JP2010229440A - Water dispersible metal nanoparticles - Google Patents
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Abstract
【課題】ナノサイズの粒子径を有し、粒子径分布が小さく、かつ、水分散性に優れる水分散性金属ナノ粒子を提供する。
【解決手段】粒子径２〜１００ｎｍの金属ナノ粒子の表面に、極性官能基を有する親水性表面修飾剤が結合した構造を有する水分散性金属ナノ粒子。
【選択図】 図１
A water-dispersible metal nanoparticle having a nano-sized particle diameter, a small particle diameter distribution, and excellent water dispersibility is provided.
A water-dispersible metal nanoparticle having a structure in which a hydrophilic surface modifier having a polar functional group is bonded to the surface of a metal nanoparticle having a particle diameter of 2 to 100 nm.
[Selection] Figure 1
Description
本発明は、ナノメートルサイズの粒子径を有し、粒子径分布が小さく、かつ、水分散性に優れる水分散性金属ナノ粒子に関する。 The present invention relates to water dispersible metal nanoparticles having a nanometer size particle diameter, a small particle size distribution, and excellent water dispersibility.
粒子径が数〜数十ナノメートル程度の微細無機粒子（以下、ナノ粒子と呼ぶ）は、粒子径が数百ｎｍ以上の粒子に比べて活性度及び反応性が飛躍的に向上し、電気的、磁気的、光学的、機械的特性が大きく変化するため、印刷材料、電子材料、化粧品材料、食品材料、医薬品材料等の分野に応用するため多くの合成方法が提案・開発されてきている。しかしながら、合成された微細粒子やナノ粒子を回収する方法、そして回収後も凝集等させることなく微粒子のまま分散安定化させておく方法が必要とされている。 Fine inorganic particles (hereinafter referred to as “nanoparticles”) having a particle size of several to several tens of nanometers have significantly improved activity and reactivity compared to particles having a particle size of several hundreds of nanometers or more. Since magnetic, optical, and mechanical properties change greatly, many synthesis methods have been proposed and developed for application in fields such as printing materials, electronic materials, cosmetic materials, food materials, and pharmaceutical materials. However, there is a need for a method for recovering the synthesized fine particles and nanoparticles, and a method for stabilizing the dispersion as fine particles without aggregation after the recovery.
ナノ粒子は、多くの場合、コロイド化学的合成法により合成され、その表面は、一般的に界面活性剤及び／又は表面修飾剤で被覆されて安定化されている。粒子径分布が狭いナノ粒子を得るための合成法は限定されており、これらのプロセス上の制約から得られるナノ粒子の表面は疎水基をもつ分子に保護されて親油性となる場合が多い。このようなナノ粒子は、プラスチックや油溶媒に分散するには都合が良い。しかし、一方で、表面が疎水性であると、水系溶媒に対する分散安定性に劣り、水系溶媒中での使用に制限があり、また、タンパク質、ウイルス、核酸等の生体関連物質との反応性が低下するという問題があった。そのため、ナノ粒子の表面を親水化することが望まれていた。 Nanoparticles are often synthesized by colloidal chemical synthesis methods, and their surfaces are generally coated and stabilized with surfactants and / or surface modifiers. Synthesis methods for obtaining nanoparticles having a narrow particle size distribution are limited, and the surface of the nanoparticles obtained from these process restrictions is often protected by molecules having hydrophobic groups to become lipophilic. Such nanoparticles are convenient for dispersing in plastics and oil solvents. However, on the other hand, if the surface is hydrophobic, it is inferior in dispersion stability in an aqueous solvent, limited in use in an aqueous solvent, and reactive with biological materials such as proteins, viruses, and nucleic acids. There was a problem of lowering. Therefore, it has been desired to make the surfaces of the nanoparticles hydrophilic.
近年、半導体ナノ粒子については、種々の親水化ナノ粒子が報告されている。
例えば、特許文献１には、親水性ナノ粒子の製造方法として、（１）金属化合物と５Ｂ族又は６Ｂ族原子の供給源である液体化合物を混合し、不均一系で２０〜４０℃の温度条件下で反応させて、ナノ粒子を得る工程、及び（２）前記工程（１）で得られたナノ粒子の表面を、メルカプト基及び／又はセレノメルカプト基を有する親水性化合物を用いてコーティングする工程、を含む方法が開示されている。この方法は、粒子径分布が均一に揃った親水性のナノ粒子を得ることができる。しかしながら、金属化合物と５Ｂ族又は６Ｂ族原子が難水溶性塩を形成することを利用していることから、コアとなる粒子は、半導体ナノ粒子に限られる。
In recent years, various hydrophilized nanoparticles have been reported for semiconductor nanoparticles.
For example, in Patent Document 1, as a method for producing hydrophilic nanoparticles, (1) a metal compound and a liquid compound that is a source of a group 5B or group 6B atom are mixed, and the temperature is 20 to 40 ° C. in a heterogeneous system. (2) The surface of the nanoparticles obtained in the step (1) is coated with a hydrophilic compound having a mercapto group and / or a selenomercapto group. A method including the steps is disclosed. With this method, hydrophilic nanoparticles having a uniform particle size distribution can be obtained. However, since the metal compound and the group 5B or 6B group form a sparingly water-soluble salt, the core particles are limited to semiconductor nanoparticles.
これに対して、金属ナノ粒子については、凝集を防ぎつつ親水化する適切な手段が殆どなく、粒子径分布が小さく、凝集することなく高濃度で水分散可能な金属ナノ粒子は、作製することができなかった。 On the other hand, for metal nanoparticles, there is almost no appropriate means to make them hydrophilic while preventing aggregation, and metal nanoparticles that have a small particle size distribution and can be dispersed in water at high concentrations without aggregation should be prepared. I could not.
例えば、特許文献２には、貴金属の原料微粒子の表面を、表面処理剤で被覆した貴金属微粒子であって、平均粒子径が２００ｎｍ未満、ＢＥＴ比表面積が１．０ｍ２／ｇ以上で、かつ原料微粒子と表面処理剤との総重量に対する、表面処理剤の重量で表される表面処理剤の被覆率が１〜１５重量％であることを特徴とする貴金属微粒子が開示されている。これは、種々の溶剤や樹脂に対する高い親和性を有する貴金属ナノ粒子を与える。当該ナノ粒子は、原料貴金属微粒子の表面に表面処理剤が吸着したものである。当該方法は、水相合成された貴金属ナノ粒子を親油性のものに転換することができる。しかしながら、新油性に転換される前に凝集が進むため、粒子がひとつひとつ独立して分散するという状態ではない。 For example, Patent Document 2 discloses noble metal fine particles obtained by coating the surface of noble metal raw material fine particles with a surface treatment agent, having an average particle diameter of less than 200 nm, a BET specific surface area of 1.0 m 2 / g or more, and raw material fine particles. Noble metal fine particles characterized in that the coverage of the surface treatment agent represented by the weight of the surface treatment agent with respect to the total weight of the surface treatment agent and the surface treatment agent is 1 to 15% by weight. This gives noble metal nanoparticles with high affinity for various solvents and resins. The nanoparticles are obtained by adsorbing a surface treatment agent on the surface of the raw material noble metal fine particles. The method can convert aqueous phase synthesized noble metal nanoparticles into lipophilic ones. However, since the agglomeration proceeds before the oil is converted to the new oil, the particles are not dispersed individually.
特許文献３では、銀ナノ粒子を製造する方法であって、（１）アミン化合物、（２）銀塩及び（３）カルボキシル基を有する多環式炭化水素化合物を含む出発原料を熱処理する工程を含むことを特徴とする製造方法が開示されている。当該方法は、水相合成された貴金属ナノ粒子を親油性を示す状態で分散安定化するものである。実施例にあるように、粒子径が綺麗に揃った高濃度の油性分散液とすることができる。しかしながら、当該ナノ粒子は、表面が疎水性であり、水系溶媒に対する分散安定性に劣り、水系溶媒中での使用に制限がある。 In patent document 3, it is a method for producing silver nanoparticles, and includes a step of heat-treating a starting material containing (1) an amine compound, (2) a silver salt, and (3) a polycyclic hydrocarbon compound having a carboxyl group. The manufacturing method characterized by including is disclosed. In this method, the aqueous phase synthesized noble metal nanoparticles are dispersed and stabilized in a state of lipophilicity. As in the examples, it is possible to obtain a high-concentration oil-based dispersion liquid having a uniform particle size. However, the nanoparticle has a hydrophobic surface, is inferior in dispersion stability in an aqueous solvent, and is limited in use in an aqueous solvent.
