JP2010091809A - 顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】落射蛍光観察、共焦点観察、全反射蛍光観察が可能で、大型化や高コスト化を抑えた顕微鏡装置。
【解決手段】対物レンズ８を介して標本５上に集光される第１光源からの照明光で標本５上を走査する走査手段３２と、標本５からの観察光を対物レンズ８及び走査手段３２を介して受光する受光手段３８とを有する共焦点観察装置２５と、第２光源の光を共焦点観察装置２５の光路へ導入する導入部材Ｕ１を有し第２光源の光を対物レンズ８を介して標本５へ照射する落射照明装置２６と、共焦点観察装置２５又は落射照明装置２６の光で励起された標本５の蛍光を検出する蛍光検出光学系１０，１７，１８，２７とを有し、第１光源の光源像を対物レンズ８の瞳面Ｐ上に形成する結像位置変換部材Ｕ２と、導入部材Ｕ１と結像位置変換部材Ｕ２を共焦点観察装置２５の光路中の略同位置へ切り替えて挿入する挿脱機構とを備える。
【選択図】図２

Description

本発明は、顕微鏡装置に関する。

従来、共焦点顕微鏡、全反射蛍光顕微鏡、及び落射蛍光顕微鏡は、いずれも生体細胞等の標本を観察するための装置として広く使用されており、近年では共焦点観察と全反射蛍光観察を切り替えて実施可能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。
特開２００５−１２１７９６号公報

しかしながら上述のような従来の顕微鏡において、共焦点観察と全反射蛍光観察との切り替えは、照明光を対物レンズの瞳面の全反射条件領域に集光させるための光学部材を照明光学系中に挿脱することによって行われる。したがって従来の顕微鏡は、これを実現する大掛かりな切り替え機構が必要となるため、大型化や高コスト化を招いてしまうという問題があった。

そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、落射蛍光観察、共焦点観察、及び全反射蛍光観察を行うことが可能で、大型化や高コスト化を抑えた顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために本発明は、
対物レンズを介して標本上に集光される第１光源からの照明光で前記標本上を走査する走査手段と、前記標本からの観察光を前記対物レンズ及び前記走査手段を介して受光する受光手段とを有する共焦点観察装置と、
第２光源からの照明光を前記共焦点観察装置の光路へ導入する導入部材を有し、前記第２光源からの照明光を前記対物レンズを介して前記標本へ照射する落射照明装置と、
前記共焦点観察装置又は前記落射照明装置の前記照明光によって励起された前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、を有しており、
前記第１光源の光源像を前記対物レンズの瞳面上に形成するための結像位置変換部材と、
前記導入部材と前記結像位置変換部材を前記共焦点観察装置の光路中の略同位置へ切り替えて挿入するための挿脱機構と、をさらに備えていることを特徴とする顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、落射蛍光観察、共焦点観察、及び全反射蛍光観察を行うことが可能で、大型化や高コスト化を抑えた顕微鏡装置を提供することができる。

以下、本発明の実施形態に係る顕微鏡装置を添付図面に基づいて詳細に説明する。
図１は本発明の実施形態に係る顕微鏡装置の概略を示す図であり、図２は本発明の実施形態に係る顕微鏡装置の光学系を示す図である。
図１に示すように本実施形態に係る顕微鏡装置１は、倒立型の顕微鏡本体２と、制御装置３とから構成されている。

顕微鏡本体２は、上方から順に、後述する透過照明光源４からの光を標本５へ導く透過照明光学系６、標本５を載置するステージ７、倍率の異なる複数の対物レンズ８を回転切り替え可能に備えたレボルバ９、蛍光キューブホルダ１０、結像光学系１１、及び接眼鏡筒１２を備えている。
蛍光キューブホルダ１０は、公知の回転機構によって２つの蛍光キューブ１５，１６を回転切り替え可能に備えた保持部材であって、蛍光キューブ１５はダイクロイックミラー１５ａと、その透過光路上に配置されたエミッションフィルタ１５ｂとからなる。蛍光キューブ１６はダイクロイックミラー１６ａと、その透過光路上に配置されたエミッションフィルタ１６ｂと、入射光路上に配置された波長選択フィルタ１６ｃとからなる。
結像光学系１１は、図２に示すように蛍光キューブホルダ１０側から順に、結像レンズ１７、公知のスライド機構によって光路内へ挿脱可能なプリズム１８、ミラー１９ａ、リレーレンズ２０ａ、ミラー１９ｂ、及びリレーレンズ２０ｂからなる。
接眼鏡筒１２は、レンズ２１、ミラー２２、及び不図示の接眼レンズからなる。

