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JP2010017179A - Ｄｎａを定量又は検出する方法 - Google Patents

Ｄｎａを定量又は検出する方法 Download PDF

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JP2010017179A JP2009138008A JP2009138008A JP2010017179A JP 2010017179 A JP2010017179 A JP 2010017179A JP 2009138008 A JP2009138008 A JP 2009138008A JP 2009138008 A JP2009138008 A JP 2009138008A JP 2010017179 A JP2010017179 A JP 2010017179A
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JP2009138008A
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Yoshitaka Tomigahara
祥隆 冨ヶ原
Hideo Sato
日出夫 佐藤
Hirokazu Tarui
弘和 樽井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
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Abstract

【課題】簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供する。
【解決手段】検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、（１）目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する第一工程、（２）第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する第二工程、（３）第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得し、該一本鎖メチル化ＤＮＡに検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検ＤＮＡ複合体を取得する第三工程、（４）第三工程で取得した被検ＤＮＡ複合体に固定化メチル化ＤＮＡ抗体を結合させて検出複合体を取得する第四工程等を有することを特徴とする方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法等に関する。
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法としては、例えば、生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）によってＤＮＡを増幅させて検出する方法や、生物由来検体中のＤＮＡが有する目的のＤＮＡ領域に蛍光標識したオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて検出する方法等が知られている（例えば、非特許文献１、２参照）。
Chiquet C., Lina G., Benito Y., Cornut P.L., Etienne J., Romanet J.P., Denis P., Vandenesch F.,Polymerase chain reaction identification in aqueous humor of patients with postoperative endophthalmitis.,J. Cataract. Refract. Surg.,2007;33(4):635-641. Brandriff B.F., Gordon L.A., Trask B.J.,DNA sequence mapping by fluorescence in situ hybridization.,Environ. Mol. Mutagen.1991;18(4):259-262.
しかしながら、上記方法は、ＰＣＲに供するまでの操作（具体的には例えば、メチル化検出のためのＤＮＡの修飾及びその後の生成物の精製等）に非常に時間と労力とを要する。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を調製して液相中にてＰＣＲ反応が行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作や、目的領域を増幅させるための前記プライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、それらの操作は極めて繁雑である。
また、in situ hybridizationは、検体の病理標本の作製のために、多大な時間と労力を要する方法である。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、かかる状況下鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
[発明１]
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
（１）目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する第一工程、
（２）第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する第二工程、
（３）第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得し、該一本鎖メチル化ＤＮＡに検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検ＤＮＡ複合体を取得する第三工程、
（４）第三工程で取得した被検ＤＮＡ複合体に固定化メチル化ＤＮＡ抗体を結合させて検出複合体を取得する第四工程、
（５）第四工程で得られた検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により定量又は検出することにより、前記一本鎖ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第五工程、
を有することを特徴とする方法。
[発明２]
第三工程で被検ＤＮＡ複合体を取得する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する発明１に記載の方法。
[発明３]
固定化メチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である発明１又は２に記載の方法。
[発明４]
ＤＮＡメチル化酵素がシトシンメチル化酵素又はＳｓｓ Ｉメチラーゼである発明１〜３のいずれか一に記載の方法。
[発明５]
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ＲＮＡから逆転写酵素により生成されたＤＮＡにおける目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである発明１〜４のいずれか一に記載の方法。
[発明６]
検体が、下記のいずれかの生物由来検体である発明１〜５のいずれか一に記載の方法。
（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ
（ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
[発明７]
第一工程で取得した前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、又は予め精製されてなるＤＮＡである発明１〜６のいずれか一に記載の方法。
[発明８]
検出オリゴヌクレオチドの識別機能が、下記のいずれかの識別機能である発明１〜７のいずれか一に記載の方法。
（ａ）ＦＩＴＣの蛍光検出
（ｂ）ＦＩＴＣ抗体による検出
[発明９]
検出オリゴヌクレオチドが、ヒトゲノム中の反復配列、重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列若しくはその一部と相補的に結合し得る塩基配列からなる発明１〜８のいずれか一に記載の方法。
[発明１０]
ヒトゲノム中の反復配列がLINE又はSINEである発明９に記載の方法。
[発明１１]
検出オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列と相補的に結合し得る塩基配列からなる発明１〜１０のいずれか一に記載の方法。
（１）配列番号３７で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号３７で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号３９で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号３９で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
[発明１２]
検出オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列からなる発明１〜１０のいずれか一に記載の方法。
（１）配列番号３８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号３８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号４０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号４０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
[発明１３]
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下である発明１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
[発明１４]
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下である発明１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
[発明１５]
癌患者由来の検体を選抜する方法であり、発明１〜１４のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
[発明１６]
検体が、哺乳動物由来の血清である発明１５に記載の方法。
[発明１７]
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである発明１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
；等を提供するものである。
本発明により、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供することが可能となる。
図１は、実施例１において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ１を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図２は、実施例２において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ１を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図３は、実施例３において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ２を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図４は、実施例４において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ１及びF２を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図５は、実施例５において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図６は、実施例６において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図７は、実施例７において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３及びF４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図８は、実施例８において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(100 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (10 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(1 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/5 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図９は、実施例９において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ６を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(100 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (10 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(1 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/5 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図１０は、実施例１０において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図１１は、実施例１１において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図１２は、実施例１２において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドF４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図１３は、実施例１３において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３及びF４を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液ＭＡ(10 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (1 ng each/20 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0 ng each/20 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図１４は、実施例１４において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ５を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(100 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (10 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(1 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/5 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図１５は、実施例１５において、ビオチン標識メチルシトシン抗体0.5 μｇ/ｍＬ及び５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ６を用いて実施した結果を示した図である。右から順に、溶液Ａ(100 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (10 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(1 ng/5 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0 ng/5 μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）)のそれぞれについて、ＤＮＡ量を吸光度（４５０nm）にて測定した値を示している。 図１６は、実施例１６において、処理1をおこない、ビオチン標識メチルシトシン抗体および5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドF1を用いてDNAの検出を実施した結果を示した図である。右から順に、溶液A (10 ng/10 μLラット血清溶液)、溶液B (1 ng/10 μLラット血清溶液)、溶液Ｃ (0.1 ng/10 μLラット血清溶液)、溶液Ｄ(ラット血清 (ネガティブコントロール液)) のそれぞれについて、吸光度 (450 nm) を測定した値を示している。 図１７は、実施例１６において、処理2をおこない、ビオチン標識メチルシトシン抗体および5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドF1を用いてDNAの検出を実施した結果を示した図である。右から順に、溶液A (10 ng/10 μLラット血清溶液)、溶液B (1 ng/10 μLラット血清溶液)、溶液Ｃ (0.1 ng/10 μLラット血清溶液)、溶液Ｄ(ラット血清 (ネガティブコントロール液)) のそれぞれについて、吸光度 (450 nm) を測定した値を示している。 図１８は、実施例１７において、ビオチン標識メチルシトシン抗体および5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドF1を用いてDNAの検出を実施した結果を示した図である。右から順に、溶液A (4 ng/40 μLヒト血清溶液)、溶液B (2 ng/40 μLヒト血清溶液)、溶液C (1 ng/40 μLヒト血清溶液)、溶液D (ヒト血清 (ネガティブコントロール液)) のそれぞれについて、吸光度 (450 nm) を測定した値を示している。 図１９は、実施例１８において、ビオチン標識メチルシトシン抗体および5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドF1を用いて検出した結果と、リアルタイムPCRにより定量した結果を比較した図である。図中、検出結果を縦軸に、リアルタイムPCRによる定量結果を横軸にとり、プロットした。またグラフ中の直線は回帰直線（太線）および標準誤差範囲（細線）を示してある。 図２０は、実施例１８において、57歳以下のヒト血清サンプルについて、ビオチン標識メチルシトシン抗体および5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドF1を用いてDNAを検出した結果を、癌患者と健常者に分けてプロットしたものである。◆は健常者、▲は癌患者の測定結果を示しており、それぞれについて平均値および標準偏差を示してある。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法（以下、本発明方法と記すこともある。）に関するものである。
本発明方法における「検体」としては、非生物由来検体と生物由来検体とが挙げられる。非生物由来検体とは、例えば食品、河川、土壌、一般市販製品の表面付着物等の真菌、細菌、ウイルス等の混入微生物や核酸が含まれ得るものを意味する。
尚、特に食品においては食中毒菌の有無の検査と原因菌の特定が重要であり、通常は微生物表面の抗原を利用した免疫法が使用される。しかし、免疫法は、抗原を作るために多大の労力を必要とし、更に病原菌の特定が必要となる。即ち、微生物検査における免疫法は、微生物種の特異性を利用しているため、一回の検査で複数菌種をまとめて、その有無を検査することが難しいだけでなく、免疫法を確立できない微生物に対しては、ＰＣＲ法等を用いるなど、検査には多大の労力が必要となる。本発明方法は、まず、免疫法による検査が難しい場合でも、遺伝子から検査方法を確立でき、次に、複数の微生物を同時に検出することが可能な検査方法を提供できる。即ち、本発明方法は、非生物由来検体中に存在する真菌類、微生物類、ウイルス等の検査に利用できる。
また、本発明方法を用いることにより、例えば食品中の混入微生物やウイルスを検出することが可能となり、感染症の検査や食品汚染検査等で利用が期待できる。
生物由来検体とは、（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液、（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ、（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ、（ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ、等が挙げられる。尚、前記組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味であり、前記体液とは血漿、血清、リンパ液等を意味し、前記体分泌物とは尿や乳汁等を意味する。
検体中に含まれるＤＮＡとしては、前記生体試料や前記混入微生物から抽出して得られたゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片、若しくはＲＮＡ等を挙げることができる。
また、哺乳動物由来の検体がヒトの血液、体液又は体分泌物等である場合には、ヒトの定期健康診断における臨床検査等で採取したものを利用することができる。血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いればよい。また、ＲＮＡからＤＮＡを得るためには、市販のｃＤＮＡ作成キット等の逆転写酵素を用いてＲＮＡからＤＮＡを合成するようなキットを用いればよい。また、本発明方法においては、検体としては、人工的に合成されたＤＮＡであっても良い。
本発明方法における「哺乳動物」とは、哺乳動物に属する動物の全てを意味する。哺乳動物に属する動物とは、動物界 脊索動物門 脊椎動物亜門 哺乳綱（Mammalia）に分類される動物の総称であり、より具体的には、ヒト、サル、マーモセット、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ等を意味する。
本発明における「体液」とは、固体を構成する細胞間に存在する液体を意味し、血漿と間質液を意味し、多くの場合、固体の恒常性の維持機能を果たす。より具体的には、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液、間質液）、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液（髄液）、関節液（滑液）、眼房水（房水）、脳脊髄液、等を意味する。
本発明における「体分泌液」とは、外分泌腺からの分泌液を意味する。より具体的には、唾液、胃液、 胆汁、 膵液、腸液、 汗、 涙、 鼻水、 精液、 膣液、 羊水、 乳汁、等を意味する。
本発明における「細胞溶解液」とは、細胞培養用の10cmプレート等で培養した細胞、即ち細胞株や初代培養細胞、血球細胞等を破壊することにより得られる細胞内液を含む溶解液を意味する。細胞膜を破壊する方法としては、超音波による方法、界面活性剤を用いる方法、アルカリ溶液をを用いる方法等が挙げられる。尚、細胞を溶解するためには、様々なキット等を利用してもよい。
例えば具体的には、10cmプレートでコンフルエントになるまで細胞を培養した後、培養液を捨てて、0.6mLのRIPAバッファー（1x TBS, 1% nonidet P-40, 0.5% sodium deoxysholate, 0.1% SDS, 0.004% sodium azide）を10cmプレートに加える。4℃で15分間プレートをゆっくり揺り動かしてから、10cmプレート上の接着細胞を、スクレーパー等を用いて剥がし、プレート上の溶解液をマイクロチューブに移す。溶解液の１/10容量の10mg/mL PMSFを添加してから、氷上で30-60分間放置する。4℃で10分間、10,000xgで遠心し、上清を細胞溶解液として取得する。
本発明における「組織溶解液」とは、哺乳動物等の動物から採取した組織中の細胞を破壊することにより取得する細胞内液を含む溶解液を意味する。
より具体的には、動物から取得した組織の重量を測定した後、カミソリ等を用いて組織を小片に裁断する。凍結組織をスライスする場合は、更に小さい小片にする必要がある。裁断後、氷冷RIPAバッファー（プロテアーゼインヒビター、フォスファターゼインヒビター等を添加してもよく、例えば、RIPAバッファーの１/10容量の10mg/mL PMSFを添加しても良い）を組織1gあたり3mLの比率で添加し、４℃でホモジナイズする。ホモジナイズには、ソニケーターや加圧型細胞破砕装置を用いる。ホモジナイズの作業では、溶液を常に４℃に維持し、発熱を抑えるようにする。ホモジナイズ液を、マイクロチューブに移して、4℃で10分間、10,000xgで遠心し、上清を組織溶解液として取得する。
本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）とは、検体中に含まれるＤＮＡ領域のうち、本発明方法により検出又は定量したいＤＮＡ領域である。検体がＤＮＡである場合の目的とするＤＮＡ領域とは、ＤＮＡの塩基配列上の塩基配列を意味し、検体がＲＮＡである場合には、ＲＮＡから逆転写酵素により作成されたＤＮＡの塩基配列上の塩基配列を意味する。本発明方法においては、シトシンをメチル化して検出又は定量する方法であるため、目的領域はシトシン或いは後述のＣｐＧに富む領域を含むことが望ましい。
第一工程は、検体中から目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを取得する工程である。
「目的とするＤＮＡ領域」とは、例えばゲノムＤＮＡ上の検出対象となる所定の塩基配列を意味する。また、検体中に含まれるＲＮＡを検出する場合、「目的とするＤＮＡ領域」とは、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写酵素により合成されたＤＮＡ上の塩基配列であって、ＲＮＡ上の検出対象となる所定の塩基配列の相補的塩基配列を意味する。
第一工程で取得されるＤＮＡは、該ＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であってもよく、また予め精製されてなるＤＮＡ試料であってもよい。他に、第一工程で取得されるＤＮＡ試料として、血液中の遊離ＤＮＡ、微生物ゲノム由来のＤＮＡ、検体中のＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡ等が挙げられる。更には、「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」は人工的に合成されたＤＮＡであっても良い。
