JP2010029212A

JP2010029212A - Ｃ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸

Info

Publication number: JP2010029212A
Application number: JP2009256538A
Authority: JP
Inventors: Michinori Obara; 道法小原; Tsunamasa Watanabe; 綱正渡邉; Kazumasa Tahira; 和誠多比良; Makoto Miyagishi; 真宮岸; Masayuki Sudo; 正幸須藤
Original assignee: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science; Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science; Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-01-24
Filing date: 2009-11-09
Publication date: 2010-02-12
Also published as: JP4545091B2; WO2004078974A1; EP1591524A1; EP1591524A4; EP2071030A2; US20060128617A1; JPWO2004078974A1; EP2071030A3

Abstract

【課題】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製能を阻害する方法を提供する。
【解決手段】ＨＣＶ−ＲＮＡに対して配列特異的に結合するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸、これらを有効成分とするＣ型肝炎治療剤を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸、該オリゴヌクレオチドを発現するベクター、これらを有効成分とするＣ型肝炎治療剤、並びに該オリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸をＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡに結合させてウイルスの複製能を阻害する方法に関する。

Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」という）は、輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスであり、その遺伝子のcDNAは1989年にクローニングされた。これまでにクローニングされた遺伝子cDNAを用いてＨＣＶに関する多くの研究が行われており、特に感染予防ならびに診断法の確立など社会的に重要な成果が達成され、現在では輸血後のＨＣＶ感染はほとんど認められない状況に至っている。しかしながら、世界中のＨＣＶ感染者数は全人口の数％にもおよぶとされている。

ＨＣＶ感染に起因する肝炎は長期慢性化する特徴があり、これに伴い慢性肝炎を引き起こし、その後肝硬変、さらに肝癌に移行する割合が非常に高いことが知られており、ＨＣＶ感染後の肝炎の確実な治療が重要な課題となっている。

Ｃ型慢性肝炎の治療法については、インターフェロン（ＩＦＮ）療法が広く施行されているが、有効率が約30％であること、高頻度に発熱などの副作用が誘導されること、高薬価であることなどの問題が存在している。ＩＦＮの種類、用法・用量の検討もなされ、コンセンサスＩＦＮの開発などにより有効率の向上も期待され、また、ＩＦＮとリバビリンなどの抗ウイルス剤の併用による治療も試みられているが、現在までのところいずれも確実な治療法には至っていない。

一方、近年、動物の生体内における細胞内での特定の遺伝子の発現を抑制する方法として、標的遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡを用いて標的遺伝子の発現を抑制する方法が見出された(Fire Aら、Nature 1998年 391巻 p.806-811)。この方法はＲＮＡインターフェアランス(RNAi)と呼ばれ、二本鎖ＲＮＡ(dsRNA)を細胞内に導入した際に、そのＲＮＡ配列に対応する細胞内のmRNAが特異的に分解され、そのmRNAによってコードされる蛋白質が発現されなくなる現象をいう。RNAiは、新規遺伝子の機能を遺伝子発現阻害により調べる上で有効な方法であり、線虫、ショウジョウバエなどで遺伝子機能解析に盛んに用いられている。

しかし、RNAiが病気の治療、特にＣ型肝炎などのウイルス性疾患の治療に有効であるか否かは不明であった。

Fire Aら、Nature 1998年 391巻 p.806-811

本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、ＨＣＶのＲＮＡ（ＨＣＶ-ＲＮＡ）に対して配列特異的に結合するオリゴリボヌクレオチド（以下「オリゴＲＮＡ」ということもある）またはペプチド核酸が、ＨＣＶの複製を阻害することを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、以下の（１）〜（１３）を提供する。
（１）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡに対して配列特異的に結合するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（２）ＨＣＶのＲＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、上記（１）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（３）ＨＣＶのＲＮＡの5'非翻訳領域の配列とハイブリダイズすることを特徴とする、上記（１）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（４）遺伝子型の異なる複数種のＨＣＶの遺伝子配列において、同一性の高い領域の配列とハイブリダイズすることを特徴とする、上記（１）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（５）二本鎖ＲＮＡである、上記（１）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（６）鎖長が19〜23bpである、上記（１）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（７）配列番号２０〜３４に示すヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチド。
（８）上記（７）に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
（９）配列番号４７〜５５に示すヌクレオチド配列において連続する19〜23塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴリボヌクレオチド。
（１０）上記（９）に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
（１１）（１）〜（１０）に記載のオリゴリボヌクレオチドを発現するベクター。
（１２）（１）〜（１０）に記載のオリゴリボヌクレオチド若しくはペプチド核酸、または（１１）に記載のベクターを有効成分とするＣ型肝炎治療剤。
（１３）（１）〜（１０）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸をＨＣＶ-ＲＮＡに結合させて、ＨＣＶの複製能を阻害する方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2003-016750号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。

