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JP2010502220A - 骨形態形成タンパク質およびその受容体に対する抗体ならびにその使用方法 - Google Patents

骨形態形成タンパク質およびその受容体に対する抗体ならびにその使用方法 Download PDF

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JP2010502220A JP2009527447A JP2009527447A JP2010502220A JP 2010502220 A JP2010502220 A JP 2010502220A JP 2009527447 A JP2009527447 A JP 2009527447A JP 2009527447 A JP2009527447 A JP 2009527447A JP 2010502220 A JP2010502220 A JP 2010502220A
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Abstract

本発明は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対して高い親和性で特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞および本発明の抗体を発現させるための方法も提供する。免疫複合体、二重特異性分子および本発明の抗体と場合により１つ以上の追加の治療薬を含む薬学的組成物も提供する。本発明は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２により媒介される異常な骨形成および骨化を伴う疾患を治療するための方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２００６年９月５日に出願された米国仮特許出願第６０／８２４，５９６号明細書の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書中に援用される。
発明の分野
本発明は、概して免疫学および分子生物学の分野に関する。より詳細には、本明細書中では、骨形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）タンパク質（ＢＭＰ）およびその受容体に特異的な抗体および他の治療タンパク質、かかる抗体および治療タンパク質をコードする核酸、発明のモノクローナル抗体および他の治療タンパク質を調製するための方法、ならびに疾患、例えばＢＭＰの発現／活性によって媒介され、かつ／またはその受容体の異常な発現／活性を伴う骨疾患および癌を治療するための方法が提供される。
発明の背景
ヒト骨格は２００を超える交連骨格を含む。骨格は、胚形成中に時間的かつ空間的な形成を指示する遺伝的プログラムに従い未分化間充組織から発達する。健常個体では、生後発育には骨折部位での骨再生による新しい骨格因子の開始が含まれる。
骨格形成の正常な調節における改変により、軟部組織内で骨の異常な形成がもたらされうる。シャフリッツ（Ｓｈａｆｒｉｔｚ）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３５：５５５−５６１頁（１９９６年）およびカプラン（Ｋａｐｌａｎ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｕｒｇ．２：２８８−２９６頁（１９９４年）。極端な場合、異所性骨化とも称されるかかる異常な骨形成により、臨床的に有意であるかまたは壊滅的な結果がもたらされ、患者の生活の質が大幅に損なわれうる。異所性骨化の原因は変化し、中枢神経系または軟部組織の損傷；血管疾患（例えばアテローム硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）および弁膜性心疾患）；および関節症（例えば強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、血清反応陰性関節症、および汎発性特発性骨増殖症（ｄｉｆｆｕｓｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｈｙｐｅｒｏｓｔｏｓｉｓ））を通じて把握されうる。他の例では、異所性骨化は、進行性骨化性線維形成異常症または進行性骨異形成（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｏｓｓｅｏｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｉａ）などの遺伝的原因により発生しうる。カプラン（Ｋａｐｌａｎ）ら、「Ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃ Ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」 Ｊ．Ａｍｅｒ．Ａｃａｄ．ｏｆ Ｏｒｔｈ．Ｓｕｒｇ．１２（２）：１１６−１２５頁（２００４年）に概説されている。
脊椎関節炎（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）（ＳｐＡ）は、総じて脊髄炎症、有意な疼痛、および機能障害により特徴づけられる一群の疾患を示し、これらの疾患は患者の生活の質に多大な影響を及ぼす。ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４１：５８−６７頁（１９９８年）；ジンク（Ｚｉｎｋ）ら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２７：６１３−６２２頁（２０００年）；およびダグフィンラド（Ｄａｇｆｉｎｒｕｄ）ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６３：１６０５−１６１０頁（２００４年）。ＳｐＡは、例えば、強直性脊椎炎、乾癬性脊椎関節炎、反応性脊椎関節炎、炎症性腸疾患を併発した脊椎関節炎、および未分化脊椎関節炎などの衰弱性機能障害を含む。
強直性脊椎炎（ＡＳ）および関連の脊椎関節症は、最も一般的な炎症性リウマチ性疾患の中に含まれる。米国および北欧では、これらの障害は、約０．１％〜０．３％の推定有病率（主に２０〜４０歳の個人が罹患）を有する。カン（Ｋｈａｎ）、「Ａ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ：Ｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＬＡ−Ｂ２７ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ」（オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）：オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９９８年））およびサラフ（Ｓａｒａｕｘ）ら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２６：２６２２−２６２７頁（１９９９年）。ＡＳ特有の臨床的特徴は、通常は仙腸骨炎および付着部炎（ｅｎｔｈｅｓｉｔｉｓ）を原因とする炎症性の背痛を含む。ＡＳは、典型的には軸骨格を含むが、末梢関節（肩および股）および関節外構造にも影響を及ぼしうる。
強直性脊椎炎を有する患者は、靱帯骨棘および強直をもたらす、新たな骨形成による最も重篤な脊髄合併症を示す。したがって、ＡＳは異所性骨化を示す複数の疾患のうちの１つである。グラドマン（Ｇｌａｄｍａｎ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．５０：２４−３５頁（２００４年）およびエドモンズ（Ｅｄｍｕｎｄｓ）ら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１８：６９６−６９８頁（１９９１年）。証拠が増えることは、ＡＳでは腱や靱帯が下層の骨に付着するエンテーシスと称される解剖学的領域が病理学的過程の主な標的であることを示唆している。ボール（Ｂａｌｌ）、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．３０：２１３−２２３頁（１９７１年）およびベンジャミン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ）およびマッゴーネイグル（ＭｃＧｏｎａｇｌｅ）、Ｊ．Ａｎａｔ．１９９：５０３−５２６頁（２００１年）。
強直性脊椎炎および関連の脊椎関節症における動物モデル系について記載がなされており、それらの大部分がＡＳとヒト白血球抗原−Ｂ２７（ＨＬＡ−Ｂ２７）の発現との間の密接な関連性に基づくものである。チャン（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｈｅｕｍ．Ｒｅｐｏｒｔｓ ４：５０７−５１２頁（２００２年）に概説されている。ＨＬＡ−Ｂ２７トランス遺伝子のラットへの導入により、脊椎炎を含む多臓器障害（ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の自然発生が誘発される。ハンマー（Ｈａｍｍｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−１１１２頁（１９９０年）。ＨＬＡ−Ｂ２７トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／１０）は、足首または足根関節の進行性硬化を伴う末梢性関節炎を発症しても脊椎は罹患しない。ワインライヒ（Ｗｅｉｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：１０３−１１５頁（１９９５年）。プロテオグリカン、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）およびバーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）のＧ１ドメインのいずれかに対する免疫により、ＢＡＬＢ／ｃマウスで脊椎炎、仙腸骨炎、および付着部炎を含むＡＳ様の病状が誘発されうることも報告されている。グラント（Ｇｌａｎｔ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３０：２０１−２１２頁（１９８７年）およびシ（Ｓｈｉ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４４：Ｓ２４０（２００１年）。ＤＢＡ／１マウスは、関節炎、強直性付着部炎および異常な骨形成の自然発生モデルである。ロリーズ（Ｌｏｒｉｅｓ）ら、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５（６）：１５７１−９頁（２００５年）。マトリックスＧＬＡタンパク質を欠損したマウスは、動脈および軟骨の自発的石灰化を示すことが示されていることから、血管石灰化のためのモデル系として用いられる。ルオ（Ｌｕｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６：７８−８１頁（１９９７年）。
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバの多機能成長因子である。ＢＭＰシグナル伝達は、心臓、神経、および軟骨の発生ならびに出生後の骨形成において役割を果たす。ＢＭＰは、軟骨内骨形成カスケードを異所性に誘発し、骨格および関節の形態形成において重要な役割を果たす。ウリスト（Ｕｒｉｓｔ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ １５０：８９３−８９９頁（１９６５年）；オルセン（Ｏｌｓｅｎ）ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６：１９１−２２０頁（２０００年）；クローネンバーグ（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ）、Ｎａｔｕｒｅ ４２３：３３２−３３６頁（２００３年）；トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３１５−３１７頁（１９９６年）；トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：５８−６４頁（１９９７年）；ポリンコウスキー（Ｐｏｌｉｎｋｏｗｓｋｙ）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１８−１９頁（１９９７年）；およびストーム（Ｓｔｏｒｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：６３９−６４３頁（１９９４年）。
約２０のＢＭＰのファミリーメンバが同定されている。ＢＭＰはタイプＩおよびＩＩの双方を含むセリン／トレオニンキナーゼ受容体を介してシグナル伝達する。３つのタイプＩ受容体はＢＭＰリガンド（タイプＩＡおよびＩＢ ＢＭＰ受容体とタイプＩアクチビン受容体（ＡｃｔＲＩ））に結合する。ケーニヒ（Ｋｏｅｎｉｇ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５９６１−５９７４頁（１９９４年）およびテン・ディーケ（Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６９：１６９８５−１６９８８頁（１９９４年）；およびマシアス−シルバ（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２５６２８−２５６３６頁（１９９８年）。ＢＭＰは、細胞質内で大きい二量体のプロタンパク質として合成され、折り畳まれ、分泌中にプロテアーゼにより切断される。各単量体は、プロタンパク質として約３００のアミノ酸を有する。機能的カルボキシ領域（各単量体内に１００〜１２０個のアミノ酸）が細胞外区画に放出され、膜受容体が標的細胞上に結合する。ＢＭＰの二量体化が２つのサブユニット間のいくつかのジスルフィド結合に依存するが、二量体化および切断の正確な生化学反応については特徴づけがなされていない状況である。さらに、ＢＭＰの機能に拮抗するかそれ以外ではそれを改変する一連の細胞外タンパク質が存在するように思われ、これらのタンパク質はグリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）−３、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、コルディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、セルベラス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、およびフォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）を含む。フェインソド（Ｆａｉｎｓｏｄ）ら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．６３：３９−５０頁（１９９７年）；グリサル（Ｇｒｉｓａｒｕ）ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２３１：３１−４６頁（２００１年）；ホレイ（Ｈｏｌｌｅｙ）ら、Ｃｅｌｌ ８６：６０７−６１７頁（１９９６年）；イエムラ（Ｉｅｍｕｒａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：９３３７−９３４２頁（１９９８年）；ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４：４１１３−４１２０頁（１９９７年）；パイネ−サウンダーズ（Ｐａｉｎｅ−Ｓａｕｎｄｅｒｓ）ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２５：１７９−１８７頁（２０００年）；ピッコロ（Ｐｉｃｃｏｌｏ）ら、Ｃｅｌｌ ８６：５８９−５９８頁（１９９６年）；レエム−カルマ（Ｒｅ’ｅｍ−Ｋａｌｍａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：１２１４１−１２１４５頁（１９９５年）；ササイ（Ｓａｓａｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７６：３３３−３３６頁（１９９５年）；およびジマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）ら、Ｃｅｌｌ ８６：５９９−６０６頁（１９９６年）。ＢＭＰに対する３種のタイプＩＩ受容体も同定されている（すなわちＢＭＰＲＩ、ＡｃｔＲＩＩおよびＡｃｔＲＩＩＢ）。山下（Ｙａｍａｓｈｉｔａ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：２１７−２２６頁（１９９５年）；ローゼンワーグ（Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７６３２−７６３６頁（１９９５年）；カワバタ（Ｋａｗａｂａｔａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：５６２５−５６３０頁（１９９５年）。
タイプＩおよびＩＩ ＢＭＰ受容体は様々な組織内で異なる形で発現されるが、いずれもシグナル伝達にとって必須である。リガンド結合時、タイプＩおよびＩＩ ＢＭＰ受容体は、ヘテロ四量体−活性化受容体複合体を形成し、タイプＩおよびＩＩ受容体複合体の２つのペアを含む。ムースタカス（Ｍｏｕｓｔａｋａｓ）およびヘルディ（Ｈｅｌｄｉ）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：６７−８７頁（２００２年）。シグナル伝達には両方の受容体タイプが必須である。ホーガン（Ｈｏｇａｎ）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０：１５８０−１５９４頁（１９９６年）；ネレン（Ｎｅｌｌｅｎ）ら、Ｃｅｌｌ ７８：２２５−２３７頁（１９９４年）；ルベルテ（Ｒｕｂｅｒｔｅ）ら、Ｃｅｌｌ ８０：８８９−８９７頁（１９９５年）；テン・ディーケ（Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：１３９−１４５頁（１９９６年）；ワイス−ガルシア（Ｗｅｉｓ−Ｇａｒｃｉａ）およびマッサーグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）、ＥＭＢＯ Ｊ．１５：２７６−２８９頁（１９９６年）；およびウラナ（Ｗｒａｎａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３４１−３４７頁（１９９４年）。タイプＩＩ受容体は、リガンド結合時にタイプＩ受容体をリン酸化する構成的に活性なキナーゼ活性を有する。リン酸化タイプＩ受容体は、シグナルを下流の標的タンパク質に形質導入する。
タイプＩ ＢＭＰ受容体は、Ｓｍａｄタンパク質（ｓｍａｄ１／５）を介してシグナル伝達し、受容体から核内の標的遺伝子へのＢＭＰシグナルの中継において重要である。リン酸化Ｓｍａｄタンパク質は、受容体からの放出時、関連タンパク質Ｓｍａｄ４と結合し、共通パートナー（ｓｈａｒｅｄ ｐａｒｔｎｅｒ）として作用する。この複合体は核内に移行し、他の転写因子を用いる遺伝子転写に関与する。
ＢＭＰシグナル伝達は、ノギンなどの細胞外アンタゴニスト経由を含む多数のレベルで制御される。マッサーグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：１６９−１７８頁（２０００年）。正常な発生にとって基本的なシグナル伝達系の時機を失するかまたは望ましくない活性化により、脊椎関節症などの疾病過程が促進されうることが示唆されている。ノギンの遺伝子導入による関節炎の開始および進行に対するＢＭＰシグナル伝達の効果について、記載がなされている。ロリーズ（Ｌｏｒｉｅｓ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５（６）：１５７１−１５７９頁（２００５年）。
骨格および四肢の発生を含む正常な骨形成におけるＢＭＰおよびＢＭＰ受容体のシグナル伝達の生理的役割については試験され、最近ではチャオ（Ｚｈａｏ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３５：４３−５６頁（２００３年）において概説されている。軟骨内骨化の間、間葉細胞は凝集し、分化して軟骨細胞になる。軟骨細胞は、高度に組織化された分化プログラムを受け、骨形成における鋳型を形成する。クローネンバーグ（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ）、Ｎａｔｕｒｅ ４２３：３３２−３３６頁（２００３年）およびオルセン（Ｏｌｓｅｎ）ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６：１９１−２２０頁（２０００年）。ＢＭＰは、異所性軟骨および骨の形成を促進するその能力により同定された。ウォズニー（Ｗｏｚｎｅｙ）、Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．１：２６７−２８０頁（１９８９年）。３つのタイプＩ受容体、すなわちＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、およびＡｃｔＲ１（アクチビン受容体タイプＩ）に対する異なるＢＭＰリガンドのディファレンシャルな（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）親和性は、発生の過程でシグナル伝達の多様性に寄与する。これらの受容体は軟骨形成に関与し、各々は異なる組織分布および機能を有する。
ＢＭＰ２およびＢＭＰ４の欠損したマウスは生存できない。ホモ接合性ＢＭＰ２突然変異体の胚は、胚の７．５〜１０．５日目に死滅し、心臓の発生中に欠損を有する。チャン（Ｚｈａｎｇ）およびブラッドレイ（Ｂｒａｄｌｅｙ）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：２９７７−２９８６頁（１９９６年）。ホモ接合性のＢＭＰ４突然変異体の胚は、胚の６．５〜９．５日目に死滅し、中胚葉分化に欠損がある。ウィニアー（Ｗｉｎｎｉｅｒ）ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：２１０５−２１１６頁（１９９５年）。
ユーン（Ｙｏｏｎ）らは、軟骨細胞内でＢｍｐｒ１ａおよびＢｍｐｒ１ｂの双方が欠損したマウスの生成について記載した。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２（１４）：５０６２−５０６７頁（２００５年）。これらの筆者らは、Ｂｍｐｒ１ａ条件下のノックアウトマウスが、Ｂｍｐｒ１ｂヌルマウスと同様、骨格上の欠損を示すことがほとんどないことを実証している。しかし、両方の変異を内在するマウスは、重篤で全身性の軟骨異形成を発生させる。これらのデータは、初期軟骨形成の間ではＢＭＰＲ１ＡおよびＢＭＰＲ１Ｂにおいて機能が重複することや、ＢＭＰシグナル伝達が軟骨細胞の増殖、生存、および分化にとって必要とされることを示唆している。ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子のヌル突然変異がマウスにおける胚致死性を引き起こし、動物は胚の９．５日目に死亡する。形態欠損を伴うホモ接合性突然変異体は胚の７．５日目に検出可能であり、胚は中胚葉形成において欠損がある。ミシナ（Ｍｉｓｈｉｎａ）ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：３０２７−３０３７頁（１９９５年）。
ＢＭＰＲ１Ｂ欠損マウスは生存可能であるが、四肢骨において欠損を示す。ＢＭＰＲ１Ｂ欠損マウスでは、指骨領域内での前軟骨形成（ｐｒｅｃｈｏｎｄｏｒｇｅｎｉｃ）細胞の増殖および軟骨細胞の分化が低下する。成体突然変異マウスでは、近位指節間関節が欠如し、指骨が単一の未発達な成分に置き換わる一方、遠位指骨は影響を受けることがない。橈骨、尺骨、および脛骨の長さは正常であるが、中手骨および中足骨では減少する。イ（Ｙｉ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７：６２１−６３０頁（２０００年）。ＢＭＰＲ１Ｂがインビボでの軟骨形成において不要でない役割を果たす可能性が高いことが示唆されている。ギャノン（Ｇａｎｎｏｎ）ら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：３３９−３４３頁（１９９７年）。ＢＭＰリガンドは、複数のタイプＩ ＢＭＰ受容体を用い、軟骨および骨形成の間にそのシグナル伝達を媒介することが可能であり、かつ、ＢＭＰＲ１ＢおよびＡｃｔＲ１Ａ（Ａｌｋ２）は、インビボでの軟骨および骨形成において相乗的および／または重複的役割を果たしうる。マシアス−シルバ（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２５６２８−２５６３６頁（１９９８年）。
ノギンは、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ４に結合しかつそれらを不活性化する分泌ポリペプチドである。ノギンとＢＭＰの共結晶構造は、ノギンがタイプＩおよびタイプＩＩ ＢＭＰ受容体の双方に対する結合エピトープの分子間相互作用を遮断することによりＢＭＰシグナル伝達を阻害することを示す。トランスジェニックマウスモデルが、ノギントランス遺伝子を駆動するためのオステオカルシンプロモーターを用いて確立されている。これらの動物は、骨鉱質密度、骨容量、および骨形成速度における有意な低下からも明らかなように骨粗鬆症を発症した。デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４４：１９７２−１９７８頁（２００３年）およびウー（Ｗｕ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．１１２：９２４−９２４頁（２００３年）。全体として、ＢＭＰアンタゴニストを用いるこれらの実験では、ＢＭＰシグナル伝達タンパク質の調節がインビボでの骨形成の中核をなすことが示される。
動物モデル系については記載がなされ、ＢＭＰ２における軟骨形成および骨形成の開始により骨欠損を治療する能力を評価するのに用いられている。ＢＭＰ２の骨誘導能力は、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、および非ヒト霊長類で見られるこの成長因子により媒介される長骨に対する治療効果と合致している。村上（Ｍｕｒａｋａｍｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．６２：１６９−１７４頁（２００２年）。マウスの頭蓋冠の表面上へのＢＭＰ−２の局部注射により、予め軟骨面を有しない頭蓋冠の表面上に骨膜骨形成が誘発された。チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．６０：２８３−２９０頁（１９９７年）。また、マウスモデルでは、組換えヒトＢＭＰ２の全身投与により、間葉幹細胞の活性が高まり、卵巣切除誘発性で加齢に伴う骨欠損が食い止められ、これはＢＭＰ２が骨粗鬆症の治療において治療的に有効でありうることを示唆している。ターゲマン（Ｔｕｒｇｅｍａｎ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６：４６１−４７４頁（２００２年）。
ＢＭＰ２および４ならびにＢＭＰＲ１Ａの過剰発現が口腔上皮の悪性腫瘍に伴う一方、ＢＭＰ２の過剰発現は前立腺癌細胞内で報告されている。各々、ジン（Ｊｉｎ）ら、Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．３７：２２５−２３３頁（２００１年）およびハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２４：２０４−２１１頁（１９９４年）。ＢＭＰはメラノーマ細胞系内で転移挙動を促進することも示されている。ロスハマー（Ｒｏｔｈｈａｍｍｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５（２）：４４８−５６頁（２００５年）。
進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）は、足の親指の先天性奇形や予測可能な解剖学的パターンにおける進行性の異所性軟骨内（ｅｎｄｏｃｈｏｄｒａｌ）骨化により特徴づけられる障害を引き起こす、希少でかつ無能にする遺伝性疾患である。ＢＭＰ４の異所性発現がＦＯＰ患者において見出されている。ギャノン（Ｇａｎｎｏｎ）ら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：３３９−３４３頁（１９９７年）およびスー（Ｘｕ）ら、Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．５８：２９１−２９８頁（２０００年）。最近、ＦＯＰを有する患者がＢＭＰタイプＩ受容体ＡＣＶＲＩにおいて活性化変異を有することが示されている。ショアー（Ｓｈｏｒｅ）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２３ Ａｐｒｉｌ アドバンス・オンライン・パブリケーション（ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）（２００６年）。ＢＭＰ４をニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターの制御下で過剰発現するトランスジェニックマウスは、ＦＯＰ様表現型を発生させるものとしても記載されている。カン（Ｋａｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈ．１６５（４）：１１０７−１１１５頁（２００４年）。これらの動物を、ノギンを過剰発現するトランスジェニックマウスと交尾させることにより疾患が予防され、それ故に疾患の病原におけるＢＭＰ４の役割が確認される。
ＳｐＡは、異所性または異常な骨形成を含む別の病状である。ＳｐＡ、特に強直性脊椎炎における既存の治療様式は、ゾッホリング（Ｚｏｃｈｌｉｎｇ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１７：４１８−４２５頁（２００５年）およびファン・デル・ヘイデ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｊｄｅ）ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６１：２４−３２頁（２００２年）において概説されている。ベースライン治療は、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の使用および構造化運動を含む。ドーガドス（Ｄｏｕｇａｄｏｓ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４４：１８０−１８５頁（２００１年）；カン（Ｋｈａｎ）、Ｓｅｍ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１５（Ｓｕｐｐｌ１）：８０−８４頁（１９８５年）；ワスナー（Ｗａｓｎｅｒ）ら、ＪＡＭＡ ２４６：２１６８−２１７２頁（１９８１年）；ヒディング（Ｈｉｄｄｉｎｇ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｅ Ｒｅｓ．６：１１７−１２５頁（１９９３年）；スウィーニー（Ｓｗｅｅｎｅｙ）ら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２９：７６３−７６６頁（２００２年）；およびダグフィンラド（Ｄａｇｆｉｎｒｕｄ）ら、「コクランデータベース“システマティック・レビュー”（Ｔｈｅ Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、第４号、Ａｒｔ．Ｎｏ．：ＣＤ００２８２２、ＤＯＩ：１０．１００２／１４６５１８５８．ＣＤ００２８２２．ｐｕｂ２（２００４年）。抗リウマチ薬により強直性脊椎炎を治療する試みは不本意であった。スルファサラジンは、ＳｐＡを伴う末梢性関節炎を改善するが、脊髄疼痛を改善しない。クレッグ（Ｃｌｅｇｇ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３９：２００４−２０１２頁（１９９６年）；クレッグ（Ｃｌｅｇｇ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４２：２３２５−２３２９頁（１９９９年）；ドーガドス（Ｄｏｕｇａｄｏｓ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３８：６１８−６２７頁（１９９５年）；およびニッシラ（Ｎｉｓｓｉｌａ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３１：１１１１−１１１６頁（１９８８年）。同様に、メトトレキセートおよびレフルノミドは、関節リウマチの治療において有効である一方、強直性脊椎炎に対して最小の有効性を示す。チェン（Ｃｈｅｎ）ら、「コクランデータベースシステマティック・レビュー（Ｔｈｅ Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、第３号、Ａｒｔ．Ｎｏ．：ＣＤ００４５２４、ＤＯＩ：１０．１００２／１４６５１８５８．ＣＤ００４５２４．ｐｕｂ２（２００３年）；ハイベル（Ｈａｉｂｅｌ）ら、Ａｎｎ．ＲｈｅｕｍＤｉｓ．６４：１２４−１２６頁（２００５年）；およびヴァン・デンデレン（Ｖａｎ Ｄｅｎｄｅｒｅｎ）ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６３（Ｓｕｐｐｌ１）：３９７頁（２００４年）。
より最近になり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遮断薬の使用が試みられ、限定的には奏功している。例えば、ファン・デル・ヘイデ（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｊｄｅ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．５２：５８２−５９１頁（２００５年）では、治療群の６１％がインフリキシマブでの治療の２４週後にＡＳＡＳ２０に応答することが報告された。ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６４：２２９−２３４頁（２００５年）；ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ら、Ｌａｎｃｅｔ ３５９：１１８７−１１９３頁（２００２年）；およびミューズ（Ｍｅａｓｅ）ら、Ｌａｎｃｅｔ ３５６：３８５−３９０頁（２０００年）も参照のこと。同様に、エタネルセプトを用いる最近の試験では、陽性応答が脊髄炎症、背痛、および物理的障害の低下を含む場合の強直性脊椎炎の治療において約６０％の応答速度が示されている。ブラント（Ｂｒａｎｄｔ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４８：１６６７−１６７５頁（２００３年）、デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４８：３２３０−３２３６頁（２００３年）；およびゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１３４９−１３５６頁（２００２年）。
ヒト化モノクローナル抗−ＴＮＦ抗体のアダリムマブでの初期試験では、予備的ではあるが、この治療が強直性脊椎炎の治療におけるインフリキシマブおよびエタネルセプトに匹敵しうることが示されている。ハイベル（Ｈａｉｂｅｌ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．５０（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ２１７（２００４年）。さらに、組換えヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニストのアナキンラ、ビスホスホネートおよびサリドマイド、および抗生物質治療薬が強直性脊椎炎の治療用に試みられているが、これまでの結果は決定的なものでない。タン（Ｔａｎ）ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６３：１０４１−１０４５頁（２００４年）；マクシモウィッチ（Ｍａｋｓｙｍｏｗｙｃｈ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４６：７６６−７７３頁（２００２年）；およびクヴェイン（Ｋｖｅｉｎ）ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６３：１１１３−１１１９頁（２００４年）を参照のこと。
全体として、強直性脊椎炎および他の脊椎関節炎疾患の治療における治療レジメンの開発においては、部分的には治療が骨形成および脊髄融合を予防しないことからほとんど進歩がなされていない。疾患の完全な制御を得るため、軟骨および骨形成を特異的に標的化する治療方法が、既存の免疫抑制治療薬に対する代替薬または補完薬のいずれかとして必要とされうる。したがって、当該技術分野では、骨形態形成タンパク質およびその受容体の異常な発現／活性を原因とする疾患を含む、強直性脊椎炎および他の脊椎関節炎疾患を伴う骨障害ならびに異常な骨形成および骨化を伴う他の疾患の治療における新しい様式に対する需要の余地がある。
本発明は、骨形態形成タンパク質に特異的な抗体および他の治療タンパク質とそれらに対する受容体、かかる抗体および治療タンパク質をコードする核酸、抗−ＢＭＰや抗−ＢＭＰＲモノクローナル抗体および他の治療タンパク質を調製するための方法、ならびに、限定はされないが、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成症（ＰＯＨ）、脊髄（ｓｐｉｎａｌ ｃｈｏｒｄ）損傷、筋肉内血腫、整形手術をもたらす鈍的外傷、乾癬性関節炎、変形性関節症、強直性脊椎炎、血清反応陰性関節症、骨格骨化過剰症、耳硬化症、あぶみ骨強直症、骨肉腫、前立腺癌および外骨腫、アテローム硬化症、弁膜性心疾患、肺癌、メラノーマ、造血癌、腎癌、ならびに乳癌を含む骨疾患および癌などの疾患を治療するための方法を提供することにより、これらや他の関連する需要に対処する。
したがって、本発明は、１つ以上の骨形態形成タンパク質およびその受容体に結合しかつ１つ以上の望ましい機能特性を示す単離されたモノクローナル抗体、特にマウス、キメラ、ヒト化、および完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。かかる特性は、例えばＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４などのヒト骨形態形成タンパク質に対する高親和性の特異的結合あるいはＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２などのヒト骨形態形成タンパク質受容体に対する高親和性の特異的結合を含む。種々の骨形態形成タンパク質媒介性疾患を、本発明の抗体、タンパク質、および組成物を用いて治療するための方法も提供される。
本明細書中に開示される抗体および治療タンパク質は、（ａ）リガンド（すなわちＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４）の同族受容体（すなわちＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２）に対する結合、ならびに／あるいは（ｂ）受容体のヘテロ二量体の形成、ならびに／あるいは（ｃ）受容体のシグナル伝達を、遮断可能である。
一態様では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体は、
（ａ）ヒト骨形態形成タンパク質（例えばＢＭＰ２もしくはＢＭＰ４）またはその受容体（例えばＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、もしくはＢＭＰＲ２）に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合し、および／あるいは
（ｂ）細胞（例えばヒトまたはＣＨＯ）に結合し、ここで前記細胞はヒト骨形態形成タンパク質および／またはその受容体を発現する。
より特定の実施形態では、抗体は、ヒト骨形態形成タンパク質またはその受容体に、５×１０−８Ｍ以下、典型的には２×１０−８Ｍ以下、より典型的には１×１０−８Ｍ以下、さらにより典型的には６×１０−９Ｍ以下、３×１０−９Ｍ以下、または２×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。
別の実施形態では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体は、骨形態形成タンパク質またはその受容体に対する結合において参照抗体と交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）し、ここで参照抗体は、
（ａ）ヒト骨形態形成タンパク質もしくはその受容体に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合し、および／または
（ｂ）ヒト骨形態形成タンパク質および／もしくはその受容体を発現する細胞に結合する。
別の実施形態では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体は、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対する結合において、
（ａ）配列番号３１、３２、または３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３４、３５、または３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む参照抗体と交差競合する。
様々な実施形態では、参照抗体は、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は、
（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の態様では、本発明は、ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。本発明は、ヒトＶＨ４−３４遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。本発明は、ヒトＶＨ４−５９遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。本発明は、ヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。本発明は、ヒトＶＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。本発明は、ヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。
好ましい実施形態では、本発明は、
（ａ）ヒトＶＨ３−３３、４−３４、もしくは４−５９遺伝子の重鎖可変領域、および
（ｂ）ヒトＶＫＡ２７、Ｌ６、もしくはＶＫＬ１５の軽鎖可変領域
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。
好ましい実施形態では、抗体はヒトＶＨ４−５９遺伝子の重鎖可変領域およびヒトＶＫＡ２７遺伝子の軽鎖可変領域を含む。別の好ましい実施形態では、抗体はヒトＶＨ４−３４遺伝子の重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の軽鎖可変領域を含む。別の好ましい実施形態では、抗体は、ヒトＶＨ３−３３遺伝子の重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ１５遺伝子の軽鎖可変領域を含む。
別の態様では、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域とＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここでは
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は配列番号１９、２０、および２１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は配列番号２８、２９、および３０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにその保存的修飾を含み、かつ
（ｃ）抗体はヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する。
好ましくは、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号１６、１７、および１８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。好ましくは、重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号２２、２３、および２４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１
（ｂ）配列番号１６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２２を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２５を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２８を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１４を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１７を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２６を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２７を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３０を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
本発明の他の好ましい抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）配列番号３１、３２、および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３４、３５、および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。
好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
本発明の別の態様では、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対する結合において上記抗体のいずれかと競合する抗体またはその抗原結合部分が提供される。
本発明の抗体は、例えば、典型的にはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体でありうる。あるいは、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、もしくはＦａｂ’２断片または一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）でありうる。
本発明は、治療物質、例えば細胞毒素または放射性同位体に連結された本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体も提供する。本発明は、前記抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能部分に連結された本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む、二重特異性分子も提供する。本発明は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、またはＢＭＰＲ２に特異的な、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｙ、ＵｎｉＢｏｄｙ、ＤＡＲＰｉｎ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ａｖｉｍｅｒ、Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ、およびＤｕｏｃａｌｉｎも提供する。
本発明の、抗体またはその抗原結合部分または免疫複合体または二重特異性分子、および薬学的に許容される担体を含む組成物もまた提供される。
抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子も、かかる核酸を含む発現ベクター、かかる発現ベクターを含む宿主細胞、ならびに抗−ＢＭＰ２抗体、抗−ＢＭＰ４抗体、抗−ＢＭＰＲ１Ａ抗体、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ抗体、抗−ＡＣＴＲ１抗体、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体をかかる宿主細胞を用いて作製するための方法と同様に、本発明に包含される。
