JP2010540500A

JP2010540500A - Ｒｎａワクチン

Info

Publication number: JP2010540500A
Application number: JP2010526322A
Authority: JP
Inventors: タールハマー，ヨゼフ; ワイス，リヒャルト; レスラー，エリザベス; シャイブルホーファー，サンドラ; フリューヴィルト，アンゲリカ
Original assignee: ビオマイアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2008-09-29
Publication date: 2010-12-24
Anticipated expiration: 2028-09-29
Also published as: EP2200646B1; AU2008303483A1; EP2200646A1; US11020477B2; CA2700604C; US20110033416A1; DK2200646T3; JP5535920B2; AU2008303483B2; CN101827606B; CA2700604A1; US20170136121A1; EP2042193A1; WO2009040443A1; CN101827606A; PL2200646T3; US20140134129A1; BRPI0817265A2; ES2434221T3

Abstract

本発明は、アレルゲンまたはその誘導体をコードするＲＮＡ分子を含むＲＮＡワクチン、およびその使用に関する。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、ＲＮＡワクチンに関する。

この数十年間に、欧米先進国では、Ｉ型アレルギー性疾患が大きな健康問題として浮上してきており、現在では、人口の約２５％が発症している。

遺伝的要因の他、幼児期の感染を含む成長期の環境、食習慣、および、受動喫煙や大気汚染への暴露などの環境要因が、アトピー性疾患の発生に大きく関係する。

現在、何年かに渡ってアレルゲンを徐々に増やして投与するという特定の免疫療法が、唯一有効な治療的介入の例である。しかし、投与量が多いため、アナフィラキシー性副作用の危険性は明白であり、未精製の、殆ど特定されていないアレルゲンの抽出物を使用した場合、未確認の成分に対する患者の感作を生じさせる可能性がある。

さらに、Ｉ型アレルギーに対する予防接種は実現しておらず、アレルギー性疾患を発症する遺伝的リスクが高い幼児においてアレルギー性疾患の発症を予防するのが、最も実現可能な手法であろう。幼い免疫システムを訓練するほうが、既に発症したアレルギー性免疫表現型の均衡を保つよりも簡単である。

Ying et al.（Nature Med (1999) 5:823-827）には、免疫学的過程を研究するためのモデル分子として使用されることが多いβ−ガラクトシダーゼをコードするＲＮＡを含む自己修復ＲＮＡワクチンが開示されている。Ying et al.では、抗腫瘍反応が研究されており、ＣＤ８陽性細胞の誘導が観察されている。しかし、Ying et al.において調査されていないＣＤ４陽性細胞は、ＣＤ８陽性細胞とは対照的に、アレルギーに対する免疫学的防御を媒介し、Ｂ細胞におけるＩｇＥへのクラススイッチを妨げる。

近年、核酸ベースのワクチンは、アレルギー性疾患の根底にある免疫機構にバイアスをかける有効な手法となってきている。数多くの動物実験において、ＤＮＡワクチンがＩ型アレルギー反応の誘導を抑制し、さらには既存のアレルギー性ＴＨ２免疫状態を回復させることが立証されている（Weiss, R. et al. (2006) Int Arch Allergy Immunol 139:332-345）。

それでもなお、ＤＮＡベースのワクチンの安全性に関して懸念の声が挙がっている。注入されたＤＮＡ分子は、宿主ゲノムに統合される可能性があり、また、様々な組織への分散性により、アレルゲンが持続的に放出され、その結果、既存のアレルゲン特異的ＩｇＥ分子を有する患者において制御不可能なアナフィラキシー反応を誘発する慮がある。さらに、健康な子供に対してワクチンを投与する場合、抗アレルギーワクチンにおける最も高水準の安全基準を適用する必要がある。

したがって、本発明の目的は、ＤＮＡワクチンの欠点を克服し、さらにアレルギー治療に有効である、または、アレルゲンに対する感作をうまく抑制できるアレルゲンワクチンを提供することにある。

本発明は、少なくとも１つのアレルゲンまたはそのアレルゲンの誘導体をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含むＲＮＡワクチンに関する。当該ＲＮＡワクチンにおいて、当該アレルゲンは、アルヌス・グルチノーサ（Alnus glutinosa）、アルタナリア・アルタナータ（Alternaria alternata）、アンブローシア・アルテミシーフォリア（Ambrosia artemisiifolia）、アピウム・グラベオレンス（Apium graveolens）、アラキス・ハイポガエア（Arachis hypogaea）、ベツラ・ベルコーサ（Betula verrucosa）、カルピヌス・ベツルス（Carpinus betulus）、カスタネア・サチバ（Castanea sativa）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Cladosporiumherbarum）、コリルス・アベラナ（Corylus avellana）、クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica）、カプリナス・カルピオ（Cyprinus carpio）、ダウクス・カロタ（Daucus carota）、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（Dermatophagoides pteronyssinus）、ファグス・シルバチカ（Fagus sylvatica）、フェリス・ドメスチカス（Felis domesticus）、ヘベア・ブラシリエンシス（Heveabrasiliensis）、ジュニペルス・アシュエイ（Juniperus ashei）、マルス・ドメスチカ（Malus domestica）、ケルクス・アルバ（Quercus alba）、およびフレウム・プラテンス（Phleum pratense）のアレルゲンである。

アレルゲンまたはそのアレルゲンの誘導体をコードするＲＮＡ分子は、ＲＮＡワクチンとしても有効に使用できる可能性があることがわかった。ＲＮＡワクチンは、アレルギー性疾患の治療のためのＤＮＡワクチンによる特徴を示す。すなわち、ＲＮＡワクチンにおいて、アレルゲンは最も純粋な形態、すなわち遺伝情報にて提供され、ＤＮＡワクチンと同様に、ＲＮＡワクチンはＴＨ１−バイアスの免疫反応を誘発する。さらに、低アレルギー性の遺伝子産物を生成するためにＤＮＡワクチン用に作られた方法と同様の方法を、ＲＮＡワクチンにおいても利用することができる。

さらに、ＲＮＡワクチンには、ＤＮＡワクチンより大きな利点がある。
（ｉ）ＲＮＡワクチンは、アレルゲンの純粋な遺伝情報を含んでいるが、ＤＮＡワクチンに使用されるプラスミドの骨格に通常存在するウイルスプロモータ、抗生物質耐性遺伝子、またはウイルス／細菌の調節配列などの外来配列を含まない。
（ｉｉ）ＲＮＡは、宿主ゲノムに統合されないため、悪性腫瘍の危険性を解消できる。
（ｉｉｉ）ＲＮＡは、細胞の細胞質にて翻訳されるので、細胞核の転写機構が必要ではなく、ＲＮＡワクチンは、核内移行または核外移行とは独立しており、核の各ステージからも独立している。
（ｉｖ）ＲＮＡは迅速に分解されるので、外来遺伝子の発現は短期間に行われ、制御不可能な長期に渡る抗原の発現を避けることができる。

本発明に係るＲＮＡワクチンは、アレルゲンをコードする１つ以上のＲＮＡ分子を含んでいてもよく、好適には２、３、５、１０種等のＲＮＡ分子を含んでいてもよい。しかし、１種のＲＮＡ分子が１つ以上のアレルゲンをコードしてもよい。つまり、１種のＲＮＡ分子が少なくとも１、２、３、５、１０個の異なる、または同じアレルゲンをコードする塩基配列を含む構成としてもよい。１種ないし複数種のＲＮＡ分子によってコードされるアレルゲンは、後述の列挙のあらゆる組み合せの中から選択されてもよい。

本明細書において使用するとき、「ＲＮＡワクチン」という用語は、本明細書において規定されたＲＮＡ分子を含むワクチンを指す。しかし当然のことながら、当該ワクチンは、個体に投与する際に必要とされる、または、好適である他の物質および分子（たとえば医薬品賦形剤）を含んでいてもよい。

「〜のアレルゲン」という用語は、「〜由来のアレルゲン」および「〜から得られるアレルゲン」という用語に置き換えることができる。これは、アレルゲンが当該生物において自然発現されるものであり、本発明に係るＲＮＡ分子を生成するために当該アレルゲンをコードするＤＮＡ／ＲＮＡが単離されることを指す。

哺乳類またはヒトに投与したとき、アレルゲンをコードするＲＮＡ分子の全てがアレルゲン特異的抗体の形成を誘発するわけではないことがわかった。例えばアルテミシア・ブルガリス（Artemisiavulgaris）のアレルゲンＡｒｔＶ１、およびオレア・エウロピア（Olea europea）のアレルゲンＯｌｅｅ１をコードするＲＮＡ分子は、Ｔｈ１メモリを誘発することができず、アレルゲン特異的ＩｇＥ反応を抑制することができない。しかし、上述したソースに由来するアレルゲンをコードするＲＮＡ分子は上記を行うことができる。

