JP2009534394A - 結合組織障害の治療 - Google Patents

Abstract

本発明は、核酸を結合組織細胞に送達する方法及び結合組織障害を治療する方法に関し、詳細には、本発明は、パルボウイルスベクターを用いて核酸を結合組織細胞に送達する方法及び結合組織障害を治療する方法を提供する。

Description

本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の規定の下、２００６年４月２１日に出願された米国仮出願第６０／７９４，０４６号の恩典を主張するものであり、その全内容は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

［発明の分野］
本発明は、核酸を結合組織細胞に送達する方法及び結合組織障害を治療する方法に関し、詳細には、本発明は、パルボウイルスベクターを用いて核酸を結合組織細胞に送達する方法及び結合組織障害を治療する方法を提供する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターは、特定の遺伝子治療の用途に選択されるベクターであることが明らかになってきている。このようなプロトコルにおけるＡＡＶベクターの利用は、病原性及び病変の欠如、調製及び精製の簡便性、多くの組織での長期発現並びに有害な細胞媒介性免疫反応の欠如を含むＡＡＶの有利な特性に基づく。

ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）はＡＡＶ分離株の中で最も研究されている。過去１０年にわたり、別のＡＡＶ血清型の組織親和性の評価がなされるようになってきた。これらの研究では、特異なＡＡＶ血清型が特定の用途により適し得ることが示されている。例えば、血清型１、６及び７は骨格筋への送達に最も有望である。例示すると、ＡＡＶ２に比し、ＡＡＶ１は低用量（即ち、より少数の粒子）にて骨格筋に投与することができ、また、より早い時点で、より高いレベルの発現にて導入遺伝子を発現することができる。

ベクターとしてのＡＡＶ２の広範な発展は、その生態をインビトロにて３０年にわたり研究することによって促進されてきた。組換えＡＡＶ２（ｒＡＡＶ２）は多くの異なる生物において好適な遺伝子導入ベクターであることが判明している（Ｍｏｎｏｈａｎ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：２４，Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４７０）。インビトロ及びインビボにて遺伝子導入を評価する適用例の数が増加するのに伴い、効率的なｒＡＡＶ２導入の限界が明らかとなった（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２７７７，Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：３４２８，Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：４０８０，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ｉｎ，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７４：５３５，Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４，Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３８５２）。ｒＡＡＶ２を含むウイルスの天然の親和性は効率的な遺伝子導入の根本的な制約となる。

ＡＡＶ２受容体の同定により、標的細胞への効率的な侵入の要件が研究の重要なテーマとなった（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４３８）。ビリオンの外殻に対する二重特異性抗体を用いて（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１８１）、あるいはカプシド挿入突然変異により（国際特許公開ＷＯ００／２８００４；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６５：２７４；Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１０５２，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５）、宿主範囲を拡大することによって、これらの制約を打開しようとする努力がなされてきた。これらの努力は実を結び始めているが、ＡＡＶの他の血清型を用いることにより、安全且つ効率的な遺伝子導入ベクターを作製するための更なる資源が提供され得る。

国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１、及びＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２−２１１８において、二重鎖パルボウイルスベクターについて述べられている。少なくとも一部の組織では、二重鎖パルボウイルスベクターは従来の一本鎖ｒＡＡＶベクターより迅速な導入遺伝子発現の開始及び／又はより高いレベルの導入遺伝子発現を示し、それはおそらく、二重鎖ベクターがこれらの細胞における第二鎖合成の律速段階を回避するためである。

一態様として、本発明は、核酸を結合組織細胞に送達する方法を提供し、該方法は、
（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと、
（ｂ）５’ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、異種ヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、該ＡＡＶカプシド内に包まれる組換え核酸と
を含むウイルスベクターに該細胞を接触させるステップを含む。

特定の実施形態では、該細胞はインビトロにて接触させる。従って、別の態様として、本発明は、核酸を対象の結合組織に送達する方法を提供し、該方法は、前記方法に従ってインビトロにてウイルスベクターに接触した細胞を対象に投与するステップを含む。

本発明は、対象における結合組織障害を治療する方法も提供し、該方法は、前記方法に従ってインビトロにてウイルスベクターに接触した細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。

更なる態様として、本発明は、核酸を対象における結合組織に送達する方法を提供し、該方法は、
（ａ）ＡＡＶカプシドと、
（ｂ）５’ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、異種ヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、該ＡＡＶカプシド内に包まれる組換え核酸と
を含むウイルスベクターを対象に投与するステップを含む。

更に別の態様として、本発明は、結合組織障害を治療する方法を提供し、該方法は、
（ａ）ＡＡＶカプシドと、
（ｂ）５’ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、異種ヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、該ＡＡＶカプシド内に包まれる組換え核酸と
を含むウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。