さらに、本発明は、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖トランス遺伝子を含むトランスジェニックマウスならびにかかるマウスから調製されるハイブリドーマを提供し、ここでマウスは本発明の抗体を発現し、ハイブリドーマは本発明の抗体を産生する。
さらに別の態様では、本発明は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を発現する骨および／または腫瘍細胞の成長によって特徴づけられる疾患を治療または予防するための方法であって、本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２ヒト抗体を、疾患を治療または予防するのに有効な量で対象に投与する工程を含む方法を提供する。疾患は骨疾患および／または癌でありうる。
さらに別の態様では、本発明は、自己免疫疾患を治療する方法であって、本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２ヒト抗体を、疾患を治療するのに有効な量で対象に投与する工程を含む方法を提供する。
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および実施例から明白となり、それらは限定するものとして解釈されるべきではない。本願の全体を通じて言及されるあらゆる参考文献の内容、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、特許および公開された特許出願は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
６Ｈ４ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１６）およびＣＤＲ３（配列番号１９）領域が図示され、かつＶ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 ６Ｈ４ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４０）およびアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２２）、ＣＤＲ２（配列番号２５）およびＣＤＲ３（配列番号２８）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 １１Ｆ２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３８）およびアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１４）、ＣＤＲ２（配列番号１７）およびＣＤＲ３（配列番号２０）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 １１Ｆ２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４１）およびアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２３）、ＣＤＲ２（配列番号２６）およびＣＤＲ３（配列番号２９）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 １２Ｅ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３９）およびアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号１８）およびＣＤＲ３（配列番号２１）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 は１２Ｅ３ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４２）およびアミノ酸配列（配列番号３６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２４）、ＣＤＲ２（配列番号２７）およびＣＤＲ３（配列番号３０）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。 ６Ｈ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３１）とヒト生殖細胞系ＶＨ４−３４のアミノ酸配列（配列番号５１）、ＶおよびＪ領域の間に位置するヒト生殖細胞系ＤＨ３−１０のアミノ酸配列（配列番号５２）、およびヒト生殖細胞系ＪＨＪＨ１のアミノ酸配列（配列番号５３）とのアラインメントを示す。 １１Ｆ２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３２）とヒト生殖細胞系ＶＨ４−５９のアミノ酸配列（配列番号４３）、ＶおよびＪ領域の間に位置するヒト生殖細胞系ＤＨ２−２のアミノ酸配列（配列番号４５）、およびヒト生殖細胞系ＪＨＪＨ５ｂのアミノ酸配列（配列番号４６）とのアラインメントを示す。 １２Ｅ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３３）とヒト生殖細胞系ＶＨ３−３３のアミノ酸配列（配列番号４４）およびヒト生殖細胞系ＪＨＪＨ６ｂのアミノ酸配列（配列番号４７）とのアラインメントを示す。 ６Ｈ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３４）とヒト生殖細胞系ＶＫＬ６のアミノ酸配列（配列番号５４）およびヒト生殖細胞系ＪＫＪＫ２のアミノ酸配列（配列番号５５）とのアラインメントを示す。 １１Ｆ２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３５）とヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７のアミノ酸配列（配列番号４８）およびヒト生殖細胞系ＪＫＪＫ４のアミノ酸配列（配列番号５０）とのアラインメントを示す。 １２Ｅ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３６）とヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５のアミノ酸配列（配列番号４９）およびヒト生殖細胞系ＪＫＪＫ４のアミノ酸配列（配列番号５０）とのアラインメントを示す。 ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析により、ＢＭＰ４のタイプ−ＩＩ（図１０ａ）およびタイプ−Ｉ（図１０ｂ）のＢＭＰ受容体に対する結合を遮断する抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体を示す。 抗−ＢＭＰ２／４抗体によるＢＭＰ２およびＢＭＰ４のシグナル伝達の阻害を示す。Ｃ２Ｃ１２細胞は組換えヒトＢＭＰ２（図１１ａ）またはＢＭＰ４（図１１ｂ）および様々な濃度の５つの異なる中和抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体またはＩｇＧ１対照ｍＡｂとともにインキュベートされた。細胞は固定され、溶解され、かつアルカリホスファターゼ活性についてアッセイされた。 デンシトメトリー走査により、骨形成が本発明の抗−ＢＭＰ２モノクローナル抗体により有意に低下することを示す。
詳細な説明
本発明は、１つ以上の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）または１つ以上の骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）および／またはアクチビンＡ受容体（ＡＣＴＲ１）に対して高い親和力で特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、特にマウス、キメラ、ヒト化、および完全ヒトモノクローナル抗体に関する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖細胞系配列に由来し、かつ／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。したがって、本発明は、単離された抗体、免疫複合体、二重特異性分子、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｙ、ＵｎｉＢｏｄｙ、ＤＡＲＰｉｎ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ａｖｉｍｅｒ、Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ、およびＤｕｏｃａｌｉｎ、前記分子を作製する方法、ならびに前記分子および薬学的担体を含有する薬学的組成物を提供する。本発明は、前記抗体、免疫複合体、二重特異性分子、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｙ、ＵｎｉＢｏｄｙ、ＤＡＲＰｉｎ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ａｖｉｍｅｒ、Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ、およびＤｕｏｃａｌｉｎを用いて、異常な骨形成を伴う疾患および癌を治療するための方法にも関する。
定義
本発明がより容易に理解されうるように、最初に特定の用語が定義される。さらなる定義が詳細な説明を通じて示される。
本明細書で記載の「抗体」という用語は、全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を示す。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記）および重鎖定常領域で構成されている。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインで構成されている。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記）および軽鎖定常領域で構成されている。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインで構成されている。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに再分化され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存される領域に散在しうる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
本明細書で用いられる抗体（または「抗体部分」）の「抗原結合部分」という用語は、（本明細書中ではＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２で例示される）抗原に対して特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を示す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片により果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（ポール（Ｐａｕｌ）編、第３版、１９９３年）を参照）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（ワード（Ｗａｒｄ）ら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６頁）；ならびに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインのＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子でコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が、それらの一価分子を形成するように対をなす単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーによる組換え方法を用いて連結されうる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばバード（Ｂｉｒｄ）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６頁、およびハストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３頁を参照）。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるようにも意図されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、断片における有用性が無傷抗体の場合と同様の方法でスクリーニングされる。
本明細書で用いられる「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すように意図されている（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対して特異的に結合する単離された抗体は、これらの６種のタンパク質のうちのいずれか１つ以上以外の抗原に対して特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対して特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば他の種由来のＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２分子に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
本明細書で用いられる「ヒト抗体」または「ヒト配列抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域を有する抗体を含むように意図されている。さらに、抗体が定常領域を有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、天然または合成修飾を含む、後の修飾を含みうる。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされることのないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的な突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含みうる。しかし、本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むように意図されていない。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、「ヒト」の後に「配列」という用語を含む場合があり、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域を有する単一の結合特異性を提示する抗体を示す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
本明細書で用いられる「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段により調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子におけるトランスジェニック動物またはトランスクロモゾーマル（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）動物（例えばマウス）あるいはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体（さらに下記に記載）、（ｂ）形質転換されることでヒト抗体を発現する宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離される抗体、（ｃ）組換えられたコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作製または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体に対し、インビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が用いられる場合、インビボでの体細胞突然変異誘発）を実施可能であり、それ故、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来しかつそれらに関連する一方、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリーの範囲内に天然に存在することがない配列である。
本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を示す。
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という語句は、本明細書中で「抗原に対して特異的に結合する抗体」という用語と同義的に用いられる。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の作用物質または抗体との複合体を示す。
「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を示すように意図されている。さらなるフレームワーク領域の修飾がヒトフレームワーク配列内でなされうる。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がある種に由来しかつ定常領域配列が別種に由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来しかつ定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を示すように意図されている。
本明細書で用いられる「特異的に結合する」抗体は、１×１０−７以下、特に５×１０−８Ｍ以下、より詳細には１×１０−８Ｍ以下、さらにより詳細には６×１０−９Ｍ以下、より詳細には３×１０−９Ｍ以下、さらにより詳細には２×１０−９Ｍ以下のＫＤで同族抗原に結合する抗体を示すように意図されている。
本明細書で用いられる、タンパク質または細胞に「実質的に結合することのない」という用語は、タンパク質または細胞に対して、結合しないかまたは高親和性で結合することのない、すなわちタンパク質または細胞に１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤで結合することを示す。
本明細書で用いられる「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を示すように意図されている一方、本明細書で用いられる「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すように意図されている。本明細書で用いられる「ＫＤ」という用語は解離定数を示すように意図されており、それはＫｄ対Ｋａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、かつモル濃度（Ｍ）として表現されるものである。抗体におけるＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定可能である。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、典型的にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの利用によるものである。
本明細書で用いられるＩｇＧ抗体における「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１０−７Ｍ以下、より典型的には１０−８Ｍ以下、より典型的には１０−９Ｍ以下、およびさらにより典型的には１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。しかし、「高親和性」結合は他の抗体のアイソタイプに応じて変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０−７Ｍ以下、より典型的には１０−８Ｍ以下、さらにより典型的には１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。
本明細書で用いられる「対象」という用語は任意のヒトまたは非ヒト動物を示す。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、魚類、爬虫類などを含む。
「免疫応答」という用語は、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合での正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的損傷、それらの破壊または人体からの除去をもたらす、例えば、（抗体、サイトカイン、および補体を含む）上記の細胞または肝臓によって生成されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および可溶性高分子の作用を示す。
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達を担う種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を示す。本明細書で用いられる「細胞表面受容体」という語句は、例えばシグナルの受信および細胞の原形質膜を通過するかかるシグナルの伝達が可能な分子および分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の例として、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、およびＢＭＰＲ２受容体が挙げられる。
本明細書で用いられる「ＢＭＰ２」という用語は、ヒト骨形態形成タンパク質２を示すように用いられる。ヒトＢＭＰ２のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２００の参照によって公的に入手可能であり、配列番号１として本明細書中に開示される。ＢＭＰ２の対応するアミノ酸配列は、配列番号２として本明細書中に示される。
本明細書で用いられる「ＢＭＰ４」という用語は、ヒト骨形態形成タンパク質４を示すように用いられる。ヒトＢＭＰ４のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３０８５１の参照によって公的に入手可能であり、配列番号３として本明細書中に開示される。ＢＭＰ４の対応するアミノ酸配列は、配列番号４として本明細書中に示される。
本明細書で用いられる「ＢＭＰＲ１Ａ」（ａｋａ Ａｌｋ３）という用語は、ヒト骨形態形成タンパク質受容体１Ａを示すように用いられる。ヒトＢＭＰＲ１Ａのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４３２９の参照によって公的に入手可能であり、配列番号５として本明細書中に開示される。ＢＭＰＲ１Ａの対応するアミノ酸配列は、配列番号６として本明細書中に示される。
本明細書で用いられる「ＢＭＰＲ１Ｂ」（ａｋａ Ａｌｋ６）という用語は、ヒト骨形態形成タンパク質受容体１Ｂを示すように用いられる。ヒトＢＭＰＲ１Ｂのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２０３の参照によって公的に入手可能であり、配列番号７として本明細書中に開示される。ＢＭＰＲ１Ｂの対応するアミノ酸配列は、配列番号８として本明細書中に示される。
本明細書で用いられる「ＡＣＴＲ１」という用語は、ヒトアクチビンＡ受容体１を示すように用いられる。ヒトＡＣＴＲ１のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０３３８６７の参照によって公的に入手可能であり、配列番号９として本明細書中に開示される。ＡＣＴＲ１の対応するアミノ酸配列は、配列番号１０として本明細書中に示される。
本明細書で用いられる「ＢＭＰＲ２」という用語は、ヒト骨形態形成タンパク質受容体２を示すように用いられる。ヒトＢＭＰＲ２のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２０４の参照により公的に入手可能であり、本明細書中で配列番号１１として開示される。ＢＭＰＲ２の対応するアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号１２として記載される。
本発明の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳述される。
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、およびＢＭＰＲ２に特異的な抗体
本発明の抗体は、特定の機能的な特徴または特性により特徴づけられる。例えば特定の実施形態内では、抗体はヒトＢＭＰ２およびヒトＢＭＰ４から選択される１つ以上の骨形態形成タンパク質に対して特異的に結合する。他の実施形態内では、抗体はＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、およびＢＭＰＲ２から選択される１つ以上の骨形態形成タンパク質受容体ならびに／またはＡＣＴＲ１から選択される１つ以上のアクチビンタイプ１受容体に対して特異的に結合する。典型的には、本発明の抗体は、高親和性、例えば５×１０−７Ｍ以下、さらにより典型的には５．５×１０−９以下、さらにより典型的には３×１０−９以下、さらにより典型的には２×１０−９以下またはさらにより典型的には１．５×１０−９以下のＫＤで結合する。
一実施形態では、抗体は好ましくはＢＭＰ２またはＢＭＰ４内に存在する抗原エピトープに結合し、ここでエピトープは他のタンパク質内に存在することがない。抗体は、典型的にはＢＭＰ２またはＢＭＰ４に結合しても他のタンパク質に結合することがないか、あるいは低親和性、例えば１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤで他のタンパク質に結合する。好ましくは、抗体は関連タンパク質に実質的に結合することがなく、例えば抗体はＢＭＰ３またはＢＭＰ８ｂに実質的に結合することがない。
抗体の１つ以上の骨形態形成タンパク質またはその受容体に対する結合能を評価するための標準アッセイは当該技術分野で公知であり、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリーおよびＲＩＡを含む。適切なアッセイが実施例において詳述される。抗体の結合動態（例えば結合親和性）は、当該技術分野で公知の標準アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、スキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）およびビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析によっても評価可能である。別の例として、本発明の抗体は、前軟骨細胞（ｐｒｅｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）および／または軟骨細胞などの骨細胞に結合しうる。
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に特異的なヒトモノクローナル抗体
ＢＭＰ２に特異的な抗体が望ましくはＢＭＰ４と交差反応し、かつＢＭＰ４に特異的な抗体が望ましくはＢＭＰ２と交差反応しうることが理解されるであろう。同様に、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、およびＢＭＰＲ２のいずれか１つに特異的な抗体は、望ましくは他のＢＭＰおよび／またはＡＣＶ受容体のいずれかと交差反応しうる。したがって、本発明では、有利にも、ＶＨおよびＶＬ配列が「混合されて一致する」ことで特許請求される本発明の範囲内で他の抗原特異的な結合分子の作製が可能であることが検討される。かかる「混合されて一致する」抗体の特異的結合については、上記や実施例における結合アッセイ（例えばＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡ）を用いて試験可能である。典型的には、ＶＨおよびＶＬ鎖が混合されて一致する場合、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＨ配列が構造的に類似のＶＨ配列と置換される。同様に、典型的には、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＬ配列は構造的に類似のＶＬ配列と置換される。
実施例１および２に記載のように単離し、構造的に特徴づけた本発明の好ましい抗体は、ヒトモノクローナル抗体６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３を含む。６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＨアミノ酸配列の各々は、配列番号３１、３２、および３３に示される。６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＬアミノ酸配列の各々は、配列番号３４、３５、および３６に示される。
一態様では、本発明は、
（ａ）配列番号３１、３２、および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号３４、３５、および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４、好ましくはヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。
好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせは、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の態様では、本発明は、６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む抗体を提供する。６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、および１５において示される。６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１６、１７、および１８において示される。６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１９、２０、および２１において示される。６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＫＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号２２、２３、および２４において示される。６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＫＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２５、２６、および２７において示される。６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＫＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号２８、２９、および３０において示される。ＣＤＲ領域は、カバト（Ｋａｂａｔ）システム（カバト Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．）ら （１９９１年）「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（第５版）」、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）を用いて図示される。
本明細書中に提供される各モノクローナル抗体が（１）ＢＭＰ２およびＢＭＰ４から選択される骨形態形成タンパク質または（２）ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２から選択される骨形態形成タンパク質受容体および／またはＡＣＴＲ１から選択されるアクチビンタイプ１受容体に結合する可能性があり、かつ抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域により提供されると仮定すると、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が「混合されて一致する」（すなわち、各抗体がＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を有する必要があっても、異なる抗体由来のＣＤＲが混合されて一致する）ことで、本発明の他の抗原特異的な結合分子が作製されうる。かかる「混合されて一致した」抗体の結合については、上記と実施例における結合アッセイ（例えば、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析）を用いて試験してもよい。典型的には、ＶＨＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。同様に、ＶＫＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＫ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は典型的には構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。新規のＶＨおよびＶＬ配列を、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ領域配列を本発明のモノクローナル抗体における本明細書中に開示のＣＤＲ配列に由来する構造的に類似の配列と置換することにより作製可能であることが当業者に容易に理解されるであろう。
別の態様では、本発明は、
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３；
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで各重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３ならびに各軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３は、１種、２種、３種、４種、５種、もしくは６種の骨形態形成タンパク質受容体に結合する抗体から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体はＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４（典型的にはヒトＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４）に対して特異的に結合する。
したがって、別の態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１３、１４、および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１６、１７、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９、２０、および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２２、２３、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２５、２６、および２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２８、２９、および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３；
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４、好ましくはヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。
好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２２を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２５を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２８を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号１４を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１７を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２６を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号１５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２７を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３０を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立したＣＤＲ３ドメインが単独で抗体の同族抗原に対する結合特異性を決定しうることと、共通のＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測どおりに産生されうることは、当該技術分野で周知である。例えば、［マウス抗−ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いるヒト化抗−ＣＤ３０抗体の産生について記載する］クリムカ（Ｋｌｉｍｋａ）ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２−２６０頁（２０００年）；［親マウスＭＯＣ−３１抗−ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いる組換え上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）抗体について記載する］ベイボアー（Ｂｅｉｂｏｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９頁（２０００年）；［マウス抗−インテグリンαｖβ３抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを用いる一群のヒト化抗−インテグリンαｖβ３抗体においては、各メンバ抗体は、ＣＤＲ３ドメイン外部の異なる配列を含み、親マウス抗体と同じエピトープに親マウス抗体と同程度に高いまたはそれより高い親和性で結合可能である点について記載する］レイダー（Ｒａｄｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５頁（１９９８年）；［ＣＤＲ３ドメインが抗原結合に対して最も有意な寄与をもたらす点を開示する］バーバス（Ｂａｒｂａｓ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２頁（１９９４年）；［ヒト胎盤ＤＮＡに対する３つのＦａｂ（ＳＩ−１、ＳＩ−４０、およびＳＩ−３２）の重鎖ＣＤＲ３配列の抗破傷風トキソイドＦａｂの重鎖上への移植により既存の重鎖ＣＤ３が置換される点を記載し、ＣＤＲ３ドメインが単独で結合特異性を与えた点について示している］バーバス（Ｂａｒｂａｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３頁（１９９５年）；ならびに［単一特異性ＩｇＧ破傷風トキソイドに結合するＦａｂ ｐ３１３抗体の重鎖に対する親多重特異性Ｆａｂ ＬＮＡ３の重鎖ＣＤＲ３のみの転移が親Ｆａｂの結合特異性を保持するのに十分であったという移植試験について記載する］ディッツェル（Ｄｉｔｚｅｌ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９頁（１９９６年）を参照のこと。これらの各参考文献はその全体が参照により本明細書中に援用される。
したがって、特定の態様内では、本発明は、非ヒト抗体、例えばマウスまたはラット抗体に由来する１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体は、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４（典型的にはヒトＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４）あるいはＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１および／またはＢＭＰＲ２（典型的にはヒトＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１および／またはＢＭＰＲ２）に対して特異的に結合可能である。いくつかの実施形態内では、非ヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むかかる発明の抗体は、（ａ）結合において競合可能であり、（ｂ）機能的特徴を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、かつ／または（ｄ）対応する親の非ヒト抗体と類似した結合親和性を有する。
他の態様内では、本発明は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などの第１のヒト抗体に由来する１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで第１のヒト抗体は、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４（典型的にはヒトＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４）あるいはＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２（典型的にはヒトＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２）に対して特異的に結合可能であり、かつ、第１のヒト抗体由来のＣＤＲ３ドメインはＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４あるいはＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する結合特異性が欠如したヒト抗体内のＣＤＲ３ドメインを置換し、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４あるいはＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２の各々に対して特異的に結合可能な第２のヒト抗体を産生する。いくつかの実施形態内では、第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むかかる発明の抗体は、（ａ）結合において競合可能であり、（ｂ）機能的特徴を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、および／または（ｄ）対応する親の第１のヒト抗体と類似した結合親和性を有する。
特定の生殖細胞系配列を有する抗体
特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
本明細書で用いられるヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列「の産物」であるかまたはそれ「由来の」重鎖または軽鎖可変領域を含む。かかる系は、目的の抗原とともにヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫する工程または目的の抗原とともにファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングする工程を含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体が、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列においてヒト抗体の配列に対して最も近い（すなわち最大の％同一性がある）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することにより、かかるものとして同定されうる。
例えば、好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＶＨ４−５９遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＶＨ４−３４遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。
別の例では、好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＶＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれ由来の軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体は、
（ａ）ヒトＶＨ４−５９、４−３４、または３−３３遺伝子（遺伝子は各々、配列番号４３、５１、および４４に示されるアミノ酸配列をコードする）の産物であるかまたはそれ由来の重鎖可変領域を含み、
（ｂ）ヒトＶＫＡ２７、Ｌ６、またはＬ１５遺伝子（遺伝子は各々、配列番号４８、５４、および４９に示されるアミノ酸配列をコードする）の産物であるかまたはそれ由来の軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｃ）ＢＭＰ２またはＢＭＰ４、好ましくはヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対して特異的に結合する。
ＶＨおよびＶＫの各々としてＶＨ４−３４およびＶＫＬ６を有する抗体の例は６Ｈ４である。ＶＨおよびＶＫの各々としてＶＨ４−５９およびＶＫＡ２７を有する抗体の例は１１Ｆ２である。ＶＨおよびＶＫの各々としてＶＨ３−３３およびＶＫＬ１５を有する抗体の例は１２Ｅ３である。
特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば自然発生的体な細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因し、生殖細胞系配列と比べてアミノ酸の差を有しうる。しかし、選択されたヒト抗体は、典型的にはアミノ酸配列においてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、かつ、ヒト抗体が他種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えばマウス生殖細胞系配列）と比較される場合にヒトであるものと同定されるアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒト抗体は、アミノ酸配列において生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列由来のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは１０個以下のアミノ酸の差を示すと考えられる。特定の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは５個以下またはさらには４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の差を示しうる。
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、本明細書中に記載の抗体のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで抗体は本発明の抗体の所望の機能特性を保持する。
例えば、本発明は、
（ａ）重鎖可変領域は配列番号３１、３２、および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は配列番号３４、３５、および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、かつ
（ｃ）抗体は１×１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４に結合する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