本発明の好適な実施形態によると、アルヌス・グルチノーサのアレルゲンは、Ａｌｎｇ１であり、アルタナリア・アルタナータのアレルゲンは、Ａｌｔａ１、Ａｌｔａ３、Ａｌｔａ４、Ａｌｔａ５、Ａｌｔａ６、Ａｌｔａ７、Ａｌｔａ８、Ａｌｔａ１０、Ａｌｔａ１２およびＡｌｔａ１３からなる群より選択され、アンブローシア・アルテミシーフォリアのアレルゲンは、Ａｍｂａ１、Ａｍｂａ２、Ａｍｂａ３、Ａｍｂａ５、Ａｍｂａ６、Ａｍｂａ７、Ａｍｂａ８、Ａｍｂａ９およびＡｍｂａ１０からなる群より選択され、アピウム・グラベオレンスのアレルゲンは、Ａｐｉｇ１、Ａｐｉｇ４およびＡｐｉｇ５からなる群より選択され、アラキス・ハイポガエアのアレルゲンは、Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２、Ａｒａｈ３、Ａｒａｈ４、Ａｒａｈ５、Ａｒａｈ６、Ａｒａｈ７およびＡｒａｈ８からなる群より選択され、ベツラ・ベルコーサのアレルゲンは、Ｂｅｔｖ１、Ｂｅｔｖ２、Ｂｅｔｖ３、Ｂｅｔｖ４、Ｂｅｔｖ６およびＢｅｔｖ７からなる群より選択され、カルピヌス・ベツルスのアレルゲンは、Ｃａｒｂ１であり、カスタネア・サチバのアレルゲンは、Ｃａｓｓ１、Ｃａｓｓ５およびＣａｓｓ８からなる群より選択され、クラドスポリウム・ヘルバルムのアレルゲンは、Ｃｌａｈ２、Ｃｌａｈ５、Ｃｌａｈ６、Ｃｌａｈ７、Ｃｌａｈ８、Ｃｌａｈ９、Ｃｌａｈ１０およびＣｌａｈ１２からなる群より選択され、コリルス・アベラナのアレルゲンは、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ２、Ｃｏｒａ８、Ｃｏｒａ９、Ｃｏｒａ１０およびＣｏｒａ１１からなる群より選択され、クリプトメリア・ジャポニカのアレルゲンは、Ｃｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２からなる群より選択され、カプリナス・カルピオのアレルゲンは、Ｃｙｐｃ１であり、ダウクス・カロタのアレルゲンは、Ｄａｕｃ１およびＤａｕｃ４からなる群から選択され、デルマトファゴイデス・プテロニシヌスのアレルゲンは、Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｐ２、Ｄｅｒｐ３、Ｄｅｒｐ４、Ｄｅｒｐ５、Ｄｅｒｐ６、Ｄｅｒｐ７、Ｄｅｒｐ８、Ｄｅｒｐ９、Ｄｅｒｐ１０、Ｄｅｒｐ１１、Ｄｅｒｐ１４、Ｄｅｒｐ２０、Ｄｅｒｐ２１およびＣｌｏｎｅ３０アレルゲンからなる群より選択され、ファグス・シルバチカのアレルゲンは、Ｆａｇｓ１であり、フェリス・ドメスチカスのアレルゲンは、Ｆｅｌｄ１、Ｆｅｌｄ２、Ｆｅｌｄ３、Ｆｅｌｄ４、Ｆｅｌｄ５ｗ、Ｆｅｌｄ６ｗおよびＦｅｌｄ７ｗからなる群より選択され、ヘベア・ブラシリエンシスのアレルゲンは、Ｈｅｖｂ１、Ｈｅｖｂ２、Ｈｅｖｂ３、Ｈｅｖｂ４、Ｈｅｖｂ５、Ｈｅｖｂ６．０１、Ｈｅｖｂ６．０２、Ｈｅｖｂ６．０３、Ｈｅｖｂ７．０１、Ｈｅｖｂ７．０２、Ｈｅｖｂ８、Ｈｅｖｂ９、Ｈｅｖｂ１０、Ｈｅｖｂ１１、Ｈｅｖｂ１２およびＨｅｖｂ１３からなる群より選択され、ジュニペルス・アシュエイのアレルゲンは、Ｊｕｎａ１、Ｊｕｎａ２およびＪｕｎａ３からなる群より選択され、マルス・ドメスチカのアレルゲンは、Ｍａｌｄ１、Ｍａｌｄ２、Ｍａｌｄ３およびＭａｌｄ４からなる群より選択され、ケルクス・アルバのアレルゲンは、Ｑｕｅａ１であり、ならびに、フレウム・プラテンスのアレルゲンは、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ２、Ｐｈｌｐ４、Ｐｈｌｐ５、Ｐｈｌｐ６、Ｐｈｌｐ７、Ｐｈｌｐ１１、Ｐｈｌｐ１２およびＰｈｌｐ１３からなる群より選択される。

本発明の好適な実施形態によると、アレルゲンは、下記からなる群から選択される：
イネ科の花粉：Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 12
イエダニ：Der p 1, Der p 2, Der p 7, Der p 21, Clone 30 allergen （PCT国際出願番号AT2007/000201, オーストリア特許出願番号AT 503530：
MKFNIIIVFI SLAILVHSSY AANDNDDDPT TTVHPTTTEQ PDDKFECPSR FGYFADPKDP HKFYICSNWE AVHKDCPGNT RWNEDEETCT、配列番号１）
カバノキ花粉：Bet v 1 およびその同種の木（Aln g 1, Cor a 1, Fag s 1）または食物アレルゲン（Mal d 1, Api g 1, Pru p 1）
猫：Fel d 1, Fel d 2
草（ブタクサ、ヨモギ）：Amb a 1
イトスギ／ビャクシン／ヒマラヤスギ：Cry j 1, Cry j 2, Jun a 1, Jun a 3,
Cha o 1, Cha o 2, Cup a 1, Cup a 3, Jun a 1, Jun a 3, Pla a 3
ピーナッツ：Ara h 1, Ara h 2, Ara h 4
へーゼルナッツ：Cor a 8, Cor a 9
魚／エビ：Gad c 1, Cyp c 1, Pen a 1。

本発明に係るＲＮＡワクチンに使用される特に好適なアレルゲンは、Ａｌｎｇ１、Ａｌｔａ１、Ａｍｂａ１、Ａｐｉｇ１、Ａｒａｈ２、Ｂｅｔｖ１、ベータ−カゼイン、Ｃａｒｂ１、Ｃａｓｓ１、Ｃｌａｈ８、Ｃｏｒａ１、Ｃｒｙｊ１、Ｃｙｐｃ１、Ｄａｕｃ１、Ｄｅｒｐ２、Ｆａｇｓ１、Ｆｅｌｄ１、Ｈｅｖｂ６、Ｊｕｎａ１、Ｍａｌｄ１、オボアルブミン（ＯＶＡ）、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ２、Ｐｈｌｐ５、Ｐｈｌｐ６およびＰｈｌｐ７からなる群より選択される。

