JP2010100581A - Arthritis therapeutic agent - Google Patents
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Abstract
【課題】リウマチ関節炎等の関節炎を効果的に治療でき、副作用のおそれの小さい関節炎治療剤を安価に提供することを目的とする。
【解決手段】関節炎治療剤は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と安定化剤とを含有する。安定化剤としてアテロコラーゲンが好ましい。また、リウマチ関節炎の治療剤としは、ｍｉＲＮＡとして合成ｍｉＲＮＡ−１５ａ、合成ｍｉＲＮＡ−１４６、或いは、合成ｍｉＲＮＡ−３４ａが好ましい。ｍｉＲＮＡは安定化剤に保護され、分解されずに滑膜組織に広範囲に渡って取り込まれる。投与したｍｉＲＮＡが、関節炎を引き起こす遺伝子へタンパク翻訳されるｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を直接分解、或いはｍＲＮＡのタンパク翻訳を阻害するので、滑膜細胞の細胞死が導かれることにより関節炎を治療できる。
【選択図】図５An object of the present invention is to provide an arthritis therapeutic agent that can effectively treat arthritis such as rheumatoid arthritis and has a low risk of side effects at low cost.
An arthritis therapeutic agent contains microRNA (miRNA) and a stabilizer. Atelocollagen is preferred as the stabilizer. Moreover, as a therapeutic agent for rheumatoid arthritis, synthetic miRNA-15a, synthetic miRNA-146, or synthetic miRNA-34a is preferable as miRNA. miRNA is protected by a stabilizer and is taken up extensively in synovial tissue without being degraded. Since the administered miRNA directly degrades messenger RNA (mRNA) that is protein-translated into a gene that causes arthritis, or inhibits protein translation of mRNA, arthritis can be treated by leading to cell death of synovial cells.
[Selection] Figure 5
Description
本発明は、リウマチ関節炎等、関節炎の治療に用いる関節炎治療剤に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for arthritis used for the treatment of arthritis such as rheumatoid arthritis.
関節炎は関節の炎症性疾患であり、主な疾患として、リウマチ関節炎や関節に炎症が認められるその類縁疾患があげられる。リウマチ関節炎は関節リウマチともいわれ、関節内包層の滑膜における炎症性変化を主要病変とする慢性多発性関節炎である。リウマチ関節炎などの関節炎は進行性であり、関節の変形、強直などの関節障害をきたし、効果的な治療が施されずに進行すれば、重症の身体障害にいたることも多い。 Arthritis is an inflammatory disease of the joint, and the main diseases include rheumatoid arthritis and related diseases in which inflammation is observed in the joint. Rheumatoid arthritis, also called rheumatoid arthritis, is chronic polyarthritis with inflammatory changes in the synovial membrane of the joint capsule as the main lesion. Arthritis such as rheumatoid arthritis is progressive and causes joint disorders such as joint deformities and toughness, and if it progresses without effective treatment, it often results in severe disability.
リウマチ関節炎等の関節炎治療では、手術療法或いは薬物療法がなされている。薬物療法では、生物学的製剤が浸透してきている。生物学的製剤とは化学的に合成したものではなく、生体が作る物質を薬剤として使用する製剤である。 In the treatment of arthritis such as rheumatoid arthritis, surgical therapy or drug therapy is performed. In drug therapy, biologics have become permeated. Biological preparations are not chemically synthesized, but are preparations that use substances made by living bodies as drugs.
その他、関節炎治療薬について、特許文献１〜３に開示されている。特許文献１では、チアジアゾリン誘導体を有効成分として含有する関節炎の治療及び／又は予防剤について開示されている。特許文献２では、主たる構成成分としてアンチトロンビンを含有する関節リウマチおよび若年性関節リウマチの治療用薬剤について開示されている。特許文献３では、キノリンまたはキナゾリン系関節炎予防・治療剤と速効性消炎鎮痛剤を組み合わせてなる医薬について開示されている。 In addition, the therapeutic agents for arthritis are disclosed in Patent Documents 1 to 3. Patent Document 1 discloses a therapeutic and / or prophylactic agent for arthritis containing a thiadiazoline derivative as an active ingredient. Patent Document 2 discloses a therapeutic drug for rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis containing antithrombin as a main constituent. Patent Document 3 discloses a pharmaceutical comprising a combination of a quinoline or quinazoline-based arthritis preventive / therapeutic agent and a fast-acting anti-inflammatory analgesic.
上述の生物学的製剤は非常に高価という問題がある。 The biologics described above have the problem of being very expensive.
また、上述の生物学的製剤や関節炎治療剤を投与すると、いくつかの副作用が生じるおそれがある。例えば、副作用として結核や肺炎等の感染症、アレルギーを発症してしまう。 In addition, when the above-mentioned biological preparation or arthritis therapeutic agent is administered, several side effects may occur. For example, as side effects, infectious diseases such as tuberculosis and pneumonia, and allergies develop.