目的とするＤＮＡ領域の塩基配列を含むゲノムＤＮＡを取得するには、例えば、検体が哺乳動物由来の場合は、市販のＤＮＡ抽出用キット（Genfind v2 Kit（ベックマン・コールター社製）、FastPure DNA Kit（タカラバイオ株式会社製））等を用いればよい。
また、検体が真菌等の微生物である場合、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法等を用いればよく、検体が大腸菌のような原核生物である場合、Molecular Cloning -A Laboratory Manual-（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されているような一般的な微生物ゲノム調製法等を用いればよい。
また、検体が食品である場合、食品から微生物等を分離してからＤＮＡを取得してもよく、食品に含まれる微生物以外のゲノムＤＮＡと微生物由来のゲノムを同時に取得してもよい。また、検体が哺乳動物由来の組織であり、目的とするＤＮＡ領域がウイルス由来のＤＮＡである場合は、組織中から市販のＲＮＡ抽出用キット（ISOGEN（311-02501）（NIPPON GENE社製）、或いは、FastRNA Pro Green Kit (フナコシ社製)、FastRNA Pro Blue Kit (フナコシ社製)、FastRNA Pro Red Kit (フナコシ社製)、等）等を用いてＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によってＤＮＡを取得してもよい。また、検体が哺乳動物由来の検体である場合、ウイルス粒子を抽出してからウイルスのＤＮＡを抽出してもよく、或いはウイルス粒子を抽出してから市販のキット（QuickGene RNA tissue kit S II、富士フィルム社製）等を用いてウイルスＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりウイルス由来のＤＮＡを取得しても良い。ウイルスが感染した組織からＲＮＡを抽出し逆転写酵素によりウイルス由来のＤＮＡを取得しても良いし、ウイルスが感染した組織からＤＮＡを取得して、ウイルス由来のＤＮＡを取得しても良い。尚、ＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを取得する場合には、市販のキット（トランスクリプターハイフィデリティcDNA合成キット、ロシュディアグノスティク社製）等を用いてもよい。
本発明方法における、「メチル化ＤＮＡ」とは、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する４種類の塩基のいずれかがメチル化されていることを意味する。例えば、哺乳動物では、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、該塩基配列を「ＣｐＧ」と記すこともある。）中のシトシンのみがメチル化されるという現象が知られている。シトシンのメチル化部位は５位である。ＣｐＧのシトシンメチル化現象は、細胞分裂に先立つＤＮＡ複製により新生二本鎖ＤＮＡにおいては、親細胞由来のＤＮＡ鎖中の「ＣｐＧ」中のシトシンのみがメチル化された状態であるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生されたＤＮＡ鎖中の「ＣｐＧ」中のシトシンもメチル化される。このシトシンメチル化は、親細胞由来のＤＮＡ鎖中のメチル化されたシトシンを含むＣｐＧと相補的に結合する新生ＤＮＡ鎖のＣｐＧのシトシンをメチル化する。従って、親細胞のＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後の、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。尚、「ＣｐＧ対」とは、ＣｐＧで示される塩基配列と、これに相補するＣｐＧが結合してなる二本鎖ＤＮＡを意味するものである。
また、本発明方法における「一本鎖メチル化ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡの塩基配列中の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンの５位がメチル化された一本鎖ＤＮＡを意味する。
本発明方法における前記「目的とするＤＮＡ領域」を換言すると、検体中のＤＮＡ含量を調べたいＤＮＡ領域ともいえる。例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）等を自由に挙げることができる。「目的とするＤＮＡ領域」においてメチル化されたＤＮＡを個々に検出又は定量することは勿論であるが、例えば１つの検出系において「目的とするＤＮＡ領域」がより多く存在すれば、それだけ定量精度及び検出感度を向上させることができる。
具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号２で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号３で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号４で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号５で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号６で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号７で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号７で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン１と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号８で示される塩基配列が挙げられる。配列番号８で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン１の５’側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号９で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号９で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１０で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１０で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１１で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１２で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１３で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１４で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１５で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１６で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。
本発明方法における「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ」としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌、真菌、ウイルス、病原性原虫等の微生物等由来のＤＮＡや、該微生物等由来のＲＮＡから逆転写酵素により取得したＤＮＡを挙げることができる。例えば、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma pneumoniae、Borrelia burgdorferi B31、Rickettsia prowazekii、Treponema pallidum、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia trachomatis、Helicobacter pylori J99、Helicobacter pylori 26695、Haemophilus influenzae Rd、Mycobacterium tuberculosis H37Rv、Pseudomonas aeruginosa、Legionella pneumophila、Serratia marcescens、Escherichia coli、Listeria monocytogenes、Salmonella enterica、Campylobacter jejuni subsp. Jejuni、Staphylococcus aureus、Vibrio parahaemolyticus、Bacillusu cereus、Clostridium botulinum、Clostridium perfringens、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberuculosis、Trichophyton ruburum、Trichophyton mentagrophytes、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、Aspergillus fumigatus、Pneumocystis carinii、Coccidioides immitis、Cytomegalovirus、human herpesvirus 5、Epstein-Barr virus、Human Immunodeficiency Virus、Human Papilloma Virus、Enterovirus、Norovirus Influenza Virus、Toxoplasma gondii、Cryptosporidium parvum、Entamoeba histolyticaのゲノムＤＮＡや、それらのＲＮＡから逆転写酵素により作製されたＤＮＡは、検体中の感染症原因菌、或いは食品中の食中毒原因菌等の検出に利用できる。
第二工程は、第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する工程である。
第二工程における「目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する」とは、第一工程で得られたＤＮＡをメチル化酵素で処理し、メチル化ＤＮＡを取得することを意味する。
「ＤＮＡメチル化酵素」とは、ＤＮＡ中の塩基をメチル化する酵素であり、哺乳動物細胞、細菌等から、多くのＤＮＡメチル化酵素が単離されている。ＤＮＡメチル化酵素は、基質の塩基の種類から、アデニンメチル化酵素、シトシンメチル化酵素など、複数種類に分類される。シトシンメチル化酵素は、ＤＮＡ塩基配列中の特定の配列を認識し、その配列の近くのシトシンをメチル化する酵素であり、認識する塩基配列により異なったシトシンメチル化酵素が知られている。
また、ＤＮＡメチル化酵素の触媒するＤＮＡのメチル化反応は、制限修飾系と呼ばれる原始的な免疫系から多数見出されている。制限修飾系とは、細菌で機能するゲノム全体を定期的にメチル化することにより、特定の配列を認識する制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）によって消化されないようにした上で、外来ＤＮＡ（特にバクテリオファージ）を制限酵素によって消化する機能で、バクテリオファージ感染から微生物ゲノムを防御するシステムのことである。ゲノムのメチル化に機能している酵素は、シトシン又はアデニンをメチル化し、多くはプリン残基の６位の窒素（Ｎ６）、或いは５位の炭素（Ｃ５）をメチル化することが知られている。このような酵素のうち、シトシンのＣ５をメチル化するシトシンメチル化酵素としては、SssI(M.SssI)メチラーゼ、AluIメチラーゼ、HhaIメチラーゼ、HpaIIメチラーゼ、MspIメチラーゼ、HaeIIIメチラーゼ等が知られている。また、これらシトシンのＣ５位をメチル化する酵素は、認識する塩基配列が異なっており、ＣpＧを認識するシトシンメチル化酵素は、SssIのみである。
また、ヒトゲノム中のＤＮＡのメチル化反応としては、エピジェネティクス（遺伝子配列によらない遺伝子発現の多様性を生みだす仕組み）として、ＣｐＧのシトシンの５位（Ｃ５）のメチル化が知られており、このようなシトシンメチル化酵素として、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが知られている。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとしては、DnmtIメチルトランスフェラーゼが知られている。
従って、ヒト細胞中ではＣｐＧ配列のシトシンのＣ５位がメチル化されているため、人為的にゲノムをメチル化する場合には、SssIを用いることで、ヒト細胞内でのメチル化と同じ配列（ＣｐＧ）の、同じシトシンの、同じ位置をメチル化することが可能となる。
シトシンメチル化酵素によりメチル化されたＤＮＡにするためには、具体的には例えば、以下のように実施すればよい。ＤＮＡ試料に、最適な10×緩衝液（NEBuffer2 (NEB社製)）を5μL、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を0.5μｌ、シトシンメチル化酵素SssI（NEB社製）を夫々0.5μL加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、37℃で30分間インキュベーションすればよい。第二工程におけるメチル化は、目的とするＤＮＡ領域を、メチル化ＤＮＡ抗体に結合させることにより、支持体へ結合するために実施するため、抽出したＤＮＡ試料の目的とするＤＮＡ領域がメチル化されていれば、必ずしも第二工程を実施する必要は無い。
第二工程において、ＤＮＡメチル化酵素によって修飾されたメチル化ＤＮＡを構成するメチル化塩基が、後述の検出オリゴヌクレオチドの有するメチル化塩基と異なる場合、該検出オリゴヌクレオチド上のメチル化塩基は識別機能として利用することができる。例えば、検出オリゴヌクレオチドが６-メチルアデニンであり、第二工程でシトシンが５-メチルシトシンに修飾できれば、検出オリゴヌクレオチドの識別機能として、６-メチルアデニン抗体を利用し、支持体への固定はメチルシトシン抗体を用いることができる。具体的には、第二工程でＳｓｓＩメチラーゼで修飾した場合、支持体への固定はメチルシトシン抗体を用いることができる。即ち、検出オリゴヌクレオチドがメチルアデニン有しており、メチルアデニン抗体で検出オリゴヌクレオチドを検出することは、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡのメチルシトシンを検出することなく、検出オリゴヌクレオチドのメチルアデニンのみを検出することが可能となる。
第三工程は、第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得し、該一本鎖メチル化ＤＮＡに検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検ＤＮＡ複合体を取得する工程である。
本発明方法における「検出オリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基が、該検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量するための識別機能と、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと相補性によって結合するための塩基配列である検出用接着配列とを有しているオリゴヌクレオチドである。
また、本発明における「検出オリゴヌクレオチド」は、後述するヒトゲノム中の反復配列、重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列若しくはその一部と相補的に結合し得る塩基配列からなってもよい。具体的に例えば、配列番号３８、４０で示される塩基配列又はそれらの相補配列を有する塩基配列等を挙げることができる。
検出用接着配列は、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体（二本鎖）を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基対合により結合できる配列を含む塩基配列、又は、目的とするＤＮＡ領域の５’末端より更に５’末端側ＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列、又は、目的とするＤＮＡ領域の３’末端より更に３’末端側の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であり、尚且つ、メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害しないことが望ましい。
また「メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害せず」とは、本オリゴヌクレオチドの塩基配列が、メチル化ＤＮＡ抗体がメチル化された一本鎖ＤＮＡへの結合に要する占有空間内で、本オリゴヌクレオチドと前記一本鎖ＤＮＡの相補的な結合がおこらないような塩基配列であることを意味する。即ち、メチル化ＤＮＡ抗体がメチル化された塩基（シトシン）に結合するには、直接結合するメチル化された塩基（シトシン）のみならず、メチル化された塩基（シトシン）の存在する周辺空間も占有すると考えられる。故に、検出用接着配列は、メチル化ＤＮＡ抗体がメチル化されたＤＮＡに結合する際に要する占有空間で、前記一本鎖ＤＮＡと相補的な結合をしないものであれば良い。前記一本鎖ＤＮＡに結合させる検出用接着配列は、１種類である必要は無く、メチル化ＤＮＡ抗体の結合を阻害しなければ、２種類以上用いても良い。複数の本オリゴヌクレオチドを使用すれば、定量精度及び検出感度を向上させることができる。
第三工程における「目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得し、該一本鎖メチル化ＤＮＡに検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検ＤＮＡ複合体を取得する」とは、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ（以下、一本鎖メチル化ＤＮＡと記すこともある）と検出オリゴヌクレオチドとが相補的に結合してなる被検ＤＮＡ複合体を形成させることを意味する。具体的には、前記第二工程でＤＮＡメチル化酵素によりメチル化された一本鎖メチル化ＤＮＡをＴris-HClバッファー（10 mM）で1ng/μLの溶液に調製し、該一本鎖メチル化ＤＮＡと相補的に結合しうる検出オリゴヌクレオチドをＴris-HClバッファー（10 mM）で0.02μMの溶液に調製し、夫々のオリゴヌクレオチド溶液と緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを混合し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとする。その後、９５℃で１０分間加熱し、その後７０℃まで速やかに冷却して１０分間保温した後、５０℃まで冷却して１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温してから、室温に戻すことで、一本鎖メチル化ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの被検ＤＮＡ複合体の形成を促せばよい。
「相補的に結合」とは、塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。例えば、ＤＮＡを構成する二本鎖の各々一本鎖ＤＮＡを構成する塩基が、プリンとピリミジンの塩基対合により二本鎖を形成することであり、より具体的には、複数の連続した、チミンとアデニン、グアニンとシトシンの水素結合による塩基結合により、二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。相補性によって結合することを「相補的な結合」と呼ぶこともある。「相補的に結合」は、「相補的に結合し得る」、「相補的に塩基対合し得る」、「相補性により結合」又は「相補性によって結合（相補的な（塩基対合による）結合）する」と表現することもある。また、相補的に結合し得る塩基配列を互いに「相補性を有する」[相補性である]と表現することもある。尚、人工的に作製されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンが、シトシン、アデニン、又はチミンと水素結合により結合することも意味する。
また、本発明方法において、一本鎖メチル化ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドが「相補性により結合」する場合、検出オリゴヌクレオチドの検出用接着配列を構成する塩基配列の全てが一本鎖メチル化ＤＮＡと塩基対合しない場合も含める。例えば、検出用接着配列を構成する塩基のうち、少なくとも７５％、好ましくは８０％以上の塩基が一本鎖メチル化ＤＮＡと塩基対合しており、尚且つ、被検オリゴヌクレオチドと、少なくと７５％以上、好ましくは８０%以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドと結合できる場合も含める。
本発明方法の第三工程において、一本鎖メチル化ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの被検ＤＮＡ複合体を形成させる際の好ましい態様としては、カウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げることができる。
カウンターオリゴヌクレオチドとは、目的とするＤＮＡ領域と同じ塩基配列からなるポリヌクレオチドを「短い」オリゴヌクレオチドに分割したものである。この場合、「短い」とは、１０〜１００塩基、より好ましくは、２０〜５０塩基の長さをいう。尚、カウンターオリゴヌクレオチドは、検出オリゴヌクレオチドと一本鎖メチル化ＤＮＡとが結合する塩基配列上には設計しない。カウンターオリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域に比し過剰に添加する。目的とするＤＮＡ領域が正鎖である場合、目的とするＤＮＡ領域（正鎖）を一本鎖にした後、後述する固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる際に、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖（負鎖）と目的とするＤＮＡ領域（正鎖）が相補性により再結合することを妨げるために添加する。メチル化された目的とするＤＮＡ領域にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて、目的とするＤＮＡ量又はそれに相関関係のある指標値を測定する際に、メチル化された目的領域が一本鎖である方がメチル化ＤＮＡ抗体に結合しやすいからである。尚、カンウターオリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域に比べて、少なくとも１０倍、好ましくは１００倍以上の量で添加されることが望ましい。
尚、第一工程で取得したＤＮＡ試料中の目的とするＤＮＡ領域が一本鎖ＤＮＡである場合には、第三工程のうち「目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得」するためには、特別な作業をしなくとも一本鎖メチル化ＤＮＡをＤＮＡ試料として取得することができる。具体的には、ＤＮＡ試料として、ＲＮＡから逆転写酵素処理により合成された一本鎖ＤＮＡ、ウイルスから抽出されたＤＮＡのうち、一本鎖ＤＮＡをゲノムとするウイルスから取得された一本鎖ＤＮＡを上げることができる。また、第一工程で取得したＤＮＡ試料中の目的とするＤＮＡ領域が二本鎖ＤＮＡである場合には、第三工程のうち「目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得」するためには、二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするための操作を行えばよい。この場合、具体的には９５℃で数分間加熱し、4℃以下に急冷すればよい。
検出オリゴヌクレオチドにおける「検出用接着配列」とは、目的とするＤＮＡ領域の有する塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、検出用接着配列が対合し得る目的とするＤＮＡ領域の塩基配列と７５％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する配列であることを意味する。また、検出用接着配列は、後述する固定化メチル化ＤＮＡ抗体と被検ＤＮＡ複合体との結合を阻害しないものであれば良い。また、「検出用接着配列」は、目的とするＤＮＡ領域又は目的とするＤＮＡ領域の近傍に結合する塩基配列を有し、後述する第四工程で検出複合体を形成できるように設定されていれば良い。尚、検出用接着配列は後述する同一反復配列中（目的とするＤＮＡ領域中）に一つであってもよく、二つ以上設計されていても良い。二つ以上設計する場合、複数の検出用接着配列と後述する特定接着配列は、互いに一本鎖メチル化ＤＮＡとの結合を阻害しないものであれば良い。
第四工程とは、第三工程で取得した被検ＤＮＡ複合体に固定化メチル化ＤＮＡ抗体を結合させて検出複合体を取得する工程である。
「固定化メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合するメチル化ＤＮＡ抗体を「支持体」に固定化したものである。抗体として、好ましくは一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体であればよく、より好ましくは、メチルシトシン抗体でも良い。また、市販されているメチル化ＤＮＡ抗体であっても、本明細書記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。
「支持体」としては、メチル化ＤＮＡ抗体が結合可能な支持体であれば、材質及び形状は何でも良い。例えば、形状は、使用目的に適っていればよく、チューブ状、テストプレート状、フィルター状、ディスク状、ビーズ状等が挙げられる。また、材質としては、通常の免疫測定法用支持体として用いられるもの、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ナイロン等の合成樹脂、又は、前記合成樹脂にスルホン基、アミノ基等の反応性官能基を導入したものでも良い。また、ガラス、多糖類若しくはその誘導体（セルロース、ニトロセルロース等）、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等でも良い。