上述したアレルゲンは、ＲＮＡワクチンにおける使用に特に適することがわかった。当然のことながら、Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 8, Amb a 9, Amb a 10, Amb t 5, Hel a 1, Hel a 2, Hel a 3, Mer a 1, Che a 1, Che a 2, Che a 3, Sal k 1, Cat r 1, Pla l 1, Hum j 1, Par j 1, Par j 2, Par j 3, Par o 1, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 5, Fes p 4w, Hol l 1, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 5, Lol p 11, Pha a 1, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13, Poa p 1, Poa p 5, Sor h 1, Pho d 2, Aln g 1, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Car b 1, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Que a 1, Fra e 1, Lig v 1, Syr v 1, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3w, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1, Pla a 1, Pla a 2, Pla a 3, Aca s 13, Blo t 1, Blo t 3, Blo t 4, Blo t 5, Blo t 6, Blo t 10, Blo t 11, Blo t 12, Blo t 13, Blo t 19, Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 7, Der f 10, Der f 11, Der f 14, Der f 15, Der f 16, Der f 17, Der f 18w, Der m 1, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6, Der p 7, Der p 8, Der p 9, Der p 10, Der p 11, Der p 14, Der p 20, Der p 21, Eur m 2, Eur m 14, Gly d 2,Lep d 1, Lep d 2, Lep d 5, Lep d 7, Lep d 10, Lep d 13, Tyr p 2, Tyr p 13, Bos d 2, Bos d 3, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Equ c 4, Equ c 5, Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5w, Fel d 6w, Fel d 7w, Cav p 1, Cav p 2, Mus m 1, Rat n 1, Alt a 1, Alt a 3, Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Alt a 7, Alt a 8, Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13, Cla h 2, Cla h 5, Cla h 6, Cla h 7, Cla h 8, Cla h 9, Cla h 10, Cla h 12, Asp fl 13, Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22w, Asp f 23, Asp f 27, Asp f 28, Asp f 29, Asp n 14, Asp n 18, Asp n 25, Asp o 13, Asp o 21, Pen b 13, Pen b 26, Pen ch 13, Pen ch 18, Pen ch 20, Pen c 3, Pen c 13, Pen c 19, Pen c 22w, Pen c 24, Pen o 18, Fus c 1, Fus c 2, Tri r 2, Tri r 4, Tri t 1, Tri t 4, Cand a 1, Cand a 3, Cand b 2, Psi c 1, Psi c 2, Cop c 1, Cop c 2, Cop c 3, Cop c 5, Cop c 7, Rho m 1, Rho m 2, Mala f 2, Mala f 3, Mala f 4, Mala s 1, Mala s 5, Mala s 6, Mala s 7, Mala s 8, Mala s 9, Mala s 10, Mala s 11, Mala s 12, Mala s 13, Epi p 1, Aed a 1, Aed a 2, Api m 1, Api m 2, Api m 4, Api m 6, Api m 7, Bom p 1,Bom p 4, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g 7, Bla g 8, Per a 1, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Chi k 10, Chi t 1-9, Chi t 1.01, Chi t 1.02, Chi t 2.0101, Chi t 2.0102, Chi t 3, Chi t 4, Chi t 5, Chi t 6.01, Chi t 6.02, Chi t 7, Chi t 8, Chi t 9, Cte f 1, Cte f 2, Cte f 3, Tha p 1, Lep s 1, Dol m 1, Dol m 2, Dol m 5, Dol a 5, Pol a 1, Pol a 2, Pol a 5, Pol d 1, Pol d 4, Pol d 5, Pol e 1, Pol e 5, Pol f 5, Pol g 5, Pol m 5, Vesp c 1, Vesp c 5, Vesp m 1, Vesp m 5, Ves f 5, Ves g 5, Ves m 1, Ves m 2, Ves m 5, Ves p 5, Ves s 5, Ves vi 5, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 5, Myr p 1, Myr p 2, Sol g 2, Sol g 4, Sol i 2, Sol i 3, Sol i 4, Sol s 2, Tria p 1, Gad c 1, Sal s 1, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Gal d 1, Gal d 2, Gal d 3, Gal d 4, Gal d 5, Met e 1, Pen a 1, Pen i 1, Pen m 1, Pen m 2, Tod p 1, Hel as 1, Hal m 1, Ran e 1, Ran e 2, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Sec c 20, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 25, Tri a 26, Zea m 14, Zea m 25, Ory s 1, Api g 1, Api g 4, Api g 5, Dau c 1, Dau c 4, Cor a 1.04, Cor a 2, Cor a 8, Fra a 3, Fra a 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Mal d 4, Pyr c 1, Pyr c 4, Pyr c 5, Pers a 1, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru av 4, Pru d 3, Pru du 4, Pru p 3, Pru p 4, Aspa o 1, Cro s 1, Cro s 2, Lac s 1, Vit v 1, Mus xp 1, Ana c 1, Ana c 2, Cit l 3, Cit s 1, Cit s 2, Cit s 3, Lit c 1, Sin a 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Vig r 1, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Len c 1, Len c 2, Pis s 1, Pis s 2, Act c 1, Act c 2, Cap a 1w, Cap a 2, Lyc e 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola t 4, Ber e 1, Ber e 2, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Ric c 1, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Cuc m 1, Cuc m 2, Cuc m 3, Ziz m 1, Ani s 1, Ani s 2, Ani s 3, Ani s 4, Arg r, Asc s 1, Car p 1, Den n 1, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6.01, Hev b 6.02, Hev b 6.03, Hev b 7.01, Hev b 7.02, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hom s 1, Hom s 2, Hom s 3, Hom s 4, Hom s 5、およびTrip s 1などの他のアレルゲンを本発明に使用することもできる。

本発明に係る好適な実施形態によると、アレルゲン誘導体は低アレルギー性である。

哺乳類、特にヒトの体内において、アレルギー反応を誘発させずに、または、最小限に抑えながら、特定の免疫反応を誘発するためには、本発明のアレルゲンまたはその誘導体が低アレルギー性を示すこと、すなわち、その低アレルギー性の分子が、全くまたは殆どＩｇＥ反応を示さないことが好ましい。

本明細書において使用するとき、「低アレルギー性」という用語は、アレルギー特性をもつアレルゲンに由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、個体に投与されたときに、該アレルゲンに対して特異的なＴ細胞の誘導を誘発し、かつアレルギー反応が少ない、または全く発生させない能力があることを指す。当該アレルゲンに存在するＴ細胞エピトープは保存しつつ、当該アレルゲンからＩｇＥ結合エピトープを除去または破壊することによって、ヒトのアレルギー反応を誘発する能力をアレルゲンの低アレルギー性誘導体において消失または低減させることができる。例えば、ＩｇＥ結合能力が低減された、またはＩｇＥ結合能力が全くないフラグメントに分割することによって達成される。分割した当該フラグメントのうちのいくつか、または全てを、野生型のアレルゲンにおけるフラグメントの順番とは異なる順番に結合させてもよい。（例えば欧州特許出願公開第１４４０９７９号明細書参照）。アレルゲンから低アレルギー性分子を生成する他の方法は、野生型アレルゲンのＣ末端欠失、および／または、Ｎ末端欠失を伴う方法である（例えば欧州特許出願公開第１２２４２１５号明細書参照）。当然のことながら、野生型アレルゲンの１つ以上のアミノ酸残基に対して特異的変異を導入することによって、低アレルギー性分子を生成することもできる。この改変の結果、３次元構造が欠失する。

ＲＮＡワクチンの低アレルギー化は、ＲＮＡワクチンから生ずるタンパク質を細胞のユビキチン化経路の標的とし、ユビキチン化経路において、各タンパク質を低アレルギー性のペプチドに分解することによって為される。上記は、ユビキチンをコードする配列を、アレルゲンをコードするＲＮＡの５’末端に結合させることによって、達成される。７６番目のアミノ酸残基をグリシンからアラニンに変異させる（Ｇ７６→Ａ７６）ことによって、ユビキチン化効率を上げることができる。また、アレルゲンの第１アミノ酸（メチオニン）を不安定化アミノ酸（アルギニン）に変異させる（Ｍ７７→Ｒ７７）ことによって、ユビキチン化効率をさらに上げることができる。また、ＰＥＳＴ配列として知られるカルボキシ末端不安定化配列を加えることによって、ＲＮＡワクチンから生ずる遺伝子産物のユビキチン化を行うこともできる。

本発明の好適な実施形態によると、ワクチンにおけるＲＮＡによってコードされた低アレルギー性のアレルゲン誘導体のＩｇＥ反応性は、野生型アレルゲンのＩｇＥ反応性よりも、１０％以上、好適には２０％以上、より好適には３０％以上、特に５０％以上低い。

ウサギの網状赤血球溶解液システムにおいてインビトロにてＲＮＡを翻訳することによって、ＲＮＡワクチンの低アレルギー性を定期的に検査することができる。適切な患者の血清のプールを用いたＩｇＥウェスタンブロット法によって、ＲＮＡワクチンから生じた遺伝子産物を分析することができる。当該網状赤血球溶解液システムにおいて翻訳された野生型分子のＩｇＥ結合能力と比較して、各低アレルギー性アレルゲンのＩｇＥ結合能力を評価することができる。

本発明に係る特に好適な実施形態によると、本発明のＲＮＡ分子は、１個を越える、好適には２個を越える、より好適には３個を越える、さらに好適には４個を越えるアレルゲンまたはそのアレルゲンの誘導体をコードするものであってもよい。特に、ＲＮＡ分子は、Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5およびPhl p6、またはAln g 1, Cor a 1, Que a 1, Car b 1およびBet v 1をコードする。

アレルゲンまたはその誘導体をコードするＲＮＡ分子は、少なくとも１つのさらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に結合される。

アレルゲンをコードするＲＮＡ配列は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ配列に結合され得る。これらのペプチドは、小胞体にアレルゲンを方向付けることによって細胞からのタンパク質分泌を高める、例えばヒト組織プラスミノーゲン活性化シグナルペプチド（ｈＴＰＡ）などのシグナルペプチドであってもよい。当該ペプチドまたはタンパク質は、リソソームに結合した膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、またはリソソームの膜内在性タンパク−ＩＩ（ＬＩＭＰ−ＩＩ）におけるＣ末の２０−アミノ酸であってもよい。ＬＡＭＰ／ＬＩＭＰ−ＩＩ配列は、抗原タンパク質を、形質転換された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の主要組織適合クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）小胞区画に方向付けるのに使用され、それによって、ワクチンの有効性を向上させるＴヘルパー細胞の活性を高める。当該タンパク質またはポリペプチドは、例えば熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、コレラ毒素などの細菌毒素、または大腸菌（Escherichia coli）の易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）といった、ワクチンのＴＨバイアスを高めるタンパク質であってもよい。