本発明は上記実状に鑑みてなされたものであり、リウマチ関節炎等の関節炎に有効に作用し、副作用のおそれが小さい安価な関節炎治療剤を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide an inexpensive arthritis therapeutic agent that effectively acts on arthritis such as rheumatoid arthritis and has a low risk of side effects.
上記課題を解決するため、本発明に係る関節炎治療剤は、ｍｉｃｒｏＲＮＡと安定化剤とを含有することを特徴とする。 In order to solve the above problems, the therapeutic agent for arthritis according to the present invention is characterized by containing microRNA and a stabilizer.
また、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡが合成ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１５ａ、合成ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４６、或いは合成ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３４ａであることが好ましい。 In addition, the microRNA is preferably synthetic microRNA-15a, synthetic microRNA-146, or synthetic microRNA-34a.
更に、前記安定化剤がアテロコラーゲンであることが好ましい。 Furthermore, the stabilizer is preferably atelocollagen.
更に、リウマチ関節炎治療剤であってもよい。 Further, it may be a therapeutic agent for rheumatoid arthritis.
更に、関節注射用製剤であってもよい。 Further, it may be a joint injection preparation.
本発明によれば、リウマチ関節炎等の関節炎を効果的に治療でき、副作用のおそれの少ない関節炎治療剤を安価に提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, arthritis, such as rheumatoid arthritis, can be treated effectively, and the arthritis therapeutic agent with few side effects can be provided at low cost.
本実施形態に係る関節炎治療剤は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡ）と安定化剤とを含有する。 The therapeutic agent for arthritis according to the present embodiment contains microRNA (hereinafter, miRNA) and a stabilizer.
ｍｉＲＮＡは、２２〜２３塩基対からなる機能性ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現の転写後抑制をする機能を有する。具体的には、ｍｉＲＮＡが複数のタンパク質と複合体を形成し、標的となるｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡ）に結合してｍＲＮＡのタンパク翻訳を抑制している。このようにして、ｍｉＲＮＡの機能により人間の全遺伝子の凡そ１／３が制御されているものと考えられている。 miRNA is a functional non-coding RNA consisting of 22 to 23 base pairs. miRNA has a function of post-transcriptional suppression of gene expression. Specifically, miRNA forms a complex with a plurality of proteins and binds to a target messenger RNA (hereinafter referred to as mRNA) to suppress protein translation of mRNA. Thus, it is considered that approximately 1/3 of all human genes are controlled by the function of miRNA.
本発明者らは、リウマチ関節炎の滑膜細胞において、あるｍｉＲＮＡの発現量が大きく変化していることを見いだした。体内で自己治癒すべく、ｍｉＲＮＡが関節リウマチの滑膜細胞を減少させるために発現が増加したり、或いは、病態に関与している何らかの因子が、関節リウマチの滑膜細胞の細胞死を阻害しないよう、ｍｉＲＮＡの発現を抑えているものと考えられる。したがって、リウマチ関節炎等の病態によって発現量が変化するｍｉＲＮＡを、人為的に制御することで、リウマチ関節炎等の新たな治療となる。 The present inventors have found that the expression level of a certain miRNA is greatly changed in synovial cells of rheumatoid arthritis. MiRNA decreases expression of rheumatoid arthritis synovial cells to self-heal in the body, or some factor involved in the pathology does not inhibit rheumatoid arthritis synovial cell death Thus, it is considered that miRNA expression is suppressed. Therefore, artificially controlling miRNAs whose expression level varies depending on the pathological condition such as rheumatoid arthritis can be a new treatment for rheumatoid arthritis.
ｍｉＲＮＡを滑膜組織に人為的に投与することで、リウマチ関節炎の滑膜細胞等、関節炎の原因となる滑膜細胞の増殖或いは細胞死の阻害に関与する遺伝子の発現を制御できる。ｍｉＲＮＡが関節炎を司る遺伝子へタンパク翻訳されるｍＲＮＡを分解、或いは当該遺伝子へのタンパク翻訳を阻害することにより、関節炎を効果的に治療することができる。 By artificially administering miRNA to synovial tissue, the expression of genes involved in the inhibition of synovial cell proliferation or cell death causing arthritis, such as rheumatoid arthritic synovial cells, can be controlled. Arthritis can be effectively treated by degrading mRNA in which miRNA is protein-translated into a gene that controls arthritis or inhibiting protein translation into the gene.
また、ｍｉＲＮＡは前述のように体内にて自然に発現するものゆえ、体内に人為的に投与したとしても副作用のおそれは少ない。 Moreover, since miRNA is naturally expressed in the body as described above, there is little risk of side effects even if it is artificially administered to the body.