「支持体」は微粒子でも良く、更に、検出オリゴヌクレオチドには、支持体と同じ微粒子が結合されていても構わない。微粒子としては、ラテックスビーズ、金コロイド（金ナノ粒子）等が挙げられる。
支持体と検出オリゴヌクレオチドに、同一種類の微粒子が結合されていれば、支持体である微粒子と検出オリゴヌクレオチドに結合されている微粒子は、目的とするＤＮＡ領域を有するメチル化されたＤＮＡ上に同時結合して、微粒子同士が凝集することが可能になる。即ち、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と、検出オリゴヌクレオチドと、メチル化された一本鎖ＤＮＡが結合して検出複合体を形成することにより、支持体である微粒子と検出オリゴヌクレオチドに結合された微粒子が凝集体となることを意味する。この場合、微粒子がラテックスビーズであれば、凝集体は濁度の変化によって検出することが可能となる。また、微粒子が金コロイド（金ナノ粒子）であれば、凝集体は、色調変化（ピンクから紫色）によって検出することが可能となる。
一つの目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ上に同時に複数の支持体に固定化されたメチル化ＤＮＡ抗体が結合する場合には、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡ上の複数のメチル化ＤＮＡに微粒子上に固定化されたメチル化ＤＮＡ抗体が結合することにより微粒子の凝集を検出できる。例えば、支持体がラテックスビーズである場合、微粒子の凝集体は濁度の変化によって検出することが可能となる。また、支持体が金コロイド（金ナノ粒子）である場合、微粒子の凝集体は、色調変化（ピンクから紫色）によって検出することが可能となる。尚、この場合、検出オリゴヌクレオチドを付加せずに実施しても検出オリゴヌクレオチドを添加した場合と同様の検出結果を得ることができる。
尚、微粒子の凝集体で検出される量は、第二工程までにメチル化されているＤＮＡの総和に相関する値となる。第一工程で取得するＤＮＡが組織中の細胞に含まれるＤＮＡである場合、組織中の細胞に含まれるＤＮＡのメチル化の程度は組織毎に異なっている為、第二工程で得られるＤＮＡのメチル化の程度は、組織中の細胞でのメチル化の程度と、第二工程でメチル化されるの程度の双方を含む。即ち、第二工程でＤＮＡメチル化酵素処理を実施しない場合に微粒子の凝集体で検出される量は、組織中の細胞でのメチル化の程度に相関する値となる。
本発明において「メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合する抗体を意味する。具体的には、メチルシトシン抗体であり、一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることができる。また、市販されているメチル化ＤＮＡ抗体であっても、本明細書記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。メチル化ＤＮＡ抗体は、メチル化された塩基、メチル化ＤＮＡ等を抗原として、通常の方法により作製できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、或いは、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を抗原として作製された抗体からＤＮＡ中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。尚、このような固定化メチル化ＤＮＡ抗体の性質（１つのメチル化された塩基（シトシン）に１つの抗体が結合すること）から考えると、目的とするＤＮＡ領域としては、数多くのメチル化された塩基（シトシン）、即ちＣｐＧ、が存在する領域を選抜することが望ましく、また、定量精度及び検出感度の向上が期待できる。
動物に抗原を接触させて得られる抗体としては、動物から精製した抗原を免疫した後、ＩｇＧ画分の抗体（ポリクローナル抗体）を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体（モノクローナル抗体）を利用する方法がある。本発明においてはメチル化ＤＮＡ、或いはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法をあげることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体（モノクローナル抗体）を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。また、アジュバント溶液（例えば、流動パラフィンとＡｒａｃｅｌ Ａを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの）と抗原をよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。或いは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下或いは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。尚、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内或いは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法などが挙げられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。細胞融合操作の後、ＨＡＴ培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）などが挙げられる。
一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されていれば抗メチル化抗体と結合することができる。従って、本発明の方法における「メチル化された」とは、ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されているＤＮＡを意味しており、ＤＮＡ中に存在するＣｐＧの全てがメチル化されているＤＮＡに限った意味ではない。
第四工程における「検出複合体」とは、第三工程で取得された被検ＤＮＡ複合体と固定化メチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を意味する。メチル化ＤＮＡ抗体は支持体に固定化され得るものとして使用されるため、メチル化ＤＮＡ抗体が、最終的に、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの被検ＤＮＡ複合体を形成した状態で支持体に固定化できればよく、
（１）被検ＤＮＡ複合体とメチル化ＤＮＡ抗体との結合前の段階で、メチル化ＤＮＡ抗体が支持体へ固定化されていても良く、また、
（２）被検ＤＮＡ複合体とメチル化ＤＮＡ抗体との結合後の段階で、メチル化ＤＮＡ抗体が支持体へ固定化されていても良い。
メチル化ＤＮＡ抗体を支持体へ固定させるためには、具体的には、メチル化ＤＮＡ抗体をビオチン化して得られたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ、ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリップ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、メチル化ＤＮＡ抗体に、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これをシランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、又は前記合成樹脂等或いは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。尚、前記の共有結合は、例えば、メチル化ＤＮＡ抗体に前記の活性官能基を有する分子を、トリグリセライドを５個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等を用いて共有結合させればよい。また、メチル化ＤＮＡ抗体を直接支持体に固定化してもよく、また、メチル化ＤＮＡ抗体に対する抗体（二次抗体）を支持体に固定化し、二次抗体にメチル化抗体を結合させることで支持体に固定しても良い。
第四工程である「被検ＤＮＡ複合体に固定化メチル化ＤＮＡ抗体を結合させて検出複合体を取得する」とは、第三工程で得られた被検ＤＮＡ複合体に含まれる一本鎖メチル化ＤＮＡを固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させて支持体に固定化することを意味する。例えば、「被検ＤＮＡ複合体とメチル化ＤＮＡ抗体との結合前の段階で、メチル化ＤＮＡ抗体が支持体へ固定化」する場合、具体的には例えば、支持体に固定化可能なメチル化ＤＮＡ抗体として、「ビオチン標識されたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体」を使用し、検体由来のＤＮＡ試料が、生物由来検体由来検体中に含まれるゲノム由来のＤＮＡ試料である場合には、以下のように実施すれば良い。
（ａ）ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を適当量（例えば、4μg/mL溶液を100μL/ウエル）アビジン被覆プレートに添加し、その後、室温で、例えば、約２時間静置することにより、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とストレプトアビジンとの固定化を促す。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4））を、例えば３００μＬ/ウエルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、支持体に固定化されたビオチン化メチルシトシン抗体をウエル上に残す。
（ｂ）検体由来のＤＮＡ試料が、生物由来検体由来検体中に含まれるゲノム由来のＤＮＡ試料に、NEBuffer2 (NEB社製)を5μL、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を0.5μｌ、シトシンメチル化酵素SssI（NEB社製）を夫々0.5μL加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、37℃で30分間インキュベーション後、二本鎖ＤＮＡを分離させて得られたメチル化一本鎖ＤＮＡと、検出オリゴヌクレオチドと、アニーリングバッファー（例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc2、0.5mM Dithothreitol）とを混合して、９５℃で例えば数分間加熱する。その後、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させるために、検出オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で例えば数分間保温し、その後、室温に戻す（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含むメチル化一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）。
（ｃ）形成されたメチル化一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体を、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体が固定化されたアビジン被覆プレートに添加し、その後、室温で約３時間静置し、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体と、前記メチル化一本鎖ＤＮＡのうち目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含むメチル化一本鎖ＤＮＡと、検出オリゴヌクレオチドとの複合体の形成を促す（複合体の形成）（この段階で、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡ試料がメチル化されていなければ、一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体は、メチル化ＤＮＡ抗体との複合体を形成しない。）。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4））を、例えば３００μＬ/ウエルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返すことにより、複合体をウエル上に残す（複合体の分離）。
（ｂ）において使用するアニーリングバッファーとしては、検出オリゴヌクレオチドと、目的とするＤＮＡ領域を含むメチル化一本鎖ＤＮＡとを結合させるのに適していれば良く、前記アニーリングバッファーに限られるわけではない。二価イオン、好ましくはマグネシウムイオンが１〜６００ｍＭの濃度で溶解しているものを使用すれば結合の安定性が増加する。
（ａ）及び（ｃ）における洗浄操作は、溶液中に浮遊している固定化されていないメチル化ＤＮＡ抗体と、メチル化ＤＮＡ抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖ＤＮＡと、検出オリゴヌクレオチドとの結合体を形成しなかった目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化一本鎖ＤＮＡ等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離のメチル化ＤＮＡ抗体、溶液中に浮遊しているメチル化一本鎖ＤＮＡ等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、ＤＥＬＦＩＡバッファー（Perkin Elmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）、ＴＥバッファー等でも良い。
因みに、前述の如く、上記（ａ）〜（ｃ）では、前記の目的とするＤＮＡ領域をメチル化して得られたメチル化一本鎖ＤＮＡと、検出オリゴヌクレオチドとの結合の後、生じる結合体にビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を結合させ、複合体を形成しているが、この順番に限られるわけではない。即ち、前記の目的とするＤＮＡ領域を含むメチル化一本鎖ＤＮＡとビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させた後、生じる結合体に検出オリゴヌクレオチドを結合させ、複合体を形成しても良い。例えば、ストレプトアビジンで被覆した支持体に固定化されたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体に、生物由来検体由来検体中に含まれるゲノム由来のＤＮＡ試料を、NEBuffer2 (NEB社製)を5μL、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を0.5μｌ、シトシンメチル化酵素SssI（NEB社製）を夫々0.5μL加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、37℃で30分間インキュベーション後、二本鎖ＤＮＡから分離して得られたメチル化一本鎖ＤＮＡを添加することにより、支持体に固定化されたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体と該メチル化一本鎖ＤＮＡとの結合体を形成させる（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含むメチル化一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化されたメチル化一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる。）。その後、これに検出オリゴヌクレオチドを添加して、前記結合体のうち目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含むメチル化一本鎖ＤＮＡを有する結合体との複合体を形成させ、分離しても良い（この段階で、目的とするＤＮＡ領域以外の領域におけるメチル化されたＤＮＡを含むメチル化一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体は複合体を形成しない。）。
上記（ａ）〜（ｃ）の操作を、クロマトストリップを用いて行うことも可能である。その場合には、具体的には以下のように実施する。例えば、まず、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体の適当量を、ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリップにより展開する。該操作により、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体が、ストレプトアビジンで被覆された部分に固定化されることになる。次いで、（ｂ）で得られた前記メチル化一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含むメチル化一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）を、前記のクロマトストリップにより展開する。これら操作により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料を、NEBuffer2 (NEB社製)を5μL、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を0.5μｌ、シトシンメチル化酵素SssI（NEB社製）を夫々0.5μL加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、37℃で30分間インキュベーション後、二本鎖ＤＮＡを分解して得られたメチル化一本鎖ＤＮＡと、検出オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とからなる複合体が、ストレプトアビジンで被覆した部分に固定化されることになる（複合体の形成・支持体への固定）（この段階で、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。複合体形成の順番については、これら操作の順に限られるわけではない。例えば、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、検出オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とからなる複合体を形成させた後、これをクロマトストリップで展開し、ストレプトアビジンで被覆した部分に、該複合体を固定化しても良い。これら操作では、溶液をクロマトストリップにより展開することで不要な成分を除去することができ、洗浄操作を省略することが可能となる。勿論、各操作間に、洗浄操作（洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）によるクロマトストリップの展開）を実施しても何ら問題はない。
第五工程は、第四工程で得られた検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により定量又は検出することにより、前記一本鎖ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する工程である。
ここでいう「検出」とは、検出オリゴヌクレオチドの識別機能により、第二工程までにメチル化されているＤＮＡのメチル化の程度が一定程度以上か否かを判別することを意味する。即ち、通常は、後述の識別機能により有意な値が得られることを意味する。
また、「定量」とは、第五工程で求めた識別機能により検出される数値を意味するものである。即ち、第一工程で取得された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと第二工程でＤＮＡメチル化酵素処理によりメチル化されたメチル化ＤＮＡの総和量に相関する値が得られる事を意味する。例えば、後述する識別機能としてメチル化ＤＮＡ抗体又は本オリゴヌクレオチドの量を定量した値は、検体中での目的とするＤＮＡ領域のＤＮＡの量と相関する値であり、例えば、検体が１mLの血清であった場合、血清１mL中に含まれる目的領域のＤＮＡの、第一工程で取得された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと第二工程でＤＮＡメチル化酵素処理によりメチル化されたメチル化ＤＮＡの総和量に相関する値を取得することを意味する。
第五工程における「識別機能」とは、検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量できる機能である。即ち、識別機能は検出オリゴヌクレオチドの有する機能であれば何でも良く、例えば、検出オリゴヌクレオチドの標識に基づく識別機能や、検出オリゴヌクレオチドに結合する検出分子によって検出オリゴヌクレオチドに付与される識別機能を意味する。具体的には、検出オリゴヌクレオチドに、その５’末端若しくは３’末端にユーロピウム標識、金コロイド標識、ラテックスビーズ標識、放射性同位体標識、蛍光物質（ＦＩＴＣ等）標識、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識、アルカリホスファターゼ標識等がなされた検出オリゴヌクレオチドの蛍光・発色等の特性を挙げることができる。
ユーロピウムの検出のためには、Enhancement Solution（PerkinElmer社製）を添加・混合し、約４５分間室温で静置した後、蛍光検出器で蛍光（励起340nm/蛍光612nm）を測定すればよい。また、検出オリゴヌクレオチドがメチル化オリゴヌクレオチドである場合には、検出分子としては、具体的には、メチル化ＤＮＡ抗体や、オスミウム錯体（非特許文献５）等が挙げられる。メチル化オリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基の少なくとの一つががメチル化されているオリゴヌクレオチドを意味し、より具体的には５-メチルシトシン、６-メチルアデニン等を含むオリゴヌクレオチドを意味する。更に、検出オリゴヌクレオチドがＦＩＴＣ標識されている場合には、検出分子としてＦＩＴＣ抗体を挙げることができる。
Tanaka K., Tainaka K., Kamei T., Okamoto A., Direct labeling of 5-methylcytosine and its applications.，J. Am. Chem. Soc.，2007;129:5612-5620．
検出分子がメチル化ＤＮＡ抗体（但し、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と基質交差性を有するメチル化ＤＮＡ抗体は用いることができない。例えば、固定化メチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体を使用している場合、メチルシトシンに結合し得るメチル化ＤＮＡ抗体を利用することはできない）である場合には、以下の方法により、定量又は検出のために利用される機能として、抗体に結合させて定量又は検出できるものであれば識別機能としての機能を付与することができる。具体的には、ユーロピウム標識、金コロイド標識、ラテックスビーズ標識、放射性同位体標識、蛍光物質（ＦＩＴＣ等）標識、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識、アルカリホスファターゼ標識、ビオチン標識等、標識が蛍光・発色等の機能である。尚、これら検出分子としての抗体に識別機能を付与する方法としては、検出分子である抗体に直接識別機能を結合させても良いし、識別機能を有した二次抗体又は三次抗体を検出分子である抗体に結合させる方法が挙げられる。具体的には、蛍光物質で標識された抗体、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識された抗体、アルカリホスファターゼ標識された抗体、ビオチン標識された抗体、ユーロピウム標識された抗体は、市販されているので、二次抗体又は三次抗体として利用する事ができる。また、酵素サイクル法で検出可能な基質を結合した抗体であっても良い。これら機能の定量又は検出手段としては、例えば、放射線検出器、分光光度計等による測定、又は目視等が挙げられる。例えば、検出オリゴヌクレオチドを、その識別機能により検出又は定量する場合として、具体的に検出又は定量可能な機能としてユーロピウムが付加された二次抗体を使用する場合、検出複合体に二次抗体を結合させた後、Enhancement Solution（PerkinElmer社製）を添加・混合し、約４５分間室温で静置する。その後、蛍光検出器で蛍光（励起340nm/蛍光612nm）を測定すればよい。
検出オリゴヌクレオチド上のメチル化ＤＮＡにメチル化ＤＮＡ抗体（固定化メチル化ＤＮＡ抗体と異なる基質特異性を有するメチル化ＤＮＡ抗体）を結合させて、その機能により検出又は定量する場合には、具体的には例えば、抗体自身の特性を機能として用いる際には、以下のように操作を行えば良い。複合体にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させた後、メチル化ＤＮＡ抗体に対する二次抗体（例えば、Eu-N1標識マウスIgG抗体：PerkinElmer社製）を添加し、室温で約１時間静置し、二次抗体の複合体への結合を促す。その後、Enhancement Solution（PerkinElmer社製）を添加・混合し、例えば約４５分間室温で静置する。その後、蛍光検出器で蛍光（励起340nm/蛍光612nm）を測定することにより、検出又は定量する。
また、検出オリゴヌクレオチド上のメチル化ＤＮＡに結合するメチル化ＤＮＡ抗体をＦＩＴＣで標識する場合には、二次抗体としてＦＩＴＣを結合させた抗体を用いることもできる。この場合、公知の方法により、ＦＩＴＣの蛍光を測定し、検出又は定量することもでき、抗ＦＩＴＣ抗体を二次抗体として検出又は定量することもできる。更に、検出オリゴヌクレオチドにＦＩＴＣを直接結合させた場合は、ＦＩＴＣを識別機能として利用することもできるし、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識されたＦＩＴＣ抗体、アルカリホスファターゼ標識されたＦＩＴＣ抗体、ビオチン標識されたＦＩＴＣ抗体、ユーロピウム標識されたＦＩＴＣ抗体等により標識機能を付与することもできる。具体的には、検出オリゴヌクレオチドとして、ＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドを検出オリゴヌクレオチドとして使用する場合は、該検出オリゴヌクレオチドを含む支持体に固定化された検出複合体に、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識された抗体（例えば、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories社製）を添加し、室温で約１時間〜2時間静置し、ＦＩＴＣ抗体の検出複合体への結合を促す。その後、ＦＩＴＣ抗体溶液を洗浄除去してから、適切な基質（例えば、Substrate Reagent Pack #DY999：R&D SYSTEMS社製）を添加・混合する。約５〜６０分間室温で静置した後、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を添加してhorseradish Peroxidase（ＨＲＰ）の反応を停止させ、反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定すればよい。
