JP2010059081A - Anti-hcv agent containing oncostatin m and its utilization - Google Patents
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Abstract
【課題】新たな抗HCV技術であり、特にオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を用いた新技術の提供。
【解決手段】オンコスタチンＭを含有する組成物を抗ＨＣＶ剤とし、さらにオンコスタチンＭとインターフェロン、シクロスポリンＡ、フルバスタチンまたはピタバスタチンとを組み合わせて適用されることを特徴とする抗ＨＣＶ剤。またオンコスタチンＭを含有しているＣ型肝炎に対する治療組成物、およびインターフェロン治療を必要とするＣ型肝炎患者に対して適用されることを特徴とする治療組成物。
【選択図】なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new anti-HCV technology, particularly using oncostatin M (OSM).
An anti-HCV agent is characterized in that a composition containing Oncostatin M is used as an anti-HCV agent, and further, Oncostatin M is applied in combination with interferon, cyclosporin A, fluvastatin or pitavastatin. A therapeutic composition for hepatitis C containing oncostatin M, and a therapeutic composition characterized by being applied to a hepatitis C patient in need of interferon therapy.
[Selection figure] None
Description
本発明は、新規な抗HCV技術に関するものであり、より詳細には、オンコスタチンＭを含有する抗HCV剤およびその利用に関するものである。 The present invention relates to a novel anti-HCV technology, and more particularly to an anti-HCV agent containing oncostatin M and use thereof.
オンコスタチンＭ（OSM）は、リンパ腫細胞（U-937）が産生する、黒色腫細胞を抑制する抗腫瘍効果を有する液性因子として、1986年にZarlingらによって発見された（非特許文献１参照）。その後、構造が類似している点および受容体複合体にgp130を共通して含む点から、IL-6ファミリーの一員であることが明らかとなった。 Oncostatin M (OSM) was discovered by Zarling et al. In 1986 as a humoral factor having an antitumor effect that suppresses melanoma cells produced by lymphoma cells (U-937) (see Non-Patent Document 1). ). Later, it became clear that it was a member of the IL-6 family due to the similarity in structure and the common inclusion of gp130 in the receptor complex.
IL-6ファミリーのサイトカインとしては、OSM以外に、IL-6、IL-11、IL-27、ciliary neutrophic factor（CNTF）、cardiotrophin-like cytokine（CLC）、cardiotrophin-1（CT-1）、neuropoietin（NP）、Leukemia-inhibitory factor（LIF）が知られている。OSMの受容体はgp130とオンコスタチンＭ受容体（OSMR）とのヘテロダイマーから構成されている。 In addition to OSM, IL-6 family cytokines include IL-6, IL-11, IL-27, ciliary neutrophic factor (CNTF), cardiotrophin-like cytokine (CLC), cardiotrophin-1 (CT-1), neuropoietin (NP), Leukemia-inhibitory factor (LIF) is known. The OSM receptor is composed of a heterodimer of gp130 and oncostatin M receptor (OSMR).
OSMは、多機能なサイトカインとして知られており、抗腫瘍効果以外に、肝細胞の分化誘導、肝再生において重要な役割を果たすことが知られている。特許文献１には、OSMの肝細胞の分化誘導能を利用した、肝細胞（特に成熟肝細胞）の製造方法を開示している。特許文献２には、特許文献１の技術にさらにデキサメサゾン（DEX）を適用することにより、ヒト肝細胞の表現型にさらに近いヒト肝細胞様細胞を製造し、この細胞にＣ型肝炎ウイルス（HCV）を感染させることによるHCV粒子の産生系が開示されている。さらに、OSMおよびDEXで刺激した肝細胞の分化をHCVのコアタンパク質が抑制することも報告されている（非特許文献２参照）。
HCVは非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルスとして１９８９年に発見同定されたフラビウイルス科に属するRNAウイルスである。HCVは持続感染を成立させるウイルスであることから、HCV感染により引き起こされる肝炎（Ｃ型肝炎）は高率に慢性肝炎に移行する。その後、二十数年の経過のなかで肝硬変、そして最終的に肝細胞癌発症に至ることが明らかになっている。 HCV is an RNA virus belonging to the Flaviviridae family that was discovered and identified in 1989 as a causative virus for non-A non-B hepatitis. Since HCV is a virus that establishes persistent infection, hepatitis caused by HCV infection (hepatitis C) shifts to chronic hepatitis at a high rate. Since then, it has been revealed that cirrhosis and eventually hepatocellular carcinoma develop in the course of more than 20 years.
インターフェロン（以下「IFN」と記載する）のみが、Ｃ型慢性肝炎に対して単独で抗ウイルス効果を示す治療薬として知られている。著効率を上げることを目的として、近年になって核酸構造類似体で幅広い抗ウイルス活性を示すことが知られていたリバビリン（単独ではＣ型肝炎には効果がない）とIFN−αとの併用療法（２００１年１２月に保険適用認可）や、IFN−αにポリエチレングリコールを結合させてIFN−αの血中での安定性を高め、かつ腎排泄度を低下させたPEG-IFN−αを用いた療法（２００３年１２月使用認可）が行われるようになっている。しかし、約半数の患者には治癒が望めないことから、IFN療法の限界も明らかになっている。 Only interferon (hereinafter referred to as “IFN”) is known as a therapeutic agent exhibiting an antiviral effect alone against chronic hepatitis C. A combination of IFN-α and ribavirin (independently effective for hepatitis C by itself), which has been known to have a wide range of antiviral activity with nucleic acid structural analogs in recent years for the purpose of significantly increasing the efficiency. PEG-IFN-α, which improves the stability of IFN-α in blood by binding polyethylene glycol to IFN-α and reduces renal excretion. The therapy used (approved for use in December 2003) is being carried out. However, since about half of the patients cannot be cured, the limitations of IFN therapy have become clear.
IFN以外には、スタチン剤のなかでも抗HCV活性の強いフルバスタチン（FLV）の臨床での有用性が国内外から報告されている（非特許文献８および９参照）。しかし、抗HCV剤として提示されている物質は極めて限られている。 In addition to IFN, clinical usefulness of fluvastatin (FLV), which has strong anti-HCV activity among statin drugs, has been reported from inside and outside the country (see Non-Patent Documents 8 and 9). However, the substances presented as anti-HCV agents are very limited.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、新たな抗HCV技術を提供することにあり、特にOSMを用いた新技術を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-described problems, and an object thereof is to provide a new anti-HCV technology, and particularly to provide a new technology using OSM.
HCV感染者の数は日本国内で約２００万人、世界で約２億人と推定されている。最近の社会的問題にもなっているフィブリノゲン製剤によるHCV感染という事態からもわかるように、HCVに感染していることを自覚していないいわゆる無症候性キャリアーも多数存在している。現在、日本国内における肝細胞癌による犠牲者は年間約３．５万人となっており、その８割はHCV感染によるものである。また、その前段階である肝硬変においても年間約２万人が犠牲となっている。したがって、HCVは深刻な感染症を引き起こすウイルスであると言える。 The number of HCV-infected persons is estimated to be about 2 million in Japan and about 200 million worldwide. There are many so-called asymptomatic carriers who are not aware of being infected with HCV, as can be seen from the situation of HCV infection with fibrinogen preparations, which has become a recent social problem. Currently, there are about 35,000 victims of hepatocellular carcinoma annually in Japan, 80% of which are due to HCV infection. In addition, about 20,000 people are sacrificed annually in the previous stage of cirrhosis. Therefore, it can be said that HCV is a virus that causes serious infections.
HCVが増殖し、その感染、複製、粒子産生、再感染が繰り返される状態（すなわちHCVの生活環）が再現されるシステムを得ることは、抗HCV技術の開発に非常に有用である。しかしながら、HCVの発見以後、多くの培養細胞や動物を用いて人工増殖システムの開発が試みられたものの、実用的なものは得られなかった。また、HCV感染のモデル動物はチンパンジーのみであり、これに代わる動物は未だ見つかっていない。また、抗HCV剤の開発にあたって、多数のモデル動物（チンパンジー）を用いた薬理試験を実施することができないため、代替の薬効評価システムが必要とされている。 Obtaining a system that reproduces the state in which HCV proliferates and repeats infection, replication, particle production, and reinfection (that is, the life cycle of HCV) is very useful for the development of anti-HCV technology. However, since the discovery of HCV, an attempt was made to develop an artificial growth system using many cultured cells and animals, but no practical one was obtained. Moreover, the chimpanzee is the only model animal for HCV infection, and no alternative animal has been found yet. In developing an anti-HCV agent, since a pharmacological test using a large number of model animals (chimpanzees) cannot be performed, an alternative medicinal evaluation system is required.
抗HCV剤の開発にあたって、多数のモデル動物（チンパンジー）を用いた薬理試験を容易に実施することができないため、代替の薬効評価システムが必要とされている。このようなシステムとして、全長HCVゲノムの複製システムが開発され、これまでに、３種類のHCV株（Ｎ株、Ｃｏｎ−１株およびＨ７７株）の全長ゲノムを複製できる細胞（全長HCV RNA複製システム）の樹立が報告されている（非特許文献３〜５参照）。また、レポーター遺伝子を含む、HCVゲノムの複製レベルをモニタリングし得るアッセイ系（非特許文献６および特許文献３参照）が開発されている。 In developing an anti-HCV agent, since a pharmacological test using a large number of model animals (chimpanzees) cannot be easily performed, an alternative medicinal evaluation system is required. As such a system, a full-length HCV genome replication system has been developed. To date, cells capable of replicating full-length genomes of three types of HCV strains (N strain, Con-1 strain and H77 strain) (full length HCV RNA replication system). ) Has been reported (see Non-Patent Documents 3 to 5). In addition, an assay system (see Non-Patent Document 6 and Patent Document 3) that can monitor the replication level of the HCV genome including a reporter gene has been developed.
また、抗HCV剤を開発するには、HCVタンパク質を評価することも重要である。非特許文献７には、２ａ遺伝子型に属するJFH１株HCVを用いた感染性HCV粒子産生細胞（HuH-7細胞由来のクローン化細胞）が開示されている。 It is also important to evaluate HCV proteins in order to develop anti-HCV agents. Non-Patent Document 7 discloses infectious HCV particle-producing cells (cloned cells derived from HuH-7 cells) using JFH1 strain HCV belonging to the 2a genotype.
上述したように、OSMおよびDEXは、肝細胞の分化誘導に必要な物質である。本発明者らは、OSMおよびDEXを用いたHCV粒子の産生系を利用したHCV生活環再現システムおよび感染性HCV粒子産生細胞の構築を試みていた。その過程において、本発明者らはこれらの物質の能力を検証したところ、全く予期し得なかったOSMの能力を見出し、本発明を完成するに至った。 As described above, OSM and DEX are substances necessary for induction of hepatocyte differentiation. The present inventors have attempted to construct an HCV life cycle reproduction system and an infectious HCV particle producing cell using an HCV particle production system using OSM and DEX. In the process, the present inventors verified the ability of these substances, and found the ability of OSM which was completely unexpected and completed the present invention.
本発明に係る抗HCV剤は、OSMを含有していることを特徴としている。本発明において、OSMは、(i) 配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または(ii) 配列番号６に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列からなり、かつ抗HCV活性を有しているタンパク質であり得る。また、本発明において、OSMは、(i) 配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、(ii) 配列番号５に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつ抗HCV活性を有しているタンパク質、(iii) 配列番号５に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによってコードされ、かつ抗HCV活性を有しているタンパク質、または(iv) 配列番号５に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドによってコードされ、かつ抗HCV活性を有しているタンパク質であり得る。 The anti-HCV agent according to the present invention is characterized by containing OSM. In the present invention, OSM comprises (i) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or (ii) one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. It may be a protein consisting of a certain amino acid sequence and having anti-HCV activity. Further, in the present invention, OSM comprises (i) a protein encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and (ii) one or several bases missing in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. A protein encoded by a polynucleotide comprising a base sequence that is deleted, substituted or added and having anti-HCV activity; (iii) a polynucleotide comprising a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 80% or more homology with a protein encoded by a polynucleotide that can hybridize under various conditions and having anti-HCV activity, or (iv) a polynucleotide comprising a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 It may be a protein encoded by a polynucleotide having sex and having anti-HCV activity.
特許文献１および２に開示されるように、HCV粒子の産生系を構築する際にOSMおよびDEXは有用である。効率よくHCV粒子を産生させるためには、HCV RNAの複製効率がよいことが重要である。本発明者らは、肝細胞の分化誘導に用いられる物質が、HCV RNAの複製を抑制しないことを検証した。期待通り、DEXや他の増殖因子がHCV RNAの複製に影響を与えないことを確認した。しかし、OSMのみがHCV RNAの複製を抑制することは全くの予想外であった。 As disclosed in Patent Documents 1 and 2, OSM and DEX are useful in constructing a production system for HCV particles. In order to produce HCV particles efficiently, it is important that the replication efficiency of HCV RNA is good. The present inventors have verified that a substance used for induction of hepatocyte differentiation does not suppress HCV RNA replication. As expected, we confirmed that DEX and other growth factors did not affect HCV RNA replication. However, it was completely unexpected that only OSM suppressed HCV RNA replication.
OSMは２０年以上前に発見された、かなり研究の進んでいるサイトカインである。HCVコアタンパク質がOSMの肝細胞分化作用を抑制することが報告されているが、OSMの「抗ウイルス効果」を教示または示唆する報告は全くなされていない。HCV粒子の産生系を作製するための、ES細胞から肝細胞への分化誘導に必要なOSMが、実は抗HCV活性を有しているという知見は、全く予期され得るものではなかった。また、構造が類似するIL-6もIL-6ファミリーの他の分子もまた、抗HCV活性を有していなかった。このように、OSMの抗HCV活性は、その構造面からも全く予期し得ない知見である。 OSM is a well-studied cytokine discovered over 20 years ago. Although it has been reported that HCV core protein suppresses the hepatocyte differentiation action of OSM, there has been no report that teaches or suggests the “antiviral effect” of OSM. The finding that the OSM necessary for induction of differentiation from ES cells to hepatocytes to produce a production system for HCV particles actually has anti-HCV activity was completely unexpected. Also, neither IL-6, which is similar in structure, nor other molecules of the IL-6 family had anti-HCV activity. Thus, the anti-HCV activity of OSM is a finding that is completely unexpected from the structural aspect.