抗体は、細胞表面結合性のヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４を有するＣＨＯ細胞にも結合しうる。ＢＭＰ２またはＢＭＰ４は、細胞表面上の受容体または二価のエンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）に結合されうるかまたは膜貫通ドメインを有する融合タンパク質として発現されうる。
様々な実施形態では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、上記で示される配列に８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同でありうる。上記で示される配列のＶＨおよびＶＬ領域に対して高い（すなわち８０％以上の）相同性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体を、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、および３６をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる（ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）突然変異誘発）と、その後の本明細書中に記載のアッセイを用いてのコードされた改変抗体の保持された機能についての試験により得ることができる。
本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供し、ここで
（ａ）重鎖可変領域は、本明細書中に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含み、ここで重鎖可変領域はＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、および／もしくはＢＭＰＲ２から選択される骨形態形成タンパク質受容体に対し、および／またはＡＣＴＲ１から選択されるアクチビンタイプ１受容体に対して特異的に結合する抗体に由来し、
（ｂ）軽鎖可変領域は、本明細書中に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、ここで軽鎖可変領域はＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、および／もしくはＢＭＰＲ２から選択される骨形態形成タンパク質受容体に対し、および／またはＡＣＴＲ１から選択されるアクチビンタイプ１受容体に対して特異的に結合する抗体に由来し、かつ
（ｃ）抗体は、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、および／もしくはＢＭＰＲ２から選択される骨形態形成タンパク質受容体に対し、および／またはＡＣＴＲ１から選択されるアクチビンタイプ１受容体に対して特異的に結合する。
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、および／もしくは抗−ＢＭＰＲ２抗体に対し、および／または本明細書中に示される抗−ＡＣＴＲ１配列に対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。本明細書中に示される配列のＶＨおよびＶＬ領域に対して高い（すなわち８０％以上の）同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体を、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂおよび／または抗−ＢＭＰＲ２抗体の、および／または抗−ＡＣＴＲ１のＶＨまたはＶＬ領域をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲによる突然変異誘発）により得ることができる。
本明細書で用いられる２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列で共有される同一位置の数の関数（すなわち相同性％＝同一位置の数／位置の全体数×１００）であり、２つの配列の最適なアラインメントにおいて導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記の非限定例にて記載のように数学的アルゴリズムを用いて行われうる。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｅ．メイヤーズ（Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ）およびＷ．ミラー（Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１−１７頁（１９８８年））を用いて決定可能であり、同アルゴリズムはＰＡＭ１２０重み残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入されている。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを用いて決定可能であり、同アルゴリズムはブロッサム（Ｂｌｏｓｓｕｍ）６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重量および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重量を用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラム中に包含されている。
さらにまたはその他として、本発明のタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用い、公的データベースで探索を行い、例えば関連配列を同定することが可能である。かかる探索は、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９０年） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０頁のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質の探索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことで、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップドアラインメント（ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）を得るため、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９７年） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２頁に記載のようにギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）を用いることができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）プログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
保存的修飾を有する抗体
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでこれらのＣＤＲ配列のうちの１つ以上は本明細書中に記載の典型的な抗体に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、かつ抗体は本発明のモノクローナル抗体の所望の機能特性を保持する。
したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号１９、２０、および２１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号２８、２９、および３０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ
（ｃ）抗体は１×１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４に結合する。
抗体は、細胞表面結合性のＢＭＰ２またはＢＭＰ４を有するＣＨＯ細胞にも結合しうる。
好ましい実施形態では、重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号１６、１７、および１８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号２５、２６、および２７からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
別の好ましい実施形態では、重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号２２、２３、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
様々な実施形態では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供し、ここで
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、本明細書中に開示される抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、本明細書中に開示される抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ
（ｃ）抗体はＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対して特異的に結合する。
本明細書で用いられる「保存的配列修飾（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」という用語は、アミノ酸配列を有する抗体の結合特性に対して有意に作用または改変することのないアミノ酸修飾を示すように意図されている。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当該技術分野で公知の標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲによる突然変異誘発により本発明の抗体に導入されうる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換可能であり、改変抗体は保持された機能（すなわち（ｃ）に示される機能）について本明細書中に記載の機能アッセイを用いて試験可能である。
本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体のいずれかと同じヒトＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２上のエピトープに結合する抗体（すなわち、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に結合するのに本発明のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）を提供する。いくつかの実施形態では、交差競合試験のための参照抗体は本明細書中に開示されるモノクローナル抗体でありうる。かかる交差競合抗体は、標準のＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２結合アッセイにおいて、それが本明細書中に開示される抗体と交差競合する能力に基づいて同定されうる。
好ましい実施形態では、交差競合試験における参照抗体は、モノクローナル抗体６Ｈ４（配列番号３１および３４で示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）、モノクローナル抗体１１Ｆ２（配列番号３２および３５で示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）、モノクローナル抗体１２Ｅ３（配列番号３３および３６で示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）、または実施例１および２で同定されるモノクローナル抗体のうちの任意の１つでありうる。かかる交差競合抗体は、標準のＢＭＰ２またはＢＭＰ４結合アッセイにおいてこれらの抗体と交差競合するその能力に基づいて同定されうる。例えば、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーを用い、本発明の抗体との交差競合を実証することが可能である。試験抗体の例えば６Ｈ４、１１Ｆ２、または１２Ｅ３のヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４に対する結合を阻害する能力により、試験抗体がヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４への結合において６Ｈ４、１１Ｆ２、または１２Ｅ３と競合可能であり、それにより６Ｈ４、１１Ｆ２、または１２Ｅ３と同じヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４上のエピトープに結合することが示される。好ましい実施形態では、６Ｈ４、１１Ｆ２、または１２Ｅ３と同じヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４上のエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載のように調製され、単離されうる。
改変され修飾された抗体
さらに、本発明の抗体を出発原料として本明細書中に開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの１つ以上を有する抗体を用いて調製し、修飾抗体を改変することが可能であり、ここで修飾抗体は最初の抗体からの改変された特性を有しうる。抗体は、一方もしくは両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内および／または１つ以上のフレームワーク領域内での１つ以上の残基の修飾によって改変可能である。さらにまたはその他として、抗体は、例えば定常領域内で残基を修飾し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変可能である。
実施可能な可変領域の改変の１つのタイプはＣＤＲ移植である。抗体は、６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基全体に支配的な標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、各抗体間でＣＤＲ外部の配列よりも多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用に関与することから、特定の天然の抗体の特性を模倣する組換え抗体を、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターの作成により発現させることは可能である（例えば、リーヒマン Ｌ．（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．）ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７頁；ジョーンズ Ｐ．（Ｊｏｎｅｓ Ｐ．）ら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５頁；クイーン Ｃ．（Ｑｕｅｅｎ Ｃ．）ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３頁；ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）に交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにクイーン（Ｑｕｅｅｎ）らに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
したがって、本発明の別の実施形態は、本明細書中に示される第１の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体に由来するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、第２の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２に由来するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。好ましい実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（各々、配列番号１３、１４、および１５、配列番号１６、１７、および１８、ならびに配列番号１９、２０、および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（各々、配列番号２２、２３、および２４、配列番号２５、２６、および２７、ならびに配列番号２８、２９、および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）を含む軽鎖可変領域とを含む。したがって、かかる抗体は、モノクローナル抗体６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を有し、これらはさらにこれらの抗体由来の異なるフレームワーク配列を有しうる。
かかるフレームワーク配列は、例えば生殖細胞系の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースまたは出版された参考文献から得ることが可能である。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、（インターネット上のｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能な）「Ｖベース（ＶＢａｓｅ）」ヒト生殖細胞系配列データベースや、カバト Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．）ら（１９９１年）「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（第５版）」、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２；トムリンソン Ｉ．Ｍ．（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ｉ．Ｍ．）ら（１９９２年）「Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；ならびにコックス Ｊ．Ｐ．Ｌ．（Ｃｏｘ Ｊ．Ｐ．Ｌ．）ら（１９９４年）「Ａ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉａｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ Ｕｓａｇｅ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６頁（これら各々の内容全体は参照により本明細書中に明示的に援用される）において見出されうる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース内に見出されうる。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）ならびに３−７（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）にて入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、４−３４（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、３−３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）ならびに３−２３（ＡＪ４０６６７８）にて入手可能である。
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）と称される配列類似性を探索する方法（アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９−３４０２頁）の１つを用いて集められたタンパク質配列データベースに対して比較される。ＢＬＡＳＴは、抗体配列とデータベース配列の間での統計的に有意なアラインメントが整列されたワードの高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を有する傾向が高いという点でヒューリスティックアルゴリズムである。スコアが延長またはトリミングにより改善されえないセグメント対はヒットと称される。つまり、Ｖベース（ＶＢＡＳＥ）由来のヌクレオチド配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ１／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ）が翻訳され、かつＦＲ１〜ＦＲ３フレームワーク領域の間の領域および同領域を含む領域が保持される。データベース配列は平均９８残基長を有する。タンパク質の全長にわたり正確に一致する二重配列が除去される。オフの低複雑性フィルタを除くデフォルトの標準パラメータおよびＢＬＯＳＵＭ６２の置換マトリックスを備えたｂｌａｓｔｐプログラムを用いるタンパク質についてのＢＬＡＳＴ探索では、配列一致をもたらす上位５つのヒットがフィルタにかけられる。ヌクレオチド配列は全部で６つのフレームで翻訳され、データベース配列の一致するセグメント内に停止コドンを全く有しないフレームはヒットの可能性があると考えられる。次いで、これはＢＬＡＳＴプログラムｔｂｌａｓｔｘを用いて確認される。これにより全部で６つのフレーム内で抗体配列が翻訳され、全部で６つのフレーム内で動的に翻訳されたＶベース（ＶＢＡＳＥ）ヌクレオチド配列に対する翻訳が比較される。
同一性は、抗体配列と配列の全長にわたるタンパク質データベースの間の正確なアミノ酸の一致である。正（同一性＋置換の一致）は同一ではなく、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスによって導かれるアミノ酸置換である。抗体配列が同じ同一性を有するデータベース配列のうちの２つに一致する場合、大部分の正を伴うヒットであれば一致する配列ヒットであることが決定されることになる。
本発明の抗体において用いられる好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択された抗体によって用いられるフレームワーク配列に構造的に類似する、例えば本発明の好ましいモノクローナル抗体によって用いられるＶＨ４−５９フレームワーク配列（配列番号４３）、および／またはＶＨ３−３３フレームワーク配列（配列番号４４）、および／またはＶＨ４−３４フレームワーク配列（配列番号５１）、および／またはＶＨ１−６９フレームワーク配列、および／またはＶＫＡ２７フレームワーク配列（配列番号４８）、および／またはＶＫＬ１５フレームワーク配列（配列番号４９）、および／またはＬ６ＶＫフレームワーク配列（配列番号５４）に類似する配列である。ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびにＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列の元となる生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子内に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植されうるか、またはＣＤＲ配列は、生殖細胞系配列と比べて１つ以上の突然変異を有するフレームワーク領域上に移植されうる。例えば、特定の例ではフレームワーク領域内で残基を変異させ、抗体の抗原結合能を維持または促進することが有効であることが見出されている（例えば、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）らに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
可変領域修飾の別のタイプは、アミノ酸残基をＶＨおよび／またはＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内で変異させ、それにより目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善するものである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発を行い突然変異を導入可能であり、かつ、目的の抗体の結合または他の機能特性に対する効果が、本明細書中に記載されかつ実施例に提供されるインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価されうる。典型的には、（上記で考察の）保存的修飾が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失でありうるが、典型的には置換である。さらに典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ以下の残基が改変される。
したがって、別の実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号１３、１４、および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１３、１４、および１５に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号１６、１７、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１６、１７、および１８に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号１９、２０、および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１９、２０、および２１に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号２２、２３、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２２、２３、および２４に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号２５、２６、および２７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２５、２６、および２７に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ２領域；ならびに（ｆ）配列番号２８、２９、および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２８、２９、および３０に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗−ＢＭＰ２／ＢＭＰ４モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、（ａ）ＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）ＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）ＶＨＣＤＲ３領域；（ｄ）ＶＫＣＤＲ１領域；（ｅ）ＶＫＣＤＲ２領域；および（ｆ）ＶＫＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで各ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域ならびに各ＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの異なる抗−ＢＭＰＲ１Ａ抗体；１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの異なる抗−ＢＭＰＲ１Ｂ抗体；１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの異なる抗−ＡＣＴＲ１抗体、および／または１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの異なる抗−ＢＭＰＲ２抗体；または１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの異なる抗−ＢＭＰＲ１Ａ抗体に対して１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列；１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの異なる抗−ＢＭＰＲ１Ｂ抗体；１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの異なる抗−ＡＣＴＲ１抗体；および／または１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの異なる抗−ＢＭＰＲ２抗体に由来する。
本発明の改変抗体は、例えば抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＫ内のフレームワーク残基に修飾が施されている場合の抗体を含む。典型的には、かかるフレームワーク修飾を施すことで抗体の免疫原性が低下する。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異する（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」ことである。より詳細には、体細胞突然変異を経ている抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を有しうる。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することにより同定されうる。かかる「復帰突然変異された（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅｄ）」抗体はまた、本発明に包含されるように意図されている。
例えば、６Ｈ４においては、カバト（Ｋａｂａｔ）番号付与系を用いると、ＶＨのアミノ酸残基＃３（ＦＲ１内）がヒスチジン（配列番号３１）である一方、対応するＶＨ４−３４生殖細胞系配列内のこの残基はグルタミン（配列番号５１）である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系の配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異」可能である（例えば、６Ｈ４のＶＨの残基＃３（ＦＲ１の残基＃３）はヒスチジンからグルタミンに「復帰突然変異」可能である）。
別の例として、１１Ｆ２においては、ＶＨのアミノ酸残基＃２７（ＦＲ１内）がアスパルテート（配列番号３２）である一方、対応するＶＨ４−５９生殖細胞系配列内のこの残基はグリシン（配列番号４３）である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系の配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異」可能である（例えば、１１Ｆ２のＶＨの残基＃２７（ＦＲ１の残基＃２７）はアスパルテートからグリシンに「復帰突然変異」可能である）。
別の例として、１１Ｆ２においては、ＶＨのアミノ酸残基＃３０（ＦＲ１内）がアルギニン（配列番号３２）である一方、対応するＶＨ４−５９生殖細胞系配列内のこの残基はセリン（配列番号４３）である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系の配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異」可能である（例えば、１１Ｆ２のＶＨの残基＃３０（ＦＲ１の残基＃３０）はアルギニンからセリンに「復帰突然変異」可能である）。
別の例として、１１Ｆ２においては、ＶＨのアミノ酸残基＃５４（ＣＤＲ２内）がアルギニン（配列番号３２）である一方、対応するＶＨ４−５９生殖細胞系配列内のこの残基はセリン（配列番号４３）である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系の配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異」可能である（例えば、１１Ｆ２のＶＨの残基＃５４（ＣＤＲ２の残基＃５）はアルギニンからセリンに「復帰突然変異」可能である）。
別の例として、１１Ｆ２においては、ＶＨのアミノ酸残基＃５８（ＣＤＲ２内）がヒスチジン（配列番号３２）である一方、対応するＶＨ４−５９生殖細胞系配列内のこの残基はアスパラギン（配列番号４３）である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系の配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異」可能である（例えば、１１Ｆ２のＶＨの残基＃５８（ＣＤＲ２の残基＃９）はヒスチジンからアスパラギンに「復帰突然変異」可能である）。
別の例として、１２Ｅ３においては、ＶＨのアミノ酸残基＃５２Ａ（ＣＤＲ２内）がアスパルテート（配列番号３３）である一方、対応するＶＨ３−３３生殖細胞系配列内のこの残基はチロシン（配列番号４４）である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系の配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異」可能である（例えば、１２Ｅ３のＶＨの残基＃５２Ａ（ＣＤＲ２の残基＃４）はアスパルテートからチロシンに「復帰突然変異」可能である）。
別の例として、１２Ｅ３においては、ＶＨのアミノ酸残基＃５５（ＣＤＲ２内）がアルギニン（配列番号３３）である一方、対応するＶＨ３−３３生殖細胞系配列内のこの残基はセリン（配列番号４４）である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系の配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異」可能である（例えば、１２Ｅ３のＶＨの残基＃５５（ＣＤＲ２の残基＃７）はアルギニンからセリンに「復帰突然変異」可能である）。
別の例として、１２Ｅ３においては、ＶＨのアミノ酸残基＃５６（ＣＤＲ２内）がリジン（配列番号３３）である一方、対応するＶＨ３−３３生殖細胞系配列内のこの残基はアスパラギン（配列番号４４）である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系の配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異」可能である（例えば、１２Ｅ３のＶＨの残基＃５６（ＣＤＲ２の残基＃８）はリジンからアスパラギンに「復帰突然変異」可能である）。
別の例として、１１Ｆ２においては、ＶＨのアミノ酸残基＃８２（ＦＲ３内）がメチオニン（配列番号３２）である一方、対応するＶＨ４−５９生殖細胞系配列内のこの残基はロイシン（配列番号４３）である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系の配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異」可能である（例えば、１１Ｆ２のＶＨの残基＃８２（ＦＲ３の残基＃１７）はメチオニンからロイシンに「復帰突然変異」可能である）。
フレームワーク修飾の別のタイプは、フレームワーク領域内またはさらに１つ以上のＣＤＲ領域内で１つ以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは、「脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも称され、Ｃａｒｒらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳述されている。
本発明の改変抗体は、修飾をアミノ酸残基に施し、抗体上でのＴ細胞エピトープの相互作用を改変するアミノ酸修飾を通じて免疫原性応答を増大または低下させる場合の抗体も含む（例えば、米国特許第６，８３５，５５０号明細書；米国特許第６，８９７，０４９号明細書および米国特許第６，９３６，２４９号明細書を参照）。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内でなされる修飾に加えまたはその他として、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内で修飾を含み、典型的には抗体の１つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性および／または抗原依存性の細胞毒性を変化させるように改変されうる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾されうる（例えば１つ以上の化学的部分が抗体に付着されうる）か、または修飾によりそのグリコシル化が改変されさらに抗体の１つ以上の機能特性が改変されうる。これらの各実施形態は下記にさらに詳述されている。Ｆｃ領域内の残基の番号付与はＫａｂａｔのＥＵ指数のものである。
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチは、ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）らによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化することで、例えば軽鎖および重鎖の構築が促進されるかあるいは抗体の安定性が増大または低下する。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域の突然変異により抗体の生物学的半減期が減少する。より詳細には、天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して、抗体のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合が低下しているように、１つ以上のアミノ酸変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、ワード（Ｗａｒｄ）らによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳述されている。
別の実施形態では、抗体の修飾によりその生物学的半減期が増加する。様々なアプローチが可能である。例えば、ワード（Ｗａｒｄ）に交付された米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のように、１つ以上の下記の変異、すなわちＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆが導入可能である。あるいは、プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）らによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書および米国特許第６，１２１，０２２号明細書に記載のように、生物学的半減期を増加させるため、抗体は、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープを有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変されうる。
別の実施形態では、抗体は国際公開第２００７／０５９７８２号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のＵｎｉＢｏｄｙとして産生される。
さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換して抗体のエフェクター機能を改変することにより改変される。例えば、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有するが親抗体の抗原への結合能は保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基と置換されうる。親和性が改変される対象のエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第５，６４８，２６０号明細書（いずれもウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）らによる）にさらに詳述されている。
別の例では、抗体の、Ｃ１ｑ結合が改変されかつ／または補体依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）が低減または消失しているように、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基と置換されうる。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号明細書（イドゥソギー（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ）らによる）にさらに詳述されている。
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つ以上のアミノ酸残基が改変されることにより、抗体の補体を固定する能力が改変される。このアプローチは、ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）らによるＰＣＴ国際公開公報第９４／２９３５１号パンフレットにさらに記載されている。
さらに別の例では、以下の位置、すなわち２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８もしくは４３９での１つ以上のアミノ酸の修飾によるＦｃ領域の修飾により、抗体の、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力が増大しおよび／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性が増大する。このアプローチは、ＰＣＴ国際公開公報第００／４２０７２号パンフレット（プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）による）にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、かつ結合が改善された変異体についての記載がなされている（シールズ Ｒ．Ｌ．（Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．）ら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４頁を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特異的変異がＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の変異体の組み合わせ、すなわちＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡがＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体が作製されうる（すなわち抗体におけるグリコシル化が失われる）。グリコシル化の改変により、例えば抗体の抗原に対する親和性が増大しうる。かかる糖質修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することによりなされうる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換がなされうる結果、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去によりその部位でのグリコシル化が失われる。かかるアグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増大しうる。かかるアプローチは、米国特許第５，７１４，３５０号明細書および米国特許第６，３５０，８６１号明細書（コ（Ｃｏ）らによる）にさらに詳述されている。
さらにまたはその他として、グリコシル化の改変タイプを有する抗体、例えば減量されたフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または増強されたＧｌｃＮａｃ二分構造を有する抗体が作製されうる。かかる改変されたグリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能力が増大することが示されている。かかる糖質修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞内で抗体を発現させることにより行われうる。グリコシル化機構が改変された細胞は、当該技術分野で記載がなされており、本発明の組換え抗体を発現し、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生する宿主細胞として用いられうる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞系内で発現される抗体がその糖質上にフコースを含まないように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１、６）フコシルトランスフェラーゼ）を含まない。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを用いたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞内での標的化されたＦＵＴ８遺伝子の破壊により作製された（ヤマネ（Ｙａｍａｎｅ）らによる米国特許公開第２００４０１１０７０４号明細書およびヤマネ−オオヌキ（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ）ら（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４−２２頁を参照）。別の例として、ハナイ（Ｈａｎａｉ）らによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、機能的に破壊されたフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系について記載している。かかる細胞系内で発現される抗体は、α１，６結合に関連した酵素の低減または除去により低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を示す。ハナイ（Ｈａｎａｉ）らは、フコースを抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンに添加するのに低い酵素活性を有するかまたは酵素活性を有することのない細胞系、例えばラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）についても記載している。プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）によるＰＣＴ国際公開公報第０３／０３５８３５号パンフレットには、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された糖質に付着させる能力が低下した（その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化ももたらす）変異ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞について記載されている（シールズ Ｒ．Ｌ．（Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．）ら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁も参照）。ウマナ（Ｕｍａｎａ）らによるＰＣＴ国際公開公報第９９／５４３４２号パンフレットには、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えばβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を、改変された細胞系内で発現される抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらすＧｌｃＮａｃ二分構造の増大を示すように発現するように改変された細胞系について記載されている（ウマナ（Ｕｍａｎａ）ら（１９９９年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０頁も参照）。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を用いて切断されうる。例えば、フコシダーゼのα−Ｌ−フコシダーゼはフコシル残基を抗体から除去する（タランティーノ Ａ．Ｌ．（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ Ａ．Ｌ．）ら（１９７５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３頁）。