また、メチル化ＤＮＡ抗体の固定化にビオチンを利用しない場合、ビオチン化検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量に用いることができる。ビオチン化された検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量する場合には、例えば、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを固定化された検出複合体に添加・混合し、ビオチン化検出オリゴヌクレオチドとＨＲＰ標識ストレプトアビジンとの結合体を形成・分離した後、公知の方法によりＨＲＰの活性を測定することによりビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を検出又は定量できる。
また、識別機能としては、酵素サイクル法等の高感度検出法で用いられる基質等を利用するものであってもよい。具体的には、酵素サイクル法で用いられる酵素を結合した抗体を検出分子として、検出複合体に結合させれば良い。尚、本発明方法において検出分子に付与される識別機能としては、上記の記載の方法に限定されるものではない。
「検出分子」とは、検出オリゴヌクレオチドを検出又は定量する性質を有していればよい。また、検出分子は、検出オリゴヌクレオチドの検出配列を認識するものであっても良く、予め検出オリゴヌクレオチドに結合されていても構わない。即ち、検出分子は、検出オリゴヌクレオチドに特異的に結合する性質を有し、且つ、定量又は検出のために利用される機能・特性である「識別機能」を有するか、或いは識別機能を付与され得るものであれば良い。具体的には、検出分子は、検出配列がメチル化オリゴヌクレオチドの場合、該メチル化オリゴヌクレオチドに結合して該メチル化オリゴヌクレオチドを検出できるものであれば良く、該メチル化オリゴヌクレオチドに特異的に結合して識別機能を示すものであれば良い。（但し、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と基質交差性を有するメチル化ＤＮＡ抗体は用いることができない。例えば、固定化メチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体を使用している場合、メチルシトシン抗体を検出分子として利用することはできない）。他に例えば、検出分子はメチル化ＤＮＡ抗体であってもよい。但し、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と基質交差性を有するメチル化ＤＮＡ抗体は用いることができない。例えば、固定化メチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体を使用している場合、メチルシトシン抗体を検出分子として利用することはできない。また、検出配列が検出分子そのものである場合、検出オリゴヌクレオチドを検出するために、新たな検出分子を添加しなくとも良く、検出オリゴヌクレオチドに組み込まれた検出分子を検出することにより、該検出オリゴヌクレオチドの検出が可能になる。
血液、尿等の生体試料中に含まれる微量物質の検出又は定量する方法として、免疫学的測定方法が汎用されている。該免疫学的測定方法のうち、クロマトグラフィーを用いた所謂イムノクロマト法は操作が簡単であり、検定に要する時間も短いため、現在、例えば、病院における臨床検査、研究室における検定試験等の多くの場面で広く利用されている。また、近年、標識されたＤＮＡ（遺伝子）をクロマトストリップ上で展開し、目的ＤＮＡ（遺伝子）を捕獲できるプローブを用いてハイブリダイゼーションすることにより、目的ＤＮＡ（遺伝子）を検出する、所謂ハイブリッドクロマト法が利用されるようになってきた。この方法も操作が簡便であり、検定に要する時間も短いため、現在、病院における臨床検査、研究室における検定試験等の場面で広く利用され始められている。本発明方法は、上記のイムノクロマト法とハイブリッドクロマト法とを混合した方法を概念的に可能としている。本発明方法では、複合体形成及び複合体取得に関して、その順序は特に限定されないため、種々の方法が可能である。具体的には例えば、以下のように実施すれば良い。
方法１：第二工程終了直後の試料に、識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドを添加し、目的とするＤＮＡ領域を含むメチル化された一本鎖ＤＮＡと識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させ（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと検出オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）、次いで、ビオチン化メチル化抗体を添加し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成させる。得られた試料を、クロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記複合体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。その後、得られた複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出又は定量することにより、目的とするＤＮＡ領域有するＤＮＡを検出又は定量できる。
方法２：第二工程終了直後の試料に、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を添加し、メチル化されたシトシンを有するメチル化された一本鎖ＤＮＡ（この中には、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと目的以外の一本鎖ＤＮＡが存在する）とビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体との結合体を形成させる（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる。）。得られた試料を、クロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記結合体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される（この段階でも結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる。）。その後、識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドを導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、結合体のうち目的とするＤＮＡ領域を含むメチル化された一本鎖ＤＮＡにのみ結合し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成する。得られた複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出又は定量することにより、目的とするＤＮＡ領域有するＤＮＡを検出又は定量できる。
方法３：ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体をクロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記メチル化ＤＮＡ抗体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。次いで、第二工程終了直後の試料を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、既に捕獲されているメチル化ＤＮＡ抗体に、メチル化されたシトシンを有する一本鎖ＤＮＡが結合体として捕獲される（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる。）。その後、識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドを導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、結合体のうち目的とするＤＮＡ領域を含むメチル化された一本鎖ＤＮＡにのみ結合し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とが結合した検出複合体を形成する。得られた複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出又は定量することにより、目的とするＤＮＡ領域有するＤＮＡを検出又は定量できる。
方法４：ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体をクロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記メチル化ＤＮＡ抗体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。第二工程終了直後の試料に、識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドを添加し、目的とするＤＮＡ領域を含むメチル化された一本鎖ＤＮＡと識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドとの結合体である被検ＤＮＡ複合体を形成させる。次いで、得られた結合体を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、既に捕獲されているメチル化ＤＮＡ抗体に、結合体のうち目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡのみが結合し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、識別機能を有する検出オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とが結合した検出複合体を形成する。得られた複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出又は定量することにより、目的とするＤＮＡ領域有するＤＮＡを検出又は定量できる。
目的とするＤＮＡ領域に複数の検出部位（それぞれ異なる目的とするＤＮＡ領域と相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドを用いる）を存在させ、各目的とするＤＮＡ領域を順次検出又は定量することも可能であり、また、複数の目的とするＤＮＡ領域と複合体を形成できるように、ゲノム中の反復配列や重複遺伝子或いは複数の異なる遺伝子を同時に検出するような、複数の目的とするＤＮＡ領域と相補的に結合し得る検出オリゴヌクレオチドを用いても、検出感度を飛躍的に上げることができる。更に、１つの目的領域の中でも、数多くの検出オリゴヌクレオチドを設計し、それらを支持体側又は検出側で用いても、検出感度を飛躍的に上げることができる。
また、検出オリゴヌクレオチド、ビオチン化メチル化抗体、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化された一本鎖ＤＮＡの複合体を形成し支持体へ結合させる過程を実施する方法としては、前記の方法1〜方法４に限定されるものではなく、免疫抗体法を用いる方法であってもよい。例えば、ELISA法では、クロマトストリップ法と同様の原理を用いるため、複合体を形成し支持体へ結合させる過程を方法１〜４に記載の順番で実施することはが可能である。
このような本発明方法で使用し得るＤＮＡメチル化酵素、検出オリゴヌクレオチド、又は、メチル化ＤＮＡ抗体は、検出用キットの試薬として有用である。本発明方法は、これらＤＮＡメチル化酵素、特定オリゴヌクレオチド、又は、メチル化ＤＮＡ抗体等を試薬として含有する検出用キットや、これら本オリゴヌクレオチド、又は、メチル化ＤＮＡ抗体等が支持体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、本発明方法の権利範囲は、該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。
通常、生検サンプルや食品中に含まれる病原性微生物の有無を検査する場合、各々微生物抗原に対して免疫法による検査により、該病原性微生物の有無を調べたり、該病原性微生物を特定する。しかし、この免疫法に用いる抗体の作製は容易ではなく、更に複数の病原性微生物を検出するためには、各々の病原性微生物の抗原に対する抗体を作製する必要がある。そこで、本発明方法を用いることにより、これら煩雑な抗体作製を行うことなく病原性微生物に対する簡易な検査が可能となる。また、本発明方法では、異なる病原性微生物の塩基配列を同時に検査できることから、一つの検体中に含まれる数種類の病原性微生物を、同時に検出できるようになる。具体的には、Listeria monocytogenes、Salmonella enterica、Campylobacter jejuni subsp. Jejuni、Staphylococcus aureus、Vibrio parahaemolyticus、Bacillusu cereus、Clostridium botulinum、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberuculosis、Clostridium perfringens等の食中毒菌が知られているが、これらのうち数種類の食中毒菌を同時に検出する技術は知られていない。しかし、本発明方法を用いることで数種類の食中毒菌の塩基配列を同時に検出することが可能となる。また、検出対象の塩基配列として、CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)領域のように、ゲノム中に複数見出される塩基配列を特定オリゴヌクレオチドにより選択する場合、一ゲノム中の一遺伝子を検出するよりも高感度での検出が可能となる。このような技術は、感染症の診断や食中毒菌の迅速検出にも有用である。また、本発明方法は環境中の微生物のゲノムを検出することにより、産業上の有用な菌の同定や土壌、河川、湖沼の底質等の微生物群の簡易調査にも用いることができる。環境中の微生物のうち、例えば、Methanococcus jannaschii、Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH、Aquifex aeolicus、Pyrococcus horikoshii OT3、Archaeoglobus fulgidus、Thermotoga maritima MSB8、Aeropyrum pernix K1、Haloferax mediterraneiの生息を確認することが可能となる。また、Geobacter sulfurreducensのように工業上利用でき得る細菌やStreptococcus thermophilusのような醗酵に用いられる微生物の検出、同定も可能となる。
本発明方法における目的とするＤＮＡ領域が、微生物由来の塩基配列である場合、検体中から抽出したゲノムＤＮＡまたはＤＮＡ断片、或いは、検体中から抽出したＲＮＡを逆転写酵素によりＤＮＡとした塩基配列を意味する。従って、検出オリゴヌクレオチドとの相補的な結合が可能な塩基配列としては、該微生物に特異的な領域を選択すればよい。例えば、本発明における目的とするＤＮＡ領域が微生物の塩基配列である場合、目的とするＤＮＡ領域を検体中から選択的に抽出するためには、微生物ゲノムＤＮＡ、或いは、検体中から抽出したＲＮＡを逆転写酵素によりＤＮＡ等の塩基配列のうち、目的とするＤＮＡ領域近傍にある微生物特有の塩基配列を特定オリゴヌクレオチドと特異的に結合する塩基配列とすればよい。
例えば、微生物中のゲノムを検出するための目的とするＤＮＡ領域と検出オリゴヌクレオチドが相補的に結合する領域としては、具体的にはGenbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域（配列番号２９）、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685（配列番号３４）のように遺伝子をコードしない塩基配列でもよい。また、種々の病原性微生物に共通する特徴的な遺伝子の病原性微生物で保存された塩基配列を検出対象とすることは、複数の病原性微生物を同時に検出する方法を提供し得るものであるため有用である。具体的には、mce-family遺伝子（Micobacterium tuberculosis）、13番染色体上のtRNA-Tyr塩基配列（Cryptococcus neoformans）、chitin synthase activator (Chs3)は、Aspergillus fumigatus及びNeosartorya 属に特有の塩基配列を有することから、ヒトの痰、肺の生検サンプル中から抽出したＤＮＡ中にこれら微生物由来のＤＮＡが含まれるか否かを検定することで微生物による感染症の検定に用いることができる。また、actA（Listeria monocytogenes）、pyrG（NC_002163、Campylobacter jejuni subsp. jejuni）などは食中毒菌に特有共通した遺伝子であることから、これらの遺伝子は食中毒における微生物検定に用いることができる。また、thrAは、Salmonella enterica、Yersinia enterocolitica、Escherichia coliで保存された配列を有しており、一つの遺伝子で複数の微生物を検出することも可能である。
データベース上で公開されている塩基配列のうち、微生物特有の塩基配列を検索し、微生物特有の塩基配列を探索することができる。例えば、ＰｕｂＭｅｄ等の公開データベース上にある塩基配列であれば、通常の手続きにより取得することが可能であり、取得した塩基配列は、通常の手続きによるＢｌａｓｔ検索をかけることにより、特有の塩基配列であるか否かを検討することができる。尚、特有の塩基配列とは、検出対象の塩基配列が検出対象となる微生物のゲノム塩基配列以外の生物由来の塩基配列と相同性を示す塩基配列を有さないことを意味する。
特に、検体がヒト生検サンプルである場合、ヒト遺伝子と相補的な結合をしない特定オリゴヌクレオチドを設計することは重要である。また、同様に、検体が食品である場合、食品に含まれる検出対象以外の生物由来の塩基配列と相補的な結合をしない特定オリゴヌクレオチドを設計することは重要である。
血液中の遊離ＤＮＡを検出するためには、遊離ＤＮＡの量と相関する領域であれば何でもよく、遊離ＤＮＡの定量又は検出を目的とする場合、ゲノム中の同じ配列が、特に数回以上、反復して見られる、いわゆる反復配列が望ましく、単純反復配列（縦列反復配列、或いは、タンデムリピートと呼ばれる）や、散在反復配列であれば、更によい。
単純反復配列は、同じ配列が同じ向きに隣り合って存在することを特徴とし、サテライトＤＮＡ、ミニサテライト、マイクロサテライト、セントロメア、テロメア、動原体、リボソーム集団遺伝子のような一連の塩基配列などが知られている。
散在反復配列は、隣り合わず散在することを特徴とし、レトロトランスポゾンに由来するＤＮＡと考えられている。散在反復配列は、塩基配列の長さにより、ＳＩＮＥ（Short Interspersed Repetitive Element：短鎖散在反復配列）とＬＩＮＥ（Long Interspersed Elements：長鎖散在反復配列）に分類され、ヒトの塩基配列としては、各々、Ａｌｕ配列やＬＩＮＥ−１配列が代表的な反復配列として知られている。また、ＲＮＡやタンパク質から逆転移した不活性なプロセッシング済みの偽遺伝子、遺伝子重複により増幅した遺伝子配列も知られている。
重複遺伝子とは、一つのゲノム上に複数の高い相同性を有する遺伝子が存在する場合を指し、多くの場合は、一遺伝子の近傍にタンデムに並んで存在する塩基配列である。尚、偽遺伝子も重複遺伝子の一つである事が多い。
反復配列の具体的な例としては、例えば、比較的短い塩基配列からなる繰り返しとしては、(A)n、(T)n、(GA)n、(CA)n、(TAA)n、(GGA)n、(CAGC)n、(CATA)n、(GAAA)n、(TATG)n、(TTTG)n、(TTTA)n、(TTTC)n、(TAAA)n、(TTCA)n、(TATAA)n、(TCTCC)n、(TTTCC)n、(TTTAA)n、(TTTTC)n、(TTTTA)n、(TTTTG)n、(CAAAA)n、(CACCC)n、(TATATG)n、(CATATA)n、(TCTCTG)n、(AGGGGG)n、(CCCCCA)n、(TGGGGG)n（ｎは繰返し数を意味する）等の配列が知られていおり、転写因子に由来する配列としては、hATグループとして、MER１-Charlie、Zaphodが該当し、Tc-1グループとして、MER2-Tigger、Tc-1、Marinerが該当する。その他、具体的には、Tigger1、Tigger2a、Tigger5、Charlie4a、Charlie7等が知られている。これらの配列は、一般的に短く且つ単純な塩基配列であり、後述の特定接着配列及び検出用接着配列を設定することは難しいが、本発明方法における、後述の特定接着配列及び検出用接着配列の設定対象と設定可能な配列を有していれば、本発明方法にも利用可能であることから、必ずしも、本発明方法の対象として排除するものではない。また、サテライトＤＮＡ、ミニサテライト、マイクロサテライトなどは、単純反復配列に分類される反復配列である。
また、遺伝子中に多コピー存在する配列としては、セントロメアに存在する配列としてALR6、snRNAとしてU2やU6、その他、tRNAやrRNAのように一般的にゲノム中に多コピー存在することが知られている遺伝子の他、遺伝子重複によりゲノム中に複数コピー存在する遺伝子等を挙げることができる。
更に、レトロウイルス、末端にLTR（Lomg terminal repeat）を有するレトロトランスポゾン、MaLRs（Mammalian apparent LTR-Retrotransposons）のような、ウイルス由来と考えられる内在配列や、レトロウイルス由来のLTRについても、一ゲノム中に複数存在することが知られている。
例えば、レトロトウイルス由来のLTRとしては、具体的には、LTR1、LTR1B、LTR5、LTR7、LTR8、LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E、MER48、MLT2CB等のサブファミリーが知られている。また、レトロトランスポゾン由来のLTRは、ERV、ERVK、ERVLの各クラスに分類され、具体的には、LTR8A、LTR28、MER21B、MER83、MER31B、MER49、MER66B、HERVH、ERVL、LTR16A1、LTR33A、LTR50、LTR52、MLT2A1、MLT2E 、MER11C、MER11C等のサブファミリーを挙げることができる。更に、ＭａＬＲｓは、典型的なレトロトランスポゾンと同様にその配列の両端にLTRを含むが、LTRにはさまれた内部配列がレトロウイルス由来ではない配列のＤＮＡ因子を指す。例えば、MLT1A1、MLT1A2、MLT1B、MLT1C、MLT1D 、MLT1F、MLT1G 、MLT1H、MLT1J 、MLT1K 、MLT1I 、MLT2CB 、MSTA、MSTA-int、MSTB 、THE1A、THE1B、THE1B-internal、THE1等のサブファミリーを挙げることができる。
散在反復配列は、隣り合わず散在することを特徴としており、レトロトランスポゾンに由来すると考えられている。また、散在反復配列は、その長さにより、ＳＩＮＥ（Short Interspersed Repetitive Element：短鎖散在反復配列）とＬＩＮＥ（Long Interspersed Elements：長鎖散在反復配列）に分類される。ＳＩＮＥのうち、大部分はＡｌｕファミリーに属する配列である。特徴としては、７ＳＬ ＲＮＡの３’側の配列或いは５’側の配列を有し、尚且つLeft-monomerとRight-monomerと呼ばれる領域にはさまれたＡＴ−Ｒｉｃｈ領域を有している。Ａｌｕファミリーのサブファミリーとしては、Alu、AluJb、AluJo、AluSc、AluSg、AluSp、AluSq、AluSx、AluYを、更には、ＦＡＭ（Fossil Alu Monomer）と、ＦＡＭの配列を有するＦＬＡＭ（Free Left Alu Monomer）とＦＲＡＭ（Free Right Alu Monomer）を挙げることができる。Ａｌｕファミリー以外のＳＩＮＥとしては、ＭＩＲ、及びＴｈｅｒ／ＭＩＲ３が知られており、夫々、サブファミリーとして、MIR、MIR3が知られている。そのほか、他の生物種のＡｌｕファミリーのサブファミリーとしては、B1、B2、B4、PB1、PB1D等が知られている。ＬＩＮＥとしては、LINE1からLine23のサブファミリーが報告されているが、LINE-1、LINE2、LINE3が広くゲノム中に存在することが知られている。尚、LINE-1については、例えば、L1M1、L1M2、L1M3、L1M3d、L1M4、L1M4c、L1MA2、L1MA7、L1MA8、L1MA9、L1MB1、L1MB1、L1MB3、L1MB4、L1MB5、L1MB6、L1MB7、L1MCa、L1MCb、L1MC2、L1MC3、L1MC4、L1MC4a、L1MC5、L1MDa、L1ME、L1MEc、L1MEd、L1MEg、L1ME1、L1ME2、L1ME3、L1ME3A、L1ME3B、L1ME4a、L1PB3、L1P4、L1PA2、L1PA3、L1PA4、L1PA5、L1PA6、L1PA7、L1PA10、L1PA12、L1PA13、L1PA14、L1PA16、L1PB1、L1PB3、L1PB4、L1PREC2、HAL1のサブファミリーが知られており、LINE-2としては、L2、L2cのサブファミリーが知られている。なお例えば、Aluファミリー又はAluのサブファミリーに共通の配列、LINE-1ファミリー或いはLINE-1のサブファミリーに共通の配列に対して、後述の特定接着配列及び検出用接着配列を設定できれば、一ゲノム中に複数の検出対象を設定することができるため、ゲノムの検出をより高感度にすることができる。
目的とするＤＮＡ領域としては、具体的に例えばＬＩＮＥ−１の部分配列（配列番号３７）やＡｌｕの部分配列（配列番号３９に示す塩基配列）又はそれらの相同性を示す塩基配列等を挙げることができる。
尚、例えばある領域中の反復配列を調べたい場合、PubMed等の一般的な配列検索のデータベースで検索することは難しく、通常は、Repbase（http://www.girinst.org/repbase/）、RepeatMasker（http://www.repeatmasker.org/）等のデータベースを用いればよい。本発明方法の特定接着配列及び検出用接着配列を設定できれば、検出感度を上げることができる。更に、これらの反復配列を測定することは、例えば、血液中の遊離ＤＮＡ量のサロゲートマーカーとして扱うことが可能であり、生物種特異的な反復配列に注目する場合は、生物種の特定等に利用することができる。
