JP2010266709A - レーザ走査顕微鏡及びその制御方法、並びにプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】少ないリソースで、有効な解析を行うことができるようにする。
【解決手段】まず、設定されたＸＹＺ走査領域Ａ_XYZをプレビュー走査して（Ｓ１２）、プレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnを取得し（Ｓ１３）、クロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnを設定する（Ｓ１５ないしＳ１８）。次に、設定されたクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnに基づいて算出した本走査を行う際の各Ｚステップにおけるクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cmを本走査して（Ｓ１９，Ｓ２０）、クロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmを取得する。そして、取得したクロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmから３次元画像を生成することで、少ないリソースで有効な解析を行うことができる。本発明は、例えば、試料Ｓの３次元データを取得するコンフォーカル顕微鏡に適用できる。
【選択図】図３

Description

本発明は、レーザ走査顕微鏡及びその制御方法、並びにプログラムに関する。

レーザ走査顕微鏡は、その光学原理から焦点面近傍の限られた厚さの面情報のみを取得できる顕微鏡である。この原理を利用して、焦点面をＺ方向にずらしながら、各断面を取得することにより、試料の３次元画像データを取得することが可能となる。

このようにして取得した画像データを立体画像として表示したり、任意方向の断面を表示することにより、試料の立体構造や試料内の物質の３次元的な移動の解析を行うことができる。

この種のレーザ走査顕微鏡としては、例えば、特許文献１に開示されているものが知られている。

特開平１０−１６１０３４号公報

しかしながら、より詳細な画像データを得るためには、ＸＹ方向の解像度を上げたり、Ｚ方向の移動ピッチを細かくする必要があるが、走査時間がかかるとともに、相対的にデータ量が膨大なものとなるという側面を持っている。データ量が増えると、ソフトウェアの演算速度が遅くなったり、パーソナルコンピュータの記憶領域におけるデータの占める領域が肥大したりするので、有効な解析を行うためには、リソースを増やす必要が出てくる。

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、解析のために取得するデータ量を少なくすることで、リソースを削減できるようにするものである。

本発明のレーザ走査顕微鏡は、光源と、前記光源からの光を試料上で２次元走査する走査手段と、前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レンズと、前記対物レンズと前記試料とを前記対物レンズの光軸方向に相対移動させる駆動手段とを備えるレーザ走査顕微鏡において、前記駆動手段によって第１の移動量ごとに移動させながら、前記走査手段によって前記試料の概略の形状を得るための領域であるプレビュー領域内を走査することで得られるプレビュー画像を取得するプレビュー画像取得手段と、取得された前記プレビュー画像に基づいて、前記駆動手段によって前記第１の移動量よりも細かい第２の移動量ごとに移動させながら前記試料の詳細な形状を得るために前記走査手段により走査すべき領域であるクロップ領域を設定するクロップ領域設定手段と、前記駆動手段によって前記第２の移動量ごとに移動させながら、前記走査手段によって前記クロップ領域内を走査することで得られるクロップ画像を取得するクロップ画像取得手段と、取得された前記クロップ画像に基づいて、前記試料の３次元画像を生成する３次元画像生成手段とを備える。

本発明によれば、高速で画像を取得できるとともに、少ないリソースで、有効な解析を行うことができる。

本発明を適用したレーザ走査顕微鏡の一実施の形態を示す図である。 制御コントロールユニットの詳細な構成例を示す図である。 試料Ｓの３次元構造表示処理を説明するフローチャートである。 ＸＹＺ走査領域Ａ_XYZの設定方法を示す図である。 クロップ領域Ａ_Cの設定手順と、設定されたクロップ領域Ａ_Cから生成されるクロップ画像Ｉ_Cを説明するための図である。 試料Ｓの各断面の中心点を結んだ軸に沿って求められるクロップ領域Ａ_Cを示す図である。 最小限エリア法を採用した場合の画像処理について説明する図である。 最大エリア法を採用した場合の画像処理について説明する図である。 光刺激による励起特性変更処理を説明するフローチャートである。 カエデを使用する場合の蛍光検出部の構成例を示す図である。 ファムレットを使用する場合の蛍光検出部の構成例を示す図である。 断面ごとに異なる形状を有する試料Ｓの３次元構造表示処理を説明するフローチャートである。 ＸＹＺ走査領域Ａ_XYZの設定方法を示す図である。 クロップ領域Ａ_Cの設定手順と、設定されたクロップ領域Ａ_Cから生成されるクロップ画像Ｉ_Cを説明するための図である。 試料Ｓの各断面の中心点を結んだ軸に沿って求められるクロップ領域Ａ_Cを示す図である。

以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。

図１は、本発明を適用したレーザ走査顕微鏡の一実施の形態を示す図である。

図１において、レーザ走査顕微鏡システム１は、試料Ｓに照射されるレーザ光により画像を取得するレーザ走査顕微鏡１１と、そのレーザ走査顕微鏡１１を制御するパーソナルコンピュータ１２とが接続されて構成される。

パーソナルコンピュータ１２には、マウスやキーボードからなる入力装置１３と、LCD（Liquid Crystal Display）などからなる表示装置１４が接続される。パーソナルコンピュータ１２は、内蔵するCPU（Central Processing Unit）がアプリケーションソフトウェア６１を実行することで、レーザ走査顕微鏡１１によって取得された画像や、レーザ走査顕微鏡１１の設定値をユーザに入力させるためのGUI（Graphical User Interface）などを表示装置１４に表示させたり、ユーザが入力装置１３を操作することにより入力される設定値に基づいて、レーザ走査顕微鏡１１を制御する。

レーザ走査顕微鏡１１では、レーザ光源部２１からのレーザ光が試料Ｓに照射され、そのレーザ光により試料Ｓの蛍光物質が励起されて試料から発せられる蛍光による蛍光画像及び試料Ｓを透過する透過光による透過光画像が取得される。

レーザ光源部２１には、それぞれ異なる波長のレーザ光を発する３つのレーザ光源３１ａないし３１ｃ及びレーザ光の照射をオン／オフするための３つのシャッタ３２ａないし３２ｃが設けられている。シャッタ３２ａないし３２ｃは、例えば、AOM(音響光学素子)やAOFT（音響光学可変フィルタ）等の高速シャッタ素子であり、後述する制御コントロールユニット２７の制御にしたがって、レーザ光源３１ａないし３１ｃからのレーザ光による試料Ｓの照射を、それぞれオン／オフする。

レーザ光源部２１から発せられるレーザ光（励起光）は、出力端がファイバコネクタ（不図示）に接続された光ファイバ（不図示）によりダイクロイックミラー２２に導入される。

ダイクロイックミラー２２により反射された光は、レーザ走査部２３により走査され、顕微鏡部２４内に入射し、対物レンズ４１により集光されて、ステージ４２上の試料Ｓに照射される。レーザ走査部２３は、例えば、レーザ光を反射するミラーと、そのミラーを駆動する駆動機構を有して構成されるガルバノスキャナであって、レーザ光源部２１からのレーザ光を、試料ＳのＸ−Ｙ平面（試料Ｓに照射されるレーザ光の光軸に対し直交する平面）で走査する。