脱フコシル化（Ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、「Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」という表題の米国特許第６，９４６，２９２号明細書（日本、東京（Ｔｏｋｙｏ）の協和発酵工業（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ））に記載のポテリジェント（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ）（商標）の方法によっても成し遂げられてもよい。この方法により、フコシルトランスフェラーゼを欠損した宿主細胞が、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性のレベルが上昇した抗体を産生するために用いられる。
本発明に記載の脱フコシル化（ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体を産生するための他のアプローチでは、チュー（Ｚｈｕ）ら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｅｇｇｓ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｃｈｉｃｋｅｎｓ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１５９−１１６９頁（２００５年）に記載の方法が用いられる。この方法により、完全に機能的なモノクローナル抗体がキメラニワトリの卵の卵白内に卵１個当たり約３ミリグラムの収量で発現される［カリフォルニア州バーリンガム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）のオリゲン・セラピュウティクス（Ｏｒｉｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）］。このようにして産生される抗体には末端シアル酸およびフコース残基が欠如し、それは結果的に従来の哺乳類細胞培養物（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞）内で産生される抗体よりも最大で１００倍大きい抗体依存性細胞毒性を有する。典型的には、本発明の抗体の可変ドメインはベクター系にクローン化され（チュー（Ｚｈｕ）らに記載）、ニワトリのＥＳ細胞に形質移入され、ニワトリ胚に導入され、それによりキメラニワトリのバイオリアクターが生成される。
本発明で検討される本明細書中の抗体の別の修飾がペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）である。抗体をペグ化することで、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期が増加されうる。抗体をペグ化するため、抗体またはその断片を典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着した状態になるという条件下で反応させる。典型的には、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性の水−可溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で用いられる「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導体化するのに用いられているＰＥＧの形態のいずれかを包含するように意図されている。特定の実施形態では、ペグ化されるべき抗体はアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当該技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用可能である。例えば、ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）らによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびイシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）らによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照のこと。
抗体の物理的特性
本発明の抗体は、ＢＭＰ２／ＢＭＰ４抗体の様々な物理的特性によりさらに特徴づけられうる。様々なアッセイを用い、これらの物理的特性に基づいて抗体の異なるクラスの検出および／または識別が可能である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を有しうる。可変領域内に１つ以上のグリコシル化部位が存在する結果、抗原結合の改変により抗体の免疫原性または抗体のｐＫの変化が増大しうる（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）ら（１９７２年）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３−７０２頁；ガラ Ｆ．Ａ．（Ｇａｌａ Ｆ．Ａ．）およびモリソン Ｓ．Ｌ．（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．）（２００４年） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９−９４頁；ワリック（Ｗａｌｌｉｃｋ）ら（１９８８年）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９−１０９頁；スピロ Ｒ．Ｇ．（Ｓｐｉｒｏ Ｒ．Ｇ．）（２００２年）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ−５６Ｒ；パレク（Ｐａｒｅｋｈ）ら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２−７頁；ミムラ（Ｍｉｍｕｒａ）ら（２０００年）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７−７０６頁）。グリコシル化はＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を有するモチーフで生じることが知られている。可変領域のグリコシル化はグライコブロット（Ｇｌｙｃｏｂｌｏｔ）アッセイを用いて試験可能であり、同アッセイでは、抗体の切断によりＦａｂが産生され、次いで過ヨウ素酸酸化およびシッフ塩基形成を測定するアッセイを用いてグリコシル化が試験される。あるいは、可変領域のグリコシル化はディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）光クロマトグラフィー（ディオネックス−ＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ））を用いて試験可能であり、そこでは糖類がＦａｂから切断されて単糖類にされ、各糖類の含量が分析される。いくつかの例では、可変領域グリコシル化を含有しない抗−ＣＤ１９抗体を有することが好ましい。これは、可変領域内にグリコシル化モチーフを有することのない抗体を選択するかまたはグリコシル化モチーフ内の残基を当該技術分野で周知の標準技術を用いて突然変異させることにより実現されうる。
好ましい実施形態では、本発明の抗体はアスパラギン異性部位を有することがない。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果が各々、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じうる。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果の結果、主鎖ではなく側鎖のカルボキシ末端から離れてキンク構造（ｋｉｎｋｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を生成することにより抗体の安定性を低下させるイソアスパラギン酸が生成される。イソアスパラギン酸の生成は異性体定量分析（ｉｓｏ−ｑｕａｎｔ ａｓｓａｙ）を用いて測定可能であり、そこでは逆相ＨＰＬＣを用いてイソアスパラギン酸についての試験が行われる。
各抗体は特有の等電点（ｐＩ）を有することになるが、一般に抗体は６〜９．５のｐＨ範囲に収まることになる。ＩｇＧ１抗体におけるｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲内に収まり、かつＩｇＧ４抗体におけるｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲内に収まる。抗体はこの範囲外のｐＩを有する場合がある。効果は一般に未知であるが、正常な範囲外のｐＩを有する抗体がインビボ条件下である程度のアンフォールディングおよび不安定性を有しうることが推定される。等電点はキャピラリー等電点電気泳動アッセイを用いて試験可能であり、それはｐＨ勾配を生成し、そこでは精度向上のためにレーザー集光が用いられうる（ジャニニ（Ｊａｎｉｎｉ）ら（２００２年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２３：１６０５−１１頁；マ（Ｍａ）ら（２００１年）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ５３：Ｓ７５−８９頁；ハント（Ｈｕｎｔ）ら（１９９８年）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ８００：３５５−６７頁）。いくつかの例では、正常な範囲内に収まるｐＩ値を有する抗−ＣＤ１９抗体を有することが好ましい。これは、正常な範囲内のｐＩを有する抗体を選択するかまたは帯電した表面残基を当該技術分野で周知の標準の技術を用いて突然変異することにより成し遂げることが可能である。
各抗体は、熱安定性を示す融解温度を有すると考えられる（クリシュナムルティ Ｒ．（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ Ｒ．）およびマニング Ｍ．Ｃ．（Ｍａｎｎｉｎｇ Ｍ．Ｃ．）（２００２年） Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：３６１−７１頁）。より高い熱安定性は、インビボで全体的により高い抗体安定性を示す。抗体の融解点は、示差走査熱量測定などの技術を用いて測定されうる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら（２００３年）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２０：１９５２−６０頁；ガーランド（Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ）ら（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６８：４７−５２頁）。ＴＭ１は抗体の初期のアンフォールディングの温度を示す。ＴＭ２は抗体の完全なアンフォールディングの温度を示す。一般に、本発明の抗体のＴＭ１が６０℃より高く、好ましくは６５℃より高く、さらにより好ましくは７０℃より高いことが好ましい。あるいは、抗体の熱安定性は円二色性を用いて測定されうる。（マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら（２００２年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｓｃｉ ４０：３４３−９頁）。
好ましい実施形態では、急速に分解することのない抗体が選択される。抗−ＣＤ１９抗体の断片化は、当該技術分野で十分に理解されているようにキャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて測定されうる（アレキサンダー Ａ．Ｊ．（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ａ．Ｊ．）およびヒュー Ｄ．Ｅ．（Ｈｕｇｈｅｓ Ｄ．Ｅ．）（１９９５年）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６７：３６２６−３２頁）。
別の好ましい実施形態では、最小の凝集効果を有する抗体が選択される。凝集が、望ましくない免疫応答および／または改変されるかもしくは好ましくない薬物動態学的特性の誘因となりうる。一般に、抗体では、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下およびさらにより好ましくは５％以下の凝集が許容される。凝集は、単量体、二量体、三量体または多量体を同定するためのサイズ排除カラム（ＳＥＣ）高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含む、当該技術分野で周知のいくつかの技術により測定されうる。
抗体を改変する方法
上記で考察したように、本明細書中に開示されるＶＨおよびＶＫ配列を有する抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体を用い、ＶＨおよび／またはＶＫ配列またはそれらに付着された定常領域の修飾により、新しい抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体を作製可能である。したがって、本発明の別の態様では、本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体の構造的特徴を用い、本発明の抗体の少なくとも１つの機能特性、例えばヒトＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する特異的結合性を保持する構造的に関連した抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体が作製される。例えば、上記で考察したように、本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／もしくは抗−ＢＭＰＲ２抗体またはそれらの変異体の１つ以上のＣＤＲ領域を、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換え結合させ、さらなる組換え操作された本発明の抗体が作製可能である。
修飾の他のタイプとして、前セクションに記載のタイプが挙げられる。改変方法における出発原料は、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＫ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域である。改変抗体を作製するのに、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＫ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわちタンパク質として発現させる）必要はない。それに対し、配列内に含まれる情報を出発原料として用い、元の配列由来の「第二世代」配列が作製され、次いで「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
したがって、別の実施形態では、本発明は、抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体を調製するための方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、抗−ＢＭＰ２／ＢＭＰ４抗体を調製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１３、１４、および１５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１６、１７、および１８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号１９、２０、および２１からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；ならびに／あるいは（ｉｉ）配列番号２２、２３、および２４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２５、２６、および２７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号２８、２９、および３０からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供する工程と、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列の内部の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも１つの改変抗体配列を作製する工程と、
（ｃ）改変抗体配列をタンパク質として発現させる工程と
を含む方法を提供する。
標準の分子生物学技術を用い、改変抗体配列の調製および発現が可能である。
典型的には、改変抗体配列によりコードされる抗体は本明細書中に記載の１つ以上の抗体の機能特性のうちの１つ、一部もしくは全部を保持する抗体であり、ここで機能特性はＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する特異的結合を含むがそれに限定されない。
改変抗体の機能特性は、当該技術分野で使用可能であり、かつ／または本明細書中に記載の標準アッセイ、例えば実施例で示されるアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ）を用いて評価可能である。
本発明の抗体を改変する方法の特定の実施形態では、変異が、抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体のコード配列の全部もしくは一部に沿ってランダムまたは選択的に導入可能であり、かつ、得られる修飾された抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体は、本明細書中に記載の、結合活性および／または他の機能特性についてスクリーニング可能である。突然変異方法については当該技術分野で記載がなされている。例えば、ショート（Ｓｈｏｒｔ）によるＰＣＴ国際公開公報第０２／０９２７８０号パンフレットでは、抗体変異を飽和突然変異誘発、合成的ライゲーションアセンブリー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）またはそれらの組み合わせを用いて作製しスクリーニングするための方法が記載されている。あるいは、レーザー（Ｌａｚａｒ）らによるＰＣＴ国際公開公報第０３／０７４６７９号パンフレットでは、コンピュータによるスクリーニング方法を用いて抗体の生理化学的特性を最適化する方法が記載されている。
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中にまたは部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、当該技術分野で周知のアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製される場合、「単離される」かまたは「実質的に純粋な状態にされる」。Ｆ．アウスベル（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編（１９８７年）「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のグリーン・パブリッシング・アンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を参照のこと。本発明の核酸が例えばＤＮＡまたはＲＮＡでありうるとともに、イントロン配列を有するかまたは有しない場合がある。好ましい実施形態では核酸はｃＤＮＡ分子である。
本発明の核酸を、標準の分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、下記にさらに記載のヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）によって発現される抗体においては、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準のＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得られうる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる（例えばファージディスプレイ技術を用いて）抗体をコードする核酸が回収されうる。本発明の典型的な核酸分子は、本明細書中に示される抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。
本発明の好ましい核酸分子は、６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列は各々、配列番号３７、３８、および３９で示される。６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は各々、配列番号４０、４１、および４２で示される。
本発明の他の好ましい核酸は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、もしくは４２に示される配列のうちの１つと、少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、本発明の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸である。
２つの核酸配列間の同一性パーセントは、配列内でヌクレオチドが同一である位置の数であり、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮しており、このことは２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある。２つの配列間での配列の比較および同一性パーセントの判定は、数学的アルゴリズム、例えばメイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズムまたは上記のアルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）のＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて行われうる。
本発明のさらに好ましい核酸は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、および４２に示される核酸配列の１つ以上のＣＤＲコード部分を含む。この実施形態では、核酸は、６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列、あるいは６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列をコードしうる。
配列番号３７、３８、３９、４０、４１、もしくは４２のかかるＣＤＲコード部分と、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸は、本発明の好ましい核酸でもある。かかる核酸は、非ＣＤＲコード領域内および／またはＣＤＲコード領域内の配列番号３７、３８、３９、４０、４１、もしくは４２の対応する部分とは異なる場合がある。差がＣＤＲコード領域内に存在する場合、核酸によりコードされる核酸ＣＤＲ領域は、典型的には、６Ｈ４、１１Ｆ２、および１２Ｅ３の対応するＣＤＲ配列に対する本明細書中に定義される１つ以上の保存的配列修飾を含む。
一旦ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片を標準の組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することで、例えば可変領域遺伝子が完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換されうる。これらの操作では、ＶＬもしくはＶＨをコードするＤＮＡ断片が、別のタンパク質、例えば抗体の定常領域またはフレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。これに関連して用いられる「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味するように意図されている。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり（例えばカバト Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．）ら 「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（第５版）」、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、１９９１年を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により得ることが可能である。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域でありうるが、最も典型的にはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡが、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結されうる。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり（例えばカバト Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．）ら「免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（第５版）」、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、１９９１年を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により得ることが可能である。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域でありうるが、最も典型的にはカッパ定常領域である。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片がフレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結されることで、ＶＨおよびＶＬ配列はフレキシブルリンカーで連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有する隣接した一本鎖タンパク質として発現されうる（例えば、バード（Ｂｉｒｄ）ら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６頁（１９８８年）；ハストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３頁（１９８８年）；およびマッカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４頁（１９９０年）を参照）。
本発明のモノクローナル抗体の産生
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばコーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５頁（１９７５年）の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により産生可能である。原理上、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換が用いられうる。
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生成は極めて十分に確立された方法である。融合のために免疫された脾細胞を単離するための免疫プロトコルおよび技術は当該技術分野で公知である。融合相手（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合方法についても公知である。
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製されるマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製されうる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから得られ、標準の分子生物学技術を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を有するように改変されうる。例えば、キメラ抗体を作製するため、マウス可変領域は当該技術分野で公知の方法を用いてヒト定常領域に連結されうる（例えばキャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らに交付された米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。ヒト化抗体を作製するため、マウスＣＤＲ領域は当該技術分野で公知の方法を用いてヒトフレームワークに挿入されうる（例えば、ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）に交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにクイーン（Ｑｕｅｅｎ）らに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
好ましい実施形態では、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に特異的なかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモゾームマウスを用いて産生されうる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモゾームマウスは、本明細書中で各々ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）およびＫＭマウス（登録商標）と称されるマウスを含み、本明細書中で総称して「ヒトＩｇマウス」と称される。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（メダレックス社（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．））は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異とともに未転位のヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を有する（例えば、ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁（１９９４年）を参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫に応答し、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子がクラススイッチおよび体細胞突然変異を受け、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナルが産生される（ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら、上記；ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）の「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」１１３：４９−１０１頁（１９９４年）にレビュー；ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）およびハスザー（Ｈｕｓｚａｒ）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３頁（１９９５年）ならびにハーディング（Ｈａｒｄｉｎｇ）およびロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６頁（１９９５年））。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用ならびにかかるマウスにより保有されるゲノム修飾は、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５頁（１９９２年）；チェン（Ｃｈｅｎ）ら「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」５：６４７−６５６頁（１９９３年）；テュアイヨン（Ｔｕａｉｌｌｏｎ）ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７２０−３７２４頁（１９９５年）；チョイ（Ｃｈｏｉ）ら Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−１２３頁（１９９３年）；チェン（Ｃｈｅｎ）ら ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８２１−８３０頁（１９９３年）；テュアイヨン（Ｔｕａｉｌｌｏｎ）ら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０頁（１９９４年）；テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」６：５７９−５９１頁（１９９４年）；ならびにフィッシュワイルド（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ）ら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁（１９９６年）においてさらに記載されている（これらすべての内容はその全体が参照により本明細書中に具体的に援用される）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，７８９，６５０号明細書；米国特許第５，８７７，３９７号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８７４，２９９号明細書；および米国特許第５，７７０，４２９号明細書（すべてはロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）およびケイ（Ｋａｙ）に交付）、スラニ（Ｓｕｒａｎｉ）らに交付された米国特許第５，５４５，８０７号明細書；ＰＣＴ国際公開公報第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第９９／４５９６２号パンフレット（すべてはロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）およびケイ（Ｋａｙ）に交付）、ならびにコーマン（Ｋｏｒｍａｎ）らに交付されたＰＣＴ国際公開公報第０１／１４４２４号パンフレットを参照のこと。
関連の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子の一部を保有するマウスが免疫されうる。例えば、マウスはヒト免疫グロブリン遺伝子のＶ領域のみを保有しうる。これら動物への免疫の結果、キメラ抗体が産生されることになる。
別の実施形態では、本発明のヒト抗体は、トランス遺伝子およびトランスクロモゾーム上でヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えばヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモゾームを保有するマウスを用いて産生されうる。本明細書中で「ＫＭマウス（登録商標）」と称されるかかるマウスは、イシダ（Ｉｓｈｉｄａ）らに交付されたＰＣＴ国際公開公報第０２／４３４７８号パンフレットに詳述されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスジェニック動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体が産生されうる。例えば、ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（カリフォルニア州サウサンドオークス（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ）のアムジェン社（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．））として称される他のトランスジェニック系の使用が可能であり、かかるマウスは、例えばクチャーラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）らに交付された米国特許第５，９３９，５９８号明細書；米国特許第６，０７５，１８１号明細書；米国特許第６，１１４，５９８号明細書；米国特許第６，１５０，５８４号明細書および米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスクロモゾーム動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本発明の抗体の産生が可能である。例えば、「ＴＣマウス」と称される、ヒト重鎖トランスクロモゾームおよびヒト軽鎖トランスクロモゾームの双方を保有するマウスの使用が可能であり、かかるマウスはトミズカ（Ｔｏｍｉｚｕｋａ）ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２２−７２７頁（２０００年）に記載されている。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモゾームを保有するウシについての記載が当該技術分野でなされており（クロイワ（Ｋｕｒｏｉｗａ）ら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８８９−８９４頁（２００２年））、その使用により、本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体の産生が可能である。
さらに、（精製されたＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／もしくはＢＭＰＲ２関連タンパク質またはＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／もしくはＢＭＰＲ２発現細胞が存在する場合または存在しない場合）当該技術分野で公知の裸ＤＮＡ免疫技術を用い、コードされた免疫原に対する免疫応答を生じさせることができる（概説としてドネリー（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ）ら、１９９７年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８頁を参照、その内容全体は参照により本明細書中に明示的に援用される）。したがって、本発明は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／もしくはＢＭＰＲ２遺伝子またはそれらの一部でのＤＮＡ免疫も含む。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いても調製可能である。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当該技術分野で確立されたものである。例えば、ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）らに交付された米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；および米国特許第５，５７１，６９８号明細書；ドワー（Ｄｏｗｅｒ）らに交付された米国特許第５，４２７，９０８号明細書および米国特許第５，５８０，７１７号明細書；マッカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）らに交付された米国特許第５，９６９，１０８号明細書および米国特許第６，１７２，１９７号明細書；ならびにグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）らに交付された米国特許第５，８８５，７９３号明細書；米国特許第６，５２１，４０４号明細書；米国特許第６，５４４，７３１号明細書；米国特許第６，５５５，３１３号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書および米国特許第６，５９３，０８１号明細書を参照のこと。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体反応が免疫時に生成されうるようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて調製されうる。かかるマウスは、例えばウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）らに交付された米国特許第５，４７６，９９６号明細書および米国特許第５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
本発明に記載の抗体は、レックス・システム（ＬＥＸ Ｓｙｓｔｅｍ）（商標）およびプランティボディーズ（Ｐｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（商標）［ノースカロライナ州ピッツボロ（Ｐｉｔｔｓｂｏｒｏ）のバイオレックス社（Ｂｉｏｌｅｘ，Ｉｎｃ．）］の方法によっても産生可能であり、ここで本発明の抗体はトランスジェニック植物内で産生される。最近交付された「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という表題の米国特許第６，８５２，３１９号明細書を参照のこと。レックス・システム（ＬＥＸ Ｓｙｓｔｅｍ）（商標）は、小さい緑色の水生植物のウキクサ科（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）の自然の特性と、遺伝子工学およびタンパク質回収方法とを合わせることで発生および産生技術を創出し、それらにより、考えられる明確な用途に応じ、既存の細胞培養系およびトランスジェニック発現系全般に特定の利点をもたらしうる。（形質転換および選択の方法、トランスジェニック植物再生の方法、成長および回収の方法、複数の遺伝子およびベクターの使用、ならびに形質転換された組織および植物について開示する）「Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｄｕｃｋｗｅｅｄ」という表題の米国特許第６，０４０，４９８号明細書およびＰＣＴ特許出願公開、国際公開第９９／０７２１０号パンフレット；（発現のための方法および組成物、回収のための方法および組成物、発現レベルを高めるための方法、ならびに特異的分泌のための方法を開示する）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｄｕｃｋｗｅｅｄ」という表題のＰＣＴ特許出願公開、国際公開第０２／１０４１４号パンフレット；「Ｐｌａｔｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」という表題のＰＣＴ特許出願公開、国際公開第０２／０９７０２９号パンフレット；「Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｕｃｋｗｅｅｄ ｉｎ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」という表題のＰＣＴ特許出願公開、国際公開第０２／０９７４３３号パンフレット；ならびに「ＬＥＤ Ａｒｒａｙ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｒａｃｋ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｈａｎｄｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」という表題の米国特許第６，６８０，２００号明細書を参照のこと。植物内でヒトおよび他の抗体を発現させるためのプランティボディーズ（Ｐｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（商標）の方法が、米国特許第６，４１７，４２９号明細書；米国特許第５，２０２，４２２号明細書；米国特許第５，６３９，９４７号明細書；米国特許第５，９５９，１７７号明細書；および米国特許第６，４１７，４２９号明細書に開示されている。これらの特許および特許出願の各々は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
ヒトＩｇマウスの免疫
ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁（１９９４年）；フィッシュワイルド（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ）ら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁（１９９６年）；ならびにＰＣＴ国際公開公報第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第０１／１４４２４号パンフレットに記載によると、ヒトＩｇマウスを用いて本発明のヒト抗体が産生される場合、かかるマウスは、本発明のＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２抗体、本発明のＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２抗体、本発明のＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２抗体を発現する細胞系、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２抗原の精製または濃縮された調製物、ならびに／あるいは組換えＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２、あるいはＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２融合タンパク質で免疫されうる。典型的には、マウスは１回目の免疫時に６〜１６週齢となる。例えば、ヒトＩｇマウスの腹腔内に免疫するために、抗原の、精製または組換え調製物（５〜５０μｇ）を用いることができる。
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための詳細な方法が、下記の実施例１に記載されている。様々な抗原を用いる試験を重ねることで、トランスジェニックマウスが、最初に完全フロイントアジュバント中の抗原で腹腔内（ＩＰ）に免疫され、それに続き、不完全フロイントアジュバント中の抗原で隔週、最大で全６回ＩＰ免疫された場合、応答することが示されている。しかし、フロイント以外のアジュバントについても有効であることが見出されている。さらに、アジュバントの非存在下では全細胞における免疫原性が高いことが見出されている。免疫応答は、例えば後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）の出血により得られる血漿試料を用いる免疫プロトコルを通して監視可能である。血漿はＥＬＩＳＡでスクリーニング可能であり、十分な力価のヒト免疫グロブリンを有するマウスが融合に用いられうる（実施例１に記載のように）。マウスを、屠殺および脾臓摘出の３日前、抗原で静脈内に追加免疫することができる。免疫ごとに２〜３の融合がなされる必要がありうることが想定される。典型的にはマウス６〜２４匹が各抗原について免疫される。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２株の双方が用いられる。ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２マウス株の生成については、各々、米国特許第５，７７０，４２９号明細書およびＰＣＴ国際公開公報第０１／０９１８７号パンフレットの実施例２に記載されている。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランス遺伝子は共に、２つの異なるヒト重鎖トランス遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する単一のマウスに育種されうる。その他としてまたはさらに、ＫＭマウス（登録商標）株がＰＣＴ国際公開公報第０２／４３４７８号パンフレットに記載のように用いられうる。