特許文献４には、ナノクリスタルからなるコア部と、該コア部の周囲が前記ナノクリスタル粒子と結合する結合部を有する表面修飾部とガラス状態を形成する物質を基体とする絶縁シェル部を有する物質からなり、前記コア部の周囲が前記ナノクリスタルの結合欠陥と結合する結合部を有する表面修飾部とガラス状態を形成する物質を基体とする絶縁シェル部を有する物質により表面を被覆するように形成されたことを特徴とする複合ナノ粒子が開示されている。当該ナノ粒子は、親水性を示すと考えられるが、コア粒子は半導体結晶に限られている。コア粒子が金属にできたとしても、表面がガラス招待のシェルに覆われているため、当該ナノ粒子には、金属としての電気化学的性質が期待できない。 Patent Document 4 has a core portion made of nanocrystals, a surface modifying portion having a binding portion around which the core portion is bonded to the nanocrystal particles, and an insulating shell portion based on a substance that forms a glass state. The surface of the core portion is covered with a material having a surface modifying portion having a bonding portion that binds to a bonding defect of the nanocrystal and an insulating shell portion based on a material that forms a glass state. Composite nanoparticles characterized by being formed are disclosed. The nanoparticles are considered to be hydrophilic, but the core particles are limited to semiconductor crystals. Even if the core particle is made of metal, the nanoparticle cannot be expected to have electrochemical properties as a metal because the surface is covered with a glass invitation shell.
特許文献５には、ポリビニル−２−ピロリドンにより保護された金属ナノ粒子の作製方法が開示されている。この方法は、ポリマーで保護されるために、ナノ粒子が数倍の大きさになってしまい、本来の金属ナノ粒子のサイズでなくなり、サイズが支配的な現象を用いた応用に支障が出る。例えば、ドラッグデリバリーや抗体標識といった用途がそうである。 Patent Document 5 discloses a method for producing metal nanoparticles protected with polyvinyl-2-pyrrolidone. Since this method is protected by the polymer, the nanoparticle becomes several times larger than the original size of the metal nanoparticle, which hinders an application using a phenomenon in which the size is dominant. For example, such applications as drug delivery and antibody labeling.
本発明は、ナノメートルサイズの粒子径を有し、粒子径分布が小さく、かつ、水分散性に優れる水分散性金属ナノ粒子を提供することを目的とする。特に、粒子径が１０ナノメートル以下のシングルナノサイズの水分散性金属ナノ粒子を提供する。 An object of the present invention is to provide water-dispersible metal nanoparticles having a particle size of nanometer size, a small particle size distribution, and excellent water dispersibility. In particular, the present invention provides single nano-sized water-dispersible metal nanoparticles having a particle size of 10 nanometers or less.
本発明は、粒子径２〜５０ｎｍの金属ナノ粒子の表面に、極性官能基を有する親水性表面修飾剤が結合した構造を有する水分散性金属ナノ粒子である。
以下に本発明を詳述する。
The present invention is a water-dispersible metal nanoparticle having a structure in which a hydrophilic surface modifier having a polar functional group is bonded to the surface of a metal nanoparticle having a particle diameter of 2 to 50 nm.
The present invention is described in detail below.
本発明の水分散性金属ナノ粒子は、金属ナノ粒子の金属表面に親水性表面修飾剤が結合した構造を有する。図１に、本発明の水分散性金属ナノ粒子の一例を表す模式図を示した。 The water-dispersible metal nanoparticles of the present invention have a structure in which a hydrophilic surface modifier is bonded to the metal surface of the metal nanoparticles. In FIG. 1, the schematic diagram showing an example of the water dispersible metal nanoparticle of this invention was shown.
上記金属は、例えば、Ａｇ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｃｕ、これらの合金等が挙げられる。これらの金属は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。また、２種以上の金属を併用する場合には、異なる金属が多層に積層されていてもよい。 Examples of the metal include Ag, Pd, Ni, Cu, and alloys thereof. These metals may be used independently and may use 2 or more types together. Moreover, when using 2 or more types of metals together, a different metal may be laminated | stacked on the multilayer.
上記金属ナノ粒子の粒子径の下限は２ｎｍ、上限は５０ｎｍである。
上記金属ナノ粒子の粒子径が２ｎｍ未満であると、金属原子数が極端に少なくなり、金属性を失ってしまう。上記金属ナノ粒子の粒子径の好ましい下限は４ｎｍである。
上記金金属ナノ粒子の粒子径が５０ｎｍを超えると、比重が重くなるために、重力の影響下では沈降しやすくなる。上記金属ナノ粒子の粒子径の好ましい上限は２０ｎｍである。
The lower limit of the particle diameter of the metal nanoparticles is 2 nm, and the upper limit is 50 nm.
When the particle diameter of the metal nanoparticles is less than 2 nm, the number of metal atoms is extremely reduced and the metallic property is lost. A preferred lower limit of the particle diameter of the metal nanoparticles is 4 nm.
When the particle diameter of the gold metal nanoparticles exceeds 50 nm, the specific gravity becomes heavy, so that the gold metal nanoparticles tend to settle under the influence of gravity. The upper limit with a preferable particle diameter of the said metal nanoparticle is 20 nm.
上記金属ナノ粒子の形状は特に限定されず、例えば、球状、棒状、板状、薄膜上、繊維状、立方体、放射状体、チューブ状、トーラス状等が挙げられる。なかでも球状が好適である。 The shape of the metal nanoparticles is not particularly limited, and examples thereof include a spherical shape, a rod shape, a plate shape, a thin film, a fiber shape, a cube shape, a radial shape, a tube shape, and a torus shape. Of these, spherical shapes are preferred.
上記金属ナノ粒子は、コア微粒子の表面に金属層が形成されたコアシェル型金属ナノ粒子であってもよい。
上記コア微粒子としては、例えば、樹脂からなる樹脂微粒子、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２等の金属酸化物からなる金属酸化物粒子、ガラス微粒子、セラミック微粒子、ダイヤモンド等の炭素材料からなる炭素微粒子等が挙げられる。
The metal nanoparticles may be core-shell type metal nanoparticles in which a metal layer is formed on the surface of the core fine particles.
Examples of the core fine particles include resin fine particles made of a resin, metal oxide particles made of a metal oxide such as SiO 2 and TiO 2 , glass fine particles, ceramic fine particles, and carbon fine particles made of a carbon material such as diamond. .
一般に、粒子径分布が小さい金属ナノ粒子は、従来公知のコロイド化学的な方法、例えば、逆ミセル法により製造することができる。ただし、従来公知の方法により製造した金属ナノ粒子は、表面が疎水性の親油性金属ナノ粒子となっている。
本発明の水分散性金属ナノ粒子は、前記親油性金属ナノ粒子の表面の疎水性修飾剤を後述する方法によって親水性表面修飾剤に置換することによって得られる。
In general, metal nanoparticles having a small particle size distribution can be produced by a conventionally known colloid chemical method, for example, a reverse micelle method. However, the metal nanoparticles produced by a conventionally known method are lipophilic metal nanoparticles having a hydrophobic surface.
The water-dispersible metal nanoparticles of the present invention can be obtained by replacing the hydrophobic modifier on the surface of the lipophilic metal nanoparticles with a hydrophilic surface modifier by the method described later.