本発明は、更に、軟骨の治癒及び／又は再生を促進し、且つ／あるいは関節炎を軽減するため、結合組織障害（例えば、関節障害）の治療のための薬剤の製造における、本発明のウイルスベクター又は細胞の使用を提供する。任意選択的に、該ウイルスベクターは二重鎖パルボウイルスベクターである。

本発明のこれら及び他の態様は本発明の以下の説明において更に詳細に示される。

本発明の代表的な実施形態が示されている添付図面を参照し、本発明について説明する。しかし、本発明は、異なる形態にて実施され得、本明細書で示される実施形態に限定されると理解されるべきではない。むしろ、本開示が完璧且つ完全であって本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように、これらの実施形態は示される。

別記しない限り、本明細書で用いられる技術及び科学用語は全て、本発明が帰属する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施形態についてのみ説明することを目的とし、本発明を限定するものではない。本明細書で述べられる全ての文献、特許出願、特許及び他の参考文献はそれらの全体を参照により本明細書に組み込まれる。

他に示さない限り、ｒＡＡＶ構造体、ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ配列を発現するパッケージングベクター並びに一過性且つ安定にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築と組換えウイルスベクターの作製には、当業者には公知の標準的な方法が用いられ得る。このような手法は当業者には公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；Ｆ．Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

［定義］
本発明及び添付の特許請求の範囲の説明において用いられるように、文脈で明瞭に別様に示さない限り、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は複数形も含むものとする。

本明細書で用いられるように、「及び／又は（並びに／あるいは、且つ／あるいは）」は、１つ以上の関連記載項目のあらゆる可能な組合せを指し、包含するとともに、選択的に（「又は（あるいは）」）解釈される際の組合せの欠如を指す。

更に、測定可能な値、例えば、本発明の化合物又は薬剤の量、用量、時間、温度などを指す場合に本明細書で用いられるような「約」という語は、指定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％又は更には±０．１％の変動を包含するものとする。

本明細書で用いられるような「パルボウイルス」という用語は、自律複製パルボウイルス及びディペンドウイルスを含むパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科を包含する。自律性パルボウイルスには、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属及びＣｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ属のメンバーが含まれる。典型的な自律性パルボウイルスには、限定されないが、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、マスコビーダックパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス及び現在公知であり、もしくは今後発見される他の任意の自律性パルボウイルスが含まれる。他の自律性パルボウイルスは当業者には公知である。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。

本明細書で用いられるように、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）には、限定されないが、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ及び現在公知であり、もしくは今後発見される他の任意のＡＡＶが含まれる。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。最近、多くの新規の推定ＡＡＶ血清型及びクレードが同定された（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１−６３８８；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３−：３７５−３８３；及び表１を参照されたい）。

ＡＡＶの種々の血清型及び自律性パルボウイルスのゲノム配列並びに末端反復、Ｒｅｐタンパク質及びカプシドサブユニットの配列は、当分野において公知である。このような配列は文献又はＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースに見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照されたい；パルボウイルスとＡＡＶの核酸及びアミノ酸配列を教示するため、それらの開示内容は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３−：３７５−３８３；国際特許公開ＷＯ ００／２８０６１、ＷＯ ９９／６１６０１、ＷＯ ９８／１１２４４；及び米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたい；パルボウイルスとＡＡＶの核酸及びアミノ酸配列を教示するため、それらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。表１も参照されたい。本明細書で用いられるように、別様に示さない限り、「ポリペプチド」という用語はペプチド及びタンパク質を包含する。

「核酸」又は「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」（又は類似の用語）はヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列（天然ヌクレオチド及び非天然ヌクレオチドを含む）でよいが、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列が好ましい。

本明細書で用いられるように、「単離された」ヌクレオチド配列又は核酸又は類似の用語（例えば、「単離されたＤＮＡ」又は「単離されたＲＮＡ」）は、天然の生物又はウイルスの少なくとも一部の他の構成要素、例えば、一般に核酸と関連して見出される細胞又はウイルスの構造的要素又は他のポリペプチド又は核酸から少なくとも部分的に分離されたヌクレオチド配列又は核酸を意味する。

「異種ヌクレオチド配列」又は「異種核酸」（及び類似の用語）は、その中に導入されて発現するウイルス及び／又は細胞において天然に生じない配列である。一般的に、異種ヌクレオチド配列又は核酸は、対象とするポリペプチド又は非翻訳ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームを含む（例えば、細胞又は対象への送達のため）。

「単離されたポリペプチド」は、天然の生物又はウイルスの少なくとも一部の他の構成要素、例えば、一般にポリペプチドと関連して見出される細胞又はウイルスの構造的要素又は他のポリペプチド又は核酸から少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。

「治療用ポリペプチド」は、細胞又は対象におけるタンパク質の欠如又は欠損から生じる症状を軽減、低減、遅延且つ／あるいは予防することが可能なポリペプチドである。あるいは、「治療用ポリペプチド」は他に、対象に利益、例えば、抗癌作用又は移植生存率の向上を与えるものである。