本発明に係る抗HCV剤は、IFN、シクロスポリン（CsA）、FLVまたはピタバスタチン（PTV）と組み合わせて適用されることが好ましい。 The anti-HCV agent according to the present invention is preferably applied in combination with IFN, cyclosporine (CsA), FLV or pitavastatin (PTV).
本発明に係る治療組成物は、Ｃ型肝炎を治療するために、OSMを含有していることを特徴としている。本発明に係る治療組成物は、IFN治療を必要とするＣ型肝炎患者に対して適用されることが好ましく、対象とされるＣ型肝炎は慢性肝炎であってもよい。また、本発明に係る治療組成物は、IFN、CsA、FLVまたはPTVをさらに含有していてもよい。 The therapeutic composition according to the present invention is characterized by containing OSM in order to treat hepatitis C. The therapeutic composition according to the present invention is preferably applied to hepatitis C patients who require IFN treatment, and the target hepatitis C may be chronic hepatitis. The therapeutic composition according to the present invention may further contain IFN, CsA, FLV or PTV.
本発明に係る治療キットは、Ｃ型肝炎を治療するために、OSMを備えていることを特徴としている。本発明に係る治療キットは、IFN治療を必要とするＣ型肝炎患者に対して適用されることが好ましい。また、本発明に係る治療キットは、IFN、CsA、FLVまたはPTVをさらに備えていてもよい。 The treatment kit according to the present invention is characterized by having OSM in order to treat hepatitis C. The treatment kit according to the present invention is preferably applied to hepatitis C patients who require IFN treatment. Moreover, the treatment kit according to the present invention may further include IFN, CsA, FLV, or PTV.
本発明に係るＣ型肝炎患者に対するIFN治療の有効性を予測する方法は、被験体サンプル中に存在するOSMのレベルを測定する工程を包含することを特徴している。本発明に係る方法において、上記被験体サンプルはＣ型肝炎患者からの血液であることが好ましい。 The method for predicting the effectiveness of IFN treatment for hepatitis C patients according to the present invention is characterized in that it comprises the step of measuring the level of OSM present in a subject sample. In the method according to the present invention, the subject sample is preferably blood from a hepatitis C patient.
また、本発明に係るＣ型肝炎患者に対するIFN治療の有効性を予測する方法は、Ｃ型肝炎患者からの肝組織サンプル中に存在するgp130およびOSMRのレベルを測定する工程を包含することを特徴としている。本発明に係る方法において、上記肝組織サンプルは、生検（バイオプシー）によって得られた組織サンプルであっても、組織サンプルから調製された肝細胞であってもよい。本発明に係る方法は、上記肝組織サンプルにてgp130およびOSMRから構成されるヘテロダイマーを検出する工程をさらに包含してもよい。 In addition, the method for predicting the effectiveness of IFN treatment for hepatitis C patients according to the present invention includes the step of measuring the levels of gp130 and OSMR present in liver tissue samples from hepatitis C patients. It is said. In the method according to the present invention, the liver tissue sample may be a tissue sample obtained by biopsy or a hepatocyte prepared from the tissue sample. The method according to the present invention may further include a step of detecting a heterodimer composed of gp130 and OSMR in the liver tissue sample.
本発明に係る測定キットは、Ｃ型肝炎患者に対するIFN治療の有効性を予測するために、(i) OSMタンパク質に対する抗体；(ii) gp130タンパク質に対する抗体およびOSMRタンパク質に対する抗体；(iii) OSM mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチド；ならびに、(iv) gp130 mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチドおよびOSMR mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチド、の少なくとも１つを備えていることを特徴としている。 The measurement kit according to the present invention is used to predict the effectiveness of IFN treatment for hepatitis C patients: (i) an antibody against OSM protein; (ii) an antibody against gp130 protein and an antibody against OSMR protein; (iii) OSM mRNA And (iv) at least one of an oligonucleotide capable of detecting gp130 mRNA and an oligonucleotide capable of detecting OSMR mRNA.
本発明を用いれば、新規抗HCV剤およびＣ型肝炎治療薬を提供し得る。また、IFNとの併用によって相乗的な抗HCV活性を示すので、IFNの著効率を向上し得る。 By using the present invention, a novel anti-HCV agent and a therapeutic agent for hepatitis C can be provided. In addition, since it exhibits synergistic anti-HCV activity when used in combination with IFN, the remarkable efficiency of IFN can be improved.
〔１〕抗HCV剤
本発明は、新規抗HCV剤を提供する。一般に、抗HCV作用は、HCVの感染、複製、粒子産生および再感染のいずれかを抑制または阻害する作用が意図されるが、本明細書中において使用される場合、「抗HCV」は、HCVの複製の抑制または阻害が意図される。なお、「抗HCV剤」の適用は生体内および生体外が包含されるが、生体内での使用の局面は「治療組成物」として後述する。
[1] Anti-HCV agent The present invention provides a novel anti-HCV agent. In general, anti-HCV action is intended to suppress or inhibit any of HCV infection, replication, particle production and reinfection, but as used herein, “anti-HCV” means HCV Suppression or inhibition of replication is intended. The application of the “anti-HCV agent” includes in vivo and in vitro, but the aspect of in vivo use will be described later as “therapeutic composition”.
HCVは、１９８９年に米国のカイロン社のグループによって発見された。それ以前は、原因不明の肝炎を引き起こす病原体として、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスと呼ばれていた。Ｃ型慢性肝炎に対する治療の歴史をさかのぼると、HCVが発見される以前から非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに対するIFN療法が有効であることが報告されていた。HCV感染の診断が可能となってから、はじめにIFN単独療法が行われたがその著効率は約３０％であった。２００１年よりIFN−αとリバビリンとの併用療法が開始され、その著効率は約４０％となった。２００４年よりPEG-IFN−αとリバビリンとの併用療法が開始されて、その著効率は約５０％に改善された。しかし、依然として約半数のＣ型慢性肝炎患者ではウイルスが排除されず、肝硬変、肝癌等へ進行している。また、IFN治療が有効ではない患者では、グリチルリチン製剤、ウルソデオキシコール酸などを用いた対症療法の継続、肝硬変、肝癌等に対する診断、治療に対する経済的負担もまた、大きな問題である。このような、現状では新しい治療法の開発が急務とされており、社会的な需要も大きい。 HCV was discovered in 1989 by a group of Chiron Corporation in the United States. Prior to that, it was called non-A non-B hepatitis virus as a pathogen causing unexplained hepatitis. Looking back on the history of treatment for chronic hepatitis C, it was reported that IFN therapy for non-A non-B hepatitis virus was effective before HCV was discovered. Since the diagnosis of HCV infection became possible, IFN monotherapy was first performed, but its remarkable efficiency was about 30%. In 2001, combination therapy with IFN-α and ribavirin was started, and its remarkable efficiency was about 40%. In 2004, combination therapy with PEG-IFN-α and ribavirin was started, and the remarkable efficiency was improved to about 50%. However, about half of the patients with chronic hepatitis C do not eliminate the virus and progress to cirrhosis, liver cancer and the like. In patients who are not effective in IFN treatment, continuation of symptomatic treatment using glycyrrhizin preparation, ursodeoxycholic acid, etc., diagnosis of liver cirrhosis, liver cancer, etc., and the economic burden of treatment are also major problems. Under such circumstances, the development of new treatment methods is urgently required, and there is a great social demand.
本発明に係る抗HCV剤は、OSMを含有していることを特徴としている。OSMは、元来リンパ球が産生する抗腫瘍効果のある液性因子として２０年以上前に発見された、かなり研究の進んでいるサイトカインであり、HCVコアタンパク質がOSMの肝細胞分化作用を抑制することが報告されている。上述したように、OSMは、DEXとともに肝細胞の分化誘導に必要な物質である。本発明者らは、OSMおよびDEXを用いたHCV粒子の産生系を利用したHCV生活環再現システムおよび感染性HCV粒子産生細胞の構築を試みていた。その過程において、本発明者らはこれらの物質の能力を検証したところ、「抗ウイルス効果」という、これまでに全く予期し得なかったOSMの能力を見出した。OSMの「抗ウイルス効果」を教示または示唆する報告は、これまで全くなされていない。 The anti-HCV agent according to the present invention is characterized by containing OSM. OSM is a highly studied cytokine that was originally discovered over 20 years ago as a humoral factor with an antitumor effect produced by lymphocytes, and the HCV core protein suppresses hepatocyte differentiation of OSM. It has been reported to do. As described above, OSM is a substance necessary for induction of hepatocyte differentiation together with DEX. The present inventors have attempted to construct an HCV life cycle reproduction system and an infectious HCV particle producing cell using an HCV particle production system using OSM and DEX. In the process, the present inventors verified the ability of these substances, and found the ability of OSM, which had never been expected so far, to be “antiviral effect”. There have been no reports that teach or suggest the “antiviral effect” of OSM.
本発明者らは、HCV-O株(遺伝子型１ｂ)由来の全長HCV RNA複製細胞（OR6細胞）を開発している（特許文献３参照）。OR6細胞で複製する全長HCV RNAには、レポーター遺伝子としてのRenilla luciferase遺伝子、選択マーカー遺伝子としてのネオマイシン耐性遺伝子、およびEMCV IRESが含まれている。OR6細胞において、Renilla luciferase遺伝子産物およびネオマイシン耐性遺伝子産物は融合蛋白質として細胞内で発現する。G418を添加した培地中では、ネオマイシン耐性遺伝子産物によって、安定したHCV RNA複製細胞が選択され得、かつ維持され得る。また、細胞内のRenilla Luciferase活性はHCV RNA量と非常に良く相関するため、簡便かつ正確なRenilla Luciferase活性を測定することによって煩雑なHCV RNA定量を代用し得る。このようなOR6システムを開発したことにより、これまで困難であった薬剤の併用効果の微妙な判定が可能になった。OR6システムの開発によってFLVが強い抗HCV活性を有することが見出され（特許文献３参照）、この知見に基づいた臨床での有用性が国内外から報告されている（非特許文献８および９参照）。 The present inventors have developed full-length HCV RNA replicating cells (OR6 cells) derived from the HCV-O strain (genotype 1b) (see Patent Document 3). Full length HCV RNA replicated in OR6 cells includes Renilla luciferase gene as a reporter gene, neomycin resistance gene as a selectable marker gene, and EMCV IRES. In OR6 cells, the Renilla luciferase gene product and the neomycin resistance gene product are expressed intracellularly as fusion proteins. In the medium supplemented with G418, stable HCV RNA replicating cells can be selected and maintained by the neomycin resistance gene product. Moreover, since intracellular Renilla Luciferase activity correlates very well with the amount of HCV RNA, it is possible to substitute complicated HCV RNA quantification by measuring simple and accurate Renilla Luciferase activity. By developing such an OR6 system, it has become possible to make subtle judgments on the combined effects of drugs, which has been difficult until now. The development of the OR6 system has found that FLV has a strong anti-HCV activity (see Patent Document 3), and clinical usefulness based on this finding has been reported both domestically and internationally (Non-Patent Documents 8 and 9). reference).
特許文献１および２に開示されるように、HCV粒子の産生系を構築する際にOSMおよびDEXは有用である。効率よくHCV粒子を産生させるためには、HCV RNAの複製効率がよいことが重要である。本発明者らは、肝細胞の分化誘導に用いられる物質が、HCV RNAの複製を抑制しないことを、上記OR6システムを用いて確認した。その結果、DEXや他の増殖因子はHCV RNAの複製に影響を与えなかったが、OSMのみがHCV RNAの複製を抑制した。このことは、本発明者らの見出したOSMによる「抗ウイルス効果」を支持する。 As disclosed in Patent Documents 1 and 2, OSM and DEX are useful in constructing a production system for HCV particles. In order to produce HCV particles efficiently, it is important that the replication efficiency of HCV RNA is good. The present inventors have confirmed using the OR6 system that a substance used for inducing differentiation of hepatocytes does not suppress HCV RNA replication. As a result, DEX and other growth factors did not affect HCV RNA replication, but only OSM suppressed HCV RNA replication. This supports the “antiviral effect” by OSM found by the present inventors.
また、OSMは、その構造、および受容体複合体にgp130を含むという特徴に基づいて、IL-6ファミリーに分類される。上記OR6システムを用いてIL-6ファミリー（受容体複合体にgp130を含む）の抗HCV活性を確認すると、腫瘍抑制効果を示すLIFは、抗HCV活性を示さず、IL-6も、強い抗HCV活性を示さなかった。これらの結果は、OSMの抗HCV活性が、IL-6ファミリーに共通する機能ではないことを示している。OSMの受容体複合体はgp130とOSMRのヘテロダイマーにより構成される。受容体複合体にOSMRを含むサイトカインとして、IL-31（IL-6ファミリーではない）が知られている。受容体複合体にOSMと共通のOSMRを含むIL-31の抗HCV活性を調べたが、IL-31もまた抗HCV活性を示さなかった。構造面からも機能面からも全く予期され得なかったOSMの抗ウイルス効果は、HCV関連の肝疾患、さらにはウイルス学全般に対して非常に大きな影響を与え得る。 OSM is also classified into the IL-6 family based on its structure and the characteristics of including gp130 in the receptor complex. When the anti-HCV activity of the IL-6 family (including gp130 in the receptor complex) was confirmed using the OR6 system, LIF, which exhibits a tumor suppressive effect, did not exhibit anti-HCV activity, and IL-6 also has strong anti-antigenic activity. It did not show HCV activity. These results indicate that the anti-HCV activity of OSM is not a function common to the IL-6 family. The OSM receptor complex is composed of gp130 and OSMR heterodimers. IL-31 (not IL-6 family) is known as a cytokine containing OSMR in the receptor complex. IL-31, which contains OSMR in common with OSM in the receptor complex, was examined for anti-HCV activity. IL-31 also did not show anti-HCV activity. The antiviral effects of OSM, which could not be expected at all from a structural and functional point of view, can have a tremendous impact on HCV-related liver diseases and even virology in general.