ＨＣＶ-ＲＮＡの5'側の非翻訳領域における一般的な二次構造を示す。ＨＣＶ-ＲＮＡの3'側の非翻訳領域における一般的な二次構造を示す。ＨＣＶの分離株HCV-1、HCV-BK、HCV-JのRNAの5'側の非翻訳領域からコア領域の500塩基についてのcDNA配列を示す。ＨＣＶの分離株R6、R24、S14JのRNAの5'側の非翻訳領域からコア領域の500塩基についてのcDNA配列を示す。ＨＣＶの分離株HCJ6、JFH1、JCH1のRNAの5'側の非翻訳領域からコア領域の500塩基についてのcDNA配列を示す。ＨＣＶの分離株JCH3及びHCJ8のRNAの5'側の非翻訳領域からコア領域の500塩基についてのcDNA配列を示す。各種ＨＣＶの5'非翻訳領域からコア領域の500塩基についてのマルチプルアライメントの結果の一部を示す。各種ＨＣＶの5'非翻訳領域からコア領域の500塩基についてのマルチプルアライメントの結果（図４Ａの続き）を示す。各種ＨＣＶの5'非翻訳領域からコア領域の500塩基についてのマルチプルアライメントの結果（図４Ｂの続き）を示す。 pH77J6S、R6、R24L、R24SのRNAの3'側の非翻訳領域についてのcDNA配列を示す。 HCJ6CH、JFH1、JCH1、2b_AB030907のRNAの3'側の非翻訳領域についてのcDNA配列を示す。 siRNA添加とRz-HepM6細胞株が産生するＨＣＶコアタンパク量との関係を示す。 siRNA添加とＨＣＶレプリコンが複製する活性との関係を示す。ダイサー処理で調製したsiRNAの添加とＨＣＶレプリコンが複製する活性との関係を示す。ダイサー処理で調製したsiRNAの添加とＨＣＶレプリコンが複製する活性との関係を示す。

本発明のＨＣＶ-ＲＮＡに対して配列特異的に結合するオリゴＲＮＡは、糖としてリボースを有するオリゴヌクレオチドであり、塩基としては、天然のＲＮＡ中に存在するアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルの他、チミン、並びに他の修飾塩基等を含むものも包含する。本発明のオリゴＲＮＡは、ＨＣＶ-ＲＮＡに配列特異的に結合可能なオリゴＲＮＡであれば特に制限されないが、ＨＣＶの複製能を阻害するオリゴＲＮＡであることが好ましい。ＨＣＶ-ＲＮＡに配列特異的に結合可能なオリゴＲＮＡとしては、例えば、ＨＣＶ-ＲＮＡの配列と相補的な配列を有するオリゴＲＮＡ、ＨＣＶ-ＲＮＡの配列と相補的な配列と高い同一性を示す配列を有するオリゴＲＮＡ、ＨＣＶ-ＲＮＡの配列を有するＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なオリゴＲＮＡ等を挙げることができる。尚、本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、本発明の好ましい一態様であるsiRNAは、細胞内で標的遺伝子にハイブリダイズしてダイサーを介して標的遺伝子を切断するものであり、標的遺伝子は19〜23ntの長さに切断されると考えられている。一方、本発明の他の態様であるアンチセンス核酸は、標的遺伝子にハイブリダイズしてＩＦＮを誘導し、RNaseを活性化することによって標的遺伝子を分解すると考えられる。あるいは、結合によって標的ＲＮＡの構造変化を起こして翻訳を阻害すると考えられている。また、本発明において、ＨＣＶ−ＲＮＡの配列とは、ＨＣＶのゲノムＲＮＡ（−鎖）の配列、ゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡ（＋鎖）の配列のいずれでも良いが、好ましくは＋鎖の配列である。

尚、本明細書において、siRNAとは、オリゴＲＮＡの中でも、その長さが19〜23nt（19〜23bp）のものをいう。siRNAが二本鎖を形成している場合、一方または双方が突出末端を有していても良い。