なお、顕微鏡部２４において、対物レンズ４１及びステージ４２には、ピエゾ駆動装置又はＤＣモータ等の駆動装置（不図示）がそれぞれ接続されており、光軸方向に移動可能となっている。

レーザ光を照射することにより励起された試料Ｓから発せられた蛍光は、対物レンズ４１を経てレーザ走査部２３に入射し、デスキャンされた後、ダイクロイックミラー２２を透過して蛍光検出部２５に入射される。

蛍光検出部２５において、試料Ｓからの蛍光は、ＤＭ（Dichroic Mirror：ダイクロイックミラー）５１ａに入射し、第１の波長領域の蛍光がＤＭ５１ａにより反射されて、ＢＡフィルタ（Barrier filter）５２ａにより、フィルタリングされた後、ＰＭＴ（photo multiplier tube：光電子増倍管）５３ａに入射される。

また、ＤＭ５１ａを透過した蛍光は、ＤＭ５１ｂに入射し、第２の波長領域の蛍光がＤＭ５１ｂにより反射されて、ＢＡフィルタ５２ｂによりフィルタリングされた後、ＰＭＴ５３ｂに入射される。また、ＤＭ５１ｂを透過した第３の波長領域の蛍光は、ＢＡフィルタ５２ｃによりフィルタリングされた後、ＰＭＴ５３ｃに入射される。

そして、ＰＭＴ５３ａないし５３ｃは、それぞれ受光した蛍光を検出し、その光量に応じた電圧の電気信号を制御コントロールユニット２７に供給する。なお、以下、適宜、ＰＭＴ５３ａないし５３ｃを、それぞれ区別する必要がない場合、ＰＭＴ５３と称する。

また、試料Ｓに照射されたレーザ光のうち、試料Ｓを透過した透過光は、透過光検出部２６に入射する。透過光検出部２６は、試料Ｓを透過した透過光の光量に応じた電圧の電気信号を制御コントロールユニット２７に供給する。

制御コントロールユニット２７は、ＰＭＴ５３から供給される電気信号を増幅してA/D(Analog/Digital)変換し、その電気信号から画像を組み立てる画像処理を行い、その画像処理により得られる画像データをパーソナルコンピュータ１２に供給する。また、制御コントロールユニット２７は、レーザ走査顕微鏡１１の各部の動作を制御する。

次に、図２を参照して、制御コントロールユニット２７の詳細な構成を説明する。

制御コントロールユニット２７は、走査領域設定部１０１、レーザ走査部制御部１０２、画像取得部１０３、画像処理部１０４、及びチャンネル設定部１０５から構成される。

本実施の形態において、レーザ走査顕微鏡システム１は、図１に示すようなハードウェア構成を有しているので、走査領域設定部１０１ないしチャンネル設定部１０５の機能は、例えば、記録部（不図示）に記録されたプログラムを実行する制御コントロールユニット２７に内蔵されたCPU（不図示）により実現される。ただし、走査領域設定部１０１ないしチャンネル設定部１０５は、ハードウェアとして構成することもできるし、ソフトウェアとハードウェアの組み合わせとして構成することもできる。

制御コントロールユニット２７において、走査領域設定部１０１ないし画像処理部１０４によって実行される処理の詳細については、後述する図３及び図１２のフローチャートを参照して説明する。また、チャンネル設定部１０５によって実行される処理の詳細については、後述する図９のフローチャートを参照して説明する。

次に、レーザ走査顕微鏡システム１の動作について説明する。

まず、図３のフローチャートを参照して、制御コントロールユニット２７により実行される、試料Ｓの３次元構造を表示する処理について説明する。

例えば、ユーザによって、観察対象となる試料Ｓがステージ４２上に載置され、レーザ走査顕微鏡システム１が起動されると、パーソナルコンピュータ１２側では、アプリケーションソフトウェア６１によって、試料Ｓのおおよその構造を取得するプレビュー用の走査（プレビュー走査）をするための条件設定画面が、表示装置１４に表示される。ユーザが入力装置１３を操作して、プレビュー走査を行う範囲のＺ方向のトップ位置、ボトム位置、及び移動ピッチ、並びにＸＹ方向の領域（以下、プレビュー領域Ａ_Pという）を入力すると、ステップＳ１１において、走査領域設定部１０１は、それらの操作入力に応じたプレビュー用のＸＹＺ方向の走査領域（以下、ＸＹＺ走査領域Ａ_XYZという）を設定する。そして、ステップＳ１２において、レーザ走査部制御部１０２は、レーザ走査部２３などを制御して、設定されたＸＹＺ走査領域Ａ_XYZのプレビュー走査を行う。

具体的には、図４に示すように、試料Ｓに対し、プレビュー画像Ｉ_Pの取り込みを開始するトップ位置と、その取り込みを終了するボトム位置を設定し、さらに、トップ位置とボトム位置との間におけるＺ方向の走査の間隔であるＺ移動ピッチと、ＸＹ方向の領域であるプレビュー領域Ａ_Pを設定することで、ＸＹＺ走査領域Ａ_XYZが設定される。なお、このＺ移動ピッチは、プレビュー走査を行うためのものであるため、試料Ｓの詳細な構造を取得するための本走査（後述するステップＳ２０の処理）を比して、その間隔は、例えば5倍〜10倍などの広いものとなる。すなわち、Ｚ方向のステップ（Ｚステップ）数で考えれば、プレビュー走査においては、本走査の1/5〜1/10のステップ数が設定される。

そして、このＸＹＺ走査領域Ａ_XYZが走査されることで、ステップＳ１３において、画像取得部１０３は、トップ位置からボトム位置までの間、プレビュー領域Ａ_Pに対応するプレビュー画像Ｉ_Pを、Ｚ移動ピッチごとに順次取得する。図４の例では、Ｚステップ数は、ｎ（ｎ：自然数）となるので、ｎ枚のプレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnが取得される。

ステップＳ１４において、画像処理部１０４は、取得したプレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnを用いて、試料Ｓの概略の形状に対応する３次元画像を生成し、パーソナルコンピュータ１２に出力する。これにより、パーソナルコンピュータ１２側では、試料Ｓの３次元画像が表示装置１４に表示される。この３次元画像は、Ｚ移動ピッチを広くとって取得したプレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnから生成した試料Ｓの概略の形状を示した画像であるため、厳密には正確であるとは言えないが、試料Ｓのおおよその立体構造を把握することは可能である。また、ここでは、３次元画像に限らず、試料Ｓを２次元画像で表示してもよい。

また、このとき、表示装置１４には、上記の試料Ｓの概略の形状を示した３次元画像の他に、その試料Ｓのクロップ領域Ａ_Cを設定するためのクロップ領域設定画面が表示される。

ここで、クロップ領域Ａ_Cとは、元になる画像のうち必要な部分のみを切り出す（クロップ：Crop）走査であるクロップ走査を行う領域を意味する。このクロップ走査では、必要な部分を画像化する方式と異なり、元の画像の分解能と走査速度を落とさずに必要な部分を走査するので、データを短時間で取得することが可能となる。クロップ領域Ａ_Cの設定には、領域の中心となる座標と、その座標を中心とする領域のＸ，Ｙ方向のピクセル数の設定が必要となり、以下に、本実施の形態におけるクロップ領域Ａ_Cの設定手順を、図５を参照しながら説明する。