OSMは、(i) 配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または(ii) 配列番号６に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列からなり、かつ抗HCV活性を有しているタンパク質であり得る。また、本発明において、OSMは、(i) 配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、(ii) 配列番号５に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、かつ抗HCV活性を有しているタンパク質、(iii) 配列番号５に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによってコードされ、かつ抗HCV活性を有しているタンパク質、または(iv) 配列番号５に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドによってコードされ、かつ抗HCV活性を有しているタンパク質であり得る。 OSM consists of (i) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or (ii) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. And a protein having anti-HCV activity. Further, in the present invention, OSM comprises (i) a protein encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and (ii) one or several bases missing in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. A protein encoded by a polynucleotide comprising a base sequence that is deleted, substituted or added and having anti-HCV activity; (iii) a polynucleotide comprising a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 80% or more homology with a protein encoded by a polynucleotide that can hybridize under various conditions and having anti-HCV activity, or (iv) a polynucleotide comprising a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 It may be a protein encoded by a polynucleotide having sex and having anti-HCV activity.
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用され、化学合成されたものであっても、天然供給源より単離されたものであってもよい。用語「単離された」タンパク質は、その天然の環境から取り出されたタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。組換えタンパク質は、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含み、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、発現されたタンパク質を細胞、組織などから単離精製されたものが意図される。 As used herein, the term “protein” is used interchangeably with “peptide” or “polypeptide” and is either chemically synthesized or isolated from a natural source. It may be. The term “isolated” protein is intended to be a protein that has been removed from its natural environment. For example, a recombinantly produced protein expressed in a host cell is considered isolated, as are native or recombinant proteins that have been substantially purified by any suitable technique. Recombinant proteins are assembled from natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (including, for example, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells). It is intended to include a product produced by a replacement technique, introduce a gene encoding a protein of interest into a host cell, and isolate and purify the expressed protein from cells, tissues, and the like.
当業者は、周知技術を使用してタンパク質のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。また、当業者は、周知技術を使用してポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の抗HCV活性を有するか否かを、当業者は容易に決定し得る。 One skilled in the art can readily mutate one or several amino acids in the amino acid sequence of a protein using well-known techniques. Moreover, those skilled in the art can easily mutate one or several bases in a polynucleotide base sequence using a well-known technique. For example, according to a known point mutation introduction method, any base of a polynucleotide encoding a protein can be mutated. In addition, a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site of a polynucleotide encoding a protein. Furthermore, using the methods described herein, one of ordinary skill in the art can readily determine whether a generated variant has the desired anti-HCV activity.
好ましい変異体タンパク質は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。このような変異は、サイレントな置換、添加、および欠失が好ましく、保存性置換が特に好ましい。このようなタンパク質は、本発明に用いられるタンパク質の抗HCV活性を変化させない。 Preferred variant proteins have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions, or additions. Such mutations are preferably silent substitutions, additions and deletions, and conservative substitutions are particularly preferred. Such a protein does not change the anti-HCV activity of the protein used in the present invention.
当業者は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、周知の方法（例えば、Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載の方法）に従って容易に行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。 Those skilled in the art can easily perform hybridization of a polynucleotide according to a well-known method (for example, a method described in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory)). Usually, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (harder to hybridize), and a more homologous polynucleotide can be obtained. The appropriate hybridization temperature varies depending on the base sequence and the length of the base sequence. For example, when a DNA fragment consisting of 18 bases encoding 6 amino acids is used as a probe, a temperature of 50 ° C. or lower is preferable.
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような測定キットのツールとして使用され得る。また、このようなオリゴヌクレオチドは、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）が融合されていてもよい。 As used herein, the term “stringent (hybridization) conditions” refers to a hybridization solution (50% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM phosphorous. After overnight incubation at 42 ° C. in sodium acid (pH 7.6), 5 × Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg / ml denatured sheared salmon sperm DNA, It is intended to wash the filter in 1 × SSC. Depending on the polynucleotide that hybridizes to a “portion” of the polynucleotide, at least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt, and even more preferably about Polynucleotides (either DNA or RNA) that hybridize to polynucleotides longer than 30 nt are contemplated. A polynucleotide (oligonucleotide) that hybridizes to a “portion” of such a polynucleotide can be used as a tool in a measurement kit as discussed in more detail herein. Moreover, such oligonucleotides may be fused with a tag label (tag sequence or marker sequence) on the 5 'side or 3' side.
本発明に係る抗HCV剤は、IFN、CsA、FLVまたはPTVと組み合わせて適用されることが好ましい。従来から抗HCV剤として用いられているIFN以外にも、CsA、FLVおよびPTVにも優れた抗HCV活性があることが報告されている。本発明に係る抗HCV剤は、これらの抗HCV活性を増強し、特にIFNの抗HCV活性を相乗的に増強する。 The anti-HCV agent according to the present invention is preferably applied in combination with IFN, CsA, FLV or PTV. In addition to IFN, which has been used as an anti-HCV agent, CsA, FLV and PTV have been reported to have excellent anti-HCV activity. The anti-HCV agent according to the present invention enhances these anti-HCV activities, and in particular synergistically enhances the anti-HCV activity of IFN.
〔２〕治療組成物、治療キットおよび治療方法
本発明は、Ｃ型肝炎を治療するための治療組成物、治療キットおよび治療方法を提供する。本発明に係る治療組成物は、OSMを含有していることを特徴としている。Ｃ型肝炎は、急性Ｃ型肝炎と慢性Ｃ型肝炎とに分けられ得るが、本発明に係る治療組成物は慢性Ｃ型肝炎に好適である。
[2] Therapeutic composition, therapeutic kit and therapeutic method The present invention provides a therapeutic composition, therapeutic kit and therapeutic method for treating hepatitis C. The therapeutic composition according to the present invention is characterized by containing OSM. Although hepatitis C can be divided into acute hepatitis C and chronic hepatitis C, the therapeutic composition according to the present invention is suitable for chronic hepatitis C.
上述したように、本発明者らは、予期し得なかったOSMの抗HCV活性を見出し、その能力を、OR6システムを用いてOSMの抗HCV活性を検証し、後述する実施例に示すように、OSMが濃度依存的（EC50＝0.71 ng/ml）にHCV RNAの複製を抑制することを確認した。OSMが発見されてからOSMに関する多くの報告がなされているが、OSMのウイルス複製抑制機能に関する報告は全くなされていない。 As described above, the present inventors found an anti-HCV activity of OSM that could not be anticipated, and verified the ability of the anti-HCV activity of OSM using the OR6 system, as shown in the examples described below. It was confirmed that OSM suppresses HCV RNA replication in a concentration-dependent manner (EC 50 = 0.71 ng / ml). Many reports on OSM have been made since the discovery of OSM, but no reports on the virus replication suppression function of OSM have been made.
本発明に係る治療組成物は、経口、非経口、または局所のいずれかの経路で被験体へ投与され得る。当業者は、有効成分であるOSMの含有量を、治療対象の体重および状態、治療される疾病の状態、および選択される特定の投与経路に応じて、適宜選択し得る。有効成分であるOSMは、任意の投与経路により、単独で、あるいは薬学的に受容可能な担体または希釈剤と組み合わせて、単回または複数回投与され得る。本発明に係る治療組成物の剤形は特に限定されず、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、ハードキャンディー剤、散剤、スプレー剤、クリーム剤、塗剤、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤、水性懸濁液、注射溶液、エリキシル剤、シロップ剤などの形態にて、種々の薬学的に受容可能な担体と組み合わされ得る。なお、薬学的に受容可能な担体は当業者には周知であり、例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Merck Pub. Co., N.J.1991) に十分に記載されている。 The therapeutic composition according to the present invention may be administered to a subject by any oral, parenteral, or topical route. A person skilled in the art can appropriately select the content of the active ingredient OSM depending on the weight and condition of the subject to be treated, the condition of the disease to be treated, and the particular administration route selected. The active ingredient OSM can be administered by any route of administration, alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The dosage form of the therapeutic composition according to the present invention is not particularly limited, and is a tablet, capsule, lozenge, troche, hard candy, powder, spray, cream, coating, suppository, jelly, gel. , Pastes, lotions, ointments, aqueous suspensions, injectable solutions, elixirs, syrups and the like and may be combined with various pharmaceutically acceptable carriers. Pharmaceutically acceptable carriers are well known to those skilled in the art and are fully described, for example, in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Merck Pub. Co., N.J. 1991).
現在、Ｃ型慢性肝炎に対する標準的な治療法は、IFN−αとリバビリンの併用療法である。しかし、この治療法を適用したときのＣ型肝炎に対する有効性は、血中での安定性を高めたPEG-IFNを用いた場合でも最大５０％に過ぎず、残りの患者は、致死的な肝硬変、肝癌発症の危険に曝されている。また、リバビリンは６５歳以上の高齢者には溶血性貧血の副作用が頻発し、治療の中止を余儀なくされるという事態が生じている。したがって、リバビリンに代わる新たなIFNとの併用に有効な薬剤の早期開発が望まれている。 Currently, the standard treatment for chronic hepatitis C is combination therapy of IFN-α and ribavirin. However, the effectiveness against hepatitis C when this treatment is applied is only 50% even when using PEG-IFN with increased blood stability, and the remaining patients are fatal. He is at risk of developing cirrhosis and liver cancer. In addition, ribavirin is frequently affected by the side effects of hemolytic anemia in elderly people 65 years of age and older, and there is a situation in which the treatment must be stopped. Therefore, early development of a drug effective for use in combination with a new IFN in place of ribavirin is desired.
本発明者らが見出したOSMの特性は、現状のIFN治療を大きく改善することを期待させ得る。本発明に関して特筆すべき事項は、低濃度（25 pg/ml）のOSMがIFN−αの抗HCV活性を相乗的に増強することである。本発明は、PEG-IFN−αとリバビリンとの併用療法の治療効果を大きく改善することが期待される。すなわち、本発明に係る治療組成物は、IFN治療を必要とするＣ型肝炎患者に対して適用されることが好ましい。また、上述したように、抗HCV活性を有しているIFN、CsA、FLVおよびPTVとともに用いられることによって、OSMはこれらの抗HCV活性を増強し、特にIFNの抗HCV活性を相乗的に増強する。すなわち、本発明に係る治療組成物は、IFN、CsA、FLVまたはPTVをさらに含有していてもよく、好ましくはIFNをさらに含有し得る。 The characteristics of OSM found by the present inventors can be expected to greatly improve the current IFN treatment. Of particular note with respect to the present invention is that low concentrations (25 pg / ml) of OSM synergistically enhance the anti-HCV activity of IFN-α. The present invention is expected to greatly improve the therapeutic effect of the combination therapy of PEG-IFN-α and ribavirin. That is, the therapeutic composition according to the present invention is preferably applied to patients with hepatitis C who require IFN treatment. In addition, as described above, when used with IFN, CsA, FLV and PTV that have anti-HCV activity, OSM enhances these anti-HCV activities, and in particular, synergistically enhances the anti-HCV activity of IFN. To do. That is, the therapeutic composition according to the present invention may further contain IFN, CsA, FLV or PTV, and preferably may further contain IFN.
Ｃ型慢性肝炎は肝癌の最大（８０％）の病原因子であるが、元来、抗腫瘍効果のあるサイトカインとして発見されたOSMは肝癌の抑制効果も期待される。また、腫瘍細胞の抑制効果以外にOSMには血管内皮細胞の増殖抑制効果も報告されている。よって、血管に富んだ腫瘍である肝癌には、この点からも抑制効果が期待される。OSMは、Ｃ型慢性肝炎の治療効果と同時に肝癌の発生を予防する効果が期待される。また、本発明は、HCVの治療のみならず他の病原ウイルス（インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなど）についての研究に大きな影響を与えることが期待される。 Chronic hepatitis C is the largest (80%) virulence factor of liver cancer, but OSM, which was originally discovered as a cytokine with an antitumor effect, is also expected to suppress liver cancer. In addition to the tumor cell inhibitory effect, OSM has also been reported to have a vascular endothelial cell growth inhibitory effect. Therefore, an inhibitory effect is also expected from this point in liver cancer, which is a tumor rich in blood vessels. OSM is expected to have the effect of preventing the development of liver cancer as well as the therapeutic effect of chronic hepatitis C. In addition, the present invention is expected to have a great influence not only on the treatment of HCV but also on other pathogenic viruses (influenza virus, hepatitis B virus, etc.).
本発明に係る治療キットは、上述した治療組成物がキットの態様で提供されたものであり得る。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図され、好ましくはこれらの材料を使用するための使用説明書を備えている。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。 The therapeutic kit according to the present invention may be one in which the above-described therapeutic composition is provided in the form of a kit. As used herein, the term “kit” is intended for packaging with containers (eg, bottles, plates, tubes, dishes, etc.) containing specific materials, preferably using these materials. Instruction manual is provided. The instructions for use may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, and the like.
本発明に係る治療キットは、OSMを備えていればよく、本発明に係る治療組成物を備えていてもよい。本発明に係る治療キットは、OSMまたは本発明に係る治療組成物と異なる成分を含むさらなる組成物が備えられていてもよい。本発明に係る治療組成物と異なる成分を含む組成物としては、特に限定されないが、IFN、CsA、FLVまたはPTVを有効成分とするＣ型肝炎治療用組成物が好ましい。IFNとしては、IFN−αまたはIFN−βが好ましく、IFN−αが特に好ましい。また、IFNはPEG化等の修飾がされていてもよい。すなわち、本発明に係る治療キットは、OSMを備えていればよく、IFN、CsA、FLVまたはPTVをさらに備えていてもよい。 The treatment kit according to the present invention only needs to include OSM, and may include the therapeutic composition according to the present invention. The therapeutic kit according to the present invention may be provided with a further composition comprising components different from those of OSM or the therapeutic composition according to the present invention. The composition containing a component different from the therapeutic composition according to the present invention is not particularly limited, but a composition for treating hepatitis C containing IFN, CsA, FLV or PTV as an active ingredient is preferable. As IFN, IFN-α or IFN-β is preferable, and IFN-α is particularly preferable. IFN may be modified such as PEGylation. That is, the treatment kit according to the present invention only needs to include OSM, and may further include IFN, CsA, FLV, or PTV.