本明細書で用いられるように、「単離された細胞」は、対象から除去され、あるいは対象から除去された細胞に由来し、その天然の状態にて関連する組織もしくは器官（例えば、軟骨、滑膜、半月板、骨髄）から富化され、又は少なくとも部分的に精製された細胞である。

本明細書で用いられるように、「有効量」は、任意選択的に、治療及び／又は予防効果（即ち、治療有効量の投与により）である所望の効果を生じさせるのに十分なウイルスベクター、細胞又は医薬組成物の量を指す。例えば、「有効量」は結合組織障害を治療するのに十分な量となり得る。

本明細書で用いられるような「治療有効量」は、対象にある程度の改善又は利益を与えるのに十分な量である。別の言い方をすると、「治療有効」量は対象における少なくとも１つの臨床症状のある程度の軽減、緩和又は低減をもたらす量である。対象にある程度の利益が付与されるのであれば、治療効果が完全あるいは治癒的である必要はないことを当業者は理解する。

「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「〜の治療」という用語（又は文法的に等価な用語）は、対象の病状の重症度が低減又は少なくとも部分的に改善又は好転し、且つ／あるいは少なくとも１つの臨床症状のある程度の軽減、緩和又は低減がもたらされ、且つ／あるいは病状の進行の遅延及び／又は疾患もしくは障害の発症の予防もしくは遅延があることを意味する。従って、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「〜の治療」という用語（又はそれらの文法的変形）は、予防及び治療レジメンを指す。

本明細書で用いられるように、「ウイルスベクター」、「ベクター」又は「遺伝子送達ベクター」という用語（又は類似の用語）は、核酸送達ビヒクルとして機能するとともに、ＡＡＶカプシド内に包まれたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含むウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指す。あるいは、一部の文脈において「ベクター」という用語は単にベクターゲノム／ｖＤＮＡを指すのに用いられ得る。

「ｒＡＡＶベクターゲノム」又は「ｒＡＡＶゲノム」は、１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶゲノム（即ち、ｖＤＮＡ）である。通常、ベクターにより効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大化するため、ｒＡＡＶベクターゲノムは最小限の末端反復配列（各々１４５塩基）のみを保持する。他の全てのウイルスの構造及び非構造コード配列は不必要であり、例えば、プラスミドのようなベクターから、あるいは該配列をパッケージング細胞に安定に組み込むことにより、イントランスにて供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。一般的に、ｒＡＡＶベクターゲノムは少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列、任意選択的に、２つのＡＡＶ末端反復配列を含み、通常、これは異種ヌクレオチド配列の５’端及び３’端に位置するが、それに隣接する必要はない。末端反復は同じであるか、あるいは互いに異なってもよい。

「末端反復」という用語は、任意のウイルス末端反復及び／又はヘアピン構造を形成するとともに逆方向末端反復として機能する部分的もしくは完全に合成された配列、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，４７８，７４５号に述べられているような「二重Ｄ配列（ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」を含む。

「ＡＡＶ末端反復」は、限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２又は現在公知であり、あるいは今後発見される他の任意のＡＡＶを含む任意のＡＡＶ由来のものでよい。ＡＡＶ末端反復は、該末端反復が所望の機能、例えば、複製、ニッキング、ウイルスパッケージング、組込み及び／又はプロウイルスのレスキューなどを媒介するのであれば、野生型配列を有する必要はない（例えば、野生型配列は挿入、欠失、切断又はミスセンス変異により改変され得る）。

「非分解性の末端反復」は天然末端反復配列を包含し（その改変された形態を含む）、例えば、ＡＡＶを含むパルボウイルスから得られ、あるいは別のウイルスから得られ、あるいは更なる代替例として部分的又は完全に合成でよい。「非分解性の末端反復」とは、末端反復の分解が実質的に低減（例えば、分解性末端反復と比べて少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％以上）あるいは排除されるように、末端反復がＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質に認識されて分解されない（即ち、「ニッキングされない」）ことを意味する。

非分解性の末端反復は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質に認識されない非ＡＡＶウイルス配列でよく、あるいは改変されて（例えば、挿入、置換及び／又は欠失により）、その結果、もはやＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質に認識されないＡＡＶ末端反復でよい。更に、非分解性の末端反復は、ウイルスベクターを作製するのに用いられる条件下にて非分解性の任意の末端反復でよい。例えば、非分解性の末端反復はベクターゲノムを複製するのに用いられるＲｅｐタンパク質に認識され得ない。例示すると、非分解性の末端反復は、自律性パルボウイルス末端反復又はＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質に認識されないパルボウイルス末端反復以外のウイルス末端反復でよい。別の例示例として、分解性末端反復及びＲｅｐタンパク質は１つのＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）に由来し得、分解が実質的に低減あるいは排除されるように、非分解性の末端反復はＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質に認識されない別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ５）に由来する。更に、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質による分解が実質的に低減あるいは排除されるように、ＡＡＶ末端反復は改変され得る。