図５ａには、プレビュー走査によって得られたプレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnが、図示されている。これらのプレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnには、試料Ｓの観察対象となる細胞の断面像と観察対象外の細胞の断面像とが表示されているが、これは、例えば、脳組織の神経細胞などでは、１つのプレビュー領域Ａ_P内に複数の神経軸策が存在することが多くあるため、観察対象の細胞の近くに他の細胞があると、それらの観察対象ではない細胞までプレビュー画像Ｉ_Pに表示されることになる。そのため、本実施の形態では、プレビュー画像Ｉ_Pに表示された複数の細胞の像の中から観察対象となる細胞のみ含むクロップ領域Ａ_Cを設定するようにしている。

例えば、図５ｂに示すように、プレビュー画像Ｉ_P1からクロップ領域Ａ_Cをユーザの操作により設定するには、試料Ｓの断面像のうち、クロップ領域Ａ_Cとして切り出す領域の中心点をユーザがマウス等の入力装置１３を操作して指定し、その点を中心とするクロップ領域Ａ_C1をマウス等のドラッグ操作により選択する、又はその点を中心とする領域のＸ，Ｙ方向の各ピクセル数をキーボードで入力することにより選択すると、ステップＳ１５において、そのユーザの操作入力に応じたクロップ領域Ａ_C1が、走査領域設定部１０１によって設定される。

そして、ステップＳ１６において、走査領域設定部１０１は、他のクロップ領域Ａ_Cの設定が必要か否かを判定し、まだ、図５ｂのプレビュー画像Ｉ_P2ないしＩ_Pnのクロップ領域Ａ_Cを設定していないので、ステップＳ１５に戻り、それらの画像に対してクロップ領域Ａ_Cが設定されるまで、ステップＳ１５及びＳ１６の処理が繰り返される。これにより、図５ｂに示すように、プレビュー画像Ｉ_P2ないしＩ_Pnにおいては、プレビュー画像Ｉ_P1と同様に、試料Ｓの断面像上の任意の中心点を指示することで、その点を中心とするクロップ領域Ａ_C2ないしＡ_Cnをそれぞれ設定する。

ステップＳ１７において、画像処理部１０４は、プレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnに対して設定されたクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnに基づいて、観察対象である試料Ｓのいずれの部位がクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnとして設定されたかを示すクロップ領域確認画面を生成し、パーソナルコンピュータ１２に出力する。これにより、パーソナルコンピュータ１２に接続された表示装置１４には、クロップ領域確認画面が表示される。すなわち、図５ａに示したように、プレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnには、観察対象となる試料Ｓの断面像以外の像が表示される場合があり、誤った像に対して、クロップ領域Ａ_Cを設定した場合には、試料Ｓの正しい立体構造が得られないことになる。そのため、クロップ領域Ａ_Cの設定が終了した後、クロップ領域確認画面を表示して、設定されたクロップ領域Ａ_Cを変更する必要があるか否かをユーザに判断させる（ステップＳ１８の処理）。

ステップＳ１８において、ユーザの操作入力に基づいて、設定されたクロップ領域Ａ_Cを変更すると判定された場合、処理は、ステップＳ１５に戻り、上述したステップＳ１５及びＳ１６の処理が行われることで、再度、クロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnの設定が行われる。これにより、クロップ領域Ａ_Cが正確に設定できなかった場合には、再設定が行われるので、クロップ領域Ａ_Cの過誤設定を防止できる。

一方、ステップＳ１８において、クロップ領域Ａ_Cの変更を行わないと判定された場合、ユーザの操作入力に応じたクロップ領域Ａ_Cに設定を確定する。

なお、クロップ領域Ａ_Cの設定方法であるが、上述したユーザによる手動の設定以外にも、例えば、プレビュー画像Ｉ_Pに表示された観察対象となる試料Ｓの輝度値が他の領域と異なることに注目し、次のような所定の画像処理を施すことにより、ソフトウェアにより自動的に切り出すことができる。すなわち、試料Ｓの断面像に表示されている蛍光波長の輝度値を所定の閾値で２値化して、観察対象となる細胞の断面部分を白（輝度値=255）、その周辺のバックグラウンドを黒（輝度値=0）で表示する。白い部分の重心を求めて、その重心を中心座標とした白い部分を含む所定の四角形領域を求める。これにより、観察対象となる細胞を含む最小限の領域をクロップ領域Ａ_Cとして設定してもよい。

この場合におけるクロップ領域Ａ_Cの範囲は、例えば、最大エリア法又は最小限エリア法により設定される。ここで、最大エリア法とは、各断面で切り出すクロップ領域Ａ_Cの大きさ（形状、面積を含む概念）が全て同じになるように、各断面中の最大画角にサイズを合わせる方法である。この最大エリア法を採用した場合、クロップ領域Ａ_Cは、各断面ごとに揃ったデータサイズとなるため、後段の画像処理を容易にすることが可能となるが、走査領域は増大することになるので、画像データを取得する時間が増大する。一方、最小限エリア法とは、必要となるＸＹ領域の最小限の大きさを、クロップ領域Ａ_Cとして設定する方法である。試料Ｓの観察対象となる細胞断面形状に適合した範囲のみを設定するために、前述の画像処理にて２値化して表示された観察対象となる細胞の断面部分が、全体の80％〜90％程度の面積を占めるように四角形領域をクロップ領域Ａ_Cとして設定する。この最小限エリア法を採用した場合、クロップ領域Ａ_Cは、各断面ごとに個別の大きさとなるが、そのＸＹ領域が、観察対象となる試料Ｓの断面形状に合った適切な範囲で指定されるので、画像データを取得する時間を短縮することが可能となる。図３のフローチャートでは、この最小限エリア法を採用した場合を例にして説明する。

また、上述したように、プレビュー画像Ｉ_Pには、試料Ｓの観察対象となる細胞断面像以外の複数の細胞像が表示されることも考えられるため、単純に試料Ｓの観察対象となる細胞断面像の輝度値と閾値との比較を行うだけでは、所望の断面像を指定できない可能性も出てくるが、その場合には、例えば、試料Ｓの細胞にフォトコンバージョンタイプの蛍光蛋白質を予め発現させておき、観察したい細胞のみにＵＶレーザ光（紫外光）による光刺激によって励起特性（発生する蛍光波長）を変更させてからプレビュー画像Ｉ_Pを取得することで、観察したい細胞とそれ以外の細胞を、この励起特性の違いにより容易に区別することができる。すなわち、本実施の形態においては、蛍光を取得するＰＭＴ５３（図１）のうち、励起特性の変更後の蛍光のみが取得されるＰＭＴ５３からの画像を領域設定に用いることで、観察対象となる細胞のみが表示されている画像を利用することができるようになる。この方法の詳細については、図９以降の図面を参照して後述する。

そして、クロップ領域Ａ_Cの設定が確定されると、処理は、ステップＳ１９に進む。ステップＳ１９において、走査領域設定部１０１は、プレビュー画像Ｉ_Pにて設定された複数のクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnに基づいて、本走査を行う際の各Ｚステップにおけるクロップ領域の中心座標とクロップ領域を算出する。

