JP2010504521A

JP2010504521A - 試料調製のためのマルチキャピラリー装置

Info

Publication number: JP2010504521A
Application number: JP2009529161A
Authority: JP
Inventors: ユリピー．ベロフ，; カルロジー．パンタノ，; クセニアルボバ，
Original assignee: クロンバ，インコーポレイテッド
Priority date: 2006-09-20
Filing date: 2006-09-20
Publication date: 2010-02-12
Also published as: WO2008036091A1; EP2067019A1; DK2067019T3; EP2067019A4; AU2006348443A1; EP2067019B1; CA2664011A1

Abstract

タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、および他の生体材料（例えば、細胞）の試料を単離（イムノアッセイ）、精製、および濃縮する際に用いるための効率的な試料調製装置を提供することが、本発明の目的である。本発明は、固定相で被覆され、一体要素内に配置された複数の均一なキャピラリー管を備える、生体試料の取扱いに特に有用な高表面積マルチキャピラリー試料調製装置である。このマルチキャピラリー装置は、ピペット、マイクロピペット、シリンジ、または他の分析もしくは試料調製機器への取り付けに適している。

Description

（関連する出願への参照）
本願は、２００４年９月３０日に出願された米国特許出願第１０／９５５，３７７号および２００３年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／５０７，４７４号の利益を主張する。

（発明の分野）
本発明は、生体試料の取扱いに特に有用なマルチキャピラリー試料調製装置に関する。具体的には、このマルチキャピラリー装置は、ピペット、マイクロピペット、シリンジ、またはその他類似の分析機器と共に使用するのに適している。

（発明の背景）
多くの生体試料は、一般に、ゲル電気泳動によって分離され、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって分析される。しかしながら、これらの技法の１つの不利な点は、分析が、生体試料の調製に一般に使用される塩、緩衝剤、および低分子量有機化合物の存在により大きく影響されることである。分析の感度と選択性を向上させるために、しばしば吸着性および膜状の装置を用いて、分析前に試料を精製および濃縮する。そうした装置は、所望の構成物質を捕捉する一方混入物は通過させる、好適な寸法および形状の筐体内に固定された、多孔質吸着剤の下地または半透性膜を特徴とする。

０．０１から１００マイクログラム（μｇ）の範囲の試料を取扱うためには、ピペット、マイクロピペット、シリンジ、または類似の分析機器（以下、集合的に「ピペット」とする）が一般に使用されている。これらのピペットのチップには、ペプチドおよび他の生体分子を精製、濃縮、または分画することができる、１つ以上の吸着性または膜状のプラグがはめ込まれている。

しかしながら、吸着性および膜状のプラグの主な欠点は、多孔質材料が、概して、タンパク質やポリヌクレオチドなどの小さい生体分子を分離するのに有効でないことである。多孔質プラグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および細胞などの大きい生体材料および核酸を単離および精製することに関しても不十分である。この欠点は、試料処理中に、分子が海綿様の膨張性で多孔質の吸着剤シリカの迷路を通って進まなければならないことに起因する。

試料調製に用いられる多孔質材料には、均一性、一貫性、および再現性がほとんどない。既存のピペットチップでの試料損失は、典型的には約４０〜６０％である。低い試料回収率は主に、試料が多孔質材料の不規則な空隙を通って移動しなければならず、それにより試料の一部が小さい空隙内に留まって、回収できないことに起因する。さらに、十分な成果を得るためには、試料を多孔質材料に複数回（例えば、１０回）通過させなければならない。これらの試料調製装置は、通常再利用できず、自動機器類に適さないが、これは低い試料回収率が試料の持ち越しによる汚染を引き起こす恐れがあるためである。

遠心機ローターによって作動するスピンカラムおよびその他の器具は一般的に、生体試料および核酸試料の単離と精製に使用されている。しかしながら、一部の適用例では、検体を回転させて単離および精製するための遠心機の使用を回避することが望ましい。この理由の一部は、水平分離は、例えば最大４，０００ＲＰＭの遠心力が、十分な分離を達成するために、スピンカラムと試料の垂直軸に沿って加えられる、あるいは伝えられる結果をもたらす可能性があることである。空気抵抗は、スピンカラムおよびその内容物を加熱する抗力と摩擦を発生して、スピンカラムに悪影響を与える。熱伝達、きつい遠心力、および付随する空気抵抗により、試料断片のかなりの破損が避けられない。スピンカラムおよび遠心処理時に抽出された生体試料および核酸試料の質の低下は、使用者にとって極めて望ましくない。

したがって、機器分析前に多孔質材料を用いて生体試料および核酸試料を精製および濃縮することは、時間がかかり、再現性が乏しく、処理能力が低く、試料を多孔質プラグに繰り返し通過させる必要があることがわかる。

したがって、分析前に、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、および他の生体材料（例えば、細胞）の試料を単離（イムノアッセイ）、精製、および濃縮する際に用いるための効率的な試料調製装置を提供することが、本発明の目的である。

また、処理能力を増加させ、試料損失を減少させる、高い試料容量を有する試料調製装置を提供することも本発明の目的である。

均一性、一貫性、およびほぼ同一の試料通過経路を実現する、再現性の高い試料調製装置を提供することは、本発明のさらなる目的である。

簡単で、費用効率が高く、またシリカ系多孔質基材あるいは遠心機などの特別な装置の使用を必要としない試料調製装置を提供することは、本発明のさらに別の目的である。

本発明は、生体試料の取扱いに特に有用な、高表面積マルチキャピラリー試料調製装置である。このマルチキャピラリー装置は、シリカ系多孔質基材の使用を必要としない。それどころか、この装置は複数の平行なキャピラリー管を含み、各管の空洞は、試料の処理を通して開放され、閉塞されない状態のままである。装置のキャピラリー管は互いに無関係に作用するため、試料分子は、１つのキャピラリーから別のキャピラリーに、物理的に交換される、または拡散されることがない。マルチキャピラリー装置は、好ましくは「ピペット」またはその他の試料調製もしくは分析機器への取り付けに適した筐体内に配置され、マイクロリットルおよびナノリットル範囲で、またより大きい質量負荷および容積で、核酸試料または生体試料の単離、精製、濃縮、および／または分画を可能にする。本発明の実施形態において、マルチキャピラリー装置は、複数の均一なキャピラリーが貫通した一体要素を特徴とする。該一体要素は、典型的に、ピペットチップ、シリンジ針、または管の下端に取り付けられ、ピペットを用いて操作される。

タンパク質の分離および精製の適用例では、不溶性の固定相材料が、支持または媒介構成物質を使用せずに、各キャピラリー管の内面（壁）上に沈積される。

本発明には、タンパク質試料調製のためにマルチキャピラリー装置を調製する方法も含まれる。かかる方法では、キャピラリー管の内壁をまず固定相材料で被覆し、それから一体要素を適当な筐体内に取り付ける。あるいは、一体要素をまず筐体内に固定し、その後キャピラリーの壁を固定相で被覆してもよい。操作には、マルチキャピラリー試料調製装置をピペット、マイクロピペット、管、シリンジ、または類似の分析機器に取り付ける。