本発明に係る好適な実施形態では、ＲＮＡ分子は、レプリカーゼ、β−グロビンリーダー配列、ｃａｐ０、ｃａｐ１およびポリＡテールからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる要素を含むものである。

本発明のＲＮＡワクチンは、それぞれのアレルゲンをコードするＲＮＡ配列により構成される。当該ＲＮＡ配列は、アレルゲンの野生型配列であってもよいし、そのコドン使用頻度に対して適合されてもよい。コドン使用頻度の適合によって、ＲＮＡの翻訳効率および半減期を増大させることができる。少なくとも３０個のアデノシン残基からなるポリＡテールを、ＲＮＡの３´末端に結合させ、ＲＮＡの半減期を増大させる。ＲＮＡの５’末端は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（ｃａｐ０構造）構造をもつ変異リボヌクレオチド、またはその誘導体によってキャップされる。当該変異リボヌクレオチドまたはその誘導体は、ＲＮＡ合成の間に組み込まれてもよく、または、ＲＮＡ転写の後に、Vaccinia Virus Capping Enzyme（ＶＣＥ：ｍＲＮＡトリフォスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼおよびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼからなる酵素）を用いて酵素処理してもよい。この酵素が、N7-monomethylated cap 0構造の構成を触媒する。ｃａｐ０構造は、ＲＮＡワクチンの安定性および翻訳効率を維持するために重要な役割を果たす。ＲＮＡワクチンの５’キャップを２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾させてもよく、これによって、ｃａｐ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）が生成され、さらに、翻訳効率が向上する。

ＲＮＡワクチンは、自己複製ワクチンへの変換によって最適化され得る。当該ベクターは、対象の遺伝子とともに、アルファウイルス由来の複製要素と、構造的なウイルスタンパク質の代用物とを含む。レプリカーゼを基本要素とするＲＮＡワクチンは、ウイルス由来の危険シグナルが媒介する免疫活性化が原因で、極めて低量であっても、抗体だけでなく細胞毒性応答をも誘発することが示されている（Ying, H. et al. (1999) Nat Med 5:823-827）。

また、ＲＮＡワクチンは、自己複製ＲＮＡワクチンであってもよい。自己複製ＲＮＡワクチンは、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、またはアルファウイルスファミリーに属する他のウイルスに由来するレプリカーゼＲＮＡ分子によって構成されている。レプリカーゼの下流にはサブゲノムプロモータが存在し、当該サブゲノムプロモータがアレルゲンＲＮＡ、およびこれに続く３０個以上のアデノシン残基からなる人工ポリＡテールの複製を制御する。

本発明の他の好適な実施形態によると、ワクチンはさらにＣｐＧ−ＤＮＡおよびサイトカインを含み、サイトカインは好適にはインターロイキン（ＩＬ）−１２およびＩＬ−１５である。

さらに、ワクチンまたは本発明に係るワクチン製剤はアジュバントを含んでいてもよい。本発明における「アジュバント」は、抗原に対する免疫反応を高める化合物または混合物を指す。アジュバントは、抗原を徐放する組織徐放性製剤として供給されてもよい。アジュバントは、とりわけ、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバンド、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルオロニック多価アルコール、多価陰イオン、ペプチド、レバミゾール、ＣｐＧ−ＤＮＡ、油または炭化水素乳剤、ならびに、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有益なアジュバントを含む。

上記の代わりに、または上記に加えて、免疫刺激タンパク質をアジュバントとして、または、ワクチンに対する免疫の増大のために用いてもよい。免疫刺激サイトカイン、免疫増強サイトカインもしくは炎症性サイトカイン、リンフォカイン、またはケモカインなどの免疫刺激分子を、ワクチン、特にベクターワクチンとともに同時投与することによって、ワクチン接種の効果が高まる可能性がある（Salgaller and Lodge, J. Surg. Oncol. (1988) 68:122）。例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および、他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド（Lyman, Curr. Opin. Hematol., 1998, 5:192）、ＣＤ４０リガンド、などのサイトカインまたはサイトカイン遺伝子、ならびに、いくつかの主要な副刺激分子またはそれらの遺伝子（例えばＢ７．１、Ｂ７．２）を使用することができる。これら免疫刺激性分子は、タンパク質として全身的もしくは局所的に分配されてもよいし、ＲＮＡ分子または本発明に係るＲＮＡワクチンにおけるＲＮＡ分子にコードされていてもよい。また、免疫刺激性分子として、ポリアルギニンなどのポリカチオン性ペプチドを使用してもよい。

本発明に係るさらなる好適な実施形態によると、ワクチンは、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与、局所性投与、または微粒子銃投与に適用される。

様々な方法を用いて、本発明に係るＲＮＡワクチンを投与してもよい。例えば１つの方法では、インビボにおいてＲＮＡワクチンを直接体内に注入する（例：筋内、皮内、静脈内、鼻腔内など）。また、体外においてＲＮＡを細胞（例えば上皮細胞）内に注入することができる。例えば、インビトロにおいてＲＮＡワクチンを上皮細胞に形質移入し、身体に投与する（移殖する）。外因性ＲＮＡまたは異種ＲＮＡを細胞内に注入すれば、細胞は、当該ＲＮＡによって形質移入され得る。パルス法（pulsing）、すなわち、本発明に係るＲＮＡ分子とともに、細胞を培養することによって、細胞内にＲＮＡを導入することができる。また、ネイキッドＲＮＡとして、または他の形質移入促進剤（ペプチド、ポリマーなど）とともに、リポフェクションによってインビボでＲＮＡを導入してもよい。合成陽イオン性脂質は、インビボでの形質移入においてリポソームを生成するために使用される。核酸の形質移入に有益な脂質化合物および組成物は、例えばＤＯＤＣ，ＤＯＰＥ，ＣＨＯＬ，ＤＭＥＤＡ，ＤＤＡＢ，ＤＯＤＡＣ，ＤＯＴＡＰおよびＤＯＴＭＡである。また、他の分子も生体内での核酸の形質移入を促進するのに役立つ。他の分子とは、カチオン性オリゴペプチド（例えば国際公開第９５／２１９３１号パンフレット）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば国際公開第９６／２５５０８号パンフレット）、またはカチオン性ポリマー（例えば国際公開第９５／２１９３１号パンフレット）である。また、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、ポリラクチド−ポリグリコリドならびにキトサンを使用してもよい。また、電気穿孔法、顕微注入法、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、または遺伝子銃を使用する方法などの周知の方法を用いて、ＲＮＡ分子を所望の宿主細胞の中に導入してもよい（微粒子銃形質移入、Tang et al., Nature (1992) 356: 152-154参照）。

本発明の他の形態は、本明細書において規定された、アレルギーの治療用または予防用のワクチンを製造するための、少なくとも１つのＲＮＡ分子の使用に関する。

本発明のさらなる形態は、本明細書において規定された、アレルゲンに対する個体の除感作のためのワクチンを製造するための少なくとも１つのＲＮＡ分子の使用に関する。

本発明に係る他の好適な実施形態によると、ワクチンは、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与または微粒子銃投与に適用される。

本発明に係る他の形態は、少なくとも１つのアレルゲンまたはその誘導体をコードする少なくとも１つのヌクレオチドを含む分離されたＲＮＡ分子に関する。当該ＲＮＡ分子は、好適には、ｃａｐ０、ｃａｐ１、５’β−グロビンリーダー配列、自己複製ＲＮＡ、再コード化されたアレルゲン配列、および人工のポリＡテールからなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列を含む。なかでも、ＲＮＡ分子は、ｃａｐ０‐アレルゲン配列‐ポリＡテールが特に好ましい。ｃａｐ０は、インビボでの抗体の生成のため、ならびにアレルゲン特異的なＴ細胞の誘導およびＩＦＮ−ガンマ分泌のための自己複製ＲＮＡワクチンに関して、有益である。

さらに、下記の図面および例を用いて本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。

図１は、β−ガラクトシダーゼをコードするＲＮＡ（βＧａｌ−ＲＮＡ）または自己複製ＲＮＡ（βＧａｌ−ｒｅｐＲＮＡ）転写産物を用いた、インビトロにおけるＢＨＫ２１細胞の形質移入を示す。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造を付加したＲＮＡ転写産物（キャップ）または当該構造を付加していないＲＮＡ転写産物（キャップなし）について試験した。形質移入していない細胞をバックグラウンド対照として使用した（形質移入されていない）。データは、３つの独立した形質移入実験の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。