図１から図３は、リウマチ関節炎マウス（ＲＡ）の滑膜組織、及び通常のマウス（Ｎｏｒｍａｌ）の滑膜組織における各種ｍｉＲＮＡの発現量を相対的に示したものである。それぞれｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて評価した結果である。 1 to 3 show the relative expression levels of various miRNAs in the synovial tissue of a rheumatoid arthritis mouse (RA) and in the normal mouse (Normal). The results are evaluated using real time PCR.
リウマチ関節炎の滑膜組織において、図１に示すように、ｍｉＲＮＡ−１５ａの発現量が減少している。これは、リウマチ関節炎に関与している何らかの因子が滑膜細胞の細胞死を阻害しないよう、ｍｉＲＮＡの発現を抑えていること、或いはｍｉＲＮＡ−１５ａがリウマチ関節炎に関与している何らかの因子の排除に用いられ、相対的に減少したものと考えられる。 In the synovial tissue of rheumatoid arthritis, as shown in FIG. 1, the expression level of miRNA-15a is decreased. This is because miRNA-15a suppresses miRNA expression so that any factor involved in rheumatoid arthritis does not inhibit synovial cell death, or miRNA-15a eliminates any factor involved in rheumatoid arthritis. It is used and is considered to have decreased relatively.
また、図２に示すように、リウマチ関節炎マウスでは滑膜組織におけるｍｉＲＮＡ−１４６の発現量が増加している。同様に、図３に示すように、リウマチ関節炎マウスでは滑膜組織におけるｍｉＲＮＡ−３４ａの発現量が増加している。これは、ｍｉＲＮＡ−１４６、ｍｉＲＮＡ−３４ａが遺伝子へタンパク翻訳されるｍＲＮＡを分解或いは当該遺伝子へのタンパク翻訳を阻害するため、相対的に発現量が増加したものと考えられる。 Moreover, as shown in FIG. 2, the expression level of miRNA-146 in synovial tissue is increasing in rheumatoid arthritis mice. Similarly, as shown in FIG. 3, in the rheumatoid arthritis mouse, the expression level of miRNA-34a in the synovial tissue is increased. This is probably because miRNA-146 and miRNA-34a degraded the mRNA that is protein-translated into the gene or inhibited the protein translation into the gene, so the expression level was relatively increased.
リウマチ関節炎の滑膜組織では、上述のように、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１４６、及び、ｍｉＲＮＡ−３４ａの発現量が大きく変化していることから、リウマチ関節炎の治療を行う観点からは、ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１４６、或いはｍｉＲＮＡ−３４ａを用いるとよい。これらのｍｉＲＮＡは合成したものを用いればよい。合成は既知の手法によって行うことができ、安価に提供することが可能である。 In the synovial tissue of rheumatoid arthritis, as described above, the expression levels of miRNA-15a, miRNA-146, and miRNA-34a are greatly changed. From the viewpoint of treating rheumatoid arthritis, MiRNA-15a, miRNA-146, or miRNA-34a may be used. These miRNAs may be synthesized. The synthesis can be performed by a known method and can be provided at low cost.
リウマチ関節炎の場合、関節の滑膜組織に抗アポトーシス作用を有する遺伝子であるＢＣＬ２（Ｂ Ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２）が発現し、ＢＣＬ２がリウマチ関節炎の滑膜細胞の細胞死を抑制している。アポトーシスとは、細胞死を導く性質をいう。したがって、リウマチ関節炎では、滑膜組織に発現するＢＣＬ２の抗アポトーシス作用により、滑膜細胞の細胞死が起こりにくいため、リウマチ関節炎の滑膜細胞が増殖してしまう。この結果、滑膜が肥厚化して炎症がおこる。 In the case of rheumatoid arthritis, BCL2 (B Cell Leukemia / Lymphoma 2), which is a gene having an anti-apoptotic effect, is expressed in the synovial tissue of the joint, and BCL2 suppresses cell death of synovial cells of rheumatoid arthritis. Apoptosis is a property that leads to cell death. Therefore, in rheumatoid arthritis, synovial cells of rheumatoid arthritis proliferate because cell death of synovial cells is unlikely to occur due to the anti-apoptotic effect of BCL2 expressed in the synovial tissue. As a result, the synovium becomes thickened and inflamed.
