１〜３０の少なくとも１種の対応する部分の対応するアミノ酸配列に対する約９０〜１００％の同一性（すなわち９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはその中のいずれかの範囲若しくは値）を有する。好ましくは、９０〜１００％のアミノ酸同一性（すなわち９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはその中のいずれかの範囲若しくは値）は、当該技術分野で既知のところの適するコンピュータアルゴリズムを使用して決定する。
本発明のミメティボディまたは特定部分若しくはバリアントは、本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントからのいずれかの数の連続するアミノ酸残基を含み得、その数は、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニスト中の連続する残基の数の１０〜１００％からよりなる整数の群から選択される。場合によっては、連続するアミノ酸のこの下位配列は、長さが少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０若しくはそれ以上のアミノ酸、またはその中のいずれかの範囲若しくは値である。さらに、こうした下位配列の数は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０のような１から２０までよりなる群から選択されるいずれかの整数若しくはそれ以上であり得る。
当業者が認識するであろうとおり、本発明は本発明の少なくとも１種の生物学的に活性のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを包含する。生物学的に活性のミメティボディまたは特定部分若しくはバリアントは、天然の（非合成の）、内因性の若しくは関連したおよび既知の挿入若しくは融合されたタンパク質または特定部分若しくはバリアントの比活性の少なくとも２０％、３０％若しくは４０％、および好ましくは少なくとも５０％、６０％若しくは７０％、ならびに最も好ましくは少なくとも８０％、９０％若しくは９５％〜１０００％の
比活性を有する。酵素活性および基質特異性の尺度のアッセイおよび定量方法は当業者に公知である。
別の局面において、本発明は、有機部分の共有結合により修飾されている本明細書に記述されるところのヒトミメティボディおよびリガンド結合フラグメントに関する。こうした修飾は、改良された薬物動態特性（例えば増大されたｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期）をもつＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたはリガンド結合フラグメントを生じ得る。該有機部分は、直鎖状若しくは分枝状の親水ポリマー基、脂肪酸基若しくは脂肪酸エステル基であり得る。特定の態様において、親水ポリマー基は約８００ないし約１２０，０００ダルトンの分子量を有し得、そしてポリアルカングリコール（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー若しくはポリビニルピロリドンであり得、また、脂肪酸若しくは脂肪酸エステル基は約８から約４０個までの炭素原子を含み得る。
本発明の修飾ミメティボディおよびリガンド結合フラグメントは、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントに直接若しくは間接的に共有結合されている１個若しくはそれ以上の有機部分を含み得る。本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたはリガンド結合フラグメントに結合されている各有機部分は、独立に親水ポリマー基、脂肪酸基若しくは脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用されるところの「脂肪酸」という用語はモノカルボン酸およびジカルボン酸を包含する。該用語が本明細書で使用されるところの「親水ポリマー基」は、オクタン中よりも水中でより溶解性である有機ポリマーを指す。例えばポリリシンはオクタン中よりも水中でより溶解性である。従って、ポリリシンの共有結合により修飾されたＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストが本発明により包含される。本発明のミメティボディを修飾するのに適する親水ポリマーは直鎖状若しくは分枝状であり得、そして例えばポリアルカングリコール（例えばＰＥＧ、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えばデキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えばポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド（例えばポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）およびポリビニルピロリドンを包含する。好ましくは、本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストを修飾する親水ポリマーは、別個の分子実体として約８００ないし約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ７５００、ＰＥＧ９０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ１２５００、ＰＥＧ１５０００およびＰＥＧ２０，０００（ここで下付き数字はポリマーの平均分子量（ダルトン）である）を使用し得る。
親水ポリマー基は１ないし約６個のアルキル、脂肪酸若しくは脂肪酸エステル基で置換し得る。脂肪酸若しくは脂肪酸エステル基で置換されている親水ポリマーは適する方法を使用することにより製造し得る。例えば、アミン基を含んでなるポリマーを脂肪酸若しくは脂肪酸エステルのカルボキシレートに結合し得、そして脂肪酸若しくは脂肪酸エステル上の活性化されたカルボキシレート（例えばＮ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化された）をポリマー上のヒドロキシル基に結合し得る。
本発明のミメティボディを修飾するのに適する脂肪酸および脂肪酸エステルは、飽和であり得るかまたは１個若しくはそれ以上の不飽和単位を含有し得る。本発明のミメティボディを修飾するのに適する脂肪酸は、例えばｎ−ドデカノエート（Ｃ１２、ラウレート）、ｎ−テトラデカノエート（Ｃ１４、ミリステート）、ｎ−オクタデカノエート（Ｃ１８、ステアレート）、ｎ−エイコサノエート（Ｃ２０、アラキデート）、ｎ−ドコサノエート（Ｃ２２、ベヘネート）、ｎ−トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタノ
エート（Ｃ４０）、ｃｉｓ−Δ９−オクタデカノエート（Ｃ１８、オレエート）、全ｃｉｓ−Δ５，８，１１，１４−エイコサテトラエノエート（Ｃ２０、アラキドネート）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などを包含する。適する脂肪酸エステルは直鎖状若しくは分枝状低級アルキル基を含んでなるジカルボン酸のモノエステルを包含する。該低級アルキル基は１から約１２まで、好ましくは１ないし約６個の炭素原子を含み得る。
修飾されたヒトミメティボディおよびリガンド結合フラグメントは、１種若しくはそれ以上の修飾剤との反応によるような適する方法を使用して製造し得る。該用語が本明細書で使用されるところの「修飾剤」は、活性化基を含んでなる適する有機基（例えば親水ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件下で第二の化学基と反応してそれにより修飾剤と該第二の化学基の間に共有結合を形成し得る化学部分すなわち官能基である。例えば、アミン反応性の活性化基は、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などのような求電子基を包含する。チオールと反応し得る活性化基は、例えばマレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などを包含する。アルデヒド官能基はアミン若しくはヒドラジドを含有する分子に結合し得、また、アジド基は三価のリン基と反応してホスホルアミデート若しくはホスホルイミド結合を形成し得る。分子への活性化基の適する導入方法は当該技術分野で既知である（例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：カリフォルニア州サンディエゴ（１９９６）を参照されたい）。活性化基は、有機基（例えば親水ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接、または、リンカー部分、例えば１個若しくはそれ以上の炭素原子が酸素、窒素若しくはイオウのようなヘテロ原子により置換され得る二価のＣ１−Ｃ１２基により結合し得る。適するリンカー部分は、例えばテトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−を包含する。リンカー部分を含んでなる修飾剤は、例えば、モノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えばモノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下に脂肪酸と反応させて遊離アミンと脂肪酸のカルボキシレートの間でアミド結合を形成することにより製造し得る。Ｂｏｃ保護基は、一級アミンを露出させるためのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により生成物から除去することができ、一級アミンは記述されるとおり別のカルボキシレートに結合させ得るか、若しくは無水マレイン酸と反応させ得そして生じる生成物を環化させて脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生じ得る。（例えばＴｈｏｍｐｓｏｎら、第ＷＯ ９２／１６２２１号明細書（その教示全体は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
本発明の修飾ミメティボディは、ヒトＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたはリガンド結合フラグメントを修飾剤と反応させることにより製造し得る。例えば、アミン反応性の修飾剤、例えばＰＥＧのＮＨＳエステルを使用することにより有機部分を部位非特異的様式でＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストに結合し得る。修飾ヒトミメティボディ若しくはリガンド結合フラグメントは、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたはリガンド結合フラグメントのジスルフィド結合（例えば鎖内ジスルフィド結合）を還元することによってもまた製造し得る。還元されたＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたはリガンド結合フラグメントをその後チオール反応性の修飾剤と反応させて、本発明の修飾ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストを製造し得る。本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアン
トの特定の部位に結合されている有機部分を含んでなる修飾ヒトミメティボディおよびリガンド結合フラグメントは、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、３：１４７−１５３（１９９２）；Ｗｅｒｌｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５：４１１−４１７（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３−２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２４（１）：５９−６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、５６（４）：４５６−４６３（１９９７））のような適する方法、およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：カリフォルニア州サンディエゴ（１９９６）に記述される方法を使用して製造し得る。
ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストの組成物
本発明はまた、天然に存在しない組成物、混合物若しくは形態で提供される、本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６種若しくはそれ以上のミメティボディまたはそれらの特定部分若しくはバリアントを含んでなる、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの組成物も提供する。こうした組成物のパーセンテージは、当該技術分野で既知若しくは本明細書に記述されるところの液体若しくは乾燥溶液（ｄｒｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、混合物、懸濁液、乳液またはコロイドとしての重量、容量、濃度、モル濃度若しくは重量モル濃度である。
こうした組成物は、限定されるものでないが０．００００１、０．００００３、０．００００５、０．００００９、０．０００１、０．０００３、０．０００５、０．０００９、０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４．、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％を挙げることができる、その中のいずれかの範囲若しくは値で当該技術分野で既知若しくは本明細書に記述されるところの液体、気体若しくは乾燥溶液、混合物、懸濁液、乳液またはコロイドとして０．００００１〜９９．９９９９重量、容量、濃度、モル濃度若しくは重量モル濃度パーセントを含み得る。本発明のこうした組成物は、従って限定されるものでないが０．００００１〜１００ｍｇ／ｍｌおよび／若しくは０．００００１〜１００ｍｇ／ｇを包含する。
該組成物は、場合によっては、抗感染薬、心血管（ＣＶ）系薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、気道薬、胃腸（ＧＩ）管薬、ホルモン薬、液体若しくは電解質バランスのための薬物、血液製剤、抗腫瘍薬、免疫調節薬、眼、耳若しくは鼻の薬物、局所薬、栄養薬などの少なくとも１種から選択される少なくとも１種の化合物若しくはタンパク質の有効量をさらに含み得る。本明細書に提示されるそれぞれの製剤、適応症、投薬および投与を包含するこうした薬物は当該技術分野で公知である（例えば、Ｎｕｒｓｉｎｇ ２００１ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ、第２１版、Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ Ｃｏｒｐ．、ペンシルバニア州スプリングハウス、２００１；Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｇｕｉｄｅ ２００１、Ｓｈａｎｎｏｎ、Ｗｉ
ｌｓｏｎ、Ｓｔａｎｇ編、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州アッパーサドルリバー；Ｐｈａｒｍｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｗｅｌｌｓら編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、コネチカット州スタンフォード（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい）。