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、免疫されたマウス由来の脾細胞および／またはリンパ節細胞が単離され、適切な不死化細胞系、例えばマウス骨髄腫細胞系に融合されうる。生成されたハイブリドーマでは、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニング可能である。例えば、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液が、５０％ＰＥＧとともにＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）の数の１／６に融合されうる。あるいは、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液は、サイト・パルス（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ）大型チャンバ細胞融合エレクトロポレーター（メリーランド州グレンバーニー（Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ）のサイト・パルス・サイエンシズ社（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））を用いる、電場に基づく電気融合法を用いて融合されうる。細胞を平底マイクロタイタープレート内に約２×１０５でプレーティング後、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム（バージニア州ハーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）のメディアテック社（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））と、さらに２０％ウシ胎仔血清（ユタ州ローガン（Ｌｏｇａｎ）のハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））、１８％ Ｐ３８８ＤＩ条件培地、５％オリゲンハイブリドーマクローニングファクター（Ｏｒｉｇｅｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｌｏｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（バージニア州ゲチスバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）のバイオベリス（ＢｉｏＶｅｒｉｓ））、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｍＭヘペス、０．０５５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１×ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地（シグマ（Ｓｉｇｍａ）；ＨＡＴは融合の２４時間後に添加される）を含有するＤＭＥＭ高グルコース培地内で１週間インキュベートした。１週間後、ＨＡＴが用いられた培地内で培養された細胞がＨＴと交換された。次いで、各ウェルでは、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてのスクリーニングをＥＬＩＳＡにより行うことができる。通常で１０〜１４日後、ハイブリドーマの成長が観察されうる。抗体を分泌するハイブリドーマは、再プレーティングされ、再びスクリーニングされ、依然としてヒトＩｇＧ陽性である場合、モノクローナル抗体は限界希釈により少なくとも２回サブクローニングされうる。次いで、特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養することで、組織培地内に少量の抗体が産生されうる。
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマをモノクローナル抗体の精製用の２リットルのスピナーフラスコ内で成長させることができる。親和性クロマトグラフィー前に、上清をプロテインＡ−セファロース（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて濾過し、濃縮する。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーで検査することで、純度を保証することができる。緩衝溶液はＰＢＳに交換可能であり、濃度は１．４３の減衰係数を用い、ＯＤ２８０により判定可能である。モノクローナル抗体は、一定量に分割され、−８０℃で保存されうる。
本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本発明の抗体は、例えば当該技術分野で周知のように組換えＤＮＡ技術と遺伝子形質移入方法を併用し、宿主細胞のトランスフェクトーマ内でも産生されうる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２頁（１９８５年））。
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるため、部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが標準の分子生物学技術（例えば目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いるＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）により得られ、ＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入されうる。これに関連し、「作動可能に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図された機能を果たすようにベクターにライゲートされることを意味するように意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞と適合可能であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されうるかまたは、より典型的には両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上での相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が全く存在しない場合での平滑末端ライゲーション）により、発現ベクターに挿入される。
本明細書中に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用い、それらを、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結されかつＶＫセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製可能である。さらにまたはその他として、組換え発現ベクターは、抗体鎖の宿主細胞からの分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるようにベクターにクローン化されうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でありうる。
抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。かかる調節配列は、例えばゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）（「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）（１９９０年））に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換対象の宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要素に依存しうることが当業者により理解されるであろう。哺乳類宿主細胞の発現における好ましい調節配列は、哺乳類細胞内で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス因子、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えばアデノウィルスメジャー後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列、例えばユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターが用いられうる。さらに、異なる供給源由来の配列からなる調節因子、例えばＳＲαプロモーター系は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１のＳＶ４０初期プロモーターおよび長い末端リピートに由来する配列を含有するものである（タケベ（Ｔａｋｅｂｅ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２頁（１９８８年））。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、本発明の組換え発現ベクターは、追加配列、例えば宿主細胞内でのベクターの複製（例えば複製の起点）を調節する配列および選択可能マーカー遺伝子を保有しうる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、米国特許第４，６３４，６６５号明細書および米国特許第５，１７９，０１７号明細書（いずれもアクセル（Ａｘｅｌ）らによる）を参照）。例えば典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に対して薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートへの耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、（メトトレキセートの選択／増幅の場合にｄｈｆｒ−宿主細胞内で用いられる）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８の選択用の）ｎｅｏ遺伝子を含む。
軽鎖および重鎖の発現においては、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技術により宿主細胞に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡの原核または真核宿主細胞への導入のために一般に用いられる多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸塩の沈降、ＤＥＡＥ−デキストランによる形質移入などを包含するように意図されている。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることは理論的に可能であるが、原核細胞よりもかかる真核細胞および特に哺乳類細胞の方が、適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性が高いことから、真核細胞内および最も典型的には哺乳類宿主細胞内での抗体の発現が最も好ましい。原核生物での抗体遺伝子の発現は、高収量の活性抗体の産生にとって無効であることが報告されている（ボス（Ｂｏｓｓ）およびウッド（Ｗｏｏｄ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ６：１２−１３頁（１９８５年））。
本発明の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばカウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁（１９８２年）に記載のように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる、ウアラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：４２１６−４２２０頁（１９８０年）に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の場合の使用においては、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号パンフレット、国際公開第８９／０１０３６号パンフレットおよび欧州特許第３３８，８４１号明細書に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現、またはより典型的には抗体の宿主細胞を成長させる培地への分泌を実現するのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。
抗原に対して結合する抗体の特徴づけ
本発明の抗体では、例えばフローサイトメトリーにより、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する結合について試験してもよい。つまり、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２発現細胞を、組織培養フラスコおよび調製された単一の細胞懸濁液から新たに回収する。ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を発現する細胞懸濁液を、透過処理ありまたは無しで、１％パラホルムアルデヒドＰＢＳを用いた固定後かまたは直接に、一次抗体で染色する。約１００万個の細胞を、０．５％ＢＳＡおよび５０〜２００μｇ／ｍｌの一次抗体を含有するＰＢＳ中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートする。細胞を、０．１％ ＢＳＡ、０．０１％ ＮａＮ３を含有するＰＢＳで２回洗浄し、１：１００希釈のＦＩＴＣと複合されたヤギ−抗−ヒトＩｇＧ（ペンシルバニア州ウエストグローブ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）のジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））１００μｌ中に再懸濁し、氷上でさらに３０分間インキュベートする。細胞を再び洗浄用緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄し、ファックスキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）血球計算器（カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）のベクトン−ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））上で蛍光染色について分析する。
あるいは、本発明の抗体では、標準ＥＬＩＳＡにより、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する結合について試験してもよい。つまり、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中、０．２５μｇ／ｍｌでの精製されたＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２でコートし、次いでＰＢＳ中、５％ウシ血清アルブミンでブロックする。抗体の希釈物（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２で免疫されたマウス由来の血漿の希釈物）を各ウェルに添加し、３７℃で１−２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／トゥイーンで洗浄し、次いでアルカリホスファターゼに複合された二次試薬（例えば、ヒト抗体においてはヤギ−抗−ヒトＩｇＧＦｃに特異的なポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で発色させ、ＯＤ４０５−６５０で分析する。典型的には、最高力価を生じるマウスは融合に用いられることになる。
上記のＥＬＩＳＡアッセイを用い、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２免疫原との反応性で陽性を示すハイブリドーマのスクリーニングも可能である。ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対して高い結合活性で結合するハイブリドーマはサブクローニングされ、さらに特徴づけられる。各ハイブリドーマ由来の１つのクローンは、（ＥＬＩＳＡにより）親細胞の反応性を保持し、−１４０℃で保存された５〜１０のバイアルの細胞バンクの作製および抗体精製のために選択されうる。
抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマを２リットルのスピナーフラスコ内で成長させ、モノクローナル抗体の精製を行ってもよい。上清を、プロテインＡ−セファロース（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いる親和性クロマトグラフィー前に濾過し、濃縮してもよい。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーにより検査し、純度を保証してもよい。緩衝溶液をＰＢＳに交換し、濃度を、１．４３消衰係数を用いるＯＤ２８０によって決定してもよい。モノクローナル抗体を一定量に分割し、−８０℃で保存してもよい。
選択された抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するか否かを判定するため、各抗体を市販の試薬（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いてビオチン化してもよい。未標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を有する競合試験を、上記のＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２でコートされたＥＬＩＳＡプレートを用いて行ってもよい。ビオチン化ｍＡｂの結合性を、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐ−ａｖｉｄｉｎ）−アルカリホスファターゼプローブで検出してもよい。あるいは、下記の実施例でさらに記載のように、競合試験を、放射性標識抗体を用いて行い、未標識競合抗体をスカッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析で検出してもよい。
精製抗体アイソタイプを判定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡを特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いて行ってもよい。例えば、ヒトモノクローナル抗体アイソタイプを判定するため、マイクロタイタープレートのウェルを１μｇ／ｍｌの抗−ヒト免疫グロブリンで４℃で一晩コートしてもよい。１％ ＢＳＡでブロック後、プレートを１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭのいずれかに特異的なアルカリホスファターゼと複合されたプローブと反応させてもよい。プレートを発色させ、上記のように分析される。
抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２ヒトＩｇＧを、ウエスタンブロッティングにより、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２抗原との反応性についてさらに試験することができる。つまり、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原はニトロセルロース膜に移され、１０％ウシ胎仔血清でブロックされ、試験対象のモノクローナル抗体で探索される。ヒトＩｇＧの結合性を、抗−ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．））を用いて発色させてもよい。
免疫複合体
別の態様では、本発明は、治療的部分、例えば細胞毒素、薬剤（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素に複合された、抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体、またはそれらの断片を特徴とする。かかる複合体は本明細書中で「免疫複合体」と称される。１つ以上の細胞毒素を含む免疫複合体は「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞毒性物質は、細胞に対して有害な（例えば細胞を殺滅する）任意の作用物質を含む。例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。治療物質は、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含む。
本発明の特定の態様内では、［毒素（例えばビンブラスチン、リシン（ｒｉｓｉｎ）、ジフテリア毒素、アブリン、ビンブラスチンヒドラジド、メトトレキセートヒドラジド、アントラサイクリン、インジウムとイットリウムとのキレート、ならびに金属キレート）が、ポリエチレングリコールおよびジペプチドを含む切断可能なスペーサーを介して例えば抗体またはその断片上の残基に結合された毒素複合体について記載する］米国特許第６，１００３，２３６号明細書および米国特許第６，６３８，５０９号明細書；［細胞毒性物質、ジスルフィドプロドラッグ、ペプチジルプロドラッグ、および化学的リンカーを含むリンカーについて記載する］米国特許第６，９８９，４５２号明細書および米国特許出願第１０／１６０，９７２号明細書、米国特許出願第１０／１６１，２３４号明細書、米国特許出願第１１／１３３，９７０号明細書、米国特許出願第１１／１３４，６８５号明細書、米国特許出願第１１／１３４，８２６号明細書、米国特許出願第１１／２２４，５８０号明細書、および米国特許出願第１１／３９８，８５４号明細書に開示のように、ウルトラ−ポテント・セラピュウティック（Ｕｌｔｒａ−ｐｏｔｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）（ＵＰＴ（商標）；カリフォルニア州ミルピタス（Ｍｉｌｐｉｔａｓ）のメダレックス社（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．））である治療部分に複合された抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／もしくは抗−ＢＭＰＲ２抗体、またはそれらの断片を含む、免疫複合体が提供される。
本発明の抗体に複合可能な細胞毒素治療薬の他の好ましい例として、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）およびそれらの誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体複合体の例として市販のもの（ミロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標）；アメリカン・ホーム・プロダクツ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））が挙げられる。
細胞毒素は、当該技術分野で利用可能なリンカー技術を用いて本発明の抗体に複合されうる。細胞毒素を抗体に複合させるのに用いられているリンカータイプの例として、限定はされないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチドを含有するリンカーが挙げられる。例えば、リソソーム区画内で低いｐＨにより切断を受けやすいかまたはプロテアーゼ、例えばカテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの腫瘍組織内で優先的に発現されるプロテアーゼにより切断を受けやすいリンカーを選択してもよい。
細胞毒素の例が、例えば、米国特許第６，９８９，４５２号明細書、米国特許第７，０８７，６００号明細書、および米国特許第７，１２９，２６１号明細書、ならびにＰＣＴ出願番号、ＰＣＴ／ＵＳ０２／１７２１０号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７８０４号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ０６／３７７９３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ０６／０６００５０号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６０７１１号明細書、国際公開第２００６／１１０４７６号パンフレット、ならびに米国特許出願第６０／８９１，０２８号明細書に記載されている（これらのすべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。細胞毒素のタイプ、リンカーおよび治療物質を抗体に複合させるための方法についてのさらなる考察としては、サイトウ Ｇ．（Ｓａｉｔｏ Ｇ．）ら（２００３年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５頁；トレイル Ｐ．Ａ．（Ｔｒａｉｌ Ｐ．Ａ．）ら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７頁；ペイン Ｇ．（Ｐａｙｎｅ Ｇ．）（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７−２１２頁；アレン Ｔ．Ｍ．（Ａｌｌｅｎ Ｔ．Ｍ．）（２００２年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２：７５０−７６３頁；パスタン Ｉ．（Ｐａｓｔａｎ Ｉ．）およびクレイトマン Ｒ．Ｊ．（Ｋｒｅｉｔｍａｎ Ｒ．Ｊ．）（２００２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ３：１０８９−１０９１頁；センター Ｐ．Ｄ．（Ｓｅｎｔｅｒ Ｐ．Ｄ．）およびスプリンガー Ｃ．Ｊ．（ＳｐｒｉｎｇｅｒＣ．Ｊ．）（２００１年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４頁も参照のこと。
本発明の抗体を、放射性同位体にも複合し、放射性免疫複合体とも称される細胞毒性のある放射性医薬品を生成してもよい。診断または治療用途として抗体に複合可能な放射性同位体の例として、限定はされないが、ヨウ素１３１、ヨウ素１２５、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７が挙げられる。放射性免疫複合体を調製するための方法は、当該技術分野で確立されている。放射性免疫複合体の例は、ゼバリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（商標）（バイオジェン（Ｂｉｏｇｅｎ）（登録商標）ＩＤＥＣ）およびベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）（商標）（グラクソ−スミスクライン（Ｇｌａｘｏ−ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））および（登録商標）（コリクサ・ファーマシューティカルズ（Ｃｏｒｉｘａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））などが市販されており、同様の方法を用い、本発明の抗体を用いて放射性免疫複合体を調製してもよい。
本発明の抗体複合体を用いて所与の生物学的応答を修飾可能であり、薬剤部分は従来の化学治療物質に限定されるものとして解釈されるべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドでありうる。かかるタンパク質は、例えば、酵素活性毒素またはその活性断片、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシンまたはジフテリア毒素；腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γなどのタンパク質；あるいは、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の成長因子などの生物学的応答修飾因子を含みうる。
かかる治療部分を抗体に複合させるための技術は周知であり、例えば、アーノン（Ａｒｎｏｎ）ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２４３−５６頁（レイスフェルド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ら編、アラン・アール・リス社（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）１９８５年）；ヘルストローム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、６２３−５３頁（第２版、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら編、マーセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）１９８７年）；ソルペ（Ｔｈｏｒｐｅ）、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ'８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４７５−５０６頁（１９８５年）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、３０３−１６頁（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）１９８５年）；ならびにソルペ（Ｔｈｏｒｐｅ）ら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８頁（１９８２年）を参照のこと。
二重特異性分子
別の態様では、本発明は、本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／もしくは抗−ＢＭＰＲ２抗体またはそれらの断片を含む二重特異性分子を特徴とする。かかる抗体またはその抗原結合部分が別の機能分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば別の抗体または受容体に対するリガンド）に誘導体化または連結され、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子が生成されうる。本発明の抗体が実際に２つ以上の他の機能分子に誘導体化または連結され、３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子が生成される可能性があり、かかる多重特異性分子は本明細書で用いられる「二重特異性分子」という用語に包含されるようにも意図されている。本発明の二重特異性分子を作製するため、本発明の抗体は、二重特異性分子が生成されるように、１つ以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｍｅｔｉｃ）に（例えば化学共役、遺伝子融合、非共有結合またはその他により）機能的に連結されうる。
したがって、本発明は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する少なくとも１つの第１の結合特異性、ならびに第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本発明の特定の実施形態では、第２の標的エピトープはＦｃ受容体、例えばヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。したがって、本発明は、ＦｃγＲまたはＦｃαＲを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージまたは多形核球細胞（ＰＭＮ））、ならびにＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を発現する標的細胞の双方に結合可能な二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、エフェクター細胞に対するＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２発現細胞を標的にし、かつ、Ｆｃ受容体媒介性のエフェクター細胞活性、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出あるいはスーパーオキシドアニオンの生成を引き起こす。
二重特異性分子が多重特異性である場合の本発明の実施形態では、同分子は、抗−Ｆｃ結合特異性および抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２結合特異性に加え、第３の結合特異性をさらに含みうる。一実施形態では、第３の結合特異性は、抗促進因子（ａｎｔｉ−ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）（ＥＦ）部分、例えば細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗促進因子部分」は、所与の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによりＦｃ受容体または標的細胞抗原における結合決定因子の効果の促進をもたらす抗体、機能抗体断片またはリガンドでありうる。「抗促進因子部分」はＦｃ受容体または標的細胞抗原に結合しうる。あるいは、抗促進因子部分は、第１および第２の結合特異性の結合対象である実体とは異なる実体に結合しうる。例えば、抗促進因子部分は、（例えば標的細胞に対する免疫応答の増大をもたらすＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１または他の免疫細胞を介して）細胞毒性Ｔ細胞に結合しうる。
一実施形態では、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、または一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）らに交付されたラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、米国特許第４，９４６，７７８号明細書（その全体は参照により明示的に援用される）に記載のように、抗体は、Ｆｖまたは一本鎖コンストラクトなどの軽鎖または重鎖二量体またはその任意の最小断片でもありうる。
別の実施形態では、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体により提供され、その結合はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）により遮断されることはない。本明細書で用いられる「ＩｇＧ受容体」という用語は、染色体１上に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかを示す。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）にグループ化された全部で１２の膜貫通または可溶性受容体アイソフォームをコードする。好ましい一実施形態では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは７２ｋＤａの分子であり、単量体ＩｇＧに対して高い親和性を示す（１０８〜１０９Ｍ−１）。
特定の抗−Ｆｃγモノクローナル抗体の産生および特徴づけについては、ファンガー（Ｆａｎｇｅｒ）らにより、ファンガー（Ｆａｎｇｅｒ）らに交付されたＰＣＴ国際公開公報第８８／０００５２号パンフレットおよび米国特許第４，９５４，６１７号明細書において記載されており、それらの教示内容は参照により本明細書中に十分に援用される。これらの抗体は、受容体のＦｃγ結合部位から離れた部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合することから、それらの結合がＩｇＧの生理的レベルにより実質的に遮断されることはない。本発明で有用な特異的な抗−ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２およびｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を産生するハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ９４６９から入手可能である。他の実施形態では、抗−Ｆｃγ受容体抗体はモノクローナル抗体２２のヒト化形態である（Ｈ２２）。Ｈ２２抗体の産生および特徴づけについては、グラジアノ（Ｇｒａｚｉａｎｏ）ら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５５（１０）：４９９６−５００２頁（１９９５年）およびテンペスト（Ｔｅｍｐｅｓｔ）らに交付されたＰＣＴ国際公開公報第９４／１０３３２号パンフレットに記載されている。Ｈ２２抗体産生細胞系は、ＨＡ０２２ＣＬ１の指定の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されたものであり、アクセッション番号ＣＲＬ１１１７７を有する。
さらに他の実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性はヒトＩｇＡ受容体、例えばＦｃ−α受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体により提供され、その結合は典型的にはヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）により遮断されることはない。「ＩｇＡ受容体」という用語は、染色体１９上に位置する１つのα遺伝子の遺伝子産物（ＦｃαＲＩ）を含むように意図されている。この遺伝子は、５５〜１１０ｋＤａの数種の交互にスプライスされた膜貫通アイソフォームをコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球上に構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団上に発現されることはない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２の双方に対して中程度の親和性（約５×１０７Ｍ−１）を有し、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインへの暴露時に増加する（モートン（Ｍｏｒｔｏｎ）ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６：４２３−４４０頁（１９９６年））。Ａ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７として同定された４つのＦｃαＲＩに特異的なモノクローナル抗体は、ＩｇＡリガンド結合ドメイン外部のＦｃαＲＩに結合するものであり、記載がなされている（モンテイロ（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４頁（１９９２年））。
ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、（１）主に免疫エフェクター細胞、例えば単球、ＰＭＮ、マクロファージおよび樹状細胞の上で発現され、（２）高レベルで発現され（例えば１細胞当たり５，０００−１００，０００）、（３）細胞毒性活性のメディエーター（例えばＡＤＣＣ、食作用）であり、かつ（４）それらに対して標的とされる、自己抗原を含む抗原の抗原提示の促進を媒介することから、本発明の二重特異性分子において用いられる要因となる好ましい誘発受容体である。
本発明の二重特異性分子は、構成要素の結合特異性、例えば抗−ＦｃＲおよび抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２の結合特異性を、当該技術分野で公知の方法によって複合することにより調製されうる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は別々にもたらされ、次いで互いに複合されうる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々のカップリング剤または架橋剤が共有結合において用いられうる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈａｘａｎｅ）−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、カルボウスキー（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６頁（１９８４年）；リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：８６４８頁（１９８５年））。他の方法として、パウルス（Ｐａｕｌｕｓ）、Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８：１１８−１３２頁（１９８５年）；ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１−８３頁（１９８５年）およびグレニー（Ｇｌｅｎｎｉｅ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５頁（１９８７年）に記載の方法が含まれる。好ましい複合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもピアス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して複合されうる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、複合に先立ち、奇数、典型的には１つのスルフヒドリル残基を有するように修飾される。
あるいは、両方の結合特異性は同じベクター内にコードされ、かつ同じ宿主細胞内で発現され、構築されうる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定因子を含む一本鎖分子、または２つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子でありうる。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載されている（これらの各々はその全体が参照により本明細書中に援用される）。
二重特異性分子のその特異的な標的に対する結合は、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイによって確認されうる。これらの各アッセイでは、一般に、特別な目的のタンパク質−抗体複合体の存在が目的の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば抗体）の使用により検出される。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識しかつそれに対して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて検出されうる。あるいは、複合体は種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて検出されうる。例えば、抗体は放射活性物質で標識され、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられうる（例えば、ワイントラウブ Ｂ．（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ Ｂ．）、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、米国内分泌学会（Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９８６年３月（参照により本明細書中に援用される）を参照）。放射性同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用などの手段あるいはオートラジオグラフィーにより検出されうる。
抗体断片および抗体模倣体
本発明は、従来の抗体に限定されることなく、抗体断片および抗体模倣体の使用を通じて実施可能である。下記に詳述のように、多種多様な抗体断片および抗体模倣技術が現在では開発されており、当該技術分野で広く知られている。多数のこれら技術、例えばドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｙ、およびＵｎｉＢｏｄｙでは従来の抗体構造の断片またはそれに対する他の修飾が用いられる一方、他の技術、例えば従来の抗体結合を模倣する一方、異なる機序から産生され、それを介して機能する結合構造を用いるＡｆｆｉｂｏｄｙ、ＤＡＲＰｉｎ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ａｖｉｍｅｒ、およびＶｅｒｓａｂｏｄｙも存在する。
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は抗体の最小の機能結合単位であり、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応するものである。ドメイン抗体は約１３ｋＤａの分子量を有する。ドマンティス・リミテッド（Ｄｏｍａｎｔｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、完全ヒトＶＨおよびＶＬ ｄＡｂにおける一連の大規模でかつ高度に機能的なライブラリ（各ライブラリ内に１００億超の異なる配列）を開発しており、これらのライブラリを用いて治療標的に特異的なｄＡｂを選択する。多数の従来の抗体に対し、ドメイン抗体は細菌、酵母、および哺乳類細胞系内で十分に発現される。ドメイン抗体およびその産生方法のさらなる詳細については、米国特許第６，２９１，１５８号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書；米国特許第６，５９３，０８１号明細書；米国特許第６，１７２，１９７号明細書；米国特許第６，６９６，２４５号；米国特許出願公開第２００４／０１１０９４１号明細書；欧州特許出願第１４３３８４６号明細書および欧州特許第０３６８６８４号明細書および欧州特許第０６１６６４０号明細書；国際公開第０５／０３５５７２号パンフレット、国際公開第０４／１０１７９０号パンフレット、国際公開第０４／０８１０２６号パンフレット、国際公開第０４／０５８８２１号パンフレット、国際公開第０４／００３０１９号パンフレットおよび国際公開第０３／００２６０９号パンフレットの参照により得られうる（これら各々はその全体が参照により本明細書中に援用される）。
Ｎａｎｏｂｏｄｙは、天然の重鎖抗体の固有の構造および機能特性を有する抗体由来の治療タンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。重要なことには、クローン化され、単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を内在する完全に安定的なポリペプチドである。Ｎａｎｏｂｏｄｙは、ヒト抗体のＶＨドメインとの高い相同性を有し、かつ活性の任意の低下を伴うことなくさらにヒト化されうる。重要なことには、Ｎａｎｏｂｏｄｙは免疫原性の低い可能性があり、霊長動物試験でＮａｎｏｂｏｄｙのリード化合物を用いて確認されている。
Ｎａｎｏｂｏｄｙでは、従来の抗体の利点と小分子薬物の重要な特徴とが組み合わされる。Ｎａｎｏｂｏｄｙは、従来の抗体と同様、その標的および低い固有の毒性に対し、高い標的特異性、高親和性を示す。しかし、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、小分子薬物と同様、酵素を阻害し、受容体のクレフトに容易に接近可能である。さらに、Ｎａｎｏｂｏｄｙは極めて安定的であり、注射以外の手段で投与可能であり（例えば国際公開第０４／０４１８６７号パンフレットを参照（その全体が参照により本明細書中に援用される）、製造が容易である。Ｎａｎｏｂｏｄｙの他の利点には、小さいサイズに起因するまれであるかまたは隠されたエピトープの認識、タンパク質標的の空洞または活性部位へのその固有の三次元構造に起因する高い親和性および選択性による結合性、薬物形式の柔軟性、半減期の調整ならびに薬物発見の容易性および速度が挙げられる。