ｍｉＲＮＡによって、ＢＣＬ２へタンパク翻訳されるｍＲＮＡが直接分解されること、或いは、ｍＲＮＡのタンパク翻訳が阻害されることにより、ＢＣＬ２の発現が抑えられる。ＢＣＬ２の発現が抑えられれば、リウマチ関節炎の滑膜細胞の細胞死が阻害されず、壊死することになる。リウマチ関節炎の滑膜細胞が壊死によって減少し、関節滑膜の肥厚化が抑えられるので、効果的にリウマチ関節炎を治療できる。 miCL directly degrades mRNA that is protein-translated into BCL2, or inhibits protein translation of mRNA, thereby suppressing BCL2 expression. If the expression of BCL2 is suppressed, cell death of rheumatoid arthritis synovial cells is not inhibited and necrosis occurs. Since rheumatoid arthritis synovial cells are reduced by necrosis and thickening of the synovial membrane is suppressed, rheumatoid arthritis can be effectively treated.
しかしながら、ｍｉＲＮＡは非常に分解されやすい性質を有する。分解されやすい性質ゆえ、そのまま合成ｍｉＲＮＡを関節の滑膜組織に投与しても、ｍｉＲＮＡが分解されて一部の滑膜細胞にしか取り込まれない。従って、ＢＣＬ２の発現を効果的に抑制できない。ｍｉＲＮＡを分解されることなく、広範囲に渡って滑膜細胞に取り込ませるために、ｍｉＲＮＡに安定化剤を混入させる。 However, miRNA has the property of being easily degraded. Due to the property of being easily degraded, even if the synthetic miRNA is directly administered to the synovial tissue of the joint, the miRNA is degraded and taken into only some synovial cells. Therefore, the expression of BCL2 cannot be effectively suppressed. In order to incorporate miRNA into synovial cells over a wide range without being degraded, a miRNA is mixed with a stabilizer.
ｍｉＲＮＡに安定化剤を混入すると、図４の模式図に示すように、安定化剤１２がｍｉＲＮＡ１１を被覆した形態になる。ｍｉＲＮＡ１１が安定化剤１２に保護されるので、分解しにくい形態となる。 When a stabilizer is mixed into miRNA, the stabilizer 12 is coated with the miRNA 11 as shown in the schematic diagram of FIG. Since miRNA11 is protected by the stabilizer 12, it becomes a form which is hard to decompose | disassemble.
混入した安定化剤によって、滑膜組織に投与されたｍｉＲＮＡが分解されずに、広範囲に渡って滑膜細胞に取り込まれる。そして、滑膜細胞に取り込まれたｍｉＲＮＡが上述した機能を発揮し、滑膜組織におけるＢＣＬ２の発現が効果的に抑えられる。 The miRNA administered to the synovial tissue is taken up by synovial cells over a wide range without being degraded by the contaminated stabilizer. And miRNA taken in into a synovial cell exhibits the function mentioned above, and the expression of BCL2 in a synovial tissue is suppressed effectively.
安定化剤として、アテロコラーゲン（Ａｔｅｌｏ Ｃｏｌｌａｇｅｎ）が好ましい。アテロコラーゲンは、不溶性コラーゲンをプロテアーゼ（タンパク分解酵素）処理して、コラーゲン分子の両末端にある抗原性のあるテロペプチドを除いて精製される。テロペプチドはコラーゲン分子本体とは異質なもので、アミノ酸組成も本体とは異なりアレルギー反応の原因にもなりやすい。したがって、テロペプチドを切断除外したアテロコラーゲンはアレルギー反応を起こしにくいコラーゲンであり、生体親和性に優れる。この様な理由から、滑膜組織に投与しても副作用が生じるおそれが小さい。 As a stabilizer, atelocollagen is preferred. Atelocollagen is purified by treating insoluble collagen with protease (proteolytic enzyme) to remove antigenic telopeptides at both ends of the collagen molecule. The telopeptide is different from the collagen molecule main body, and unlike the main body, the amino acid composition tends to cause an allergic reaction. Therefore, atelocollagen from which telopeptide is cleaved away is a collagen that hardly causes an allergic reaction and has excellent biocompatibility. For these reasons, there is little risk of side effects even when administered to synovial tissue.
本実施形態に係る関節炎治療剤は、上述したように、安定化剤にｍｉＲＮＡを混入することで得られる。そして、この関節炎治療剤は、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などが混合していてもよい。 As described above, the therapeutic agent for arthritis according to the present embodiment is obtained by mixing miRNA into the stabilizer. The therapeutic agent for arthritis may be mixed with a physiologically acceptable carrier, excipient, binder, diluent and the like.
そして、関節注射用製剤として、関節注射により滑膜組織へ非経口投与することが好ましい。関節注射にて直接投与することで、リウマチ関節炎の滑膜細胞に効率よくｍｉＲＮＡを行き渡らせることができる。 And it is preferable to administer parenterally to a synovial tissue by joint injection as a formulation for joint injection. By directly administering by joint injection, miRNA can be efficiently distributed to synovial cells of rheumatoid arthritis.