本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの組成物は、限定されるものでないが希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどを挙げることができるいずれかの適する補助物質の少なくとも１種をさらに含み得る。製薬学的に許容できる補助物質が好ましい。こうした無菌溶液の制限しない例および製造方法は、限定されるものでないが、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（ペンシルバニア州イーストン）１９９０を挙げることができる当該技術分野で公知である。当該技術分野で公知若しくは本明細書に記述されるところのＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストの組成物の投与様式、溶解性および／若しくは安定性に適する製薬学的に許容できる担体を慣例に選択し得る。
本組成物で有用な製薬学的賦形剤および添加物は、限定されるものでないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質ならびに炭水化物（例えば、単糖、二、三、四およびオリゴ糖を包含する糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などのような誘導体化糖；ならびに多糖若しくは糖ポリマー）を挙げることができ、それらは単独で若しくは組合せで存在し得、単独若しくは組合せで１〜９９．９９重量若しくは容量％を含んでなる。例示的タンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを包含する。緩衝能力においてもまた機能し得る代表的なアミノ酸／ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどを包含する。１種の好ましいアミノ酸はグリシンである。
本発明での使用に適する炭水化物賦形剤は、例えば、果糖、麦芽糖、ガラクトース、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、ソルボースなどのような単糖；乳糖、ショ糖、トレハロース、セロビオースなどのような二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどのような多糖；およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルチトール）、ミオイノシトールなどのようなアルジトールを包含する。本発明での使用に好ましい炭水化物賦形剤はマンニトール、トレハロースおよびラフィノースである。
ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストの組成物は緩衝剤すなわちｐＨ調節剤もまた包含し得；典型的には緩衝剤は有機酸若しくは塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤は、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸若しくはフタル酸の塩のような有機酸の塩；トリス、塩酸トロメタミン若しくはリン酸緩衝液を包含する。本組成物での使用に好ましい緩衝剤はクエン酸塩のような有機酸塩である。
加えて、本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）（例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン）、ポリエチレングリコールのようなポリマー性賦形剤／添加物、香味料、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界
面活性剤（例えば「ＴＷＥＥＮ ２０」および「ＴＷＥＥＮ ８０」のようなポリソルベート）、脂質（例えばリン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えばコレステロール）ならびにキレート剤（例えばＥＤＴＡ）を包含し得る。
本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストの組成物での使用に適するこれらおよび付加的な既知の製薬学的賦形剤および／若しくは添加物は、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ、（１９９５）および「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ、ニュージャージー州モントベール（１９９８）（それらの開示は引用することに本明細書によりそっくりそのまま組み込まれる）に列挙されるとおり当該技術分野で既知である。好ましい担体若しくは賦形剤物質は炭水化物（例えば糖類およびアルジトール）ならびに緩衝剤（例えばクエン酸塩）若しくはポリマー剤である。
製剤
上に示されたとおり、本発明は、製薬学的に許容できる製剤中に少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを含んでなる、製薬学的若しくは家畜の使用に適する生理的食塩水若しくは選ばれた塩を含む適する緩衝剤を好ましくは包含し得る安定な製剤、ならびに、保存剤を含有する任意の保存される溶液および製剤ならびに多回使用の保存される製剤を提供する。保存される製剤は、水性希釈剤中に少なくとも１種の既知の若しくは少なくとも１種のフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールよりなる群から任意に選択される保存剤またはそれらの混合物を含有する。限定されるものでないが０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４．、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９またはその中のいずれかの範囲若しくは値を挙げることができる０．００１〜５％またはその中のいずれかの範囲若しくは値のような当該技術分野で既知のところのいかなる適する濃度若しくは混合物も使用し得る。制限しない例は、保存剤なし、０．１〜２％ｍ−クレゾール（例えば０．２、０．３．０．４、０．５、０．９、１．０％）、０．１〜３％ベンジルアルコール（例えば０．５、０．９、１．１．、１．５、１．９、２．０、２．５％）、０．００１〜０．５％チメロサール（例えば０．００５、０．０１）、０．００１〜２．０％フェノール（例えば０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５〜１．０％アルキルパラベン（１種若しくは複数）（例えば０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などを包含する。
上に示されたとおり、本発明は、包装資材、ならびに場合によっては水性希釈剤中の処方された緩衝剤および／若しくは保存剤とともに少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの溶液を含んでなる少なくとも１本のバイアルを含んでなる製品を提供し、前記包装資材
は、こうした溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間若しくはそれ以上にわたり保持し得ることを示すラベルを含んでなる。本発明はさらに、包装資材、凍結乾燥した少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを含んでなる第一のバイアル、および処方された緩衝剤若しくは保存剤の水性希釈剤を含んでなる第二のバイアルを含んでなる製品を含んでなり、前記包装資材は、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを水性希釈剤中で再構成して２４時間若しくはそれ以上の時間にわたり保持し得る溶液を形成することを患者に指図するラベルを含んでなる。
本発明で使用される少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、本明細書に記述されるか若しくは当該技術分野で既知であるとおり、哺乳動物細胞若しくはトランスジェニックの調製物からを包含する組換え手段により製造し得るか、または他の生物学的供給源から精製し得る。
本発明の生成物中の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの量の範囲は、再構成に際して生じる量、すなわち湿潤／乾燥系での場合は約１．０μｇ／ｍｌから約１０００ｍｇ／ｍｌまでの濃度を包含するとは言え、より低いおよびより高い濃度が操作可能であり、そして意図される送達ベヒクルに依存し、例えば、溶液製剤は、経皮貼付剤、肺、経粘膜、または浸透圧若しくはマイクロポンプ法と異なることができる。
好ましくは、水性希釈剤は製薬学的に許容できる保存剤を場合によってはさらに含んでなる。好ましい保存剤は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール若しくはそれらの混合物よりなる群から選択されるものを包含する。製剤中で使用される保存剤の濃度は抗菌効果を生じるのに十分な濃度である。こうした濃度は選択した保存剤に依存し、そして当業者により容易に決定される。
他の賦形剤、例えば等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存増強剤を場合によってはかつ好ましくは希釈剤に添加し得る。グリセリンのような等張剤は一般に既知濃度で使用する。生理学的に耐えられる緩衝剤を、好ましくは、改良されたｐＨ制御を提供するために添加する。製剤は、約ｐＨ４から約ｐＨ１０までのような広範囲のｐＨ、および約ｐＨ５から約ｐＨ９までの好ましい範囲、および約６．０ないし約８．０の最も好ましい範囲を包括し得る。好ましくは本発明の製剤は約６．８と約７．８の間のｐＨを有する。好ましい緩衝剤はリン酸緩衝液、最も好ましくはリン酸ナトリウム、とりわけリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を包含する。
Ｔｗｅｅｎ ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）およびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような製薬学的に許容できる可溶化剤、あるいはポリソルベート２０若しくは８０またはポロキサマー１８４若しくは１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ(R)多価アルコール（ｐｏｌｙｌ）、他のブロックコポリマーのような非イオン性界面活性剤、ならびにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡのようなキレート剤のような他の添加物を、凝集を低下させるために該製剤若しくは組成物に場合によっては添加し得る。これらの添加物は、ポンプ若しくはプラスチック容器を使用して製剤を投与する場合にとりわけ有用である。製薬学的に許容できる界面活性剤の存在はタンパク質が凝集する傾向を緩和する。
本発明の製剤は、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント、ならびにフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールよりなる群から選択される保存剤若しくはそれらの混合物を水性希釈剤中で混合することを含んでなる方法により製造し得る。少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントおよび保存剤を水性希釈剤中で混合することは、慣習的溶解および混合手順を使用して実施する。適する製剤を製造するため、例えば、緩衝溶液中の測定された量の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを、所望の濃度のタンパク質および保存剤を提供するのに十分な量の緩衝溶液中で所望の保存剤と組み合わせる。この方法の変形が当業者により認識されるであろう。例えば、成分を添加する順序、付加的な添加物を使用するかどうか、製剤を製造する温度およびｐＨは全部、使用される濃度および投与手段について最適化しうる因子である。
特許請求される製剤は、澄明な溶液として、あるいは、水性希釈剤中に水、保存剤ならびに／または賦形剤、好ましくはリン酸緩衝液および／若しくは生理的食塩水ならびに選ばれた塩を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥した少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントのバイアルを含んでなる２本のバイアルとして、患者に提供し得る。単一の溶液バイアル若しくは再構成を必要とする２本のバイアルのいずれも複数回再使用し得、かつ、単一若しくは複数周期の患者治療に十分であり得、そして従って現在利用可能よりも便宜的な治療計画を提供し得る。
本特許請求される製品は、即座ないし２４時間若しくはそれ以上の時間にわたり投与に有用である。従って現在特許請求される製品は患者に大きな利点を提供する。本発明の製剤は、場合によっては約２から約４０℃までの温度で安全に保存し得かつタンパク質の生物学的活性を長期間保持し得、従って６、１２、１８、２４、３６、４８、７２若しくは９６時間またはそれ以上の時間にわたり該溶液を保持かつ／若しくは使用し得ることを示す包装ラベルを可能にする。保存される希釈剤を使用する場合、こうしたラベルは１〜１２か月、半年、１年半および／若しくは２年の少なくとも１種までの使用を包含し得る。
本発明の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの溶液は、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを水性希釈剤中で混合することを含んでなる方法により製造し得る。混合することは慣習的溶解および混合手順を使用して実施する。適する希釈剤を製造するため、例えば、水若しくは緩衝液中の測定された量の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを、所望の濃度のタンパク質および場合によっては保存剤若しくは緩衝剤を提供するのに十分な量で組み合わせる。この方法の変形が当業者により認識されるであろう。例えば、成分を添加する順序、付加的な添加物を使用するかどうか、製剤を製造する温度およびｐＨは全部、使用される濃度および投与手段について最適化しうる因子である。
特許請求される製品は、澄明な溶液として、あるいは、水性希釈剤を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥した少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボデ
ィ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントのバイアルを含んでなる２本のバイアルとして、患者に提供し得る。単一の溶液バイアル若しくは再構成を必要とする二つの部分からなるバイアルのいずれも複数回再使用し得、かつ、単一若しくは複数周期の患者治療にとって十分であり得、従って現在入手可能なものよりも便宜的な治療計画を提供する。
特許請求される製品は、澄明な溶液、あるいは、水性希釈剤を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥した少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントのバイアルを含んでなる２本のバイアルを薬局、診察室若しくは他のこうした施設（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）および施設（ｆａｃｉｌｉｔｙ）に提供することにより患者に間接的に提供し得る。この場合の澄明な溶液は大きさが１リットル若しくはより大きくまででさえあり得、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの溶液のより小さい部分をより小さいバイアルへの移動のため１回若しくは複数回取り出し得かつ薬局若しくは診察室によりそれらの顧客および／若しくは患者に提供し得る大型のリザーバを提供する。