上記親水性表面修飾剤は、上記金属ナノ粒子の金属表面に結合され、本発明の水分散性金属ナノ粒子に優れた水分散性を付与する役割を有する。上記金属表面に結合した親水性表面修飾剤の極性官能基のために、本発明の水分散性金属ナノ粒子の表面と液相（水相）との間に電荷分離が起こり、電気二重層が形成され電位差が生じる。このため、水分散性金属ナノ粒子に静電的な反発が働き、互いに凝集することなく、水相中に安定して分散する。 The hydrophilic surface modifier is bonded to the metal surface of the metal nanoparticles and has a role of imparting excellent water dispersibility to the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention. Due to the polar functional group of the hydrophilic surface modifier bonded to the metal surface, charge separation occurs between the surface of the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention and the liquid phase (water phase), and the electric double layer is The potential difference is formed. For this reason, electrostatic repulsion acts on the water-dispersible metal nanoparticles, and they are stably dispersed in the water phase without aggregating with each other.
上記親水性表面修飾剤は、水分散性を付与するための極性官能基と、上記金属ナノ粒子の金属表面に結合するための金属と結合を形成可能な官能基（本発明の水分散性金属ナノ粒子においては、上記金属ナノ粒子の金属表面に結合して結合部を形成する）とを有する。上記親水性表面修飾剤は、上記金属と結合を形成可能な官能基を２以上有していてもよく、また、上記極性官能基を２以上有していてもよい。 The hydrophilic surface modifier includes a polar functional group for imparting water dispersibility and a functional group capable of forming a bond with a metal for binding to the metal surface of the metal nanoparticles (the water dispersible metal of the present invention). The nanoparticle has a bonding part by binding to the metal surface of the metal nanoparticle). The hydrophilic surface modifier may have two or more functional groups capable of forming a bond with the metal, and may have two or more polar functional groups.
本明細書において極性官能基とは、分子内で電荷分布に偏りがあり、水やエタノールといった極性溶媒と相互作用して、よく溶媒和する官能基を意味する。
上記極性官能基は、例えば、カルボキシル基又はその塩、水酸基、アミノ基、シアノ基、スルホン基、アミド基、イミド基又はその塩、硫酸エステル基又はその塩等、またこれらの官能基を含む糖、ペプチド等が挙げられる。具体的には、例えば、−ＮＲ２、−ＮＲ’Ｒ、−ＮＨＲ、−ＮＨ２等のアミノ基や、−ＣＲ”Ｒ’Ｒ、−ＣＲ’２Ｒ、−ＣＲ３、−ＣＨＲ２、−ＣＨＲ’Ｒ、−ＣＨ２Ｒ、−ＣＨ３、−ＳＲ、−ＳＨが挙げられる。なお、上記Ｒ”、Ｒ’、Ｒは側鎖を示す。
In the present specification, the polar functional group means a functional group that has a biased charge distribution in the molecule and interacts with a polar solvent such as water or ethanol to solvate well.
Examples of the polar functional group include a carboxyl group or a salt thereof, a hydroxyl group, an amino group, a cyano group, a sulfone group, an amide group, an imide group or a salt thereof, a sulfate ester group or a salt thereof, and a sugar containing these functional groups. , Peptides and the like. Specifically, for example, an amino group such as —NR 2 , —NR′R, —NHR, —NH 2, or —CR ″ R′R, —CR ′ 2 R, —CR 3 , —CHR 2 , — CHR′R, —CH 2 R, —CH 3 , —SR, —SH may be mentioned. The above R ″, R ′, and R represent side chains.
上記極性官能基は、なかでも、弱酸性条件下及び／又は塩基性条件下でイオン化する極性官能基が好適であり、弱酸性条件下及び塩基性条件下でイオン化する極性官能基がより好適である。弱酸性と塩基性とのいずれの条件下でもイオン化する極性官能基を有することにより、得られる本発明の水分散性金属ナノ粒子は、弱酸性と塩基性とのいずれの条件下でも安定して分散することができる。
このような極性官能基は、例えば、カルボキシル基又はその塩、水酸基、アミノ基、シアノ基、スルホン基、アミド基、イミド基又はその塩、硫酸エステル基又はその塩等、これらの官能基を含む糖、ペプチド等が挙げられる。
Among these polar functional groups, polar functional groups that ionize under weakly acidic conditions and / or basic conditions are preferred, and polar functional groups that ionize under weakly acidic conditions and basic conditions are more preferred. is there. By having a polar functional group that ionizes under both weakly acidic and basic conditions, the resulting water-dispersible metal nanoparticles of the present invention are stable under both weakly acidic and basic conditions. Can be dispersed.
Such polar functional groups include, for example, carboxyl groups or salts thereof, hydroxyl groups, amino groups, cyano groups, sulfone groups, amide groups, imide groups or salts thereof, sulfate ester groups or salts thereof, and the like. Examples include sugars and peptides.
本明細書において金属と結合を形成可能な官能基とは、金属に対して直接に配位結合、水素結合、イオン結合、共有結合等可能な官能基を意味する。
本明細書において金属と結合を形成可能な官能基は、特に限定されないが、なかでも金属と配位結合または共有結合を形成可能な官能基が好適である。
In this specification, the functional group capable of forming a bond with a metal means a functional group capable of directly forming a coordinate bond, a hydrogen bond, an ionic bond, a covalent bond or the like to the metal.
In this specification, the functional group capable of forming a bond with a metal is not particularly limited, and among them, a functional group capable of forming a coordinate bond or a covalent bond with a metal is preferable.
例えば、チオール基、カルボキシル基、アミノ基等が挙げられる。なかでもチオール基が好適である。上記チオール基は、含有されるＳ原子が金属に配位することができる。また、上記共有結合可能な反応性官能基は、触媒の存在下において上記金属の表面に存在する水素基とヒドロシリル化反応を行うことにより、金属に配位することができる。上記共有結合可能な反応性官能基は、例えば、炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）、アジ基（−Ｎ３）等が挙げられる。 For example, a thiol group, a carboxyl group, an amino group, etc. are mentioned. Of these, a thiol group is preferred. In the thiol group, the contained S atom can be coordinated to the metal. Further, the reactive functional group capable of covalent bonding can be coordinated to the metal by performing a hydrosilylation reaction with a hydrogen group present on the surface of the metal in the presence of a catalyst. Examples of the reactive functional group capable of covalent bonding include a carbon-carbon double bond (C═C), an azide group (—N 3 ), and the like.
上記チオール基を有する親水性表面修飾剤は、例えば、２−メルカプトエタノール、４−メルカプト−１−ブタノール、３−メルカプト−２−ブタノール、１−メルカプト−２−プロパノール、３−メルカプト−１−プロパノール、３−メルカプトプロピオン酸、メルカプトコハク酸（ｍｅｒｃａｐｔｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、チオグリコール酸、カプトプリル、１−チオグリコール、チオ乳酸、２−メルカプトエタンスルホン酸、３−メルカプトイソブチル酸、３−メルカプト安息香酸、２−メルカプトベンゾイルアルコール、２−メルカプトニコチン酸、６−メルカプトニコチン酸、２−メルカプトフェノール、３−メルカプトフェノール、４−メルカプトフェノール、チオリンゴ酸、２−アミノエタンチオール等が挙げられる。なお、カプトプリルの構造式を下記に示した。 Examples of the hydrophilic surface modifier having a thiol group include 2-mercaptoethanol, 4-mercapto-1-butanol, 3-mercapto-2-butanol, 1-mercapto-2-propanol, and 3-mercapto-1-propanol. , 3-mercaptopropionic acid, mercaptosuccinic acid, thioglycolic acid, captopril, 1-thioglycol, thiolactic acid, 2-mercaptoethanesulfonic acid, 3-mercaptoisobutyric acid, 3-mercaptobenzoic acid, 2- Examples include mercaptobenzoyl alcohol, 2-mercaptonicotinic acid, 6-mercaptonicotinic acid, 2-mercaptophenol, 3-mercaptophenol, 4-mercaptophenol, thiomalic acid, 2-aminoethanethiol, and the like.The structural formula of captopril is shown below.