更なる代替例として、非分解性の末端反復はヘアピン構造を形成する任意の逆方向反復でよく、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質によりニッキングされ得ない。

［結合組織への送達用ウイルスベクター］
本発明は、インビボ又はインビトロ（後者はエクスビボを含む）にて対象とする核酸を結合組織細胞に送達するためのウイルスベクター、細胞、医薬組成物及び方法を提供する。

本明細書で述べるように、ｒＡＡＶベクターは、現在公知であり、あるいは今後発見される任意の好適なｒＡＡＶベクターでよい。一般的に、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ末端反復（任意選択的に、２つのＡＡＶ末端反復）を含む組換えベクターゲノムを包むＡＡＶカプシドと、対象とする異種ヌクレオチド配列とを含む。

国際特許公開ＷＯ ００／２８００４及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に述べられているように、本発明のウイルスベクターは、「標的」パルボウイルスベクター（即ち、ＡＡＶカプシドが外因性標的配列を含む）、「キメラ」パルボウイルスベクター（即ち、ＡＡＶカプシドが異なるＡＡＶ又は自律性パルボウイルス由来のカプシド領域を含む）及び／又は「ハイブリッド」パルボウイルスベクター（即ち、ＡＡＶカプシドとＡＡＶ末端反復が異なるＡＡＶ由来である）となり得る。

国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１及びＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２−２１１８に述べられているように、本発明のウイルスベクターは、更に、二重鎖パルボウイルスベクターとなり得る。

加えて、ＡＡＶカプシド又はベクターゲノムは、挿入、欠失及び／又は置換を含む他の改変を含有し得る。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは表１に列挙されたようなＡＡＶカプシドを含み、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はＡＡＶ１２カプシドを含み、その改変形態を含む。任意選択的に、該カプシドはＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシド又はその改変形態となり得る。

ベクターゲノムは、同一であり、あるいは異なり得る、１つ以上（例えば、２つ）のＡＡＶ末端反復を含み得る。更に、１つ以上のＡＡＶ末端反復はＡＡＶカプシドと同じＡＡＶ血清型由来でよく、あるいは異なってもよい。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及び／又はＡＡＶ１２末端反復を含む。

本発明の代表的な実施形態では、ウイルスベクターは二重鎖パルボウイルスベクターであり、この場合、組換えベクターゲノムは、（分解性の）５’及び３’ＡＡＶ末端反復、対象とする異種ヌクレオチド配列並びに非分解性の末端反復を含む。二重鎖パルボウイルスベクターとその作製については、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１及びＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２−２１１８に述べられている。

一般的に、二重鎖パルボウイルスベクターは、ＡＡＶカプシド内に包まれた二量体の自己相補的ポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）である。いくつかの点で、カプシド内に包まれた組換えウイルスゲノムは、本質的に、分解されてプラス極性鎖及びマイナス極性鎖を生じることができない「トラップされた」ＡＡＶ複製中間体である。二重鎖パルボウイルスベクターは、従来のｒＡＡＶベクターに内在する宿主細胞媒介性の相補的ＤＮＡの合成の必要性を回避するように思われ、これにより、ｒＡＡＶベクターの１つの制約に対処する。

二重鎖パルボウイルスベクターは、ウイルスＤＮＡが鎖内塩基対により二本鎖ヘアピン構造を形成することができ、また、両極性のＤＮＡ鎖がカプシドに包まれるという点で、従来のｒＡＡＶベクター及び親ＡＡＶと根本的に異なる。従って、二重鎖パルボウイルスベクターは、それが由来するＡＡＶよりむしろ二本鎖ＤＮＡウイルスベクターに機能的に類似する。この特徴はｒＡＡＶ媒介遺伝子導入の過去に認識された欠点に対処するものであり、それは、通常、ＡＡＶによりカプシドに包まれた一本鎖ゲノムに対する相補的ＤＮＡを合成する所望の標的細胞の限定的な性向である。

本発明の特定の理論に捉われることを望まないが、ビリオンゲノムはウイルスカプシド内に包まれている間、一本鎖形態にて保持される可能性がある。ウイルス感染時のカプシドからの放出後、二量体分子は鎖内塩基対により「スナップバック」あるいはアニーリングして二本鎖分子を形成し、非分解性ＴＲ配列が一端にて共有結合閉ヘアピン構造を形成すると考えられる。この二本鎖ウイルスＤＮＡは、ＡＡＶトランスダクションの律速段階であると想定されている宿主細胞媒介性の第二鎖合成の必要性を不要にする。