図１は、本発明の実施形態による、試料調製用マルチキャピラリー装置の斜視図である。図２Ａ、２Ｃ、および２Ｄ（ＳＥＭ）は、装置の個々のキャピラリーを示す拡大横断面図である。図２Ｂは、個々のキャピラリー管の分解斜視図である。図２Ａ、２Ｃ、および２Ｄ（ＳＥＭ）は、装置の個々のキャピラリーを示す拡大横断面図である。図２Ｂは、個々のキャピラリー管の分解斜視図である。図２Ａ、２Ｃ、および２Ｄ（ＳＥＭ）は、装置の個々のキャピラリーを示す拡大横断面図である。図２Ｂは、個々のキャピラリー管の分解斜視図である。図２Ａ、２Ｃ、および２Ｄ（ＳＥＭ）は、装置の個々のキャピラリーを示す拡大横断面図である。図２Ｂは、個々のキャピラリー管の分解斜視図である。図３は、従来の試料調製装置の横断面図を示すＳＥＭ画像である。図３は、従来の試料調製装置の横断面図を示すＳＥＭ画像である。図４Ａ〜４Ｄはそれぞれ、本発明による、ピペットチップおよびピペット形式マルチキャピラリー装置の斜視図である。図４Ａ〜４Ｄはそれぞれ、本発明による、ピペットチップおよびピペット形式マルチキャピラリー装置の斜視図である。図４Ａ〜４Ｄはそれぞれ、本発明による、ピペットチップおよびピペット形式マルチキャピラリー装置の斜視図である。図４Ａ〜４Ｄはそれぞれ、本発明による、ピペットチップおよびピペット形式マルチキャピラリー装置の斜視図である。図５Ａ〜５Ｃは、本発明による試料調製用シリンジ形式マルチキャピラリー装置の斜視図である。図５Ａ〜５Ｃは、本発明による試料調製用シリンジ形式マルチキャピラリー装置の斜視図である。図５Ａ〜５Ｃは、本発明による試料調製用シリンジ形式マルチキャピラリー装置の斜視図である。図６は、本発明による試料調製用マルチキャピラリー装置における、３成分混合物の分離を示すクロマトグラムである。図７Ａは、試料濃縮におけるマルチキャピラリー試料調製装置の性能を示す、図７Ｂの標準ＳＰＥカートリッジと比較したクロマトグラムである。図７Ａは、試料濃縮におけるマルチキャピラリー試料調製装置の性能を示す、図７Ｂの標準ＳＰＥカートリッジと比較したクロマトグラムである。図８Ａおよび８Ｂは、複雑なペプチド混合物の脱塩におけるマルチキャピラリー試料調製装置の性能を示す質量スペクトルである。図８Ａおよび８Ｂは、複雑なペプチド混合物の脱塩におけるマルチキャピラリー試料調製装置の性能を示す質量スペクトルである。図９Ａおよび９Ｂは、複雑なペプチド混合物の分画におけるマルチキャピラリー試料調製装置の性能を示す質量スペクトルである。図９Ａおよび９Ｂは、複雑なペプチド混合物の分画におけるマルチキャピラリー試料調製装置の性能を示す質量スペクトルである。図１０は、従来の装置と本発明によるマルチキャピラリー試料調製装置とを比較した、試料の容量および回収性能（１０Ａ）、再現性（１０Ｂ）、および時間性能（１０Ｃ）を示すゲルである。比較データは、表２に示す。図１０は、従来の装置と本発明によるマルチキャピラリー試料調製装置とを比較した、試料の容量および回収性能（１０Ａ）、再現性（１０Ｂ）、および時間性能（１０Ｃ）を示すゲルである。比較データは、表２に示す。図１０は、従来の装置と本発明によるマルチキャピラリー試料調製装置とを比較した、試料の容量および回収性能（１０Ａ）、再現性（１０Ｂ）、および時間性能（１０Ｃ）を示すゲルである。比較データは、表２に示す。図１１Ａは、ＤＮＡの精製に用いられる従来のスピンカラムの斜視図である。図１１Ｂおよび１１Ｃは、スピンカラムのＳＥＭ画像である。図１１Ａは、ＤＮＡの精製に用いられる従来のスピンカラムの斜視図である。図１１Ｂおよび１１Ｃは、スピンカラムのＳＥＭ画像である。図１１Ａは、ＤＮＡの精製に用いられる従来のスピンカラムの斜視図である。図１１Ｂおよび１１Ｃは、スピンカラムのＳＥＭ画像である。図１２Ａおよび１２Ｂはそれぞれ、従来のスピンカラムと本発明のマルチキャピラリー試料調製装置とのＤＮＡの質およびサイズを判定するために実施した、パルスフィールドおよびアガロース・ゲル電気泳動分析である。図１２Ａおよび１２Ｂはそれぞれ、従来のスピンカラムと本発明のマルチキャピラリー試料調製装置とのＤＮＡの質およびサイズを判定するために実施した、パルスフィールドおよびアガロース・ゲル電気泳動分析である。図１３Ａおよび１３Ｂはそれぞれ、ＤＮＡ収率と試料調製に要した時間とに関する、従来のスピンカラムと本発明のマルチキャピラリー試料調製装置との試料の精製結果である。図１３Ａおよび１３Ｂはそれぞれ、ＤＮＡ収率と試料調製に要した時間とに関する、従来のスピンカラムと本発明のマルチキャピラリー試料調製装置との試料の精製結果である。

本発明により、市販のピペットとともに使用する平行キャピラリーアレイまたはマルチキャピラリー試料調製装置１２が提供され、マイクロリットルおよびナノリットル範囲、またより大きい質量負荷および容積での生体試料の単離、精製、濃縮、および／または分画が可能となる。本発明は、手動および自動のピペット、マイクロピペット２０、シリンジ２２、および他の試料取扱い機器または分析機器との使用に適合された、取り外し可能なマルチキャピラリー装置１２、および一体的に組み込まれたマルチキャピラリー装置１２を含む。なお、マルチキャピラリー装置１２は、シリカ系多孔質基材の使用を必要としない。

図１および２を参照すると、上端および下端を有し、チャンバーを画定する一体要素（ロッド、管など）１４を備える試料調製用マルチキャピラリー装置１２が示されている。均一の内径および長さを有するキャピラリー管１６は、チャンバー内に配置される。各キャピラリー管１６は、内腔を画定する、内面および外面を有する非多孔質または無孔の壁を含む。各管１６は、対向する端部に第１および第２の開口部も含み、それにより抵抗および背圧が低くなる。

タンパク質またはペプチドの分離および精製の適用例では、不溶性固定相１８をキャピラリー管１６の無孔内壁上に沈積させることが好ましい。核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）などの極性化合物の分離および精製では、不溶性固定相１８が極性材料を含むことが好ましい。本発明の好ましい実施形態において、固定相１８の厚さは、マルチキャピラリー装置１２の効率を最適にするように、個々のキャピラリー管１６の半径と相関する。結果として、固定相１８の塗布時に、より広いキャピラリーの内面にはより多くの量が沈着し、より狭いキャピラリーの内面にはより少ない量が沈着する。このプロセスによって、キャピラリー１６はほぼ均一となり、これはマルチキャピラリー装置１２の効率を実質的に高める。高いピーク効率を得るための以下の関係が、発明者により導かれた：

固定相膜厚ｄ_ｆは、キャピラリーの半径ｒのｎ乗に比例する（ｎ＞１であり、ｃ_ｆは定数である）。

より好ましい実施形態において、固定相被膜１８の厚さは、キャピラリー管１６の半径のｎ乗に比例し、ｎは１より大きい。

最高のピーク効率を実現するためには、固定相の厚さｄ_ｆは、キャピラリーの半径ｒの３乗に比例する。

固定相媒体１８は、安定した化学結合または架橋によって、無孔中空キャピラリー管１６の内面上に保持される。その結果、分離中に固定相媒体１８が移動相内に放出されることがなく、試料の汚染を減少させる。マルチキャピラリー装置１２の開放管システムでは、支持媒介構成物質ならびに吸着性および膜状のプラグ（例えば、多孔質吸着剤シリカの粒子または繊維）は必要ない。各キャピラリー管１６の管腔または内部空洞は、タンパク質、ペプチド、核酸、または生体試料の分離プロセスを通して、閉塞されず障害物がない状態のままである。この安定した分離の表面媒介機構では、試料分子は、キャピラリー管１６の無孔壁間および無孔壁を通して、あるいは１つのキャピラリーから別のキャピラリーへと拡散することができない。個々のキャピラリー管１６は、物理的および機能的に、互いに無関係のままである。