顕微鏡本体２の外部には、図１に示すように標本５を透過照明するための透過照明光源４が上方に備えられており、側方には標本５を共焦点観察するための共焦点観察装置２５、標本５を落射照明するための落射照明装置２６、及び撮像素子２７が備えられている。なお、図２において透過照明光源４及び透過照明光学系６は図示を省略している。
共焦点観察装置２５は、図２に示すように蛍光キューブホルダ１０側から順に、結像レンズ２９、交換ユニットホルダ３０、瞳リレーレンズ３１、光を二次元的に走査する二次元スキャナ３２、ビームスプリッタ３３、コレクタレンズ３４、光ファイバ３５、及び不図示のレーザ光源、そしてビームスプリッタ３３の反射光路上に配置された結像レンズ３６、ピンホール３７、及び受光素子（ＰＭＴ）３８からなる。
交換ユニットホルダ３０は、公知のスライド機構によって２つの交換ユニットＵ１，Ｕ２を光路中の略同位置へ切り替えて挿入可能に保持する保持部材である。交換ユニットＵ１はダイクロイックミラー３９からなり、交換ユニットＵ２は後述する補正レンズ４０からなる。

落射照明装置２６は、図２に示すように交換ユニットホルダ３０側から順に、視野絞り４２、コレクタレンズ４３、光ファイバ４４、及び不図示の落射照明光源からなり、交換ユニットホルダ３０及び結像レンズ２９は共焦点観察装置２５と共用している。なお、本実施形態において落射照明光源にはレーザ光源が用いられているが、これに限られず高圧水銀ランプやキセノンランプ等を使用することもできる。
制御装置３は、顕微鏡本体２に搭載された各種装置を制御するパーソナルコンピュータ４５、及びモニタ４６等からなる。

斯かる構成の本実施形態に係る顕微鏡装置１では、以下に述べるように標本５を透過照明して透過光を観察する透過照明観察、標本５を落射照明して蛍光を観察する落射蛍光観察、照明光を二次元的に走査して標本５に照射し蛍光を観察する走査型蛍光観察、照明光を二次元的に走査して標本５に照射し反射光を観察する共焦点観察、及び標本５を全反射照明して蛍光を観察する全反射蛍光観察を適宜切り換えて実施することができる。
図３（ａ）、図３（ｂ）、及び図３（ｃ）は、本実施形態に係る顕微鏡装置１で標本５の落射蛍光観察を行う場合、走査型蛍光観察と共焦点観察を行う場合、及び全反射蛍光観察を行う場合の光学系の要部と照明光の振る舞いを示す図である。

本実施形態に係る顕微鏡装置１によって標本５の透過照明観察を行う際には、予め、蛍光キューブホルダ１０の２つの蛍光キューブ１５，１６、及びプリズム１８を光路外へ退避させる。
この前提の下、透過照明光源４からの照明光は透過照明光学系６を介してステージ７上の標本５に照射され、標本５を透過した透過光（観察光）はレボルバ９に搭載されている対物レンズ８によって集光される。この観察光は、結像光学系１１の結像レンズ１７とミラー１９ａを介して一次像面Ｑに結像された後、リレーレンズ２０ａ、ミラー１９ｂ、リレーレンズ２０ｂを順に経て接眼鏡筒１２へ入射する。接眼鏡筒１２へ入射した観察光は、レンズ２１、ミラー２２を介して不図示の接眼レンズへ導かれる。これにより観察者は、不図示の接眼レンズを覗いて標本５の透過像を観察することが可能となり、即ち標本５の透過照明観察を行うことが可能となる。

本実施形態に係る顕微鏡装置１によって標本５の落射蛍光観察を行う際には、予め、蛍光キューブホルダ１０の蛍光キューブ１６、プリズム１８、及び交換ユニットホルダ３０の交換ユニットＵ１を光路内へ配置する。
この前提の下、不図示の落射照明光源からのレーザ光は、図３（ａ）に示すように光ファイバ４４で導かれその端面より射出された後、コレクタレンズ４３を介して略平行なレーザ光となり、視野絞り４２を経て交換ユニットＵ１のダイクロイックミラー３９で反射される。そしてこの略平行なレーザ光は、結像レンズ２９で集光され、蛍光キューブ１６の波長選択フィルタ１６ｃを透過しダイクロイックミラー１６ａで反射されることで所定の励起波長の光が選択された後、対物レンズ８を介してステージ７上の標本５に照射される。