結合組織細胞の場合、二重鎖パルボウイルスベクターは、より速い遺伝子発現の開始及び／又はより高いレベルの遺伝子発現を提供することができ、これにより、低用量を可能とし、これは次に標的組織における炎症の可能性及び／又は程度の低減をもたらし得るため、有利となり得る。

通常、二重鎖パルボウイルスベクターゲノムは５’から３’方向にて、（ｉ）分解性のＡＡＶ末端反復、（ｉｉ）対象とする異種ヌクレオチド配列（コード又は非コード鎖）、（ｉｉｉ）非分解性の末端反復、（ｉｖ）（ｉｉ）の対象とする異種ヌクレオチド配列に対する相補的配列又は実質的に相補的な配列（例えば、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％以上）並びに（ｖ）分解性ＡＡＶ末端反復を含む。該ベクターゲノムが他の配列（例えば、具体的に上述した配列間の介在配列）を含み得ることを当業者は理解するであろう。

特定の実施形態では、該ベクターゲノムが相補的配列間の塩基対により二本鎖分子を形成し得るように、該ベクターゲノムの各半分における配列（例えば、全配列又はＡＡＶ末端反復と非分解性の末端反復との間の配列）は実質的に相補的（即ち、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％のヌクレオチド配列相補性以上）である。言い換えると、該ベクターゲノムは本質的に両半分が非分解性の末端反復により結合した逆方向反復である。特定の実施形態では、該ベクターゲノムの両半分（即ち、全配列又はＡＡＶ末端反復と非分解性の末端反復との間の配列）は本質的に完全に自己相補的（即ち、わずかな数のミスマッチ塩基を含む）あるいは完全に自己相補的である。

別の実施形態では、対象とする異種ヌクレオチド配列の二本鎖は（調節エレメントの有無にかかわらず）実質的に相補的（即ち、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％のヌクレオチド配列相補性以上）である。特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列の二本鎖は本質的に完全に自己相補的（即ち、わずかな数のミスマッチ塩基を含む）あるいは完全に自己相補的である。

一般的に、二重鎖パルボウイルスのベクターゲノムは、二重鎖パルボウイルスベクターからの異種ヌクレオチド配列の発現が、対応するｒＡＡＶベクターからの発現よりも亢進する程度まで（例えば、より早い発現の開始及び／又はより高いレベルの発現）、非相補性の位置又は領域を含み得る。本発明の二重鎖パルボウイルスは、ｒＡＡＶベクターの欠点の１つ、即ち、宿主細胞が一本鎖ｒＡＡＶビリオンＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する必要性に対処する二本鎖分子を宿主細胞に与える。ビリオンＤＮＡ内、詳細には、異種ヌクレオチド配列内の相当量の非相補性の領域の存在は、宿主細胞に認識され、ミスマッチ塩基を修復するためにＤＮＡ修復機構が誘導されることとなり、これにより、二重鎖パルボウイルスベクターの有利な特徴、例えば、宿主細胞がウイルステンプレートを処理する必要性の低減又は排除といった特徴を打ち消すこととなり得る。

非分解性のＡＡＶ末端反復は当分野で公知の任意の方法により作製可能である。例えば、末端反復への挿入はニッキング部位（即ち、ｔｒｓ）を変位させ、非分解性の末端反復が生じる。末端反復内の種々の領域又は要素の名称は当分野で公知である（例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９，Ｆｉｇｕｒｅ ５，３ｄ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ及びＷＯ０１／９２５５５１の図６を参照されたい）。挿入は末端分解性部位（ｔｒｓ）の配列にもなされ得る。あるいは、挿入はＡエレメント内のＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）とｔｒｓとの間の部位になされ得る（ＷＯ０１／９２５５５１の図６を参照）。ＡＡＶ ｔｒｓ部位のコア配列は当分野で公知であり、記載されている（Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０：１０５；Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６０９６；Ｂｒｉｓｔｅｒ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：７７６２；Ｂｒｉｓｔｅｒ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３２５。例えば、Ｂｒｉｓｔｅｒ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３２５では、Ｄエレメントに隣接する３’−ＣＣＧＧＴ／ＴＧ−５’のコアｔｒｓ配列について述べている。Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６０９６では、最小のｔｒｓ配列を３’−ＧＧＴ／ＴＧＡ−５’と同定した。この配列はＢｒｉｓｔｅｒ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａによって同定された配列と実質的に重複する。

該挿入は、末端反復の分解を実質的に低減（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％以上）あるいは排除する任意の好適な長さでよい。挿入は少なくとも約３、４、５、６、１０、１５、２０もしくは３０ヌクレオチド以上でよい。好適なレベルのウイルス複製及びパッケージングがなされるのであれば、挿入配列のサイズの特定の上限はない（例えば、挿入は、５０、１００、２００もしくは５００ヌクレオチドもの長さ以上の長さでよい）。