上記共有結合可能な反応性官能基を有する親水性表面修飾剤は、例えば、下記一般式（１）で表される末端に炭素−炭素二重結合を有する官能基を有する化合物が挙げられる。
Ｈ２Ｃ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎ−１−Ｘ （１）
式（１）中、Ｘは、親水部を示し、ｎは、正の整数を示す。
Examples of the hydrophilic surface modifier having a reactive functional group capable of covalent bonding include a compound having a functional group having a carbon-carbon double bond at the terminal represented by the following general formula (1).
H 2 C = CH- (CH2) n-1 -X (1)
In formula (1), X represents a hydrophilic part, and n represents a positive integer.
上記親水性表面修飾剤は、重量平均分子量が３００以下であることが好ましい。なかでも１０原子以上の炭素−炭素の連続結合を含有しない化合物であることが好ましい。 The hydrophilic surface modifier preferably has a weight average molecular weight of 300 or less. Among these, a compound that does not contain a continuous carbon-carbon bond of 10 atoms or more is preferable.
上記親水性表面修飾剤は、前記結合部と極性官能基とを結ぶリンク部を構成する原子リンク数が１０以下であることが好ましい。ここで、原子リンク数とは、最も短いパスに含まれる原子の数としている。前記結合部と極性官能基とを結ぶリンク部構成する原子リンク数が１０より大きくなると、疎水性ドメインが無視できなくなり、分散安定性に影響する。原子リンク数が１０以下の結合部と親水部としては、例えば、直鎖状、分岐状又は環状構造が挙げられる。 In the hydrophilic surface modifier, the number of atomic links constituting the link portion connecting the binding portion and the polar functional group is preferably 10 or less. Here, the number of atomic links is the number of atoms included in the shortest path. If the number of atomic links constituting the link portion connecting the binding portion and the polar functional group is larger than 10, the hydrophobic domain cannot be ignored, and the dispersion stability is affected. Examples of the bond portion and the hydrophilic portion having 10 or less atomic links include a linear, branched, or cyclic structure.
上記親水性表面修飾剤は、上記金属と結合を形成可能な官能基を介して上記金属ナノ粒子の表面に結合している。上記親水性表面修飾剤は、上記金属ナノ粒子の表面の一部又は全部を取り囲むようにして結合していることが好ましい。
上記親水性表面修飾剤による上記金属ナノ粒子の被覆率としては、少なくとも本発明の水分散性金属ナノ粒子が水相中で安定して分散可能である程度であれば特に限定されないが、被覆率は５０パーセント以上であることが望ましい。被覆率が高まることによりより分散安定性が向上する。修飾の度合いによっては、凝集状態を制御し、所望の大きさの２次粒子を形成させる効果を発揮することもある。
The hydrophilic surface modifier is bonded to the surface of the metal nanoparticles through a functional group capable of forming a bond with the metal. The hydrophilic surface modifier is preferably bonded so as to surround a part or all of the surface of the metal nanoparticles.
The coverage of the metal nanoparticles with the hydrophilic surface modifier is not particularly limited as long as at least the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention can be stably dispersed in an aqueous phase. It is desirable to be 50 percent or more. The dispersion stability is further improved by increasing the coverage. Depending on the degree of modification, the effect of controlling the aggregated state and forming secondary particles of a desired size may be exhibited.
本発明の水分散性金属ナノ粒子は、本発明の目的を損なわない範囲であれば、金属表面の一部が化学的又は物理的に修飾されたものであってもよく、また、界面活性剤、分散安定剤又は酸化防止剤等の添加剤を加えたものであってもよい。 As long as the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention are within a range that does not impair the object of the present invention, a part of the metal surface may be chemically or physically modified. In addition, an additive such as a dispersion stabilizer or an antioxidant may be added.
本発明の水分散性金属ナノ粒子の製造方法は、例えば、従来公知のコロイド化学的な方法、例えば、逆ミセル法により製造した表面が疎水性の金属ナノ粒子を原料として、以下の２つの方法により水分散性を付与する方法等が挙げられる。
第１の方法は、表面が疎水性の金属ナノ粒子を、トルエンやテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の有機溶媒に溶解した後、該溶液を８５℃に加温し、そこにエタノールに溶解させた上記親水性表面修飾剤を滴下させながら１２時間程度還流させる方法である（以下、「還流法」と呼ぶ。）。上記還流法は、上記金属と結合を形成可能な官能基と金属との親和力の違いを利用して、還流により金属表面に結合した分子の置換を進める方法である。
第２の方法は、表面が疎水性の金属微粒子の分散液と、上記親水性表面修飾剤を少量の両親媒性溶媒に溶解させた溶液とをピンチコックされたキャピラリー流路に通液する方法である（以下、「流通法」ともいう。）。上記流通法は、ピンチコックされたキャピラリー流路通過時にかかる高せん断力を利用して金属表面に結合した分子を常温のまま引き剥がし、露出した金属表面に上記親水性表面修飾剤を結合させて、表面結合分子の置換を進める方法である。上記流通法において、上記ピンチコックされたキャピラリー流路の最も狭い部分の幅が５０ｎｍ未満であって、分散液が通過する際のマイクロ流路内の圧力を１０ＭＰａ以上とすることが好ましい。また、上記ピンチコックされたキャピラリー流路は、圧力に応答して流路幅を０ｍｍを超えて５０ｎｍ未満の範囲で自動的に調整する機構を有することが好ましい。
The method for producing water-dispersible metal nanoparticles of the present invention includes, for example, the following two methods using a conventionally known colloid chemical method, for example, a metal nanoparticle having a hydrophobic surface produced by a reverse micelle method as a raw material. And a method for imparting water dispersibility.
In the first method, after the metal nanoparticles having a hydrophobic surface are dissolved in an organic solvent such as toluene or tetrahydrofuran (THF), the solution is heated to 85 ° C. and dissolved in ethanol therein. This is a method of refluxing for about 12 hours while dripping the functional surface modifier (hereinafter referred to as “reflux method”). The reflux method is a method of proceeding substitution of molecules bound to the metal surface by reflux using the difference in affinity between the metal and the functional group capable of forming a bond with the metal.
The second method is a method in which a dispersion of fine metal particles having a hydrophobic surface and a solution obtained by dissolving the hydrophilic surface modifier in a small amount of an amphiphilic solvent are passed through a pinch-cocked capillary channel. (Hereinafter also referred to as the “Distribution Law”). The flow method uses a high shear force applied when passing through a pinch-cocked capillary channel to peel off molecules bound to the metal surface at room temperature, and binds the hydrophilic surface modifier to the exposed metal surface. This is a method of proceeding with substitution of surface-bound molecules. In the above flow method, it is preferable that the narrowest portion of the pinched-capillary capillary channel has a width of less than 50 nm, and the pressure in the microchannel when the dispersion liquid passes is 10 MPa or more. In addition, the pinched cocked capillary channel preferably has a mechanism that automatically adjusts the channel width in the range of more than 0 mm and less than 50 nm in response to pressure.
本発明の水分散性金属ナノ粒子の表面に分子認識物質が更に結合している分子認識水分散性金属ナノ粒子もまた、本発明の１つである。
上記分子認識物質は、標的物質に特異的に反応するものであれば特に限定されず、例えば、抗原、抗体等のタンパク質や、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、糖鎖、レクチン、シクロデキストリン、クラウンエーテル等が挙げられる。
The molecular recognition water-dispersible metal nanoparticles in which a molecular recognition substance is further bonded to the surface of the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention are also one aspect of the present invention.
The molecular recognition substance is not particularly limited as long as it specifically reacts with the target substance, and examples thereof include proteins such as antigens and antibodies, DNA, RNA, peptide nucleic acids, sugar chains, lectins, cyclodextrins, and crown ethers. Etc.