試料調製用マルチキャピラリー装置１２は、ピペット２０に取り付け可能な適切な形状およびサイズを有するピペットチップ、針、管、または他の筐体の末端部分の周囲に、取り外し可能に（機械的に）取り付けても、あるいは固定的に挿入しても（例えば、溶融または接着により）よい。マルチキャピラリー装置１２は、その第１の端部で移動（液）相の試料を受け取り、塩や緩衝剤などの混入物を含まない、濃縮および精製された試料を装置１２の第２の端部で放出する。

図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ（走査型電子顕微鏡画像）に示されるように、マルチキャピラリー装置１２の構造は独特で、従来のスピンカラムおよびシリカベースの吸着性および膜状の「プラグ」（図３および１１を参照）とは異なる。後者は不規則な空隙と大きく異なる試料経路とを特徴とするが、これらが生体試料を取り込み、それにより半分を超える試料が通常は回収不能となる。マルチキャピラリー装置１２は、その内面上に不溶性固定相媒体１８を有する複数の均一なキャピラリー管１６を備え、それによって試料をマルチキャピラリー装置１２の流路に挿入して、開放された事実上同一の経路を通って前進させることができる。したがって、各キャピラリー管１６の内部空洞または流路は、試料の分離プロセスを通して、閉塞されず障害物がない状態のままである。

図１２および１３に示されるように、マルチキャピラリー装置１２の開放された非閉塞キャピラリーチャネルから抽出された精製（ＤＮＡ）試料断片は、かなり大きい断片を含み、断片の破損または「せん断」の著しい減少を示している。これらの大きい断片は、概して、精製された試料の質が、試料処理に用いられる従来の多孔質シリカプラグと比較して良好であることを反映している。従来の吸着性および膜状のプラグでは、試料は、多孔質材料の曲がりくねった不規則な空隙を通って移動しなければならず、それによって試料の一部が小さい空隙内に留まり、回収することができない。そのため、断片せん断は避けられない。その開放された非閉塞チャネル構造により、本発明のマルチキャピラリー装置１２は、現在試料調製に使用されている海綿様の膨張性および多孔質のシリカ材料と比較して、実質的な均一性および一貫性を実現する。

マルチキャピラリー装置１２の開放された非閉塞チャネル構造によって可能になった試料損失の著しい減少により、既存の多孔質シリカのプラグ、粒子（タンパク質およびペプチドの場合）、および繊維（ＤＮＡおよびＲＮＡの場合）で要求されるように、試料を分離材料に複数回通過させる必要がなくなる。結果、マルチキャピラリー装置１２は、試料の持ち越しによる汚染がないため、概して再利用可能であり、自動機器類に好都合に適合する。要するに、本マルチキャピラリー装置１２は、結合能力、回収率、向上した処理能力、均一性、および再現性に関して、従来の吸着性および膜状のプラグよりも優れた特徴を示す。

本発明の一実施形態において、キャピラリー管１６の無孔内壁は、マルチキャピラリー装置１２の表面積を増大させるために、不活性材料の粒子、もしくは瘤のあるまたは平坦でない表面を含む。このような例では、内壁は、例えば鉱酸もしくは塩基、または有機酸あるいは塩基などの溶媒と組み合わせたエッチングプロセスを用いることによって、改変することができる。

本発明は、液体クロマトグラフィーおよび試料調製の適用例に適合された、任意の固定相１８および界面化学の使用を包含する。いくつかの実施形態において、キャピラリー壁の内面上に沈積された固定相媒体１８は、有機分子、バイオポリマー、またはより大きい粒子の単層を含む。かかる分子および粒子には、炭化水素およびそのＣ−、Ｎ−、Ｓ−、およびＰ−誘導体；タンパク質、核酸、および多糖類；線状および架橋ポリシロキサンおよびその他のポリマー；ならびにウイルスおよび細胞が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、固定相被膜１８は、キャピラリー１６の内面を有機ケイ素化合物で処理し、これらの基を適当な試薬および粒子でさらに修飾することによって形成される。

固定相１８の沈積のための代替技法は、キャピラリー管１６の内壁上での、例えばブタジエン、スチレン、ジビニルベンゼンなどの不飽和化合物の重合を伴う。

下記の実施例に記載される固定相材料１８の沈積に用いられる技法は、アセトニトリル、メタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、および尿素；酢酸、ヨード酢酸、トリフルオロ酢酸、およびギ酸；ならびにリン酸塩、酢酸塩、および炭酸塩緩衝液など、試料調製および液体クロマトグラフィーに一般に用いられる有機溶媒および水−有機溶媒に対して、固定相材料を不溶性にする。

マルチキャピラリー試料調製装置１２は、有利には、広範な試料調製および分析機器との使用に適している。図１、４、および５に示されるように、これらには手動および自動ピペットならびにマイクロピペット２０、シリンジ２２、使い捨て装置、および自動試料取扱い機器が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、マルチキャピラリー装置１２は、例えば滑合または圧入によって、ピペットチップ２０またはその他の適当な筐体の終端部の周囲に挿入され、弾性シーリングリングおよび／または筐体の壁などの機械的手段によって、取り外し可能に所定の位置に保持される。

別の実施形態において、マルチキャピラリー装置１２は、溶融、熱収縮、または接着によって、ピペットチップ２０またはその他の筐体の終端領域の周囲に一体的かつ永久的に組み込んで（例えば、現場成型）、一般にポリプロピレンまたはその他の熱可塑性材料から作られたピペットチップ２０または他の筐体の表面に一体要素１４を融合させる。代替として、プラズマおよび／または化学的手段を用いて、一体要素１４をピペットチップ２０または他の筐体の表面に接着することもできる。

さらに別の実施形態において、マルチキャピラリー装置１２は、実質的に円筒形、円錐形、または他の筐体形態の中空流路と、取り外し可能にまたは固定的に係合するように、あるいは一列に揃うように適合される。マルチキャピラリー装置１２は、様々なサイズおよび形態のハウジングに組み込むために、好適なサイズと形状にする。ただし、筐体の容積は、好ましくは約０．１μＬから約１００ｍＬの範囲であり、より好ましくは約１から約１０００μＬの範囲であり、最も好ましくは約２から約２００μＬの範囲である。

ピペット２０による操作のためのピペットチップまたは他の筐体内にマルチキャピラリー装置１２を設置するために用いられるあらゆる技法は、液相状態の試料を一体要素１４のキャピラリー管１６を通して、要素１４を回避することなく正確に方向付けるべきであることは理解されるであろう。かかる適合において、マルチキャピラリー装置１２は、その第１の端部で試料を受け取り、塩や緩衝剤などの混入物を含まない、濃縮および精製された試料を第２の端部で放出する。本発明のマルチキャピラリー装置１２は、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、および他の分子ならびにバイオポリマーだけでなく、ウイルス、胞子、細胞（例えば、癌細胞および幹細胞）、および微生物も自由に透過できる。ただし、試料分子が１つのキャピラリー管１６から別のキャピラリー管に拡散できないことは理解されるであろう。