注射用製剤、例えば、無菌注射用水性懸濁物あるいは油性懸濁物は、適当な分散化剤または湿化剤及び懸濁化剤を用いて当該分野で知られた方法で調整されうる。無菌注射用製剤は、例えば水溶液などの非毒性の非経口投与できる希釈剤、あるいは無菌の注射可能な溶液または懸濁液であってよい。 Injectable preparations, for example, sterile injectable aqueous or oleaginous suspensions may be prepared according to methods known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. The sterile injectable preparation may be a non-toxic parenterally acceptable diluent such as an aqueous solution, or a sterile injectable solution or suspension.
リウマチ関節炎マウスを用い、関節炎治療剤に含有するｍｉＲＮＡ−１５ａが滑膜細胞に取り込まれ、ＢＣＬ２の発現の抑制、及びリウマチ関節炎の滑膜細胞のアポトーシスを導くことを検証した。 Using rheumatoid arthritis mice, it was verified that miRNA-15a contained in a therapeutic agent for arthritis is taken up by synovial cells, leading to suppression of BCL2 expression and apoptosis of synovial cells of rheumatoid arthritis.
ＤＢＡ１／Ｊマウス雄７週齢を用いて、抗（II）型コラーゲン抗体誘導による関節炎マウスを準備した。 Arthritic mice induced by anti- (II) type collagen antibody were prepared using 7 weeks old male DBA1 / J mice.
合成ｍｉＲＮＡ−１５ａを準備し、１０μｌの純水に１０μｇの合成ｍｉＲＮＡ−１５ａを溶解し、１０μｌのアテロコラーゲンに混入して関節炎治療剤を用意した。この関節炎治療剤には、蛍光標識として蛍光蛋白を結合させた抗体を混入した。この抗体はｍｉＲＮＡ−１５ａに特異的に結合する抗体である。以下、これを試薬１と記す。 Synthetic miRNA-15a was prepared, 10 μg of synthetic miRNA-15a was dissolved in 10 μl of pure water, and mixed with 10 μl of atelocollagen to prepare a therapeutic agent for arthritis. This arthritis therapeutic agent was mixed with an antibody bound with a fluorescent protein as a fluorescent label. This antibody is an antibody that specifically binds to miRNA-15a. Hereinafter, this is referred to as Reagent 1.
また、１０μｌの純水に１０μｇの合成ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（合成ｓｉＲＮＡ）を溶解し、１０μｌのアテロコラーゲンに混入し、更に、試薬１と同様、蛍光標識として蛍光蛋白を結合させた抗体を混入した。以下、これを試薬２と記す。合成ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡのタンパク翻訳を阻害する機能を有しないＲＮＡである。 Further, 10 μg of synthetic scrambled short interfering RNA (synthetic siRNA) was dissolved in 10 μl of pure water, mixed with 10 μl of atelocollagen, and, similarly to reagent 1, an antibody bound with a fluorescent protein as a fluorescent label was mixed. Hereinafter, this is referred to as reagent 2. Synthetic siRNA is RNA that does not have the function of inhibiting protein translation of mRNA.
試薬１及び試薬２それぞれ２０ｍｌをリウマチ関節炎マウスの右膝関節の滑膜組織に関節注射した。なお、それぞれの試薬について、５体のマウスの右膝関節に注射した。 20 ml each of Reagent 1 and Reagent 2 were jointly injected into the synovial tissue of the right knee joint of rheumatoid arthritis mice. Each reagent was injected into the right knee joint of five mice.
それぞれの試薬の投与から２４時間後、投与した合成ｍｉＲＮＡ−１５ａが滑膜組織に取り込まれているか否かをｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲにより評価した。 24 hours after administration of each reagent, it was evaluated by real time PCR whether or not the administered synthetic miRNA-15a was taken up into the synovial tissue.
図５は、試薬１及び試薬２を投与した滑膜組織におけるｍｉＲＮＡ−１５ａの相対量を示している。試薬１を投与した場合のｍｉＲＮＡ−１５ａの発現量は、試薬２を投与した場合の発現量に比べ凡そ３．５倍となっている。アテロコラーゲンの作用により、投与したｍｉＲＮＡ−１５ａは２４時間後にも分解されず、滑膜組織に取り込まれたことがわかる。 FIG. 5 shows the relative amount of miRNA-15a in the synovial tissue administered with Reagent 1 and Reagent 2. The expression level of miRNA-15a when Reagent 1 is administered is approximately 3.5 times the expression level when Reagent 2 is administered. By the action of atelocollagen, it can be seen that the administered miRNA-15a was not degraded after 24 hours and was taken up into the synovial tissue.