尚、本発明方法において、反復配列を測定することは、一ゲノム中に複数存在する塩基配列を同時に測定することを意味し、例えば配列番号３７で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列は、ヒトゲノム中に約２８０コピーあり、配列番号３９で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列は、ヒトゲノム中に約８２０コピーある。従って、夫々の塩基配列中に検出用接着配列と特定接着配列を設定できれば、１ゲノムの中に一種類しかない配列に対して検出用接着配列と特定接着配列を設定する場合に比べると、１ゲノムの検出感度を、理論上で２８０〜８２０倍上げることが可能となる。
本発明方法における「重複遺伝子」とは、遺伝子重複により、ゲノム中の特定の遺伝子或いは遺伝子断片が倍加することにより生じた遺伝子或いは遺伝子断片を意味する。遺伝子重複とは、遺伝子を含むDNAのある領域が重複する現象のことである。遺伝子重複が起こる原因としては、遺伝的組換えの異常、レトロトランスポゾンの転移、染色体全体の重複などがある。例えば、1つの遺伝子がコピーされてゲノムＤＮＡに挿入されることを意味し、異なる染色体位置へ挿入される場合と、元の遺伝子の近傍に挿入される場合がある。元の遺伝子の近傍への挿入により、コピーされた遺伝子が並んでいる場所をタンデムリピートと呼び、遺伝子重複によって作り出された遺伝子のグループを遺伝子族(或いは遺伝子ファミリー)と呼ぶ。
本発明方法における「偽遺伝子」とは、ＤＮＡの配列のうち、遺伝子産物（特にタンパク質）をコードしていたことを想像させるような特徴のある塩基配列を有しているが、現在は機能を失っている遺伝子をいう。元の機能を有する配列に突然変異が生じた結果生まれたと考えられている。例えば、突然変異によりストップコドンが生じてタンパク質のペプチド鎖が短くなってしまいタンパク質として機能を果たせなくなる場合や、一塩基置換等の突然変異により正常な転写に必要な調節配列が機能を失う場合などがある。偽遺伝子は元の正常な遺伝子が別に残っている場合が多いが、単独で偽遺伝子になるものもある。
偽遺伝子は、遺伝子配列の特徴により3タイプに分類できる。ｍＲＮＡからレトロトランスポゾンの逆転写酵素によって作られたＤＮＡがゲノムに挿入される場合（プロセス型偽遺伝子）、ゲノム内で元の遺伝子配列が重複し、そのコピーのうち一部が突然変異等により機能を喪失して偽遺伝子になる場合（重複偽遺伝子または非プロセス型偽遺伝子）、及び、ゲノム内の遺伝子が、（重複遺伝子がなく単独の遺伝子のまま）機能を失うことにより偽遺伝子になる場合がある。
尚、現在、偽遺伝子として知られる遺伝子の中には、転写されている例や、遺伝子機能を有する例（偽遺伝子と呼ぶべきかどうかは定まっていない）も知られるようになっていることから、本発明方法における、「偽遺伝子」とは、遺伝子機能の有無、転写されるか否かではなく、前記の「プロセス型偽遺伝子」と「重複偽遺伝子（非プロセス型偽遺伝子）」を意味するものとする。
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡがゲノム中の反復配列である場合には、反復配列が相同性を有する一群の塩基配列であることから、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと検出用接着配列の相補的な塩基対合は、塩基配列のすべてが目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡと塩基対合しない場合が発生する可能性がある。具体的には、ＬＩＮＥ配列として、配列番号３７に対しては、８０％以上の相同性を有する塩基配列はゲノム中に約２８０コピーあり、ＳＩＮＥ（Ａｌｕ）配列として、配列番号３９に対しては、８０％以上の相同性を有する塩基配列は、ゲノム中に約８２０コピーが見出される。しかし、これらのゲノム中に見出される相同性を有する塩基配列は、配列番号３７及び配列番号３９に対して、一塩基から数塩基異なるものが含まれている。
本発明方法の第一工程において、高濃度のナトリウム塩が存在する系により検体からＤＮＡを抽出することが好ましい。具体的には、本発明方法の第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液（例えば、緩衝液）中のナトリウム塩の濃度としては、少なくとも５０ｍＭ以上、好ましくは１００ｍＭ以上を挙げることができる。より具体的には、５０ｍＭ以下１０００ｍＭ以下、好ましくは１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下、より好ましくは１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下が挙げられる。また、ナトリウムイオンを含む塩であれば、ＮａＣｌ、ＮａＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４等を含むどのような塩でも構わないが、好ましくは、ＮａＣｌを挙げることができる。
本発明は、癌患者由来の検体を選抜する方法であり、発明１〜１３のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法を含む。当該発明の好ましい態様としては、検体が哺乳動物由来の血清である発明、また更に、目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである発明を挙げることができる。これら発明を利用すれば、血液検査により、癌患者を簡便に特定することが可能となろう。
ここで「癌患者」とは、癌を発症した被験者を意味しており、癌としては、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、直腸癌、肝癌（肝細胞癌、胆管細胞癌）、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、結腸癌、肛門癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、前立腺癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣（睾丸）癌、上顎癌、舌癌、（上、中、下）咽頭癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病 、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、甲状腺癌、脳腫瘍、骨肉腫、皮膚癌（基底細胞癌、有棘細胞癌）等の、ヒトおよび哺乳類の臓器で発症する固形癌と、ヒトおよび哺乳類の血液で発症する非固形癌のいずれの癌も含むことを意味する。
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号１７及び配列番号１８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号１９、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF1：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ （配列番号１７）
PR１：5’- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号１８）
＜DNAフラグメント＞
X：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号１９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。
ＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を10μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号２０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＸ’に相補性により結合可能な配列番号２１で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ１を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
X’：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号２０）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’ （配列番号２１）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。約１５分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）その結果を図１に示した。溶液Ａ、溶液Ｂ、及び溶液Ｃでは、溶液Ｄに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例２
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号１７及び配列番号１８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号１９、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ１：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ （配列番号１７）
ＰＲ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号１８）
＜DNAフラグメント＞
Ｘ：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号１９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。
ＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
またクロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号２２及び配列番号２３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｙ、配列番号２４、Genbank Accession No. AC009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’ （配列番号２２）
ＰＲ２：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ （配列番号２３）
＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号２４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６０℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＹを精製した。
ＤＮＡフラグメントＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
前記に調製したＤＮＡフラグメントＸの溶液ＡとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ａを、ＤＮＡフラグメントＸの溶液ＢとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ｂを、ＤＮＡフラグメントＸの溶液ＣとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ｃを、ＤＮＡフラグメントＸの溶液ＤとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ｄを、夫々混合し、以下に示すＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＤを夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＢ：1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＤ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号２０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＸ’に相補性により結合可能な配列番号２１で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ１を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
X’：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号２０）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’ （配列番号２１）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約３０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図２に示した。溶液ＭＡ、溶液ＭＢ、及び溶液ＭＣでは、溶液ＭＤに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例３
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号１７及び配列番号１８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号１９、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ１：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ （配列番号１７）
ＰＲ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号１８）
＜DNAフラグメント＞
X：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号１９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。
ＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
また、クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号２２及び配列番号２３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｙ、配列番号２４、Genbank Accession No. AC009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’ （配列番号２２）
ＰＲ２：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ （配列番号２３）
＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号２４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６０℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＹを精製した。
ＤＮＡフラグメントＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
前記に調製したＤＮＡフラグメントＸの溶液ＡとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ａを、ＤＮＡフラグメントＸの溶液ＢとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ｂを、ＤＮＡフラグメントＸの溶液ＣとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ｃを、ＤＮＡフラグメントＸの溶液ＤとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ｄを、夫々混合し、以下に示すＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＤを夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＢ：1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＤ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号２５で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＹ’に相補性により結合可能な配列番号２６で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ２を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｙ’：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号２５）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ２：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’ （配列番号２６）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約３０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図３に示した。溶液ＭＡ、及び溶液ＭBでは、溶液ＭＤに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例４
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号１７及び配列番号１８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号１９、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ１：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ （配列番号１７）
ＰＲ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号１８）
＜DNAフラグメント＞
X：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号１９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。
ＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
また、クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号２２及び配列番号２３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｙ、配列番号２４、Genbank Accession No. AC009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF２：5’- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’ （配列番号２２）
PR２：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ （配列番号２３）
＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号２４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６０℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＹを精製した。
ＤＮＡフラグメントＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
前記に調製したＤＮＡフラグメントＸの溶液ＡとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ａを、ＤＮＡフラグメントＸの溶液ＢとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ｂを、ＤＮＡフラグメントＸの溶液ＣとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ｃを、ＤＮＡフラグメントＸの溶液ＤとＤＮＡフラグメントＹの溶液Ｄを、夫々混合し、以下に示すＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＤを夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＢ：1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＤ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を10μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号２０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＸ’に相補性により結合可能な配列番号２１で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ１を合成し、また、配列番号２５で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＹ’に相補性により結合可能な配列番号２６で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ２を合成し、夫々の濃度が0.02 μＭであるＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
X’：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号２０）
Ｙ’：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号２５）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’ （配列番号２１）
Ｆ２：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’ （配列番号２６）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約３０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図４に示した。溶液ＭＡ、溶液ＭＢ、及び溶液ＭＣでは、溶液ＭＤに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例５
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号２７及び配列番号２８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（S、配列番号２９、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号２７）
PR３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２８）
＜DNAフラグメント＞
S：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントSを精製した。
ＤＮＡフラグメントSについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号３０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＳ’に相補性により結合可能な配列番号３１で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｓ’：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３０）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ３：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’ （配列番号３１）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約３０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図５に示した。溶液Ａ、溶液Ｂ、及び溶液Ｃでは、溶液Ｄに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例６
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号２７及び配列番号２８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（S、配列番号２９、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号２７）
ＰＲ３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２８）
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
ＤＮＡフラグメントＳについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
また、得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３２及び配列番号３３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号３４、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号３２）
ＰＲ４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号３３）
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号３４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
ＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