上記分子認識物質が抗体である場合、該抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。抗原分子は、多価抗原である場合であっても、特定のエピトープに限れば多価であるとは限らない。モノクローラル抗体は、抗原分子上の特定のエピトープのみと反応する。従って、分子認識物質としてモノクローナル抗体を用いた場合には、測定対象となる抗原分子は、特定のモノクローナル抗体に対応するエピトープに関する限り、一価抗原となる可能性が高くなる。測定対象となる抗原分子が一価抗原であると、一時に競合する結合反応は全て同じ結合定数の同じモノクローナル抗体であるから、ポリクローナル抗体を用いたときに起こる結合定数が大きく異なる抗体による優先的な結合による定量性を阻害する効果が起こらない。上記モノクローナル抗体は、１種のみを用いてもよく、２種以上を併用してもよい。モノクローナル抗体に換えて、モノクローナル抗体の分子認識部位を含む部分を切り出したＦｖやＦａｂであってもよい。 When the molecular recognition substance is an antibody, the antibody is preferably a monoclonal antibody. Even when the antigen molecule is a multivalent antigen, the antigen molecule is not necessarily multivalent as long as it is limited to a specific epitope. Monoclonal antibodies react only with specific epitopes on the antigen molecule. Therefore, when a monoclonal antibody is used as a molecular recognition substance, the antigen molecule to be measured is likely to be a monovalent antigen as far as it relates to an epitope corresponding to a specific monoclonal antibody. If the antigen molecule to be measured is a monovalent antigen, all binding reactions that compete at one time are the same monoclonal antibody with the same binding constant, so that the binding constant that occurs when using a polyclonal antibody is preferentially different. The effect of inhibiting the quantitative property due to the binding does not occur. As for the said monoclonal antibody, only 1 type may be used and 2 or more types may be used together. Instead of the monoclonal antibody, Fv or Fab obtained by cutting out a portion including the molecular recognition site of the monoclonal antibody may be used.
本発明の水分散性金属ナノ粒子には、通常、４つまでの抗体を固定することができる。上記分子認識物質としてエピトープが異なる２種以上のモノクローナル抗体を併用した本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子を標的物質が分散している溶液に加えると、多数の標的物質と多数の分子認識水分散性金属ナノ粒子とが凝集した懸濁液が得られる。得られた懸濁液は、物理的な篩効果がある不織布等で短時間で濾し取ることができる。。濾取した凝集体を洗浄、溶出、イオン定量すれば、被検溶液中の標的物質濃度を知ることができる。 Usually, up to four antibodies can be immobilized on the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention. When the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles of the present invention using two or more kinds of monoclonal antibodies having different epitopes as the molecular recognition substance are added to a solution in which the target substance is dispersed, a large number of target substances and a large number of molecules are recognized. A suspension in which water-dispersible metal nanoparticles are aggregated is obtained. The obtained suspension can be filtered out in a short time with a nonwoven fabric having a physical sieving effect. . The concentration of the target substance in the test solution can be determined by washing, eluting, and quantifying the ions of the collected aggregate.
上記分子認識物質がＤＮＡ、ＲＮＡ等のオリゴヌクレオチド鎖である場合、該オリゴヌクレオチド鎖の長さは１００〜５，０００ｍｅｒであることが好ましく、１００〜１，０００ｍｅｒであることがより好ましく、１００〜５００ｍｅｒであることが更に好ましい。上記オリゴヌクレオチド鎖の長さが上記範囲を満たす場合には、本発明の水分散性金属ナノ粒子との複合化が容易となり、得られる分子認識水分散性金属ナノ粒子を安定化させるとともに、検出感度の向上や検出時間の短縮を図り得る。 When the molecular recognition substance is an oligonucleotide chain such as DNA or RNA, the length of the oligonucleotide chain is preferably 100 to 5,000 mer, more preferably 100 to 1,000 mer, more preferably 100 to 1,000 mer. More preferably, it is 500 mer. When the length of the oligonucleotide chain satisfies the above range, it is easy to complex with the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention, and the resulting molecular recognition water-dispersible metal nanoparticles are stabilized and detected. The sensitivity can be improved and the detection time can be shortened.
上記分子認識物質がオリゴペプチド核酸鎖である場合、１０〜１００アミノ酸残基のオリゴペプチド鎖に、１００〜５，０００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖が連結したものが好ましく、１００〜１，０００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖が連結したものがより好ましく、１００〜５００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド鎖が連結したものが更に好ましい。上記オリゴペプチド核酸鎖の長さが上記範囲を満たす場合、本発明の水分散性表面金属微粒子との複合化が容易となり、得られる分子認識水分散性金属ナノ粒子を安定化させるとともに、検出感度の向上や検出時間の短縮を図り得る。 When the molecular recognition substance is an oligopeptide nucleic acid chain, it is preferable that an oligopeptide chain of 10 to 100 amino acid residues is linked to an oligonucleotide chain of 100 to 5,000 mer, and an oligonucleotide chain of 100 to 1,000 mer. Are more preferable, and those in which 100 to 500-mer oligonucleotide chains are connected are more preferable. When the length of the oligopeptide nucleic acid chain satisfies the above range, the complexing with the water-dispersible surface metal fine particles of the present invention is facilitated, and the resulting molecular recognition water-dispersible metal nanoparticles are stabilized and the detection sensitivity Can be improved and the detection time can be shortened.
上記分子認識物質を本発明の水分散性金属ナノ粒子に結合する方法は特に限定されず、例えば、物理的吸着法や化学的結合法等が挙げられる。
上記分子認識物質がタンパク質である場合には、本発明の水分散性金属ナノ粒子をアミノシラン誘導体等で処理することにより、直接又は縮合試薬により、タンパク質のアミノ基と本発明の水分散性金属ナノ粒子とを結合することができる。
上記分子認識物質がＤＮＡである場合には、本発明の水分散性金属ナノ粒子を、ポリＬ−リシンでコートすることにより静電気的に結合可能である。
上記分子認識物質がオリゴヌクレオチドである場合には、予めアルキルアミノアシランでコートした本発明の水分散性金属ナノ粒子を、光感受性保護基を有するリンカーで保護し、光照射による脱保護、合成の繰り返しによりオリゴヌクレオチド鎖を合成する方法が挙げられる。
The method for binding the molecular recognition substance to the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a physical adsorption method and a chemical binding method.
When the molecular recognition substance is a protein, by treating the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention with an aminosilane derivative or the like, the amino group of the protein and the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention can be directly or by a condensation reagent. Particles can be combined.
When the molecular recognition substance is DNA, it can be electrostatically bound by coating the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention with poly L-lysine.
When the molecular recognition substance is an oligonucleotide, the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention previously coated with alkylaminoasilane are protected with a linker having a photosensitive protective group, and are deprotected and synthesized by light irradiation. A method of synthesizing an oligonucleotide chain by repeating the above.
ビオチンとアビジンとを介して上記分子認識物質を本発明の水分散性金属ナノ粒子に結合する方法も好適である。
上記ビオチンとアビジンとを介して上記分子認識物質を本発明の水分散性金属ナノ粒子に結合する方法は、例えば、分子認識物質とビオチンを結合しておき、一方で、アビジンを結合した本発明の水分散性金属ナノ粒子を用意しておき、両者を混合してビオチン−アビジン結合を生じさせる方法が挙げられる。別法として、アビジン結合分子認識物質とビオチン結合水分散性金属ナノ粒子を混合する方法や、分子認識物質と水分散性金属ナノ粒子をともにビオチン化しておき、アビジンを介して両者を結合する方法等のバリエーションも可能である。
A method of binding the molecular recognition substance to the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention via biotin and avidin is also suitable.
The method for binding the molecular recognition substance to the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention via the biotin and avidin is, for example, the present invention in which the molecular recognition substance and biotin are bonded while the avidin is bonded. The water dispersible metal nanoparticles are prepared, and both are mixed to generate a biotin-avidin bond. Alternatively, a method of mixing avidin-binding molecule recognition substance and biotin-binding water-dispersible metal nanoparticles, or a method of binding both molecular recognition substance and water-dispersible metal nanoparticles to biotin and binding them via avidin Variations such as these are also possible.