本発明の一体要素１４、キャピラリー管１６、チップ、ピペット２０、シリンジ２２、および他の筐体を作製するための好ましい材料には、ガラス、溶融シリカ、セラミック、金属（例えば、ステンレススチール）、およびプラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、またはポリエーテルエーテルケトン）が含まれるが、これらに限定されない。試料調製およびクロマトグラフィーの適用例では、多数（例えば、数百または数千）のキャピラリー管を使用して、試料装填容量を向上させるための十分な表面積を提供することが望ましい。ただし、本発明で使用されるマルチキャピラリー装置１２、固定相媒体１８、溶媒、チップ、および他の筐体の数ならびに寸法は、適用に応じて異なるであろうことは理解されるであろう。

例として、マルチキャピラリー装置１２に備えられるキャピラリー管１６の数は、約１００から約１，０００，０００の範囲としてよい。各キャピラリー管１６の内径は、約０．１μｍから約２００μｍの範囲としてよい。一体要素１４の外径は、約０．１ｍｍから約１ｍの範囲としてよく、長さは、約０．１ｍｍから約２ｍの範囲としてよい。好ましい実施形態において、キャピラリー管１６の数は約１０００から約１０，０００の範囲であり、各キャピラリーの内径は約５μｍから約１００μｍの範囲であり、一体要素１４の外径は約１ｍｍから約２０ｍｍの範囲であり、長さは約１ｍｍから約２５０ｍｍの範囲である。

（実施例１）
Ｃ−１固定相
トルエンにトリメチルクロロシラン５％を含む溶液を１０μＬ／分にて６時間ポンプで送出し、直径１０μｍのキャピラリーおよそ４４００本が貫通した外径１ｍｍ×長さ２５０ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッドに１０５℃で通す。マルチキャピラリーロッドをトルエン、アセトン、およびメタノールで濯ぎ、窒素気流で乾燥させる。

（実施例２）
Ｃ−４固定相
トルエンにブチルジメチルクロロシラン１０％を含む溶液を４０μＬ／分にて６時間ポンプで送出し、直径２５μｍのキャピラリーおよそ４６００本が貫通した外径２ｍｍ×長さ３００ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッドに１０５℃で通す。マルチキャピラリーロッドをトルエン、アセトン、およびメタノールで濯ぎ、窒素気流で乾燥させる。

（実施例３）
Ｃ−８固定相
トルエンにオクチルトリクロロシラン１０％を含む溶液を５０μＬ／分にて６時間ポンプで送出し、直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ２５０ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッドに１０５℃で通す。マルチキャピラリーロッドをトルエン、アセトン、およびメタノールで濯ぎ、窒素気流で乾燥させる。

（実施例４）
Ｃ−１２固定相
トルエンにドデシルトリクロロシラン５％を含む溶液を７５μＬ／分にて６時間ポンプで送出し、直径６５μｍのキャピラリーおよそ３３００本が貫通した外径６ｍｍ×長さ３００ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッドに１０５℃で通す。マルチキャピラリーロッドをトルエン、アセトン、およびメタノールで濯ぎ、窒素気流で乾燥させる。

（実施例５）
Ｃ−１８固定相１
トルエンにオクタデシルトリエトキシシラン１０％を含む溶液を１０μＬ／分にて６時間ポンプで送出し、清潔で乾燥した、直径２０μｍのキャピラリーおよそ４，０００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ３００ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッドに１０５℃で通す。溶液をポンプで送出しながら、１５０℃に加熱したオーブン内で、マルチキャピラリー装置の反対端を線速度０．５ｍｍ／分で移動させる。装置をトルエン、アセトン、およびメタノールで濯ぎ、窒素気流で乾燥させる。

（実施例６）
Ｃ−１８固定相２
直径１０μｍのキャピラリーおよそ４４００本が貫通した外径１ｍｍ×長さ２．５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、トルエンにオクタデシルジメチルクロロシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器および塩化カルシウム管を装備したフラスコ内に設置する。混合物を６時間ゆっくりと還流する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、テトラヒドロフラン、およびメタノールで繰り返し洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例７）
Ｃ−１６、Ｃ−３０、フェニル、ナフチル、およびシアノ固定相
実施例６に記載の条件に従い、Ｃ−１６、Ｃ−３０、フェニル、ナフチル、およびシアノ基を有する固定相を、それに対応して、ヘキサデシルトリクロロシラン、トリアコンチルトリクロロシラン、フェネチルトリクロロシラン、（１−ナフチルメチル）トリクロロシラン、および３−シアノプロピルトリクロロシランから調製する。

（実施例８）
エポキシド固定相
直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、トルエンに（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を５時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持して、反応によって調製されたメタノールを除去する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、テトラヒドロフラン、およびメタノールで繰り返し洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例９）
ジオール固定相１
直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ３ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、トルエンに（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を３時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、テトラヒドロフラン、メタノール、および水で繰り返し洗浄する。水５０ｍＬを加え、硝酸を用いてｐＨを２．０に調整する。混合物を室温で２時間ゆっくりと攪拌する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドを水で洗液が中性になるまで洗浄し、その後メタノールで３回洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例１０）
ジオール固定相２
（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシシラン２．５ｇを水５０ｍＬが入ったフラスコに滴下し、その間０．０１Ｍ水酸化カリウムを用いてｐＨを５〜６に維持する。直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本をフラスコ内に設置する。還流冷却器を用いて、混合物を３時間ゆっくりと還流する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドを水、メタノール、およびテトラヒドロフランで繰り返し洗浄する。水５０ｍＬを加え、硝酸を用いてｐＨを２．０に調整する。混合物を室温で２時間ゆっくりと攪拌する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドを水で洗液が中性になるまで洗浄し、その後メタノールで３回洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例１１）
アミノ固定相
直径１０μｍのキャピラリーおよそ４４００本が貫通した外径１ｍｍ×長さ２．５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２５本を、トルエンに３−アミノプロピルトリメトキシシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を５時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、テトラヒドロフラン、およびメタノールで繰り返し洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例１２）
トリメチルアンモニウム固定相
直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、トルエンに３−アミノプロピルトリメトキシシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を６時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、テトラヒドロフラン、およびメタノールで繰り返し洗浄する。フラスコに、メタノールにトリメチルアミン５％を含む溶液３０ｍＬを加える。フラスコに塩化カルシウム管を装備し、混合物を０〜５℃で４８時間ゆっくりと攪拌する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをメタノール、水、０．０１ＭＨＣｌ、水、およびテトラヒドロフランで繰り返し洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例１３）
カルボン酸固定相
直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、カルボキシエチルシラントリオール（ナトリウム塩）の５％水溶液５０ｍＬが入ったフラスコ内に設置する。塩酸を加えて、ｐＨを２．０に調整する。還流冷却器を用いて、混合物を３時間ゆっくりと還流する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドを水で洗液が中性になるまで洗浄し、その後メタノールで３回洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例１４）
スルホン酸固定相
直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ３ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２５本を、３−（トリヒドロキシシリル）−１−プロパンスルホン酸の５％水溶液５０ｍＬが入ったフラスコ内に設置する。還流冷却器を用いて、混合物を３時間ゆっくりと還流する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドを水で洗液が中性になるまで洗浄し、その後メタノールで３回洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例１５）
リン酸固定相
直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ３ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド３０本を、（３−トリヒドロキシシリルプロピル）メチルホスホン酸ナトリウム塩の５％水溶液５０ｍＬが入ったフラスコ内に設置する。混合物をＨＣＬでｐＨ２．０に酸性化し、還流冷却器を用いて３時間ゆっくりと還流する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドを水で洗液が中性になるまで洗浄し、その後メタノールで３回洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例１６）
イミノ二酢酸固定相
直径１０μｍのキャピラリーおよそ４４００本が貫通した外径１ｍｍ×長さ２．５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、トルエンに（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を５時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、テトラヒドロフラン、メタノール、および水で繰り返し洗浄する。０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に２Ｍイミノ二酢酸を含む溶液２０ｍＬを加え、混合物を室温で２４時間ゆっくりと攪拌する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドを水で洗液が中性になるまで洗浄し、その後メタノールで３回洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例１７）
システイン固定相
直径１０μｍのキャピラリーおよそ４４００本が貫通した外径１ｍｍ×長さ２．５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２５本を、トルエンに３−ブロモプロピルトリメトキシシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を５時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、テトラヒドロフラン、およびメタノールで繰り返し洗浄する。メタノールにシステイン１％を含む溶液５０ｍＬとトリエチルアミン１ｍＬとを加え、還流冷却器を用いて混合物を５時間ゆっくりと還流する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをメタノール、水、メタノール、および塩化メチレンで繰り返し洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例１８）
グルタチオン固定相
直径１０μｍのキャピラリーおよそ４４００本が貫通した外径１ｍｍ×長さ２．５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、トルエンに１１−ブロモウンデシルトリメトキシシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を５時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、テトラヒドロフラン、およびメタノールで繰り返し洗浄する。メタノールにグルタチオン０．５％を含む溶液５０ｍＬとトリエチルアミン１ｍＬとを加え、還流冷却器を用いて混合物を５時間ゆっくりと還流する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをメタノール、水、メタノール、および塩化メチレンで繰り返し洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例１９）
キラル固定相
トルエンに（Ｒ）−Ｎ−１−フェニルエチル−Ｎ′−トリエトキシシリルプロピル尿素５％を含む溶液を１０μＬ／分にて６時間ポンプで送出し、直径１０μｍのキャピラリーおよそ４０００本が貫通した外径１ｍｍ×長さ３００ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッドに１０５℃で通す。マルチキャピラリーロッドをトルエン、テトラヒドロフラン、およびメタノールで濯ぎ、窒素気流で乾燥させる。