本発明において高い同一性とは、70％以上の同一性であり、好ましくは80％以上の同一性であり、さらに好ましくは90％以上の同一性（例えば95％以上の同一性）である。塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)等によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。

ハイブリダイゼーション技術は当業者によく知られた技術であり（例えばSambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989、など）、ストリンジェントな条件も当業者であれば適宜選択することが可能である。ストリンジェントな条件の例としては、例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において42℃、5×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、5×SSC 、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは65℃、0.1×SSC及び0.1％SDSの条件である。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

本発明のオリゴＲＮＡは一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、又、さらに二本以上の複数の鎖から形成されていてもよいが、好ましいのは二本鎖である。二本鎖は独立した2本の鎖から形成されていてもよいし、又、自己相補的な一本鎖ＲＮＡ中で形成される二本鎖であってもよく、この場合、一分子でステム−ループ構造を形成することができる。オリゴＲＮＡが二本鎖の場合、全ての領域において二本鎖を形成していてもよいし、一部の領域（例えば両末端又は片方の末端など）が一本鎖等の他の構造を形成していてもよい。

本発明のオリゴＲＮＡは、ＨＣＶ-ＲＮＡへの配列特異的結合能を有していればよく、その長さは限定されない。本発明のオリゴＲＮＡの長さとしては、例えば、5〜1000塩基（二本鎖の場合には、5〜1000bp）であり、好ましくは10〜100塩基（二本鎖の場合には、10〜100bp）であり、さらに好ましくは15〜25塩基（二本鎖の場合には、15〜25bp）であり、特に好ましくは19〜23塩基（二本鎖の場合には、19〜23bp）である。

本発明において好ましいオリゴＲＮＡは、配列番号２０〜３４に示すヌクレオチド配列を有するオリゴＲＮＡであり、特に好ましいものとして配列番号２０〜２５に示すヌクレオチド配列を有するオリゴＲＮＡが挙げられる。また、本発明において好ましい他のオリゴＲＮＡとして、配列番号４７〜５５に示すヌクレオチド配列における連続した19〜23塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴＲＮＡが挙げられる。

本発明において好ましい更に他のオリゴＲＮＡとして、例えば上記配列番号２０〜３４に示すヌクレオチド配列を有するオリゴＲＮＡと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴＲＮＡ、及び上記配列番号４７〜５５に示すヌクレオチド配列における連続した19〜23塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴＲＮＡと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴＲＮＡが挙げられる。当業者であれば、これらのオリゴＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域を任意のＨＣＶ種において容易に決定することができる。これらのオリゴＲＮＡの例として、例えば上記配列番号２０〜３４に示すヌクレオチド配列、あるいは上記配列番号４７〜５５に示すヌクレオチド配列における連続した19〜23塩基からなるヌクレオチド配列において、７個以下、好ましくは５個以下、より好ましくは３個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＨＣＶのＲＮＡとハイブリダイズすることによってＨＣＶの複製を阻害し得るものが挙げられる。

また、本発明において好適に使用できるペプチド核酸として、本発明において好適に使用できるオリゴＲＮＡと対応する塩基配列を有するペプチド核酸が挙げられる。

ＨＣＶのＲＮＡは、約340ヌクレオチドの5'側の非翻訳領域（5'非翻訳領域）、約9400ヌクレオチドからなるオープン・リーディング・フレーム(ORF)、約50ヌクレオチドからなる3'側の非翻訳領域（3'非翻訳領域）で構成されている。このＲＮＡ配列中、本発明のオリゴＲＮＡがターゲットとする部位は特に限定されず、どの部位でもよいが、好ましくは5'非翻訳領域〜ORFの5'末端領域（例えば、配列番号１〜１１に示す塩基配列を有する領域）、3'非翻訳領域（例えば、配列番号１２〜１９に示す塩基配列を有する領域）であり、特に好ましくは5’非翻訳領域である。

ＨＣＶ-ＲＮＡの5'非翻訳領域には、インターナル・リボソーム・エントリー・サイト（Internal Ribosomal Entry Site ： IRES）やステムループを形成するステム領域などが存在する。ＨＣＶの5'非翻訳領域やIRES、ステム領域については既に多くの報告がある(Kato. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 9524-9528, (1990)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88, 2451-2455, (1991)、J. Viol., 65, 1105-1113, (1991)、J. Gen. Viol., 72, 2697-2704, (1991)、 Virology, 188, 331-341, (1992)、Tsukiyama. Kohara. et al., J. Virol., 66, 1476-1483, (1992)、Honda Masao. et al., J.Virol., 73, 1165-1174, (1999)、Honda Masao et al., RNA, 2(10), 955-968, (1996)、Sasano T. et al., Genome Inf. Ser., 9, 395-396, (1998)、Ito T et al., J. Virol., 72, 8789-8796, (1998)、Kamoshita N et al., Virology., 233, 9-18, (1997)、など)。図１及び図２に、ＨＣＶ-ＲＮＡの5'非翻訳領域及び3'非翻訳領域における一般的な二次構造を示す。