特に分子認識物質が抗体グロブリンである場合、分子認識物質とビオチンの結合は容易である。ビオチンは、抗体タンパク質中のシステイン基に攻撃し結合する。また、分子認識物質がペプチドである場合、ペプチドのＮ末端にシステイン基としておくことで、ペプチドＮ末端にビオチンを結合させることができる。 In particular, when the molecular recognition substance is an antibody globulin, the binding between the molecular recognition substance and biotin is easy. Biotin attacks and binds to the cysteine group in the antibody protein. Further, when the molecular recognition substance is a peptide, biotin can be bound to the peptide N-terminus by providing a cysteine group at the peptide N-terminus.
上記分子認識物質がモノクローナル抗体である場合は、該モノクローナル抗体がプロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種のアダプターを介して本発明の水分散性金属ナノ粒子に結合していることが好適である。
上記プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬは、抗体グロブリンのＦｃ部分に特異的に容易に結合するため、目的物質と抗体グロブリンの複合体に対して水分散性金属ナノ粒子を結合させることができる。
本発明の水分散性金属ナノ粒子と上記アダプターとを結合には、スクシンイミド基とチオール基を持つカップリング剤を用いることができる。また、アダプターをアビジン修飾し、ビオチン化した親水性金属ナノ粒子を混合して結合を行ってもよい。
When the molecular recognition substance is a monoclonal antibody, the monoclonal antibody binds to the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention through at least one adapter selected from the group consisting of protein A, protein G and protein L. It is preferred that
Since the protein A, protein G, and protein L specifically and easily bind to the Fc portion of the antibody globulin, the water-dispersible metal nanoparticles can be bound to the complex of the target substance and the antibody globulin.
A coupling agent having a succinimide group and a thiol group can be used for binding the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention and the adapter. Alternatively, the adapter may be avidin-modified and biotinylated hydrophilic metal nanoparticles may be mixed and bonded.
本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子は、本発明の水分散性金属ナノ粒子からなることにより分散安定性に極めて優れる。このため、タンパク質の検出や、免疫スクリーニング、ハイブリッド形成によるＤＮＡ、ＲＮＡの検出等のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出法に用いると、凝集が起こりにくく、長時間安定した試験を行うことができる。また、生体内での分散安定性に優れることから、生体内における標的物質を高感度に測定することができ、薬物や生体成分の追尾、薬物の作用機構の解析等のｉｎ ｖｉｖｏ試験にも応用することができる。 The molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles of the present invention are extremely excellent in dispersion stability due to the water-dispersible metal nanoparticles of the present invention. For this reason, when used for in vitro detection methods such as protein detection, immunoscreening, and detection of DNA and RNA by hybridization, aggregation is unlikely to occur and a stable test can be performed for a long time. In addition, because of its excellent dispersion stability in vivo, it is possible to measure target substances in vivo with high sensitivity, and it can also be applied to in vivo tests such as drug and biological component tracking and drug action mechanism analysis. can do.
本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子は、生体関連物質、環境関連物質等の標的物質の高感度測定法の分子認識試薬として好適に用いることができる。例えば、標的物質と本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子との複合体を形成した後、必要に応じてＢ／Ｆ分離を行ない、次いで、分子認識水分散性金属ナノ粒子の金属を酸等で溶出させることでイオン化し、該イオンを定量することにより極めて高精度の分析を行うことができる。 The molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles of the present invention can be suitably used as a molecule-recognition reagent for high-sensitivity measurement methods for target substances such as biological substances and environment-related substances. For example, after forming a complex of the target substance and the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles of the present invention, B / F separation is performed as necessary, and then the metal of the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles is converted to an acid. It is possible to perform analysis with extremely high accuracy by ionizing by elution and the like and quantifying the ions.
従来の金属ナノ粒子のように表面が疎水性の金属ナノ粒子では、水分散させるために界面活性剤が必要で、分子認識部の標的となるタンパク質、ウイルス、核酸等の生体関連物質との反応性が低下するという問題があったが、本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子を用いれば、表面が親水性であることから、このような反応性の低下が起こらない。また、表面が分子被覆によって安定化されていない金属ナノ粒子では、調製後の分散液で時間とともに凝集が進んでしまうことから、凝集が起こる前に測定を終了しなくてはならないという問題があったが、本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子では、上記極性官能基の有するイオンの電荷同士の反発により粒子の凝集を防ぐため、高い分散安定性を有し、調製液の長期の保存が可能になる。 In the case of metal nanoparticles with a hydrophobic surface like conventional metal nanoparticles, a surfactant is required to disperse in water, and it reacts with biological materials such as proteins, viruses, and nucleic acids that are targets of the molecular recognition unit. However, if the molecularly recognized water-dispersible metal nanoparticles of the present invention are used, such a decrease in reactivity does not occur because the surface is hydrophilic. In addition, in the case of metal nanoparticles whose surface is not stabilized by molecular coating, aggregation proceeds with time in the dispersion after preparation, so there is a problem that the measurement must be terminated before aggregation occurs. However, the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles of the present invention have high dispersion stability and prevent long-term storage of the preparation liquid in order to prevent particle aggregation due to repulsion between the charges of ions having the polar functional group. Is possible.
本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子と、該分子認識水分散性金属ナノ粒子に含まれる金属を金属イオンに変換する溶離液とを含む試薬キットもまた、本発明の１つである。
上記溶離液により、標的物質と分子認識水分散性金属ナノ粒子との複合体から金属イオンを溶離させることができる。金属微粒子ひとつには、数百〜数千の金属原子が含まれるから、凝集濾過法又は固相アッセイ法を行なうことにより、大量の複合体を集める効果と、金属のイオン化による計数可能なシグナル数の増大効果とにより、標的物質に対して高感度な定量を行なうことができる。
A reagent kit comprising the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles of the present invention and an eluent that converts the metal contained in the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles into metal ions is also one aspect of the present invention.
With the eluent, metal ions can be eluted from the complex of the target substance and the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles. One metal fine particle contains hundreds to thousands of metal atoms, so by performing aggregation filtration method or solid phase assay method, the effect of collecting a large amount of complex and the number of signals that can be counted by metal ionization With the effect of increasing the sensitivity, highly sensitive quantification can be performed for the target substance.
上記溶離液は、例えば、０．１Ｎ硝酸、０．１Ｎ塩酸が挙げられる。 Examples of the eluent include 0.1N nitric acid and 0.1N hydrochloric acid.
本発明の試薬キットは、更に、分子認識物質が結合した粒子径１μｍ〜５０μｍのラテックス粒子を更に含んでもよい。
本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子よりも大きいラテックス粒子を併用し、標的物質が該ラテックス粒子を介して凝集した複合体を形成するようにすれば、ラテックス微粒子を選別しうる濾過等の容易な手段で標的物質の数に対応する分子認識水分散性金属ナノ粒子を容易に選別、濃縮することができる。このような状態で、遊離の分子認識水分散性金属ナノ粒子を洗い流すことは容易であり、Ｓ／Ｎを悪化させずに大きなシグナル増幅効果を得ることができる。
The reagent kit of the present invention may further include latex particles having a particle diameter of 1 μm to 50 μm to which a molecular recognition substance is bound.
If latex particles larger than the molecularly recognized water-dispersible metal nanoparticles of the present invention are used together to form a complex in which the target substance is aggregated via the latex particles, filtration such as filtration capable of selecting latex particles can be performed. The molecular recognition water-dispersible metal nanoparticles corresponding to the number of target substances can be easily selected and concentrated by an easy means. In such a state, it is easy to wash away free molecular recognition water-dispersible metal nanoparticles, and a large signal amplification effect can be obtained without deteriorating S / N.
例えば、標的物質が２種のエピトープを有する抗原分子である場合、一方のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を分子認識水分散性金属ナノ粒子が有し、かつ、他方のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体をラテックス粒子が有するようにすれば、凝集性試薬を含む試薬キットとすることができる。 For example, when the target substance is an antigen molecule having two types of epitopes, the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles have a monoclonal antibody that specifically binds to one epitope, and specifically the other epitope. If the latex particles have a monoclonal antibody to be bound, a reagent kit containing an aggregating reagent can be obtained.