本実施の形態では、対物レンズ４１及びステージ４２は、ピエゾ駆動装置（不図示）によりＺ方向（光軸方向）に駆動されるので、例えば、対物レンズ４１を、25nmずつ段階的にＺ方向に移動させることが可能である。つまり、本走査では、トップ位置からボトム位置までの間を、プレビュー走査よりも細かい間隔で段階的に移動しながら、各Ｚステップにおけるクロップ領域Ａ_Cを走査することになる。

具体的には、本走査のＺステップ数ｍは、プレビュー走査（上述したステップＳ１２の処理）のステップ数に対してユーザが任意に決めることができ（ｍ：自然数，ｍ＞ｎ）、通常、５倍〜１０倍のステップ数である。本走査のステップ数が決まったら、以下の手順で仮想的に設定された各Ｚステップごとのクロップ領域Ａ_Cを設定する。

つまり、上述のステップ１２の処理で設定されたｎ個のステップの各断面におけるクロップ領域Ａ_C1からＡ_Cnのそれぞれの中心点を結ぶ直線または曲線（この設定方法については後述する）と、仮想的に設定された本走査用の各Ｚステップの断面との交点を算出し、その交点を各Ｚステップごとのクロップ領域Ａ_Cの中心座標とする。

次に、各Ｚステップのクロップ領域Ａ_Cを設定する。前述の最大エリア法では上述のステップ１２の処理で設定したクロップ領域Ａ_Cの最大領域を、全てのＺステップにおいて適用してクロップ領域Ａ_C1からＡ_Cmまで設定する。前述の最小エリア法では、２つの設定方法をユーザが選択できるものとする。第１の方法は、上述のステップ１２の処理で設定されたｎステップの各断面におけるクロップ領域Ａ_C1からＡ_Cnのうち、クロップ領域Ａ_C1からＡ_C2までの間に入る本走査のＺステップのクロップ領域をクロップ領域Ａ_C1と同じに設定する。同様に、クロップ領域Ａ_C2からＡ_C3まではクロップ領域Ａ_C2と同じクロップ領域を設定し、クロップ領域Ａ_Cn-1からＡ_Cnまでではクロップ領域Ａ_Cn-1と同じクロップ領域に設定する。

また、第２の方法は、クロップ領域Ａ_Cx-1からＡ_Cx（ｘは２からｎ）までの間に入る本走査用のＺステップの領域を、クロップ領域Ａ_Cx-1とクロップ領域Ａ_Cxの四角形の各頂点同士を結ぶ４本の各線分と、仮想的に設定された本走査用の各Ｚステップの断面との交点を算出し、各Ｚステップの断面上に求められる４つの点からなる四角形を、そのＺステップの断面のクロップ領域とする。この方法では、各Ｚステップにおけるクロップ領域Ａ_C1からＡ_Cmの面積が、徐々に大きくなったり小さくなったりすることで、プレビューステップｘ−１からｘ（ｘは２からｎ）の間に変化する観察対象細胞の断面積の変化に対応することができる。

また、クロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnのそれぞれの中心点を結ぶ方法としては、例えば、直線、スプライン曲線、ベジェ曲線などが選択できるものとし、ユーザにより所望の方法が選択される。また、予め学習させておいた方法により中心点を結ぶようにしてもよい。そして、この中心点を結んだ軸を含むＸＹ領域であるクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cmが、上述した最小限エリア法に従った範囲で決定され、Ｚステップごとのクロップ領域Ａ_Cの中心座標とクロップ領域Ａ_Cが算出される。

以上により、図６に示すような、試料Ｓの各走査断面における観察対象の細胞の断面の輪郭を含むクロップ領域Ａ_C1，Ａ_C2，Ａ_C3，・・・，Ａ_Cmが、試料Ｓの各断面の観察対象の細胞の中心点を結んだ軸に沿って求められる。

図３のフローチャートに戻り、ステップＳ２０において、レーザ走査部制御部１０２は、レーザ走査部２３などを制御して、Ｚステップごとに、算出されたクロップ領域Ａ_Cの走査（本走査）を行う。そして、ステップＳ２１において、この本走査で得られるクロップ画像Ｉ_Cが、画像取得部１０３により取得される。

ステップＳ２２において、レーザ走査部制御部１０２は、本走査を行う次のＺステップにおけるクロップ領域Ａ_Cが存在するか否かを判定する。ステップＳ２２において、次のＺステップのクロップ領域Ａ_Cが存在すると判定された場合、ステップＳ２０に戻り、次のＺステップのクロップ領域Ａ_Cが存在しないと判定されるまで、ステップＳ２０ないしＳ２２の処理が繰り返される。すなわち、ステップＳ２０ないしＳ２２の処理が繰り返し実行されることで、各Ｚステップ（1,2,3,・・・,m）の本走査が順次行われ、図６のクロップ領域Ａ_C1，Ａ_C2，Ａ_C3，・・・，Ａ_Cmに対応するクロップ画像Ｉ_C1，Ｉ_C2，Ｉ_C3，・・・，Ｉ_Cmが順次取得される。

そして、ステップＳ２２において、次のＺステップのクロップ領域Ａ_Cが存在しないと判定された場合、クロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cmの走査が終了し、すべてのクロップ領域Ａ_Cに対応するクロップ画像Ｉ_Cが取得されたことになるので、ステップＳ２３において、画像処理部１０４は、取得されたクロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmに対し、補間処理を施す。すなわち、図５ｃ、図５ｄを参照して説明すれば、最小限エリア法を採用した場合、図５ｃのクロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmが取得されるため、同一平面上で見た場合には、図５ｄに示すように、クロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmのそれぞれは、互いに領域の大きさと中心座標が異なるものとなる。そこで、図５ｄに示すように、クロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmのそれぞれを、クロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmを全て包含する最大領域（以下、最大領域Ｒ_MAXという）に合わせる必要がある。従って、画像処理部１０４は、クロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmのそれぞれについて、最大領域Ｒ_MAXを基準とした場合に不足している分の領域を補間する処理を行って、全てのクロップ画像Ｉ_Cが最大領域Ｒ_MAXと同じになるようにする。

ステップＳ２４において、画像処理部１０４は、補間処理が施されたクロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmから試料Ｓの３次元画像を生成する。すなわち、図７を参照して簡単に説明すれば、最小限エリア法を採用した場合には、例えば、図７ａのクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_C6に対応するクロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_C6が順次取得されるが、それら画像では大きさや、同一平面上での中心座標が異なっている場合があるので、クロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_C6のそれぞれを最大領域Ｒ_MAXに合わせることで、図７ｂのハッチングを施した部分を補間し、試料Ｓの３次元画像を生成できるようにしている。なお、図８に示すように、最大エリア法を採用した場合には、例えば、図８ａのクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_C4に対応するクロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_C4が順次取得されるが、それらの画像では大きさや同一平面上での中心座標が一致しているため、最小限エリア法のような補間処理を行う必要はない。そのため、最大エリア法の場合、ステップＳ１９のクロック領域域Ａ_Cの中心座標とクロップ領域域Ａ_Cを求める処理と、ステップＳ２３の補間処理を行う必要がない。