キットに２種類以上の組成物が備えられる場合には、これらは別個の容器（例えば、分割されたボトルなど）に入れて備えられてもよく、分割されていない単独の容器に入れて備えられてもよい。またキットは、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、治療キットは、Ｃ型肝炎治療法に適用するために必要な器具をあわせて備えてもよい。 If the kit is provided with more than one composition, these may be provided in separate containers (eg, divided bottles, etc.) or in a single undivided container. May be. The kit may also comprise a container containing a diluent, solvent, washing solution or other reagent. Furthermore, the treatment kit may be provided with a device necessary for application to the hepatitis C treatment method.
キットの形態は、別個の成分が好ましくは異なる剤形（例えば経口および非経口）で投与され、異なる投与量で投与され、または、処方する医師が当該組み合わせの各成分の滴定を所望する場合などに特に有利である。本発明に係る治療キットの使用方法は、上述した組成物の使用形態に従えばよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。 The kit form is such that separate components are preferably administered in different dosage forms (eg, oral and parenteral), administered at different dosages, or where the prescribing physician desires a titration of each component of the combination, etc. Is particularly advantageous. Those skilled in the art who have read this specification will easily understand that the method of using the treatment kit according to the present invention may follow the use form of the composition described above.
また、本発明に係る治療法は、上述した治療組成物または治療キットを適用する態様であり得る。すなわち、本発明に係る治療法は、Ｃ型肝炎患者にOSMを投与する工程を包含していればよく、IFN、CsA、FLVまたはPTVを投与する工程をさらに包含してもよい。本発明に係る治療法における上記組成物等の適用については、上述した使用形態に従えばよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。 Further, the treatment method according to the present invention may be an embodiment in which the above-described treatment composition or treatment kit is applied. That is, the treatment method according to the present invention only needs to include a step of administering OSM to a patient with hepatitis C, and may further include a step of administering IFN, CsA, FLV, or PTV. Those skilled in the art who have read this specification will easily understand that the application of the above-described composition or the like in the treatment method according to the present invention may be in accordance with the use form described above.
〔３〕IFN治療の有効性を予測する方法およびキット
OSMは肝臓でKuppfer細胞により産生されるということが報告されている。しかし、Ｃ型慢性肝炎患者でのOSMの血中濃度に関する情報はこれまでに全く報告されていない。本発明者らは、OSMが低濃度（25 pg/ml）であってもIFNの抗HCV活性を相乗的に増強することを見出した。本発明者らが見出したOSMの特性は、現状のIFN治療を大きく改善し得る。
[3] Method and kit for predicting effectiveness of IFN treatment
It has been reported that OSM is produced by Kuppfer cells in the liver. However, no information on the blood level of OSM in patients with chronic hepatitis C has ever been reported. The inventors have found that OSM synergistically enhances the anti-HCV activity of IFN even at low concentrations (25 pg / ml). The characteristics of OSM found by the present inventors can greatly improve the current IFN treatment.
すなわち、本発明は、IFN治療の有効性を予測する方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る方法は、被験体サンプル中に存在するOSMのレベルを測定する工程を包含することを特徴している。測定されるOSMはタンパク質であってもmRNAであってもよい。タンパク質レベルを測定する場合は、OSMに対する抗体を用いた免疫アッセイが好ましい。OSMに関して数多くの研究がこれまでになされているので、抗OSM抗体は当業者に周知である。また、周知のOSM配列（OSMのアミノ酸配列および塩基配列）に基づけば、当業者は抗OSM抗体を容易に取得し得る。mRNAを測定する場合は、OSMの塩基配列（配列番号５）に基づいて作製されたオリゴヌクレオチドがプローブまたはプライマーとして用いられることが好ましい。なお、当業者は上記プローブまたはプライマーとして利用可能なオリゴヌクレオチドを当該分野の技術常識に基づいて容易に作製し得る。また、OSMに関してなされている数多くの研究において採用された、OSM mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチドもまた本発明に適用可能であることを、当業者は容易に理解する。 That is, the present invention provides a method for predicting the effectiveness of IFN treatment. In one embodiment, the method according to the invention is characterized in that it comprises the step of measuring the level of OSM present in a subject sample. The OSM to be measured may be a protein or mRNA. When measuring the protein level, an immunoassay using an antibody against OSM is preferred. Anti-OSM antibodies are well known to those skilled in the art since numerous studies on OSM have been made so far. Moreover, based on the well-known OSM sequence (the amino acid sequence and base sequence of OSM), those skilled in the art can easily obtain an anti-OSM antibody. When measuring mRNA, it is preferable to use an oligonucleotide prepared based on the base sequence of OSM (SEQ ID NO: 5) as a probe or primer. A person skilled in the art can easily prepare an oligonucleotide that can be used as the probe or primer based on the common general technical knowledge in the field. In addition, those skilled in the art will readily understand that oligonucleotides capable of detecting OSM mRNA employed in many studies on OSM are also applicable to the present invention.
本明細書中において使用される場合、「被験体サンプル」は、IFN治療の有効性を予測すべき対象となるＣ型肝炎患者（好ましくはＣ型慢性肝炎患者）から採取された任意の組織サンプルまたは細胞サンプルが意図され、肝組織サンプルに限定されない。サンプルの取得手順は、所望される組織または細胞に応じて適宜選択され得ることを当業者は容易に理解する。本実施形態に係る方法において、上記被験体サンプルはＣ型肝炎患者からの血液であることが好ましいが、これに限定されない。なお、サンプル取得の第一段階として組織または細胞を被験体から直接取り出す工程は、医師によるものであり、本発明の範囲外である。 As used herein, a “subject sample” is any tissue sample taken from a hepatitis C patient (preferably a chronic hepatitis C patient) for which the efficacy of IFN treatment is to be predicted. Or a cell sample is intended and is not limited to a liver tissue sample. Those skilled in the art will readily understand that the procedure for obtaining a sample can be appropriately selected depending on the desired tissue or cell. In the method according to the present embodiment, the subject sample is preferably blood from a hepatitis C patient, but is not limited thereto. In addition, the process of taking out a tissue or a cell directly from a subject as a first stage of sample acquisition is performed by a doctor and is outside the scope of the present invention.
他の実施形態において、Ｃ型肝炎患者からの肝組織サンプル中に存在するgp130およびOSMRのレベルを測定する工程を包含することを特徴としている。測定されるgp130およびOSMRはタンパク質であってもmRNAであってもよい。タンパク質レベルを測定する場合は、gp130またはOSMRに対する抗体を用いた免疫アッセイが好ましい。gp130およびOSMRに関して数多くの研究が、OSMに関する研究と同様にこれまでになされているので、抗gp130抗体および抗OSMR抗体は当業者に周知である。また、周知のgp130配列（gp130のアミノ酸配列および塩基配列）およびOSMR配列（OSMRのアミノ酸配列および塩基配列）に基づけば、当業者は抗gp130抗体および抗OSMR抗体を容易に取得し得る。mRNAを測定する場合は、公知の配列データベースから入手可能なgp130またはOSMRの塩基配列に基づいて作製されたオリゴヌクレオチドがプローブまたはプライマーとして用いられることが好ましい。なお、当業者は上記プローブまたはプライマーとして利用可能なオリゴヌクレオチドを当該分野の技術常識に基づいて容易に作製し得る。また、gp130およびOSMRに関してなされている数多くの研究において採用された、gp130 mRNAおよびOSMR mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチドもまた本発明に適用可能であることを、当業者は容易に理解する。 In another embodiment, the method comprises measuring the level of gp130 and OSMR present in a liver tissue sample from a hepatitis C patient. The measured gp130 and OSMR may be proteins or mRNA. When measuring protein levels, immunoassays using antibodies against gp130 or OSMR are preferred. Anti-gp130 antibodies and anti-OSMR antibodies are well known to those skilled in the art, as many studies on gp130 and OSMR have been done so far, as do studies on OSM. Further, based on the well-known gp130 sequence (amino acid sequence and base sequence of gp130) and OSMR sequence (amino acid sequence and base sequence of OSMR), those skilled in the art can easily obtain anti-gp130 antibodies and anti-OSMR antibodies. When measuring mRNA, it is preferable that an oligonucleotide prepared based on the base sequence of gp130 or OSMR available from a known sequence database is used as a probe or primer. A person skilled in the art can easily prepare an oligonucleotide that can be used as the probe or primer based on the common general technical knowledge in the field. In addition, those skilled in the art will easily understand that oligonucleotides capable of detecting gp130 mRNA and OSMR mRNA employed in many studies conducted on gp130 and OSMR are also applicable to the present invention.
本実施形態に係る方法において、上記肝組織サンプルは、Ｃ型肝炎患者から生検（バイオプシー）によって得られた肝組織であることが好ましいが、この肝組織から調製された肝細胞であってもよい。本発明に係る方法は、上記肝組織サンプルにてgp130およびOSMRから構成されるヘテロダイマーを検出する工程をさらに包含してもよい。なお、サンプル取得の第一段階として肝組織を被験体から直接取り出す工程は、医師によるものであり、本発明の範囲外である。 In the method according to this embodiment, the liver tissue sample is preferably a liver tissue obtained from a hepatitis C patient by biopsy (biopsy), but even a hepatocyte prepared from this liver tissue. Good. The method according to the present invention may further include a step of detecting a heterodimer composed of gp130 and OSMR in the liver tissue sample. In addition, the process of taking out liver tissue directly from a subject as the first stage of sample acquisition is performed by a doctor and is outside the scope of the present invention.
Ｃ型慢性肝炎患者のOSMの血中濃度とIFN−α治療の著効率との相関を検討することによって、IFN−α治療の効果を予想し得、治療計画（IFNの投与量、投与期間）に有用な情報を提供することが可能となる。すなわち、OSMの血中濃度の測定は、Ｃ型慢性肝炎患者の治療効果予測のための臨床検査として有用であり、大市場が期待される。 By investigating the correlation between the blood concentration of OSM in chronic hepatitis C patients and the remarkable efficiency of IFN-α treatment, the effects of IFN-α treatment can be predicted, and the treatment plan (IFN dose, administration period) It is possible to provide useful information. That is, the measurement of the OSM blood concentration is useful as a clinical test for predicting the therapeutic effect of chronic hepatitis C patients, and a large market is expected.
さらに、本発明は、IFN治療の有効性を予測するための測定キットを提供する。本発明に係る測定キットは、上述した方法を実践するに必要なツールを備えていることを特徴としている。 Furthermore, the present invention provides a measurement kit for predicting the effectiveness of IFN treatment. The measurement kit according to the present invention is characterized by including tools necessary for practicing the above-described method.
一実施形態において、本発明に係る測定キットは、Ｃ型肝炎患者に対するIFN治療の有効性を予測するために、被験体サンプル中に存在するOSMのレベルを測定するためのツールを備えている。OSMが機能を奏するためには所望の被験体（Ｃ型肝炎患者）の体内にOSMが存在していることが必要である。本実施形態における、OSMのレベルを測定するためのツールは、OSMタンパク質に対する抗体、あるいはOSM mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチドであり得る。上述したように、当業者は、OSMタンパク質に対する抗体、あるいはOSM mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチドを容易に入手または作製し得る。 In one embodiment, the measurement kit according to the present invention comprises a tool for measuring the level of OSM present in a subject sample in order to predict the effectiveness of IFN treatment for hepatitis C patients. In order for OSM to function, it is necessary for OSM to be present in the body of a desired subject (hepatitis C patient). In this embodiment, the tool for measuring the level of OSM may be an antibody against OSM protein or an oligonucleotide capable of detecting OSM mRNA. As described above, those skilled in the art can easily obtain or prepare an antibody against OSM protein or an oligonucleotide capable of detecting OSM mRNA.
他の実施形態において、本発明に係る測定キットは、Ｃ型肝炎患者に対するIFN治療の有効性を予測するために、被験体サンプル中に存在するgp130およびOSMRのレベルを測定するためのツールを備えている。OSMが機能を奏するためには所望の部位（Ｃ型肝炎患者）にOSMのレセプターが発現していることが必要である。本実施形態における、OSMのレベルを測定するためのツールは、gp130タンパク質に対する抗体およびOSMRタンパク質に対する抗体、あるいはgp130 mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチドおよびOSMR mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチドであり得る。上述したように、当業者は、gp130タンパク質に対する抗体およびOSMRタンパク質に対する抗体、あるいはgp130 mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチドおよびOSMR mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチドを容易に入手または作製し得る。 In another embodiment, the measurement kit according to the present invention comprises a tool for measuring the level of gp130 and OSMR present in a subject sample in order to predict the effectiveness of IFN treatment for hepatitis C patients. ing. In order for OSM to function, it is necessary that the OSM receptor is expressed at a desired site (hepatitis C patient). In this embodiment, the tool for measuring the level of OSM can be an antibody against gp130 protein and an antibody against OSMR protein, or an oligonucleotide capable of detecting gp130 mRNA and an oligonucleotide capable of detecting OSMR mRNA. As described above, those skilled in the art can easily obtain or prepare an antibody against gp130 protein and an antibody against OSMR protein, or an oligonucleotide capable of detecting gp130 mRNA and an oligonucleotide capable of detecting OSMR mRNA.
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications are possible within the scope shown in the claims, and embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. Is also included in the technical scope of the present invention.