また、ＨＣＶには遺伝子型の異なる複数種のＨＣＶが存在する。そのようなＨＣＶの例としては、例えば、HCJ6、HCJ8、HCV-1、HCV-BK、HCV-J、JCH1、JCH3、JFH1、R24、R6、S14J、pH77J6S（GenBank Accession no. AF177039）、HCJ6CH、2b_AB030907などが挙げられる。このような遺伝子型の異なる複数のＨＣＶ-ＲＮＡに対応する為には、遺伝子型の異なる複数種のＨＣＶ遺伝子配列の中で同一性が高い領域をターゲットにすることが好ましい。ここで、遺伝子型の異なる複数のHCV遺伝子配列の中で同一性が高い領域とは、複数種のＨＣＶのＲＮＡ配列がお互いに80％以上の同一性、好ましくは90％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性を有する領域である。そのような領域は、10塩基以上の長さを有していることが好ましく、さらに好ましくは15塩基以上、特に好ましくは20塩基以上の長さを有する。ここで、複数種のＨＣＶとは、通常、3種類以上のＨＣＶ、好ましくは5種類以上、特に好ましくは10種類以上のＨＣＶのことをいう。遺伝子配列の同一性は、対象となる複数種の遺伝子の配列を比較し、上述したアルゴリズム等を用いて計算することができる。

本発明で用いられるオリゴリボヌクレオチドは、修飾されていない通常のＲＮＡの構成を有するものの他に、リン酸ジエステル部や糖部などを修飾した修飾ＲＮＡなどを用いることも可能であり、特に限定されるものではない。又、本発明のオリゴＲＮＡは、その一部分にデオキシリボヌクレオチドなどのリボヌクレオチドでない分子を含んでいてもよい。

また、本発明においては、オリゴＲＮＡの代わりにペプチド核酸（ＰＮＡ）などを用いてもよい。ＰＮＡは当業者によく知られた技術であり(Nielsen Peter E., Methods in Molecular Biology, 208, 3-26, (2002)、 Braasch Dwaine A et al., Biochemistry, 41(14), 4503-4510, (2002)、 Koppelhus Uffe et al., Antisense Drug Technology, 359-374, (2001)、 Nielsen Peter E., Methods in Enzymology, 340, 329-340, (2001))、上記オリゴＲＮＡと同様に、配列特異的にＨＣＶ−ＲＮＡに結合し得るものを製造できる。本発明において好適なペプチド核酸の長さとしては、例えば、5〜1000塩基（二本鎖の場合には、5〜1000bp）であり、好ましくは10〜100塩基（二本鎖の場合には、10〜100bp）であり、さらに好ましくは15〜25塩基（二本鎖の場合には、15〜25bp）であり、特に好ましくは19〜23塩基（二本鎖の場合には、19〜23bp）である。

本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸は当業者に公知の方法で作製することが可能である。

本発明のオリゴＲＮＡを継続的に発現させる場合には、本発明のオリゴＲＮＡを発現するベクターを作製してもよい。ベクターは当業者に公知の方法で作製することが可能である。例えば、Nature Biotech (2002) 19, 497-500に記載されたもの等の公知のベクターに本発明のオリゴＲＮＡをコードする遺伝子を導入することにより作製することが可能である。本発明のオリゴＲＮＡの発現のために好適なプロモーターとしては、特に限定するものではないが、T7プロモーター、tRNAプロモーター、U6プロモーター等が挙げられる。

本発明のオリゴＲＮＡは、ＨＣＶの複製を阻害し、ＨＣＶの増殖を抑制することが可能であるので、Ｃ型肝炎の治療剤として有用である。この場合、複数種類のＨＣＶに対応するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸を提供することで、臨床の場において患者が感染しているウイルスの型を同定することなく治療でき、また複数種のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸を混合して用いる必要もなくなるので好ましい。