続いて、滑膜組織におけるｍｉＲＮＡ−１５ａの分布状況を顕微鏡により観察した。図６が試薬１を投与したマウスの右膝関節の滑膜組織の写真であり、図６（Ａ）が光学顕微鏡写真、図６（Ｂ）が図６（Ａ）と同部位におけるｍｉＲＮＡ−１５ａの分布状況を示す蛍光顕微鏡写真である。また、図７は試薬２を投与したマウスの右膝関節の滑膜組織の写真であり、図７（Ａ）が光学顕微鏡写真、図７（Ｂ）が図７（Ａ）と同部位におけるｍｉＲＮＡ−１５ａの分布状況を示す蛍光顕微鏡写真である。図６（Ｂ）及び図７（Ｂ）では、前述の蛍光蛋白で染色された箇所が表れている。 Subsequently, the distribution of miRNA-15a in the synovial tissue was observed with a microscope. 6 is a photograph of the synovial tissue of the right knee joint of a mouse administered with reagent 1, FIG. 6 (A) is an optical micrograph, and FIG. 6 (B) is miRNA-15a at the same site as FIG. 6 (A). It is the fluorescence micrograph which shows the distribution condition of. 7 is a photograph of the synovial tissue of the right knee joint of a mouse administered with reagent 2. FIG. 7 (A) is an optical micrograph and FIG. 7 (B) is a miRNA at the same site as FIG. 7 (A). It is a fluorescence micrograph which shows the distribution condition of -15a. 6 (B) and 7 (B), the portion stained with the aforementioned fluorescent protein appears.
試薬１を投与した場合では、図６（Ｂ）を見ると、滑膜組織が染色されていることがわかる。合成ｍｉＲＮＡ−１５ａが広範囲に渡って滑膜組織に取り込まれていることがわかる。 When reagent 1 is administered, it can be seen from FIG. 6B that the synovial tissue is stained. It can be seen that the synthetic miRNA-15a is taken up into the synovial tissue over a wide range.
一方、試薬２を投与した場合には、図７（Ｂ）に示すように、骨以外はあまり染色されていないことから、ｍｉＲＮＡ−１５ａは滑膜組織にほとんど存在しないことがわかる。 On the other hand, when Reagent 2 is administered, as shown in FIG. 7 (B), it is found that miRNA-15a is hardly present in the synovial tissue because it is not stained much except for bone.
続いて、滑膜細胞にｍｉＲＮＡ−１５ａが取り込まれているかを、細胞核の免疫染色により検証した。 Subsequently, it was verified by immunostaining of cell nuclei whether miRNA-15a was incorporated into synovial cells.
図８（Ａ）は図６（Ｂ）の破線で囲った箇所の拡大写真である。また、図８（Ｂ）は図８（Ａ）と同部位の細胞核を免疫染色した蛍光顕微鏡写真である。そして、図８（Ｃ）は滑膜細胞と細胞核双方の染色状況を示した写真である。なお、図８（Ｃ）は、理解の容易のため、図８（Ｂ）の色調を反転させ、図８（Ａ）と合成したものである。 FIG. 8A is an enlarged photograph of a portion surrounded by a broken line in FIG. FIG. 8 (B) is a fluorescence micrograph obtained by immunostaining the cell nucleus at the same site as in FIG. 8 (A). FIG. 8C is a photograph showing the staining state of both synovial cells and cell nuclei. Note that FIG. 8C is obtained by inverting the color tone of FIG. 8B and combining it with FIG. 8A for easy understanding.
図８（Ｃ）を見ると、ｍｉＲＮＡ−１５ａが取り込まれた細胞とその細胞核は一致していることがわかる。従って、ｍｉＲＮＡ−１５ａは広範囲に渡って滑膜組織に取り込まれ、且つ、それぞれの滑膜細胞に取り込まれていることを確認した。 FIG. 8 (C) shows that the cell into which miRNA-15a has been taken up coincides with its cell nucleus. Therefore, it was confirmed that miRNA-15a was taken up into a synovial tissue over a wide range and taken into each synovial cell.
続いて、ｍｉＲＮＡ−１５ａによってＢＣＬ２の発現が減少することを、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ、及び滑膜組織中のＢＣＬ２の免疫染色により検証した。 Subsequently, the reduction of BCL2 expression by miRNA-15a was verified by Western blotting and immunostaining of BCL2 in synovial tissue.
ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出は、前述の試薬１を投与した滑膜組織及び試薬２を投与した滑膜組織を磨りつぶしたものを用意して行った。 Western blotting detection was performed by preparing the above-described synovial tissue administered with Reagent 1 and the synovial tissue administered with Reagent 2 polished.