（実施例２０）
ポリブタジエン固定相
イソオクタンにビニルトリクロロシラン１０％を含む溶液を２０μＬ／分にて６時間ポンプで送出し、直径１０μｍのキャピラリーおよそ４，４００本が貫通した外径１ｍｍ×長さ２５０ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッドに９０℃で通す。マルチキャピラリーロッドをイソオクタン、テトラヒドロフラン、メタノール、トルエン、およびイソオクタンで濯ぐ。イソオクタン１００ｍＬにポリブタジエン１００ｍｇ（分子量３，４００）と過酸化ジクミル０．５ｍｇとを含む溶液１００ｍｇを１０μＬ／分にて６時間ポンプで送出し、マルチキャピラリーガラスロッドに９０℃で通す。マルチキャピラリーロッドをトルエン、テトラヒドロフラン、およびメタノールで濯ぎ、窒素気流で乾燥させる。

（実施例２１）
ビオチン固定相
直径１０μｍのキャピラリーおよそ４４００本が貫通した外径１ｍｍ×長さ２．５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２５本を、トルエンに３−アミノプロピルトリメトキシシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を５時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、メタノール、およびジメチルホルムアミドで繰り返し洗浄する。ビオチンの飽和ジメチルホルムアミド溶液１５ｍＬと、ジメチルホルムアミド１０ｍＬに１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物０．３ｇを含む溶液と、ジメチルホルムアミド１０ｍＬにＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド０．２５ｇを含む溶液とを加え、混合物を室温で５時間ゆっくりと攪拌する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをジメチルホルムアミド、メタノール、水、メタノール、および塩化メチレンで繰り返し洗浄し、室温で乾燥させる。

（実施例２２）
ヘパリン固定相
直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ２．５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、トルエンに３−アミノプロピルトリメトキシシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を５時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、メタノール、水、および０．０５Ｍ２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．６）で繰り返し洗浄する。０．０５Ｍ２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．６）に、ヘパリン（ウシ腎臓由来）０．２ｇ、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド１ｇ、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．５ｇを含む溶液１０ｍＬを加える。混合物を室温で３時間ゆっくりと攪拌する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドを水、リン酸緩衝液（ｐＨ８）、および２０％塩化ナトリウムで洗浄し、その後水で洗浄して、４℃で保管する。

（実施例２３）
糖タンパク質固定相
直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ３ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、トルエンに（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシシラン５％を含む溶液２０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を５時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、メタノール、および水で繰り返し洗浄する。０．４Ｍ塩化ナトリウムと０．２Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）の１：１混合物にα１酸（ウシ血漿由来）１００ｍｇを含む溶液４ｍＬを加える。混合物を室温で４８時間ゆっくりと攪拌する。液相を分離する。マルチキャピラリーロッドを０．４Ｍ塩化ナトリウムと０．２Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）の１：１混合物で繰り返し洗浄し、その後水で洗浄して、４℃で保管する。

（実施例２４）
トリプシン固定相
直径２５μｍのキャピラリーおよそ４６００本が貫通した外径２ｍｍ×長さ５ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、トルエンに（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシシラン５％を含む溶液２０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を５時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、メタノール、および水で繰り返し洗浄する。０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にトリプシン（ウシ膵臓由来）１００ｍｇを含む溶液７ｍＬをフラスコに加える。混合物を室温で１５時間ゆっくりと攪拌し、液相を分離する。マルチキャピラリーロッドを０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、水、０．２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で２時間繰り返し洗浄し、その後水で洗浄して、４℃で保管する。

（実施例２５）
アビジン、レクチン、およびプロテインＡ固定相
実施例２４に記載の条件に従い、アビジン、レクチン、およびプロテインＡ固定相を、それに対応して、アビジン（卵白由来）、レクチン（アガリクス・ビスポラス由来）、およびプロテインＡ（黄色ブドウ球菌由来）を用いて調製する。

（実施例２６）
抗体固定相
直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本が貫通した外径２．３ｍｍ×長さ３ｍｍのマルチキャピラリーガラスロッド２０本を、トルエンに１０−（カルボメトキシ）デシルジメチルメトキシシラン５％を含む溶液５０ｍＬが入った、還流冷却器を装備したフラスコ内に設置する。混合物を３時間ゆっくりと還流する間、冷却器を温度７０℃で維持する。液相を分離し、マルチキャピラリーロッドをトルエン、メタノール、および塩化メチレンで繰り返し洗浄する。塩化メチレンにトリメチルヨードシラン１ｍＬを含む溶液３５ｍＬを加える。混合物を室温で７２時間ゆっくりと攪拌する。

液相を分離し、マルチキャピラリーロッドを塩化メチレン、メタノール、９０％メタノール、および水で繰り返し洗浄する。０．１Ｍ２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に０．０２Ｍエチル（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを含む溶液２０ｍＬを加え、混合物を室温で１時間ゆっくりと攪拌する。液相を分離し、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）にリシン抗体５μｇ／ｍＬを含む溶液５ｍＬを加える。混合物を室温で２時間ゆっくりと攪拌する。液相を分離する。マルチキャピラリーロッドをリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で繰り返し洗浄し、そのあと水で洗浄して、４℃で保管する。