治療に用いる場合、細胞内でそのまま機能し得る形態で投与することもできる。この場合、オリゴＲＮＡまたはペプチド核酸の長さは19〜23塩基程度とすることが最適である。また細胞内のプロセシングを経て機能し得るものを投与することもできる。この場合には、目的とする配列を含むより長い配列を有するオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸を投与することができる。細胞内に取り込まれた二本鎖ＲＮＡ（dsRNA）はダイサー（Dicer）と呼ばれる酵素によって21mer前後に分解されてsiRNA（short-interfering RNA）となり、RISC(RNA-induced Silencing Complex)と呼ばれる複合体を作り、ゲノムから転写された特定の塩基配列を持ったRNAを破壊すると考えられている（Bernstein, E.ら, Nature, 409:363-366, 2001; Hammond, S.M.ら, Nature, 404:293-296, 2000）。あるいはまた、市販のダイサーを用いて予めsiRNAをin vitroで調製して用いることもできる。

本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸を有効成分とするＣ型肝炎治療剤は、必要に応じて、製薬上許容される賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤などの医薬組成物として調製することができ、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。又、本発明のオリゴＲＮＡを発現するベクターを投与することも可能である。

本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸の投与経路は特に限定するものではないが、好ましくは患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高める封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ-L-リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。

本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、0.001〜100mg/kg、好ましくは0.1〜10mg/kgの範囲で投与することができるが、特に限定するものではない。

本発明は更に、上記本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸をＨＣＶのＲＮＡに結合させて、ＨＣＶの複製能を阻害する方法を提供する。本発明の方法は、in vivo及びin vitroの双方でＨＣＶを含むか、または含むおそれのあるサンプルと本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸とを接触させることを含む。ＨＣＶの複製能の阻害の有無は、当分野で通常用いられる方法によって検出することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

siRNAの標的とする領域の決定
C型肝炎ウイルスの多くの分離株の中で遺伝子を構成している塩基配列、特に5'側の非翻訳領域からコア領域および3'側の非翻訳領域において相同性が高い領域を見出すために、配列の比較を行った。

図３にHCVの分離株であるHCV-1（GenBank Accession no. M62321）、HCV-BK（Accession no. M58335）、HCV-J（Accession no. D90208）、R6（Accession no. AY045702）、R24、S14J、HCJ6、JFH1（Accession no. AB047639）、JCH1（Accession no. AB047640）、JCH3（Accession no. AB047642）、HCJ8（Accession no. D10988）のRNAの5'側の非翻訳領域からコア領域の500塩基についてのcDNA配列を示す。これらの塩基配列について、当分野において通常行われる方法を用いてマルチプルアライメントを行った。結果を図４に示す。また、HCVの5'側の少なくとも１０種の型のHCVにおいて同一性が９５％以上である領域から、この領域を標的として配列特異的に結合し得るsiRNAを設計した。

同様に、図５に示したpH77J6S（Accession no. AF177039）、R6、R24L、R24S、HCJ6CH（Accession no. AF177036）、JFH1、JCH1、2b_AB030907（Accession no. AB030907）の配列から、同様に3'側の非翻訳領域についてマルチプルアライメントを実施し、少なくとも８種の型のHCVにおいて同一性が９５％以上である領域から、この領域を標的として配列特異的に結合し得るsiRNAを設計した。

尚、siRNAは、上記配列同一性を考慮して設計する他、翻訳開始部位直前で設計することが好ましい。更に、標的となるHCV RNAの二次構造をも考慮して設計することが好ましい。特に、5'及び3'UTRのループ構造及びその近傍を標的とすることができる。

siRNA合成
実施例１の結果に基づいて、目的のHCV全ゲノムに対して21ntの長さでsiRNAの配列を設計し、Silencer siRNA Construction Kit(Ambion cat. no. 1620)のプロトコールに従い、３’末端にT7プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドを合成した。鋳型となる各オリゴヌクレオチドを100μM に調製後、T7プライマーとハイブリダイズさせ、その後Klenow酵素にて2本鎖DNAとしてT7プロモーターを用いて転写させた。合成されたRNAを各々の相補鎖とアニーリングさせて2本鎖RNAとした後、残存する1本鎖の突出末端をRNaseにより切断し、siRNAを作成した。最終的に合成された15〜30μg/reactionのsiRNAをRNase freeの水にて10μMに調製し、12% アクリルアミドゲル電気泳動にて20〜22塩基の二本鎖RNAを確認後、使用時まで−80℃に保存した。