なお、上記の補間処理は一例であり、クロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmを用いて試料Ｓの３次元画像を生成することができる方法であれば、他の方法でもよい。また、補間処理を適用する時期であるが、クロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmを取得後、直ちに行ってもよいし、クロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmを一旦保存した後に解析を行う場合には、その解析を行う際の画像の読み込み時に行ってもよい。

そして、この３次元画像は、パーソナルコンピュータ１２に出力される。これにより、ステップＳ２５において、パーソナルコンピュータ１２は、試料Ｓの観察対象となる細胞の３次元画像を表示装置１４に表示する。この３次元画像は、Ｚステップ数を上げて取得したクロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmから生成されたものであるため、試料Ｓの観察対象となる細胞の正確な立体構造を把握することが可能となる。

ところで、脳細胞などの神経細胞の観察を行う場合、１つのクロップ領域内に複数の神経軸策が存在する可能性が高くなる。この場合、特定の神経細胞に着目して軸の中心を決定していくことは、人間の目、ましてや画像処理による判別では、注目している目的の細胞と、他の細胞とが同一に表示されるため、軸の中心の決定には相当の困難を生じる。

そこで、本実施の形態においては、観察する神経細胞に対し、いわゆるフォトコンバージョンタイプの蛍光蛋白質を、予め発現させておくことにより、目的の細胞を容易に識別できるようにする。

ここで、フォトコンバージョン（photoconversion）とは、所定の波長の光の照射によって色が変化する特性をいう。フォトコンバージョンタイプの蛍光蛋白質は、光刺激を与える前後で、発する蛍光の波長が変化する蛍光蛋白質のことである。この蛍光蛋白質としては、例えば、カエデ（Kaede）やファムレット（Phamret）などが良く知られているが、それぞれの蛋白質ごとに若干特性が異なるため、各蛋白質の特徴に合わせた使い方が必要となる。そこで、共通となる基本的なシーケンスについての説明をし、その後、カエデとファムレットを例にとり、それぞれの特徴にあった手順を説明する。

図９は、フォトコンバージョンタイプの蛍光蛋白質を利用する場合に行われる光刺激による励起特性変更処理を説明するフローチャートである。

ステップＳ３１において、ユーザによって、フォトコンバージョンタイプの蛍光蛋白質を発現した試料Ｓがステージ４２上に載置され、所定の操作が行われた場合（ステップＳ３１の「Ｙｅｓ」）、処理が開始される。なお、この例では、試料Ｓは、蛍光蛋白質を神経細胞へ発現させた脳組織であるとする。また、組織中の神経細胞は生かされたままであることとする。

ステップＳ３２において、チャンネル設定部１０５は、ユーザの操作に応じて、１ｃｈ目と２ｃｈ目の各励起レーザ波長と、各蛍光観察フィルタの組み合わせを設定する。

この例では、図１のレーザ走査顕微鏡１１は、少なくとも２つの異なる波長の蛍光を同時に観察するため、蛍光検出部２５においては、ＰＭＴ５３ａないし５３ｃのうち、１つ目のＰＭＴ５３ａを１ｃｈ（チャンネル）、２つ目のＰＭＴ５３ｂを２ｃｈ（チャンネル）と定義して説明する。

すなわち、ユーザは、入力装置１３を操作して、試料Ｓを観察する前に、レーザ走査顕微鏡１１の１ｃｈ目には、光刺激前の蛍光観察が行える設定をし、２ｃｈ目には、光刺激後の蛍光観察が行える設定をしておく。これにより、１ｃｈ，２ｃｈ目の各励起レーザ波長と、各蛍光観察フィルタの組み合わせが設定されるが、その詳細については、カエデ（図１０）とファムレット（図１１）を例にして後述する。

上記の設定が終了した後、制御コントロールユニット２７は、ユーザの操作に応じて、対物レンズ４１やステージ４２等の各部の駆動を制御することで、ステップＳ３３において、試料Ｓの観察部位を決定し、観察に適した観察部位が見つかった場合には、ステップＳ３４において、さらに視野の中から観察したい神経細胞を特定する。この際、蛍光励起に使用する波長は、１ｃｈ目の設定を使用してフォトコンバージョン前の励起波長で走査を行い、取得する蛍光も変化前の蛍光を取得する。

ステップＳ３５において、制御コントロールユニット２７は、レーザ光源部２１を制御して、特定された神経細胞に対し、405nm〜408nmのＵＶレーザ光をあてて、光刺激を与えることにより、蛍光蛋白質の性質を変化させる。このとき、ＵＶレーザ光は、スポット上に収束させ、目的の神経細胞のみに光刺激を行うことが重要であり、目的以外の細胞の色が変化しないように注意する。

この光刺激の最中は、チャンネル設定部１０５は、ステップＳ３６において、刺激前の蛍光と刺激後の蛍光の２波長を同時に観察できる設定をする。この観察の設定は、光刺激と同時に行う設定だけでなく、光刺激と２波長観察を交互に行う設定であってもよい。

これにより、目的の細胞の刺激（性質の変化）具合を観察しつつ、少しずつ光刺激を行い、目的の細胞の励起特性が他と区別できるのに十分な励起特性変化を示したところで、光刺激を止める。その結果、ＵＶレーザ光による細胞へのダメージを最小限とすることが可能である。

すなわち、ユーザは、ＵＶレーザ光による光刺激により、細胞の励起特性が変化していないと判断した場合、光刺激を続行する操作を行い（ステップＳ３７の「Ｎｏ」）、ステップＳ３５及びＳ３７が繰り返し行われ、目的の細胞に対しＵＶレーザ光があてられる。一方、細胞の励起特性が変化したと判断した場合、ユーザは、光刺激を中止する操作を行うことで（ステップＳ３７の「Ｙｅｓ」）、処理は、ステップＳ３８に進む。

光刺激により細胞の励起特性を変化させた後、チャンネル設定部１０５は、ステップＳ３８において、光刺激後の蛍光蛋白質の性質に合わせた２ｃｈ目の励起波長や取得蛍光波長に設定を変更する。これにより、光刺激後の細胞の観察が可能となる。

上記の基本シーケンスにより、光刺激による対象細胞の励起特性変更が行われた後は、励起特性を変更した細胞のみが観察されるために細胞の特定が容易になり、観察部位全体の走査をして試料Ｓの観察対象となる細胞の概略の形状に対応する３次元画像データを取得した後の各断面画像における神経軸策の中心部の指定を、手動でも、画像処理による抽出でも、確実に指定することができるようになる。

次に、その具体例として、カエデを使用した場合について説明する。

カエデは、最初488nmの波長で励起することにより、518nm付近の緑色の蛍光を発し、408nmなどのＵＶレーザ光をあてることにより、561nmの励起で580nm付近のオレンジ色の蛍光を発するようになる。このように、ＵＶレーザ光による光刺激の前後で励起波長と蛍光波長がそれぞれ変わるため、カエデは、２励起２波長タイプの蛍光蛋白質であると言われている。

この性質を活かすためには、上述した図９のステップＳ３２の処理において、１ｃｈ目と２ｃｈ目の励起レーザ波長と、蛍光観察フィルタを適切に設定する必要がある。このような、カエデを使用する場合の設定が行われた図１の蛍光検出部２５の構成について、図１０を参照して説明する。なお、図１０において、図１と対応する部分については、同一の符号が付してある。