これらの単一バイアル系を含んでなる認識されるデバイスは、本発明での使用のための薬物溶液の送達のための単一若しくは二つの部分からなるバイアルのペン型注入器デバイスを包含し、ならびに、二つの部分からなるバイアル系を場合によってはさらに含んでよいことは、米国特許第６，２０３，５３０号、同第５，０２６，３４９号、同第５，５６７，１６０号、同第５，９５４，７３８号、同第５，８７９，３２７号、同第５，５９９，３０２号、同第６，０１５，４３８号、同第６，４６１，３３３号、同第６，５１７，５１７号、同第６，０７７，２４７号、同第６，０９９，５０４号、同第６，４２８，５２８号、同第６，３８７，０７８号、同第５，８６８，７１１号、同第５，９６０，７９７号、同第５，１７６，６４３号、同第５，２７１，７４４号、同第５，４０５，３６２号、同第５，４５１，２１０号、同第５，１３７，５１６号、同第５，１７６，６４３号、同第５，３００，０３０号、同第５，２９５，９６５号、同第５，４２５，７１５号、同第５，４７８，３１６号、同第５，５７５，７７７号、同第５，５９９，３０９号、同第５，６８１，２９１号、同第５，７０９，６６２号、同第５，７７９，６７７号、同第５，９１３，８４３号、同第５，８４３，０３６号、同第５，９５７，８９７号、同第６，４２８，５２８号、同第６，０８６，５６２号、同第６，０９９，５０３号、同第６，２２１，０４４号、同第６，２７０，４７９号、同第６，２５８，０６８号、同第６，３９１，００３号、同第６，２８０，４２１号、同第６，０４５，５３４号、同第６，３７１，９３９号、同第６，０９０，０７８号、同第５，２６７，９６３号、同第５，４８７，７３２号、同第５，４２５，７１５号、同第６，５７５，９３９号、同第６，５６５，５４０号、同第６，１５９，１８１号．同第６，１７９，８１２号、同第６，５４４，２３４号、同第６，５７２，５８１号、同第６，６７６，６３０号、同第６，０８３，１９７号、同第６，２０３，５３０号、同第６，２７０，４７９号、同第６，３７１，９３９号、同第５，５７５，７７７号、同第６，０９０，０７８号、同第６，７４３，１９９号、同第６，５８９，２１０号、同第６，６８９，０９３号、同第６，７８３，５０９号、同第６，６４５，１７０号、同第６，６４１，５５４号、同第６，７９６，９６７号、同第６，６４５，１８１号、同第６，６４１，５６５号、同第６，５７５，９３９号、同第６，５６９，１１５号、同第６，６７３，０４９号、同第６，６４１，５６０号、同第６，５６９，１２４号、同第６，６９９，２２０号、同第６，６３８，２５６号、同第６，６０７，５０８号、同第６，６０７，５１０号、同第６，７７６，７７７号、同第６，７６７，３３６号、同第６，５９５，９６２号、同第６，７４０，０６２号、同第６，５６５，５５３号、同第６，７４６，４２９号、同第６，５６９，１２３号、同第６，５９５，９５７号、同第６，７７０，０５６号明細書（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）に開示されるもののような当該技術分野で公知のところ
の薬物溶液の送達のためのカートリッジ中で凍結乾燥された薬物を再構成するためのペン型注入器デバイスを包含する。
現在特許請求される製品は包装資材を包含する。包装資材は、規制当局により必要とされる情報に加え該製品を使用し得る条件を提供する。本発明の包装資材は、２本のバイアルすなわち湿潤／乾燥製品について、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを水性希釈剤中で再構成して溶液を形成しかつ該溶液を２〜２４時間若しくはそれ以上の時間にわたり使用するための患者に対する説明書を提供する。単一バイアルの溶液製品について、ラベルはこうした溶液を２〜２４時間若しくはそれ以上の時間にわたり使用し得ることを示す。現在特許請求される製品はヒトの製薬学的製品の使用に有用である。
本発明の製剤は、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントおよび選択された緩衝液、好ましくは生理的食塩水若しくは選ばれた塩を含有するリン酸緩衝液を混合することを含んでなる方法により製造し得る。少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントおよび緩衝剤を水性希釈剤中で混合することは、慣習的な溶解および混合手順を使用して実施する。適する製剤を製造するため、例えば、水若しくは緩衝液中の測定された量の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを、所望の濃度のタンパク質および緩衝剤を提供するのに十分な量の水中の所望の緩衝剤と組み合わせる。この方法の変形が当業者により認識されるであろう。例えば、成分を添加する順序、付加的な添加物を使用するかどうか、製剤を製造する温度およびｐＨは全部、使用される濃度および投与手段について最適化し得る因子である。
特許請求される安定なすなわち保存される製剤は、澄明な溶液として、あるいは、水性希釈剤中に保存剤若しくは緩衝液および賦形剤を含有する第二のバイアルで再構成される凍結乾燥した少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントのバイアルを含んでなる２本のバイアルとして、患者に提供し得る。単一の溶液バイアル若しくは再構成を必要とする２本のバイアルのいずれも複数回再使用し得、かつ、単一若しくは複数周期の患者治療に十分であり得、そして従って現在利用可能よりも便宜的な治療計画を提供する。
本明細書に記述される安定なすなわち保存される製剤若しくは溶液のいずれか中の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、当該技術分野で公知のところの、ＳＣ若しくはＩＭ注入；経皮、肺、経粘膜、植込物、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプまたは当業者により認識される他の手段を包含する多様な送達方法を介して本発明により患者に投与し得る。
治療的応用
ミメティボディについての本発明はまた、細胞、組織、器官、動物若しくは患者におけるグルコース不耐症関連障害および／若しくは腎疾患関連の貧血の調節若しくは治療方法も提供する。
本発明はまた、細胞、組織、期間、動物若しくは患者におけるグルコース不耐症関連障害および／または腎疾患関連の貧血若しくは血液細胞関連の症状の調節若しくは治療方法も提供し、前記貧血若しくは血液細胞関連の症状は、限定されるものでないが免疫関連疾患、心血管疾患、感染性、悪性および／若しくは神経学的疾患の少なくとも１種を挙げることができる少なくとも１種と関連する。こうした方法は、場合によっては、こうした調
節、治療若しくは治療の必要な細胞、組織、器官、動物若しくは患者に少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを含んでなる少なくとも１種の組成物若しくは製薬学的組成物の有効量を投与することを含み得る。
本発明のいずれの方法も、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを含んでなる組成物若しくは製薬学的組成物の有効量をこうした調節、治療若しくは治療の必要な細胞、組織、器官、動物若しくは患者に投与することを含み得る。こうした方法は、場合によっては、こうした免疫疾患を治療するための共投与若しくは併用療法をさらに含み得、前記少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニスト、その特定部分若しくはバリアントの投与は、少なくとも１種のＴＮＦアンタゴニスト（限定されるものでないがＴＮＦ抗体若しくはフラグメント、可溶性ＴＮＦ受容体若しくはフラグメント、それらの融合タンパク質または小分子ＴＮＦアンタゴニストを挙げることができる）、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬（例えばアミノグリコシド、抗真菌薬、抗寄生虫薬、抗ウイルス薬、カルバペネム、セファロスポリン、フルロルキノロン（ｆｌｕｒｏｒｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗菌薬）、抗乾癬薬、コルチコステロイド、蛋白同化ステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐剤、抗潰瘍薬、緩下剤、抗凝固薬、エリスロピエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｉｅｉｔｉｎ）（例えばエポエチンα）、フィルグラスチム（例えばＧ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えばバシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節物質、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁薬、抗精神病薬、抗不安薬、睡眠薬、交感神経刺激薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息医薬品、βアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン若しくはアナログ、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカインあるいはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも１種の前同時および／若しくは後に投与することをさらに含んでなる。適する投薬量は当該技術分野で公知である。例えば、Ｗｅｌｌｓら編、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ、コネチカット州スタンフォード（２０００）；ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００、豪華版、Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、カリフォルニア州ロマリンダ（２０００）（それらの参考文献のそれぞれは引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。
本明細書で使用されるところの「腫瘍壊死因子抗体」、「ＴＮＦ抗体」、「ＴＮＦα抗体」若しくはフラグメントなどは、ＴＮＦα活性をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕおよび／若しくは好ましくはｉｎ ｖｉｖｏで低下、遮断、阻害、廃止若しくは妨害する。例えば、本発明の適するＴＮＦヒト抗体はＴＮＦαを結合し得、そして、抗ＴＮＦ抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびＴＮＦαに特異的に結合するそれらの指定される変異体若しくはドメインを包含する。適するＴＮＦ抗体若しくはフラグメントは、ＴＮＦのＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはタンパク質の合成、ＴＮＦ放出、ＴＮＦ受容体のシグナル伝達、膜ＴＮＦ切断、ＴＮＦ活性、ＴＮＦ産生および／若しくは合成もまた低下遮断、廃止、妨害、予防かつ／若しくは阻害し得る。
典型的には、病理学的症状の治療は、組成物に含有されるの比活性に依存して、合計で平均して用量あたり患者１キログラムあたり少なくとも約０．００１から５００ミリグラ
ムまでの少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント、および好ましくは単回若しくは複数回投与あたり患者１キログラムあたり少なくとも約０．０１から１００ミリグラムまでのＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの範囲になる少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストの組成物の有効量若しくは投薬量を投与することにより遂げられる。あるいは、有効血清濃度は単回若しくは複数回投与あたり０．００１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を含み得る。適する投薬量は医学実務者に既知であり、そしてもちろん特定の疾患症状、投与されている組成物の比活性および治療を受ける特定の患者に依存することができる。いくつかの例において、所望の治療量を達成するために、反復投与、すなわち所望の１日用量若しくは効果が達成されるまで個々の投与を反復する特定のモニター若しくは計測された用量の反復個別投与を提供することが必要であり得る。
好ましい用量は、場合によっては、投与あたり０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５．０．０６、０．０７、０．０８、００９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および／若しくは３０ｍｇ／ｋｇまたはそのいずれかの範囲、値若しくは画分を、あるいは、単回若しくは複数回投与あたり０．１、０．５、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、１．９、２．０、２．５、２．９、３．０、３．５、３．９、４．０、４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、２０、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４．０、１４．５、４．９、５．０、５．５．、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、１２、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４、１４．５、１５、１５．５、１５．９、１６、１６．５、１６．９、１７、１７．５、１７．９、１８、１８．５、１８．９、１９、１９．５、１９．９、２０、２０．５、２０．９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００および／若しくは５０００μｇ／ｍｌの血清濃度またはそのいずれかの範囲、値若しくは画分の血清濃度を達成するように包含し得る。
あるいは、投与される投薬量は、特定の剤の薬動力学的特徴ならびにその投与様式および経路；受領者の齢、健康症状および重量；症状の性質および程度、付随する治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果のような既知の因子に依存して変動し得る。通常、有効成分の投薬量は体重１キログラムあたり約０．１ないし１００ミリグラムであり得る。投与あたり若しくは除放性の形態で１キログラムあたり通常０．１ないし５０、および好ましくは０．１ないし１０ミリグラムが所望の結果を得るのに有効である。
制限しない一例として、ヒト若しくは動物の治療は、単一、注入、若しくは反復用量を使用して、第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０日の少なくとも１つ、または、あるいは第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０週の少なくとも１つあるいはそれらのいずれかの組合せに、本発明の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコア
ミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの一時若しくは定期的投薬量として１日あたり０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｍｇ／ｋｇのような０．０１ないし１００ｍｇ／ｋｇを提供し得る。
内的投与に適する投薬形態物（組成物）は、一般に、単位若しくは容器あたり約０．０００１ミリグラムから約５００ミリグラムまでの有効成分を含有する。これらの製薬学的組成物中で、有効成分は通常組成物の総重量に基づき約０．５〜９５重量％の量で存在することができる。
非経口投与のためには、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを、製薬学的に許容できる非経口ベヒクルとともに溶液、懸濁剤、乳剤若しくは凍結乾燥粉末として処方し得るかまたは別個に提供し得る。こうしたベヒクルの例は水、生理的食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンである。リポソーム、および不揮発性油のような非水性ベヒクルもまた使用しうる。ベヒクル若しくは凍結乾燥粉末は、等張性（例えば塩化ナトリウム、マンニトール）ならびに化学的安定性（例えば緩衝剤および保存剤）を維持する添加物を含有しうる。該製剤は既知の若しくは適する技術により滅菌する。