合成したsiRNA配列を以下に示す。尚、これらの配列が対応するHCV（R6株）の配列（Accession no. AY045702、配列番号５６）中のヌクレオチド番号を併せて示す。

１）5'-UTR を標的とする siRNA
R1-siRNA; 5'-GGAACUACUGUCUUCACGCAG-3'(21塩基) （配列番号２０、53-73nt）
R2-siRNA; 5'-GCCAUAGUGGUCUGCGGAACC-3'(21塩基) （配列番号２１、139-159nt）
R3-siRNA; 5'-AGGCCUUGUGGUACUGCCUGAU-3'(22塩基) （配列番号２２、278-299nt）
R5-siRNA; 5'-GUCUCGUAGACCGUGCAUCA-3'(20塩基) （配列番号２３、325-344nt）
R6-siRNA; 5'-GCGAAAGGCCTTGTGGTACTG-3'(21塩基) （配列番号２４、273-293nt）
R7-siRNA; 5'-GTCTCGTAGACCGTGCACCA-3'(20塩基) （配列番号２５、325-344nt）
R5L-siRNA; 5'-GUCUCGUAGACCGUGCAUCAT-3'(21塩基) （配列番号２６、325-345nt）
R1mut-siRNA; 5'-GGAACUACUGUCUUCACGCAG-3'(21塩基)（配列番号２７、53-73nt）
R2mut-siRNA; 5'-GCCAUAGUGGUCUGCGGAACC-3'(21塩基)（配列番号２８、139-159nt）
R3mut-siRNA; 5'-AGGCCUUGUGGUACUGCCUGAU-3'(22塩基)（配列番号２９、278-299nt）
R5mut-siRNA; 5'-GUCUCGUAGACCGUGCAUCA-3'(20塩基) （配列番号３０、325-344nt）
R6mut-siRNA; 5'-GCGAAAGGCCTTGTGGTACTG-3'(21塩基)（配列番号３１、273-293nt）
R7mut-siRNA; 5'-GTCTCGTAGACCGTGCACCA-3'(20塩基) （配列番号３２、325-344nt）

２）3'-UTR を標的とする siRNA
R8-siRNA; 5'-GGCTCCATCTTAGCCCTAGTC-3'(21塩基) （配列番号３３、9515-9535nt）
R9-siRNA; 5'-GGCTAGCTGTGAAAGGTCCGT-3'(21塩基) （配列番号３４、9538-9558nt）

ＨＣＶのコアタンパク質の発現に対する効果
本発明者等はこれまでにCre/loxPシステムによりHCV全ゲノムをスイッチング発現する系を確立しており（J. Biol. Chem.273, 9001-6 .(1998)）、今回Cre recombinaseによりHCV全ゲノム(Genotype 1b, nucleotide no. 1〜9611nt) を持続発現するヒト由来肝細胞株Rz-HepM6を構築し、これを標的とした。Rz-HepM6細胞を10%ウシ胎児血清（REHATUIN cat. no. 1020-90）を含むDulbecco's Modified EAGLE MEDIUM（NISSUI cat. no. 05915）に懸濁し、24穴プレートに１ウェルあたり10⁵個の細胞で蒔き、３７℃、５％CO₂で一夜培養した。細胞密度が50〜70％のときにsiRNA の導入を行なった。すなわち、2.0μlのOligofectamineトランスフェクション試薬（Invitrogen cat. No. 12252-011）と5.5μlのOpti-MEM１（Gibco cat. No. 22600）を加えよく攪拌し、室温にて10分間放置した。その後、5.0 μlの合成した10μM siRNAをOpti-MEM１ 40 μlに希釈し、最終200ｎMになるように加えた。室温にて20分間放置した後、あらかじめ培養液を200μlのOpti-MEM１に交換した細胞に、Oligofectamine 試薬を加えたsiRNAを直接加え37℃、５％CO₂で培養した。

siRNA添加4時間後、3倍濃度にあたる30％のウシ胎児血清を含むDulbecco's Modified EAGLE MEDIUM 125μlを加え37℃、５％CO₂で培養する。血清添加24時間後、細胞をlysis Buffer(1% SDS, 0.5% NP40, 0.15M NaCl, 0.5MmEDTA, 1mM DTT, 10mM Tris:pH7.4)20μlにて回収し、HCVコア定量キット(国際試薬cat. No. 14861)を用いてHCVコアタンパク質を定量した。