なお、上記ラテックス粒子は、慣用的にラテックス粒子と呼ばれているものであれはよく、化学物質としては、必ずしもラテックスである必要はなく、ポリスチレンやポリメタクリル酸メチルであってもよい。 The latex particles may be those conventionally called latex particles, and the chemical substance is not necessarily a latex, and may be polystyrene or polymethyl methacrylate.
本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子及び試薬キットは、分子認識物質を選択することにより種々の生体関連物質、環境関連物質等を標的物質とすることができる。
本発明の分子認識試薬による測定対象となる標的物質としては、抗体又はレセプターを作製できるものであれば特に限定されず、例えば、抗原、抗体や異常型プリオン等のタンパク質、ダイオキシン類等の内分泌撹乱物質、エイズウイルス等のウイルス、菌体、膜貫通タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）、ステロイド、サイトカイン、金属イオン等が挙げられる。
The molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles and reagent kit of the present invention can target various biologically-related substances, environment-related substances, etc. by selecting a molecule-recognizing substance.
The target substance to be measured by the molecular recognition reagent of the present invention is not particularly limited as long as it can produce an antibody or a receptor. For example, endocrine disruption such as antigen, protein such as antibody or abnormal prion, dioxins, etc. Examples include substances, viruses such as AIDS virus, bacterial cells, transmembrane proteins, peptides, nucleic acids (DNA and RNA), steroids, cytokines, metal ions, and the like.
被験試料中の標的物質の濃度は、限定されない。本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子及び試薬キットを用いる方法によれば、例えば、被験試料１μＬあたり標的物質がｎｇオーダー以下の濃度であっても、特定の標的物質を明確に識別検出することができ、またｐｇオーダー以下であってもよいし、更にｆｇオーダー以下であってもよい。 The concentration of the target substance in the test sample is not limited. According to the method using the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles and the reagent kit of the present invention, for example, even if the target substance has a concentration of ng order or less per 1 μL of a test sample, a specific target substance is clearly identified and detected. In addition, it may be pg order or less, and may be fg order or less.
本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子及び試薬キットを用いた分析方法では、標的物質と分子認識水分散性金属ナノ粒子とが複合体を形成する過程と、発生させた金属イオンを定量する過程とが分離されているため、標的物質と分子認識水分散性金属ナノ粒子とが複合体を形成する過程を凝集濾過法や固相表面固定法で行なうことにより、標的物質濃度に比例する上記複合体の濃縮を行なうことができる。前記複合体ひとつあたりには少なくとも金属微粒子ひとつを含む。金属微粒子ひとつには、数百〜数千の金属原子が含まれるから、前記複合体から溶出する金属イオンを定量すれば、測定の見かけ感度を１００倍〜数万倍向上させることができる。 In the analysis method using the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles and reagent kit of the present invention, the process of forming a complex between the target substance and the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles and the generated metal ions are quantified. Since the process is separated, the process of forming a complex between the target substance and the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles is performed by the coagulation filtration method or the solid surface immobilization method. Concentration of the complex can be performed. Each composite contains at least one metal fine particle. Since one metal fine particle contains hundreds to thousands of metal atoms, the apparent sensitivity of the measurement can be improved by 100 to tens of thousands of times by quantifying the metal ions eluted from the complex.
上記固相表面固定法に用いられる固相としては、抗原等の標的物質を固定することができ、当該標的物質に、抗体等の結合物質（溶液）を接触させることができるものであればよく、限定はされない。このような固相としては、通常、不溶性の材質及び形状等のものが用いられる。例えば、抗原抗体反応によるアッセイ系に用い得る固相が好ましく、具体的には、マルチプラスチックウェルプレート、プラスチックビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、プラスチックチューブ、ナイロン膜、ニトロセルロース膜などが挙げられる。標的物質または分子認識物質を前記固相に固定する場合は、常法に従い、ブロッキングを行うことが好ましい。なお、固相に固定する分子認識物質は、水分散性金属微粒子に結合している分子認識物質とは標的物質に対して認識するエピトープが異なるものを用いる。 The solid phase used in the solid phase surface immobilization method is not particularly limited as long as a target substance such as an antigen can be immobilized and a binding substance (solution) such as an antibody can be brought into contact with the target substance. There is no limitation. As such a solid phase, insoluble materials and shapes are usually used. For example, a solid phase that can be used in an assay system based on an antigen-antibody reaction is preferable, and specific examples include multi-plastic well plates, plastic beads, latex beads, magnetic beads, plastic tubes, nylon membranes, and nitrocellulose membranes. When the target substance or the molecular recognition substance is immobilized on the solid phase, it is preferable to perform blocking according to a conventional method. The molecular recognition substance immobilized on the solid phase is different from the molecular recognition substance bound to the water-dispersible metal fine particles and has a different epitope to recognize the target substance.
検知機構は、複数の金属もしくは金属イオンの検知が可能な機知の検出方法が使用できる。たとえば、アノーディック ストリッピング ボルタンメトリー（ＡＳＶ）に代表される電気化学的検出機構やＩＣＰ、質量分析装置（ＭＳ）等を援用することができる。ＡＳＶでは、アノード上に電気化学的に金属イオンを還元して金属を析出させ、次いで電位を掃引しつつ微小電流を測定することで、シグナルのピーク面積を測定し、もとの標的物質の濃度に換算することができる。これらの方法を援用することで、複数の標的タンパク質もしくは標的ペプチド、標的ＤＮＡの精密で再現性に優れる同時定量が可能になる。 As the detection mechanism, a known detection method capable of detecting a plurality of metals or metal ions can be used. For example, an electrochemical detection mechanism represented by anodic stripping voltammetry (ASV), an ICP, a mass spectrometer (MS), or the like can be used. In ASV, metal ions are electrochemically reduced on the anode to deposit metal, and then the minute current is measured while sweeping the potential to measure the peak area of the signal, and the concentration of the original target substance. Can be converted to By using these methods, simultaneous quantification of a plurality of target proteins, target peptides, and target DNAs with high precision and excellent reproducibility becomes possible.
本発明の試薬キットの１種として、メンブランと電気化学的電極とを備えたカートリッジ式分析キットも考えられる。 As one kind of the reagent kit of the present invention, a cartridge type analysis kit including a membrane and an electrochemical electrode is also conceivable.
また、金属種が異なる２種の分子認識水分散性金属ナノ粒子を併用することにより、複数標的物質の同時測定が可能となる。
更に、本発明の分子認識水分散性金属ナノ粒子は、プラズモンカップリング吸収、構造色等に基づく特有の発色を有すことから、分析プロセスの進行状況を容易に把握できるという利点もある。
Moreover, simultaneous measurement of a plurality of target substances becomes possible by using two types of molecularly recognized water-dispersible metal nanoparticles having different metal types in combination.
Furthermore, the molecule-recognized water-dispersible metal nanoparticles of the present invention have a unique color development based on plasmon coupling absorption, structural color, etc., and thus have an advantage that the progress of the analysis process can be easily grasped.
本発明によれば、ナノサイズの粒子径を有し、粒子径分布が小さく、かつ、水分散性に優れる水分散性金属ナノ粒子を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it can provide the water dispersible metal nanoparticle which has a nanosize particle diameter, a particle diameter distribution is small, and is excellent in water dispersibility.
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
（１）銀ナノ粒子の調製
エタノール（７ｍｌ）にコール酸（８１８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、炭酸銀（２７６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、エタノールアミン（１２２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）及びオクチルアミン（２５９ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を加え、撹拌しながら１時間加熱還流したところ、赤茶色溶液が得られた。室温まで放冷し、アセトン（１０ｍｌ）を添加し、静置した後、桐山ロートで濾過し、減圧下で乾燥させ、赤茶色の銀ナノ粒子を得た。
Example 1
(1) Preparation of silver nanoparticles Cholic acid (818 mg, 2 mmol), silver carbonate (276 mg, 1 mmol), ethanolamine (122 mg, 2 mmol) and octylamine (259 mg, 2 mmol) were added to ethanol (7 ml) with stirring. When heated to reflux for 1 hour, a reddish brown solution was obtained. After allowing to cool to room temperature, acetone (10 ml) was added and allowed to stand, it was filtered through a Kiriyama funnel and dried under reduced pressure to obtain reddish brown silver nanoparticles.