図２Ａは、核酸ワクチン接種後のＰｈｌｐ５特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルを示し、図２Ｂは、ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作を示す。血清は、１：１０００（図２Ａ）、１：１０００００（図２Ｂ）に希釈した。棒グラフの頂点上の数値は、各群におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２の平均比を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。

図３は、ＲＢＬ放出アッセイによって測定されたＰｈｌｐ５特異的ＩｇＥを示す。ＩｇＥレベルは、各核酸ワクチンを用いたワクチン接種後（グレーの棒グラフ）、および、ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作（黒の棒グラフ）後に測定した。数値は、特定のヘキソサミニダーゼ放出の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。

図４は、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型ＰｈｌＰ５によるインビトロでの再刺激後のＩＦＮ−ガンマ（図４Ａ）、ＩＬ−４（図４Ｂ）、およびＩＬ−５（図４Ｃ）の数を示す。データは、１０^６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。

図５は、アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおける全白血球数（図５Ａ）、および好酸球数（図５Ｂ）を示す。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。

図６は、アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおけるＩＬ−５（図６Ａ）およびＩＦＮ−γ（図６Ｂ）のレベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。

図７は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｂｅｔｖ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図８は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃａｒｂ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図９は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃａｓｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図１０は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図１１は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図１２は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｏｒａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図１３は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｌｎｇ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図１４は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｆａｇｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図１５は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図１６は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ７によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図１７は、ＲＮＡｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図１８は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｒｙｊ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図１９は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｊｕｎａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図２０は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｍｂａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図２１は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｐｉｇ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図２２は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｄａｕｃ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図２３は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｍａｌｄ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図２４は、ＲＮＡｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図２５は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｂｅｔａ−ＣａｓｅｉｎによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図２６は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｙｐｃ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図２７は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｆｅｌｄ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図２８は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｄｅｒｐ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図２９は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｌｔａ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図３０は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｌａｈ８によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図３１は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｈｅｖｂ６によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図３２は、ＲＮＡｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（アレルゲン）によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図３３は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｒａｈ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。

図３４は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｑｕｅａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図３５は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｒｔｖ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。

図３６は、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｏｌｅｅ１によるＴｈ１メモリの誘導がない、またはＩｇＥ反応の抑制がないことを示す。

＜実施例＞
〔実施例１：〕
本実施例では、ＲＮＡおよび臨床的に関連するオオアワガエリの花粉アレルゲンＰｈｌｐ５をコードするレプリカーゼベースのＲＮＡワクチンが、アレルギー反応を効果的に抑制することを示す。

（材料および方法）
［ＲＮＡ転写に使用されるプラスミド］
ｐＴＮＴベクターをＰｒｏｍｅｇａ（マンハイム、ドイツ）から購入した。このベクターは、他のベクターより優れた利点をもつ特別な特徴を有する。一方はＳＰ６ポリメラーゼ用、もう一方はＴ７ポリメラーゼ用の２つのプロモータが存在しており、ＳＰ６およびＴ７に基づくインビトロ転写を可能にする。それらプロモータは、タンデムにマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の近傍に配置されている。Ａ５’β−グロビンのリーダー配列は、より迅速に翻訳を開始させることによって複数の遺伝子の翻訳の増加を促進する。当該ベクターは、遺伝子の発現を向上させる他の特徴として、合成ポリ（Ａ）３０テールを有する。

ベクターｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，オーストリア）は、シンドビス・アルファウイルス（sindbis alphavirus）由来であり、これは包まれたポジティブストランドＲＮＡウイルスである。アルファウイルスベースのレプリコンベクターは、ウイルス性構造タンパク質を欠失しているが、細胞質におけるＲＮＡの自己増殖、およびアルファウイルス性プロモータを介する挿入遺伝子の発現に必要な複製エレメント（レプリカーゼ）を保持する。

ベクターｐＣＭＶ−Ｐｈｌｐ５からＮｈｅＩ／ＸｂａＩを介してＰｈｌｐ５遺伝子を抽出し（Gabler et al. (2006), J Allergy Clin Immunol 118:734-741）、ｐＴＮＴおよびｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５のＸｂａＩ制限酵素認識部位に連結し、それぞれｐＴＮＴ−Ｐ５およびｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５−Ｐ５を得た。

［ＲＮＡ転写］
対応する制限酵素を用いてプラスミドｐＴＮＴ−Ｐ５およびｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５−Ｐ５を直鎖状にした。フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出、それに続く１回のクロロホルム−イソアミルアルコール抽出によって、テンプレートを精製した。１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２を加えた後、２容量の１００％ＥｔＯＨによってプラスミドを沈殿させ、７０％ＥｔＯＨを用いて３回洗浄した。

全ての転写反応は、製造者のプロトコルに従って、Ｔ７またはＳＰ６ＲｉｂｏＭＡＸ^ＴＭＬａｒｇｅＳｃａｌｅＲＮＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。簡単には、１００μｌの反応液として、２０μｌの転写バッファー、３０μｌのｒＮＴＰ、５〜１０μｇのテンプレート、および１０μｌの酵素混合液を、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏで満たして１００μｌとし、３７℃にて２〜３時間インキュベートした。ＳＰ６ＲｉｂｏＭａｘキットを使用する場合、３０μｌのｒＮＴＰの代わりに２０μｌのｒＮＴＰを使用した。

ｍＲＮＡのキャップ構造を擬態させるために、ＲＮＡ合成中に５’７−メチルグアノシンヌクレオチド（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）またはキャップアナログ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ，ＵＳＡ）を組み込んだ。ｒＮＴＰ混合物は、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＧＴＰおよびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの２５：２５：２５：２２．５：２．５ｍＭ混合物となるように調製した。

転写の後に、１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、氷上にて１０〜１５分間混合物をインキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温にて１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後、７０％エタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ中に再縣濁した。

（結果）
［ＲＮＡおよび自己複製ＲＮＡを用いたインビトロ形質移入］
β−ガラクトシダーゼをコードする２つの異なるＲＮＡ転写産物を用いて、ＢＨＫ−２１細胞をインビトロ形質移入した。当該ＲＮＡ転写産物は、ベクターｐＴＮＴ−βＧａｌから転写された従来のＲＮＡワクチン（βＧａｌ−ＲＮＡ）、または、ベクターｐＲｅｐ５−βＧａｌから転写された自己複製ＲＮＡ（βＧａｌ−ｒｅｐＲＮＡ）である。

ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造が付加されたＲＮＡ転写産物、または付加されていないＲＮＡ転写産物について、試験した。図１は、従来のＲＮＡと同量の自己複製ＲＮＡを形質移入した場合、従来のＲＮＡと比べて７．５倍高い遺伝子発現を誘発することを示す。加えて、キャップ構造によるＲＮＡの安定化は、ＲＮＡのインビトロ形質移入／翻訳に不可欠である。

［アレルゲンＰｈｌｐ５をコードするＲＮＡベースのワクチンは、免疫原性であり、ＩｇＥ誘導を抑制する］
ＲＮＡベースのワクチンがアレルギーの誘導を抑制する可能性を検証するために、Ｐｈｌｐ５をコードする従来のＲＮＡ、またはＰｈｌＰ５をコードする自己複製ＲＮＡを用いて、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫性を付与した。ＲＮＡワクチンの有効性を算出するために、従来のＤＮＡワクチン（ｐＣＭＶ−Ｐ５）およびＰｈｌｐ５をコードする自己複製ＤＮＡワクチン（ｐＳｉｎ−Ｐ５）を同量用いて、対応する群に免疫性を付与した。１週間ごとのインターバルをおいて３回マウスに免疫性を付与し、２週間後、ミョウバンとの複合体とした組み換え体Ｐｈｌｐ５を２回注入して、感作させた。これは、アレルギー表現型を誘導するプロトコルとして知られており、高レベルのＩｇＥ、およびＴＨ２にバイアスされたサイトカインプロファイルを特徴とする。

図２Ａは、両方のＲＮＡワクチンが、自己複製ＤＮＡワクチンｐＳｉｎ−Ｐ５と同様の液性免疫反応を誘導することを示す。対照的に、従来のＤＮＡワクチンｐＣＭＶ−Ｐ５によって誘導された液性免疫反応は、他のワクチンよりも約１桁高い大きさであった。全てのワクチンタイプが、低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比によって特徴付けられるＴＨ１バイアスの血清学的プロファイルを示し、かつＲＢＬ放出アッセイによって測定される機能性あるＩｇＥの誘導を示さなかった（図３、グレーの棒グラフ）。