適する製薬学的担体は、この分野の標準的参照教科書、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａ．Ｏｓｏｌの最新版に記述されている。
治療的投与
製薬学的有効量の本発明の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを投与するのに多くの既知のおよびの開発されたの様式を本発明により使用し得る。肺投与を以下の記述で使用する一方、他の投与様式を、適する結果を伴い本発明により使用し得る。
本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストは、この中に（ｈｅｒｅ ｗｉｔｈｉｎ）記述されるか若しくは当該技術分野で既知の吸入若しくは他の様式による投与に適する多様なデバイスおよび方法のいずれかを使用して、担体中で溶液、乳剤、コロイド若しくは懸濁剤としてまたは粉末として送達し得る。
非経口製剤および投与
非経口投与のための製剤は、共通の賦形剤として滅菌水若しくは生理的食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含有し得る。注入のための水性若しくは油性懸濁剤は、既知の方法に従って適切な乳化剤若しくは湿潤剤および懸濁化剤を使用することにより製造し得る。注入のための剤は、水性溶液または溶媒中の無菌の注入可能な溶液若しくは懸濁液のような非毒性の経口で投与可能でない希釈剤であり得る。使用可能なベヒクル若しくは溶媒として、水、リンゲル液、等張食塩水などが許容され；通常の溶媒若しくは懸濁化溶媒として無菌の不揮発性油を使用し得る。これらの目的上、天然のまたは合成若しくは半合成の脂肪油若しくは脂肪酸；天然のまたは合成若しくは半合成のモノ若しくはジ若しくはトリグリセリドを包含するいかなる種類の不揮発性油および脂肪酸も使用し得る。非経口投与は当該技術分野で既知であり、そして、限定されるものでないが慣習的注入手段、米国特許第５，８５１，１９８号明細書に記述されるところのガス加圧式無針注入デバイス、および米国特許第５，８３９，４４６号明細書（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込ま
れる）に記述されるところのレーザー穿孔器デバイスを挙げることができる。
代替送達
本発明はさらに、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの非経口、皮下、筋肉内、静脈内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮手段による投与に関する。ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分またはバリアントの組成物は、非経口（皮下、筋肉内若しくは静脈内）投与のためとりわけ液体の溶液若しくは懸濁液の形態で；膣若しくは直腸投与での使用のためとりわけクリーム剤および坐剤のような半固形の形態で；頬側若しくは舌下投与のためとりわけ錠剤若しくはカプセル剤の形態で；あるいはとりわけ粉末、点鼻薬若しくはエアゾルまたはある種の剤の形態で鼻内で；あるいは、皮膚構造を改変するか若しくは経皮貼付剤中の薬物濃度を増大させるかのいずれかのためのジメチルスルホキシドのような化学的増強剤を含む（“Ｄｒｕｇ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ”；Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．編中Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒら、ｐｐ．５９−９０（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．ニューヨーク １９９４（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）））、あるいはタンパク質およびペプチドを含有する製剤の皮膚上への塗布（第ＷＯ
９８／５３８４７号明細書）または電気穿孔のような一過性輸送経路を創製するか若しくはイオントフォレーシスのような皮膚を通る荷電した薬物の移動性を増大させるための電場の適用、あるいはソノフォレーシスのような超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号および同第４，７６７，４０２号明細書）（上の刊行物および特許は引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を可能にする酸化剤を含む、とりわけゲル剤、軟膏剤、ローション剤、懸濁剤若しくは貼付剤送達系の形態で経皮での使用のため製造し得る。
肺／鼻投与
肺投与のため、好ましくは少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの組成物は、肺の下部気道若しくは洞（ｓｉｎｕｓｅｓ）に達するために有効な粒子径で送達される。本発明により、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントは、吸入による治療薬の投与のための当該技術分野で既知の多様な吸入若しくは鼻デバイスのいずれかにより送達し得る。患者の副鼻腔洞（ｓｉｎｕｓ ｃａｖｉｔｙ）若しくは肺胞中にエアゾル化製剤を沈着させることが可能なこれらのデバイスは、定量噴霧式吸入器、ネブライザー、乾燥粉末発生デバイス、噴霧器などを包含する。ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの肺若しくは鼻投与を指図するのに適する他のデバイスもまた当該技術分野で既知である。全部のこうしたデバイスは、エアゾル中のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの分注のための投与に適する製剤の使用し得る。こうしたエアゾルは溶液（水性および非水性双方）若しくは固体粒子のいずれかから構成し得る。Ｖｅｎｔｏｌｉｎ(R)定量噴霧式吸入器のような定量噴霧式吸入器は典型的に噴射剤ガスを使用し、そして吸気の間の起動を必要とする（例えば第ＷＯ ９４／１６９７０号、同第ＷＯ ９８／３５８８８号明細書を参照されたい）。Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより市販されるデバイス、ＴｕｒｂｕｈａｌｅｒＴＭ（Ａｓｔｒａ）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ(R)（Ｇｌａｘｏ）、Ｄｉｓｋｕｓ(R)（Ｇｌａｘｏ）、ＳｐｉｒｏｓＴＭ吸入器（Ｄｕｒａ）のような乾燥粉末吸入器およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ(R)粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ）は混合粉末の呼吸起動を使用する（米国特許第ＵＳ ４６６８２１８号 Ａｓｔｒａ、欧州特許第ＥＰ ２３７５０７号 Ａｓｔｒａ、第ＷＯ ９７／２５０８６号 Ｇｌａｘｏ、第ＷＯ ９４／０８５５２号 Ｄｕｒａ、米国特許第ＵＳ ５４５８１３５号 Ｉｎｈａｌｅ、第ＷＯ ９４／０６４９８号 Ｆｉｓｏｎｓ（引用することにより本
明細書にそっくりそのまま組み込まれる））。ＡＥＲｘＴＭ Ａｒａｄｉｇｍ、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ(R)ネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）およびＡｃｏｒｎ ＩＩ(R)ネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（米国特許第ＵＳ
５４０４８７１号 Ａｒａｄｉｇｍ、第ＷＯ ９７／２２３７６号明細書）（上の参考文献は引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）のようなネブライザーは溶液からエアゾルを生じさせる一方、定量噴霧式吸入器、乾燥粉末吸入器などは小粒子エアゾルを生成させる。商業的に入手可能な吸入デバイスのこれらの特定の例は本発明の実務に適する特定のデバイスの代表例であることを意図しており、そして本発明の範囲を制限するとして意図していない。好ましくは、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを含んでなる組成物は乾燥粉末吸入器若しくは噴霧器により送達される。本発明の少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを投与するための吸入デバイスのいくつかの望ましい特徴が存在する。例えば、吸入デバイスによる送達は有利に信頼でき、再現可能かつ正確である。吸入デバイスは、場合によっては、良好な呼吸可能性のため小乾燥粒子、例えば約１０μｍ未満、好ましくは約１〜５μｍを送達し得る。
ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの組成物のスプレー剤としての投与
ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質を包含するスプレー剤は、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの懸濁液若しくは溶液に加圧下にノズルを通させることにより生じさせ得る。ノズルの大きさおよび構成、適用される圧ならびに液体フィード速度は所望の出力および粒子径を達成するように選ぶことができる。例えばキャピラリー若しくはノズルフィードとともにの電場により電気スプレーを生じさせ得る。有利には、噴霧器により送達される少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍないし５μｍ、および最も好ましくは約２μｍないし約３μｍの範囲の粒子径を有する。
噴霧器を用いる使用に適する少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の製剤は、典型的に、溶液１ｍｌあたり約１ｍｇないし約２０ｍｇの少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の濃度で水性溶液中にＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質を包含する。該製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、保存剤、界面活性剤および好ましくは亜鉛のような剤を包含し得る。該製剤はまた、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質若しくは炭水化物のような、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の安定化のための賦形剤若しくは剤も包含し得る。ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の処方において有用なバルクタンパク質はアルブミン、プロタミンなどを包含する。ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の処方において有用な典型的な炭水化物は、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、ブドウ糖などを包含する。ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の製剤はまた、エアゾルの形成における溶液の霧化により引き起こされるＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバ
リアント組成物タンパク質の表面誘発性凝集を低下若しくは予防し得る界面活性剤も包含し得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコールならびにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルのような多様な慣習的界面活性剤を使用し得る。量は一般に製剤の０．００１と１４重量％の間の範囲にわたることができる。本発明の目的上とりわけ好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。ミメティボディまたは特定部分若しくはバリアントのようなタンパク質の製剤について当該技術分野で既知の付加的な剤もまた製剤中に包含し得る。
ネブライザーによるＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの組成物の投与
ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質は、ジェットネブライザー若しくは超音波ネブライザーのようなネブライザーにより投与し得る。典型的には、ジェットネブライザー中では圧縮空気供給源を使用してオリフィスを通して高速空気ジェットを創製する。ガスがノズルを超えて膨脹する際に低圧領域が創製され、それが液体リザーバに接続された毛細管を通してＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の溶液を引き出す。毛細管からの液体流はそれが管を出る際に不安定な糸状体および液滴に剪断されてエアゾルを創製する。ある範囲の構成、流速およびバッフル型を使用して所定のジェットネブライザーから所望の性能の特徴を達成し得る。超音波ネブライザーでは、高周波電気エネルギーを使用して、典型的には圧電トランスを使用して振動性の力学的エネルギーを創製する。このエネルギーが、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の製剤に直接若しくはカップリング液によるかのいずれかで伝播され、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質を包含するエアゾルを創製する。有利には、ネブライザーにより送達されるＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍないし約５μｍ、および最も好ましくは約２μｍないし約３μｍの範囲の粒子径を有する。
ジェット若しくは超音波いずれかのネブライザーを用いる使用に適する少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの製剤は、典型的には溶液１ｍｌあたり約１ｍｇないし約２０ｍｇの少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントタンパク質の濃度で水性溶液中にＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質を包含する。該製剤は賦形剤、緩衝剤、等張剤、保存剤、界面活性剤、および好ましくは亜鉛のような剤を包含し得る。該製剤はまた、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質若しくは炭水化物のような、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の安定化のための賦形剤若しくは剤も包含し得る。少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の処方において有用なバルクタンパク質はアルブミン、プロタミンなどを包含する。少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの処方において有用な典型的な炭水化物は、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、ブドウ糖などを包含する。少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの製剤は、エアゾルの形成において溶液の霧化により引き起こされる少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボデ
ィ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの表面誘発性凝集を低下若しくは予防し得る界面活性剤もまた包含し得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコールならびにポリオキシエチレンソルビタル脂肪酸エステルのような多様な慣習的界面活性剤を使用し得る。量は一般に製剤の０．００１と４重量％の間の範囲にわたることができる。本発明の目的上とりわけ好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントタンパク質のようなタンパク質の製剤について当該技術分野で既知の付加的な剤もまた製剤中に包含し得る。