前記に調製したＤＮＡフラグメントＳの溶液ＡとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ａを、ＤＮＡフラグメントＳの溶液ＢとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ｂを、ＤＮＡフラグメントＳの溶液ＣとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ｃを、夫々混合し、以下に示すＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＣを夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＢ：1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＣ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号３０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＳ’に相補性により結合可能な配列番号３１で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｓ’：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３０）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３１）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約６０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図６に示した。溶液ＭＡ、及び溶液ＭＢでは、溶液ＭＣに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例７
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号２７及び配列番号２８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（S、配列番号２９、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号２７）
ＰＲ３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２８）
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
ＤＮＡフラグメントＳについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
また得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３２及び配列番号３３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号３４、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号３２）
ＰＲ４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号３３）
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号３４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
ＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
前記に調製したＤＮＡフラグメントＳの溶液ＡとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ａを、ＤＮＡフラグメントＳの溶液ＢとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ｂを、ＤＮＡフラグメントＳの溶液ＣとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ｃを、夫々混合し、以下に示すＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＣを夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＢ：1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＣ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号３０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＳ’に相補性により結合可能な配列番号３１で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を合成し、また、配列番号３５で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＴ’に相補性により結合可能な配列番号３６で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ４を合成し、夫々の濃度が0.02 μＭであるＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｓ’：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３０）
Ｔ’：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号３５）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３１）
Ｆ４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号３６）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約６０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図７に示した。溶液ＭＡ、及び溶液ＭＢでは、溶液ＭＣに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例８
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：100ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：10ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：1ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
上記の調製した夫々の溶液を５μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）２μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
得られた夫々の反応液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
ヒトトランスポゾンとして知られるLINE1領域に設計された配列番号３７で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドZ（Genbank Accession No. M80340等に示される塩基番号115-386に相当する領域）と相補性により結合可能な配列番号３８で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ５を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｚ：5’- TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC -3’（配列番号３７）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ５：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’ （配列番号３８）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約１０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図８に示した。溶液Ａ、溶液Ｂ、及び溶液Ｃでは、溶液Ｄに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はゲノムＤＮＡの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなり、ゲノムＤＮＡの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例９
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：100ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：10ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：1ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
上記の調製した夫々の溶液を５μＬと、制限酵素ＭｓｐＩを４Ｕと、ＭｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、500mM NaCl）２μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
得られた夫々の反応液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
ヒトトランスポゾンとして知られるＡｌｕ領域に設計された配列番号３９で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＷ（Genbank Accession No. ＡＦ４５８１１０等に示される塩基番号178-262に相当する領域）と相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ６を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｗ：5’- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC-3’（配列番号３９）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ６：5’- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3’ （配列番号４０）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約８分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図９に示した。溶液Ａ、溶液Ｂ、及び溶液Ｃでは、溶液Ｄに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はゲノムＤＮＡの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなり、ゲノムＤＮＡの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例１０
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号２７及び配列番号２８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（S、配列番号２９、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
PF３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号２７）
PR３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２８）
＜DNAフラグメント＞
S：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントSを精製した。
ＤＮＡフラグメントSについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：0.1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号３０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＳ’に相補性により結合可能な配列番号３１で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｓ’：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３０）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ３：5’- CTGGCCAAACTGGAGAT -3’ （配列番号３１）
また、配列番号３０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＳ’の負鎖に対して相補性により結合可能な、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、及び配列番号５０で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC１、C２、C３、C４、C５、C６、C７、C８、Ｃ９、及びC１０を合成し、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した。
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
C１：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号４１）
C２：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’ （配列番号４２）
C３：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’ （配列番号４３）
C４：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’ （配列番号４４）
C５：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’ （配列番号４５）
C６：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’ （配列番号４６）
C７：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’ （配列番号４７）
C８：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’ （配列番号４８）
C９：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’ （配列番号４９）
C１０：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’ （配列番号５０）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約３０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図１０に示した。溶液Ａ、溶液Ｂ、及び溶液Ｃでは、溶液Ｄに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例１１
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号２７及び配列番号２８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（S、配列番号２９、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号２７）
ＰＲ３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２８）
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
ＤＮＡフラグメントＳについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
また、得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３２及び配列番号３３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号３４、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号３２）
ＰＲ４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号３３）
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号３４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
ＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
前記に調製したＤＮＡフラグメントＳの溶液ＡとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ａを、ＤＮＡフラグメントＳの溶液ＢとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ｂを、ＤＮＡフラグメントＳの溶液ＣとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ｃを、夫々混合し、以下に示すＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＣを夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＢ：1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＣ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号３０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＳ’に相補性により結合可能な配列番号３１で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｓ’：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３０）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３１）
また、配列番号３０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＳ’の負鎖に対して相補性により結合可能な、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、及び配列番号５０で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC１、C２、C３、C４、C５、C６、C７、C８、Ｃ９、及びC１０を合成し、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した。
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
C１：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号４１）
C２：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’ （配列番号４２）
C３：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’ （配列番号４３）
C４：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’ （配列番号４４）
C５：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’ （配列番号４５）
C６：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’ （配列番号４６）
C７：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’ （配列番号４７）
C８：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’ （配列番号４８）
C９：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’ （配列番号４９）
C１０：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’ （配列番号５０）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約６０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図１１に示した。溶液ＭＡ、及び溶液ＭＢでは、溶液ＭＣに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例１２
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号２７及び配列番号２８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（S、配列番号２９、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号２７）
ＰＲ３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２８）
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
ＤＮＡフラグメントＳについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
また、得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３２及び配列番号３３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号３４、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号３２）
ＰＲ４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号３３）
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号３４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
ＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
前記に調製したＤＮＡフラグメントＳの溶液ＡとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ａを、ＤＮＡフラグメントＳの溶液ＢとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ｂを、ＤＮＡフラグメントＳの溶液ＣとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ｃを、夫々混合し、以下に示すＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＣを夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＢ：1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＣ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号３５で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＴ’に相補性により結合可能な配列番号３６で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ４を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｔ’：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号３５）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’ （配列番号３６）
また、配列番号３５で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＴ’の負鎖に対して相補性により結合可能な、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC１１、C１２、C１３、及びC１４を合成し、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した。
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
C１１：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号５１）
C１２：5’- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’ （配列番号５２）
C１３：5’- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’ （配列番号５３）
C１４：5’- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3’ （配列番号５４）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約６０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図１２に示した。溶液ＭＡ、及び溶液ＭＢでは、溶液ＭＣに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例１３
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号２７及び配列番号２８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（S、配列番号２９、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号２７）
ＰＲ３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号２８）