図６に、siRNA添加とRz-HepM6細胞株が産生するHCVコアタンパク量との関係を示す。200μMの各siRNA（R1-siRNA、R2-siRNA、R3-siRNA、R5-siRNA、R1mut-siRNA、R2mut-siRNA、R3mut-siRNA、及びR5mut-siRNA）を添加後、ウイルス粒子を構成するコアタンパク質をELISA法で定量した。添加した全てのsiRNAはコアタンパク質の合成を阻害したが、特にR3、R5はその作用が強く、また塩基配列の特異性も高いことが観察された。また、これらの変異導入配列であるR3mutとR5mutはコアタンパク質の発現抑制効果が減弱された。

レプリコンアッセイ
HCV-RNAのコピー数を定量するためにHCV-RNAの中にレポーター遺伝子としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を導入したものを構築した。Kriegerら（J. Virol.75,4614-24 (2001)）の方法に従い、HCV遺伝子のInternal Ribosome Entry Site(IRES)の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラーゼ遺伝子を導入した。In vitroで当該RNAを合成後、エレクトロポレーション法でHuh7細胞（Japanese Collection of Research Bioresources）に導入しG418耐性クローンとして単離した。ホタル・ルシフェラーゼHCVレプリコン細胞（Huh-3-1）を５％ウシ胎児血清（Hyclone cat. no. SH30071.03）を含むダルベッコMEM（Gibco cat. no. 10569）に懸濁し96穴プレートに5000細胞／Wellで蒔き、５％CO₂，37℃で一夜培養した。約20時間後、希釈したsiRNAをWellあたり10μl加え、さらに3日間培養した。アッセイプレートは2系統用意し、1つは白色プレート、他はクリアープレートでアッセイを行った。

培養終了後、白色プレートはSteady-Glo Luciferase Assay System（Promega cat. no. E2520）に用いた。すなわち、Wellあたり100μlの試薬を入れ、3〜4回ピペットで混ぜ、5分間放置後に1450 MicroBeta TRILUX (WALLAC)にてルミネッセンスを測定した。

合成したsiRNAは以下の方法でHCVレプリコン細胞に導入した。すなわち、96穴プレートに細胞を、1ウェルあたり10000個蒔き、３７℃、５％CO₂で一夜培養した。細胞密度が50〜70％のときにsiRNA の導入を行なった。すなわち、1.5μlのTransIT-TKOトランスフェクション試薬（Mirus Corporation cat. No. MIR2150）と25μlのOpti-MEM１（cata no. 31985）を激しく攪拌後、20分間静置し、0.125〜1.25μlのsiRNAを混ぜ、緩やかに攪拌後さらに20分間静置した。この溶液を96穴プレート中の100μlの細胞に静かに加え、緩やかに攪拌後３７℃、５％CO₂で一夜培養した。この細胞を用いてレプリコンアッセイを行なった。siRNAを終濃度1nM, 10nM, 30nM, 100nMになるように加え、TransIT-TKOトランスフェクション試薬にて導入後24時間後にHCVレプリコン活性をレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ活性）を指標に測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、siRNA未添加の活性を100％として、各siRNAの活性を算出した。

図７にsiRNA添加とHCVレプリコンが複製する活性との関係を示す。配列R3, R5, R6, R7は容量依存的にレプリコンの活性を阻害した。また、これらの塩基配列の一部置換体である配列R3mut, R5mut, R6mut, R7mutはその効果が減弱されたため、配列R3, R5, R6, R7は塩基配列特異的な抗ウイルス作用を示すと考えられる。

RNAトランスフェクション効率の算定
Silencer siRNA Labeling Kit （Ambion cat no.1632）を用いてプロトコールに従ってCy3でsiRNAを標識した。すなわち、R7-siRNA 10μM (19.2μl)に7.5μlのCy3ラベリング試薬を加え、50μl中で37℃、1時間遮光した状態で標識を行なった。5μlの５M NaClと2.5倍量の99.5％エタノールを加えて−20℃でエタノール沈殿を行なった。４℃、15000回転／分の遠心でCy3標識のsiRNAを回収した。標識されたsiRNAの定量はCy3の吸収極大と分子吸光係数から算定した(http://www.ambion.com/techlib/append/base_dye.html)。

得られたCy3標識siRNAをTransIT-TKOトランスフェクション試薬を用いて細胞に導入し、24時間後に蛍光顕微鏡にて観察した。初めに位相差顕微鏡の視野で細胞の位置を確認した後、蛍光顕微鏡でCy3染色された細胞を観察した。このとき用いた波長は励起波長510nm、吸収波長 550nmであった。Cy3で標識された細胞は全体の約90％であり、非常に高いトランスフェクション効率であることが明らかとなった。