感作後、プレ免疫付与されていない対照群は、アレルギー感作を示す、高いＩｇＧ１レベルおよび高いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を有する完全にＴＨ２にバイアスされた血清を示した。対照的に、ワクチン接種された全群がＴＨ１調和型の免疫表現型を維持した（図２Ｂ）。両タイプのＲＮＡワクチンを用いたプレワクチン接種によって、対応するＤＮＡを用いた対照動物と同じ、またはよりよいＩｇＥ誘導の抑制が生じた（図３、黒棒グラフ）。全体的に見て、両タイプのＲＮＡワクチンを用いたプレワクチン接種によって、アレルギー感作に対するＩｇＥ誘導が９３％抑制された。

［ＲＮＡベースのワクチンがＴＨ１バイアスＴ細胞メモリを誘導］
最終感作の２週間後、組み換え型Ｐｈｌｐ５タンパク質を用いて脾細胞をインビトロにおいて再刺激し、それらのＴＨ１／ＴＨ２プロファイルを評価した。したがって、ＥＬＩＳＰＯＴを用いてＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−５分泌細胞の数を測定した。

核酸ワクチンによってプレワクチン接種された全ての接種群は、対照群に比べてＩＦＮ−γ分泌細胞の誘導が著しいことが示された（図４Ａ）。同時に、ＴＨ２型サイトカインＩＬ−４（図４Ｂ）およびＩＬ−５（図４Ｃ）を分泌する細胞数は抑制され、ＤＮＡワクチンと同様に、ＲＮＡワクチンがＴＨ１バイアス抗原特異的メモリを確立することができ、このＴＨ１バイアス抗原特異的メモリはその後のアレルゲン曝露によって再活性化され得ることが示された。

［ＲＮＡベースのワクチンがアレルゲン誘導性の肺炎症を軽減する］
ＲＮＡ接種が肺病理の誘導に及ぼす影響を検証するために、最終感作の２週間後に、１μｇの組み換え型Ｐｈｌｐ５を１日２回鼻腔内投与して、肺炎症を誘導した。当該プロトコルによって、感作されたマウスにおいて気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）内への白血球の浸潤が強く誘導された（図５Ａ、対照）。浸潤した白血球の約８０％が好酸球であった（図５Ｂ）。対照的に、プレワクチン接種されたマウスにおいて浸潤した白血球の全数は大幅に低減しており、好酸球に関してはさらに低減していた。

炎症性浸潤は、ＢＡＬＦ中のＩＬ−５の抑制の影響をも強く受けて、低減した（図６Ａ）。ＩＬ−５の抑制は、逆にＩＦＮ−γの誘導と相関した（図６Ｂ）。

（結論）
ＤＮＡワクチンは、アレルギー性疾患の予防および治療に有効である可能性が極めて高い。しかし、ＤＮＡワクチンにはリスクがあるのではという仮説があるので、この新型ワクチンを健康な成人または子供に対して臨床使用することは疑問視されている。

本実施例では、臨床的に関連性あるアレルゲンをもつネイキッドＲＮＡを接種することによって、このネイキッドＲＮＡと同量のＤＮＡワクチンが投与された場合と同程度にアレルギー誘導を抑制できることが初めて示された。

より多量のＲＮＡを製造するという問題に取り組むため、従来のＲＮＡをシンドビス・ウイルスのレプリコン由来の自己複製ＲＮＡと比較した。両タイプのＲＮＡを用いたインビトロ形質移入では、抗原の発現は、とりわけ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップのアナロゴン（ａｎａｌｏｇｏｎ）の付加に依存することがわかった。真核ｍＲＮＡの大半が５’末端において当該ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造を有することは周知であり、これは、翻訳開始因子の結合にとって重要であり、ｍＲＮＡ安定性に寄与する。加えて、同様の量の自己複製ＲＮＡから、７倍高いレベルのタンパク質が翻訳された（図１）。この結果は、それぞれの抗原をコードするサブゲノムＲＮＡの自己増殖に寄与する。この結果は、従来のＤＮＡワクチンよりもタンパク質の発現が低い自己複製ＤＮＡワクチンとは対照的に、形質移入された細胞におけるアポトーシスの誘導に寄与したという効果である。しかし、ＲＮＡワクチンの発現は一過性のものに過ぎず、そのため、自己複製ワクチンによって形質移入された直後にアポトーシスを起こす細胞と同等である。実際、自己複製ＲＮＡワクチンは、自己複製ＤＮＡワクチンと同様の液性免疫反応を誘発する（図２Ａ）が、従来のＤＮＡワクチンは、抗原を継続的に発現させるため、最も高い液性免疫反応を示す。

本実施例では従来のＲＮＡ／ＤＮＡワクチンの５分の１量の自己複製核酸ワクチンを使用したが、ミョウバン中における組み換え型アレルゲンを用いた次の感作後のＩｇＧ２ａの増加（図２Ｂ）、および再刺激された脾細胞のＴＨ１サイトカインプロファイル、ならびに高い抑制能力（図３）に示されたように、同様のＴＨ１メモリ誘導が観察された。したがって、ＲＮＡワクチンおよび自己複製ＤＮＡワクチンの両方が従来のＤＮＡワクチンよりも高い抑制能力を示す。ただし、後者は、より高いレベルの正常抗原、およびより高い液性免疫反応を誘導する。これは、長期間のアレルゲン分泌を誘発するワクチンが、ＲＮＡワクチンおよび自己複製ワクチンに見られる短期間のワクチン発現に比べて逆効果を招き得ることを示す。

また、ＲＮＡワクチン接種は、鼻腔内の誘発後の肺浸潤をＤＮＡワクチンと同程度低減させる（図５Ａ）。これは、ＢＡＬＦ中における好酸球の数の激減が主な原因である（図５Ｂ）。このことは、肺におけるＩＬ−５の低減（図６Ａ）、および中間レベルのＩＦＮ−γの誘導と相関しており（図２Ｂ）、ワクチンにより誘導されたＴＨ１細胞の産生が、肺におけるＴＨ１／ＴＨ２サイトカインバランスに影響を及ぼすことを示している。ウイルスモデルでは、肺におけるＩＦＮ−γは、喘息および肺病理に有害な影響を及ぼすが、これは、ＩＦＮ−γが肺上皮細胞を活性化させ、より多くのＴＨ２細胞を組織内に取り入れることによる間接的影響であると考えられる。実際、アレルギーモデルでは、ＴＨ２免疫を、より調和のとれたＴＨ１環境に再度方向付けることは、主にＩＬ−５およびＩＬ−１３を対抗制御することによって、肺浸潤および気道過敏症に好影響を及ぼす（Ford, J. G. et al. (2001) J Immunol 167:1769-1777）。

上記をまとめると、ＲＮＡベースワクチンは、アレルギー性感作に対する防御を強く誘発させることができ、自己複製ＲＮＡワクチンを使用することによって、低用量にて当該効果を得ることができる。ＲＮＡワクチンにおけるこの優れた安全なプロファイルを鑑みると、治療環境だけでなく、アレルギー性疾患を発症する可能性が高い健康な個体にもＲＮＡワクチンを使用できる可能性がある。

〔実施例２〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｂｅｔｖ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。３７℃にて１５分間、キャップした転写産物をＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ中に再縣濁した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｂｅｔｖ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換え体Ｂｅｔｖ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｂｅｔｖ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｂｅｔｖ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図７Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図７Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的ＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図７Ｃ）。

〔実施例３〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃａｒｂ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ中に再縣濁した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｒｂ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣａｒｂ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｃａｒｂ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｒｂ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図８Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図８Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図８Ｃ）。

〔実施例４〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃａｓｓ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ中に再縣濁した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｓｓ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣａｓｓ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｃａｓｓ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｓｓ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図９Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図９Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図９Ｃ）。

〔実施例５〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したように、Ｐｈｌｐ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を作製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌｐ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｐｈｌｐ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１０Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１０Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。

〔実施例６〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｐｈｌｐ６をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ中に再縣濁した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ６を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌｐ６を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定＞］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｐｈｌｐ６を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１１Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１１Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１１Ｃ）。

〔実施例７〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｏｒａ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ中にて再縣濁させた。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｏｒａ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｏｒａ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的な血清ＩｇＧ２ａを測定した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｏｒａ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１２Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１２Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１２Ｃ）。

〔実施例８〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したように、Ａｌｎｇ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ中にて再縣濁させた。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｎｇ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｌｎｇ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ａｌｎｇ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清をアレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｎｇ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１３）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。

〔実施例９〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｆａｇｓ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆａｇｓ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＦａｇｓ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｆａｇｓ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆａｇｓ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１４Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１４Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１４Ｃ）。