（実施例２７）
ポリプロピレン製ピペットチップ形式マルチキャピラリー試料調製装置
実施例６に記載されるように調製した外径１ｍｍ〜５ｍｍのマルチキャピラリー要素１０を、容積１０μＬ〜５，０００μＬのポリプロピレン製マイクロピペットチップの下端に向けてしっかりと押す。ポリプロピレンが軟化し始める温度にサーモスタットで調節されたオーブンに、ピペットチップの下部を１０分間入れる。図４Ａおよび４Ｂに、試料調製用ポリプロピレン製ピペットチップ形式マルチキャピラリー装置１２、２０を示す。

（実施例２８）
ポリエチレン製ピペット形式マルチキャピラリー試料調製装置
実施例６に記載されるように調製した外径１ｍｍ〜５ｍｍのマルチキャピラリー要素１０を、使い捨てのポリエチレン製ホールピペットの下端にしっかりと収める。ポリエチレンが軟化し始める温度にサーモスタットで調節されたオーブンに、ピペットの下部を１０分間入れる。図４Ｃに、試料調製用ポリエチレン製ピペット形式マルチキャピラリー装置１２、２０を示す。

（実施例２９）
シリンジ形式マルチキャピラリー試料調製装置（１）
実施例５に記載されるように調製した外径２ｍｍのマルチキャピラリー要素１０を熱収縮管に取り付ける。除去可能なシリンジ針を熱収縮管の第２の端部に取り付ける。熱収縮管区域をその収縮管に推奨される温度で１０分間加熱する。図５Ａに、代表的な試料調製用シリンジ形式マルチキャピラリー装置１２、２２を示す。

（実施例３０）
シリンジ形式マルチキャピラリー試料調製装置（２）および（３）
実施例５に記載されるように調製した外径２．３ｍｍのマルチキャピラリー要素１０を除去可能な熱可塑性シリンジハブにしっかりと収める。熱可塑性物質が軟化し始める温度にサーモスタットで調節されたオーブン内で、ハブを１０分間加熱する。図５Ｂおよび５Ｃに、試料調製用シリンジ形式マルチキャピラリー装置１２、２２を示す。

（実施例３１）
３成分混合物の分離
実施例５に記載されるように調製し、標準ＨＰＬＣ付属品を用いてＬＣ−６００型Ｓｈｉｍａｄｚｕ液体クロマトグラフ装置に設置した試料調製用マルチキャピラリー装置上で、３成分混合物（ウラシル、フルオレン、およびフェナントレン）を分離する。クロマトグラフ条件およびクロマトグラムを図６に再現する。クロマトグラムは、約１．８分でウラシルのピークを、約２．１分でフルオレンのピークを、約２．４分でフェナントレンのピークを示している。この実施例は、本発明の試料調製用マルチキャピラリー装置を用いた液体クロマトグラフィーの適用例を示しており、これにより典型的な有機混合物を３分未満で分析することが可能となる。

（実施例３２）
ＨＰＬＣ分析のための試料濃縮
図７Ａを参照すると、実施例５に記載されるように調製した、直径４０μｍのキャピラリーおよそ１，４００本を含む外径２．３ｍｍ×長さ１００ｍｍの試料調製用マルチキャピラリーＣ−１８装置を用いて、ＨＰＬＣ分析前に試料を濃縮している。現在のところ、固相抽出（「ＳＰＥ」）カートリッジとして既知の短いＨＰＬＣカラムが、試料調製に一般的に使用されている。ＳＰＥカートリッジと比較すると、試料調製用マルチキャピラリー装置１２ははるかに速く、簡単で、また再利用可能である。表１に、本試料調製用マルチキャピラリー装置１２（図７Ａ）の標準ＳＰＥカートリッジ（図７Ｂ）と比較した性能を示す。

（実施例３３）
ウシ血清アルブミンの加水分解
アセトニトリルと０．２ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．５）の４０：６０混合物にウシ血清アルブミン０．２５ｍｇ／ｍＬを含む溶液１０μＬ量を、実施例２４に記載されるように調製したマルチキャピラリー試料調製装置に吸引し、サーモスタットで３７℃に調節する。５分後、消化された試料をバイアルに分注し、４℃で保管する。

（実施例３４）
ペプチド試料の脱塩
実施例３４に記載されるように調製したウシ血清アルブミン消化物を窒素気流で乾燥させ、１０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に溶解する。実施例５および２７に記載されるように、この試料１μＬをマルチキャピラリー試料調製装置から吸引、分注する。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５％アセトニトリル／水１０μＬの３回分をマルチキャピラリー試料調製装置へ／からポンプで送入、送出した。０．１％ＴＦＡを含む７０％アセトニトリル／水５μＬ分を用いて、マルチキャピラリー試料調製装置から試料を溶出させ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析する。図８Ａおよび８Ｂに、脱塩前後の試料のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す。

（実施例３５）
ペプチドの分画
実施例３４に記載のように、ウシ血清アルブミンの酵素加水分解によって得られた１００ピコモル／μＬペプチド混合物３μＬ量を、長さ１０ｃｍのＣ−１８マルチキャピラリー試料調製装置に導入する。０．１％ＴＦＡ水溶液１００μＬ、続いて０．１％ＴＦＡを含む４０％アセトニトリル／水３０μＬを用いて、試料を１００μＬ／分で溶出する。４０％アセトニトリル／水３μＬを１０画分採取し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析する。図９Ａおよび９Ｂに、第３画分および第６画分の質量スペクトルを示す。この実施例は、複雑なペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析前の、本発明のマルチキャピラリー試料調製装置の分画能力を示している。

（実施例３６）
タンパク質のゲル電気泳動
図１０Ａおよび１０Ｂは、市販の多孔質シリカベースの装置と比較して、本発明による試料調製用マルチキャピラリー装置の試料容量、回収率、および再現性を評価するために調製されたゲルを示している。レーン１および１０は、比較の目的で挿入されたタンパク質標準物質である。レーン２〜５は従来の装置を表し、レーン３〜１０は本発明のマルチキャピラリー試料調製装置を示している。

電気泳動に使用する試験試料は、以下の４種の代表的なタンパク質の混合物である：ホスホリラーゼＢ（分子量９７，４００）、ウシ血清アルブミン（分子量６６，２００）、炭酸脱水酵素（分子量３１，０００）、およびリゾチーム（分子量１４，４００）。これらのタンパク質は、大きさが異なり、特性が一般的に知られていることから選択された。さらに、これらのタンパク質は、標準物質として一般に用いられている。全ての結果は、精度を確保するために、数回再現および再試験した。試験は、ＣｈｒｏｍＢＡ，Ｉｎｃ．（米国ペンシルベニア州ステートカレッジ）、ＴｈｅＭａｔｅｒｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（米国ペンシルベニア州ユニバーシティーパーク）、ＴｈｅＭｉｌｔｏｎＨｅｒｓｈｅｙＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ（米国ペンシルベニア州ハーシー）、ＨｕｃｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（米国ペンシルベニア州ユニバーシティーパーク）、ＡＰＤＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．（米国ペンシルベニア州ステートカレッジ）、およびＭａｓｓＴｅｃｈＩｎｃ．（米国メリーランド州コロンビア）で実施した。合計４０を超えるゲルを使用したが、これには市場で最も普及している２つの相、Ｃ_１８およびＣ_４が含まれる。さらに、５００を超える試料調製装置を試験した。