定量噴霧式吸入器によるＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの組成物の投与
定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）中では、噴射剤、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント、およびいずれかの賦形剤若しくは他の添加物が、液化圧縮ガスを包含する混合物としてキャニスター中に含有される。計量バルブの起動が、好ましくは約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍないし約５μｍ、および最も好ましくは約２μｍないし約３μｍの大きさ範囲の粒子を含有するエアゾルとして該混合物を放出する。所望のエアゾル粒子径は、ジェットミル粉砕、噴霧乾燥、臨界点凝縮などを包含する当業者に既知の多様な方法により製造されるＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアント組成物タンパク質の製剤を使用することにより得ることができる。好ましい定量噴霧式吸入器は、３Ｍ若しくはＧｌａｘｏにより製造されかつハイドロフルオロカーボン噴射剤を使用するものを包含する。
定量噴霧式吸入器デバイスを用いる使用のための少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの製剤は、一般に、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを例えば界面活性剤の助けを借りて噴射剤中に懸濁した非水性媒体中の懸濁液として含有する微粉を包含することができる。噴射剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタン、ＨＦＡ−１３４ａ（ヒドロフルオロアルカン−１３４ａ）、ＨＦＡ−２２７（ヒドロフルオロアルカン−２２７）などを包含するクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン若しくは炭化水素のような本目的上使用されるいずれの慣習的物質でもあり得る。好ましくは噴射剤はヒドロフルオロカーボンである。界面活性剤は、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを噴射剤中の懸濁液として安定化させる、有効成分を化学的分解に対し保護する、などのために選ぶことができる。適する界面活性剤はソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、オレイン酸などを包含する。いくつかの場合には、エタノールのような溶媒を使用する溶液エアゾルが好ましい。タンパク質のようなタンパク質の製剤について当該技術分野で既知の付加的な剤もまた該製剤に包含し得る。
当業者は、本発明の方法を、本明細書に記述されないデバイスを介する少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの組成物の肺投与により達成し得ることを認識するであろう。
粘膜製剤および投与
粘膜表面を通る吸収のため、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを投与する組成物および方法は、乳剤粒子の粘膜付着を達成することにより粘膜表面を通る吸収を促進する
複数のサブミクロン粒子、粘膜付着性巨大分子、生物活性ペプチドおよび水性連続層を含んでなる乳剤を包含する（米国特許第５，５１４，６７０号明細書）。本発明の乳剤の適用に適する粘膜表面は、角膜、結膜、頬側、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸および直腸の投与経路を包含し得る。膣若しくは直腸投与のための製剤例えば坐剤は、賦形剤として例えばポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオバターなどを含有し得る。鼻内投与のための製剤は固体であり得、そして賦形剤として例えば乳糖を含有し得るか、または点鼻薬の水性若しくは油性溶液であり得る。頬側投与のためには、賦形剤は糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、予め糊化した（ｐｒｅｇｅｌｉｎａｔｉｎｅｄ）デンプンなどを包含する（米国特許第５，８４９，６９５号明細書）。
経口製剤および投与
経口のための製剤は、腸壁の浸透性を人工的に増大させるための補助物質（例えばレゾルシノール、ならびにポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤）の共投与、ならびに酵素的分解を阻害するための酵素阻害剤（例えば膵トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＦ）およびトラシロール）の共投与に頼る。経口投与のための固体型投薬形態物の有効構成成分を、ショ糖、乳糖、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成若しくは半合成のポリマーおよびグリセリドを包含する少なくとも１種の添加物と混合し得る。これらの投薬形態物は他の型（１種若しくは複数）の添加物、例えば不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、パラベン、ソルビン酸、アスコルビン酸、α−トコフェロールのような保存剤、システインのような抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味料、着香料、香料などもまた含有し得る。
錠剤および丸剤は腸溶コーティング製剤にさらに加工し得る。経口投与のための液体製剤は医学的使用に許容できる乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤および溶液製剤を包含する。これらの製剤は前記分野で通常使用される不活性希釈剤例えば水を含有しうる。リポソームもまたインスリンおよびヘパリンの薬物送達系として記述されている（米国特許第４，２３９，７５４号明細書）。より最近、混合アミノ酸の人工的ポリマー（プロテイノイド）のミクロスフェアが医薬品を送達するために使用されている（米国特許第４，９２５，６７３号明細書）。さらに、米国特許第５，８７９，６８１号および同第５，５，８７１，７５３号明細書に記述されるように、生物学的有効成分を経口で送達するために使用される担体化合物は、当該技術分野で既知である。
経皮製剤および投与
経皮投与のためには、少なくとも１種のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを、リポソームまたはポリマーナノ粒子、微小粒子、マイクロカプセル若しくはミクロスフェア（別の方法で述べられない限り集合的に微小粒子と称される）のような送達デバイス中に被包化する。ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそれらのコポリマーのようなポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物ならびにポリホスファゼンのような合成ポリマー、ならびにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミンおよび他のタンパク質、アルギン酸塩ならびに他の多糖のような天然のポリマー、ならびにそれらの組合せから作成される微小粒子を包含する多数の適するデバイスが既知である（米国特許第５，８１４，５９９号明細書）。
長時間投与および製剤
本発明の化合物を単一投与から長時間にわたり、例えば１週ないし１年間被験体に送達することがときに望ましいことがあり得る。多様な持続放出デポー若しくは植込投薬形態物を利用し得る。例えば、投薬形態物は、体液中で低い程度の溶解性を有する化合物の製
薬学的に許容できる非毒性の塩、例えば（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ若しくはジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような多塩基性酸との酸付加塩；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどのような多価金属陽イオン、または例えばＮ，Ｎ’−ジベンジル−エチレンジアミン若しくはエチレンジアミンから形成される有機陽イオンとの塩；あるいは（ａ）および（ｂ）の組合せ、例えば亜鉛タンニン酸塩を含有し得る。加えて、本発明の化合物、若しくは好ましくはたった今記述されたもののような比較的不溶性の塩を、注入に適する例えばゴマ油とともにゲル例えばモノステアリン酸アルミニウムゲル中で処方し得る。とりわけ好ましい塩は、亜鉛塩、亜鉛タンニン酸塩、パモ酸塩などである。注入のための別の型の持続放出デポー製剤は、例えば米国特許第３，７７３，９１９号明細書に記述されるところのポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーのようなゆっくりと分解する非毒性の非抗原性ポリマー中に被包化されるために分散された化合物若しくは塩を含有することができる。該化合物、若しくは好ましくは上述されたもののような比較的不溶性の塩は、とりわけ動物での使用のためコレステロールマトリックスのシラスティックペレット中でもまた処方し得る。付加的な持続放出デポー若しくは植込製剤、例えば気体若しくは液体リポソームが文献（米国特許第５，７７０，２２２号明細書、および“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ”、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９７８）で既知である。
本発明を全般的に記述したので、それは、具体的説明として提供されかつ制限するとして意図していない以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろう。
糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）にＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）若しくは陰性対照ＭＭＢ（ペプチドを欠く）を静脈内投与した。Ａ．ＩＰＧＴＴを投与１０分後に行った。Ｂ．ＩＰＧＴＴを投与７日後に行った。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）若しくは陰性対照ＭＭＢ（ペプチドを欠く）を静脈内投与した。Ａ．ＩＰＧＴＴを投与１０分後に行った。Ｂ．ＩＰＧＴＴを投与７日後に行った。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）若しくは陰性対照ＭＭＢ（ペプチドを欠く）を静脈内投与した。投与７日後に動物を殺しかつ血液（ｂｌｏｏｄ）。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＢＳを静脈内投与した。ＩＰＧＴＴを１０分（Ａ）７日（Ｂ）、１４日（Ｃ）、２１日（Ｄ）、２８日（Ｅ）、３５日（Ｆ）後に行った。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＢＳを静脈内投与した。動物を多様な時間後に殺し、そして血液学測定のため血液を収集した。ヘモグロビン濃度を示すＡ．投与後２１日Ｂ．２８日およびＣ．３５日。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＢＳを静脈内投与した。動物を多様な時間後に殺し、そしてインスリン測定のため血液を収集した。循環インスリン濃度を示すＡ．投与後２１日Ｂ．２８日およびＣ．３５日。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にＥＰＯ（０．０３、０．１、０．３ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＢＳを静脈内投与した。ＩＰＧＴＴを５日後に行った。（Ａ）ＩＰＧＴＴを通じてのグルコース濃度（Ｂ）Ａからの曲線下面積。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にＥＰＯ（０．０３、０．１、０．３ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＢＳを静脈内投与した。（Ａ）ヘモグロビンおよび（Ｂ）網状赤血球を５日後に測定した。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にダルベポエチン（０．０１、０．０３、０．１ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＢＳを静脈内投与した。ＩＰＧＴＴを７日後に行った。（Ａ）ＩＰＧＴＴを通じてのグルコース濃度（Ｂ）Ａからの曲線下面積。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にダルベポエチン（０．０１、０．０３、０．１ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＢＳを静脈内投与した。空腹時血糖を７日後に測定した。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にダルベポエチン（０．０３、０．１、０．３ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＢＳを静脈内投与した。（Ａ）ヘモグロビンおよび（Ｂ）網状赤血球を７日後に測定した。 野生型（Ｃ５７Ｂ１６マウス）またはヒトＥＰＯを過剰発現するトランスジェニックマウス（ヘテロ接合体若しくはホモ接合体）の空腹時血糖。 野生型（Ｃ５７Ｂ１６マウス）またはヒトＥＰＯを過剰発現するトランスジェニックマウス（ヘテロ接合体若しくはホモ接合体）でのＧＴＴ。 糖尿病マウス（ＤＩＯ）にＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）若しくはＰＢＳを静脈内投与した。グルコース（Ａ）およびインスリン濃度（Ｂ）を一夜絶食後およびグルコース投与２０分後に測定した。 図１４に示される空腹時グルコースおよびインスリン濃度を使用してＨＯＭＡを計算した。 ６．０の上の基礎ＨｂＡ１Ｃレベルを伴う患者でのヘモグロビンに対するＥＰＯ投与の影響。 ６．０の上基礎ＨｂＡ１Ｃレベルを伴う患者でのヘモグロビンＡ１Ｃに対するＥＰＯ投与の影響。 ６．０の上の基礎ＨｂＡ１Ｃレベルを伴う患者での空腹時血糖に対するＥＰＯ投与の影響。 ６の上の基礎ＨｂＡ１Ｃレベルの差違に基づくＨｂＡ１Ｃレベルに対するＥＰＯ投与の影響。 １〜２および４〜６か月のＨｂＡ１Ｃレベルに対するＥＰＯ投与および基礎ＨｂＡ１Ｃレベルの影響（長期データ） 基礎（ＥＰＯ投与２か月前）およびその後の時間区分（１〜３か月および４〜６か月）でデータが入手可能であった患者における１〜２および４〜６か月の空腹時血糖値に対するＥＰＯの影響。
哺乳動物細胞中でのＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストのクローニングおよび発現