これによって標本５で発現した蛍光は、対物レンズ８で集光され、蛍光キューブ１６のダイクロイックミラー１６ａとエミッションフィルタ１６ｂを透過することで不要波長の光がカットされる。そしてこの蛍光は、結像光学系１１の結像レンズ１７を経てプリズム１８で反射され、撮像素子２７の撮像面上に結像される。これにより撮像素子２７では標本５の蛍光像が撮像され、これをＰＣ４５が画像処理してモニタ４６に表示させる。このようにして観察者は、本顕微鏡装置１によって標本５の落射蛍光観察を行うことが可能となる。

本実施形態に係る顕微鏡装置１によって標本５の走査型蛍光観察を行う際には、予め、蛍光キューブホルダ１０の蛍光キューブ１５、プリズム１８を光路内へ配置し、交換ユニットホルダ３０の２つの交換ユニットＵ１，Ｕ２を光路外へ退避させる。
この前提の下、不図示のレーザ光源からのレーザ光は、光ファイバ３５で導かれその端面より射出された後、コレクタレンズ３４を介して略平行なレーザ光となってビームスプリッタ３３を透過する。ビームスプリッタ３３を透過したレーザ光は、二次元スキャナ３２で反射され、図３（ｂ）に示すように瞳リレーレンズ３１によって像面Ｒに結像された後、交換ユニットホルダ３０を通過し、結像レンズ２９を介して再び略平行なレーザ光となる。この略平行なレーザ光は、蛍光キューブ１５のダイクロイックミラー１５ａで反射されることで所定の波長の光が選択された後、対物レンズ８で集光されてステージ７上の標本５に照射される。なおこのレーザ光は、二次元スキャナ３２で二次元的に走査されるため、標本５の観察領域全体にわたって照射されることとなる。これにより標本５は、レーザ光によって励起されて蛍光を発現するとともに、レーザ光を反射することとなる。

標本５で発現された蛍光は、対物レンズ８で集光され、蛍光キューブ１５のダイクロイックミラー１５ａとエミッションフィルタ１５ｂを透過することで不要波長の光がカットされる。そしてこの蛍光は、結像光学系１１の結像レンズ１７を経てプリズム１８で反射され、撮像素子２７の撮像面上に結像される。これにより撮像素子２７では標本５の蛍光像が撮像され、これをＰＣ４５が画像処理してモニタ４６に表示させる。このようにして観察者は、本顕微鏡装置１によって標本５の走査型蛍光観察を行うことが可能となる。

一方、標本５で反射されたレーザ光は、対物レンズ８で集光され、蛍光キューブ１５のダイクロイックミラー１５ａで反射される。そしてこのレーザ光は、結像レンズ２９と瞳リレーレンズ３１を経て、二次元スキャナ３２とビームスプリッタ３３で順に反射された後、ピンホール３７を通過して受光素子３８へ達する。なお、この受光素子３８へ達する光は二次元スキャナ３２によってデスキャンされるため、受光素子３８では標本５の観察領域全体にわたる観察光が検出されることとなる。そしてこれによりＰＣ４５は、受光素子３８で得られたレーザ光の強度信号に基づき標本５の二次元画像を生成してモニタ４６に表示させる。このようにして観察者は、本顕微鏡装置１によって標本５の共焦点観察を行うことが可能となる。
なお、本実施形態に係る顕微鏡装置１では、撮像素子２７から得られた蛍光画像と、受光素子３８から得られた共焦点画像とをモニタ４６に重ねて表示して観察することもできる。

本実施形態に係る顕微鏡装置１によって標本５の全反射蛍光観察を行う際には、予め、蛍光キューブホルダ１０の蛍光キューブ１５、プリズム１８、及び交換ユニットホルダ３０の交換ユニットＵ２を光路内へ配置する。
本実施形態における交換ユニットホルダ３０の交換ユニットＵ２は、図３（ｃ）に示すように両凸形状の正レンズのみからなる補正レンズ４０を備えている。補正レンズ４０は交換ユニットＵ２内において、交換ユニットＵ２が光路内へ配置された際に、共焦点観察装置２５の不図示のレーザ光源の光源像位置（像面Ｒ）から補正レンズ４０の前側主点Ｓまでの距離Ｌが補正レンズ４０の焦点距離ｆと略等しくなる位置に配置されている。斯かる配置により補正レンズ４０は、像面Ｒ上の一点より射出された光を略平行光束に変換することが可能となる。