図９（Ａ）に、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出によるＢＣＬ２の発現量を示す。なお、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出において、５２ｋＤａのバンドにＢＣＬ２が検出される。また、図９（Ｂ）は、４３ｋＤａのバンドにて検出されるＡｃｔｉｎの結果であり、ＢＣＬ２の検出結果の妥当性を示す指標となる。図９（Ｂ）で試薬１及び試薬２を投与した滑膜組織では、Ａｃｔｉｎの検出結果に差がないため、図９（Ａ）に示すＢＣＬ２の検出結果は妥当性を有している。 FIG. 9 (A) shows the expression level of BCL2 by Western blotting detection. In the case of Western blotting detection, BCL2 is detected in a 52 kDa band. FIG. 9B shows the result of Actin detected in the 43 kDa band, which is an index indicating the validity of the detection result of BCL2. In the synovial tissue to which Reagent 1 and Reagent 2 are administered in FIG. 9B, there is no difference in the detection result of Actin, so the detection result of BCL2 shown in FIG. 9A has validity.
図９（Ａ）中に、黒く現れている箇所がＢＣＬ２の発現を示している。試薬１を投与した滑膜組織では、試薬２を投与した滑膜組織に比べ、黒く現れている部分が少ない。したがって、試薬１を投与することにより、ＢＣＬ２の発現が減少することを確認した。 In FIG. 9A, black spots indicate the expression of BCL2. The synovial tissue administered with Reagent 1 has fewer black portions than the synovial tissue administered Reagent 2. Therefore, it was confirmed that administration of reagent 1 decreased the expression of BCL2.
図１０は、試薬１を投与した滑膜組織を用い、ＢＣＬ２の免疫染色を行った蛍光顕微鏡写真である。また、図１１は、試薬２を投与した滑膜組織を用いてＢＣＬ２の免疫染色を行った蛍光顕微鏡写真である。図１０及び図１１いずれもＢＣＬ２が染色されて表れている。 FIG. 10 is a fluorescence micrograph of immunostaining BCL2 using the synovial tissue administered with Reagent 1. FIG. 11 is a fluorescence micrograph of BCL2 immunostained using the synovial tissue administered with Reagent 2. Both FIG. 10 and FIG. 11 show BCL2 stained.
試薬１を投与した場合では、試薬２を投与した場合に比べて、染色部分が小さいことから、投与したｍｉＲＮＡ−１５ａの作用によりＢＣＬ２の発現が減少していることがわかる。 When Reagent 1 is administered, the stained portion is smaller than when Reagent 2 is administered, indicating that the expression of BCL2 is reduced by the action of administered miRNA-15a.
以上のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出及びＢＣＬ２の免疫染色の結果から、投与された合成ｍｉＲＮＡ−１５ａはアテロコラーゲンの作用により、滑膜組織の細胞に取り込まれ、ＢＣＬ２の発現が抑えられることを確認した。 From the results of the above Western blotting detection and BCL2 immunostaining, it was confirmed that the administered synthetic miRNA-15a was taken into the cells of the synovial tissue by the action of atelocollagen and the expression of BCL2 was suppressed.
更に、関節注射３日後におけるマウスの右膝関節に、アポトーシスの指標であるカスパーゼ３の免疫染色を行い、リウマチ関節炎の滑膜細胞のアポトーシスが誘導されるか否かを検証した。なお、カスパーゼは、細胞にアポトーシスを起因させるシグナル伝達経路を構成する、一群のシステインプロテアーゼであり、カスパーゼ３はアポトーシスの実行そのものに関わるエフェクター・カスパーゼの一種である。 Furthermore, immunostaining of caspase 3, which is an indicator of apoptosis, was performed on the right knee joint of the mouse 3 days after joint injection to verify whether apoptosis of rheumatoid arthritis synovial cells was induced. Caspase is a group of cysteine proteases that constitute a signal transduction pathway that causes apoptosis in cells, and caspase 3 is a kind of effector caspase involved in the execution of apoptosis itself.
試薬１及び試薬２を投与して３日経過した後のマウスの右膝関節に、カスパーゼ３と特異的に結合する抗体を反応させた。この抗体には蛍光標識として蛍光蛋白を結合させている。 An antibody that specifically binds to caspase 3 was allowed to react with the right knee joint of the mouse 3 days after administration of Reagent 1 and Reagent 2. A fluorescent protein is bound to this antibody as a fluorescent label.
図１２（Ａ）は試薬１を投与した滑膜組織のカスパーゼ３の免疫染色を示す蛍光顕微鏡写真、図１２（Ｂ）は図１２（Ａ）と同部位の細胞核の免疫染色を示す蛍光顕微鏡写真である。一方、図１３（Ａ）は試薬２を投与した滑膜組織のカスパーゼ３の免疫染色を示す蛍光顕微鏡写真、図１３（Ｂ）は図１３（Ａ）と同部位の細胞核の免疫染色を示す蛍光顕微鏡写真である。 FIG. 12 (A) is a fluorescence micrograph showing immunostaining of caspase 3 of synovial tissue administered with reagent 1, and FIG. 12 (B) is a fluorescence micrograph showing immunostaining of cell nuclei at the same site as FIG. 12 (A). It is. On the other hand, FIG. 13 (A) is a fluorescence micrograph showing immunostaining of caspase 3 of synovial tissue administered with reagent 2, and FIG. 13 (B) is a fluorescence showing immunostaining of cell nuclei at the same site as FIG. 13 (A). It is a micrograph.