両図において、従来のシリカベースの装置（図１０Ａ：レーン２〜５；図１０Ｂ：レーン１〜２）は、薄くかつ様々なバンドを示している。対照的に、本発明の装置（図１０Ａ：レーン６〜９；図１０Ｂ：レーン３〜１０）は、はっきりした濃いバンドを示し、はるかに優れた結合能力および回収率を表している。さらに、本装置のバンドは、明らかにレーン間でより同一であり、優れた再現性を表している。表２に示されるように、さらなる定量化により、本発明の試料調製装置は、平均して、従来の装置によって結合および解放されるタンパク質のほぼ２倍を結合および解放し、また半分の誤差の範囲（結合された試料の量の差異）を示すことが明らかにされている。

図１０Ｃは、本発明による試料調製用マルチキャピラリー装置の使用速度（時間性能）を市販のシリカベースの装置と比較して評価するために作製されたゲルを示している。製造業者が推奨するように、適切な結果を得るためには、試料をシリカベースの装置のチップにおよそ１０回通過させなければならない。その主な理由として、ほとんどの試料は、濾材の大きい空隙を通って移動し、実質的に吸着および除去されないことがあげられる。具体的には、図１０Ｃのレーン１〜４に示されるように、従来の装置は、チップを１０回通過させた後でさえ薄いバンドを示している。

対照的に、レーン５〜１０は、本発明のマルチキャピラリー装置を１回のみ通過させた試料のほぼ同一の地点を示している。注目すべきことに、バンドは、シリカベースの装置のものよりもはるかに濃くかつ幅広く、はるかに多量のタンパク質が存在することを示している。

図１０Ａ〜１０Ｃにおいて、電気泳動によって生じたゲル上のバンドの濃さとサイズは、試料調製装置（すなわち、一体型のシリカベースのプラグを備えるピペットチップ対マルチキャピラリー要素）によって結合され、試料調製装置から回収されたタンパク質の量を示している。本発明のマルチキャピラリー装置１２の優れた性能は、図２に示されるように、良好なチップ間の複製に加え、試料が均一で一貫した事実上同一の経路で装置を通過することに一部起因する。図３および図１１は、対照的に、市販の（市場を先導する）多孔質シリカおよびシリカ繊維ベースの試料調製装置の断面を示している。シリカベースの装置は、不規則な粒径および繊維径、大きい空隙（濃い部分）、ならびに大きく異なる試料経路を示している。さらに、従来の装置は、チップ間の不十分な複製（すなわち著しい差異）を示している。

（実施例３７）
核酸の単離
シリンジ２２形式、ピペットチップ２０形式双方のマルチキャピラリー装置１２を扱う以下の実験は、マルチキャピラリー装置を試料取扱い、および組織、血液、細菌細胞、尿などの種々の生体試料からのＤＮＡの抽出に用いる利点を明らかにしている。

試料調製用マルチキャピラリー装置１２（外径１〜２．５ｍｍ、長さ０．２５〜３ｃｍ、直径１０〜４０μｍのキャピラリーおよそ４０００本、内部容積２〜９０μＬ）に、溶解した生体試料１０〜１，０００μＬを２回装填する。装填溶液廃棄後、マルチキャピラリー装置１２を洗浄緩衝液で濯ぎ、タンパク質および他の非ＤＮＡ型物質を排除する。次に、溶出緩衝液１０〜３００μＬを用いて、吸着したＤＮＡを溶出する。ＰａｃｋａｒｄＦｌｕｏｒｏＣｏｕｎｔ装置での５３０ｎｍにおけるＹｏ−Ｐｒｏ蛍光（収率の判定）、アガロース・ゲル電気泳動（質の判定）、およびパルスフィールドゲル電気泳動（ＤＮＡのサイズおよび質の判定）を含む種々の方法を用いて、溶出されたＤＮＡを分析する。

図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ、本発明による２５μｍ×１ｃｍ×２００μＬのピペットチップ形式マルチキャピラリー装置１２、２０、および市販の（市場を先導する）スピンカラム１６本を用いた、ラット肝臓の１６試料の精製結果をＤＮＡ収率および試料調製に要した時間に関して比較する棒グラフである。ＤＮＡ収率のデータはＹｏ−Ｐｒｏ蛍光を用いて取得し、時間は試料ごとにストップウォッチを用いて記録した。本実験は、本発明のマルチキャピラリー装置１２が、ＤＮＡ収率に関しては従来のスピンカラムと同程度であるが、処理に要する時間は著しく短いことを明らかにしている。注目すべきことに、本マルチキャピラリー装置の使用により、ＤＮＡ単離の試料調製のための「実地」作業時間は７分の１に減少する。

アガロース・ゲル電気泳動およびパルスフィールドゲル電気泳動分析は、ＤＮＡの質とサイズを判定するために実施した。図１２Ｂは、ピペットチップ形式マルチキャピラリー装置（レーン１〜７）、および市販のスピンカラム（レーン８〜９）を用いてウシ全血から抽出したＤＮＡを分析するために実施した０．８％アガロース・ゲルを示しているが、これは同程度のＤＮＡの収率および質を示している。さらに、図１２Ａに示されるように、パルスフィールドゲル電気泳動を利用して、本発明のマルチキャピラリー装置１２、および市販のスピンカラムを用いて精製された試料のＤＮＡ鎖の長さを分類した。主要なスピンカラムと比較して、本マルチキャピラリー装置１２を用いて抽出した試料は、かなり大きなＤＮＡ断片を示し、これは試料処理時におけるＤＮＡの損傷または「せん断」の著しい減少を示唆している。大きなＤＮＡ断片は、精製試料のより高い質を反映しているが、これはＰＣＲおよび配列決定などの多くの下流の適用例にとって非常に望ましい。

図１２および１３に表されるように、遠心機を用いて操作される市販のスピンカラムを用いて処理した検体では、著しいＤＮＡのせん断が避けられない。しかしながら、本発明のマルチキャピラリー装置１２では、不溶性の表面媒介分離機構を用いることにより、ＤＮＡのせん断はおおむね回避されるが、この機構は、試料処理を通して、キャピラリーチャネル（管腔）が開放され、閉塞されない状態のままにする。一般に利用されている遠心機の代わりに、試料処理に穏やかなピペット操作手段を用いることはさらに、本明細書において開示されるマルチキャピラリー装置１２を用いて処理したＤＮＡの質およびサイズにも貢献する。

表３は、上述の方法によって調製した５つのマルチキャピラリー装置１２の吸着性の読取りを示している。平均ＤＮＡ回収収率は５０〜６０％であり、これは試料調製用マルチキャピラリー装置１２が核酸の試料取扱い、精製、および単離に有効であることを示している。

（実施例３８）
細胞の試料取扱い
細胞の試料取扱いのためのマルチキャピラリー装置１２の使用を実証するため、以下の細胞を増殖させて評価した：マウス骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇｌ４、サイズおよそ２５μｍ；マウスマクロファージＪ７７４Ａ１、サイズおよそ１５μｍ；およびヒト前立腺腫瘍ＴＨＰ−１、サイズおよそ２０μｍ。シリンジ形式試料調製用マルチキャピラリー装置１２、２２（外径２．３ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、直径４０μｍのキャピラリーおよそ１４００本、内部容積２６２μＬ）をシリンジに取り付け、平衡塩類溶液１ｍＬで濯ぎ、細胞生存率を導く環境を作る。室温で、１．５〜３．０ｍＬ量の細胞懸濁液を流速１ｍＬ／分でマルチキャピラリー装置に通過させ、続いて０．５ｍＬ量の平衡塩類溶液を通過させる。溶出された細胞懸濁液を遠心分離によって濃縮し、血球計を用いて細胞を計数する。マルチキャピラリー装置通過後の細胞生存率の変化を、表４に示す。

本データは、装置を通過した各細胞種の大部分が、無傷で現れることを明らかにしている。したがって、試料調製用マルチキャピラリー装置は、細胞の試料取扱いに非常に有効である。