ダイサーによるsi-RNAの調製
HCV R6遺伝子（Accession no. AY045702、配列番号５６）を鋳型とし、表１及び２に示す各組み合わせのプライマーを用いて定法によりPCR反応を行った。プライマーは、複数種のHCV間でホモロジーのある領域、あるいはHCVの複製機能に重要な領域を選んで設計した。得られたPCR産物をゲルから切り出して精製した後、T7 RNAポリメラーゼ（例えば、MEGAscript T7, Ambion Inc. cat # 1334）を用いて転写反応（20 μl vol x 4時間）を行ってRNAを合成し、アガロースゲル電気泳動で目的となる大きさの二本鎖RNAを確認した（前駆体siRNA-1〜前駆体siRNA-9、配列番号４７〜５５）。次いでDNaseIを用いて 15分間反応させた後、LiCl沈殿し、Nuclease free Water 20μlに溶解し、吸光度にてRNA量を測定した（total 約30〜60 μg dsRNA / reaction）。

次にGene Therapy Systems. Inc.のDicer siRNA Generation キット(Cat # T510001)を用い、10〜20 μg の各dsRNAをキットのDicerタンパク質10 unit(20 μl)にて反応（反応液量 100μl, 16〜20 時間）した。Dicerにて切断された短鎖の二本鎖RNA混合物（d-siRNA）を３％アガロースゲル電気泳動にて確認後、キットに付属のカラムにて脱塩ならびに非切断RNAを除去した後、最終的に22bpのd-siRNAをアガロースゲルで確認した。吸光度にて濃度を測定して、滅菌水にて5μMに調整後、使用時まで−80℃で保存した。

siRNAのトランスフェクション（１）
実施例６で二本鎖の前駆体siRNA-1〜前駆体siRNA-6から調製したsiRNAを、実施例４に記載したTransIT-TKOトランスフェクション試薬（Mirus Corporation cat. No. MIR2150）を用いて１〜50 nMの濃度で実施例４で用いたホタル・ルシフェラーゼHCVレプリコン細胞（Huh-3-1）に導入し、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、抗ウイルス活性を求めた。結果を図８に示す。尚、siRNA-p53は、癌遺伝子p53をダイサー処理したsiRNAを添加した結果を示し、対照は滅菌水を添加した結果を示す。

その結果、ダイサーで調製したsiRNAは濃度依存的にHCVレプリコンの複製活性を阻害し、抗ウイルス活性を有することが示された。

siRNAのトランスフェクション（２）
実施例６で二本鎖の前駆体siRNA-7〜前駆体siRNA-9から調製したsiRNAを、実施例４に記載したTransIT-TKOトランスフェクション試薬（Mirus Corporation cat. No. MIR2150）を用いて３nMまたは１０nMの濃度でホタル・ルシフェラーゼHCVレプリコン細胞（Huh-3-1）に導入し、30時間または54時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、抗ウイルス活性を求めた。結果を図９に示す。

その結果、実施例７と同様に、ダイサーで調製したsiRNAが濃度依存的にHCVレプリコンの複製活性を阻害し、抗ウイルス活性を有することが示された。

以上詳述したように、本発明によって、ＨＣＶ-ＲＮＡに対して配列特異的に結合し、ＨＣＶの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸、及びこれらを有効成分とするＣ型肝炎治療剤が提供され、ＨＣＶの新規かつ確実な治療法の提供が可能となった。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡに対して配列特異的に結合するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
ＨＣＶのＲＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
ＨＣＶのＲＮＡの5'非翻訳領域の配列とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
遺伝子型の異なる複数種のＨＣＶの遺伝子配列において、同一性の高い領域の配列とハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
二本鎖ＲＮＡである請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
鎖長が19〜23bpである、請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
配列番号２０〜３４に示すヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチド。
請求項７に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
配列番号４７〜５５に示すヌクレオチド配列において連続する19〜23塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴリボヌクレオチド。
請求項９に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴリボヌクレオチドを発現するベクター。
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴリボヌクレオチド若しくはペプチド核酸、または請求項１１に記載のベクターを有効成分とするＣ型肝炎治療剤。
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸をＨＣＶのＲＮＡに結合させて、ＨＣＶの複製能を阻害する方法。