〔実施例１０〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｐｈｌｐ２をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ２を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌｐ２を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｐｈｌｐ２を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ２（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１５Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１５Ｂ）。

〔実施１１〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したように、Ｐｈｌｐ 7をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ７を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌｐ７を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ７（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１６Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１６Ｂ）。

〔実施例１２〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ２、Ｐｈｌｐ５、およびＰｈｌｐ６をコードするハイブリッドｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした（Linhart B. and Valenta R., Int Arch Allergy Immunol (2004) 134:324-331）。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（Ｐｈｌｐ１−２−５−６）を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ２、Ｐｈｌｐ５、およびＰｈｌｐ６を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型アレルゲンを用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（Ｐｈｌｐ１−２−５−６）（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１７Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１７Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１７Ｃ）。

〔実施例１３〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｒｙｊ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｒｙｊ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｒｙｊ１を２週間注入して、感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｃｒｙｊ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｒｙｊ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１８Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１８Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。

〔実施例１４〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｊｕｎａ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｊｕｎａ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＪｕｎａ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｊｕｎａ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｊｕｎａ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１９）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。

〔実施例１５〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｍｂａ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニング。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間培養し、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ中にて再縣濁させた。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｍｂａ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｍｂａ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ａｍｂａ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｍｂａ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図２０）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。

〔実施例１６〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｐｉｇ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間培養し、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ中にて再縣濁させた。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｐｉｇ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｐｉｇ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ａｐｉｇ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２１Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２１Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２１Ｃ）。

〔実施例１７〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｄａｕｃ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｄａｕｃ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＤａｕｃ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｄａｕｃ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２２Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２２Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。

〔実施例１８〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｍａｌｄ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｍａｌｄ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＭａｌｄ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｍａｌｄ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｍａｌｄ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２３Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２３Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２３Ｃ）。

〔実施例１９〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、ＯｖａをコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を作製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｖａを用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＯｖａを２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｏｖａを用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｖａ（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２４Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２４Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２４Ｃ）。

〔実施例２０〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、ベータ−カゼインをコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を生成し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ベータ−カゼインを用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えベータ−カゼインを２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型ベータ−カゼインを用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ベータ−カゼイン（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図２５Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２５Ｂ）。

〔実施例２１〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｙｐｃ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｙｐｃ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｙｐｃ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｙｐｃ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２６）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。

〔実施例２２〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｆｅｌｄ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆｅｌｄ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＦｅｌｄ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｆｅｌｄ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆｅｌｄ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２７Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２７Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。

〔実施例２３〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｄｅｒｐ２をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーＨ_２Ｏ中にて再縣濁させた。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｄｅｒｐ２を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＤｅｒｐ２を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｄｅｒｐ２（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１１Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２８Ｂ）。

〔実施例２４〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｌｔａ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｔａ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンを用いた１μｇの組み換えＡｌｔａ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ａｌｔａ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｔａ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２９Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２９Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２９Ｃ）。

〔実施例２５〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｌａｈ８をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｌａｈ８を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｌａｈ８を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｃｌａｈ８を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清をアレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｌａｈ８（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図３０Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図３０Ｂ）。

〔実施例２６〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｈｅｖｂ６をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｈｅｖｂ６を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＨｅｖｂ６を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｈｅｖｂ６を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｈｅｖｂ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図３１Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図３１Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図３１Ｃ）。

〔実施例２７〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、５つの異なるアレルゲンをコードするハイブリッドｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（Ａｌｎ−Ｃｏｒ−Ｑｕｅ−Ｃａｒ−Ｂｅｔ）を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換え型の全アレルゲンを２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（アレルゲン）（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図３２）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。

〔実施例２８〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｒａｈ２をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ_２Ｏ中にて再縣濁させた。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒａｈ２を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｒａｈ２を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、生体外にて７２時間、組み換え型Ａｒａｈ２を用いて脾細胞を再刺激し、ＩＦＮ−γに関して細胞培養上澄み液をアレルゲン特異的Ｔｈ１細胞活性の指標として分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒａｈ２（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図３３Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図３３Ｂ）。

〔実施例２９〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｑｕｅａ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｑｕｅａ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＱｕｅａ１を２週間注入して１週間後に感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｐｈｌｐ６を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｑｕｅａ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図３４Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図３４Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。

〔実施例３０〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｒｔｖ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒｔｖ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｒｔｖ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ａｒｔｖ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。

（結果）
ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒｔｖ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大がなく（図３５Ａ）、さらにＩＦＮ−γの分泌の増大がないこと（図３５Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増がなかった。

〔例３１〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｏｌｅｅ１をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。

［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｌｅｅ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＯｌｅｅ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。

（結果）
ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｌｅｅ１（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大がなく（図３６Ａ）、さらにＩＦＮ−γの分泌の増大がないこと（図３６Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増がなかった。さらに、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導の抑制を測定することができなかった（図３６Ｂ）。

β−ガラクトシダーゼをコードするＲＮＡ（βＧａｌ−ＲＮＡ）または自己複製ＲＮＡ（βＧａｌ−ｒｅｐＲＮＡ）転写産物を用いた、インビトロにおけるＢＨＫ２１細胞の形質移入を示す。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造を付加したＲＮＡ転写産物（キャップ）または当該構造を付加していないＲＮＡ転写産物（キャップなし）について試験した。形質移入していない細胞をバックグラウンド対照として使用した（形質移入されていない）。データは、３つの独立した形質移入実験の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。核酸ワクチン接種後のＰｈｌｐ５特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルを示す。血清は、１：１０００（図２Ａ）に希釈した。棒グラフの頂点上の数値は、各群におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２の平均比を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作を示す。血清は、１：１０００００（図２Ｂ）に希釈した。棒グラフの頂点上の数値は、各群におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２の平均比を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。ＲＢＬ放出アッセイによって測定されたＰｈｌｐ５特異的ＩｇＥを示す。ＩｇＥレベルは、各核酸ワクチンを用いたワクチン接種後（グレーの棒グラフ）、および、ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作（黒の棒グラフ）後に測定した。数値は、特定のヘキソサミニダーゼ放出の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌｐ５によるインビトロでの再刺激後のＩＦＮ−ガンマ（図４Ａ）の数を示す。データは、１０^６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌｐ５によるインビトロでの再刺激後のＩＬ−４（図４Ｂ）の数を示す。データは、１０^６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌｐ５によるインビトロでの再刺激後のＩＬ−５（図４Ｃ）の数を示す。データは、１０^６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおける全白血球数（図５Ａ）を示す。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおける好酸球数（図５Ｂ）を示す。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおけるＩＬ−５（図６Ａ）のレベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおけるＩＦＮ−γ（図６Ｂ）のレベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｂｅｔｖ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｂｅｔｖ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｂｅｔｖ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃａｒｂ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃａｒｂ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃａｒｂ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃａｓｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃａｓｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃａｓｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｏｒａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｌｎｇ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｆａｇｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｆａｇｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｆａｇｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ７によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｐｈｌｐ７によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｒｙｊ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｒｙｊ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｊｕｎａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｍｂａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｐｉｇ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｐｉｇ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｐｉｇ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｄａｕｃ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｄａｕｃ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｍａｌｄ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｍａｌｄ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｍａｌｄ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｂｅｔａ−ＣａｓｅｉｎによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｂｅｔａ−ＣａｓｅｉｎによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｙｐｃ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｆｅｌｄ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｆｅｌｄ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｄｅｒｐ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｄｅｒｐ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｌｔａ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｌｔａ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｌｔａ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｌａｈ８によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｌａｈ８によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｈｅｖｂ６によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｈｅｖｂ６によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（アレルゲン）によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｒａｈ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｒａｈ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｑｕｅａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｑｕｅａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｒｔｖ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ａｒｔｖ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｏｌｅｅ１によるＴｈ１メモリの誘導がない、またはＩｇＥ反応の抑制がないことを示す。ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｏｌｅｅ１によるＴｈ１メモリの誘導がない、またはＩｇＥ反応の抑制がないことを示す。