図１２（Ａ）を見ると、図１３（Ａ）の結果に比べ、カスパーゼ３が多く発現していることがわかる。また、図１２（Ｂ）を見ると、図１３（Ｂ）と比較して細胞核が少ないことがわかる。カスパーゼ３の免疫染色の結果から、試薬１を投与することで、ＢＣＬ２の発現が抑制され、細胞のアポトーシスを起因するカスパーゼ３が発現し、リウマチ関節炎の滑膜細胞のアポトーシスが導かれ、滑膜細胞に細胞死を起こさせ得ることを確認した。 From FIG. 12A, it can be seen that more caspase 3 is expressed than the result of FIG. 13A. 12B shows that there are fewer cell nuclei than FIG. 13B. From the result of immunostaining of caspase 3, administration of reagent 1 suppresses the expression of BCL2, expresses caspase 3 resulting from apoptosis of cells, and leads to apoptosis of synovial cells of rheumatoid arthritis. It was confirmed that cells could cause cell death.
続いて、関節注射した合成ｍｉＲＮＡ−１５ａによる他の臓器への影響を、各臓器におけるｍｉＲＮＡ−１５ａの発現量にて検証した。ｍｉＲＮＡ−１５ａの発現は、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて評価した。 Subsequently, the effect of the synthetic miRNA-15a injected into the joint on other organs was verified by the expression level of miRNA-15a in each organ. The expression of miRNA-15a was evaluated using real time PCR.
図１４に、他の臓器におけるｍｉＲＮＡ−１５ａの発現量を示す。試薬１を投与した場合、膝関節におけるｍｉＲＮＡ−１５ａの発現量は試薬２を投与した場合に比べて大きく増加しているが、他の肝臓、肺、脾臓、腎臓、及び心臓におけるｍｉＲＮＡ−１５ａの発現量は、試薬２を投与した場合と比べてさほど差がないことがわかる。したがって、本実施形態に係る関節炎治療剤を投与しても、体内のｍｉＲＮＡ−１５ａの量的バランスが崩れることに起因して副作用が生じるおそれは少ない。 FIG. 14 shows the expression level of miRNA-15a in other organs. When Reagent 1 was administered, the expression level of miRNA-15a in the knee joint was greatly increased compared to that when Reagent 2 was administered, but miRNA-15a in other liver, lung, spleen, kidney, and heart It can be seen that the expression level is not much different from that when the reagent 2 is administered. Therefore, even when the arthritis therapeutic agent according to the present embodiment is administered, there is little possibility of causing side effects due to the loss of the quantitative balance of miRNA-15a in the body.
以上の結果から、滑膜組織に投与された合成ｍｉＲＮＡ−１５ａは滑膜細胞内に取り込まれており、ＢＣＬ２の発現が少なくなっていることから、ＢＣＬ２の発現が抑制されること、或いはＢＣＬ２にタンパク翻訳されるｍＲＮＡが分解されることが検証できた。そして、ＢＣＬ２の発現が抑えられることで、細胞死を導くカスパーゼの発現が促進されることから、リウマチ関節炎の滑膜細胞は減少していくものと考えられる。従って、リウマチ関節炎に対する治療効果を有する。 From the above results, the synthetic miRNA-15a administered to the synovial tissue is taken up into the synovial cells and the expression of BCL2 is reduced, so that the expression of BCL2 is suppressed, or It was verified that mRNA that was translated into protein was degraded. And, since the expression of caspase leading to cell death is promoted by suppressing the expression of BCL2, it is considered that the number of synovial cells in rheumatoid arthritis decreases. Therefore, it has a therapeutic effect on rheumatoid arthritis.
医療現場において、リウマチ関節炎等、種々の関節炎の薬物療法に利用することができる。 It can be used for medical treatment of various arthritis such as rheumatoid arthritis in the medical field.
１１ ｍｉＲＮＡ
１２ 安定化剤
11 miRNA
12 Stabilizer
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Cited By (1)
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| WO2022009873A1 (en) * | 2020-07-06 | 2022-01-13 | 花王株式会社 | Rna stabilizer |
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2008
- 2008-10-24 JP JP2008274703A patent/JP2010100581A/en active Pending
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| WO2022009873A1 (en) * | 2020-07-06 | 2022-01-13 | 花王株式会社 | Rna stabilizer |
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