典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する少なくとも１個のプロモーター領域、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントのコーディング配列、ならびに転写の終止および転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルを含有する。付加的なエレメントは、エンハンサー、コザック配列、ならびにＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター部位により隣接される介在配列を包含する。高度に効率的な転写は、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター、レトロウイルス例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの末端反復配列（ＬＴＲＳ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターで達成し得る。しかしながら細胞エレメントもまた使用し得る（例えばヒトアクチンプロモーター）。本発明の実施における使用に適する発現ベクターは、例えばｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ若しくはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｓ、カリフォルニア州パロアルト）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）若しくはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬおよびＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン・ウプサラ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）ならびにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターを包含する。使用し得る哺乳動物宿主細胞は、ヒトＨｅｌａ ２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １、Ｃｏｓ ７およびＣＶ １、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を包含する。
あるいは、遺伝子は染色体中に組込まれた遺伝子を含有する安定細胞株中で発現させ得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン若しくはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーとのコトランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
トランスフェクトされた遺伝子は、大量のコードされるＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントを発現させるためにまた増幅もし得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカーは、数百若しくは数千コピーさえの目的の遺伝子を保有する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカーは酵素グルタミン合成酵素（ＧＳ）（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））である。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させそして最高の耐性を伴う細胞を選択する。これらの細胞株は染色体中に組込まれた増幅された遺伝子（１種若しくは複数）を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞がＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの製造にしばしば使用される。
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７（１９８５））およびＣＭＶ−エンハンサーの１フラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を含有する。例えば制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７ｌ８を含むマルチクローニング部位が目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターは、３’イントロンに加えラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化および終止シグナルを含有する。
ＣＨＯ細胞でのクローニングおよび発現
ベクターｐＣ４を、ＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントの発現に使用する。プラスミドｐＣ４はプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。該プラスミドはＳＶ４０初期プロモーターの制御下にマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣若しくは他の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地（例えばα−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲイタースバーク）中で細胞を増殖させることにより選択し得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性の細胞中でのＤＨＦＲ遺伝子の増幅は十分に報告されている（例えば、Ｆ．Ｗ．Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｊ．Ｌ．ＨａｍｌｉｎとＣ．Ｍａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０９７：１０７−１４３（１９９０）；およびＭ．Ｊ．ＰａｇｅとＭ．Ａ．Ｓｙｄｅｎｈａｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参照されたい）。増大する濃度のＭＴＸ中で増殖させた細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することにより該薬物に対する耐性を発生する。第二の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、それは通常共増幅かつ過剰発現される。１，０００コピー以上の増幅された遺伝子（１種若しくは複数）を保有する細胞株を開発するのにこのアプローチを使用し得ることが当該技術分野で既知である。その後、メトトレキサートを取り去る場合に、宿主細胞の１個若しくはそれ以上の染色体に組込まれた増幅された遺伝子を含有する細胞株が得られる。
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子を発現させるために、ラウス肉腫ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７（１９８５））およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハンサーから単離された１フラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を含有する。プロモーターの下流に、遺伝子の組込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７ｌ８制限酵素切断部位がある。これらのクローニング部位の後に該プラスミドはラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含有する。他の高効率プロモーター、例えばヒトｂ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期若しくは後期プロモーターまたは他のレトロウイルス例えばＨＩＶおよびＨＴＬＶＩからの末端反復配列もまた発現に使用し得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系ならびに類似の系を、ＥＰＯを哺乳動物細胞中で調節された方法で発現させるのに使用し得る（Ｍ．ＧｏｓｓｅｎとＨ．Ｂｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のため、例えばヒト成長ホルモン若しくはグロビン遺伝子からの他のシグナルを同様に使用し得る。染色体中に組込まれた目的の遺伝子を保有する安定細胞株は、ｇｐｔ、Ｇ４１８若しくはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーとのコトランスフェクションに際してもまた選択し得る。初めに１種以上の選択可能なマーカー、例えばＧ４１８およびメトトレキサートを使用することが有利である。
プラスミドｐＣ４を制限酵素で消化し、そしてその後当該技術分野で既知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。ベクターをその後１％アガロースゲルから単離する。
本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストのＨＣおよびＬＣ可変領域に対応する完全なＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ若しくは他のＥＰＯ受容体アゴニストまたは特定部分若しくはバリアントをコードするＤＮＡ配列を、既知の方法の段階に従って使用する。適するヒト定常領域（すなわちＨＣおよびＬＣ
領域）をコードする単離された核酸もまた本構築物中で使用する。
単離された可変および定常領域をコードするＤＮＡならびに脱リン酸化したベクターをその後Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１若しくはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞をその後形質転換し、そして例えば制限酵素分析を使用してプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含有する細菌を同定する。
活性のＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクションを使用して０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏとコトランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは、支配的選択可能マーカー、すなわちＧ４１８を包含する抗生物質の一群に対する耐性を賦与する酵素をコードするＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子を含有する。１μｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したα−ＭＥＭに細胞を播種する。２日後に細胞をトリプシン処理し、そして１０、２５若しくは５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１μｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したα−ＭＥＭ中でハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、独国）に播種する。約１０〜１４日後に単一クローンをトリプシン処理し、そしてその後多様な濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して６ウェルペトリ皿若しくは１０ｍｌフラスコに播種する。最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンをその後なおより高濃度のメトトレキサート（１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含有する新たな６ウェルプレートに移す。１００〜２００ｍＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで同一の手順を反復する。所望の遺伝子産物の発現を例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット若しくは逆相ＨＰＬＣ分析により分析する。
本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディの制限しない例
背景：ＥＭＰ−１（ＥＰＯ模倣ペプチド−１）は、ヒトエリスロポエチン（ＨｕＥＰＯ）に対する配列相同性をもたないがしかしＥＰＯ受容体を活性化する能力（二量体として）をもつ２０アミノ酸ペプチドである（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２７３、４５８−４６３）。しかしながら、その比較的低い活性（ＨｕＥＰＯより１０，０００ないし１００，０００倍より小さい）および短い半減期（５０％血清中８時間のｅｘ ｖｉｖｏ半減期、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期不明）は、治療薬としてのその利用性を損なう。従って、その効力を妨げることなくかつおそらく改善するより長い半減期を該ペプチドに賦与する方法が必要とされた。この目標のため、ＥＭＰ−１の活性を増大させるためのいくつかの試みが、該ペプチドの二量体化を安定化する、若しくは該ペプチドをより大きい構造に組み込んで半減期を延長することによりなされた。Ｗｒｉｇｈｔｅｎら（１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１５、１２６１−６５）は、二量体化を安定化するためビオチン標識ＥＭＰ−１をストレプトアビジンと組み合わせた。彼らはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイで活性の１００倍の増大を見た。彼らはまた該ペプチド二量体を安定化させるために抗ビオチン抗体も使用したが、しかしながら活性のわずか１０倍の増大が見られた。同一の著者は化学的に定義された二量体の形態のＥＭＰ−１を製造した。この場合活性の１００倍の増大がｉｎ ｖｉｖｏで見られた。別のグループは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）への共有結合によりＥＭＰ−１の活性を改良することを探究した（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７、Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏ．、ｖｏｌ．４（１２）、９３９−５０）。彼らは１０００倍までの効力の増大を報告したが、しかしながら該構築物はマウスで免疫原性であることが見出された（該抗体は該ペプチドに向けられた）（Ｄａｎａ Ｊｏｈｎｓｏｎ、私信）。Ｋｕａｉら（２０００、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．５６、５９−６２）は、ＥＭＰ−１ペプチドをプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）の配列に挿入した。この足場構造へのＥＭＰ−１の挿入は二量体化を安定化しかつ半減期を増大させる双方であろ
うと考えられた。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイで、この構築物の効力がＥＭＰ−１単独より２５００倍以上高いような有意により高いことが見られた。多様なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルをこれらの研究で使用し、そして報告された効力は相互に若しくは本明細書に提示される結果と比較可能でないかもしれないことに注意すべきである。
本発明のＥＰＯ模倣ヒンジコアミメティボディ
本発明の特定の制限しない一例は、Ｖが天然に存在するＨＣ若しくはＬＣ抗体の最初の数個のＮ末端アミノ酸であり、Ｐが１コピーの生物活性ＥＭＰ−１ペプチドであり、ならびにＬがＧｌｙ−Ｓｅｒ若しくはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒいずれかのフレキシブルリンカーのタンデムリピートであり、Ｈがヒンジコア領域であり、ならびにＣＨ２およびＣＨ３がＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４アイソタイプサブクラスのものであるＥＭＰヒンジコアミメティボディ構築物である。この構築物はＥＭＰ−１ペプチドを拘束することができるがしかし集成されたホモ二量体の一部としての該ペプチドの二量体化が安定化されるような十分な柔軟性を可能にすることができると考えられる。これの裏付けにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイでのＥＭＰヒンジコアミメティボディの活性はＥＭＰ−１ペプチドより５００倍以上大きく、そして組換えＨｕＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）に実質的にのみ類似であった。加えて、この構築物の半減期はｒＨｕＥＰＯ若しくはＥＭＰ−１ペプチド単独のものの多数倍でありかつＩｇＧのものに類似であることができることが期待される。一致して、ＥＭＰヒンジコアミメティボディで治療した正常マウスは、等しい活性単位を与える場合にｒＨｕＥＰＯで治療したマウスに比較して有意により高い最大ヘマトクリットを獲得し、また、上昇されたレベルはより長期間維持される。この構築物は細胞から効率的に分泌されかつ適正にフォールディングされるようであり；第一世代のミメティボディと関連する問題を克服する。