Ｎａｎｏｂｏｄｙは、単一の遺伝子によりコードされ、ほぼすべての原核生物および真核生物宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば米国特許第６，７６５，０８７号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））、かび（例えばコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））ならびに酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ））（例えば米国特許第６，８３８，２５４号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））において効率的に産生される。産生プロセスは拡張可能であり、数キログラム量のＮａｎｏｂｏｄｙが産生されている。Ｎａｎｏｂｏｄｙは、従来の抗体と比べて優れた安定性を示すことから、貯蔵寿命が長く即使用可能な溶液として調合可能である。
ナノクローン（Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ）法（例えば国際公開第０６／０７９３７２号パンフレットを参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））は、Ｂ細胞の自動化されたハイスループットな選択に基づき所望の標的に対するＮａｎｏｂｏｄｙを産生するための独自の方法であり、場合により本発明との関連で用いられうる。
ＵｎｉＢｏｄｙは別の抗体断片技術であるが、この技術はＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づくものである。ヒンジ領域の欠失により、従来のＩｇＧ４抗体に対して本質的に半分のサイズでありかつＩｇＧ４抗体の二価結合領域ではなく一価結合領域を有する分子が生成される。ＩｇＧ４抗体が不活性であることから免疫系と相互作用することがないことも周知であり、これは免疫応答が望ましくない場合の疾患の治療において有利な場合があり、この利点はＵｎｉＢｏｄｙ上に受け継がれる。例えば、ＵｎｉＢｏｄｙは、その結合対象の細胞を殺滅することなく阻害または静めるように機能しうる。さらに、癌細胞に結合するＵｎｉＢｏｄｙは、それらを刺激して増殖させることはない。さらに、ＵｎｉＢｏｄｙが従来のＩｇＧ４抗体の約半分のサイズであることから、それは大きい固形腫瘍全体により適切な分布を示すとともに有利な有効性を発揮する可能性がある。ＵｎｉＢｏｄｙは、全ＩｇＧ４抗体と同様の速度で身体から除去され、その抗原に対して全抗体と同様の親和性で結合可能である。ＵｎｉＢｏｄｙのさらなる詳細は、ＰＣＴ国際公開公報第２００７／０５９７８２号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の参照により得られうる。
Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子は、スタフィロコッカル（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つに由来する、５８−アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質の新しいクラスを表す。この３つのヘリックスバンドル（ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ）ドメインはコンビナトリアルファージミドライブラリの作成物における足場として用いられており、それから所望の分子を標的にするＡｆｆｉｂｏｄｙ変異体がファージディスプレイ技術を用いて選択されうる（ノード Ｋ．（Ｎｏｒｄ Ｋ．）、ガンネリュッソン Ｅ．（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ Ｅ．）、リングダール Ｊ．（Ｒｉｎｇｄａｈｌ Ｊ．）、スタール Ｓ．（Ｓｔａｈｌ Ｓ．）、ウーレン Ｍ．（Ｕｈｌｅｎ Ｍ．）、ナイグレン Ｐ．Ａ．（Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ．）、「Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ａｎ α−ｈｅｌｉｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９７年；１５：７７２−７頁、ロンマーク Ｊ．（Ｒｏｎｍａｒｋ Ｊ．）、グロンルンド Ｈ．（Ｇｒｏｎｌｕｎｄ Ｈ．）、ウーレン Ｍ．（Ｕｈｌｅｎ Ｍ．）、ナイグレン Ｐ．Ａ．（Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ．）、「Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ（ＩｇＡ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ」、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００２年；２６９：２６４７−５５頁）。Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子におけるその低い分子量（６ｋＤａ）とともに単純で強固な構造により、それが例えば検出試薬のような多種多様な用途に適するようになり（ロンマーク Ｊ．（Ｒｏｎｍａｒｋ Ｊ．）、ハンソン Ｍ．（Ｈａｎｓｓｏｎ Ｍ．）、ナイグレン Ｔ．（Ｎｙｇｒｅｎ Ｔ．）ら、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｆｆｉｂｏｄｙ−Ｆｃ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００２年；２６１：１９９−２１１頁）、かつ受容体相互作用が阻害される（サンドストーム Ｋ．（Ｓａｎｄｓｔｏｒｍ Ｋ．）、スー Ｚ．（Ｘｕ Ｚ．）、フォルスバーグ Ｇ．（Ｆｏｒｓｂｅｒｇ Ｇ．）、ナイグレン Ｐ．Ａ．（Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ．）、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ２８−ＣＤ８０ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｂｙ ａ ＣＤ２８−ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ２００３年；１６：６９１−７頁）。Ａｆｆｉｂｏｄｙおよびそれを産生する方法のさらなる詳細が、米国特許第５８３１０１２号明細書により得られうる（その全体が参照により本明細書中に援用される）。
標識されたＡｆｆｉｂｏｄｙは、多数のアイソフォームを判定するためのイメージング用途においても有用でありうる。
ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、非抗体ポリペプチドの結合能を用いるように開発された抗体模倣ＤＲＰ（設計されたリピートタンパク質）技術の一例である。アンキリンまたはロイシンリッチリピートタンパク質などのリピートタンパク質は、偏在する結合分子であり、抗体と異なり細胞内および細胞外に生じる。それら固有のモジュール構造は、構造単位の反復（リピート）を特徴とし、共に蓄積され、可変でかつモジュール式の標的に結合する表面を示す伸長されたリピートドメインが形成される。このモジュール性に基づき、非常に多様化された結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリが生成されうる。この方法は、可変の表面残基およびそれらのリピートドメインへのランダムアセンブリを示す自家和合性リピートに共通の設計を含む。
ＤＡＲＰｉｎは、細菌発現系内で極めて高収量に産生可能であり、公知の最も安定なタンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルスおよび膜タンパク質を含む広範囲の標的タンパク質に対して極めて特異的な高親和性のＤＡＲＰｉｎが選択されている。１桁のナノモル〜ピコモルの範囲内の親和性を有するＤＡＲＰｉｎを得ることが可能である。
ＤＡＲＰｉｎは、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、チップ用途、親和性精製またはウエスタンブロッティングを含む広範囲の用途で用いられている。ＤＡＲＰｉｎは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合された細胞内マーカータンパク質として細胞内区画内で活性が高いことも判明した。ＤＡＲＰｉｎは、ｐＭ範囲内のＩＣ５０でウイルスの侵入を阻害するためにさらに用いられた。ＤＡＲＰｉｎは、タンパク質−タンパク質相互作用の遮断に望ましいだけでなく酵素の阻害にも望ましい。プロテアーゼ、キナーゼおよびトランスポーターの阻害に奏功しており、ほとんどの場合、アロステリック阻害様式である。腫瘍に対する極めて迅速で特異的な濃縮および極めて好ましい腫瘍対血液比により、インビボでの診断的または治療的アプローチに十分に適合するＤＡＲＰｉｎが作製される。
ＤＡＲＰｉｎおよび他のＤＲＰ技術に関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００４／０１３２０２８号明細書および国際特許出願公開、国際公開第０２／２０５６５号パンフレットに見出されうる（それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
Ａｎｔｉｃａｌｉｎはさらなる抗体模倣技術であるが、この場合、結合特異性は、ヒト組織内および体液中で自然にかつ豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンから誘導される。リポカリンは、進化することで、化学的感受性があるかまたは不可溶性の化合物の生理的輸送および保存に関連したインビボでの機能の範囲を果たしている。リポカリンは、タンパク質の一末端で４つのループを支持する高度に保存されたβ−バレルを含む強固な固有の構造を有する。これらのループは結合ポケットに対する入口（ｅｎｔｒａｎｃｅ）を形成し、分子のこの部分における高次構造上の差は各リポカリン間の結合特異性におけるばらつきを示している。
保存されたβシートフレームワークにより支持される超可変ループの全体構造から免疫グロブリンが連想されるが、リポカリンはサイズの観点で抗体とはかなり異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい１６０−１８０個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなる。
リポカリンはクローン化され、Ａｎｔｉｃａｌｉｎの作製のため、そのループには改変がなされる。構造的に多様なＡｎｔｉｃａｌｉｎのライブラリが生成されており、Ａｎｔｉｃａｌｉｎの提示は、結合機能の選択およびスクリーニング、それに続く、原核系または真核系におけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現および産生を可能にする。試験によると、仮想的に任意のヒト標的タンパク質に特異的なＡｎｔｉｃａｌｉｎの開発が可能で、その単離が可能であり、ナノモルのまたはより高い範囲での結合親和性が得られうることを示すことに奏功している。
Ａｎｔｉｃａｌｉｎは、二重標的化された（ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）タンパク質、いわゆるＤｕｏｃａｌｉｎとしても形式化されうる。Ｄｕｏｃａｌｉｎは、標準の作製プロセスを用いて１つの容易に生成される単量体タンパク質内の２つの別々の治療標的に結合する一方、その２つの結合ドメインの構造的方向性にかかわらず標的の特異性および親和性を保持する。
単一の分子を通じての複数の標的の調節は、２つ以上の病原因子を含むことで知られる疾患において特に有利である。さらに、Ｄｕｏｃａｌｉｎなどの二価または多価の結合形式は、疾患における細胞表面分子の標的化において有意な可能性を有し、シグナル伝達経路に対してアゴニスト作用を媒介するか、または細胞表面受容体の結合およびクラスタリングを介して内在化効果の増大を誘発する。さらに、Ｄｕｏｃａｌｉｎの固有の高い安定性は単量体Ａｎｔｉｃａｌｉｎに匹敵し、Ｄｕｏｃａｌｉｎに対して柔軟な製剤および送達の可能性をもたらす。
Ａｎｔｉｃａｌｉｎに関するさらなる情報が、米国特許第７，２５０，２９７号明細書および国際特許出願公開番号、国際公開第９９／１６８７３号パンフレットに見出されうる（それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
本発明との関連で有用な別の抗体模倣技術がＡｖｉｍｅｒである。Ａｖｉｍｅｒは、インビトロでのエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイによりヒト細胞外受容体ドメインの大きいファミリーから進化したものであり、結合および阻害特性を備えた多重ドメインタンパク質を生成する。複数の独立した結合ドメインの連結により結合活性がもたらされることが示されており、結果として従来の単一のエピトープ結合タンパク質に対して親和性および特異性が改善される。他の有望な利点として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内での多重標的に特異的な分子の単純かつ効率的な産生、プロテアーゼに対する改善された熱安定性および耐性が挙げられる。ナノメートル以下の親和性を有するＡｖｉｍｅｒが種々の標的に対して得られている。
Ａｖｉｍｅｒに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００６／０２８６６０３号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２３４２９９号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２２３１１４号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１７７８３１号明細書、米国特許出願公開第２００６／０００８８４４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２２１３８４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１６４３０１号明細書、米国特許出願公開第２００５／００８９９３２号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５３９７３号明細書、米国特許出願公開第２００５／００４８５１２号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１７５７５６号明細書に見出されうる（それらすべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
Ｖｅｒｓａｂｏｄｙは、本発明との関連で利用可能な別の抗体模倣技術である。Ｖｅｒｓａｂｏｄｙは、１５％を超えるシステインを有する３〜５ｋＤａの小さいタンパク質であり、高いジスルフィド密度の足場を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアの代わりとなる。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸の少数のジスルフィドとの置換により、より小さくより親水性が高く（低下した凝集および非特異的結合）、プロテアーゼおよび熱に対してより耐性があり、かつＭＨＣ提示の大部分に寄与する残基が疎水性であることからより低いＴ細胞エピトープの密度を有するタンパク質が生成される。これらの特性の４つすべてが免疫原性に作用することで周知であり、それらは共に免疫原性の大幅な低下の原因になると予想される。
Ｖｅｒｓａｂｏｄｙについての着想は、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ、およびアネモネにより生成される天然の注射可能な生物医薬品から得られるものであり、予想外に低い免疫原性を示すことが知られている。選択された天然タンパク質ファミリーから、サイズの設計およびスクリーニングにより、疎水性、タンパク質分解の抗原プロセシング、およびエピトープ密度が注射可能な天然タンパク質における平均を大幅に下回るレベルまで最小化される。
Ｖｅｒｓａｂｏｄｙの構造を仮定すると、これらの抗体模倣体は多価、多重特異性、半減期機構の多様性、組織標的化モジュールおよび抗体Ｆｃ領域の非存在を含む多目的形式を提供する。さらに、Ｖｅｒｓａｂｏｄｙは、高収量で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で作製され、かつ、Ｖｅｒｓａｂｏｄｙはその親水性および小サイズ故に可溶性が高く、高濃度に調合されうる。Ｖｅｒｓａｂｏｄｙは、特に熱安定的であり（それは沸騰可能であり）、長い貯蔵寿命をもたらす。
Ｖｅｒｓａｂｏｄｙに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００７／０１９１２７２号明細書に見出されうる（その全体が参照により本明細書中に援用される）。
上記で提供された抗体断片および抗体模倣技術の詳細な説明は、本明細書との関連で用いられうるあらゆる技術の包括的リストであるように意図されていない。例えば、また限定を目的としない場合、他のポリペプチドに基づく技術、例えばクイ（Ｑｕｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（８）９２１−９２９頁（２００７年）（その全体が参照により本明細書中に援用される）で概説された相補性決定領域の融合、ならびに核酸に基づく技術、例えば米国特許第５，７８９，１５７号明細書、米国特許第５，８６４，０２６号明細書、米国特許第５，７１２，３７５号明細書、米国特許第５，７６３，５６６号明細書、米国特許第６，０１３，４４３号明細書、米国特許第６，３７６，４７４号明細書、米国特許第６，６１３，５２６号明細書、米国特許第６，１１４，１２０号明細書、米国特許第６，２６１，７７４号明細書、および米国特許第６，３８７，６２０号明細書（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）に記載のＲＮＡアプタマー技術を含む種々のさらなる技術が本発明との関連で利用可能である。
薬学的組成物
別の態様では、本発明は、組成物、例えば薬学的に許容される担体とともに調合された本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分のうちの１つまたは組み合わせを含有する薬学的組成物を提供する。かかる組成物は、本発明の（例えば２種もしくは３種以上の異なる）抗体または免疫複合体または二重特異性分子のうちの１つまたはそれらの組み合わせを含有しうる。例えば、本発明の薬学的組成物は、標的抗原上で異なるエピトープに結合するかまたは相補的活性を有する抗体（または免疫複合体または二重特異性抗体）の組み合わせを含有しうる。
本発明の薬学的組成物は、併用療法、すなわち他の作用物質と併用しても投与可能である。例えば、併用療法は、本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体と、少なくとも１つの他の抗炎症物質または免疫抑制剤、骨疾患または癌に対して有効性を有する１つ以上の他の抗体、および／または１つ以上の化学療法様式との併用を含みうる。多種多様な併用療法的アプローチが、本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体の用量の低減により治療副作用の低下が得られうるという利点とともに考えられることが理解されるであろう。
他の実施形態内で、本明細書中に開示される治療抗体は、免疫抑制経路を抑制する１つ以上の抗体、例えば（本明細書中でＭＤＸ−０１０と称される抗体として例示される）抗−ＣＴＬＡ−４抗体と併用されうる。ＣＴＬＡ−４タンパク質は、ウイルスまたは細菌などの外来物質を認識する場合、免疫応答を開始して感染症と闘う特定のリンパ球上に見出される。ＣＴＬＡ−４タンパク質は、ウイルスまたは細菌と闘う免疫細胞の数を減少させることにより免疫応答の停止を助ける。しかし、免疫応答が骨および／または腫瘍細胞に対して開始される場合、免疫応答を停止するだけでなく利用可能な多数のリンパ球を保持することが有用でありうる。したがって、抗−ＣＴＬＡ−４抗体、例えばＭＤＸ−０１０を本発明の１つ以上の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体と併用することで、有利にもＣＴＬＡ−４が遮断され、免疫活性が維持されうる。
本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合可能な、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。典型的には、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適する。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、化合物を酸の活性および化合物を不活性化しうる他の天然条件から保護するための材料でコートされうる。
本発明の薬学的化合物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含む。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩を示し、任意の望ましくない毒物学的効果を与えることがない（例えば、ベルゲ（Ｂｅｒｇｅ）ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９頁（１９７７年）を参照）。かかる塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸や、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸から誘導される塩が挙げられる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどや、非毒性有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導される塩が挙げられる。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される酸化防止剤も含有しうる。薬学的に許容される酸化防止剤の例として、（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
本発明の薬学的組成物中に用いられうる適切な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な液性が、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。
これらの組成物は、防腐剤、浸潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有しうる。微生物の出現の防止は、上記の滅菌法と、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含との双方により保証されうる。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な薬学的形態の吸収遅延がモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる作用物質の包含によりもたらされうる。
薬学的に許容される担体は、注射可能な無菌溶液または分散系の即時調製のための、無菌水溶液または分散系および無菌粉末を含む。薬学的活性物質におけるかかる媒体および作用物質の使用については当該技術分野で公知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と混合できない場合を除き、本発明の薬学的組成物におけるそれらの使用が検討される。補助活性化合物も組成物中に組み込み可能である。
治療組成物は、典型的には製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適する溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の規則的構造として調合されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散系でありうる。適切な液性が、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含めることが好ましいと考えられる。注射可能な組成物の遅延された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアレート塩（ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ ｓａｌｔｓ）およびゼラチンを含めることによりもたらされうる。
注射可能な無菌溶液は、必要に応じ、上掲の原料の１つもしくは組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後に滅菌および精密ろ過を施すことにより調製されうる。一般に、分散系は、塩基性分散系および上掲の原料由来の必要な他の原料を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加え任意の所望の追加原料をその予め無菌濾過された溶液から生成する、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
担体材料と組み合わせることで単一の剤形を生成可能な活性成分の量は、治療される対象および特定の投与方法に依存して変化すると考えられる。単一の剤形を生成するための担体材料と併用可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量となる。一般に、この量は、薬学的に許容される担体との併用で、１００％のうち、活性成分の約０．０１％〜約９９％、典型的には活性成分の約０．１％〜約７０％、最も典型的には活性成分の約１％〜約３０％の範囲となる。
投与計画を調節することで最適な所望の応答（例えば治療応答）がもたらされる。例えば、単回ボーラスが投与されうるか、数回の分割用量が長期にわたり投与されうるかまたは同用量が治療状況の要件で示されるように比例的に漸減または増加されうる。投与の容易さおよび用量の均一性を意図し、非経口組成物を投与単位形態で調製することが特に有利である。本明細書で用いられる投与単位形態は、試験されるべき対象に対する単一の用量として適合する物理的に別々の単位であり、各単位は必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性化合物を有する。本発明の投与単位形態における仕様は、（ａ）活性化合物固有の特性および達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）個体における感受性を治療するためにかかる活性化合物を配合する当該技術分野に内在する制限により決定づけられ、かつそれらに直接依存している。
抗体の投与においては、用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより一般的には０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。必要に応じ、より高用量、例えば１５ｍｇ／ｋｇ体重、２０ｍｇ／ｋｇ体重もしくは２５ｍｇ／ｋｇ体重を用いてもよい。典型的な治療計画では、毎週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１か月に１回、３か月ごとに１回または３〜６か月ごとに１回の投与が必要とされる。本発明の抗体に対する特定の投与計画は、抗体の静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、ここで抗体は（ｉ）６回投与を４週ごと、次いで３か月ごと；（ｉｉ）３週ごと；（ｉｉｉ）１回の３ｍｇ／ｋｇ体重、次いで３週ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重といった投与計画のうちの１つを用いて投与される。
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する、２つもしくはそれより多数の本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体が同時投与され、いずれの場合でも投与される各抗体の用量は指定範囲内に含まれる。多くの場合、抗体が通常投与される。単回投与間の間隔は、例えば、週単位、月単位、３か月単位または年単位であってもよい。患者における抗体の標的抗原に対する血中濃度の測定により示されるように、間隔は不規則であってもよい。用量は、ある方法では約１〜１０００μｇ／ｍｌ、またある方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を得るように調節される。
他の方法では、１つ以上の本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体は、例えば抗−ＣＴＬＡ−４および／または抗−ＰＤ−１などの異なる結合特異性を有する抗体と同時投与され、いずれの場合でも投与される各抗体の用量は指定範囲内に含まれる。
あるいは、抗体は徐放製剤として投与可能であり、いずれの場合でも低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。投与の用量および頻度は、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに依存して変化しうる。予防的適用においては、比較的低用量が長期にわたり比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者が、余生にわたって治療を受け続けている。治療的適用においては、疾患の進行が低下または終結されるまで、典型的には患者が疾患の徴候の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされる場合がある。その後、患者は予防計画通りに投与されうる。
本発明の薬学的組成物中での活性成分の実際の用量レベルを、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を得るのに有効な活性成分の量を得るように変化させてもよい。選択される用量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、用いられる特定の組成物と併用される治療薬、他の薬物、化合物および／または材料の持続時間、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および過去の病歴、ならびに医術において周知の要素のようなものを含む種々の薬物動態学的因子に依存すると考えられる。
本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体の「治療有効用量」は、典型的には疾患徴候の重症度の低下、疾患徴候のない期間の頻度および持続時間の増大あるいは疾患の苦しみに起因する機能障害または身体障害の予防をもたらす。例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２細胞または腫瘍を伴う骨疾患または癌の治療においては、「治療有効用量」は、典型的には細胞成長または腫瘍成長を、未治療の対象に対し、少なくとも約２０％、より典型的には少なくとも約４０％、さらにより典型的には少なくとも約６０％およびさらにより典型的には少なくとも約８０％阻害する。化合物の腫瘍成長に対する阻害能は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価可能である。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の細胞成長に対する阻害能の試験により評価可能であり、かかる阻害は当業者に公知のアッセイによりインビトロで測定可能である。治療有効量の治療化合物により、腫瘍サイズが低減しうるかまたはさもなくば対象における徴候が改善しうる。当業者であれば、対象の大きさ、対象の徴候の重症度および選択された投与における特定の組成物または経路などの要素に基づき、かかる量を決定できるであろう。
本発明の組成物は、種々の当該技術分野で公知の方法のうちの１つ以上を用い、１つ以上の投与経路を介して投与されうる。当業者に理解されるように、投与の経路および／または方法は所望の結果に応じて変化すると考えられる。本発明の抗体における好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射もしくは注入によるものを含む。本明細書で用いられる「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の投与方法、通常は注射によるものを意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射および注入を含む。
あるいは、本発明の抗体は、非経口でない（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路、例えば局所経路、表皮または粘膜の投与経路を介し、例えば、経鼻的、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的または局所的に投与されうる。
活性化合物は、迅速な放出に対する化合物、例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤を保護することになる担体とともに調製されうる。生体分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられうる。かかる製剤を調製するための多数の方法が特許化されているかまたは一般に当業者に公知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」（Ｊ．Ｒ．ロビンソン（Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）編、マーセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９７８年）を参照のこと。
治療組成物は、当該技術分野で公知の医療器具を用いて投与可能である。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、ニードルレス皮下注射器具、例えば米国特許第５，３９９，１６３号明細書；米国特許第５，３８３，８５１号明細書；米国特許第５，３１２，３３５号明細書；米国特許第５，０６４，４１３号明細書；米国特許第４，９４１，８８０号明細書；米国特許第４，７９０，８２４号明細書；または米国特許第４，５９６，５５６号明細書に開示された器具を用いて投与可能である。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例として、薬物を制御された速度で投与するための埋め込み式マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号明細書、皮膚を通して薬剤（ｍｅｄｉｃａｎｔｓ）を投与するための治療器具を開示する米国特許第４，４８６，１９４号明細書、薬物を正確な注入速度で送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号明細書、連続的な薬物送達のための流量可変型の埋め込み式注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号明細書、マルチチャンバ式の区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号明細書、ならびに浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号明細書が挙げられる。これらの特許は参照により本明細書中に援用される。多数の他のかかるインプラント、送達システムおよびモジュールは当業者に公知である。
特定の実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体を調合し、インビボで適切な分布を保証することが可能である。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多数の親水性の高い化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを通過することを保証するため（必要に応じて）、それらを例えばリポソームの形で調合してもよい。リポソームを製造するための方法としては、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；米国特許第５，３７４，５４８号明細書；および米国特許第５，３９９，３３１号明細書を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つ以上の部分を含むことから、標的化された薬物送達を促進しうる（例えば、ラナーデ（Ｒａｎａｄｅ）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５頁（１９８９年）を参照）。典型的な標的化部分として、葉酸塩またはビオチン（例えば、ロウ（Ｌｏｗ）らに交付された米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照）；マンノシド（ウメザワ（Ｕｍｅｚａｗａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８頁（１９８８年））；抗体（ブロエマン（Ｂｌｏｅｍａｎ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０頁（１９９５年）；オワイス（Ｏｗａｉｓ）ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０頁（１９９５年））；界面活性剤のプロテインＡ受容体（ブリスコエ（Ｂｒｉｓｃｏｅ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４頁（１９９５年））；シュライアー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０頁（１９９４年））；ケイナネン（Ｋｅｉｎａｎｅｎ）およびラウッカネン（Ｌａｕｋｋａｎｅｎ）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３頁（１９９４年）も参照；キリオン（Ｋｉｌｌｉｏｎ）およびフィドラー（Ｆｉｄｌｅｒ）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３頁（１９９４年）が挙げられる。
本発明の使用および方法
本発明の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物および方法は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２媒介性の障害の診断および治療を含む、多数のインビトロおよびインビボでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を、インビトロまたは生体外で培地内の細胞にまたは例えばインビボでヒト対象に投与し、種々の障害を治療し、予防し、かつ診断してもよい。本明細書で用いられる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むように意図されている。「非ヒト動物」という用語は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。好ましい対象は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２活性に媒介される障害を有するヒト患者を含む。方法は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２の発現または機能に媒介される障害を有するヒト患者の治療に特に適する。ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する抗体が別の作用物質とともに投与される場合、その２つは順次投与または同時投与のいずれであってもよい。
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する本発明の抗体の特異的結合を仮定すると、本発明の抗体を用い、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２の細胞および組織による発現が特異的に検出可能であり、さらに同抗体を用い、免疫親和性精製によりＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２が精製可能である。
上記のように、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２は、炎症および異常な骨形成および骨化を含む種々の疾患に関連する。これらの疾患は、共に脊髄炎症、有意な疼痛、および機能障害によって特徴づけられる脊椎関節炎（ＳｐＡ）疾患を含む。ＳｐＡ疾患は、例えば、強直性脊椎炎、乾癬性脊椎関節炎、反応性脊椎関節炎、炎症性腸疾患を伴う脊椎関節炎、および未分化型脊椎関節炎を含む。特に、本発明の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体は、典型的には通常は仙腸骨炎および付着部炎が原因の炎症性の背痛で特徴づけられる強直性脊椎炎（ＡＳ）、他の脊椎関節症、および関連の炎症性リウマチ性疾患の治療において有効である可能性がある。したがって、本発明は、上記の疾患を治療する方法であって、本明細書中に開示されるモノクローナル抗体を対象に投与する工程を含む方法を包含する。
多数のＡＳ患者に対する治療の現行基準はＴＮＦα遮断を含む。ＴＮＦα遮断を用いる治療によると、おそらくは疾患病理に寄与する慢性炎症を低減することによる疾患の徴候の低減に有効であることが示されている。しかし、ＴＮＦαブロッカーの長期使用後に負の結果が生じうる。これらは、例えば、結核、アレルギー反応、および貧血などの血液障害の発生率の増加を含む。さらに、ＴＮＦα遮断は鬱血性心不全を有する場合には禁忌である。
ＴＮＦα遮断治療に伴う困難を克服するために、本発明の抗体をＡＳの治療のためにＴＮＦα遮断と併用してもよい。１つ以上の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体とＴＮＦα遮断の併用は、疾患の進行に対して治療または予防をもたらす２つの治療法の間の相乗効果が得られうる点で有利である。実際、ＴＮＦα遮断の量または頻度は、本発明の抗体と併用する場合に低減可能である。この併用療法により、長期のＴＮＦα遮断における負の影響の一部が軽減される。一旦軟骨内の原基（ａｎｌａｇｅｎ）が誘発されると、炎症の抑止が異所性骨形成の阻害において無効であることが報告されている（カプラン（Ｋａｐｌａｎ）ら、Ｊ．ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２００７年 ８９：３４７−３５７頁）。したがって、１つ以上の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体を例えばＴＮＦα遮断などの苦痛緩和と併用することで、それがＡＳ疾患の進行の治療または予防およびその徴候の改善において有効であることが実証される可能性がある。
抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体を追加的に用い、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）（カン（Ｋａｎ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６５（４）：１１０７−１５頁（２００４年））、進行性骨異形成症（ＰＯＨ）、脊髄損傷、筋肉内血腫、整形手術をもたらす鈍的外傷、乾癬性関節炎、変形性関節症、強直性脊椎炎、血清反応陰性関節症、骨格骨化過剰症（ｈｙｐｅｒｐｓｔｏｓｉｓ）、耳硬化症、あぶみ骨強直症、骨肉腫、前立腺癌および外骨腫、アテローム硬化症、弁膜性心疾患、ならびに術後再癒合症（ｒｅｓｙｎｏｓｔｏｓｉｓ）を含む異常な骨形成または骨化を伴う他の疾患および病状が治療される。
時として異所性骨形成を伴う病状は、正常な骨における骨低下または骨溶解も含む。したがって、本発明は、限定はされないが、ビスホスホネート、ＰＴＨ阻害剤、ＲＡＮＫＬの直接および間接阻害剤、ならびに他の骨吸収因子、例えばＭＣＳＦの阻害剤を含む骨再吸収の阻害剤と併用される１つ以上の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体による、異所性骨形成を有する患者の治療を含む（国際公開第２００５／０６８５０３号パンフレットを参照、その内容は参照により本明細書中に明示的に援用される）。
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２は、骨肉腫、前立腺癌、肺癌、メラノーマおよび他の造血癌、ならびに乳癌を含む種々のヒト癌内でも発現される。１つ以上の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体を単独で用いて、癌性腫瘍の成長または転移を阻害してもよい。あるいは、１つ以上の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体は、本明細書中に記載の他の免疫原性物質、標準の癌治療薬または他の抗体と併用可能である。
成長または転移が本発明の抗体を用いて阻害されうる好ましい癌は、典型的には免疫療法に応答性がある癌を含む。治療にとって好ましい癌の非限定例として、乳癌（例えば乳腺細胞癌）、卵巣癌（例えば卵巣細胞癌）、脳腫瘍、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫）ならびに鼻咽頭癌が挙げられる。本発明の方法を用いて治療可能な他の癌の例として、メラノーマ（例えば転移性の悪性メラノーマ）、前立腺癌、大腸癌、肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚または眼内の悪性メラノーマ、子宮癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、腎癌、睾丸癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、乳腺癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、乳房・骨盤（ｂｒｅａｓｔ ｐｅｌｖｉｓ）の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、例えば中皮腫などのアスベストにより誘発される癌を含む環境誘発性の癌、ならびに前記癌の組み合わせが挙げられる。
さらに、様々な腫瘍細胞上でのＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２の発現を仮定すると、本発明のヒト抗体、抗体組成物および方法を用い、発癌性疾患、例えば、乳癌（例えば、乳腺細胞癌）、卵巣癌（例えば卵巣細胞癌）、グリア芽腫、脳腫瘍、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み核細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、Ｂ細胞系のびまん性大細胞型リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連の体腔に基づくリンパ腫（ＨＩＶ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｄｙ ｃａｖｉｔｙ ｂａｓｅｄ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、胎生期癌、鼻咽頭の未分化癌（例えばシュミンケ（Ｓｃｈｍｉｎｃｋｅ’ｓ）腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリネミア（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）および他のＢ細胞リンパ腫を含む、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を発現する腫瘍細胞の存在により特徴づけられる疾患を有する対象が治療されうる。
したがって、一実施形態では、本発明は、対象における腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、対象に治療有効量の抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体またはその抗原結合部分を投与する工程を含む方法を提供する。典型的には、抗体はヒト抗体である。さらにまたはその他として、抗体は、キメラまたはヒト化抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体でありうる。
一実施形態では、本発明の抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および組成物）を用いて、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２のレベル、あるいはＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を膜表面上に有する細胞のレベルが検出可能であり、ここでのレベルは特定の疾患徴候に関連しうる。あるいは、抗体を用いて、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２の、特定の疾患徴候の予防または改善に同じく関連し得り、それによりＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２は、疾患のメディエーターとして関与している機能が阻害または遮断可能である。これは、実験試料および対照試料と抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体とを、抗体とＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより行われうる。抗体とＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２との間に形成される任意の複合体が検出され、実験試料および対照試料において比較される。