上記前提の下、不図示のレーザ光源からのレーザ光は、光ファイバ３５で導かれその端面より射出された後、コレクタレンズ３４によって略平行なレーザ光に変換された後、ビームスプリッタ３３を透過して二次元スキャナ３２で反射される。なお、このとき二次元スキャナ３２の反射角度は、反射光が後述する対物レンズ８の瞳面Ｐ内の全反射条件領域へ入射するようにＰＣ４５によって制御されている。そして、二次元スキャナ３２で反射されたレーザ光は、図３（ｃ）に示すように瞳リレーレンズ３１によって像面Ｒに結像された後、交換ユニットＵ２の補正レンズ４０によって略平行なレーザ光に変換される。この略平行なレーザ光は、結像レンズ２９によって集光作用を受け、蛍光キューブ１５のダイクロイックミラー１５ａで反射されることで所定の波長の光が選択された後、対物レンズ８の瞳面Ｐ上の全反射条件領域の一点に集光される。なお、全反射条件領域とは、対物レンズ８の瞳面Ｐに光を入射させた際に、この光を標本５に対して全反射角で入射させることが可能な瞳面Ｐ上の輪帯形の範囲をいう。

対物レンズ８の瞳面Ｐ上の全反射条件領域に集光されたレーザ光は、対物レンズ８を介して標本５へ全反射角で入射する、詳しくは標本５の媒質と標本５を保持する不図示のガラス基板との境界面において全反射される入射角度でもって標本５へ入射する。このように本顕微鏡装置１では、上述した走査型蛍光観察及び共焦点観察の際には像面Ｒと標本面とが共役であるのに対し、交換ユニットＵ２を照明光路中に配置することで像面Ｒと対物レンズ８の瞳面Ｐとが共役となり、また前述のように二次元スキャナ３２によって瞳面Ｐの全反射条件領域へレーザ光を導くことで標本５の全反射照明を実現することができる。

前述のようにして標本５が全反射照明されると、前記境界面においてエバネッセント光が発生し、このエバネッセント光によって標本５の境界面近傍部分が励起され蛍光が発現する。この蛍光は、対物レンズ８で集光され、蛍光キューブ１５のダイクロイックミラー１５ａとエミッションフィルタ１５ｂを透過することで不要波長の光がカットされる。そしてこの蛍光は、結像光学系１１の結像レンズ１７を経てプリズム１８で反射され、撮像素子２７の撮像面上に結像される。これにより撮像素子２７では標本５の蛍光像が撮像され、これをＰＣ４５が画像処理してモニタ４６に表示させる。このようにして観察者は、本顕微鏡装置１によって標本５の全反射蛍光観察を行うことが可能となる。

以上のように本顕微鏡装置１では、標本５の透過照明観察、落射蛍光観察、走査型蛍光観察、共焦点観察、及び全反射蛍光観察を適宜切り替えて実施することができる。
そして本顕微鏡装置１は、落射蛍光観察と共焦点観察とを切り替えるための交換ユニットＵ１と、共焦点観察と全反射蛍光観察とを切り替えるための交換ユニットＵ２とを交換ユニットホルダ３０で交換可能に備える、即ち２つの単純な構成の交換ユニットＵ１，Ｕ２を光路中の同位置（落射照明装置２６の光路が共焦点観察装置２５の光路に合流する位置）において交換するという簡単な構成であるため、従来の顕微鏡のような大掛かりな切り替え機構が不要となり、顕微鏡本体２の大型化及び高コスト化を抑えることができる。

なお、本実施形態において２つの交換ユニットＵ１，Ｕ２は、上述のように交換ユニットホルダ３０で切り替え可能に保持されている。しかしながらこの構成に限られず、交換ユニットホルダ３０に代えてスロットを形成しておき、別途単品で用意した交換ユニットＵ１，Ｕ２を観察者が適宜選んで当該スロットへ挿脱する構成としてもよい。これにより、顕微鏡本体２の大型化及び高コスト化をより効果的に抑えることが可能となる。
また、本実施形態における交換ユニットＵ２の補正レンズ４０は、上記構成に限られるものでなく、例えば二次元スキャナ３２側から順に、両凸形状の正レンズと両凹形状の負レンズとの接合正レンズで構成したり、両凸形状の正レンズと両凹形状の負レンズとからなる正の屈折力を有するレンズ群で構成してもよい。