既存のピペットチップの製造業者は、その技術文献において、４０〜６０％の試料損失が、精製生成物の平均であると記載している。対照的に、本発明によって提供される増加した容量と回収率は、ピペットチップにおける試料損失という重大な問題を実質的に軽減および／または排除する。さらに、本発明は従来のシリカベースの装置が必要とするような繰り返しの試料通過を避けることから、機器の消耗も低減される。

前述の実施例１〜３８に示されるように、本発明のマルチキャピラリー装置１２は、使用者が、かなり短時間で、優れた試料調製結果を得ることを可能にする。実際、良質の結果を迅速かつ再現可能に返す装置１２の能力により、使用者は、利用可能な試料調製ステーションの処理能力を、使用する試料およびシステムに応じて、少なくとも数倍増加させることができる。

要するに、本発明のマルチキャピラリー試料調製装置１２は、有利には、試料処理能力を向上させ、高い再現性という形で差異を減少させる。マルチキャピラリー装置１２は、本発明の範囲から逸脱することなく、数々の適用例において使用することができる。これには、小分子、ポリマー、ウイルス、および細胞の試料取扱い；生体試料、およびＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸の単離、精製、濃縮、脱塩、および分画；固相抽出；ヘッドスペース分析；ガスクロマトグラフィー；液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）；超臨界クロマトグラフィー；電気クロマトグラフィー；およびキャピラリー電気泳動が含まれるが、これらに限定されない。

上述の適用例の代表例には、タンパク質、ペプチド、およびポリヌクレオチドなどの生体試料の試料調製、質量分光分析前のペプチド混合物の分画、機器分析前の試料の脱塩、ペプチド溶液の脱塩、タンパク質溶液の脱塩、機器分析前の試料濃縮、および質量分光分析前のペプチド濃縮が含まれる。

本発明は、実施例およびその好ましい実施形態に関して具体的に示され記載されているが、当業者には、本発明の趣旨および適用範囲を逸脱することなく、形態および詳細に様々な変更を行なうことができることは理解されるであろう。

Claims

生体試料の取扱いに特に有用な試料調製装置であって、
（ａ）要素の上端で試料を受け取とり、該要素の下端で濃縮、精製、または分離された試料を放出するための要素であって、空洞を画定する要素と、
（ｂ）前記空洞内に配置され、それぞれのキャピラリー管が内壁と第１および第２の開口部とを有する内腔を画定する複数のキャピラリー管と、
（ｃ）マルチキャピラリー要素を保持するための実質的に円筒形または円錐形の形態を有する筐体であって、試料調製または分析機器への取り付けに適した筐体と、
を備える試料調製装置。
固定相が前記キャピラリー管の内壁上に媒介構成物質を用いずに沈積される、請求項１に記載の試料調製装置。
前記キャピラリー管の内腔は、前記固定相によって閉塞されず、
前記固定相は、高い効率を得るように個々のキャピラリー管の半径と相関する厚さを有する、
請求項２に記載の試料調製装置。
前記固定相は不溶性である、請求項２または３に記載の試料調製装置。
前記不溶性固定相は、前記キャピラリー管の内壁に化学的に結合されている、請求項４に記載の試料調製装置。
前記不溶性固定相は、前記キャピラリー管の内壁に架橋されている、請求項４に記載の試料調製装置。
前記不溶性固定相は、前記キャピラリー管の内壁に架橋され、かつ化学的に結合されている請求項４に記載の試料調製装置。
前記固定相被膜の厚さは、前記キャピラリー管の半径のｎ乗に比例し、ｎは１より大きい、請求項２または３に記載の試料調製装置。
下記の関係が適用できる：

［式中、ｄ_ｆは不溶性固定相の厚さであり、ｃ_ｆは定数であり、ｒはキャピラリーの半径であり、ｎ＞１である］
請求項２または３に記載の試料調製装置。
生体試料の取扱いに特に有用な試料調製装置であって、
（ａ）要素の上端で試料を受け取り、該要素の下端で濃縮、精製、または分離された試料を放出するための要素であって、空洞を画定する要素と、
（ｂ）前記空洞内に配置され、それぞれのキャピラリー管が内壁と第１および第２の開口部とを有する内腔を画定し、前記キャピラリー内壁は無孔構造体を有する複数のキャピラリー管と、
（ｃ）マルチキャピラリー要素を保持するための実質的に円筒形または円錐形の形態を有する筐体であって、試料調製または分析機器への取り付けに適した筐体と、
を備え、
（ｄ）前記キャピラリー内壁の無孔構造体は、前記試料が１つのキャピラリー管から別のキャピラリー管に拡散するのを防止する、
試料調製装置。
固定相が前記キャピラリー管の無孔内壁上に媒介構成物質を用いずに沈積される、請求項１０に記載の試料調製装置。
前記キャピラリー管の内腔は、前記固定相によって閉塞されず、
前記固定相は、高い効率を得るように個々のキャピラリー管の半径と相関する厚さを有する、
請求項１１に記載の試料調製装置。
前記固定相は不溶性であり、それにより分離中に前記固定相の移動相内への放出を防止する、請求項１１または１２に記載の試料調製装置。
下記の関係式が適用できる：

［式中、ｄ_ｆは不溶性固定相の厚さであり、ｃ_ｆは定数であり、ｒはキャピラリーの半径であり、ｎ＞１である］
請求項２または３に記載の試料調製装置。
前記マルチキャピラリー要素は、溶融シリカ、ガラス、セラミック、ステンレススチール、またはポリエーテルエーテルケトンから形成される、請求項１または１０に記載の試料調製装置。
前記キャピラリー管の１つ以上の内径は、約０．１μｍから約２００μｍの範囲にある、請求項１または１０に記載の試料調製装置。
前記マルチキャピラリー要素の外径は、約０．１ｍｍから約２０ｍｍの範囲にある、請求項１または１０に記載の試料調製装置。
前記マルチキャピラリー要素の長さは、約０．１ｍｍから約２５０ｍｍの範囲にある、請求項１または１０に記載の試料調製装置。
前記筐体の容積は、約０．１μＬから約１００ｍＬの範囲にある、請求項１または１０に記載の試料調製装置。
前記筐体は、ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ガラス、溶融シリカ、セラミック、またはステンレススチールから形成される、請求項１または１０に記載の試料調製装置。
前記キャピラリー管の内壁は、前記管の表面積を増大させるための不活性材料の粒子を含む、請求項１または１０に記載の試料調製装置。
前記キャピラリー管の内壁は、前記管の表面積を増大させるための瘤のある表面を含む、請求項１または１０に記載の試料調製装置。
前記試料は、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、バイオポリマー、ウイルス、胞子、細胞、微生物、核酸、またはその他の生物試料を含む、請求項１または１０に記載の試料調製装置。
前記筐体は、チップ、ピペット、マイクロピペット、またはシリンジを含む、請求項１または１０に記載の試料調製装置。
生体試料の取扱いに特に有用な試料調製装置を調製する方法であって、
（ａ）複数のキャピラリー管を含む要素であって、前記要素の第１の端部で試料を受け取り、前記要素の第２の端部で分離された試料を放出するための要素に、固定相溶液を導入する工程と、
（ｂ）同時に、前記要素を前記溶液の蒸発を促進する環境に暴露する工程と、
（ｃ）前記固定相を前記キャピラリー管の内側に架橋あるいは化学的に結合する工程と、
を含み、
（ｄ）前記固定相は、高い効率を得るように個々のキャピラリー管の半径と相関する厚さを有する、
方法。