別の手法として、末端反復はｔｒｓ部位の欠失により非分解性にされ得る。該テンプレートが所望の機能を保持する限り、欠失はｔｒｓ部位を越えて１、３、５、８、１０、１５、２０、３０ヌクレオチド以上延長し得る。ｔｒｓ部位に加え、Ｄエレメントの一部又は全てが欠失され得る（例えば、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２−２１１８；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２−２１１８；及びＷＯ０１／９２５５１を参照されたい）。欠失は更にＡエレメントに延長し得るが、例えば、効率的なパッケージングを促進するため、ＲＢＥをＡエレメントに保持することが有利であり得ることを当業者は理解する。非分解性の末端反復が他の所望の機能を保持する限り、Ａエレメントへの欠失は２、３、４、５、８、１０もしくは１５ヌクレオチド長以上でよい。更に、改変された末端反復を修復する遺伝子変換のプロセスを低減あるいは阻止するため、末端反復配列外側のＤエレメントを超えるウイルス配列の一部又は全て（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／９２５５５１号の図６におけるＤエレメントの右方）が欠失され得る。

更なる代替例として、Ｒｅｐタンパク質による分解が低減あるいは実質的に排除されるように、ニッキング部位における配列が変異させられ得る。例えば、ニッキング部位又はその近傍において、Ｇ塩基及び／又はＴ塩基はＡ塩基及び／又はＣ塩基に置換され得る。末端分解部位における置換のＲｅｐ切断に対する効果は、Ｂｒｉｓｔｅｒ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３２５において記載されている。更なる代替例として、末端分解部位におけるＲｅｐ切断を低減するように、ステムループ構造を形成すると想定されている、ニッキング部位を取り囲む領域におけるヌクレオチド置換も用いられ得る（同上）。

非分解性の末端反復における改変が、改変された末端反復の所望の機能（あるとするならば）（例えば、パッケージング、Ｒｅｐ認識及び／又は部位特異的組込みなど）を維持するように選択され得ることを当業者は理解する。

更に、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１３５において記載されているように、非分解性の末端反復は、遺伝子変換のプロセスに対して抵抗性を示すようにされ得る。非分解性の末端反復における遺伝子変換はｔｒｓ部位を復元し、これは分解性の末端反復を生じさせる。遺伝子変換は、分解性の末端反復と改変された末端反復との間の相同組換えから生じる。

遺伝子変換を低減する１つのストラテジーは、当分野で公知のように、ＤＮＡ修復に欠陥のある細胞株（例えば、哺乳動物）を用いてウイルスを作製することであり、それは、これらの細胞株がウイルステンプレートに導入された変異を修復する能力に障害があるためである。

あるいは、非分解性の末端反復に非相同領域を導入することにより、実質的に減少した割合の遺伝子変換を有するテンプレートが作製され得る。該テンプレート上の非分解性の末端反復と変更されていない末端反復との間のｔｒｓエレメントを取り囲む領域における非相同は、遺伝子変換を低減し、あるいは更に実質的に排除する。

遺伝子変換が低減あるいは実質的に排除される限り、非相同領域を作製するため、非分解性の末端反復に任意の好適な挿入又は欠失が導入され得る。欠失を用いて非相同を生じさせる方法が好ましい。欠失がテンプレートの複製及びパッケージングを必要以上に損ねないことが更に好ましい。欠失の場合、ｔｒｓ部位の分解を損ねるとともに遺伝子変換を低減するのに同一の欠失で足り得る。

更なる代替例として、遺伝子変換は非分解性の末端反復又は代替としてＲＢＥとｔｒｓ部位との間のＡエレメントへの挿入により低減され得る。通常、挿入は少なくとも約３、４、５、６、１０、１５、２０もしくは３０ヌクレオチド以上のヌクレオチド長である。挿入配列のサイズの特定の上限はなく、５０、１００、２００もしくは５００ヌクレオチド以上の長さでよいが、一般的に、挿入はベクターゲノムの複製及びパッケージングを必要以上に損ねないように選択される。

非分解性の末端反復及び二重鎖パルボウイルスベクターについては、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１号及びＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２−２１１８に述べられている。

ウイルスベクターは結合組織（関節組織を含む）への送達用の対象とする任意の異種ヌクレオチド配列を含み得る。対象とするヌクレオチド配列には、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれ、これには治療用（例えば、医学的あるいは獣医学的用途）ポリペプチドが含まれる。