例えば、図１のレーザ光源３１ａによって、488nmのレーザ光を試料Ｓに照射した場合、このレーザ光を照射することにより励起された試料Ｓから発せられた蛍光は、レーザ走査部２３等を経由して、蛍光検出部２５に到達し、図１０の光路Ｐ₁上のＤＭ５１ａ₁に入射する。

ＤＭ５１ａ₁は、光路Ｐ₁に対して４５度の傾きを持って配置されるダイクロイックミラーであって、例えば、560nmの波長までの光を反射させ、それよりも長い波長の光を透過させる。従って、ＤＭ５１ａ₁に入射した光のうち、560nmの波長までの光がＢＡ５２ａ₁に入射され、560nmの波長よりも長い光がＤＭ５１ｂ₁に入射される。

ＢＡ５２ａ₁は、例えば、525±25nmの範囲の蛍光を透過させるフィルタであって、その背後の光路Ｐ₂上には、１ｃｈ目のＰＭＴ５３ａが配置される。これにより、ＰＭＴ５３ａには、ＤＭ５１ａ₁により反射され、ＢＡ５２ａ₁を透過した光が入射する。すなわち、この光は、488nmの波長で励起される518nm付近の蛍光となるので、緑色の蛍光を発する神経細胞が、１ｃｈ目のＰＭＴ５３ａにより検出される。

また、例えば、図１のレーザ光源３１ｂによって、561nmのレーザ光を試料Ｓの観察対象である細胞に照射した場合、このレーザ光を照射することにより励起された試料Ｓの観察対象である細胞から発せられた蛍光は、レーザ走査部２３等を経由して、蛍光検出部２５に到達し、図１０のＤＭ５１ａ₁に入射する。そして、ＤＭ５１ａ₁を透過した560nmの波長よりも長い光は、ＤＭ５１ｂ₁に入射する。

ＤＭ５１ｂ₁は、光路Ｐ₁に対して４５度の傾きを持って配置されるダイクロイックミラーであって、例えば、640nmの波長までを反射させ、それよりも長い波長を透過させる。従って、ＤＭ５１ｂ₁に入射した光のうち、640nmの波長までの光がＢＡ５２ｂ₁に入射され、640nmの波長よりも長い光がＢＡ５２ｃ₁に入射される。

ＢＡ５２ｂ₁は、例えば、595±25nmの範囲の蛍光を透過させるフィルタであって、その背後の光路Ｐ₃上には、２ｃｈ目のＰＭＴ５３ｂが配置される。これにより、ＰＭＴ５３ｂには、ＤＭ５１ｂ₁により反射され、ＢＡ５２ｂ₁を透過した光が入射する。すなわち、この光は、561nmの波長で励起される580nm付近の蛍光となるので、オレンジ色の蛍光を発する神経細胞が、２ｃｈ目のＰＭＴ５３ｂにより検出される。

これにより、ＵＶレーザ光による光刺激前には、１ｃｈ目で緑色の蛍光を発する神経細胞を観察することができるので、実験の目的にあった蛍光の発現具合や形状などを持つ細胞を探すことが可能となる。そして、ＵＶレーザ光による光刺激後は、２ｃｈ目でオレンジ色の蛍光を発する細胞のみを観察すること可能となる。

なお、この例では、３ｃｈ目は使用しないため、３ｃｈ目で使用されるＢＡ５２ｃ₁及びＰＭＴ５３ｃの説明は省略する。

次に、ファムレットを使用した場合について説明する。

ファムレットは、457nmの波長で励起することにより、最初は475nm付近の青色の蛍光を発し、408nmなどのＵＶレーザ光をあてることにより、同じ457nmの励起で、今度は509nm付近の緑色の蛍光を発するようになる。このように、ＵＶレーザ光による光刺激の前後で励起波長は同じだが蛍光波長が変わるため、ファムレットは、１励起２波長タイプの蛍光蛋白質であると言われ、励起光が１つで済むことに特徴がある。

この性質を活かすためには、上述したカエデを使用した場合と同様に、図９のステップＳ３２の処理において、１ｃｈ目と２ｃｈ目の励起レーザ波長と、蛍光観察フィルタを適切に設定する必要がある。そこで、図１１を参照して、ファムレットを使用する設定の場合の設定が行われた図１の蛍光検出部２５の構成について説明する。なお、図１１において、図１と対応する部分については、同一の符号が付してある。

例えば、図１のレーザ光源３１ａによって、457nmのレーザ光を試料Ｓの観察対象である細胞に照射した場合、励起された試料Ｓの観察対象である細胞から発せられた蛍光は、レーザ走査部２３等を経由して、蛍光検出部２５に到達し、図１１の光路Ｐ₁上のＤＭ５１ａ₂に入射する。

ＤＭ５１ａ₂は、例えば、515nmの波長までの光を反射させ、それよりも長い波長の光を透過させるダイクロイックミラーであり、ＤＭ５１ａ₂に入射した光のうち、515nmの波長までの光がＢＡ５２ａ₂に入射され、515nmの波長よりも長い光がＤＭ５１ｂ₂に入射される。

ＢＡ５２ａ₂は、例えば、482±17.5nmの範囲の蛍光を透過させるフィルタであり、その背後の光路Ｐ₂上に配置される１ｃｈ目のＰＭＴ５３ａには、ＤＭ５１ａ₂により反射され、ＢＡ５２ａ₂を透過した光が入射する。すなわち、この光は、457nmの波長で励起される475nm付近の蛍光となるので、青色の蛍光を発する神経細胞が、１ｃｈ目のＰＭＴ５３ａにより検出される。

また、ＤＭ５１ｂ₂は、例えば、560nmの波長までの光を反射させ、それよりも長い波長の光を透過させるダイクロイックミラーであり、ＤＭ５１ｂ₂に入射した光のうち、560nmの波長までの光がＢＡ５２ｂ₂に入射され、560nmの波長よりも長い光がＢＡ５２ｃ₂に入射される。

ＢＡ５２ｂ₂は、例えば、525±25nmの範囲の蛍光を透過させるフィルタであり、その背後の光路Ｐ₃上に配置される２ｃｈ目のＰＭＴ５３ｂには、ＤＭ５１ｂ₂により反射され、ＢＡ５２ｂ₂を透過した光が入射する。すなわち、この光は、457nmの波長で励起される509nm付近の蛍光となるので、緑色の蛍光を発する神経細胞が、２ｃｈ目のＰＭＴ５３ｂにより検出される。

これにより、ＵＶレーザ光による光刺激前には、１ｃｈ目で青色の蛍光を発する神経細胞を観察することができるので、実験の目的にあった蛍光の発現具合や形状などを持つ細胞を探すことが可能となる。そして、ＵＶレーザ光による光刺激後は、２ｃｈ目で緑色の蛍光を発する細胞のみを観察すること可能となる。