＜DNAフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号２９）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。
ＤＮＡフラグメントＳについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
また、得られた酵母ゲノムＤＮＡから、以下の配列番号３２及び配列番号３３で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号３４、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号３２）
ＰＲ４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号３３）
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号３４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
ＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
前記に調製したＤＮＡフラグメントＳの溶液ＡとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ａを、ＤＮＡフラグメントＳの溶液ＢとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ｂを、ＤＮＡフラグメントＳの溶液ＣとＤＮＡフラグメントＴの溶液Ｃを、夫々混合し、以下に示すＤＮＡフラグメント混合溶液ＭＡ〜ＭＣを夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＢ：1ng/20μL ＴＥバッファー溶液
溶液ＭＣ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
得られた夫々の溶液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
配列番号３０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＳ’に相補性により結合可能な配列番号３１で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を合成し、また、配列番号３５で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＴ’に相補性により結合可能な配列番号３６で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ４を合成し、夫々の濃度が0.02 μＭであるＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｓ’：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３０）
Ｔ’：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号３５）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号３１）
Ｆ４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3’ （配列番号３６）
また、配列番号３０で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＳ’の負鎖に対して相補性により結合可能な、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、及び配列番号５０で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC１、C２、C３、C４、C５、C６、C７、C８、Ｃ９、及びC１０を合成し、また、配列番号３５で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＴ’の負鎖に対して相補性により結合可能な、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC１１、C１２、C１３、及びC１４を合成し、夫々の濃度が０．０１μMであるＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｓ’：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号３０）
Ｔ’：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号３５）
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
C１：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号４１）
C２：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’ （配列番号４２）
C３：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’ （配列番号４３）
C４：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’ （配列番号４４）
C５：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’ （配列番号４５）
C６：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’ （配列番号４６）
C７：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’ （配列番号４７）
C８：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’ （配列番号４８）
C９：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’ （配列番号４９）
C１０：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’ （配列番号５０）
C１１：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号５１）
C１２：5’- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’ （配列番号５２）
C１３：5’- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’ （配列番号５３）
C１４：5’- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3’ （配列番号５４）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約６０分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図１３に示した。溶液ＭＡ、及び溶液ＭＢでは、溶液ＭＣに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はＤＮＡフラグメントの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例１４
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：100ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：10ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：1ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
上記の調製した夫々の溶液を５μＬと、制限酵素ＸｓｐＩを１０Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）２μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
得られた夫々の反応液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
ヒトトランスポゾンとして知られるLINE1領域に設計された配列番号３７で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドZ（Genbank Accession No. M80340等に示される塩基番号115-386に相当する領域）と相補性により結合可能な配列番号３８で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ５を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｚ：5’- TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC -3’（配列番号３７）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ５：5’- ATAGTCTCGTGGTGCGCCGT -3’ （配列番号３８）
また、配列番号３９で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＷの負鎖と相補性により結合可能な配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、及び配列番号５９で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１５、C１６、C１７、C１８、及びＣ１９を合成し、夫々の濃度が0.0１ μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Z：5’- TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC-3’（配列番号３７）
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１５：5’- CAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGA -3’ （配列番号５５）
Ｃ１６：5’- GGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCA-3’ （配列番号５６）
Ｃ１７：5’- GGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCA -3’ （配列番号５７）
Ｃ１８：5’- ACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3’ （配列番号５８）
Ｃ１９：5’- TCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGC -3’ （配列番号５９）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約９分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図１４に示した。溶液Ａ、溶液Ｂ、及び溶液Ｃでは、溶液Ｄに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はゲノムＤＮＡの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなり、ゲノムＤＮＡの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例１５
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液として冷蔵保存した。
合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：100ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｂ：10ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｃ：1ng/5μL ＴＥバッファー溶液
溶液Ｄ：ＴＥバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
上記の調製した夫々の溶液を５μＬと、制限酵素ＭｓｐＩを４Ｕと、ＭｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、500mM NaCl）２μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
得られた夫々の反応液を２０μＬと、SssI methylase (NEB社製)を０．５μｌと、１０ｘNEBuffer2 (NEB社製)を５μlと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製)を０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて３０分間インキュベーションした(以上、本発明方法の第一工程に相当する)。
ヒトトランスポゾンとして知られるＡｌｕ領域に設計された配列番号３９で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＷ（Genbank Accession No. ＡＦ４５８１１０等に示される塩基番号178-262に相当する領域）と相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ６を合成し、0.02 μＭのＴris-HClバッファー（10 mM）溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｗ：5’- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC-3’（配列番号３９）
＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ６：5’- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3’ （配列番号４０）
また、配列番号３９で示される目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチドＷの負鎖と相補性により結合可能な配列番号６０及び配列番号６１で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ２０及びＣ２１を合成し、夫々の濃度が0.0１ μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
＜目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド＞
Ｗ：5’- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC-3’（配列番号３９）
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ２０：5’- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCA -3’ （配列番号６０）
Ｃ２１：5’- TTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAG -3’ （配列番号６１）
得られた夫々の反応液について、以下の処理を施した。
ＰＣＲチューブに、前記で調製した反応液４０μLと、前記の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記のカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を１０μＬと、１００ｍM MgCl2溶液１０μLと、1 mg/mL BSA溶液１０μLを添加し、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、更に３７℃で１０分間保温した後、室温に戻し、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとＤＮＡフラグメントとの結合体の形成を促した(以上、本発明方法の第二工程に相当する)。
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明方法の第三工程に相当する）。
その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した。
基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約８分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明方法の第四工程に相当する）
その結果を図１５に示した。溶液Ａ、溶液Ｂ、及び溶液Ｃでは、溶液Ｄに比べて吸光度の増加がみられた。またその強度はゲノムＤＮＡの濃度に依存して増加した。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のＦＩＴＣを、その機能により定量・検出することにより、ＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなり、ゲノムＤＮＡの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例１６
血清サンプルとして、ヒト血液由来ゲノムDNA (Human Genomic DNA、#636401、Clontech社)のTEバッファー溶液とラット (Wistar Hannover) より採取した血清との混合液を以下のとおり夫々4連で調製した。
血清サンプルＡ： 10 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL
血清サンプルＢ： 1 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL
血清サンプルＣ： 0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL
血清サンプルD： 0 ng/10 μL TEバッファー溶液+ラット血清10 μL (ネガティブコントロール液)
上記に調製した血清サンプルA〜Dについて、以下に示す処理1または処理2を夫々2連でおこなった。
処理1：
血清サンプル20 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)4 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を40 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
処理2：
血清サンプル20 μＬと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate (pH 7.9), 100 mM Mg(OAc)2, 5 mM DTT, 660 mM KOAc) 4 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を40 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清を回収した。
上記の処理1または処理2により調製した夫々の溶液を20 μLと、制限酵素MspIを2Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
上記の酵素処理により得られた溶液30 μLと、SssI methylase (NEB社製) を0.5 μLと、10ｘNEBuffer2 (NEB社製) を5 μLと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製) を0.5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μLとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて30分間インキュベーションした。
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号３９で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号３９、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) を取得するために用いる特定オリゴヌクレオチドとして、目的とするDNA領域Zと相補性により結合する配列番号４０で示される塩基配列とからなる5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドF1を合成し、当該合成物を含む0.02 μＭのTris-HClバッファー（10 mM）溶液（末端FITC標識オリゴヌクレオチド溶液）を調製した。
＜目的とするDNA領域＞
Z：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号３９）
＜5’末端FITC標識オリゴヌクレオチド＞
F1：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3' （配列番号４０）
上記で得た反応液50 μLと、5’末端FITC標識オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol) を10 μLと、100 mM MgCl2溶液10 μLと、1 mg/mL BSA溶液10 μLとを添加してなる混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、これを50 ℃まで冷却し10分間保温し、さらに37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、プロトコルに記載された方法に従い、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) 溶液として冷蔵保存した。
前記の熱処理により得られた反応液100 μLに、上記のビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を5倍希釈して (0.05 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) 溶液) 1 μLを添加し、これを1時間室温で放置し、目的とするDNA領域と5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとビオチン標識メチルシトシン抗体とからなる検出複合体を形成させた。
上記で得られた反応液をストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップ (StreptaWell、#11645692001、Roche社) に移し、約60分間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとビオチン標識メチルシトシン抗体とからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
その後、HRP標識FITC抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005 μg/100 μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) 溶液] を各ウェルに100 μLの割合で添加した後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを200 μLの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4)] を添加した後、該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作を更に2回繰り返した。
基質 (R&D社製、#DY999) を、各ウェルに100 μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
約30分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに50 μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後30分以内に450 nmの吸光度を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
その結果を図１６および図１７に示した。処理1では、ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液A (10 ng)、溶液B (1 ng)、および溶液C (0.1 ng) において、溶液D (0 ng：コントロール溶液) に比べて吸光度が濃度依存的に増加した (図１６)。一方、処理2では、ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液A (10 ng) において、溶液D (0 ng：コントロール溶液) に比べて吸光度が増加したが、溶液B (1 ng) および溶液C (0.1 ng) において、吸光度の増加は見られなかった (図１７)。
本実験において、固定化したビオチン標識メチルシトシン抗体と、メチル化されたDNAフラグメントと、5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のFITCを、その機能により定量・検出することにより、血清中ヒトゲノムDNAを感度よく検出・定量することが可能であることが示された。また処理2に比べて処理1では血清中ヒトゲノムDNAが感度よく検出された。
実施例１７
血清サンプルとして、ヒト血液由来ゲノムDNA (Human Genomic DNA、#636401、Clontech社)のTEバッファー溶液とコージンバイオ社より購入したヒト血清 (個体別 Human Serum)との混合液を以下のとおり夫々2連で調製した。
血清サンプルＡ： 4 ng/10 μL TEバッファー溶液+ヒト血清40 μL
血清サンプルＢ： 2 ng/10 μL TEバッファー溶液+ヒト血清40 μL
血清サンプルＣ： 1 ng/10 μL TEバッファー溶液+ヒト血清40 μL
血清サンプルD： 0 ng/10 μL TEバッファー溶液+ヒト血清40 μL (ネガティブコントロール液)
上記に調製した血清サンプルA〜Dについて、以下に示す処理を夫々2連でおこなった。
PCRチューブに血清サンプル50 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)20 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃に冷却した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清20 μLを回収した。
上記の処理により調製した溶液を20 μLと、制限酵素MspIを2Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