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
〔１：試薬および手順〕
〔使用試薬〕
FLVはCalbiochem社より購入した。PTVは興和株式会社より購入した。IFN−αはSigma社より購入した。CsAはSigma社より購入した。OSMおよびIL-31はR&D systems社より購入した。LIFはChemicon社より購入した。IL-6はAcris Antibodies社より購入した。STAT1抗体およびSTAT3抗体はBD Bioscience社より、リン酸化STAT1(Tyr701)抗体およびリン酸化STAT3(Tyr705)抗体はCell Signal社より購入した。
[1: Reagents and procedures]
[Reagent used]
FLV was purchased from Calbiochem. PTV was purchased from Kowa Co., Ltd. IFN-α was purchased from Sigma. CsA was purchased from Sigma. OSM and IL-31 were purchased from R & D systems. LIF was purchased from Chemicon. IL-6 was purchased from Acris Antibodies. STAT1 antibody and STAT3 antibody were purchased from BD Bioscience, and phosphorylated STAT1 (Tyr701) antibody and phosphorylated STAT3 (Tyr705) antibody were purchased from Cell Signal.
〔Renilla luciferase活性の測定〕
２４ウエルプレートに播種したOR6細胞（2x104 個）を、３７℃で２４時間培養した。培地を、OSM (0, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ng/ml) を含む500μlの10% FBS含有DMEMに置換した。細胞を３７℃で７２時間培養した後、PBSで洗浄し、100μlのRenilla lysis buffer（Promega社）を用いて回収した。10μlのサンプルに50μlのRenilla assay buffer (Promega社) を加えてRenilla luciferase活性を測定した。全ての実験において、異なる３種類のサンプルより得られた結果より平均値、標準偏差を算出した。
(Measurement of Renilla luciferase activity)
OR6 cells (2 × 10 4 cells) seeded in a 24-well plate were cultured at 37 ° C. for 24 hours. The medium was replaced with 500 μl of DMEM containing 10% FBS containing OSM (0, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ng / ml). The cells were cultured at 37 ° C. for 72 hours, washed with PBS, and collected using 100 μl of Renilla lysis buffer (Promega). 50 μl of Renilla assay buffer (Promega) was added to 10 μl of sample, and Renilla luciferase activity was measured. In all experiments, an average value and a standard deviation were calculated from the results obtained from three different types of samples.
〔細胞増殖に対する影響〕
６ウエルプレートに播種したOR6細胞（8x104 個）を、３７℃で２４時間培養した。培地を、OSM(0, 2.5, 5, 10 ng/ml)を含む2 mlの10% FBS含有DMEMに置換した。細胞を３７℃で７２時間培養した後、PBSで洗浄し、0.25%トリプシン処理にて回収した細胞をトリパンブルーにて染色し、生細胞数を測定した。全ての実験において、異なる３種類のサンプルより得られた結果より平均値、標準偏差を算出した。
[Influence on cell proliferation]
OR6 cells (8 × 10 4 cells) seeded in a 6-well plate were cultured at 37 ° C. for 24 hours. The medium was replaced with 2 ml of 10% FBS-containing DMEM containing OSM (0, 2.5, 5, 10 ng / ml). The cells were cultured at 37 ° C. for 72 hours, washed with PBS, and the cells collected by treatment with 0.25% trypsin were stained with trypan blue, and the number of viable cells was measured. In all experiments, an average value and a standard deviation were calculated from the results obtained from three different types of samples.
〔ウエスタンブロット分析〕
６ウェルの細胞培養プレートで培養した細胞に、SDSを含むサンプルバッファー100μlを加えて、細胞溶解液を回収した。10分間超音波破砕機にてソニケイションを行った後、各サンプルに10μlの2-メルカプトエタノールを加え100℃で３分間処理した。10〜20μlのサンプルを10％のSDS-PAGEに供し、これをメンブレン（PVDF膜）に転写した。５％のスキムミルクを含む0.1% トリス緩衝液(10mM Tris (ph7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween20)で６０分間、タンパク質を転写したメンブレンをブロッキングした。その後、各HCVタンパク質に対する抗体およびβ-actinタンパク質に対する抗体を0.1% トリス緩衝液で１０００倍希釈した溶液と前記のメンブレンとを接触させ、６０分間反応を行った。メンブレンを0.1% トリス緩衝液にて５分×３回洗浄後、１０００倍希釈したHRP標識マウス二次抗体を加えた0.1% トリス緩衝液と接触させ、６０分間反応を行った。メンブレンを0.1% トリス緩衝液にて２０分×３回洗浄した。ルネッサンスTMルミノールウエスタンブロット化学発光検出試薬プラス（NEN Life Science）にて化学発光させ、Ｘ線フィルム（KODAK BioMax）で感光した。
[Western blot analysis]
100 μl of sample buffer containing SDS was added to cells cultured in a 6-well cell culture plate, and the cell lysate was collected. After sonication with an ultrasonic crusher for 10 minutes, 10 μl of 2-mercaptoethanol was added to each sample and treated at 100 ° C. for 3 minutes. 10-20 μl of the sample was subjected to 10% SDS-PAGE and transferred to a membrane (PVDF membrane). The membrane onto which the protein had been transferred was blocked with 0.1% Tris buffer solution (10 mM Tris (ph7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween20) containing 5% skim milk for 60 minutes. Thereafter, a solution obtained by diluting an antibody against each HCV protein and an antibody against β-actin protein 1000-fold with 0.1% Tris buffer was brought into contact with the membrane and reacted for 60 minutes. The membrane was washed with 0.1% Tris buffer for 5 minutes × 3 times, then contacted with 0.1% Tris buffer containing HRP-labeled mouse secondary antibody diluted 1000 times, and reacted for 60 minutes. The membrane was washed with 0.1% Tris buffer for 20 minutes × 3 times. Chemiluminescence was performed with Renaissance ™ Luminol Western Blot Chemiluminescence Detection Reagent Plus (NEN Life Science) and exposed to X-ray film (KODAK BioMax).
今回の実験で用いた抗体は、抗Core抗体（Institute of Immunology社）、抗E1抗体(東京都臨床研究所、小原博士より供与)、抗E2抗体（参考文献：Microbiol.Immunolo. 42,875-877,1998を参照）、抗NS3抗体（Novocastera Laboratories社）、抗NS4A抗体（大阪大学、高見沢博士より供与）、抗NS5A抗体（大阪大学、高見沢博士より供与）、抗NS5B抗体(東京都臨床研究所、小原博士より供与)、抗β-actin抗体(Sigma社)である。 The antibodies used in this experiment are anti-Core antibody (Institute of Immunology), anti-E1 antibody (provided by Tokyo Clinical Research Institute, Dr. Ohara), anti-E2 antibody (reference: Microbiol. Immunol. 42,875-877, 1998), anti-NS3 antibody (Novocastera Laboratories), anti-NS4A antibody (provided by Osaka University, Dr. Takamizawa), anti-NS5A antibody (provided by Osaka University, Dr. Takamizawa), anti-NS5B antibody (Tokyo Metropolitan Research Institute, This is an anti-β-actin antibody (Sigma).
〔2'-5' OAS遺伝子プロモーター活性の測定〕
２４ウエルプレートに播種したOR6c細胞（4x104 個）またはHCV-O/KEQP複製OR6c細胞（4x104個）を、３７℃で２４時間培養した。形質転換の効率を補正するためのpRL-SV40（１ウエルあたり1ng）を、Luciferase遺伝子の上流に2',5'-oligo(A) synthetase geneのプロモーター領域 (-159/+82)を導入したレポーターアッセイ用のプラスミド（pOAS-Luc；Benech et al., Molecular Cell Biology. 4498-4504(1987)参照）100ngと同時にFuGene6で導入した。３７℃で４２時間培養した後、OSM（0, 0.1, 1, 10 ng/ml）を細胞に添加した。OSM添加6時間後にサンプルを回収してDual Luciferase Assay (Promega社)を行った。OSMの各濃度に対して３つのサンプルから平均、標準偏差を求めた。
[Measurement of 2'-5 'OAS gene promoter activity]
OR6c cells ( 4 × 10 4 cells) or HCV-O / KEQP replicating OR6c cells ( 4 × 10 4 cells) seeded in a 24-well plate were cultured at 37 ° C. for 24 hours. PRL-SV40 (1 ng per well) was added to correct the transformation efficiency, and the 2 ', 5'-oligo (A) synthetase gene promoter region (-159 / + 82) was introduced upstream of the Luciferase gene. The plasmid for reporter assay (pOAS-Luc; see Benech et al., Molecular Cell Biology. 4498-4504 (1987)) was simultaneously introduced with FuGene6. After culturing at 37 ° C. for 42 hours, OSM (0, 0.1, 1, 10 ng / ml) was added to the cells. Samples were collected 6 hours after OSM addition and Dual Luciferase Assay (Promega) was performed. The average and standard deviation were obtained from three samples for each concentration of OSM.
〔STAT1およびSTAT3のリン酸化の検出〕
６ウエルプレートに播種したOR6細胞（2x105 個）を、３７℃で２４時間培養した。OSM（0.1, 1, 10 ng/ml）およびIFN−α（10 IU/ml）、あるいはOSM（10 ng/ml）およびIFN−α（10 IU/ml）をOR6細胞に添加し、30, 60, 120分間後にサンプルを回収した。リン酸化STAT-1(Y701)、STAT1、リン酸化STAT3(Y705)、STAT3に対する抗体を用いてウエスタンブロット解析をおこなった。
[Detection of STAT1 and STAT3 phosphorylation]
OR6 cells (2 × 10 5 cells) seeded in a 6-well plate were cultured at 37 ° C. for 24 hours. OSM (0.1, 1, 10 ng / ml) and IFN-α (10 IU / ml), or OSM (10 ng / ml) and IFN-α (10 IU / ml) are added to OR6 cells, 30, 60 Samples were collected after 120 minutes. Western blot analysis was performed using antibodies against phosphorylated STAT-1 (Y701), STAT1, phosphorylated STAT3 (Y705), and STAT3.
〔HCV-O/KEQPの作製〕
最初に、HCV陽性血清よりプラスミドpHCV-O（遺伝子型１ｂ型のHCV-O全長cDNAを含む。）を、２つのフラグメントを用いて構築した。２つのフラグメントとは、参考文献（N. Kato, et al., J.Gen.Virol. 79: 1859-1869 (1998).）に記載のpBR322/16-6に由来するEcoR I−Mlu Iフラグメント（HCVゲノムの45位〜2528位に相当する。）、および血清1B-2のPCR産物由来のMlu I−Spe Iフラグメント（HCVゲノムの2528位〜3420位に相当する。）である。これらを、1B-2R1配列を有するpNSS1RZ2RU（N. Kato, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 306: 756-766 (2003)を参照）のEcoR I−Spe I 部位に連結して、pHCV-Oを構築した。４つの適応変異Q1112R, P1115L, E1202G, K1609Gについては、QuickChange mutagenesis （Stratagene）を用いて、それぞれ、a3676g, c3685t, a3946g, a5166g (数字はHCVの１番目の塩基からの位置を、左は置換前の塩基、右は置換後の塩基を表す。)の塩基置換を生成して作製した。
(Preparation of HCV-O / KEQP)
First, a plasmid pHCV-O (including a full-length HCV-O cDNA of genotype 1b) was constructed from HCV positive sera using two fragments. The two fragments are EcoR I-Mlu I fragments derived from pBR322 / 16-6 described in the reference (N. Kato, et al., J. Gen. Virol. 79: 1859-1869 (1998)). (Corresponding to positions 45 to 2528 of the HCV genome), and Mlu I-Spe I fragment derived from the PCR product of serum 1B-2 (corresponding to positions 2528 to 3420 of the HCV genome). These are linked to the EcoR I-Spe I site of pNSS1RZ2RU (see N. Kato, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 306: 756-766 (2003)) having the 1B-2R1 sequence, pHCV-O was constructed. For the four adaptive mutations Q1112R, P1115L, E1202G, and K1609G, using QuickChange mutagenesis (Stratagene) And the right represents the base after substitution.).
〔1B-4株由来の全長HCV RNAを複製し得る細胞の作製〕
HCVキャリアー株である1B-4（1b遺伝子型）から作製したplasmid (p1B-4RN/C-5B)をそれぞれ鋳型としてin vitroで合成した、ルシフェラーゼ遺伝子を有する全長HCV RNA（10 μg）を、ORL8細胞からHCV RNAを排除した治癒細胞であるORL8c細胞（2 x 106個）にエレクロトポレーション法により導入した。p1B-4RN/C-5Bには２カ所の変異（Q1067RおよびS2200R）が導入されている。S2200Rは適応変異である。RNA導入２日後から、4日ごとにG418(0.3 mg/ml)を含む培地と交換して、３週間程度培養した。ルシフェラーゼ遺伝子を有する全長HCV RNAの複製が持続的に高いレベルにあると考えられる細胞をG418耐性コロニー（クローン）として得た。これらのクローンからHCV RNAの複製レベルが高い細胞クローンを選択する目的で、コアタンパク質およびNS5Aタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。HCVタンパク質が最も多く発現していた細胞クローンを増殖させかつ株化し、p1B-4RN/C-5B細胞を得た。
[Production of cells capable of replicating full-length HCV RNA derived from strain 1B-4]
Full-length HCV RNA (10 μg) with luciferase gene synthesized in vitro using plasmid (p1B-4RN / C-5B) prepared from HCV carrier strain 1B-4 (1b genotype), respectively, as ORL8 The cells were introduced by electroporation into ORL8c cells (2 × 10 6 cells), which are healing cells in which HCV RNA was excluded from the cells. Two mutations (Q1067R and S2200R) have been introduced into p1B-4RN / C-5B. S2200R is an adaptive mutation. Two days after RNA introduction, the medium was replaced with a medium containing G418 (0.3 mg / ml) every 4 days and cultured for about 3 weeks. Cells considered to have a continuously high level of full-length HCV RNA replication having a luciferase gene were obtained as G418-resistant colonies (clones). In order to select cell clones with high HCV RNA replication levels from these clones, the expression levels of the core protein and NS5A protein were analyzed by Western blotting. Cell clones that expressed the highest amount of HCV protein were grown and established to obtain p1B-4RN / C-5B cells.