また、本実施形態において交換ユニットホルダ３０の設置場所は、スペースの自由度が高く、二次元スキャナ３２に近い位置であるため、交換ユニットＵ２の補正レンズ４０の位置調整に適している。そこで、本実施形態における交換ユニットＵ２の補正レンズ４０は、光軸方向位置を調整するための公知の移動機構（不図示）を備えている。これにより、対物レンズ８をレボルバ９を回転させて倍率の異なる対物レンズに切り替えて全反射蛍光観察を行う場合には、前記移動機構によって補正レンズ４０の位置を調整することで、切り替えた対物レンズの瞳面にレーザ光を集光させ、また二次元スキャナ３２の反射角度を変更して当該瞳面の全反射条件領域へレーザ光を導く。これにより、対物レンズ８を切り替えた場合でも標本５の全反射照明を実現することができる。
また、本顕微鏡装置１で全反射蛍光観察を行う際には、対物レンズ８の瞳面Ｐに集光させたレーザ光を、二次元スキャナ３２によって輪帯形の全反射条件領域で走査させる構成とすることもでき、これによってより良好な全反射照明を実現することができる。

また、本顕微鏡装置１で走査型蛍光観察、共焦点観察、又は全反射蛍光観察を行う際には、共焦点観察装置２５における不図示のレーザ光源において使用波長を選択してレーザ光が射出されるため、使用する蛍光キューブ１５には波長選択フィルタが不要である。しかしながらこれに限られず、波長選択フィルタを備えた蛍光キューブを用いることも勿論可能である。この場合、共焦点観察装置２５を構成する各光学素子で発生する自家蛍光を除去することが可能となるため、フレアやゴーストの発生を防止することが可能となる。
以上、本実施形態によれば、落射蛍光観察、共焦点観察、及び全反射蛍光観察を行うことが可能で、大型化や高コスト化を抑えた顕微鏡装置を実現することができる。

本発明の実施形態に係る顕微鏡装置の概略を示す図である。 本発明の実施形態に係る顕微鏡装置の光学系を示す図であり、透過照明光源及び透過照明光学系は省略している。 （ａ）、（ｂ）、（ｃ）はそれぞれ、本発明の実施形態に係る顕微鏡装置で標本の落射蛍光観察を行う場合、走査型蛍光観察と共焦点観察を行う場合、及び全反射蛍光観察を行う場合の光学系の要部と照明光の振る舞いを示す図である。

符号の説明

１ 顕微鏡装置
２ 顕微鏡本体
３ 制御装置
４ 透過照明光源
５ 標本
８ 対物レンズ
１０ 蛍光キューブホルダ
１２ 接眼鏡筒
１５，１６ 蛍光キューブ
１８ プリズム
２５ 共焦点観察装置
２６ 落射照明装置
３０ 交換ユニットホルダ
３２ 二次元スキャナ
４０ 補正レンズ
Ｐ 対物レンズ８の瞳面
Ｒ 像面（光源像）
Ｕ１，Ｕ２ 交換ユニット

Claims (4)

1. 対物レンズを介して標本上に集光される第１光源からの照明光で前記標本上を走査する走査手段と、前記標本からの観察光を前記対物レンズ及び前記走査手段を介して受光する受光手段とを有する共焦点観察装置と、
   第２光源からの照明光を前記共焦点観察装置の光路へ導入する導入部材を有し、前記第２光源からの照明光を前記対物レンズを介して前記標本へ照射する落射照明装置と、
   前記共焦点観察装置又は前記落射照明装置の前記照明光によって励起された前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、を有しており、
   前記第１光源の光源像を前記対物レンズの瞳面上に形成するための結像位置変換部材と、
   前記導入部材と前記結像位置変換部材を前記共焦点観察装置の光路中の略同位置へ切り替えて挿入するための挿脱機構と、をさらに備えていることを特徴とする顕微鏡装置。
2. 前記結像位置変換部材は、少なくとも１つのレンズからなり、全体として正の屈折力を有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記第１光源の前記光源像の位置から前記結像位置変換部材の前側主点の位置まで距離が、前記結像位置変換部材の焦点距離と略等しいことを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記挿脱機構は、前記導入部材と前記結像位置変換部材を、前記共焦点観察装置の光路中の略同位置へ切り替えて挿入可能に保持する保持部材からなることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。

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