得られた銀ナノ粒子は、ヘキサンに安定に分散した。即ち、銀ナノ粒子は、疎水表面を有することを確認した（以下、「疎水表面銀ナノ粒子」ともいう。）。
また、ＴＥＭ写真観察より、得られた銀ナノ粒子の形状及び平均粒子径を測定したところ、球状で平均粒子径が４．７±２．０ｎｍであった。
The obtained silver nanoparticles were stably dispersed in hexane. That is, it was confirmed that the silver nanoparticles had a hydrophobic surface (hereinafter also referred to as “hydrophobic surface silver nanoparticles”).
Moreover, when the shape and average particle diameter of the obtained silver nanoparticle were measured by TEM photograph observation, it was spherical and the average particle diameter was 4.7 ± 2.0 nm.
（２−１）還流法による水分散性の付与
得られた疎水表面銀ナノ粒子のヘキサン溶液を、金属含有率が２０ｍｇ／ｍＬになるように分取し、メタノールを加えて沈殿させた後、遠心分離後上清を取り除いた。この沈殿に溶媒としてテトラヒドロキシフラン（ＴＨＦ）を加えて金属含有率が２０ｍｇ／ｍＬになるように疎水表面銀ナノ粒子のＴＨＦ分散液を調製した。
得られた疎水表面銀ナノ粒子のＴＨＦ分散液は８００μＬを８５℃に加温還流し、親水性表面修飾剤として２５ｍｇのカプトリル、チオリンゴ酸又は２−アミノエタンチオールを２００μＬのエタノールに溶解したものを一晩かけて添加した。
(2-1) Providing water dispersibility by the reflux method The hexane solution of the obtained hydrophobic surface silver nanoparticles was fractioned so that the metal content was 20 mg / mL, and methanol was added to cause precipitation. After centrifugation, the supernatant was removed. To this precipitate, tetrahydroxyfuran (THF) was added as a solvent to prepare a THF dispersion of hydrophobic surface silver nanoparticles so that the metal content was 20 mg / mL.
The obtained THF dispersion of hydrophobic surface silver nanoparticles is obtained by heating and refluxing 800 μL to 85 ° C., and dissolving 25 mg of captolyl, thiomalic acid or 2-aminoethanethiol in 200 μL of ethanol as a hydrophilic surface modifier. Added over night.
還流後、２５０ｍＭのＮａＯＨ（ｐＨ１３）を３ｍＬを加え、更に９０℃で２時間加温した。ＨＣＬを滴下してｐＨを１０〜１１にまで調整した後、限外濾過膜とセファデックスカラムを用いて精製を行った。
精製後の銀ナノ粒子は、いずれの親水性表面修飾剤を使用したものも水に安定に分散した。即ち、銀ナノ粒子には水分散性が付与された（以下、「水分散性銀ナノ粒子」ともいう。）。
また、得られた水分散性銀ナノ粒子をクロロホルム洗浄した後の粒子径分布を、動的光散乱法による粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社製、「ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎａｎｏ−ＺＳ」）を用いて測定した。その結果、得られた水分散性銀ナノ粒子の粒子径（ピーク値）は、カプトリルを用いたものが１１．７ｎｍ、チオリンゴ酸を用いたものが３．６２ｎｍ、２−アミノエタンチオールを用いたものが３２．７ｎｍであった。
After refluxing, 3 mL of 250 mM NaOH (pH 13) was added, and the mixture was further heated at 90 ° C. for 2 hours. After adjusting the pH to 10 to 11 by adding HCL dropwise, purification was performed using an ultrafiltration membrane and a Sephadex column.
Silver nanoparticles after purification were stably dispersed in water using any hydrophilic surface modifier. That is, water dispersibility was imparted to the silver nanoparticles (hereinafter also referred to as “water dispersible silver nanoparticles”).
Further, the particle size distribution after the obtained water-dispersible silver nanoparticles were washed with chloroform was measured using a particle size measuring device (Malvern, “ZETASIZER Nano Series Nano-ZS”) by a dynamic light scattering method. did. As a result, the particle diameter (peak value) of the obtained water-dispersible silver nanoparticles was 11.7 nm using captolyl, 3.62 nm using thiomalic acid, and using 2-aminoethanethiol. It was 32.7 nm.
（２−２）流通法による水分散性の付与
得られた疎水表面銀ナノ粒子のヘキサン溶液を、金属含有率が２０ｍｇ／ｍＬになるように分取し、メタノールを加えて沈殿させた後、遠心分離後上清を取り除いた。この沈殿に溶媒としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えて金属含有率が２０ｍｇ／ｍＬになるように疎水表面銀ナノ粒子のＴＨＦ分散液を調製した。
得られた疎水表面銀ナノ粒子のＴＨＦ分散液８００μＬと、、親水性表面修飾剤として２５ｍｇのカプトリルを２００μＬのエタノールに溶解したもとを混合し、更に１００ｍＭのＮａＯＨを１ｍＬを加えてｐＨ１０に調整し、キャピラリー流路を介して圧力３５ＭＰａでスリットレギュレーターに流通させた。通液後の分散液をクロロホルム洗浄した後の粒子径分布を、動的光散乱法による粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社製、「ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎａｎｏ−ＺＳ」）を用いて測定した。その結果、ピーク粒子径は１５．７ｎｍ、ＣＶは２．７％であった。
流通後の溶液を、限外濾過膜とセファデックスカラムを用いて精製を行った。
精製後の銀ナノ粒子は、いずれの親水性表面修飾剤を使用したものも水に安定に分散した。即ち、銀ナノ粒子には水分散性が付与された（以下、「水分散性銀ナノ粒子」ともいう。）。
(2-2) Providing water dispersibility by a flow method The hexane solution of the obtained hydrophobic surface silver nanoparticles was fractioned so that the metal content was 20 mg / mL, and methanol was added to cause precipitation. After centrifugation, the supernatant was removed. Tetrahydrofuran (THF) was added to this precipitate as a solvent to prepare a THF dispersion of hydrophobic surface silver nanoparticles so that the metal content was 20 mg / mL.
Mix 800 µL of the obtained dispersion of hydrophobic surface silver nanoparticles with THF and 25 mg of captolyl as a hydrophilic surface modifier in 200 µL of ethanol, and adjust to pH 10 by adding 1 mL of 100 mM NaOH. Then, it was circulated through the capillary channel at a pressure of 35 MPa through the slit regulator. The particle size distribution after washing the dispersion after passing through chloroform was measured using a particle size measuring device (Malvern, “ZETASIZER Nano Series Nano-ZS”) by a dynamic light scattering method. As a result, the peak particle size was 15.7 nm and the CV was 2.7%.
The solution after distribution was purified using an ultrafiltration membrane and a Sephadex column.
Silver nanoparticles after purification were stably dispersed in water using any hydrophilic surface modifier. That is, water dispersibility was imparted to the silver nanoparticles (hereinafter also referred to as “water dispersible silver nanoparticles”).
本発明によれば、ナノメートルサイズの粒子径を有し、粒子径分布が小さく、かつ、水分散性に優れる水分散性金属ナノ粒子を提供することができる。特に、本発明で得られるシングルナノメートルサイズの水分散性金属ナノ粒子は、電気化学標識、ドラッグデリバリー担体として有用に用いられる。
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it can provide the water dispersible metal nanoparticle which has a nanometer size particle diameter, a particle diameter distribution is small, and is excellent in water dispersibility. In particular, the single nanometer-sized water-dispersible metal nanoparticles obtained in the present invention are usefully used as electrochemical labels and drug delivery carriers.
Claims (2)
The water-dispersible metal nanoparticles according to claim 1, wherein the hydrophilic surface modifier has a weight average molecular weight of 300 or less.
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