〔プラスミドp1B-4RN/C-5Bの作製〕
ISOGEN-LS (ニッポンジーン社)を用いてHCV (1B-4株)陽性血清からRNAを抽出し、RT-PCR法によってNS3（SpeI site:3474位）〜NS5B（BsiWI site: 9185位）の非構造領域、および5' UTR（5’側にAsisI を付加: １位）〜NS3（SpeI site: 3474位）の構造領域のフラグメントを作製した。pON/3-5BのSpeI site〜BsiWI siteの非構造領域を、上記1B-4の非構造領域と置換してp1B-4N/3-5Bを作製した。次いで、p1B-4N/3-5Bの5' UTR（AsisI site）〜NeoおよびEMCV-IRESを含むNS3（SpeI site）を切り出し、上記1B-4の構造領域と置換してp1B-4を作製した。さらに、pORN/C-5BのCore（ClaI site: 708位）〜3' UTR末端（XbaI site:9587位）を切り出し、p1B-4のCore（ClaI site）〜3' UTR末端（XbaI site）と置換してp1B-4RN/C-5Bを作製した。
(Preparation of plasmid p1B-4RN / C-5B)
RNA is extracted from HCV (1B-4 strain) positive serum using ISOGEN-LS (Nippon Gene), and non-structure of NS3 (SpeI site: position 3474) to NS5B (BsiWI site: position 9185) by RT-PCR Fragments of the region and the structural region from 5 ′ UTR (AsisI added to the 5 ′ side: 1st position) to NS3 (SpeI site: 3474th position) were prepared. p1B-4N / 3-5B was prepared by replacing the non-structural region of SpeI site to BsiWI site of pON / 3-5B with the non-structural region of 1B-4. Next, p1B-4N / 3-5B 5 'UTR (AsisI site) to NS3 (SpeI site) containing Neo and EMCV-IRES were excised and replaced with the structural region of 1B-4 to create p1B-4 . Furthermore, pORN / C-5B Core (ClaI site: position 708) ~ 3 'UTR end (XbaI site: position 9587) was cut out, p1B-4 Core (ClaI site) ~ 3' UTR end (XbaI site) and P1B-4RN / C-5B was prepared by substitution.
〔２：OSMのOR6細胞における抗HCV活性〕
HCV RNA複製に対するOSMの効果について、OR6細胞のRenilla luciferase活性を測定することによって検討した。図１の（ａ）に示すように、OR6細胞のluciferase活性はOSMの濃度依存的に抑制されることがわかった。OSMを添加していないコントロールのluciferase活性（RLU）を100%とした。これにより、OSMは抗HCV活性を有するサイトカインであり、濃度依存的にHCV RNAの複製を抑制することが示された。HCV RNA 50%抑制濃度 (EC50)は0.71 ng/mlであった。
[2: Anti-HCV activity of OSM in OR6 cells]
The effect of OSM on HCV RNA replication was examined by measuring Renilla luciferase activity in OR6 cells. As shown in FIG. 1 (a), it was found that the luciferase activity of OR6 cells was suppressed depending on the concentration of OSM. The luciferase activity (RLU) of the control not added with OSM was defined as 100%. Thus, it was shown that OSM is a cytokine having anti-HCV activity and suppresses HCV RNA replication in a concentration-dependent manner. The HCV RNA 50% inhibitory concentration (EC 50 ) was 0.71 ng / ml.
〔３：OSMのOR6細胞増殖に対する影響〕
OSMの細胞増殖に及ぼす影響について検討した。図１の（ｂ）に示すように、OSMで処理した細胞数はコントロールのものと変わらなかった。OSMを添加していないコントロールの生細胞数を100%とした。このように、OSMの濃度が少なくとも10 ng/ml以下の場合、OSMはOR6細胞に対する細胞増殖に影響を与えないことがわかった。すなわち、図１の（ａ）で示した4 ng/ml以下の濃度におけるOSMによるHCV RNA複製の抑制は、細胞増殖の抑制ではなくウイルスに対する抑制効果であることがわかった。
[3: Effect of OSM on OR6 cell proliferation]
The effect of OSM on cell proliferation was examined. As shown in FIG. 1 (b), the number of cells treated with OSM was the same as that of the control. The number of viable cells in the control without addition of OSM was taken as 100%. Thus, it was found that when the concentration of OSM was at least 10 ng / ml or less, OSM did not affect cell growth on OR6 cells. That is, it was found that suppression of HCV RNA replication by OSM at a concentration of 4 ng / ml or less shown in (a) of FIG. 1 is not a suppression of cell proliferation but an inhibitory effect on viruses.
続いて、OSMの抗HCV活性がIL-6ファミリーのサイトカインに共通する効果であるかどうかを検討した。IL-6ファミリーに属しOSM同様、抗腫瘍効果を有するLeukemia-inhibitory factor (LIF)では、その濃度を20 ng/mlまで増加しても全く抗HCV活性が認められなかった（図２の（ａ））。また、IL-6では、その濃度が1または10 ng/mlの場合に弱い抗HCV活性が認められたものの、1 ng/ml未満の濃度ではOSMのようなHCV RNA複製の抑制効果は認められなかった（図２の（ｂ））。このように、OSMの抗HCV活性はIL-6ファミリーに属するサイトカインに共通して認められる効果ではなくOSMに特有の効果であることがわかった。 Subsequently, it was examined whether the anti-HCV activity of OSM is an effect common to IL-6 family cytokines. Like leukemia-inhibitory factor (LIF), which belongs to the IL-6 family and has antitumor effects, no anti-HCV activity was observed even when the concentration was increased to 20 ng / ml ((a in FIG. 2). )). In IL-6, weak anti-HCV activity was observed when the concentration was 1 or 10 ng / ml, but at a concentration of less than 1 ng / ml, an inhibitory effect on HCV RNA replication such as OSM was observed. There was not ((b) of FIG. 2). Thus, it was found that the anti-HCV activity of OSM is not an effect commonly observed in cytokines belonging to the IL-6 family, but an effect specific to OSM.
さらに、OSMの抗HCV活性が、OSM受容体を構成するOSMRに関連する効果であるかどうかを検討した。OSMの受容体はgp130とOSMRとのヘテロダイマーから構成される。このOSMRを受容体複合体に含むサイトカインとして、その受容体がOMSRとIL-31Rとのヘテロダイマーから構成されているIL-31が知られている。なお、IL-31はIL-6ファミリーに属さない。図２の（ｃ）に示すように、IL-31ではその濃度を10 ng/mlまで増加させても全く抗HCV活性が認められなかった。このことは、抗HCV活性の発揮には、OSMRが受容体複合体に含まれているだけでは不十分であり、gp130とOSMRとのヘテロダイマーが重要であるということを示唆する。 Furthermore, we examined whether the anti-HCV activity of OSM is an effect related to OSMR that constitutes the OSM receptor. The OSM receptor is composed of a heterodimer of gp130 and OSMR. As a cytokine containing this OSMR in a receptor complex, IL-31, whose receptor is composed of a heterodimer of OMSR and IL-31R, is known. IL-31 does not belong to the IL-6 family. As shown in FIG. 2 (c), IL-31 showed no anti-HCV activity even when its concentration was increased to 10 ng / ml. This suggests that the presence of OSMR in the receptor complex is insufficient for exerting anti-HCV activity, and that the heterodimer of gp130 and OSMR is important.
〔４：肝細胞における受容体mRNAの発現〕
肝細胞におけるgp130, OSMR, LIFR, IL-6R, IL-31RのmRNAの発現レベルを標準的なRT-PCR法を用いて検討した。インターナルコントロールとしてはGAPDHを測定した。各受容体に対するRT-PCRの逆転写反応ではOligo-dT primerを用い、PCRには以下のSense primerおよびAntisense primerの組合せを用いた。
gp130: 5'- agaacagcatccagtgtcac -3' （配列番号７）
gp130r: 5'- tccaagttgaggcatctttgg -3' （配列番号８）
OSMR: 5'- ggaatgtgccacacactttg -3' （配列番号９）
OSMRr: 5'- cttgaagtcctcggtttcac -3' （配列番号１０）
LIFR: 5'- gaaagcaccctctggaacag -3' （配列番号１１）
LIFRr: 5'- tcactccactcttcgagacc -3' （配列番号１２）
IL-6R: 5'- aggaagtttcagaacagtccg -3' （配列番号１３）
IL-6Rr: 5'- actcctggattctgtccaag -3' （配列番号１４）
IL31RA: 5'- ttaacctgcacttggagtcc -3' （配列番号１５）
IL31RAr: 5'- cttcttcctcagtcattccc -3' （配列番号１６）
IFN−α処理によってOR6細胞からHCV RNAを排除した治癒細胞（OR6c細胞）、ORL8細胞からHCV RNAを排除した治癒細胞（ORL8c細胞）、およびヒト不死化肝細胞であるPH5CH8細胞を用いた。ORL8細胞については後述を参照のこと。図３に示すように、gp130はいずれの細胞においても同レベルで検出された。OSMRおよびLIFRの発現レベルは、OR6c細胞およびPH5CH8細胞と比較してORL8c細胞でやや低かった。IL-6Rの発現レベルは、ORL8c細胞およびPH5CH8細胞と比較してOR6c細胞でやや低かった。IL-31Rは今回検討した細胞のいずれでも検出されなかった。IL-31に抗HCV活性が認められなかった理由として、肝細胞ではIL-31Rが発現していないことが考えられた。
[4: Expression of receptor mRNA in hepatocytes]
The expression levels of gp130, OSMR, LIFR, IL-6R and IL-31R mRNA in hepatocytes were examined using standard RT-PCR. GAPDH was measured as an internal control. In the reverse transcription reaction of RT-PCR for each receptor, Oligo-dT primer was used, and the following combinations of Sense primer and Antisense primer were used for PCR.
gp130: 5'-agagagcatccagtgtcac-3 '(SEQ ID NO: 7)
gp130r: 5'- tccaagttgaggcatctttgg -3 '(SEQ ID NO: 8)
OSMR: 5'-ggaatgtgccacacactttg-3 '(SEQ ID NO: 9)
OSMRr: 5'-cttgaagtcctcggtttcac-3 '(SEQ ID NO: 10)
LIFR: 5'- gaaagcaccctctggaacag -3 '(SEQ ID NO: 11)
LIFRr: 5'- tcactccactcttcgagacc -3 '(SEQ ID NO: 12)
IL-6R: 5'- aggaagtttcagaacagtccg -3 '(SEQ ID NO: 13)
IL-6Rr: 5'-actcctggattctgtccaag-3 '(SEQ ID NO: 14)
IL31RA: 5'-ttaacctgcacttggagtcc-3 '(SEQ ID NO: 15)
IL31RAr: 5'-cttcttcctcagtcattccc-3 '(SEQ ID NO: 16)
Healing cells (OR6c cells) in which HCV RNA was excluded from OR6 cells by IFN-α treatment, healing cells (ORL8c cells) in which HCV RNA was excluded from ORL8 cells, and PH5CH8 cells that were human immortalized hepatocytes were used. See below for ORL8 cells. As shown in FIG. 3, gp130 was detected at the same level in all cells. OSMR and LIFR expression levels were slightly lower in ORL8c cells compared to OR6c and PH5CH8 cells. The expression level of IL-6R was slightly lower in OR6c cells compared to ORL8c cells and PH5CH8 cells. IL-31R was not detected in any of the cells examined this time. It was considered that IL-31R was not expressed in hepatocytes as a reason why IL-31 did not have anti-HCV activity.
〔５：OSM処理によるHCV複製の経時的変化〕
OR6細胞をOSM（0, 0.1, 1, 10 ng/ml）で処理した24, 48, 72, 96時間後のHCV RNA複製レベルを調べた。図４の（ａ）に示すように、OSMで処理していないコントロールのOR6細胞ではHCV RNAの複製は経時的に増加し、96時間後では24時間後の約5.5倍に増加した。しかし、OSMで処理したOR6ではOSMの濃度依存的にHCV RNA複製が抑制されており、OSM 10 ng/mlでは24時間後のHCV RNA複製レベルと96時間後のHCV RNA複製レベルがほぼ同一であり、強い抑制効果が持続していることがわかった。
[5: HCV replication over time by OSM treatment]
HCV RNA replication levels were examined 24, 48, 72, and 96 hours after treatment of OR6 cells with OSM (0, 0.1, 1, 10 ng / ml). As shown in FIG. 4 (a), HCV RNA replication increased with time in control OR6 cells not treated with OSM, and after 96 hours increased approximately 5.5-fold after 24 hours. However, OR6 treated with OSM suppressed HCV RNA replication in an OSM concentration-dependent manner, and at OSM 10 ng / ml, the HCV RNA replication level after 24 hours was almost the same as the HCV RNA replication level after 96 hours. It was found that the strong suppression effect was sustained.
同じ実験結果を別のグラフで表現したものが図４の（ｂ）である。OSM 0.1 ng/mlでは時間経過とともにコントロールに対する抑制効果は減弱していた。OSM 1 ng/mlでは時間が経過してもにコントロールに対する抑制効果ほぼ変わらなかった。OSM 10 ng/mlでは時間経過とともにコントロールに対する抑制効果は増強し96時間でもっとも強い抑制効果（約８０％抑制）示した。以上の結果はOSMの抗HCV活性が一過性のものではなく持続的であることを示している。 FIG. 4B shows the same experimental result expressed in another graph. With OSM 0.1 ng / ml, the inhibitory effect on the control decreased with time. With OSM 1 ng / ml, the inhibitory effect on the control was almost unchanged over time. With OSM 10 ng / ml, the inhibitory effect on the control increased with time and showed the strongest inhibitory effect (approximately 80% inhibition) at 96 hours. These results indicate that the anti-HCV activity of OSM is persistent rather than transient.