上述された基本構造に加え、潜在的に好都合な生物学的特徴をもつバリアントを記述する。これらは、自己会合する低下された傾向、低下された免疫エフェクター機能若しくは低下された免疫原性を有しうる構築物を包含する。生物学的に活性のペプチドの改良されたコンホメーションおよび血液脳関門を横断する移行のような所望の特徴を賦与する他の改変が予見される。提案されるバリアントおよび改変は、所望の活性をもつ構築物を生じるようにいずれかの様式で組合せうる。
組換えＤＮＡ法を使用して、中間体ベクター中にＥＭＰ−１ペプチドを免疫グロブリンシグナルペプチドとヒトＪ配列の間で挿入した。これは、該ベクター中に存在する制限部位と適合性の端をもつ相補合成オリゴヌクレオチドを使用して行った。これらのオリゴヌクレオチドは、シグナルペプチドコンセンサス部位（ＱＩＱ）、ＥＭＰ−１ペプチド（配列番号２）のコーディング配列、およびＧＳ若しくはＧＧＧＳいずれかから構成されるフレキシブルリンカーを含んだ。前述の機能エレメントを含有する制限フラグメントをその後発現ベクター中に移した。このベクターは、抗ＣＤ４免疫グロブリンのプロモーターおよびエンハンサー、ならびにヒトＩｇＧ１ヒンジコア配列のコーディング配列、およびＩｇＧ１ヒンジコア領域の一部分、ＣＰＰＣＰ（図３６Ｃに示されるところの配列番号６６の１０９〜１１３）、ＨＣ定常領域２（ＣＨ２）および定常領域３（ＣＨ３）、ならびに、細菌中でのプラスミドの複製および選択ならびに哺乳動物細胞中での安定発現体の選択のための必要なエレメントを含有した。
このプラスミドを直鎖状にし、そしてＮＳＯマウス骨髄腫細胞株に電気穿孔法を介して導入した。耐性の細胞を選択し、そしてＥＭＰヒンジコアミメティボディの高発現体を培養上清のＥＬＩＳＡアッセイにより同定した。細胞培養上清からの構築物の精製は標準的プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより達成した。精製した生成物の変性
および還元双方の条件下でのＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲルの通過は、該精製した生成物の期待される大きさを確認した。精製したタンパク質の同一性を質量分析およびＮ末端シークェンシングによりさらに確認した。
ＥＭＰヒンジコアミメティボディのアミノ酸配列を下に示す。機能的ドメインをペプチドコーディング配列の上に注記する。３アミノ酸のシグナルペプチドコンセンサス配列は天然に存在する免疫グロブリンの最初の３アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸は、小胞体中のシグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの効率的除去に寄与すると考えられる。この配列に直接ＥＭＰ−１コーディング配列が続く。次の６アミノ酸と組合せたＥＭＰ−１配列の２個のＣ末端アミノ酸は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復配列を特徴とするフレキシブルリンカーを形成する。ヒト結合（Ｊ）領域配列が後に続く。Ｊ配列は、ＥＭＰ−１二量体に適正なコンホメーションをとらせ、また、該二量体を免疫グロブリンの球状構造から突出させかつ２個のＥＰＯ受容体の間隙に貫入させるためのなおより大きな柔軟性を提供するであろうと考えられる。ＨＣヒンジ領域もまたＪ領域の直後で該構築物中に包含される。ＩｇＧ１ヒンジ領域中に３個のシステインが存在する（強調される）。第一のものは通常、免疫グロブリンＬ鎖（ＬＣ）に対を形成するとみられ、また、第二の２個は２個のＨＣの間の鎖間結合に参画する。該配列の残部はＣＨ２およびＣＨ３領域から構成され、該タンパク質の嵩に寄与する。免疫グロブリンが長い血清半減期を有すると考えられる理由の１つは、飲作用された免疫グロブリンを細胞外間隙に戻すことにより血清半減期を延長する、ＦｃＲｎを結合するそれらの能力である。ＦｃＲｎの結合部位はＣＨ２およびＣＨ３領域の接合部と重なる（Ｓｈｅｉｌｄｓら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、ｖｏｌ．２７６（９）、６５９１−６６０４）。
重要な機能ドメインを示すＥＭＰヒンジコアミメティボディのペプチド配列。
２本のＩｇＧ Ｈ鎖が、細胞のプロセシングの間にヒンジ領域に位置するシステイン間のジスルフィド結合を介して集成されてホモ二量体を形成することが公知である。これが改変ペプチド間でもまた発生して集成されたＥＭＰヒンジコアミメティボディ構築物を形成することができると期待される。加えて、ＥＭＰ−１ペプチド中の２個のシステインの間の鎖間ジスルフィド結合もまた生じることができることが期待される。ＥＭＰヒンジコアミメティボディの期待される構造は２個のＥＭＰ−１ペプチドを含有する。隣接配列の
柔軟性と一緒のＮ末端のペプチドの空間的配置は、該ペプチドが生物活性二量体を形成することを可能にするはずである。
ＥＭＰヒンジコアミメティボディの活性をｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性アッセイで最初に試験した。このアッセイのため、急性巨核芽球性白血病を伴う患者由来のＥＰＯ依存性ＵＴ−７／ＥＰＯ細胞株を使用した（Ｋｏｍａｔｓｕら、１９９３、Ｂｌｏｏｄ、ｖｏｌ．８２（２）、４５６−４６４）。これらの細胞は、ｒＨｕＥＰＯを補充した培地から除去４８ないし７２時間後にプログラムされた細胞死を受ける。ｒＨｕＥＰＯの非存在下で２４時間インキュベートした細胞は、ｒＨｕＥＰＯ若しくはＥＰＯＲアゴニストで処理される場合に救済され得る。ＥＭＰヒンジコアミメティボディを、ｒＨｕＥＰＯを伴わず欠乏させた細胞に添加し、そして生存細胞により代謝されて測定し得る吸光度をもつ生成物を生じるテトラゾリウム化合物ＭＴＳ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、処理４８時間後に細胞生存率を測定した。典型的なアッセイの結果は、モル濃度に基づくＥＭＰヒンジコアミメティボディの効力が、ＥＭＰ−１ペプチドより５００倍より高くかつｒＨｕＥＰＯより５倍小さいことを示した。加えて、これらの同一細胞をＥＭＰヒンジコアミメティボディで刺激し、そしてポリアクリルアミドゲルにより細胞ライセートを泳動することによりチロシンリン酸化パターンを可視化した。ＥＭＰヒンジコアミメティボディにより表されるパターンはｒＨｕＥＰＯのものに類似であり、ＥＭＰヒンジコアミメティボディがこれらの細胞に作用する機構がｒＨｕＥＰＯのものに類似であることを示した。
ｉｎ ｖｉｖｏ研究を正常マウスで行い、ＥＭＰヒンジコアミメティボディの半減期をｒＨｕＥＰＯのものと比較し、また、赤血球形成に対するそれらの効果を比較した。マウスに等しく投与した場合、ＥＭＰヒンジコアミメティボディはｒＨｕＥＰＯに比較してより高い最大応答を示し、および該応答は延長された。
ｒＨｕＥＰＯおよびＥＭＰヒンジコアミメティボディ双方の血清濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＭＰヒンジコアミメティボディのおよその半減期はｒＨｕＥＰＯのものの少なくとも数倍であった。
ＩｇＧ１のより下の（ｌｏｗｅｒ）ヒンジ領域中の２個のリシン（Ｌ）残基Ｌ２３４およびＬ２３５のアラニン（Ａ）への突然変異が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する免疫グロブリンの能力を廃止することができることが示されている（Ｈｅｚｅｒｅｈら、２００１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．７５（２４）、１２１６１−６８）。予備研究は、ＥＭＰヒンジコアミメティボディが、ＥＰＯ受容体を発現する細胞の補体溶解を媒介しないことを示した。これは、赤血球前駆細胞上で見出される受容体の少ない数によるかもしれない。加えて、ヘマトクリットの有意の増大により明示されるところの赤血球前駆細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖は、免疫エフェクター機能の可能な機能上の無関係を裏付ける。しかしながら、エフェクター機能関連の影響は観察されていない一方、予防段階としてこれらの突然変異を導入することにおける興味が存続する。
免疫エフェクター機能の媒介の減少をもたらしうる別の修飾はグリコシル化結合部位の除去である。これは位置２９７のアスパラギン（Ｎ２９７）のグルタミン（Ｑ）への突然変異により達成し得る。付加的な変更は、場合によっては、Ｏ−グリコシル化を減少若しくは改変するようにトレオニン（Ｔ）を代替アミノ酸で、例えばＴ３４若しくはＴ４７をで置き換えることを包含し、アグリコシル化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）バージョンのＩｇＧ１サブクラスは免疫エフェクター機能の乏しい媒介物であることが既知である（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら １９９８、Ｉｍｍｏｌ．Ｒｅｖ．、ｖｏｌ．１６３、５０−７６）。
利点：新規構築物すなわち上述されたＥＭＰヒンジコアミメティボディは生物活性ペプチドＥＭＰ−１を表示する代替方法を提供する。本構築物の活性はｒＨｕＥＰＯの範囲にあり、および該ｉｎ ｖｉｖｏ半減期はＩｇＧのものに類似である。加えて、提案される改変は、ＥＭＰヒンジコアミメティボディの新規特徴と組合せでかつそれに加えて、ＥＭＰヒンジコアミメティボディ構築物の利用性を高める。
グルコース不耐症および／若しくは腎疾患関連の貧血の治療におけるヒンジ欠失ＥＰＯミメティボディの使用を裏付けるデータ
利点：新規構築物すなわち上述されたＥＭＰ−ＮｆｕｓＣＧ１は、生物活性ペプチドＥＭＰ−１を表示する代替方法を提供する。本構築物の活性はｒＨｕＥＰＯの範囲にあり、および該ｉｎ ｖｉｖｏ半減期はＩｇＧのものに類似である。加えて、提案される改変は、ＥＭＰ−ＮｆｕｓＣＧ１の新規特徴と組合せでかつそれに加えて、ＥＭＰ−ｆｕｓＣＧ１構築物の利用性を高める。
背景：多数の臨床試験は、末期腎疾患を伴う患者が、尿毒症毒素、貧血若しくは二次性甲状腺機能亢進症（Ｓｐａｉａら、２０００）に帰すことができるインスリン抵抗性をしばしば有することを示す（Ｍａｋ．、１９９６；Ｓｐａｉａら、２０００；Ｔｕｚｅｕら、２００４）。興味深いことに、これらの患者集団でのＥＰＯでの治療は、血中トリグリセリド、総コレステロールおよびＬＤＬレベルの付随する改善を伴いインスリン抵抗性を改善することが示された（Ｍａｋ．、１９９６；Ｓｐａｉａら、２０００）。１グループが、インスリン感受性の改善をＥＰＯそれ自体に帰すことができかつ貧血の是正に帰すことができないことを示唆した（Ｓｐａｉａら、２０００）。
最近、Ｔｈｏｍａｓら（２００５）は、７２２例の患者を糖尿病合併症および彼らのＥＰＯレベルについてスクリーニングした研究を発表した。これらの患者のうちおよそ２３％が貧血を有した。該著者は、ヘモグロビン濃度の低下に応答してＥＰＯを産生することの失敗が、糖尿病を伴う患者における貧血への共通の寄与因子であると結論付けた。彼らはまた、ＥＰＯ産生の欠如が糖尿病性腎疾患に寄与しうるとも結論付けた。
ＣＮＴＯ ５３０は、抗体のＦｃ部分を包含するドメインにＥＰＯ模倣ペプチド（ＥＭＰ−１）を組み込むＥＰＯ模倣物である。ＥＭＰ−１はＥＰＯとの配列相同性を有しないが、しかしそれはＥＰＯ受容体への結合について１２５Ｉ標識ＥＰＯと競合する。ＣＮＴＯ ５３０はまた、ＥＰＯ応答性細胞の増殖を誘導しかつＥＰＯと同一の細胞内リン酸化パターンを刺激する。ＣＮＴＯ ５３０は、ＥＭＰ−１ペプチドが（ＩｇＧ１よりむしろ）ＩｇＧ４足場構造にグラフトされるために親分子ＣＮＴＯ ５２８と異なる。該足場構造はＶドメインを欠き、そしてＣＮＴＯ ５２８に関して有意により短いヒンジおよびリンカー領域を有する。ＣＮＴＯ ５３０のヒンジは、親分子中で欠いている３個の点突然変異（Ａｌａ／ＡｌａおよびＳ２２８Ｐ）を組み込む。これらの変化のそれぞれの役割はエフェクター機能の認識される問題を低減することおよび該分子を安定化することである。生じる分子は、ＣＮＴＯ ５２８に比較してげっ歯類およびサルで有意に改善された薬物動態および薬動力学の特徴を有する。結果、ＣＮＴＯ ５３０の持続性のｉｎ ｖｉｖｏ活性は、ＥＰＯおよび他のＥＰＯアナログに比較して改良された特性の可能性を提供する。
文献からのデータは、低下する腎機能を伴う多数の糖尿病患者にＥＰＯでの介入が有益であり得ることを示唆する。ここに提示されるデータは、ＣＮＴＯ ５３０のような長時間作用型ＥＰＯ模倣物もまた低下する腎機能を伴う糖尿病患者に有益であり得ることを示す。しかしながら、ＣＮＴＯ ５３０はむしろ長い半減期という付加的な特性を有する。
ＣＮＴＯ ５３０の月１回投与は、貧血に苦しめられる糖尿病患者の新規治療方法となろう。
参考文献
Ｍａｋ ＲＨ，ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１２９：９７−１０４、１９９６。
Ｓｐａｉａ Ｓら、Ｎｅｐｈｒｏｎ、８４：３２０−３２５、２０００。
Ｔｈｏｍａｓ ＭＣら、Ａｒｃｈ，Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．、１６５：４６６−４６９、２００５。
Ｔｕｚｃｕ Ａら、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．、３６：７１６−７２０、２００４。
ミメティボディＣＮＴＯ ５３０はｄｂ／ｄｂマウスにおいて投与７日後に耐糖能を改善した。マウス（ｄｂ／ｄｂ；ｎ＝７）を一夜絶食させ、そして空腹時血糖（ＦＢＧ）を測定した。動物をＦＢＧに基づき無作為化した。マウスにＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、そして１０分後にグルコースを腹腔内に与えた（０．５ｍｇ／ｇ）。血糖を多様な時点（グルコース後１０、２０、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０分）で測定した。７日後にＩＰＧＴＴを上述されたとおり反復した。
図１に示されるデータは、ＣＮＴＯ ５３０が試験の第一日に耐糖能に対しほとんど影響を有しないが、しかし単回投与７日後にむしろ顕著な影響を有したことを示唆する。
ＣＮＴＯ ５３０はＤＩＯマウスにおいて投与７日後に耐糖能を改善した。実施例１に記述される実験を、ＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の投与後のＤＩＯ（食餌誘発性肥満）マウスで反復した。該マウスは高脂肪食（６０．９％ｋｃａｌ脂肪および２０．８％ｋｃａｌ炭水化物よりなるＰｕｒｉｎａ試験食＃５８１２６）を給餌された後に糖尿病になるため、このマウスモデルはヒト疾患をより表すと考えられる。実施例１に記述されたとおり、ＩＰＧＴＴを投与の日および投与７日後に行った。ＩＰＧＴＴの間の時間点はグルコース投与後１５、３０、６０、９０、１２０、１５０および１８０分であった。ＩＰＧＴＴが第７日に完了した後にマウスを殺し、そして血液学試験のため心穿刺を介して全血（ＥＤＴＡ中）を収集した。図２は、ＣＮＴＯ ５３０が投与７日後に耐糖能を改善したがしかし投与直（１０分）後はしなかったことを示す。図３は、ＣＮＴＯ ５３０で治療したマウスが対照動物に関して上昇されたヘモグロビンを有したことを示す。
詳細な記述：
ＣＮＴＯ ５３０の単回投与は投与７、１４、２１および２８日後に耐糖能を改善する。マウス（ＤＩＯ；ｎ＝７）を一夜絶食させかつ空腹時血糖（ＦＢＧ）を測定した。動物をＦＢＧに基づき無作為化した。該マウスにＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、そして１０分後にグルコースを腹腔内に与えた（０．５ｍｇ／ｇ）。血糖を多様な時点で測定した（グルコース後１０、２０、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０分）。ＩＰＧＴＴをその初回単回投与７、１４、２１、２８および３５日後に反復した。２１、２８および３５日間治療した群の動物をＩＰＧＴＴ後に殺し、そして血液学測定のため全血を収集した。血液学後に血液を遠心分離し、そしてインスリン測定のため血漿を収集した。