なお、この例においても、３ｃｈ目は使用しないため、３ｃｈ目で使用されるＢＡ５２ｃ₂及びＰＭＴ５３ｃの説明は省略する。

以上のように、カエデとファムレットの両方について、ＵＶレーザ光による光刺激前は、１ｃｈ目のみの設定と蛍光観察を行い、光刺激中は、１ｃｈ目と２ｃｈ目の設定と蛍光観察を同時に行う。そして、光刺激後は、２ｃｈ目のみの設定と蛍光観察を行うことで、余計な画像信号を排除した状態で、必要な蛍光像のみを取得することが可能となる。

ところで、上述した例では、試料Ｓの観察対象である細胞の断面形状が一定である場合について説明したが、神経細胞などでは、その断面の形状が一定とならないものもある。そこで、次に、図１２のフローチャートを参照して、断面ごとに異なる形状を有する試料Ｓの観察対象である細胞の３次元構造を表示する処理について説明する。

なお、この例では、脳細胞などの神経細胞である試料Ｓの観察対象である細胞を容易に識別できるようにするため、ステップＳ５０において、観察対象となる試料Ｓに対し、図９のＵＶレーザ光による光刺激による励起特性変更処理を事前に行っておくものとする。

ステップＳ５１ないしＳ５４においては、図３のステップＳ１１ないしＳ１４と同様に、走査領域設定部１０１ないし画像処理部１０４によって、例えば、図１３に示すような、断面ごとに異なる形状を有する試料Ｓの観察対象である細胞に対し設定されたＸＹＺ走査領域Ａ_XYZのプレビュー走査が行われ、プレビュー領域Ａ_P1ないしＡ_Pnに対応するプレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnが取得され（図１４ａ）、試料Ｓの観察対象である細胞の３次元画像と、クロップ領域設定画面が表示される。

図１４ａのプレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnのそれぞれには、試料Ｓの観察対象である細胞の断面像が表されているが、試料Ｓの観察対象である細胞は、その中央部が他の紐状の部分と比して膨らんだ形状を有しているので、上記の図５ａに示した断面像とは異なり、プレビュー画像Ｉ_P3などの試料Ｓの観察対象である細胞の中央部の膨らんだ形状に近い位置の断面像ほど、試料Ｓの観察対象である細胞の形状に対応してより大きな断面を有している。また、試料Ｓの観察対象である細胞は光刺激により励起特性を変更させた細胞であるので、その像の他の細胞の像との違いは一目瞭然である（図１４ａのハッチングが施された試料Ｓの観察対象である細胞）。

ステップＳ５５ないしＳ５８においては、図３のステップＳ１５ないしＳ１８と同様に、走査領域設定部１０１、画像取得部１０３、及び画像処理部１０４によって、例えば、図１４ｂに示すように、プレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pn内の励起特性が変更された試料Ｓの断面像上の点を中心とするクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnが選択される。この選択方法としては、ユーザが手動により選択する方法の他、プレビュー画像Ｉ_P1ないしＩ_Pnに対する画像処理により選択する方法でもよく、画像処理によっても励起特性が変更された試料Ｓの観察対象である細胞の像を確実に抽出することが可能となる。このように、ＵＶレーザ光による光刺激によって、予め対象となる細胞である試料Ｓの観察対象である細胞の励起特性を変化させておくことにより、神経軸策の中心部の指定を、手動でも画像処理による抽出でも、間違いなく指定することが可能となる。

ステップＳ５９において、走査領域設定部１０１は、設定された複数のクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnに基づいて、各Ｚステップにおけるクロップ領域Ａ_Cの中心座標を算出する。つまり、各断面ごとに試料Ｓの観察対象である細胞の断面像が異なるので、図１４ｂに示すように、クロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnにおいては、その中心座標だけでなく、領域の大きさも断面ごとに変化する。従って、例えばピエゾ駆動装置により25nmずつ段階的にＺ方向に移動させたときのクロップ領域Ａ_Cの中心座標を、設定された複数のクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cnから算出する。すなわち、図１５に示すような、試料Ｓの観察対象である細胞の走査方向の断面の輪郭を含むクロップ領域Ａ_C1，Ａ_C2，Ａ_C3，・・・，Ａ_Cmが、試料Ｓの各断面の中心点を結んだ軸に沿って求められ、これらのクロップ領域Ａ_C1ないしＡ_Cmを特定するクロップ領域Ａ_Cの中心座標とクロップ領域Ａ_Cが算出される。

ステップＳ６０ないしＳ６２において、図３のステップＳ２０ないしステップＳ２２と同様に、レーザ走査部制御部１０２による制御よって本走査が行われ、画像取得部１０３によって、図１５のクロップ領域Ａ_C1，Ａ_C2，Ａ_C3，・・・，Ａ_Cmに対応するクロップ画像Ｉ_C1，Ｉ_C2，Ｉ_C3，・・・，Ｉ_Cmが順次取得される。

そして、すべてのクロップ領域Ａ_Cに対応するクロップ画像Ｉ_Cが取得されると、ステップＳ６３ないしＳ６５において、図３のステップＳ２３ないしＳ２５と同様に、画像処理部１０４によって、取得されたクロップ画像Ｉ_C1ないしＩ_Cmに対して補間処理が施され、試料Ｓの３次元画像が生成され、パーソナルコンピュータ１２の表示装置１４に表示される。

以上のように、本発明によれば、Ｚ方向に移動させながら、走査の中心を試料Ｓの構造軸に沿った位置に移動させてクロップ走査を行うので、試料Ｓの持つ３次元構造のうち、必要な部分のみを切り出してデータを取得することが可能となる。すなわち、２次元のクロップ走査を用いて高速に各断面を取得することで、結果として高速にＺ方向に移動する、いわば３次元クロップ走査を実現している。そして、この３次元クロップ走査では、最小限の走査時間で、必要な部分のみのデータが切り出されて取得されるので、データ量を削減することが可能となり、メモリやハードディスクといったリソースを闇雲に増やす必要がなくなる。その結果、少ないリソースで、有効な解析を行うことができる。また、全体のデータ量が削減されることにより、ソフトウェアのデータ処理速度を向上させることができる。

また、レーザ走査顕微鏡１１において、Ｚ方向は光軸方向となる。このため、試料Ｓが光軸に対して斜め方向に構造を持っていて、その構造全体を１つの３次元画像データに収めようとした場合、試料Ｓの上端と下端を全て包含する必要があり、必然的に走査領域を拡げる必要が出てくる。このような走査で得られるデータでは、各断面において試料Ｓのデータ部分とは関係のない不要な領域の多い画像となってしまうが、本発明では、３次元クロップ走査により、試料Ｓと関係のある必要な領域を含む画像のみを取得することができる。また、必要な領域のみを走査するので、走査を高速にできるとともに、高解像度の画像を取得することができる。その結果、観察対象である細胞のＺ方向上で起こる生命現象の変化を、ユーザの必要とする時間分解能や水平分解能を得ることが可能となる。

なお、本実施の形態においては、制御コントロールユニット２７にて、デジタル信号から画像を生成して、それをパーソナルコンピュータ１２に送り画像表示する構成で説明したが、そのデジタル信号データをデジタル信号の状態でパーソナルコンピュータ１２に送り、パーソナルコンピュータ１２側で画像を生成して表示してもよい。