〔６：IFN−αの抗HCV活性に対するOSMの効果〕
OSM添加による抗HCV活性が９６時間まで維持されていることがわかったので、次いで、OSM添加後にさらに長時間経過したときの抗HCV活性を調べた。この実験では、外来性遺伝子を含まない本来の9.6kbの全長HCV-O RNAが複製するOR6c細胞を用いた。HCV-Oには、複製効率を増強させる４つの適応変異（K1609E, E1202G, Q1112R, P1115L）を導入している。６ウエルプレートに播種したOR6c細胞（104個）を、３７℃で２４時間培養した。OSM（0, 1, 10 ng/ml）を添加した細胞を、さらに３７℃で8日間培養した。HCVタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット解析により検討した。
[6: Effect of OSM on anti-HCV activity of IFN-α]
Since it was found that the anti-HCV activity by the addition of OSM was maintained for up to 96 hours, the anti-HCV activity was examined when a longer time had elapsed after the addition of OSM. In this experiment, OR6c cells in which the original 9.6 kb full-length HCV-O RNA that does not contain a foreign gene replicates were used. Four adaptive mutations (K1609E, E1202G, Q1112R, P1115L) that enhance replication efficiency are introduced into HCV-O. OR6c cells (10 4 cells) seeded in a 6-well plate were cultured at 37 ° C. for 24 hours. Cells supplemented with OSM (0, 1, 10 ng / ml) were further cultured at 37 ° C. for 8 days. The expression level of HCV protein was examined by Western blot analysis.
図５の（ａ）に示すようにOSM処理後８日目の細胞では、OSMの濃度依存的にHCVタンパク質の発現が抑制されていた（レーン１，２，３）。このことは、１回のOSMの抗HCV活性が８日後も維持されていることを示している。また、本実験で用いたHCV RNAには外来性遺伝子が含まれていないので、OSMの抗HCV活性が外来性遺伝子（Renilla luciferase, EMCVなど）の抑制ではなくHCV自体に対する抑制効果であることが示された。 As shown in FIG. 5 (a), HCV protein expression was suppressed depending on the OSM concentration in the cells on the 8th day after the OSM treatment (lanes 1, 2 and 3). This indicates that the anti-HCV activity of one OSM is maintained even after 8 days. In addition, since the HCV RNA used in this experiment does not contain foreign genes, the anti-HCV activity of OSM is not a suppression of foreign genes (Renilla luciferase, EMCV, etc.) but an inhibitory effect on HCV itself. Indicated.
OSM (0, 1, 10 ng/ml)をIFN−α(2.5, 5, 10 IU/ml)とともに添加した。いずれの濃度のIFN−αにおいてもOSMはIFN−αの抗HCV活性を増強した（レーン４〜１２）。このように、OSMは外来性遺伝子を含まないHCV-O RNAの複製を濃度依存的に抑制し、IFN−αの抗HCV活性を増強することがわかった。 OSM (0, 1, 10 ng / ml) was added along with IFN-α (2.5, 5, 10 IU / ml). At any concentration of IFN-α, OSM enhanced the anti-HCV activity of IFN-α (lanes 4-12). Thus, it was found that OSM suppresses replication of HCV-O RNA containing no foreign gene in a concentration-dependent manner and enhances the anti-HCV activity of IFN-α.
OR6細胞を用いて、IFN−αの抗HCV活性に対するOSMの効果をさらに検討した（図５の（ｂ））。IFN−α（0, 2.5, 5, 10 IU/ml）とともにOSM（0, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ng/ml）を添加した。OSMは低濃度であってもIFN−αの抗HCV活性を増強した。 The effect of OSM on the anti-HCV activity of IFN-α was further examined using OR6 cells (FIG. 5 (b)). OSM (0, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ng / ml) was added together with IFN-α (0, 2.5, 5, 10 IU / ml). OSM enhanced the anti-HCV activity of IFN-α even at low concentrations.
IFN−α 2.5 IU/mlおよびOSM 0.062 ng/mlを単独で投与した場合のルシフェラーゼ値は、それぞれコントロール値の38.8%および81.7%である。よって、IFN−α 2.5 IU/mlとOSM 0.062 ng/mlとを併用した時のルシフェラーゼ値の予測値は0.388x0.817=0.317である。しかし、これらを併用した時のルシフェラーゼ値の実測値は22.6%であり、予想以上の抑制効果であった。このことは、IFN−αの抗HCV活性に対するOSMの増強効果は相乗的な効果であることを示しており、低濃度のOSMであってもその効果を発揮することを示している。 The luciferase values when IFN-α 2.5 IU / ml and OSM 0.062 ng / ml are administered alone are 38.8% and 81.7% of the control values, respectively. Therefore, the predicted value of the luciferase value when IFN-α 2.5 IU / ml and OSM 0.062 ng / ml are used in combination is 0.388 × 0.817 = 0.317. However, when these were used in combination, the actual measurement value of luciferase was 22.6%, which was an unexpected suppression effect. This indicates that the enhancement effect of OSM on the anti-HCV activity of IFN-α is a synergistic effect, and this effect is exhibited even with a low concentration of OSM.
〔７：IFN−α誘導性の2'-5' OAS遺伝子プロモーター活性に対するOSMの影響〕
IFN−αの抗HCV活性に対するOSMによる増強をさらに検討するために、IFN−α刺激で誘導される2'-5' OAS遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼの上流に含むプラスミド(pOAS-Luc)を用いた。図６の（ａ）にはOSMで処理していないコントロールを１として2'-5' OAS遺伝子プロモーター活性の増加を示してある。2'-5' OAS遺伝子プロモーター活性はOSMの濃度依存的に増加することがわかった。
[7: Effect of OSM on IFN-α-inducible 2'-5 'OAS gene promoter activity]
To further investigate the enhancement of IFN-α by anti-HCV activity by OSM, a plasmid (pOAS-Luc) containing 2′-5 ′ OAS gene promoter region induced by IFN-α stimulation upstream of luciferase was used. It was. FIG. 6 (a) shows an increase in the 2′-5 ′ OAS gene promoter activity, assuming that the control not treated with OSM is 1. The 2'-5 'OAS gene promoter activity was found to increase in an OSM concentration-dependent manner.
次いで、IFN−α（0, 2.5, 5, 10 IU/ml）とともにOSM（0, 0.1, 1, 10 ng/ml）を添加した時の2'-5' OAS遺伝子プロモーター活性について検討した。図６の（ｂ）に示すように、OSMは、IFN−αの2'-5' OAS遺伝子プロモーター活性刺激を濃度依存的に増強させる効果があることがわかった。 Subsequently, the 2′-5 ′ OAS gene promoter activity was examined when OSM (0, 0.1, 1, 10 ng / ml) was added together with IFN-α (0, 2.5, 5, 10 IU / ml). As shown in FIG. 6 (b), it was found that OSM had an effect of enhancing the stimulation of IFN-α 2′-5 ′ OAS gene promoter activity in a concentration-dependent manner.
〔８：OSM によるSTAT1およびSTAT3のリン酸化〕
OSMがSTAT1, STAT3をリン酸化して活性化することが知られている。そこで、HCV RNAの複製が可能なOR6細胞においてSTAT1およびSTAT3がリン酸化されるかどうかを調べた。図７に示すように、OSMで３０分間刺激した細胞において、STAT1はOSMの濃度依存的にリン酸化された。STAT1のリン酸化は、OSMでの６０分間の刺激で減弱し、１２０分間の刺激でさらに減弱した。IFN−α（10 IU/ml）で３０分間刺激した細胞におけるSTAT1リン酸化の強度はOSM（0.1 ng/ml）と同程度であったが、６０分間または１２０分間の刺激の場合に、OSMでの刺激の際にはSTAT1のリン酸化の強度が減弱するが、IFN−αでの刺激の際にはSTAT1のリン酸化は維持されていた。STAT3はOSMの濃度依存的にリン酸化された。これらの結果より、OR6細胞においてSTAT1およびSTAT3がリン酸化することが確認できた。また、STAT1のリン酸化はIFN−α刺激の場合と比べてOSM刺激の場合には早期にリン酸化の効果が減弱することがわかった。
[8: Phosphorylation of STAT1 and STAT3 by OSM]
It is known that OSM phosphorylates and activates STAT1 and STAT3. Therefore, it was examined whether STAT1 and STAT3 were phosphorylated in OR6 cells capable of replicating HCV RNA. As shown in FIG. 7, STAT1 was phosphorylated in an OSM concentration-dependent manner in cells stimulated with OSM for 30 minutes. STAT1 phosphorylation was attenuated by 60 minutes stimulation with OSM and further attenuated by stimulation for 120 minutes. The intensity of STAT1 phosphorylation in cells stimulated with IFN-α (10 IU / ml) for 30 minutes was similar to that of OSM (0.1 ng / ml), but in the case of stimulation for 60 minutes or 120 minutes, The intensity of phosphorylation of STAT1 was attenuated upon stimulation with STAT1, but phosphorylation of STAT1 was maintained upon stimulation with IFN-α. STAT3 was phosphorylated in an OSM concentration-dependent manner. From these results, it was confirmed that STAT1 and STAT3 were phosphorylated in OR6 cells. It was also found that phosphorylation of STAT1 attenuated the phosphorylation effect earlier in the case of OSM stimulation than in the case of IFN-α stimulation.
〔９：OSMおよびIFN−αの抗HCV活性における関係〕
OSMおよびIFN−αの抗HCV活性における関係について、７０％抑制濃度（EC70）に対するIsobole plots解析を行った。Isobole plots (EC70)解析では、試薬１と試薬２の濃度を変えて７０％抑制を示す濃度をグラフ上にプロットし、図８の（ａ）に示すように試薬１および試薬２単独での７０％抑制濃度を結んだ直線上に併用時のプロットが一致すれば相加効果となる。直線よりも併用時のプロット曲線が右上（上に凸）ならば相反効果となり、直線よりも併用時のプロット曲線が左下（下に凸）ならば相乗効果となる。図８の（ｂ）に示すようにOSMとIFN−αとの70%抑制曲線は左下（下に凸）に位置した曲線を描いており、OSMおよびIFN−αの抗HCV活性における関係が非常に強い相乗効果であることが示された。
[9: Relationship between OSM and IFN-α in anti-HCV activity]
Isobole plots analysis was performed with respect to the anti-HCV activity of OSM and IFN-α with respect to 70% inhibitory concentration (EC 70 ). In the Isobole plots (EC 70 ) analysis, the concentration of 70% inhibition was plotted on the graph by changing the concentrations of Reagent 1 and Reagent 2, and as shown in FIG. If the plots at the time of combined use match on a straight line connecting 70% inhibitory concentrations, an additive effect is obtained. If the plot curve when combined with the upper right (convex upward) than the straight line is a reciprocal effect, and if the plot curve when combined with the lower left (convex downward) than the straight line, a synergistic effect is obtained. As shown in FIG. 8 (b), the 70% inhibition curve between OSM and IFN-α is a curve located in the lower left (convex downward), and the relationship between the anti-HCV activity of OSM and IFN-α is very high. It was shown to be a strong synergistic effect.
〔１０：低濃度のOSMによる、IFN−αの抗HCV活性に対する影響〕
OSMの血中濃度に関する報告は少なく、肝炎患者に関するものは報告されていない。Multiple myeloma の患者におけるOSMの血中濃度は0-52 pg/mlであることが報告されている（Wierzbowska et al. British Journal of Hematology, 1999）。持続的な炎症のあるＣ型肝炎患者では、血中OSM濃度がこの値よりも高い可能性があるが、生理的な血中濃度が50 pg/ml以下であると考えて、IFN−αの抗HCV活性に対するOSMの影響を、50 pg/ml以下のOSM濃度にて調べた。IFN−α（0, 1, 2, 4, 8 IU/ml）およびOSM（0, 25, 50 pg/ml）を同時に添加して９６時間後に評価した。図９の（ａ）に示すように、OSM（25, 50 pg/ml）単独の抗HCV活性は約２０％程度の抑制効果であるが、このような低濃度のOSM であってもIFN−αの抗HCV活性を増強することがわかった。図９の（ｂ）には、IFN−α単独での抗HCV活性を100%とした時の、各濃度のOSMによるIFN−αの抗HCV活性の増強を示している。IFN−α（8 IU/ml）にOSM（25, 50 pg/ml）を併用した場合、IFN−αの抗HCV活性がさらに60%増強されていた。このように、単独では弱い抗HCV活性しか示さないような低濃度のOSMであってもIFN−αの抗HCV活性を相乗的に増強することがわかった。
[10: Effect of IFN-α on anti-HCV activity by low concentration of OSM]
There are few reports on blood levels of OSM, and no reports on hepatitis patients. The blood concentration of OSM in patients with multiple myeloma has been reported to be 0-52 pg / ml (Wierzbowska et al. British Journal of Hematology, 1999). In patients with hepatitis C with persistent inflammation, blood OSM levels may be higher than this value, but IFN-α is considered to be physiologically less than 50 pg / ml. The effect of OSM on anti-HCV activity was examined at an OSM concentration of 50 pg / ml or less. IFN-α (0, 1, 2, 4, 8 IU / ml) and OSM (0, 25, 50 pg / ml) were added simultaneously and evaluated 96 hours later. As shown in FIG. 9 (a), the anti-HCV activity of OSM (25, 50 pg / ml) alone has an inhibitory effect of about 20%, but even with such a low concentration of OSM, IFN- It was found to enhance the anti-HCV activity of α. FIG. 9 (b) shows the enhancement of the anti-HCV activity of IFN-α by each concentration of OSM when the anti-HCV activity of IFN-α alone is taken as 100%. When OSM (25, 50 pg / ml) was used in combination with IFN-α (8 IU / ml), the anti-HCV activity of IFN-α was further enhanced by 60%. Thus, it was found that even with a low concentration of OSM that shows only weak anti-HCV activity alone, the anti-HCV activity of IFN-α is synergistically enhanced.