治療用ポリペプチドには、限定されないが、成長因子（例えば、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ及び／又はインスリン様成長因子（ＩＧＦ）−ＩＩ）、抗異化作用因子（例えば、インターロイキン受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＲＡＰ））、抗炎症因子（例えば、ＴＮＦ−α可溶性受容体）及び抗酸化剤（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）が含まれる。他の例示的な治療用ポリペプチドには、限定されないが、骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−７）、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＫＬ、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）１及び／又は２（例えば、軟骨細胞又は骨系への細胞の関与を改変するため）、酸性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ、ＴＧＦα、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮由来成長因子、Ｓｏｘ９並びにヘパリン結合成長因子が含まれる。

加えて、ウイルスベクターは、遺伝子発現に関連する任意の結合組織障害に関連する症状を治療あるいは改善する生物学的効果を有する任意の異種ヌクレオチド配列を送達するのに用いられ得る。例示的な結合組織障害には、限定されないが、変形性関節症（例えば、インスリン様成長因子Ｉ及び／又はインスリン様成長因子ＩＩの投与による）、部分的もしくは完全な軟骨断裂（例えば、インスリン様成長因子Ｉ及び／又はインスリン様成長因子ＩＩの投与による）、関節リウマチ（例えば、ＩＲＡＰ及び／又はＴＮＦα可溶性受容体のような抗炎症因子の投与による）、骨折（例えば、骨形態形成タンパク質［例えば、ＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−７］、ＶＥＧＦ及び／又はＲＡＮＫＬの投与による）などが含まれる。

ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列には、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードする異種ヌクレオチド配列が含まれる。レポーターポリペプチドは当分野で公知であり、限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが含まれる。

あるいは、異種ヌクレオチド配列は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号において述べられているような）、スプライセオソーム媒介性のトランススプライシングをもたらすＲＮＡｓ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを媒介する、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを含む干渉ＲＮＡｓ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照）あるいは他の非翻訳ＲＮＡｓ、例えば、「ガイド」ＲＮＡｓ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードし得る。例示的な非翻訳ＲＮＡｓには、ＩＧＦ結合タンパク質（例えば、ＩＧＦＢＰ １、２、３、４、５及び／又は６、特に、ＩＧＦＢＰ３）、ＴＧＦ−β１及び／又は２（例えば、軟骨細胞及び／又は骨系への細胞の関与を改変するめ）並びに／あるいはインターロイキン−１受容体に対するＲＮＡｉが含まれる。

ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有するとともに、これと組み換わる核酸も含み得る。この手法は宿主細胞における遺伝子異常を修復するのに用いられ得る。

あるいは、異種ヌクレオチド配列は、インビトロ、エクスビボ又はインビボにて結合組織細胞において望ましく産生される任意のポリペプチドをコードし得る。例えば、ウイルスベクターは培養細胞内に導入することができ、発現した遺伝子産物がそこから単離され、あるいは細胞をエクスビボにて操作するのに用いることができ、該細胞は細胞ベースの治療として対象に投与され、あるいは該ベクターは対象にインビボにて直接投与することができる。

異種ヌクレオチド配列がウイルスベクターによりパッケージング並びに送達され得る限り、該異種ヌクレオチド配列に特定のサイズ制限はない。一般に、ＡＡＶカプシドは野生型ＡＡＶゲノム（４．６８ｋｂ）の約８０％〜１０５％のベクターゲノムを効率的にパッケージングし、送達することができるが、より大きい組換えベクターゲノムは効率が低下して投与することができる。

特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は少なくとも約１５、１８、２４、５０、１００、２５０、５００、１０００以上のヌクレオチド長であり、約４．２ｋｂ、４．４ｋｂ、４．６ｋｂ、４．８ｋｂ又は４．９ｋｂ未満である（調節配列の有無にかかわらず）。二重鎖パルボウイルスベクターの場合、異種ヌクレオチド配列の両鎖がベクターにより送達され、従って、通常、異種ヌクレオチド配列は、ＡＡＶカプシドによる該二重鎖配列のパッケージングを容易にするため、約２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ又は２．４５ｋｂ長未満である（調節配列の有無にかかわらず）。

対象とする異種ヌクレオチド配列が適切な制御配列と機能的に関連し得ることが当業者には理解される。例えば、異種ヌクレオチド配列は発現制御エレメント、例えば、転写／翻訳制御シグナル、複製開始点、ポリアデニリル化シグナル、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、エンハンサーなどと機能的に関連し得る。

所望の発現レベル及び組織特異的発現に依存して、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが用いられ得ることを当業者は理解する。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに依存して、構成的あるいは調節的となり得る。プロモーター／エンハンサーは天然あるいは外来性でよく、天然配列又は合成配列であってよい。外来性とは、転写開始領域が導入される野生型宿主に転写開始領域が見出されないということである。

プロモーター／エンハンサーエレメントは標的細胞に天然に存在するものであってもよく、又は処理される対象に天然に存在するものであってもよく、且つ／あるいは異種ヌクレオチド配列に天然に存在するものであってもよい。一般的に、プロモーター／エンハンサーエレメントは、対象とする標的細胞において機能するように選択される。プロモーター／エンハンサーエレメントは任意選択的に、哺乳動物のプロモーター／エンハンサーエレメントでよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは更に構成的あるいは調節的（即ち、誘導的）でよい。