また、本実施の形態においては、ピエゾ駆動装置（不図示）によりＺ方向の駆動を行う例について説明したが、勿論、他の駆動手段により駆動してもよく、例えば、対物レンズ４１及びステージ４２を連続的に移動させることができるＤＣモータなどを用いて駆動することができる。

上述した一連の処理は、ハードウェアにより実行させることもできるし、ソフトウェアにより実行させることもできる。一連の処理をソフトウェアにより実行させる場合には、そのソフトウェアを構成するプログラムが、専用のハードウェアに組み込まれているコンピュータ、または、各種のプログラムをインストールすることで、各種の機能を実行することが可能な、例えば汎用のパーソナルコンピュータ等に、記録媒体からインストールされる。

この記録媒体は、コンピュータとは別に、ユーザにプログラムを提供するために配布される、プログラムが記録されている磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、若しくは半導体メモリ等により構成されるだけでなく、コンピュータに予め組み込まれた状態でユーザに提供される、プログラムが記録されている記録手段などで構成される。

また、上述した一連の処理を実行させるプログラムは、必要に応じてルータ、モデム等のインターフェースを介して、ローカルエリアネットワーク、インターネット、デジタル衛星放送といった、有線または無線の通信媒体を介してコンピュータにインストールされるようにしてもよい。

なお、本明細書において、記録媒体に格納されるプログラムを記述するステップは、記載された順序に沿って時系列的に行われる処理はもちろん、必ずしも時系列的に処理されなくとも、並列的あるいは個別に実行される処理をも含むものである。

また、本明細書において、システムとは、複数の装置により構成される装置全体を表すものである。

さらに、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

１ レーザ走査顕微鏡システム， １１ レーザ走査顕微鏡， １２ パーソナルコンピュータ， １３ 入力装置， １４ 表示装置， ２１ レーザ光源部， ２２ ダイクロイックミラー， ２３ レーザ走査部， ２４ 顕微鏡部， ２５ 蛍光検出部， ２６ 透過光検出部， ２７ 制御コントロールユニット， ３１ａ，３１ｂ，３１ｃ レーザ光源， ３２ａ，３２ｂ，３２ｃ シャッタ， ４１ 対物レンズ， ４２ ステージ， ５１ａ，５１ｂ ＤＭ， ５２ａ，５２ｂ，５２ｃ ＢＡ， ５３ａ，５３ｂ，５３ｃ ＰＭＴ， １０１ 走査領域設定部， １０２ レーザ走査部制御部， １０３ 画像取得部， １０４ 画像処理部， １０５ チャンネル設定部， Ａ_C クロップ領域， Ａ_P プレビュー領域， Ｉ_C クロップ画像， Ｉ_P プレビュー画像， Ｒ_MAX 最大領域， Ｓ 試料

Claims (9)

1. 光源と、前記光源からの光を試料上で２次元走査する走査手段と、前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レンズと、前記対物レンズと前記試料とを前記対物レンズの光軸方向に相対移動させる駆動手段とを備えるレーザ走査顕微鏡において、
   前記駆動手段によって第１の移動量ごとに移動させながら、前記走査手段によって前記試料の概略の形状を得るための領域であるプレビュー領域内を走査することで得られるプレビュー画像を取得するプレビュー画像取得手段と、
   取得された前記プレビュー画像に基づいて、前記駆動手段によって前記第１の移動量よりも細かい第２の移動量ごとに移動させながら前記試料の詳細な形状を得るために前記走査手段により走査すべき領域であるクロップ領域を設定するクロップ領域設定手段と、
   前記駆動手段によって前記第２の移動量ごとに移動させながら、前記走査手段によって前記クロップ領域内を走査することで得られるクロップ画像を取得するクロップ画像取得手段と、
   取得された前記クロップ画像に基づいて、前記試料の３次元画像を生成する３次元画像生成手段と
   を備えることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
2. 前記試料には、フォトコンバージョンタイプの蛍光蛋白質が予め発現されており、
   前記蛍光蛋白質が発現された前記試料に対して、所定の波長のＵＶレーザ光を照射するレーザ照射手段をさらに備え、
   前記クロップ領域設定手段は、前記ＵＶレーザ光による光刺激によって励起特性が変化した前記試料の前記プレビュー画像に基づいて、前記クロップ領域を設定する
   ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
3. 前記クロップ領域は、前記プレビュー画像の所定の閾値以上の輝度値を有する領域の重心を中心として決定する
   ことを特徴とする請求項２に記載のレーザ走査顕微鏡。
4. 前記蛍光蛋白質は、フォトコンバージョンタイプの蛍光蛋白質ある
   ことを特徴とする請求項２に記載のレーザ走査顕微鏡。
5. 取得された前記プレビュー画像に基づいて、前記試料の走査方向の各断面の像を表示する表示手段をさらに備え、
   前記クロップ領域設定手段は、ユーザの操作に応じて、前記クロップ領域を設定する
   ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
6. 前記クロップ領域設定手段は、前記第２の移動量ごとに走査される前記クロップ領域の大きさが全て同じになるように、前記クロップ領域を設定する
   ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
7. 前記クロップ領域設定手段は、前記第２の移動量ごとに走査される前記クロップ領域が必要最小限の大きさであって、個別の大きさとなるように、前記クロップ領域を設定する
   ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
8. 光源と、前記光源からの光を試料上で２次元走査する走査手段と、前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レンズと、前記対物レンズと前記試料とを前記対物レンズの光軸方向に相対移動させる駆動手段とを備えるレーザ走査顕微鏡の制御方法において、
   前記駆動手段によって第１の移動量ごとに移動させながら、前記走査手段によって前記試料の概略の形状を得るための領域であるプレビュー領域内を走査することで得られるプレビュー画像を取得し、
   取得された前記プレビュー画像に基づいて、前記駆動手段によって前記第１の移動量よりも細かい第２の移動量ごとに移動させながら前記試料の詳細な形状を得るために前記走査手段により走査すべき領域であるクロップ領域を設定し、
   前記駆動手段によって前記第２の移動量ごとに移動させながら、前記走査手段によって前記クロップ領域内を走査することで得られるクロップ画像を取得し、
   取得された前記クロップ画像に基づいて、前記試料の３次元画像を生成する
   ステップを含むことを特徴とする制御方法。
9. 光源と、前記光源からの光を試料上で２次元走査する走査手段と、前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レンズと、前記対物レンズと前記試料とを前記対物レンズの光軸方向に相対移動させる駆動手段とを備えるレーザ走査顕微鏡の画像処理をコンピュータに実行させるプログラムであって、
   前記駆動手段によって第１の移動量ごとに移動させながら、前記走査手段によって前記試料の概略の形状を得るための領域であるプレビュー領域内を走査することで得られるプレビュー画像を取得し、
   取得された前記プレビュー画像に基づいて、前記駆動手段によって前記第１の移動量よりも細かい第２の移動量ごとに移動させながら前記試料の詳細な形状を得るために前記走査手段により走査すべき領域であるクロップ領域を設定し、
   前記駆動手段によって前記第２の移動量ごとに移動させながら、前記走査手段によって前記クロップ領域内を走査することで得られるクロップ画像を取得し、
   取得された前記クロップ画像に基づいて、前記試料の３次元画像を生成する
   ステップを含むことを特徴とするプログラム。

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