ＣＮＴＯ ５３０で治療した動物で対照動物に関し１４、２１および２８日後にグルコース消失（ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の有意の低下が存在した（図７）。ヘ
モグロビン濃度は治療した動物で２１および２８日後に上昇した（それ以前は試験されない）。興味深いことに、インスリン濃度は治療した動物で２１日後に有意に低下した。グルコース濃度は投与２１日後にそれほどはるかに低かったため、インスリン濃度がより低かったことは驚くことではない。しかしながら、これは観察された現象が現実でありかつグルコース測定のアーチファクトでないことを示す。
ＥＰＯの単回投与は投与５日後に耐糖能を改善する。マウス（ＤＩＯ；ｎ＝７）を一夜絶食させかつ空腹時血糖（ＦＢＧ）を測定した。動物をＦＢＧに基づき無作為化し、そしてＥＰＯ（０．０３、０．１、０．３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。（上述されたところの）ＩＰＧＴＴを投与５日後に行った。動物をＩＰＧＴＴ後に殺し、そして血液学測定のため全血を収集した。
０．０３および０．３ｍｇ／ｋｇのＥＰＯを投与した動物で耐糖能のわずかな改善が存在した（図７）とは言え、空腹時血糖の統計学的に有意の低下は観察されなかった。図８は、ヘモグロビンが用量依存性の様式で有意に上昇しなかったがしかし網状赤血球が有意に増大したことを示す。
ダルベポエチンの単回投与は投与７日後に耐糖能を改善する。マウス（ＤＩＯ；ｎ＝７）を一夜絶食させかつ空腹時血糖（ＦＢＧ）を測定した。動物をＦＢＧに基づき無作為化し、そしてダルベポエチン（０．０１、０．０３、０．１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。投与７日後に（上述されたところの）ＩＰＧＴＴを行った。動物をＩＰＧＴＴ後に殺し、そして血液学測定のため全血を収集した。
ダルベを投与した動物で耐糖能の用量依存性の改善が存在し（図９）、そして空腹時血糖の統計学的に有意の低下が観察された（図１０）。図１１は、ヘモグロビンおよび網状赤血球が有意に上昇したことを示す。
ＥＰＯトランスジェニックマウスにおけるＩＰＧＴＴ。ヒトＥＰＯを発現するトランスジェニックマウス（ヘテロ接合体若しくはホモ接合体）およびＣ５７Ｂ１６マウス（トランスジェニック体に年齢をマッチさせた）を一夜絶食させた。翌朝空腹時血糖を測定し、そしてマウスにグルコースを腹腔内に与えた（１．０ｍｇ／ｇ）。血糖を多様な時点で（グルコース後１０、２０、３０分）測定した。図１２は、空腹時血糖が対照に関してトランスジェニックマウスで有意により低かったことを示す。加えて、耐糖能試験の間の曲線下面積はトランスジェニック動物で顕著に改善された（図１３）。
ＣＮＴＯ ５３０の単回投与はインスリン感受性を改善する。マウス（ＤＩＯ；ｎ＝７）を一夜絶食させかつ空腹時血糖（ＦＢＧ）を測定した。動物をＦＢＧに基づき無作為化し、そしてＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。投与１４日後にマウスを一夜絶食させ、そしてグルコースおよびインスリン測定のため血液を収集した。動物にグルコースを腹腔内投与し、そしてグルコースおよびインスリン測定のため２０分後に血液を収集した。
図１４は、絶食直後およびグルコース投与２０分後にグルコースおよびインスリン濃度の有意の低下が存在したことを示す。ＨＯＭＡ解析を使用し、そして治療した動物はインスリン感受性が改善されたことを示唆するＨＯＭＡの１０倍以上の低下を示した（図１５）。
臨床データのデータマイニング
要約：
ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅの臨床データサービス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄａｔａ Ｓｅｒｖｉｃｅ）データベースは、ＧＥ Ｃｅｎｔｒｉｃｉｔｙ ＥＭＲデバイスを使用する救急の状況で実地活動している４，０００名に近い米国に拠点を置く内科医からの非同定の（ｄｅ−ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）正規化された長期の患者レベルの電子医学記録データを含有する。このデータベースは４７０万例を超える患者生命に関するデータを含有する。平均経過観察時間はおよそ３年である。該データベースは、患者の人口統計学、病歴、来院の型、臨床観察結果（診断コードを包含する）、臨床検査結果および処方された医薬品に関する情報を含有する。ＪＮＪはこのデータセットに対するライセンスを購入し、そして貧血にＥＰＯを処方された患者での糖尿病パラメータに関する転帰を探すためそれを調べた（ｍｉｎｅｄ）。
初期のマイニング運用は、ＣＤＳデータベースが合計４，７００，１５６例の患者を含有し、そのうち４，３３１，８３６例が活動期患者と分類されていることを示した。以下の目的変数についてＥＰＯ前測定次いでＥＰＯ後測定を伴う患者を同定するために集団をさらにフィルタリングした。
−空腹時血糖
−総ヘモグロビンの％としてのヘモグロビンＡ１ｃ
−血中ヘモグロビン
−血中ヘマトクリット
−
少なくとも１回のＥＰＯ治療前（最長６０日前）および１回の後（最長６か月後）の測定を伴う患者を分析に考慮した。この基準に合致する患者の数は、多様な変数および時間帯について数が変動した。ＥＰＯ医薬品を服用しかつ６．０若しくはそれ以上の平均ＨｂＡ１ｃ値を有した患者を糖尿病とみなした。
図１６は患者のヘモグロビン濃度に対するＥＰＯの効果を示す。期待されるとおり、ヘモグロビン濃度は、プラトーに達する前に初期ＥＰＯ投与後３か月間にわたり堅調に増大する。
図１７は患者のＨｂＡ１Ｃレベルに対するＥＰＯの効果を示す。ＨｂＡ１ＣレベルはＥＰＯ投与後最初の１か月で０．５％の平均値だけ下落し、そして元のレベルに戻る前その後２か月は低いまま留まる。図１６および１７を比較すると、図１６のみが初回ＥＰＯ投与後１か月でヘモグロビンのわずかな増大を示すため、ＨｂＡ１Ｃに対するＥＰＯの効果は総ヘモグロビン濃度に対するその影響に依存しないようである。
図１８は、元の範囲に復帰する前の４か月間にわたり最大の減少に達する初回ＥＰＯ投与後のおよそ３０ｍｇ．ｄＬの空腹時血糖濃度の低下を示す。空腹時血糖の低下は図１７に示されるＨｂＡ１Ｃの低下と比較してより持続的かつより長時間持続するようである。
図１９は、基礎の糖尿病の重篤度の関数としてのＨｂＡ１Ｃレベルに対するＥＰＯの影響の効果を示す。データベース中の糖尿病集団を４種の基礎ＨｂＡ１Ｃレベルすなわち６〜７％、７〜８％、８〜９％および＞９％で等級付けした。該図は、ＥＰＯの抗糖尿病性の利益（ＨｂＡ１Ｃレベルの低下の大きさとして定義される）が、最初の１か月間におよそ１．６９％（１０．１８から８．４９％）の低下をもたらす最高の疾患重篤度（すなわち基礎ＨｂＡ１Ｃ＞９％）を有する集団で最大であるようであることを示す。対照的に、より穏やかな疾患レベル（すなわち基礎ＨｂＡ１Ｃ＝８％〜９％および７％〜８％）で開
始すると抗糖尿病効果もまたより低かった（それぞれ０．８４％（８．３５％から７．５１％）および０．３９％（７．３８％から６．９９％））。少なくとも基礎レベルの集団（６．０％〜７．０％）で低下は観察されなかった。
ＥＭＲデータの欠点の１つは時間経過に沿った欠けている／不完全な観察結果である傾向がある。われわれが糖尿病におけるより長期の治療効果を実際に観察していることをわれわれ自身が断言するため、われわれは、データベースをさらに調べて、われわれが初回ＥＰＯ投与前２か月間に存在した基礎ＨｂＡ１Ｃ値を有しかつ２回のその後の時間区分（１〜３か月および４〜６か月）にもまたＨｂＡ１Ｃ値を有するＥＰＯで治療した患者のみを単離した。この長期データ組で得られた結果は図１９に報告される観察結果を確認する。基礎ＨＢＡ１Ｃ値が＞８について、ＨｂＡ１Ｃ低下の大きさはＥＰＯ投与後最初の３か月以内で０．９５％（９．４１％から８．４６％）であった。該効果は次の３か月間に観察されるさらなる低下を伴わずプラトーに達した。より低い基礎ＨｂＡ１Ｃ値（７〜８％）で、最初の３か月の低下の量は０．４６％（７．４７％から７．０１％）であり、次いで次の３か月で有意のさらなる変化はなかった。
長期患者を使用する解析を初期ＥＰＯ投与後の空腹時血糖データについて反復した。図２１は、１２６ｍｇ／ｄＬより大きい若しくはより下のいずれかの基礎値を伴う患者での空腹時血糖に対する効果を示す（１２６ｍｇ／ｄＬという基礎空腹時血糖値を米国糖尿病学会（ＡＤＡ）により示唆されるとおり糖尿病患者を診断するための基準として使用した。結果は、平均２８ｍｇ／ｄＬになる糖尿病患者（ＦＢＧ＞１２６ｍｇ／ｄＬ）について時間経過全体にわたる空腹時血糖値の堅調な低下を示す（１７３ｍｇ／ｄＬから１４５ｍｇ／ｄＬ）。１２６ｍｇ／ｄＬより下の基礎値を伴う患者はＦＢＧレベルのいかなる低下も示さない。代わりに彼らは時間経過の終了時に５ｍｇ／ｄＬに同等なわずかな増大（１０２ｍｇ／ｄＬから１０７ｍｇ／ｄＬ）を示す。
提示されるデータは、糖尿病患者の空腹時血糖およびインスリン感受性を改善するためＥＰＯ受容体アゴニストで彼らを治療し得ることを示唆する。図７および８ならびに図１６〜１８に示されるデータは、ヘモグロビンの増大が耐糖能を改善するために必要とされないかもしれないことを示唆し、低用量のＥＲＡを使用してヘモグロビン濃度を増大させることなく糖尿病を治療することが可能でありうることを示唆する。ＥＲＡはヘモグロビンを有意に上げる濃度で血栓症の危険性を増大させることが既知であるため、これは重要である。該臨床データはこれが可能であることもまた示唆する。該臨床データは、ヘモグロビンのわずかな改善（＜１％）を可能にしたＥＰＯの用量が空腹時血糖およびＨｂＡ１ｃの有意の改善を有したことを示した。
利点：糖尿病患者でのグルコース不耐症を治療するための治療薬としてのＥＲＡの使用はいくつかの利点を提供し得る。
・この治療は糖尿病の治療のための新規の作用機序を提供し得る。
・この治療は貧血および糖尿病の二重治療に至る可能性がある。
・インスリン感受性の改善により、脂質（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＴＧ）の改善もまたＥＲＡで可能である。
・高血糖に対する持続的効果は、糖尿病患者におけるＨｂＡ１ｃの有意の改善および島ｂ細胞喪失の遅延をもたらし得る。
２型糖尿病の現在の治療は少なくとも連日投与を必要とする。ＥＲＡでのこの患者集団の治療はより少なく頻繁な投与および従って改善されたコンプライアンスを見込みうる。
腎疾患患者での貧血およびグルコース不耐症を治療するための治療薬としてのＣＮＴＯ
５３０のような延長された半減期をもつＥＰＯ受容体アゴニストの使用は、他のＥＰＯ
受容体アゴニスト（ＥＲＡ）を上回るいくつかの利点を提供し得る。この治療は貧血および糖尿病の二重治療に有用であることが期待される。他のＥＲＡと比較してのＣＮＴＯ ５３０のような延長された半減期をもつＥＰＯ受容体アゴニストの延長された半減期は、糖尿病性腎不全患者における高血糖の治療に有用であることが期待される。高血糖に対する持続性の効果は、この過程を遅らせる若しくは低下させることにより島β細胞喪失を治療するのに有用であることが期待される。ＣＮＴＯ ５３０の延長された半減期は他のＥＲＡと比較してより少なく頻繁な投薬をもたらす。ＣＮＴＯ ５３０とＥＰＯの間の相同性の欠如はこの患者集団におけるＰＲＣＡの可能性を低下させる。耐糖（ｇｌｕｃｏｓｅ
ｔｏｅｒｉｚｉｎｇ）効果はこの患者群の付加的な糖尿病薬に対する要求を最小限にする。
本発明は前述の記述および実施例にとりわけ記述されたと別の方法で実施し得ることが明らかであろう。
本発明の多数の改変および変形が上の教示に照らして可能であり、そして従って本発明の範囲内にある。

Claims (18)

  1. 細胞、組織、器官若しくは動物に対して、有効量の少なくとも１種のエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストを含む組成物を接触若しくは投与することを含んでなる、前記細胞、組織、器官若しくは動物におけるグルコース不耐症の治療方法。
  2. 前記ＥＰＯ受容体アゴニストが、ＥＰＯ受容体アゴニスト生物製剤およびＥＰＯ受容体アゴニスト小分子化合物から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＥＰＯ受容体アゴニスト生物製剤がポリペプチド、抗体および抗体融合ポリペプチドから選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ポリペプチドがＥＰＯ若しくは天然に存在するバリアントである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ポリペプチドが少なくとも１種のポリエチレングリコール分子をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
  6. 前記ポリペプチドがＥＰＯの天然に存在しないバリアントである、請求項３に記載の方法。
  7. ＥＰＯの前記天然に存在しないバリアントがダルベポエチン−αである、請求項５に記載の方法。
  8. 前記抗体がＥＰＯ受容体若しくはＥＰＯに対するアゴニスト抗体である、請求項３に記載の方法。
  9. 前記ポリペプチドがＥＰＯの機能的模倣物である、請求項３に記載の方法。
  10. ＥＰＯの前記機能的模倣物が配列番号１〜３９から選択される少なくとも１種である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ポリペプチドがヘマチド（ｈｅｍａｔｉｄｅ）である、請求項３に記載の方法。
  12. 前記抗体融合ポリペプチドが、Ｈ鎖抗体配列の少なくとも一部分および少なくとも１種のＥＰＯ受容体アゴニストポリペプチドを含んでなる、請求項３に記載の方法。
  13. 前記ポリペプチドがＥＰＯの機能的模倣物である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記小分子がＥＰＯ受容体アゴニストである化合物である、請求項２に記載の方法。
  15. 前記小分子がＦＧ−２２１６およびＦＧ−４５９２から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記有効量が前記ＥＰＯ受容体アゴニストの０．００１〜５０ｍｇであるが０．０００００１〜５００ｍｇである、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記接触させること若しくは前記投与することが、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔
    内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液包内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病変内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される少なくとも１様式による、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  18. 前記（ａ）接触若しくは投与することの前、同時に若しくは後に、検出可能な標識若しくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗感染薬、心血管（ＣＶ）系薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、気道薬、胃腸（ＧＩ）管薬、ホルモン薬、液体若しくは電解質バランスのための薬物、血液製剤、抗腫瘍薬、免疫調節薬、眼、耳若しくは鼻の薬物、局所薬、栄養薬、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストの少なくとも１種から選択される少なくとも１種の化合物若しくはポリペプチドの有効量を含んでなる少なくとも１種の組成物を投与することをさらに含んでなる、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
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