別の実施形態では、本発明の抗体（例えばヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性および二重特異性分子および組成物）は、インビトロで治療または診断用途に関連した結合活性について最初に試験されうる。例えば、本発明の組成物は、下記実施例に記載のフローサイトメトリーアッセイを用いて試験されうる。
本発明の抗体（例えばヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性および二重特異性分子、免疫複合体および組成物）は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２関連疾患の治療および診断においてさらなる有用性を有する。例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性または二重特異性分子および免疫複合体を用いて、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を発現する細胞の成長を阻害しかつ／または同細胞を殺滅するか、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を発現する細胞の食作用またはＡＤＣＣをヒトエフェクター細胞の存在下で媒介するか、あるいはＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４のＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する結合を遮断するという生物学的活性のうちの１つ以上をインビボまたはインビトロで誘発することができる。
本発明の抗体組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、ヒト化抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は当該技術分野で周知であり、当業者により選択されうる。例えば、抗体組成物を注射（例えば静脈内または皮下）により投与してもよい。用いられる分子の適切な用量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または調合に依存すると考えられる。
上記のように、本発明のヒト抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体を、１つもしくは他の複数の治療物質、例えば細胞毒性物質、放射性毒性物質（ｒａｄｉｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）または免疫抑制剤と同時投与してもよい。抗体を、（免疫複合体としての）作用物質に連結するかまたは作用物質とは別々に投与してもよい。後者（別々の投与）の場合、作用物質の前、後またはそれと同時に抗体を投与するか、または他の公知の治療、例えば抗癌治療、例えば放射線と併せて同時投与してもよい。かかる治療物質は、特にドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシルおよびシクロホスファミドヒドロキシウレア（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）などの抗悪性腫瘍薬を含み、それら単独では患者に対して毒性または亜毒性のレベルでのみ有効である。シスプラチンは、４週ごとに１回、１００ｍｇ／ｋｇ用量で静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日ごとに１回、６０−７５ｍｇ用量で静脈内投与される。本発明のヒト抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／もしくは抗−ＢＭＰＲ２抗体またはそれらの抗原結合断片と化学療法剤の同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果をもたらす異なる機序を介して作用する２つの抗癌剤を提供する。かかる同時投与は、抗体に反応しなくなる薬剤に対する耐性または腫瘍細胞の抗原性における変化が生じることによる問題を解決しうる。
標的特異的なエフェクター細胞、例えば本発明の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）に連結したエフェクター細胞は、治療物質としても用いられうる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球でありうる。他の細胞は、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のＩｇＧ−もしくはＩｇＡ−受容体担持細胞を含む。必要に応じ、エフェクター細胞を試験されるべき対象から得てもよい。標的特異的なエフェクター細胞を生理学的に許容できる溶液中の細胞の懸濁液として投与してもよい。投与される細胞の数は１０８−１０９程度でありうるが、治療目的に応じて変化すると考えられる。一般に、量は、標的細胞、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を発現する腫瘍細胞での局在化を得るため、および例えば食作用による細胞死をもたらすために十分な量であると考えられる。投与経路もまた変化しうる。
標的特異的なエフェクター細胞による治療を標的化細胞を除去するための他の技術と併せて行ってもよい。例えば、本発明の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）および／またはこれらの組成物が備えられたエフェクター細胞を用いる抗腫瘍療法を化学療法と併用してもよい。さらに、併用免疫療法を用い、２つの異なる細胞毒性のあるエフェクター集団を指令し、腫瘍細胞を拒絶することが可能である。例えば、抗−Ｆｃ−γ ＲＩまたは抗−ＣＤ３に連結された抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体は、ＩｇＧ−またはＩｇＡ−受容体に特異的な結合剤と併用可能である。
本発明の二重特異性および多重特異性分子を用い、エフェクター細胞上のＦｃγＲまたはＦｃγＲレベルの、例えば細胞表面上の受容体のキャッピングおよび除去による調節も可能である。抗−Ｆｃ受容体の混合物もこの目的で用いられうる。
補体結合部位、例えば補体に結合するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＭ由来の部分を有する本発明の組成物（例えばヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）も補体の存在下で用いられうる。一実施形態では、本発明の結合剤および適切なエフェクター細胞による標的細胞を含む細胞の集団の生体外治療は、補体または補体を含有する血清の添加により補完されうる。本発明の結合剤でコートされた標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合により増進されうる。別の実施形態では、本発明の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）でコートされた標的細胞も補体により溶解されうる。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は補体を活性化することがない。
本発明の組成物（例えばヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）はまた、補体とともに投与可能である。したがって、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性または二重特異性分子、および血清または補体を含有する組成物は、本発明の範囲内に含まれる。これらの組成物は、補体がヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子の近接位置に存在する点で有利である。あるいは、本発明のヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子と補体または血清とを別々に投与してもよい。
本発明の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性または多重特異性分子または免疫複合体）および使用説明書を含むキットも本発明の範囲内に含まれる。キットは、１つ以上の追加試薬、例えば免疫抑制試薬、細胞毒性物質または放射性毒性物質あるいは１つ以上の追加の本発明のヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体とは異なる、異なるＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２抗原内のエピトープに対して結合する相補活性を有するヒト抗体）をさらに含みうる。
したがって、本発明の抗体組成物で治療される患者に、別の治療物質、例えばヒト抗体の治療効果を促進または増強する細胞毒性物質または放射性毒性物質を（本発明のヒト抗体の投与の前、投与と同時または投与後に）さらに投与してもよい。
他の実施形態では、対象をさらに、ＦｃγまたはＦｃγ受容体の発現または活性を調節する、例えば促進または阻害する作用物質で治療する、例えば対象をサイトカインで治療することが可能である。多重特異性分子による治療の間の投与に好ましいサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。
本発明の組成物（例えばヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性および二重特異性分子）を用い、ＦｃγＲ、またはＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２のうちの１つ以上を発現する細胞を、例えばかかる細胞を標識する目的で標的にすることも可能である。かかる使用においては、結合剤を検出可能な分子に連結してもよい。したがって、本発明は、Ｆｃ受容体、例えばＦｃγＲ、および／またはＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２のうちの１つ以上を発現する細胞を生体外またはインビトロで局在化するための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子でありうる。
特定の実施形態では、本発明は、試料中のＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２抗原の存在を検出するか、またはＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２抗原の量を測定するための方法であって、試料および対照試料と、抗体もしくはその一部とＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２との複合体の形成を可能にする条件下で、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分とを接触させる工程を含む方法を提供する。次いで、複合体の形成が検出され、ここで対照試料と比べた試料間での複合体形成の差は試料中でのＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２抗原の存在を示す。
さらに別の実施形態では、本発明の免疫複合体を用い、化合物（例えば治療物質、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤など）を、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２細胞表面受容体を有する細胞に対し、かかる化合物を抗体に連結することによって標的にすることが可能である。例えば、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２抗体は、米国特許第６，９８９，４５２号明細書、米国特許出願第１０／１６０，９７２号明細書、米国特許出願第１０／１６１，２３４号明細書、米国特許出願第１１／１３４，８２６号明細書、米国特許出願第１１／１３４，６８５号明細書、および米国仮特許出願第６０／７２０，４９９号明細書に記載のＵＰＴ、ならびに／あるいは米国特許第６，２８１，３５４号明細書および米国特許第６，５４８，５３０号明細書、米国特許公開第２００３００５０３３１号明細書、米国特許公開第２００３００６４９８４号明細書、米国特許公開第２００３００７３８５２号明細書および米国特許公開第２００４００８７４９７号明細書に記載されるかまたは国際公開第０３／０２２８０６号パンフレットに公表された毒素化合物のいずれかに複合されうる（これらはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。したがって、本発明は、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を発現する細胞を（例えば検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子を用いて）生体外またはインビボで局在化するための方法も提供する。あるいは、免疫複合体を用いて、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２細胞表面受容体を有する細胞を、細胞毒素または放射性毒素をＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対して標的化することにより殺滅することが可能である。
本発明は以下の実施例によりさらに例示され、実施例はさらに限定するものとして解釈されるべきでない。本願を通して言及されるあらゆる図面およびあらゆる参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
実施例
実施例１
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、およびＢＭＰＲ２に対するヒトモノクローナル抗体の産生
本実施例は、ヒトＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、およびＢＭＰＲ２に対して特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を産生するための方法を開示する。
抗原
マウスを組換えヒトＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２で免疫する。特に、マウスを市販の組換えヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４で免疫した。ヒト組換えＢＭＰ−２をＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）（カタログ番号３５５−ＢＭ／ＣＦ、ロット−ＭＳＡ１０６０５Ｈ）またはメドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ）（ロット−Ｍ１１５００６ＡＡＪ）から入手した。ヒト組換えＢＭＰ４をＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）（カタログ番号３１−ＢＰ／ＣＦ、ロット−ＢＥＭ１８６０５１およびＢＥＭ３１６０７１およびＭＳＡ１０６０５Ｈ）から入手した。製造業者の使用説明書に従い、凍結乾燥された抗原を再構成し、−２０℃で保存した。
トランスジェニックＨｕＭＡｂマウス（登録商標）およびＫＭマウス（登録商標）
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、およびＢＭＰＲ２に対する完全ヒトモノクローナル抗体は、ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスまたはＫＭトランスジェニックマウスのＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＨＣｏ１７株を用いて調製可能であり、これらはヒト抗体遺伝子を発現する。これらのマウス株では、内因性マウスカッパ軽鎖遺伝子はチェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８１１−８２０頁に記載のようにホモ接合性に破壊されており、内因性マウス重鎖遺伝子はＰＣＴ国際公開公報第０１／０９１８７号パンフレットの実施例１に記載のようにホモ接合的に破壊されている。さらに、このマウス株は、フィッシュワイルド（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ）ら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁（１９９６年）に記載のヒトカッパ軽鎖トランス遺伝子ＫＣｏ５と、ＰＣＴ国際公開公報第０１／０９１８７号パンフレットの実施例２に記載のヒト重鎖トランス遺伝子ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２またはＨＣｏ１７を保有する。
ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、トランスジェニックＨｕＭＡｂマウス（登録商標）のＨＣｏ２０：０２｛Ｍ／Ｋ｝（Ｂａｌｂ）Ｆ１およびＨＣｏ２７：０４｛Ｍ／Ｋ｝株およびトランスジェニックトランスクロモゾームマウスのＫＭ株を用いて調製し、ここでそれら各々はヒト抗体遺伝子を発現する。ＨＣｏ２０：０２｛Ｍ／Ｋ｝（Ｂａｌｂ）Ｆ１およびＨＣｏ２７：０４｛Ｍ／Ｋ｝マウスを国際公開公報第２００５／０５８８１５号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のように作成した。ＫＭ株を国際公開公報第０２／４３４７８号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のように作成した。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）およびＫＭマウス（登録商標）の免疫
ヒトＢＭＰ２およびＢＭＰ４に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するため、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）およびＫＭマウス（登録商標）のマウスをヒト組換え体ＢＭＰ２またはＢＭＰ４のいずれかで免疫した。ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）における一般的免疫スキームは、ロンバーグ Ｎ．（Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；フィッシュワイルド Ｄ．（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ Ｄ．）ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁およびＰＣＴ国際公開公報第９８／２４８８４号パンフレットに記載されている。マウスは抗原の１回目の注入時に６〜１６週齢であった。組換えＢＭＰ２またはＢＭＰ４の精製調製物（１０〜１５μｇ）を用い、ＨｕＭａｂマウス（登録商標）およびＫＭマウス（登録商標）の各々を免疫した。
トランスジェニックマウスを、最大で１２回の免疫を１週間間隔で、腹腔内および皮下にまたは足蹠を介し、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント中で乳化された抗原で免疫した。さらに、Ｂ細胞融合のために選択したマウスを、脾臓切除の３日前とさらに１日前、抗原で静脈内および腹腔内に免疫した。免疫応答を後眼窩の出血により監視した。血漿をＥＬＩＳＡ（下記）によってスクリーニングし、抗−ＢＭＰ２およびＢＭＰ４ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有したマウスを融合に用いた。マウスを、屠殺および脾臓の除去の３日前および１日前、抗原で静脈内に追加免疫した。４通りの融合を行い、全部でマウス３３匹を免疫した。
抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および抗−ＢＭＰＲ２抗体を産生するＨｕＭａｂマウス（登録商標）またはＫＭマウス（登録商標）の選択
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に結合する抗体を産生するＨｕＭａｂ マウス（商標）またはＫＭ マウス（商標）を選択するため、免疫されたマウス由来の血清を、フィッシュワイルド（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ）ら（１９９６年）、上記に記載のように、マイクロタイタープレートに吸着された精製抗原を用い、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。
特に、マイクロタイタープレートを、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ中の１〜２μｇ／ｍｌでの精製された組換えＢＭＰ２またはＢＭＰ４でコートし、周囲温度で一晩インキュベートし、ＰＢＳ／トゥイーン（０．０５％）で４回洗浄し、次いで０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した２００μｌ／ウェルのＰＢＳ／トゥイーン（０．０５％）でブロッキングした。ＢＭＰ２またはＢＭＰ４での免疫マウス由来の血漿の希釈物を各ウェルに添加し、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／トゥイーン（０．０５％）で洗浄し、次いで西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合したヤギ−抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃに特異的なポリクローナル抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質で発色させ（モス社（Ｍｏｓｓ，Ｉｎｃ．）、カタログ番号ＡＢＴＳ−１０００）、分光光度計によりＯＤ４１５〜４９５で分析した。
融合においては最高力価の抗原特異的な抗体を発生するマウスが用いられうる。融合を下記のように行い、ハイブリドーマ上清における抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２の活性についてＥＬＩＳＡにより試験する。マイクロタイタープレートに吸着した抗原に結合する抗体は、例えば親ＣＨＯ細胞内ではなくＣＨＯ細胞内の融合タンパク質として発現されうる。抗体は、フローサイトメトリーにより、組換えヒト抗原を発現する細胞系に結合するが、各抗原を発現しない対照細胞系に結合することのないものとして同定される。抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および抗−ＢＭＰＲ２抗体の結合は、例えば抗原を発現するＣＨＯ細胞を２０μｇ／ｍｌの濃度での目的の抗体とともにインキュベートすることにより評価可能である。細胞を洗浄し、結合を抗−ヒトＩｇＧ Ａｂに複合されたＦＩＴＣなどの標識を用いて検出する。フローサイトメトリー分析を、ファクスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）フローサイトメトリー（カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）のベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて行う。
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、およびＢＭＰＲ２に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、およびＢＭＰＲ２に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、例えば下記のプロトコルを用いて生成する。特に、ＢＭＰ２で免疫した、ＨｕＭａｂマウス（登録商標）またはＫＭマウス（登録商標）から単離したマウス脾細胞を、サイト・パルス（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ）の大型チャンバ式の細胞融合エレクトロポレーター（メリーランド州グレンバーニー（Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ）のサイト・パルス・サイエンシズ社（Ｃｙｔｏ ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））を用いる電場に基づく電気融合を用いて融合した。次いで、生成されたハイブリドーマにおける抗原特異的な抗体の産生について抗体捕捉Ｅｌｉｓａアッセイを用いてスクリーニングした。免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液を、Ａｇ８．６５３非分泌性のマウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）と、サイト・パルス（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ）の大型チャンバ式の細胞融合エレクトロポレーター（メリーランド州グレンバーニー（Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ）のサイト・パルス・サイエンシズ社（Ｃｙｔｏ ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））を用いる電場に基づく電気融合を用いて融合した。細胞を、平底マイクロタイタープレート内に約１×１０４細胞／ウェルでプレーティングした後、１０ｍＭヘペス、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび１×ＨＡＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ＣＲＬ Ｐ−７１８５）を補充したＤＭＥＭ（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、ＣＲＬ１００１３、高濃度のグルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含む）内に１０％ウシ胎仔血清３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ ＴＩＢ−６３）条件培地、３〜５％ハイブリドーマクローニング因子（バイオベリス社（Ｂｉｏｖｅｒｉｓ，Ｉｎｃ．））を含有する選択培地内で２週間インキュベートした。１〜２週間後、細胞を、ＨＡＴをＨＴと置換した培地内で培養した。次いで、各ウェルにおけるヒト抗−ＢＭＰ２またはＢＭＰ４モノクローナルＩｇＧ抗体について、ＥＬＩＳＡ（上記）によりスクリーニングした。大規模にハイブリドーマが増殖したら（１０〜１４日）、通常１０〜１４日の後、培地における抗体産生について監視した。抗体を分泌するハイブリドーマをより大きい培養容器内でさらに増幅し、抗原に特異的な抗体の産生について再びスクリーニングした。選択したコロニーを冷凍保存し、限界希釈により１回もしくは２回クローニングした。次いで、安定なサブクローンを冷凍保存し、インビトロで増幅し、さらなる特徴づけのために十分な量の抗体を産生させた。
ＢＭＰ２で免疫したマウスから、ヒト抗−ＢＭＰ２／４抗体を産生する全部で４９５のハイブリドーマコロニーを生成させた。クローニングのために３５のコロニーを選択し、次いでさらなる分析のために増幅した。３５のコロニーの中に、６Ｈ４、１１Ｆ２、１２Ｅ３、１Ｆ６、１０Ｆ６、１０Ｈ６、１６ｂ７、７Ｄ６、８Ｂ３、３３Ｆ７、および１５Ｆ３ハイブリドーマ細胞系が存在した。
実施例２
ヒトモノクローナル抗体の構造的特徴づけ
本実施例は、ＢＭＰ２およびＢＭＰ４に対して特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の構造的特徴づけについて開示する。特に、抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体６Ｈ４、１１Ｆ２、１２Ｅ３、１Ｆ６、１０Ｆ６、１０Ｈ６、１６ｂ７、７Ｄ６、８Ｂ３、３３Ｆ７、および１５Ｆ３の構造を、本実施例に開示している。
実施例１の方法により得られたモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列の各々は、標準のＰＣＲ技術を用いて抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２ハイブリドーマから得られ、標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定される。
６Ｈ４、１１Ｆ２および１２Ｅ３モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列の各々は、標準のＰＣＲ技術を用いて６Ｈ４、１１Ｆ２および１２Ｅ３ハイブリドーマから得られ、標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定された。
６Ｈ４の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の各々は、図１Ａならびに配列番号３１および３７に示される。６Ｈ４の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の各々は、図１Ｂならびに配列番号３４および４０に示される。
公知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列に対する６Ｈ４重鎖免疫グロブリン配列の比較により、６Ｈ４重鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＨ４−３４（配列番号５１）由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０（配列番号５２）由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ１（配列番号５３）由来のＪＨセグメントが用いられていることが示された。生殖細胞系ＶＨ４−３４配列に対する６Ｈ４ＶＨ配列のアラインメントを図４に示す。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いての６Ｈ４ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写（各々、図１Ａおよび４、ならびに配列番号１３、１６および１９に示される）が得られた。
公知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列に対する６Ｈ４軽鎖免疫グロブリン配列の比較により、６Ｈ４軽鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＫＬ６（配列番号５４）由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ２（配列番号５５）由来のＪＫセグメントが用いられていることが示された。生殖細胞系ＶＫＬ６配列に対する６Ｈ４ＶＫ配列のアラインメントを図７に示す。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いての６Ｈ４ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写（各々、図１Ｂおよび７、ならびに配列番号２２、２５、および２８に示される）が得られた。
１１Ｆ２の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の各々は、図２Ａならびに配列番号３２および３８に示される。１１Ｆ２の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の各々は、図２Ｂならびに配列番号３５および４１に示される。
公知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列に対する１１Ｆ２重鎖免疫グロブリン配列の比較により、６Ｈ４重鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＨ４−５９（配列番号４３）由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系２−２（配列番号４５）由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ５ｂ（配列番号４６）由来のＪＨセグメントが用いられていることが示された。生殖細胞系ＶＨ４−５９配列に対する１１Ｆ２ＶＨ配列のアラインメントを図５に示す。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いての１１Ｆ２ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写（各々、図２Ａおよび５、ならびに配列番号１４、１７および２０に示される）が得られた。
公知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列に対する１１Ｆ２軽鎖免疫グロブリン配列の比較により、１１Ｆ２軽鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７（配列番号４８）由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ４（配列番号５０）由来のＪＫセグメントが用いられていることが示された。生殖細胞系ＶＫＡ２７配列に対する１１Ｆ２ＶＫ配列のアラインメントを図８に示す。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いての１１Ｆ２ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写（各々、図２Ｂおよび８、ならびに配列番号２３、２６、および２９に示される）が得られた。
１２Ｅ３の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の各々は、図３Ａならびに配列番号３３および３９に示される。１２Ｅ３の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の各々は、図３Ｂならびに配列番号３６および４２に示される。
公知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列に対する１２Ｅ３重鎖免疫グロブリン配列の比較により、１２Ｅ３重鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＨ３−３３（配列番号４４）由来のＶＨセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ（配列番号４７）由来のＪＨセグメントが用いられていることが示された。生殖細胞系ＶＨ４−３３配列に対する１２Ｅ３ＶＨ配列のアラインメントを図６に示す。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いての１２Ｅ３ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写（各々、図３Ａおよび６、ならびに配列番号１５、１８および２１に示される）が得られた。
公知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列に対する１２Ｅ３軽鎖免疫グロブリン配列の比較により、１２Ｅ３軽鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５（配列番号４９）由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ４（配列番号５０）由来のＪＫセグメントが用いられていることが示された。生殖細胞系ＶＫＬ１５配列に対する１２Ｅ３ＶＫ配列のアラインメントを図９に示す。ＣＤＲ領域決定のカバト（Ｋａｂａｔ）システムを用いての１２Ｅ３ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写（各々、図３Ｂおよび９、ならびに配列番号２４、２７、および３０に示される）が得られた。
１０Ｆ６、１０Ｈ６および１６ｂ７モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列の各々は、標準のＰＣＲ技術を用いて１０Ｆ６、１０Ｈ６および１６ｂ７ハイブリドーマから得られ、標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定された。１０Ｆ６および１０Ｈ６モノクローナル抗体の重鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＨ３−３３（配列番号４４）、ＤＨ６−１３、およびＪＨＪＨ４ｂ遺伝子（配列番号８８）が用いられている。１０Ｆ６および１０Ｈ６モノクローナル抗体の軽鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５およびＪＫＪＫ４遺伝子が用いられている。１６Ｂ７モノクローナル抗体の重鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＨ３−３３、ＤＨ６−１３、およびＪＨＪＨ２（配列番号８９）遺伝子が用いられている。１６Ｂ７モノクローナル抗体の軽鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５およびＪＫＪＫ４遺伝子が用いられている。
１Ｆ６モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列は、標準のＰＣＲ技術を用いて１Ｆ６ハイブリドーマから得られ、標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定された。１Ｆ６モノクローナル抗体の重鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＨ４−５９、ＤＨ２−２、およびＪＨＪＨ５ｂ遺伝子が用いられている。１Ｆ６モノクローナル抗体の軽鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７およびＪＫＪＫ４遺伝子が用いられている。
７Ｄ６、８Ｂ３、３３Ｆ７、および１５Ｆ３モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列の各々は、標準のＰＣＲ技術を用いて７Ｄ６、８Ｂ３、３３Ｆ７、および１５Ｆ３ハイブリドーマから得られ、標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定された。これらのモノクローナル抗体の重鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＨ１−６９（配列番号９１）およびＪＨＪＨ３ｂ遺伝子（配列番号９０）が用いられている。これらのモノクローナル抗体の軽鎖では、ヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７およびＪＫＪＫ２遺伝子が用いられている。
実施例３
抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体の結合特異性の特徴づけ
本実施例は、抗原結合の特異性について試験するための、抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットアッセイにより、免疫精製された抗原に対する結合に関して比較するか、または免疫組織化学を用いて組織内のＢＭＰ２／４に対する結合に関して比較するための方法を開示する。
組換えＨｉｓ−タグ化抗原および組換えｍｙｃ−タグ化抗原をプレート上に一晩コートし、次いで実施例１に開示された方法によって産生されたヒトモノクローナル抗体に対する結合について試験する。標準ＥＬＩＳＡ法を実施する。抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２ヒトモノクローナル抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、１：２の段階希釈で減量して力価判定する。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合したヤギ−抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃまたはカッパ鎖に特異的な）ポリクローナル抗体を二次抗体として用いる。
組換えＢ７Ｈ４−Ｉｇを、プロテインＡを用いるクロマトグラフィーにより、Ｂ７Ｈ４−Ｉｇコンストラクトを形質移入した２９３Ｔ細胞の上清から精製する。ＥＬＩＳＡプレートをヒト抗体でコートした後、精製タンパク質を添加し、次いでウサギ抗−Ｂ７Ｈ４抗血清で検出する。Ｃ−９タグを有する組換えペンタ（Ｐｅｎｔａ）−Ｂ７Ｈ４タンパク質を、２Ａ７親和性カラムを用いるクロマトグラフィーにより、ペンタ−Ｂ７Ｈ４−Ｃ９コンストラクトを形質移入した２９３Ｔ細胞の上清から精製する。ＥＬＩＳＡプレートを抗−マウスＦｃ、次いでモノクローナル抗−Ｃ９（０．６ｕｇ／ｍｌ）、次いで指定の力価判定したペンタ−Ｂ７Ｈ４、次いで１μｇ／ｍｌでのヒトモノクローナル抗体でコートする。抗−マウスＦｃ、次いでＭ−抗−Ｃ９（０．６ｕｇ／ｍｌ）、次いで力価判定したペンタ−ＢＭＰ２、ペンタ−ＢＭＰ４、ペンタ−ＢＭＰＲ１Ａ、ペンタ−ＢＭＰＲ１Ｂ、ペンタ−ＡＣＴＲ１、および／またはペンタ−ＢＭＰＲ２、次いで１μｇ／ｍｌでのヒトモノクローナル抗体でコートする。
抗−ＢＭＰ２／４抗体の還元および非還元条件下でのＢＭＰ２に対する結合についてウエスタンブロットアッセイにより特徴づけた。組換えヒトＢＭＰ２タンパク質（メドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ））０．５μｇを還元剤の存在下または非存在下で試料緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号ＳＢ７７２２）に直接希釈した。試料を３分間、１００°に加熱してタンパク質を変性した後、電気泳動およびウエスタンブロットを行った。膜結合タンパク質を試験抗体０．５μｇ／ｍｌでプローブした後、アルカリホスファターゼと複合したＦａｂ２ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ Ｌａｂｓ）、カタログ番号１０９−０５６−０９）で検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号３４０４２）で染色した。結果によると、試験したすべてのモノクローナル抗体がＢＭＰ２ホモ二量体に対応する約３６ｋＤａで還元されていないバンドを認識することが示される。さらに、モノクローナル抗体の一部（例えば８Ｂ３）が還元条件下でＢＭＰ２を認識した。ＢＭＰ単量体に対応する約１７〜１８ｋＤａの２つのバンドが現れた。
免疫組織化学においては、２，０００μｍのマウス組織コアを用いる（イムジェネックス（ＩＭＧＥＮＥＸ）ヒスト−アレイ（Ｈｉｓｔｏ−Ａｒｒａｙ）；カリフルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のイムジェネックス社（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐ．））。３０分乾燥後、切片をアセトンで固定し（室温で１０分間）、５分間風乾する。スライドをＰＢＳですすぎ、次いでＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清とともに２０分間プレインキュベート、次いで１０％正常ヤギ血清を有するＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ化（ｆｉｔｃｙｌａｔｅｄ）抗体とともに室温で３０分間インキュベートする。次いで、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、マウス抗−ＦＩＴＣ（１０μｇ／ｍｌ ダコ（ＤＡＫＯ））とともに室温で３０分間インキュベートする。スライドをＰＢＳで再び洗浄し、ヤギ抗−マウスＨＲＰ複合体（ダコ（ＤＡＫＯ））とともに室温で３０分間インキュベートする。スライドをＰＢＳでさらに３回洗浄する。ジアミノベンジジン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を基質として用いる結果、茶色染色が得られる。蒸留水で洗浄後、スライドをヘマトキシリンで１分間対比染色する。次いで、スライドを流れる蒸留水で１０秒間洗浄し、グリセルゲル（ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ）（ダコ（ＤＡＫＯ））に載せる。
抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体のサブセットにより認識されたエピトープをビオチンに複合した受容体ペプチドを用いて測定し、ストレプトアビジンチップ（ＳＡチップ（ＳＡ ｃｈｉｐ）、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ））により捕捉し、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）で分析した。抗体をチップに対して４０ｕｇ／ｍｌで通流した。８Ｂ３および７Ｄ６抗体が、ＢＭＰ２タイプ２受容体に結合するＢＭＰ２エピトープ（ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫ）（配列番号９２）に結合した。１２Ｅ３、１１Ｆ２および１６Ｂ７抗体が、ヘパリンに結合するＢＭＰ２エピトープ（ＱＡＫＨＫＱＲＫＲＬＫＳＳＣＫＲＨ）（配列番号９３）に結合した。さらに、抗−ＢＭＰ２／４ヒトモノクローナル抗体３３Ｆ７（配列番号６３および７１）がＢＭＰ２／４とヘパリンの間の相互作用を遮断した。このことはＢＭＰ２／４の機能を遮断する。
実施例４
抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体の、軟骨細胞系の表面上に発現される各抗原に対する結合の特徴づけ
本実施例は、抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体の、ＣＨＯ−抗原トランスフェクタントならびにＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を細胞表面上に発現する軟骨細胞に対する結合について試験するためのフローサイトメトリー法を開示する。
ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を形質移入したＣＨＯ細胞系ならびに軟骨細胞系ＡＴＤＣ５（リケン・バイオソース（ＲＩＫＥＮ Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、ＲＣＢ０５６５）または線維芽細胞系ＭＣ３Ｔ３（ＡＴＣＣ アクセッション番号ＣＲＬ−２５９５、ＣＲＬ−２５９６、ＣＲＬ−２５９４およびＣＲＬ−２５９３）における抗体結合について試験する。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣで標識された抗−ヒトＩｇＧＡｂを用いて検出する。ファクスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）フローサイトメトリー（カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）のベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用い、フローサイトメトリー分析を行う。
実施例５
抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体の結合親和性の分析
本実施例は、モノクローナル抗体におけるＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２に対する特異的な結合親和性について試験するための方法を開示する。