上記の酵素処理により得られた溶液30 μLと、SssI methylase (NEB社製) を0.5 μLと、10ｘNEBuffer2 (NEB社製) を5 μLと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製) を0.5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μLとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて30分間インキュベーションした。
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号３９で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号３９、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) と相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列とからなる5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドＦ1を合成し、当該合成物を含む0.02 μＭのTris-HClバッファー（10 mM）溶液（5’末端FITC標識オリゴヌクレオチド溶液）を調製した。
＜目的とするDNA領域＞
Z：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号３９）
＜5’末端FITC標識オリゴヌクレオチド＞
F1：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3' （配列番号４０）
上記で得た反応液50 μLと、5’末端FITC標識オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol) を10 μLと、100 mM MgCl2溶液10 μLと、1 mg/mL BSA溶液10 μLとを添加してなる混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、これを50 ℃まで冷却し10分間保温し、さらに37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、プロトコルに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) 溶液として冷蔵保存した。
前記の熱処理により得られた反応液100 μLに、上記のビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を5倍希釈して (0.05 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) 溶液) 1 μLを添加し、これを1時間室温で放置し、目的とするDNA領域と5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとビオチン標識メチルシトシン抗体とからなる検出複合体を形成させた。
上記で得られた反応液をストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップ (StreptaWell、#11645692001、Roche社) に移し、1時間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとビオチン標識メチルシトシン抗体とからなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
その後、HRP標識FITC抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005 μg/100 μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) 溶液] を各ウェルに100 μLの割合で添加した後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
基質 (R&D社製、#DY999) を、各ウェルに100 μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
20分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに50 μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後30分以内に450 nmの吸光度を測定した。
その結果を図１８に示した。ヒト血液由来ゲノムDNAの溶液A (4 ng)、溶液B (2 ng)、および溶液C (1 ng) において、溶液D (0 ng：コントロール溶液) に比べて吸光度が濃度依存的に増加した。
本実験において、今回発明した手法により抽出されたDNAサンプルを用いて、目的とするDNA領域と5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとビオチン標識メチルシトシン抗体からなる検出複合体を形成し、ビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化することにより選択し、複合体中のFITCを、その機能により検出することにより、ヒト血清中ヒトゲノムDNAの検出・定量が可能であることが明らかとなった。
実施例１８
血清サンプルとして、以下に示すヒト血清を用いた。
コージンバイオ社より購入したヒト血清 (個体別 Human Serum)
Lot No.:
N51438 (健常者)
N51439 (健常者)
N51441 (健常者)
ProMedDx社より購入したヒト血清 (個体別 Human Serum)
Lot No.:
11171268 (健常者、56歳、男性)
11171292 (健常者、62歳、男性)
11171297 (健常者、67歳、男性)
11202510 (健常者、67歳、女性)
11202522 (健常者、64歳、女性)
11202527 (健常者、52歳、女性)
11202615 (健常者、75歳、女性)
11202618 (健常者、78歳、女性)
10958886 (健常者、56歳、男性)
10958979 (健常者、39歳、男性)
10958980 (健常者、45歳、男性)
10960268 (健常者、37歳、男性)
10960272 (健常者、50歳、男性)
10960276 (健常者、30歳、男性)
10960285 (健常者、39歳、男性)
11003457 (健常者、38歳、男性)
11003479 (健常者、51歳、男性)
11003480 (健常者、48歳、男性)
11324997 (健常者、59歳、男性)
11325001 (健常者、61歳、男性)
10325022 (健常者、61歳、男性)
10870623 (乳がん患者、33歳、女性)
10929521 (乳がん患者、55歳、女性)
10989644 (乳がん患者、45歳、女性)
11209430 (乳がん患者、80歳、女性)
10929514 (乳がん患者、57歳、女性)
10843055 (乳がん患者、59歳、女性)
10984680 (乳がん患者、64歳、女性)
10840414 (肺がん患者、54歳、女性)
10929506 (肺がん患者、55歳、男性)
11091955 (肺がん患者、76歳、女性)
11103346 (肺がん患者、66歳、女性)
11142322 (肺がん患者、62歳、女性)
11152564 (肺がん患者、67歳、男性)
11152571 (肺がん患者、67歳、男性)
11153198 (肺がん患者、69歳、女性)
11209435 (肺がん患者、61歳、男性)
11230621 (肺がん患者、71歳、女性)
11153192 (肺がん患者、59歳、男性)
10715942 (肺がん患者、64歳、男性)
10840422 (肺がん患者、78歳、女性)
10935547 (前立腺がん患者、83歳、男性)
11000243 (前立腺がん患者、78歳、男性)
11071226 (前立腺がん患者、84歳、男性)
上記の血清サンプルについて、以下に示す処理を2連でおこなった。
処理1：
PCRチューブに血清サンプル40 μＬと、緩衝液 (500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl)20 μLとの混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、当該混合物を含むPCRチューブを95 ℃で10分間保温し、4 ℃に冷却した後、室温に戻した。次いで、これを9100gで10分間遠心してから上清20 μLを回収した。
上記の処理により調製した溶液を20 μLと、制限酵素MspIを2Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
上記の酵素処理により得られた溶液30 μLと、SssI methylase (NEB社製) を0.5 μLと、10ｘNEBuffer2 (NEB社製) を5 μLと、3.2 mM S-adenosyl methionine (NEB社製) を0.5 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μLとしたものを調製した。該反応液を、37℃にて30分間インキュベーションした。
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号３９で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号３９、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) と相補性により結合可能な配列番号４０で示される塩基配列とからなる5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドＦ1を合成し、当該合成物を含む0.02 μＭのTris-HClバッファー（10 mM）溶液（5’末端FITC標識オリゴヌクレオチド溶液）を調製した。
＜目的とするDNA領域＞
Z：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号３９）
＜5’末端FITC標識オリゴヌクレオチド＞
F1：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3' （配列番号４０）
上記で得た反応液50 μLと、5’末端FITC標識オリゴヌクレオチド溶液10 μLと、緩衝液 (330 mM Tris-Acetate pH 7.9、660 mM KOAc、100 mM MgOAc2、5 mM Dithiothreitol) を10 μLと、100 mM MgCl2溶液10 μLと、1 mg/mL BSA溶液10 μLとを添加してなる混合物に滅菌超純水を加えて液量を100 μLとし、混合した。その後、目的とするDNA領域と5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、当該混合物を95 ℃で10分間保温し、70 ℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、これを50 ℃まで冷却し10分間保温し、さらに37 ℃で10分間保温した後、室温に戻した。
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、プロトコルに記載された方法に従って、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) 溶液として冷蔵保存した。
前記の熱処理により得られた反応液100 μLに、上記のビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を5倍希釈して (0.05 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) 溶液) 1 μLを添加し、これを1時間室温で放置し、目的とするDNA領域と5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとビオチン標識メチルシトシン抗体とからなる検出複合体を形成させた。
上記で得られた反応液をストレプトアビジン被覆済み8ウェルストリップ (StreptaWell、#11645692001、Roche社) に移し、1時間、室温で放置し、8ウェルストリップに目的とするDNA領域と5’末端FITC標識オリゴヌクレオチドとビオチン標識メチルシトシン抗体からなる検出複合体をビオチン-ストレプトアビジン結合を介して固定化した。その後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
その後、HRP標識FITC抗体溶液 [Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005 μg/100 μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー (1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4) 溶液] を各ウェルに100 μLの割合で添加した後、１時間室温で放置した。放置後、溶液をピペッティングにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05％Tween20含有リン酸バッファー（1 mM KH2PO4、3 mM Na2HPO4・7H2O、154 mM NaCl pH 7.4）]200 μLで3回洗浄した。
基質 (R&D社製、#DY999) を、各ウェルに100 μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。
25分間室温で放置し、ストップ溶液 (2N H2SO4水溶液)を各ウェルに50 μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後30分以内に450 nmの吸光度を測定し、得られた測定値について2連の平均値を算出した。
一方、上記の酵素処理（MspI処理）により得られた溶液中のDNAをリアルタイムPCRにより定量した。
濃度測定用スタンダードサンプルとしてMspI処理ヒトゲノムDNA溶液を以下のとおり調製した。ヒト血液由来ゲノムDNA (Human Genomic DNA、#636401、Clontech社)のTEバッファー溶液の5 ng/μL TEバッファー溶液を調製し、この溶液を20 μLと、制限酵素MspIを２Uと、MspIに最適な10ｘ緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM MgCl2、10 mM Dithiothreitol、500 mM NaCl) 5 μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50 μＬとしたものを夫々の処理について調製した。当該反応液を、37 ℃にて1時間インキュベーションした。得られた反応液について、TEバッファーによる希釈により、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10 ng/5 μL溶液を調製した。
ヒトトランスポゾンとして知られるAlu領域に設計された、配列番号３９で示された塩基配列からなる目的とするDNA領域 (Z、配列番号３９、Genbank Accession No. AF458110に示される塩基番号178-262に相当する領域) を増幅してリアルタイムPCRで定量するために配列番号６２で示される塩基配列からなるフォワードプライマー (F) および配列番号６３で示される塩基配列からなるリバースプライマー (R) を設計した。。
＜目的とするDNA領域＞
Ｚ：5'- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCC -3'（配列番号３９）
＜フォワードプライマー＞
F：5'- GGTGGCTCACGCCTGTAATC -3' （配列番号６２）
＜リバースプライマー＞
R：5'- GGATGGTCTCGATCTCCTGAC -3' （配列番号６３）
PCRの反応液としては、鋳型とする上記に調製したMspI処理ヒトゲノムDNA溶液5 μLまたは上記に調製した濃度測定用スタンダードサンプルと、配列番号６２および配列番号６３で示される塩基配列からなるプライマーの5 μＭ溶液をそれぞれ1.5 μＬと、SYBR（登録商標） Green I (Lonza社) を0.1x分と、each 2 mM dNTPを2.5 μLと、10xPCR緩衝液 (100 mM Tris-HCl pH 8.3、500 mM KCl、15 mM MgCl2、0.01％ Gelatin) を2.5 μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ (AmpliTaq Gold, 5 U/μＬ, ABI社)を0.125 μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25 μLとしたものを用いた。リアルタイムPCRは、Mx3005P (Stratagene社)を用いて実施した。当該反応液を、95 ℃にて10分間保温した後、95 ℃にて30秒間、61 ℃にて30秒間、72 ℃にて45秒間を１サイクルとして40サイクル繰り返すことにより、目的とするDNA領域を増幅した。当該リアルタイムPCRの結果により、血清サンプル中のDNAを定量した。
その結果を図１９および図２０に示した。本手法による測定値と、リアルタイムPCRにより定量した値とを比較したところ、相関があることが示された（相関係数：R = 0.62）(図１９)。また、57歳以下のヒト血清サンプルについて定量した結果を、癌患者と健常者で比較したところ、健常者と比較して癌患者では血清中DNA濃度が上昇していることが示された(図２０)。
本実験において、メチルシトシン抗体と、メチル化されたDNAフラグメントと、5’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・選択し、複合体中のメチルシトシン抗体を、その機能により検出することにより、ヒト血清中遊離DNAを感度よく検出・定量することが可能であることが示された。また、57歳以下の癌患者と健常者で血清中DNA濃度が異なり、さらに本手法により簡便にその差を検出できることが示された。
本発明により、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供することが可能となる。また、被験者由来の検体（好ましくは血清）を用いて、当該検体での結果と健常者由来の検体での結果との比較に基づき癌患者由来の検体を選抜する方法等を提供することが可能となる。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１７
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２０
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号２１
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号２２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２５
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号２６
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号２７
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号３０
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号３１
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号３２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号３５
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号３６
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号３７
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号３８
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号３９
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号４０
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号４１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６３
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー

Claims (17)

  1. 検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
    （１）目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する第一工程、
    （２）第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する第二工程、
    （３）第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得し、該一本鎖メチル化ＤＮＡに検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検ＤＮＡ複合体を取得する第三工程、
    （４）第三工程で取得した被検ＤＮＡ複合体に固定化メチル化ＤＮＡ抗体を結合させて検出複合体を取得する第四工程、
    （５）第四工程で得られた検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により定量又は検出することにより、前記一本鎖ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第五工程、
    を有することを特徴とする方法。
  2. 第三工程で被検ＤＮＡ複合体を取得する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１に記載の方法。
  3. 固定化メチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である請求項１又は２に記載の方法。
  4. ＤＮＡメチル化酵素がシトシンメチル化酵素又はＳｓｓ Ｉメチラーゼである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ＲＮＡから逆転写酵素により生成されたＤＮＡにおける目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 検体が、下記のいずれかの生物由来検体である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
    （ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
    （ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
    （ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
    （ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ
    （ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
  7. 第一工程で取得した前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、又は予め精製されてなるＤＮＡである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 検出オリゴヌクレオチドの識別機能が、下記のいずれかの識別機能である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
    （ａ）ＦＩＴＣの蛍光検出
    （ｂ）ＦＩＴＣ抗体による検出
  9. 検出オリゴヌクレオチドが、ヒトゲノム中の反復配列、重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列若しくはその一部と相補的に結合し得る塩基配列からなる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. ヒトゲノム中の反復配列がLINE又はSINEである請求項９に記載の方法。
  11. 検出オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列と相補的に結合し得る塩基配列からなる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
    （１）配列番号３７で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （２）配列番号３７で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （３）配列番号３９で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （４）配列番号３９で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
  12. 検出オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列からなる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
    （１）配列番号３８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （２）配列番号３８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （３）配列番号４０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    （４）配列番号４０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
  13. 第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 癌患者由来の検体を選抜する方法であり、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
  16. 検体が、哺乳動物由来の血清である請求項１５に記載の方法。
  17. 目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
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