これらの結果は、例え微量であっても血中OSMがＣ型慢性肝炎患者に対するIFN−α療法を改善し得ることや、Ｃ型慢性肝炎患者に対するIFN−α療法の効果がOSMの血中濃度に依存していることを示唆する。また、肝臓ではKuppfer細胞がOSMを産生しているので、局所（肝臓）では血中濃度よりも高い濃度でOSMが存在している可能性も考えられ、IFN治療効果予測のマーカーとしてOSMが重要であることもまた示唆される。 These results show that blood OSM can improve IFN-α therapy for patients with chronic hepatitis C, even if the amount is small, and the effect of IFN-α therapy for patients with chronic hepatitis C is the blood concentration of OSM. Suggests that it depends on In addition, since Kuppfer cells produce OSM in the liver, there is a possibility that OSM is present at a concentration higher than the blood concentration in the local area (liver), and OSM is important as a marker for predicting IFN treatment effects. It is also suggested that.
〔１１：CsAおよびPTVの抗HCV活性に対するOSMの効果〕
CsAおよびPTVが抗HCV活性を示す物質であることを示す報告がなされている。これらの物質の抗HCV活性に対するOSMの影響について検討した。CsA（0, 0.25, 0.5, 1μg/ml）またはPTV（0, 0.25, 0.5, 1 μM）とともにOSM（10 ng/ml）を細胞に添加した。図１０に示すようにOSMはCsA（（ａ））およびPTV（（ｂ））の抗HCV活性を増強した。このように、OSMが現在のＣ型慢性肝炎に対する標準的治療剤であるIFN−α以外の候補として見出されている物質の抗HCV活性も増強することがわかった。
[11: Effect of OSM on anti-HCV activity of CsA and PTV]
There have been reports that CsA and PTV are substances that exhibit anti-HCV activity. The effect of OSM on the anti-HCV activity of these substances was investigated. OSM (10 ng / ml) was added to the cells along with CsA (0, 0.25, 0.5, 1 μg / ml) or PTV (0, 0.25, 0.5, 1 μM). As shown in FIG. 10, OSM enhanced the anti-HCV activity of CsA ((a)) and PTV ((b)). Thus, it was found that OSM also enhances the anti-HCV activity of substances found as candidates other than IFN-α, which is the current standard treatment for chronic hepatitis C.
〔１２：全長HCV RNAを複製し得る細胞（1B-4RN/C-5B細胞）を用いた、OSMの抗HCV活性〕
これまで示した結果は、HCV-O株由来の全長HCV RNAを複製し得る細胞を用いたものであった。ルシフェラーゼ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を有する全長HCV RNA複製細胞は本発明者らのOR6細胞のみであったので、HCV-O株以外のHCV株を用いた検討は不可能であった。しかし、本発明者らは、1B-4株に由来する全長HCV RNA（Renilla luciferase 遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子およびEMCV IRES遺伝子を含む約12kbのHCV遺伝子）をOR6c細胞に首尾よく導入し得ることを見出し、1B-4株に由来する全長HCV RNA（1B-4RN/C-5B RNA）を複製し得る細胞（1B-4RN/C-5B細胞）を樹立した。
[12: Anti-HCV activity of OSM using cells capable of replicating full length HCV RNA (1B-4RN / C-5B cells)]
The results shown so far were obtained using cells capable of replicating full-length HCV RNA derived from the HCV-O strain. Since the full length HCV RNA replicating cells having the luciferase gene and neomycin resistance gene were only the OR6 cells of the present inventors, it was impossible to examine using HCV strains other than the HCV-O strain. However, the present inventors have found that full-length HCV RNA (approximately 12 kb HCV gene including Renilla luciferase gene, neomycin resistance gene and EMCV IRES gene) derived from strain 1B-4 can be successfully introduced into OR6c cells. Then, cells (1B-4RN / C-5B cells) capable of replicating full-length HCV RNA (1B-4RN / C-5B RNA) derived from the 1B-4 strain were established.
1B-4RN/C-5B細胞を用いて図１の場合と同じ条件でOSMの抗HCV活性について検討した。図１１に示すようにOSMはHCV RNA複製を濃度依存的に抑制した（EC50：0.83 ng/ml）。このように、HCV-O株以外のHCV株である1B-4株においてもOSMの抗HCV活性を示すことができた。 The anti-HCV activity of OSM was examined using 1B-4RN / C-5B cells under the same conditions as in FIG. As shown in FIG. 11, OSM suppressed HCV RNA replication in a concentration-dependent manner (EC 50 : 0.83 ng / ml). Thus, the anti-HCV activity of OSM could also be shown in the 1B-4 strain, which is an HCV strain other than the HCV-O strain.
〔１３：1B-4RN/C-5B細胞におけるIFN−αおよびFLVの抗HCV活性、ならびにこれらの効果に対するOSMの影響〕
IFN−α（0, 2.5, 5, 10 IU/ml）とともにOSM（0, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1,2,4 ng/ml）を1B-4RN/C-5B細胞に添加した時の、IFN−αの抗HCV活性について検討した。図１２の（ａ）に示すように、1B-4株由来のHCV株であってもOSMはIFN−αの効果を濃度依存的に増強することがわかった。FLV（0, 1.25, 2.5. 5 μM）とともにOSM（10 ng/ml）を1B-4RN/C-5B細胞に添加した時の、FLVの抗HCV活性について検討した。図１２の（ｂ）に示すように、OSMはFLVの抗HCV活性を増強した。このことは、臨床での有用性が明らかとなったFLVに対してもOSMは増強効果を有することを示している。
[13: Anti-HCV activity of IFN-α and FLV in 1B-4RN / C-5B cells and the effect of OSM on these effects]
When OSM (0, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1,2,4 ng / ml) is added to 1B-4RN / C-5B cells along with IFN-α (0, 2.5, 5, 10 IU / ml) The anti-HCV activity of IFN-α was examined. As shown in FIG. 12 (a), it was found that OSM enhanced the effect of IFN-α in a concentration-dependent manner even in the HCV strain derived from the 1B-4 strain. The anti-HCV activity of FLV was examined when OSM (10 ng / ml) was added to 1B-4RN / C-5B cells together with FLV (0, 1.25, 2.5.5 μM). As shown in FIG. 12 (b), OSM enhanced the anti-HCV activity of FLV. This indicates that OSM has an enhancing effect on FLV whose clinical usefulness has been clarified.
〔１４：HuH-7細胞株以外の細胞に由来する全長HCV RNA複製細胞〕
本発明者らは、HuH-7細胞株由来のHCV生活環再現システムに匹敵する能力を有する、HuH-7細胞株以外の細胞株に由来するHCV生活環再現システムを構築している（本願出願時は未公開）。この新規システムは、HuH-7細胞株以外の特定の細胞（Li23細胞）に由来し、特定の全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが導入されている全長HCV RNA複製細胞（ORL細胞）を用いるものである。全長HCV RNA複製細胞（ORL細胞）の作製手順を、図１３に示す。また、ORL細胞（ORL8細胞およびORL11細胞）におけるルシフェラーゼ活性とHCV RNA量との相関を、図１４に示す。この結果は、ORL細胞が、薬剤の効果を簡便に評価できる（細胞由来のルシフェラーゼ活性値がHCV RNA量と相関している）細胞系であるOR6細胞（特許文献３参照）と同様に、薬剤の効果を簡便に評価できる細胞系であることを示している。
[14: Full length HCV RNA replicating cells derived from cells other than HuH-7 cell line]
The present inventors have constructed an HCV life cycle reproduction system derived from a cell line other than the HuH-7 cell line, which has an ability comparable to the HCV life cycle reproduction system derived from the HuH-7 cell line (application of the present application). (Time is unpublished). This new system is derived from specific cells (Li23 cells) other than the HuH-7 cell line, and full-length HCV RNA-replicating cells into which RNA containing a specific full-length HCV genomic sequence and a selectable marker gene sequence has been introduced (ORL cells) are used. The production procedure of full-length HCV RNA replicating cells (ORL cells) is shown in FIG. Further, FIG. 14 shows the correlation between the luciferase activity and the amount of HCV RNA in ORL cells (ORL8 cells and ORL11 cells). This result shows that the ORL cells can evaluate the effect of the drug simply (the cell-derived luciferase activity value correlates with the amount of HCV RNA) as well as the OR6 cell (see Patent Document 3). It is shown that the cell line can easily evaluate the effect of.
なお、本発明者らが作製した細胞は、岡山大学寄託機関である国立大学法人岡山大学知的財産本部（岡山市津島中一丁目１番１号）に寄託されており、その寄託番号は以下の通りである。 The cells produced by the present inventors have been deposited at the Okayama University Intellectual Property Headquarters (1-1 1-1 Tsushima-naka, Okayama City), which is the depositary organization of Okayama University. It is as follows.
また、これらの細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに平成２０年７月３１日に受領されており、その受領番号は以下の通りである。 These cells were received by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center on July 31, 2008, and the receipt numbers are as follows.
これまでに抗HCV活性が報告されているIFN−αについて、ORL細胞のアッセイ系を用いた評価を行った結果を、図１５に示す（対照としてOR6細胞のアッセイ系を用いている。）。手順としては、各細胞にIFN−α（0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 10 IU/ml：Sigma社,I2396）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.13 IU/ml、O.30 IU/mlおよび0.40 IU/mlと算定された。同様の実験をさらに３回行ったが、ほぼ同じような値が得られ再現性は良好であった。IFN−αについては、ORL8細胞の感受性が高く、ORL11細胞、OR6細胞の順であった。 The results of evaluation using an ORL cell assay system for IFN-α for which anti-HCV activity has been reported so far are shown in FIG. 15 (OR6 cell assay system is used as a control). As a procedure, IFN-α (0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 10 IU / ml: Sigma, I2396) was added to each cell, and luciferase activity after 72 hours was measured. As a result of the analysis, EC 50 in ORL8, ORL11 and OR6 cells was calculated to be 0.13 IU / ml, O.30 IU / ml and 0.40 IU / ml, respectively. The same experiment was performed three more times, but almost the same value was obtained and the reproducibility was good. With respect to IFN-α, the sensitivity of ORL8 cells was high, followed by ORL11 cells and OR6 cells.
なお、IFN−αの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、IFN−αによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のIFN−αの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、対照細胞と比較して95%以上であり、IFN−αによる細胞毒性もほとんど認められなかった（図１５）。 In order to confirm that the decrease in luciferase activity caused by the addition of IFN-α is not due to cell growth inhibition or cytotoxicity by IFN-α, the cells were cultured under the same conditions as in the luciferase assay. The number of cells was measured by trypan blue staining. The effect of adding IFN-α at a concentration corresponding to the EC 50 value obtained in each cell was examined. As a result, in any cell, it was 95% or more compared with the control cell, and cytotoxicity by IFN-α was hardly observed (FIG. 15).
本発明者らは、IFN−α以外の抗HCV活性が報告されている化合物（例えば、IFN−β、IFN−γ、CsA、FLV等）についても同様の実験を行い、同様の結果を得ている（結果は示さず）。 The present inventors conducted similar experiments with compounds (eg, IFN-β, IFN-γ, CsA, FLV, etc.) that have been reported to have anti-HCV activity other than IFN-α, and obtained similar results. (Results not shown).
〔１５：ORL細胞アッセイ系を用いたOSMの抗HCV活性〕
各細胞にOSM（最終濃度0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ng/ml）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した（図１６）。0.1%BSAを含むPBS溶液に溶解して−２０℃に保存したOSMを、10% FBSを含むLi23細胞用培地にて検定濃度になるように希釈しながらアッセイに使用した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.15 ng/ml、3.54 ng/mlおよび0.82 ng/mlと算定された。同様の実験をさらに３回行ったが、ほぼ同じような値が得られ再現性は良好であった。なお、HuH-7細胞用培地を使用した実験の結果（図１）においてEC50は0.71 ng/mlと算定されていることから、培地の種類が違ってもほぼ同じような値が得られるといえる。
[15: Anti-HCV activity of OSM using ORL cell assay system]
OSM (final concentrations 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ng / ml) was added to each cell, and luciferase activity after 72 hours was measured (FIG. 16). OSM dissolved in a PBS solution containing 0.1% BSA and stored at −20 ° C. was used for the assay while being diluted to an assay concentration in a Li23 cell medium containing 10% FBS. As a result of the analysis, EC 50 in ORL8, ORL11 and OR6 cells was calculated to be 0.15 ng / ml, 3.54 ng / ml and 0.82 ng / ml, respectively. The same experiment was performed three more times, but almost the same value was obtained and the reproducibility was good. In addition, the EC 50 was calculated to be 0.71 ng / ml in the results of the experiment using the HuH-7 cell culture medium (Fig. 1). I can say that.
以上の結果から、OSMは単剤での処理によって高い抗HCV活性を示すことが確認された。 From the above results, it was confirmed that OSM exhibits high anti-HCV activity by treatment with a single agent.
本発明を用いれば、新規抗HCV剤およびＣ型肝炎治療薬を提供し得るので、試薬産業、医薬品産業などの発展に貢献することができる。 If this invention is used, since a novel anti-HCV agent and a hepatitis C therapeutic agent can be provided, it can contribute to development of a reagent industry, a pharmaceutical industry, etc.
Claims (12)
(i) オンコスタチンＭタンパク質に対する抗体；
(ii) gp130タンパク質に対する抗体およびオンコスタチンＭ受容体タンパク質に対する抗体；
(iii)オンコスタチンＭ mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチド；ならびに
(iv) gp130 mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチドおよびオンコスタチンＭ受容体mRNAを検出し得るオリゴヌクレオチド。 A measurement kit for predicting the effectiveness of interferon treatment for hepatitis C patients, comprising at least one of the following (i) to (iv):
(i) an antibody against Oncostatin M protein;
(ii) an antibody against the gp130 protein and an antibody against the oncostatin M receptor protein;
(iii) an oligonucleotide capable of detecting oncostatin M mRNA; and
(iv) An oligonucleotide capable of detecting gp130 mRNA and an oligonucleotide capable of detecting oncostatin M receptor mRNA.
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| JP2008225334A Pending JP2010059081A (en) | 2008-09-02 | 2008-09-02 | Anti-hcv agent containing oncostatin m and its utilization |
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|---|---|
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2008
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