一方法では、ＨＥＫ細胞に完全長ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を、標準技術を用いて形質移入し、それを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ培地内で成長させる。細胞をトリプシン処理し、トリスベースの結合緩衝液（２４ｍＭトリス ｐＨ７．２、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ グルコース、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ ＢＳＡ）で１回洗浄し、結合緩衝液中で２×１０６細胞／ｍｌに調節する。ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）プレート（ＭＡＦＢ ＮＯＢ）を水中、１％脱脂粉乳でコートし、４℃で一晩保存する。プレートを結合緩衝液０．２ｍｌで３回洗浄する。緩衝液５０μｌのみを最大結合ウェルに添加する（全結合）。緩衝液２５μｌのみを対照ウェルに添加する（非特異的結合）。様々な濃度の１２５Ｉ−抗体を２５μｌの容量の全ウェルに添加する。１００倍超での様々な濃度の未標識抗体を２５μｌの容量で対照ウェルに添加し、結合緩衝液中のＣＨＯ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）を形質移入したＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２の２５μｌを全ウェルに添加する。プレートを、４℃、振とう器上、２００ＲＰＭで２時間インキュベートする。インキュベーション後、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）プレートを、低温の洗浄用緩衝液（２４ｍＭトリス ｐＨ７．２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭグルコース、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ ＢＳＡ）０．２ｍｌで３回洗浄する。フィルタを取り出し、ガンマカウンターで計数する。平衡結合の評価を、プリズム（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェア（カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ））を有する単一部位結合パラメータを用いて行う。データをシグモイド用量応答（プリズム（ＰＲＩＺＭ）（商標））を用いる非線形回帰により分析し、ＥＣ５０の計算結果を出し、それを用いて抗体におけるＥＣ５０および９５％ＣＩをランク付けする。
別の方法では、抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体の親和性および結合動態についてビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析（スウェーデン、ウップサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）のビアコアＡＢ（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＡＢ））により特徴づけた。標準のアミンカップリング化学反応およびビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）により提供されるキットを用い、抗−ＢＭＰ−２／４抗体を、第一級アミンを介してＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストランでコートされたチップ）に共有結合された抗ヒトＦｃ抗体を有するチップ上に捕捉した。結合を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｐＨ７．４）中にＢＭＰ２またはＢＭＰ４を１０ｎＭの濃度、２５μｌ／分の流速で流すことにより測定した。抗原−抗体結合動態を２分間追跡し、解離動態を８分間追跡した。ビアエバリュエーション（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）ソフトウェア（ビアコアＡＢ（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＡＢ））を用い、結合および解離曲線を１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルに適合させた。決定されたＫｄ、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ値を表１に示す。
（表１）抗ＢＭＰ−２および４ｍＡｂの結合親和性
Figure 2010502220
実施例６
一群のＢＭＰとの抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体の交差反応性
抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体のＢＭＰファミリーとの交差反応性を、そのＢＭＰ−３、５、６、７および８ｂならびにＧＤＦ−５および７との結合親和性をビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析によって測定することにより特徴づけた。標準のアミンカップリング化学反応およびビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）により提供されるキットを用い、ＢＭＰおよびＧＤＦをＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストランでコートされたチップ）に第一級アミンを介して共有結合させた。結合を、抗体をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｐＨ７．４）中に２０ｕｇ／ｍｌの濃度、２０μｌ／分の流速で流すことにより測定した。抗原−抗体結合動態を４分間追跡し、解離動態を６分間追跡した。ビアエバリュエーション（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）ソフトウェア（ビアコアＡＢ（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＡＢ））を用い、結合および解離曲線を１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルに適合させた。決定されたＫｄ値を表２に示す。
（表２）一群のファミリーメンバーに対する抗ＢＭＰ−２および４ヒトモノクローナル抗体の交差反応性
Figure 2010502220
実施例７
ＢＭＰ受容体タイプＩおよびＩＩの遮断
抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体の、タイプＩおよびタイプＩＩ ＢＭＰ受容体（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）のＲ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ））に対するＢＭＰ４の結合を遮断する能力をビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて測定した。
タイプ−Ｉおよびタイプ−ＩＩ ＢＭＰ受容体の双方を、ＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストランでコートされたチップ）に、標準のアミンカップリング化学反応およびビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）により提供されるキットを用い、第一級アミンを介して共有結合させた。抗体−抗原複合体の混合物を固定化された受容体に通流させた。抗体濃度を、タイプＩＩに対しては４００ｎＭから、タイプＩに対しては２００ｎＭから２倍段階希釈した。ＢＭＰ４濃度は３〜１０ｎＭの間であった。抗体およびＢＭＰ−４を、注射前の少なくとも１時間、プレインキュベートした。抗体−抗原混合物を５μｌ／分の流速で３分間注射した。重複エピトープを有する抗体は完全に競合することになる（抗体濃度の増加に伴い応答が低下する）一方、異なるエピトープを有する抗体は抗原に同時に結合することになる（抗体濃度の増加に伴い応答が増大する）。この分析によると、１Ｆ６、１１Ｆ２、１６Ｂ７、１２Ｅ３、１０Ｆ６、６Ｈ４、７Ｄ６、８Ｂ３、１５Ｆ３、および３３Ｆ７の全部が、タイプＩＩ受容体に対するＢＭＰの結合を強力な遮断から弱い遮断の範囲で遮断可能であることが示された（図１０ａ）。さらに、モノクローナル抗体の一部がタイプＩの結合も遮断可能であった一方、それ以外はタイプＩＩ受容体の結合に限って遮断した（図１０ｂ）。
モノクローナル抗体はヘパリンに対するＢＭＰ２の結合を遮断する
抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体におけるヘパリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に対するＢＭＰ−２の結合を遮断する能力をアルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）アッセイ（バートホールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）技術）を用いて測定した。５ｎＭの濃度でのビオチン化ヘパリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をストレプトアビジンでコートされたドナービーズ（２５ｕｇ／ｍｌ）により捕捉し、抗体（５ｎＭ）をプロテインＡでコートされたアクセプタービーズを用いて捕捉した。ＢＭＰ／２を２０ｎＭからの２倍段階希釈で力価判定した。抗体がＢＭＰ−２に対するヘパリンの結合を遮断する場合、ヘパリン、ＢＭＰ２およびヒトモノクローナル抗体の複合体が形成されることは全くなく、かつシグナルが観察されることは全くない。抗体がＢＭＰ２に対するヘパリンの結合を遮断することがない場合、三重複合体が形成され、かつＢＭＰ２濃度の増加に伴いシグナルが増大することになる。このアッセイでは、３３Ｆ７モノクローナル抗体のみがＢＭＰ２に対するヘパリンの結合を遮断した。３３Ｆ７はヘパリンおよびＢＭＰ２の双方に結合し、さらにヘパリンとＢＭＰ２の間の相互作用を遮断する。
実施例８：抗体の安定性
抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体の熱安定性
抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体の熱安定性を抗体の融解温度の熱量分析により測定した。融解温度（Ｔｍ）の熱量測定を、オートサンプラー（米国マサチューセッツ州ノースアンプトン（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ）のマイクロカルＬＬＣ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＬＬＣ））を併用したＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ示差走査マイクロカロリメータープラットフォーム（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で行った。試料細胞容量は０．１４４ｍＬであった。抗体についての変性データを、０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度、１℃／分の速度、３０〜９５℃での試料の加熱により得た。抗体試料はｐＨ７．４でのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に存在した。同じ緩衝液を参照細胞において用い、比較によりモル熱容量を得た。観察されたサーモグラムをベースライン補正し、正規化データを、ソフトウェア、オリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）ｖ７．０を用い、非二状態モデルに基づいて分析した。表３に示されるように、１１Ｆ２は最も安定な抗−ＢＭＰ２／４抗体である。それはその主なピークにおいて最高のＴｍ値を示す。
（表３）抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体についての示差走査熱量測定データ
Figure 2010502220
抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体の化学的安定性
抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体の安定性を、蛍光分光学によりその化学的変性の中点を測定することにより比較した。化学的変性の蛍光測定を、マイクロマックス（Ｍｉｃｒｏｍａｘ）プレートリーダー（ニュージャージー州エジソン（Ｅｄｉｓｏｎ）のスペックス（ＳＰＥＸ））を備えたスペックスフルオロログ（ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ）３．２２上で行った。ＰＢＳ緩衝液中、１６の異なる濃度の塩酸グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）中で２０時間平衡化しておいた抗体試料に対し、測定を行った。測定を黒色、低容量、非結合表面の３８４−ウェルプレート（マサチューセッツ州アクトン（Ａｃｔｏｎ）のコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））内で行い、測定には１２μＬのウェル容量内に１μＭの抗体が必要であった。蛍光を２８０ｎｍで励起し、放射スペクトルを３００〜４００ｎｍで測定した。走査速度は１秒／１ｎｍであり、スリットを５ｎｍのバンドパスに設定した。ＰＢＳを用いて緩衝液ブランクとし、自動的にデータから差し引いた。データを、グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアを用いて二状態変性モデルに適合させた。表４に示されるように、１５Ｆ３は最も安定な抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体である。それは最高のアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）中点を有した。
（表４）蛍光分光法により測定された抗ＢＭＰ−２および４モノクローナル抗体の化学的変性
Figure 2010502220
実施例９
抗−ＢＭＰ２／４抗体はＢＭＰ細胞のシグナル伝達を遮断する
ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体による細胞のシグナル伝達に対する効果を、Ｃ２Ｃ１２細胞内でのアルカリホスファターゼの発現を観察することによって測定した。ＢＭＰ２およびＢＭＰ４の生物活性に対するモノクローナル抗体の中和能を測定するため、Ｃ２Ｃ１２細胞を、１０％ウシ胎仔血清および１×ペン／ストレップを含有するＤＭＥＭ培地内、平底９６ウェルプレート内に１ウェル当たり８，０００個の細胞の密度でプレーティングし、ＣＯ２下、３７°で一晩インキュベートした。翌朝、培地を、モノクローナル抗体を含有する１００ｕｌの新しい培地と交換した後、組換えヒトＢＭＰ２タンパク質（メドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ））またはＢＭＰ４タンパク質（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３１４−ＢＰ／ＣＦ）を１．６μｇ／ｍｌの濃度で含有する１００μｌの培地と交換した。プレートをＣＯ２下、３７°で２日間インキュベートした。
２日目、細胞透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の方法を用い、細胞のアルカリホスファターゼ活性についてアッセイした。ここでは、培地をウェルから取り出し、細胞を氷冷したアセトン／エタノール溶液（５０：５０ｖ／ｖ）１００μｌで固定した。アセトン／エタノール溶液を直ちに除去し、ｐ−リン酸ニトロフェニル液体基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｎ７６５３）１００ｕｌと交換した。プレートを室温で、暗下で３分間保持し、反応を、５０μｌの３Ｎ ＮＡＯＨの各ウェルへの添加により停止した。基質切断の結果、細胞内のアルカリホスファターゼの量に比例する呈色反応が生じる。プレートを、４０５ｎｍの波長で、スペクトラＭＡ（ＳｐｅｃｔｒａＭＡ）×３４０（モレキュラー・デバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））上で読み取った。これらの条件下でのモノクローナル抗体におけるＮＤ５０は１〜５ｕｇ／ｍｌであった。
図１１に示されるように、ＢＭＰ２（図１１ａ）およびＢＭＰ４（図１１ｂ）によるアルカリホスファターゼの発現をＢＭＰ２／４モノクローナル抗体により阻害した。したがって、本明細書中に開示される抗体はＢＭＰタンパク質を中和しうる。
実施例１０
抗−ＢＭＰ２／４抗体はインビボでＢＭＰ２誘発性の異所性骨化を遮断する
本実施例は、抗−ＢＭＰ２／４モノクローナル抗体がＢＭＰ２誘発性の異所性骨形成を遮断することを示す。ＢＭＰ２は、コラーゲンゲルにより吸収され、かつマウスの後肢に皮下移植される場合、異所性骨形成を誘導する。ＢＭＰ２は移植部位に軟骨細胞前駆体および血管細胞を動員し、骨形成を開始させる。３週間かけて、コラーゲンゲルは成熟骨と置き換えられた状態になる（ナカムラ Ｙ．（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ．）ら Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．２００３年１０月；１８（１０）：１８５４−６２頁）。抗−ＢＭＰ２／４抗体がインビボで異所性骨形成を遮断しうることを示すため、マウスに、ＢＭＰ２が注入されたコラーゲンゲルを移植した直後、抗−ＢＭＰ２／４抗体または対照の無関連のＩｇＧ（ＢＤファーミンゲン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カタログ番号Ａ６６１８Ｍ）で処置した。
吸収可能なコラーゲンスポンジ（ヘリスタット（Ｈｅｌｉｓｔａｔ）（登録商標）ボーン・グラフト（Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ）、インテグラ・ライフ・サイエンシズ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カタログ番号１６９０−ＺＺ）に９６ｕｇ／ｍｌのＢＭＰ２（メドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）、インフューズ・ボーン・グラフト（Ｉｎｆｕｓｅ Ｂｏｎｅ ｇｒａｆｔ））を注入し、各々、０．２３グラムの最終重量を有する移植片に切断した。ＢＭＰ２を注入したコラーゲンスポンジを成体雄Ｃ５７ＢＬ６マウス３６匹の左側および右側後肢に皮下移植した。移植手術においては、標準のプロトコルに従い、マウスをケタミン／キシラジンで麻酔した。右側後肢においては、電気クリッパーを用いて半腱様の筋肉を覆う皮膚の毛をそり、クロルヘキサジンスクラブ（ｓｃｒｕｂ）およびアルコールを用いて準備した。マウスを側臥位に置いた。メスまたはハサミを用い、長骨に沿った皮膚内に０．５ｃｍの切開部を設けた。鈍的切開により皮下移植ポケット（ｐｏｃｋｅｔ）を用意した。無菌技術を用い、各移植試料（約２５ｕｇのＢＭＰ２を注入したコラーゲンスポンジ）をポケット内に入れた。左側後肢上への移植について、同じ手順を繰り返した。ステンレス鋼製創傷クリップを用いて創縫合を行った。
手術直後、動物を６つの処置群に分け（表５）、１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度の適切な抗体を３００ｕｌの単回ボーラス注射で各マウスの腹腔に送達した。群１を無関係の対照ＩｇＧで処置した。群２〜６をＢＭＰ２／４を中和するモノクローナル抗体で処置した（表５）。
２１日後、移植片および隣接組織を切除し、１０％中性緩衝ホルマリン中に入れた。切除した移植片にデンシトメトリー走査を施した（ピキシ（ＰＩＸＩ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のＧＥルナー（ＧＥ Ｌｕｎａｒ））。各移植片における骨ミネラル領域（ＢＭＡ）を表にした。図１２に示されるように、全部で５つのモノクローナル抗体が移植片におけるＢＭＰ２誘発性の骨形成の阻止において有効であった。
（表５）
Figure 2010502220
実施例１１
抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体の内在化
本実施例は、Ｈｕｍ−Ｚａｐ内在化アッセイを用いて、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２／４ヒトモノクローナル抗体が、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２を発現するＣＨＯ細胞に内在化する能力を試験するための方法を示す。Ｈｕｍ−Ｚａｐアッセイでは、毒素サポリンに複合されたヒトＩｇＧに対する親和性を有する二次抗体の結合を通じての一次ヒト抗体の内在化について試験する。
抗原発現細胞を、１００μｌのウェル内、１．２５×１０４細胞／ウェルで一晩播種する。抗原特異的な各ヒトモノクローナル抗体を１０ｐＭの濃度でウェルに添加する。抗原のいずれかに対して非特異的なアイソタイプ対照抗体を負の対照として用いる。Ｈｕｍ−Ｚａｐ（カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のアドバンスド・ターゲティング・システムズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＴ−２２−２５）を１１ｎＭの濃度で添加し、プレートを７２時間インキュベートしておく。次いで、プレートに３Ｈ−チミジンの１．０μＣｉのパルスを２４時間かけ、回収し、トップカウント・シンチレーションカウンター（Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ）（コネチカット州メリデン（Ｍｅｒｉｄｅｎ）のパッカード・インスツルメンツ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））で読み取る。
抗原を発現するＣＨＯ細胞内のサポリン複合体の内在化活性を、実施例１に記載のように産生されたヒトモノクローナル抗体を用い、約５００ｐＭ〜１ｐＭの範囲全体での用量応答で測定する。ＣＨＯ親細胞系およびＨｕＩｇＧ−ＳＡＰを、バックグラウンド毒性または非特異的内在化の尺度としての負の対照として用いる。
実施例１２
軟骨細胞系に対する、毒素に複合された抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体による細胞殺滅の評価
本実施例は、細胞増殖アッセイにおいて、毒素に複合された抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体が、抗原を発現する軟骨細胞系を殺滅させる能力について試験するための方法を開示する。
実施例１の方法により調製したＨｕＭＡｂ抗体は、リンカー、例えばペプチジル、ヒドラゾンまたはジスルフィドリンカーを介して毒素に複合されうる。抗原を発現する軟骨細胞または骨芽細胞系、例えばＡＴＤＣ５またはＭＣ３Ｔ３細胞を、１００μｌウェル内、約１〜３×１０４細胞／ウェルで３時間播種する。抗体−毒素複合体を３０ｎＭの開始濃度でウェルに添加し、１：３の段階希釈で減量して力価判定する。抗原に非特異的なアイソタイプ対照抗体を負の対照として用いる。プレートを６９時間インキュベートしておく。次いで、プレートに３Ｈ−チミジンの１．０μＣｉのパルスを２４時間かけ、回収し、トップカウント・シンチレーションカウンター（Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ）（コネチカット州メリデン（Ｍｅｒｉｄｅｎ）のパッカード・インスツルメンツ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））で読み取る。細胞死を、抗原を発現する軟骨細胞内での３Ｈ−チミジンの取り込みにおける抗体−毒素濃度依存性の低下により示す。
実施例１３
抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体のＡＤＣＣ活性の評価
本実施例は、蛍光細胞毒性アッセイにおいて、抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２モノクローナル抗体が、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）により、エフェクター細胞の存在下で抗原＋細胞系を殺滅する能力について試験するための方法を開示する。
ヒトエフェクター細胞を以下のように全血から調製する。ヒト末梢血単核球を、標準のフィコル−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ）分離により、ヘパリン化全血から精製する。細胞を１０％ＦＢＳおよび２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地内に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を回収し、培地内で４回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌで再懸濁する。標的抗原＋細胞を、１×１０６の標的細胞／ｍＬ当たりＢＡＴＤＡ２．５μｌのＢＡＴＤＡ試薬（マサチューセッツ州ウェルズリー（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ）のパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））とともに３７℃で２０分間インキュベートする。標的細胞を４回洗浄し、スピンダウンし、最終容量を１×１０５細胞／ｍｌにする。
抗原＋細胞系におけるヒトモノクローナル抗体に対する抗体特異的なＡＤＣＣについて、以下のデルフィア（Ｄｅｌｆｉａ）蛍光放射分析を用いて試験する。各標的細胞系（標識された標的細胞１００μｌ）をエフェクター細胞５０μｌおよび抗体５０μｌとともにインキュベートする。実験を通して１：５０の標的対エフェクター比を用いる。すべての試験において、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を負の対照として用いる。２０００ｒｐｍのパルス回転および３７℃で１時間のインキュベーション後、上清を収集し、再び高速回転し、上清２０μｌを平底プレートに移し、そこにＥｕ溶液（マサチューセッツ州ウェルズリー（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ）のパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））１８０μｌを添加し、ルビースター（ＲｕｂｙＳｔａｒ）リーダー（ＢＭＧラブテック（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ））で読み取る。溶解率（％）を、（試料放出−自然放出＊１００）／（最大放出−自然放出）（式中、自然放出は標的細胞のみを含有するウェルからの蛍光であり、かつ最大放出は標的細胞を含有し、２％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘで処理されているウェルからの蛍光である）に従って計算する。
実施例１４
裸（Ｎａｋｅｄ）抗体と細胞毒素と複合された抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２抗体を用いる、インビボでの腫瘍異種移植片モデルの処置
本実施例は、癌腫瘍細胞が移植されたマウスを毒素と複合された抗体でインビボ処置し、腫瘍成長に対する抗体のインビボでの効果を試験するための方法を開示する。
標準の検査法を用い、インビトロで癌細胞を増やす。６〜８週齢の雄Ｎｃｒ胸腺欠損ヌードマウス（ニューヨーク州ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）のタコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ））に、マウス１匹当たりＰＢＳ／マトリゲル（１：１）０．２ｍｌ中、７．５×１０６個の細胞を、右脇腹に皮下移植する。移植後週２回、マウスを秤量し、電子キャリパーを用い、腫瘍を三次元測定する。腫瘍容量を高さ×幅×長さで計算する。平均１１０〜２７０ｍｍ３の腫瘍を有するマウスを処置群にランダム化する。０日目、マウスに対し、ＰＢＳビヒクル、毒素と複合されたアイソタイプ対照抗体、または毒素と複合された抗−ＢＭＰ２、抗−ＢＭＰ４、抗−ＢＭＰＲ１Ａ、抗−ＢＭＰＲ１Ｂ、抗−ＡＣＴＲ１、および／または抗−ＢＭＰＲ２ ＨｕＭＡｂを腹腔内投与する。本発明の抗体に複合可能な毒素化合物の例が、ＰＣＴ出願国際公開公報第２００５／１１２９１９号パンフレットに記載されている。抗原特異的なヒトモノクローナル抗体を受けるマウスを３種の異なる毒素化合物で試験する。マウスにおける腫瘍成長を投与後６０日間監視する。腫瘍が腫瘍エンドポイント（２０００ｍｍ３）に達する時、マウスを安楽死させる。毒素に複合された適切な抗原特異的な抗体が腫瘍エンドポイント容量（２０００ｍｍ３）に達するまでの平均時間を延長し、腫瘍成長の進行を遅延させる。したがって、かかる抗体−毒素複合体での処置が、腫瘍成長に対し、インビボでの直接的阻害効果を有する。
実施例１５
脱フコシル化ヒトモノクローナル抗体の産生
本実施例では、フコシル残基が欠如したヒトモノクローナル抗体を産生するための方法を開示する。フコシル残基の量が減少した抗体が抗体のＡＤＣＣ能力を増大させることが示されている。フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（ニュージャージー州プリンストン（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）のバイオワ社（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．））が欠如したＣＨＯ細胞系Ｍｓ７０４−ＰＦに、抗原特異的ＨｕＭＡｂの重鎖および軽鎖を発現するベクターをエレクトロポレートする。薬剤耐性クローンを、６ｍＭのＬ−グルタミンおよび５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を有するＥｘ−Ｃｅｌｌ ３２５−ＰＦ ＣＨＯ培地（カンザス州レネクサ（Ｌｅｎｅｘａ）のＪＲＨバイオサイエンシーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））内での成長により選択する。クローンにおけるＩｇＧの発現を標準のＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングする。２つの別々のクローンＢ８Ａ６およびＢ８Ｃ１１が産生され、それは１．０〜３．８ピコグラム／細胞／日の範囲の産生速度を有する。
実施例１６
脱フコシル化抗体のＡＤＣＣ活性の評価
本実施例は、蛍光細胞毒性アッセイにおいて、脱フコシル化モノクローナル抗体および脱フコシル化されていないモノクローナル抗体が、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）により、エフェクター細胞の存在下でＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＴＲ１、および／またはＢＭＰＲ２＋細胞を殺滅する能力の試験について開示する。
ヒト抗原に特異的なモノクローナル抗体を上記のように脱フコシル化する。ヒトエフェクター細胞を以下のように全血から調製する。ヒト末梢血単核球を、標準のフィコル−パック分離によりヘパリン化全血から精製する。細胞を１０％ＦＢＳ（培地）および２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０倍地内に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートする。翌日、細胞を回収し、培地内で１回洗浄し、２×１０７個の細胞／ｍｌで再懸濁する。標的抗原＋細胞を、２．５ｍＭのプロベネシドを補充した培地（アッセイ培地）内で、１×１０６個の標的細胞／ｍＬ当たりＢＡＴＤＡ２．５μｌのＢＡＴＤＡ試薬（マサチューセッツ州ウェルズリー（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ）のパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））とともに３７℃で２０分間インキュベートする。アッセイ培地内で、標的細胞を、２０ｍＭヘペスおよび２．５ｍＭのプロベネシドを有するＰＢＳで４回洗浄し、スピンダウンし、最終容量を１×１０５細胞／ｍｌにする。
一貫して１：１００の標的対エフェクター比を用いる。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を負の対照として用いる。２１００ｒｐｍのパルスの回転および３７℃で１時間のインキュベーション後、上清を回収し、再び高速回転し、上清２０μｌを平底プレートに移し、そこにＥｕ溶液（マサチューセッツ州ウェルズリー（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ）のパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））１８０μｌを添加し、フュージョン・アルファＴＲＦ（Ｆｕｓｉｏｎ Ａｌｐｈａ ＴＲＦ）プレートリーダー（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））で読み取る。溶解率（％）を、（試料放出−自然放出＊１００）／（最大放出−自然放出）（式中、自然放出は標的細胞のみを含有するウェルからの蛍光であり、かつ最大放出は標的細胞を含有し、３％ライゾール（Ｌｙｓｏｌ）で処理されているウェルからの蛍光である）に従って計算する。抗原＋発現細胞系は、ＨｕＭＡｂ抗原に特異的な抗体による抗体媒介性の細胞毒性および抗原特異抗体の脱フコシル化形態に関連した特異的な溶解の百分率が増大することを示すことになる。したがって、脱フコシル化ＨｕＭＡｂ抗体が抗原発現細胞に特異的な細胞毒性を増大させる。
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態により範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書中に記載の改良に加えて本発明の様々な変更が、上記および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。かかる変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれるように意図されている。
特許、特許出願、出版物、製品説明、およびプロトコルが本願を通して言及されているが、それらの開示はあらゆる目的でそれら全体が参照により本明細書中に援用される。
骨形態形成タンパク質配列の簡単な説明
配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２００下で開示されたヒト骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるヒト骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３０８５１下で開示されたヒト骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号４は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列によりコードされるヒト骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４３２９下で開示されたヒト骨形態形成タンパク質受容体１Ａ（ＢＭＰＲ１Ａ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列によりコードされるヒト骨形態形成タンパク質受容体１Ａ（ＢＭＰＲ１Ａ）のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２０３下で開示されたヒト骨形態形成タンパク質受容体１Ｂ（ＢＭＰＲ１Ｂ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号８は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列によりコードされるヒト骨形態形成タンパク質受容体１Ｂ（ＢＭＰＲ１Ｂ）のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０３３８６７下で開示されたヒトアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＴＲ１）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、配列番号９に示されるヌクレオチド配列によりコードされるヒトアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＴＲ１）のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２０４下で開示されたヒト骨形態形成タンパク質受容体２（ＢＭＰＲ２）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるヒト骨形態形成タンパク質受容体２（ＢＭＰＲ２）のアミノ酸配列である。
配列表の要約
Figure 2010502220
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Claims (29)

  1. 配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体により認識されるヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４上のエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分、抗体断片、もしくは抗体模倣体。
  2. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体である、請求項１に記載の単離された抗体。
  3. 全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗体断片、ヒト化抗体、一本鎖抗体、免疫複合体、脱フコシル化抗体、および二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された抗体。
  4. ＵｎｉＢｏｄｙ、ドメイン抗体、およびＮａｎｏｂｏｄｙからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体断片。
  5. Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ＤＡＲＰｉｎ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ａｖｉｍｅｒ、Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ、およびＤｕｏｃａｌｉｎからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体模倣体。
  6. 治療物質を含む、請求項３に記載の免疫複合体。
  7. 前記治療物質が細胞毒素または放射性同位体である、請求項３に記載の免疫複合体。
  8. ヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４に５．５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する、請求項１に記載の単離された抗体。
  9. ヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４に３×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する、請求項１に記載の単離された抗体。
  10. ヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４に２×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する、請求項１に記載の単離された抗体。
  11. 請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
  12. 請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分の重鎖または軽鎖をコードする、単離された核酸分子。
  13. 請求項１２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  14. 請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  15. 以下の工程を含む、抗−ＢＭＰ２抗体または抗−ＢＭＰ４抗体を調製するための方法：
    （ａ）請求項１に記載の抗体をコードする１つ以上の核酸分子を含有する宿主細胞を得る工程；
    （ｂ）宿主細胞培養物内で前記宿主細胞を成長させる工程；
    （ｃ）前記１つ以上の核酸分子が発現される宿主細胞培養条件を提供する工程；および
    （ｄ）前記宿主細胞または前記宿主細胞培養物から前記抗体を回収する工程。
  16. 対象に、抗−ＢＭＰ２抗体もしくは抗−ＢＭＰ４抗体またはその抗原結合部分を、前記疾患を治療または予防するのに有効な量で投与する工程を含む、異常な骨形成および骨化を伴う疾患を治療または予防するための方法。
  17. 前記疾患が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｏｓｓｅｏｕｓ ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｉａ）（ＰＯＨ）、脊髄損傷、筋肉内血腫、整形手術からの合併症、乾癬性関節炎、変形性関節症、強直性脊椎炎（ＡＳ）、血清反応陰性関節症、骨格骨化過剰症、耳硬化症、あぶみ骨強直症、骨癌、前立腺癌、外骨腫、アテローム硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、弁膜性心疾患からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記疾患が、骨癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、造血癌（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、腎癌、および乳癌からなる群から選択される癌である、請求項１６に記載の方法。
  19. 以下からなる群から選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体により認識されるヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ４上のエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分、抗体断片、もしくは抗体模倣体：
    ａ．配列番号３３で示される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号３６で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、
    ｂ．配列番号３４で示される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号３７で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、
    ｃ．配列番号５６で示される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号６４で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、
    ｄ．配列番号５７で示される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号６５で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、
    ｅ．配列番号５８で示される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号６６で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、
    ｆ．配列番号５９で示される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号６７で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、
    ｇ．配列番号６０で示される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号６８で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、
    ｈ．配列番号６１で示される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号６９で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、
    ｉ．配列番号６２で示される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号７０で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、ならびに
    ｊ．配列番号６３で示される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号７１で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列。
  20. 全抗体、抗体断片、ヒト化抗体、一本鎖抗体、免疫複合体、脱フコシル化抗体、および二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１９に記載の単離された抗体。
  21. ＵｎｉＢｏｄｙ、ドメイン抗体、およびＮａｎｏｂｏｄｙからなる群から選択される、請求項１９に記載の抗体断片。
  22. Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ＤＡＲＰｉｎ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ａｖｉｍｅｒ、Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ、およびＤｕｏｃａｌｉｎからなる群から選択される、請求項１９に記載の抗体模倣体。
  23. 請求項１９に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
  24. 請求項１９に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分の重鎖または軽鎖をコードする、単離された核酸分子。
  25. 請求項２４に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  26. 請求項２５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  27. 請求項１または１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を発現するハイブリドーマ。
  28. 以下の工程を含む、請求項１または１９のいずれか一項に記載の抗体を作製する方法：
    ａ．ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック動物を、ＢＭＰ２ペプチドまたはＢＭＰ４ペプチドで免疫する工程；
    ｂ．前記トランスジェニック動物からＢ細胞を回収する工程；
    ｃ．前記Ｂ細胞からハイブリドーマを作製する工程；
    ｄ．ＢＭＰ２またはＢＭＰ４に結合する抗体を発現するハイブリドーマを選択する工程；および
    ｅ．前記選択されたハイブリドーマ由来のＢＭＰ２またはＢＭＰ４に結合する前記抗体を回収する工程。
  29. 以下の工程を含む、抗−ＢＭＰ２抗体または抗−ＢＭＰ４抗体を作製する方法：
    ａ．ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック動物をＢＭＰ２ペプチドまたはＢＭＰ４ペプチドで免疫する工程；
    ｂ．前記トランスジェニック動物の前記Ｂ細胞からｍＲＮＡを回収する工程；
    ｃ．前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程；
    ｄ．ファージ内の前記ｃＤＮＡを、前記ｃＤＮＡによりコードされる抗−ＢＭＰ２抗体または抗−ＢＭＰ４抗体が前記ファージの表面上に提示されるように発現させる工程；
    ｅ．抗−ＢＭＰ２抗体または抗−ＢＭＰ４抗体を提示するファージを選択する工程；
    ｆ．核酸分子を、前記抗−ＢＭＰ２または抗−ＢＭＰ４免疫グロブリンをコードする前記選択されたファージから回収する工程；
    ｇ．前記回収された核酸分子を宿主細胞内で発現させる工程；および
    抗体をＢＭＰ２またはＢＭＰ４に結合する前記宿主細胞から回収する工程。
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