Claims

少なくとも１つのアレルゲンまたはその誘導体をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含むＲＮＡワクチンであって、当該アレルゲンが、アルヌス・グルチノーサ（Alnus glutinosa）、アルタナリア・アルタナータ（Alternaria alternata）、アンブローシア・アルテミシーフォリア（Ambrosia artemisiifolia）、アピウム・グラベオレンス（Apium graveolens）、アラキス・ハイポガエア（Arachis hypogaea）、ベツラ・ベルコーサ（Betula verrucosa）、カルピヌス・ベツルス（Carpinus betulus）、カスタネア・サチバ（Castanea sativa）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Cladosporium herbarum）、コリルス・アベラナ（Corylus avellana）、クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica）、カプリナス・カルピオ（Cyprinus carpio）、ダウクス・カロタ（Daucus carota）、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（Dermatophagoides pteronyssinus）、ファグス・シルバチカ（Fagus sylvatica）、フェリス・ドメスチカス（Felis domesticus）、ヘベア・ブラシリエンシス（Hevea brasiliensis）、ジュニペルス・アシュエイ（Juniperus ashei）、マルス・ドメスチカ（Malus domestica）、ケルクス・アルバ（Quercus alba）、およびフレウム・プラテンス（Phleum pratense）のアレルゲンである、ＲＮＡワクチン。
アルヌス・グルチノーサの上記アレルゲンは、Ａｌｎｇ１であり、アルタナリア・アルタナータの上記アレルゲンは、Ａｌｔａ１、Ａｌｔａ３、Ａｌｔａ４、Ａｌｔａ５、Ａｌｔａ６、Ａｌｔａ７、Ａｌｔａ８、Ａｌｔａ１０、Ａｌｔａ１２およびＡｌｔａ１３からなる群より選択され、アンブローシア・アルテミシーフォリアの上記アレルゲンは、Ａｍｂａ１、Ａｍｂａ２、Ａｍｂａ３、Ａｍｂａ５、Ａｍｂａ６、Ａｍｂａ７、Ａｍｂａ８、Ａｍｂａ９およびＡｍｂａ１０からなる群より選択され、アピウム・グラベオレンスの上記アレルゲンは、Ａｐｉｇ１、Ａｐｉｇ４およびＡｐｉｇ５からなる群より選択され、アラキス・ハイポガエアの上記アレルゲンは、Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２、Ａｒａｈ３、Ａｒａｈ４、Ａｒａｈ５、Ａｒａｈ６、Ａｒａｈ７およびＡｒａｈ８からなる群より選択され、ベツラ・ベルコーサの上記アレルゲンは、Ｂｅｔｖ１、Ｂｅｔｖ２、Ｂｅｔｖ３、Ｂｅｔｖ４、Ｂｅｔｖ６およびＢｅｔｖ７からなる群より選択され、カルピヌス・ベツルスの上記アレルゲンは、Ｃａｒｂ１であり、カスタネア・サチバの上記アレルゲンは、Ｃａｓｓ１、Ｃａｓｓ５およびＣａｓｓ８からなる群より選択され、クラドスポリウム・ヘルバルムの上記アレルゲンは、Ｃｌａｈ２、Ｃｌａｈ５、Ｃｌａｈ６、Ｃｌａｈ７、Ｃｌａｈ８、Ｃｌａｈ９、Ｃｌａｈ１０およびＣｌａｈ１２からなる群より選択され、コリルス・アベラナの上記アレルゲンは、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ２、Ｃｏｒａ８、Ｃｏｒａ９、Ｃｏｒａ１０およびＣｏｒａ１１からなる群より選択され、クリプトメリア・ジャポニカの上記アレルゲンは、Ｃｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２からなる群より選択され、カプリナス・カルピオの上記アレルゲンは、Ｃｙｐｃ１であり、ダウクス・カロタの上記アレルゲンは、Ｄａｕｃ１およびＤａｕｃ４からなる群から選択され、デルマトファゴイデス・プテロニシヌスの上記アレルゲンは、Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｐ２、Ｄｅｒｐ３、Ｄｅｒｐ４、Ｄｅｒｐ５、Ｄｅｒｐ６、Ｄｅｒｐ７、Ｄｅｒｐ８、Ｄｅｒｐ９、Ｄｅｒｐ１０、Ｄｅｒｐ１１、Ｄｅｒｐ１４、Ｄｅｒｐ２０、Ｄｅｒｐ２１およびＣｌｏｎｅ３０上記アレルゲンからなる群より選択され、ファグス・シルバチカの上記アレルゲンは、Ｆａｇｓ１であり、フェリス・ドメスチカスの上記アレルゲンは、Ｆｅｌｄ１、Ｆｅｌｄ２、Ｆｅｌｄ３、Ｆｅｌｄ４、Ｆｅｌｄ５ｗ、Ｆｅｌｄ６ｗおよびＦｅｌｄ７ｗからなる群より選択され、ヘベア・ブラシリエンシスの上記アレルゲンは、Ｈｅｖｂ１、Ｈｅｖｂ２、Ｈｅｖｂ３、Ｈｅｖｂ４、Ｈｅｖｂ５、Ｈｅｖｂ６．０１、Ｈｅｖｂ６．０２、Ｈｅｖｂ６．０３、Ｈｅｖｂ７．０１、Ｈｅｖｂ７．０２、Ｈｅｖｂ８、Ｈｅｖｂ９、Ｈｅｖｂ１０、Ｈｅｖｂ１１、Ｈｅｖｂ１２およびＨｅｖｂ１３からなる群より選択され、ジュニペルス・アシュエイの上記アレルゲンは、Ｊｕｎａ１、Ｊｕｎａ２およびＪｕｎａ３からなる群より選択され、マルス・ドメスチカの上記アレルゲンは、Ｍａｌｄ１、Ｍａｌｄ２、Ｍａｌｄ３およびＭａｌｄ４からなる群より選択され、ケルクス・アルバの上記アレルゲンは、Ｑｕｅａ１であり、ならびに、フレウム・プラテンスの上記アレルゲンは、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ２、Ｐｈｌｐ４、Ｐｈｌｐ５、Ｐｈｌｐ６、Ｐｈｌｐ７、Ｐｈｌｐ１１、Ｐｈｌｐ１２およびＰｈｌｐ１３からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
上記アレルゲンは、Ａｌｎｇ１、Ａｌｔａ１、Ａｍｂａ１、Ａｐｉｇ１、Ａｒａｈ２、Ｂｅｔｖ１、ベータ−カゼイン、Ｃａｒｂ１、Ｃａｓｓ１、Ｃｌａｈ８、Ｃｏｒａ１、Ｃｒｙｊ１、Ｃｙｐｃ１、Ｄａｕｃ１、Ｄｅｒｐ２、Ｆａｇｓ１、Ｆｅｌｄ１、Ｈｅｖｂ６、Ｊｕｎａ１、Ｍａｌｄ１、オボアルブミン（ＯＶＡ）、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ２、Ｐｈｌｐ５、Ｐｈｌｐ６およびＰｈｌｐ７からなる群より選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のワクチン。
上記ＲＮＡ分子が、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ２、Ｐｈｌｐ５およびＰｈｌｐ６、またはＡｌｎｇ１、Ｃｏｒａ１、Ｑｕｅａ１、Ｃａｒｂ１およびＢｅｔｖ１をコードすることを特徴とする請求項１または２に記載のワクチン。
上記アレルゲンの誘導体が低アレルギー性であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン。
上記低アレルギー性のアレルゲン誘導体のＩｇＥ反応性が、野生型アレルゲンのＩｇＥ反応性よりも、１０％以上、好適には２０％以上、より好適には３０％以上、特に５０％以上低いことを特徴とする請求項５に記載のワクチン。
上記アレルゲンまたはその誘導体をコードする上記ＲＮＡ分子が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのさらなる分子に結合されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン。
上記ＲＮＡ分子が、レプリカーゼ、β−グロビンリーダー配列、ｃａｐ０、ｃａｐ１およびポリＡテールからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる要素を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
上記ワクチンが、好適にはＣｐＧ−ＤＮＡおよびサイトカインからなる群より選択されるアジュバントをさらに含み、上記サイトカインは好適にはＩＬ−１２およびＩＬ−１５であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
上記ワクチンが、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与、局所性投与、または微粒子銃投与に適用されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン。
アレルギーの治療用または予防用のワクチンを製造するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載された少なくとも１つのＲＮＡ分子の、使用。
アレルゲンに対する個体の除感作のための予防的かつ治療的なワクチンを製造するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載された少なくとも１つのＲＮＡ分子の、使用。
上記ワクチンが、好適にはＣｐＧ−ＤＮＡおよびサイトカインからなる群より選択されるアジュバントをさらに含み、上記サイトカインは好適にはＩＬ−１２およびＩＬ−１５であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の使用。
上記ワクチンが、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与、局所性投与または微粒子銃投与に適用されることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
請求項１〜８のいずれか１項に記載された少なくとも１つのアレルゲンまたはその誘導体をコードする少なくとも１つの塩基配列を含む、単離されたＲＮＡ分子。