核酸送達用の調節性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織嗜好的及び／又は特異的プロモーター／エンハンサーエレメントでよく、軟骨細胞嗜好的及び／又は特異的並びに滑膜細胞嗜好的及び／又は特異的プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、ホルモン誘導性及び金属誘導性エレメントが含まれる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、限定されないが、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター及びメタロチオネインプロモーターが含まれる。

異種ヌクレオチド配列が標的細胞内にて転写され、次に、翻訳される実施形態では、挿入されるタンパク質コード配列の効率的な翻訳のため、特異的な開始シグナルが含まれ得る。ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含み得る、このような外因性翻訳制御配列は天然及び合成を含む種々の起源であってよい。

本発明は、本発明のウイルスベクター、該ウイルスベクターの導入により改変された単離された細胞及び前記のいずれかを含む医薬製剤も包含する。

［核酸送達の方法］
本発明は、インビトロ（エクスビボを含む）及びインビボにて任意の結合組織又は結合組織細胞に対象とする核酸を送達するように実施され得る。特定の実施形態では、該結合組織は、軟骨、半月板、滑膜、骨及び／又は骨髄である。任意選択的に、該結合組織は関節組織及び／又は関節組織の前駆体（例えば、軟骨、半月板、滑膜、骨及び／又は骨髄）である。関節組織細胞及びそれらの前駆体の非限定的例には、軟骨細胞、滑膜細胞、線維軟骨細胞及び／又は骨髄由来の間葉系幹細胞が含まれる。

関節組織の場合、核酸は任意の好適な関節の組織に送達され得る。ヒト又は非ヒト霊長動物では、関節は、膝関節、肘関節、股関節、足関節、肩関節、手関節、指関節又はそれらの任意の組合せでよいが、これらには限定されない。ウマ、ネコ又はイヌの場合、関節は、手関節、肘関節、股関節、大腿膝蓋関節（femoropatellar joint）、大腿脛骨関節、肩甲上腕関節又はそれらの任意の組合せでよい。

従って、一態様として、本発明は、核酸を結合組織細胞（例えば、関節組織細胞又はその前駆体）に送達する方法を提供し、該方法は、（ａ）ＡＡＶカプシドと、（ｂ）５’ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、異種ヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、該ＡＡＶカプシド内に包まれる組換え核酸とを含むウイルスベクターに該細胞を接触させるステップを含む。ＡＡＶベクター及び対象とする異種ヌクレオチド配列は本明細書で説明される通りである。

代表的な実施形態では、該ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドであり、任意選択的に、該細胞は軟骨細胞及び／又は滑膜細胞である。更なる選択肢として、該ウイルスベクターは本明細書で述べるような二重鎖パルボウイルスベクターでよい。

本発明の本実施形態に従って、該細胞はインビトロ（エクスビボにて操作される細胞を含む）又はインビボでの細胞でよい。対象又はドナーから細胞を除去し、エクスビボにて該細胞にウイルスベクターを導入し、次に、対象に投与する方法は、結合組織障害を治療するための細胞ベースの治療のように、当分野で公知である。

従って、また、本発明は、核酸を対象の結合組織（例えば、関節組織又はその前駆体）に送達する方法を提供し、該方法は、インビトロにてウイルスベクターが導入された細胞を該対象に投与するステップを含む。特定の実施形態では、該方法は、（ａ）該対象から細胞を除去するステップと、（ｂ）該細胞及び／又はその子孫に該ウイルスベクターを導入するステップと、（ｃ）（ｂ）の細胞及び／又はその子孫を該対象に投与するステップとを含む。該細胞は、軟骨細胞、滑膜細胞、線維軟骨細胞及び／又は骨髄由来間葉系幹細胞であってよいが、これらには限定されない。あるいは、該細胞はドナー対象由来であってよい。結合組織の非限定的例には、軟骨、滑膜、半月板、骨及び／又は骨髄が含まれる。任意選択的に、該結合組織は関節組織又は関節組織の前駆体（例えば、軟骨、半月板、滑膜及び／又は骨髄）である。

本発明のウイルスベクターは対象に直接投与することもできる。代表的な実施形態では、本発明は、核酸を、対象における結合組織（例えば、関節組織又はその前駆体）に投与する方法を提供し、該方法は、（ａ）ＡＡＶカプシドと、（ｂ）５’ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、異種ヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、該組換え核酸配列が該ＡＡＶカプシド内に包まれる組換え核とを含むウイルスベクターを該対象に投与するステップを含む。ＡＡＶベクター及び対象とする異種ヌクレオチド配列は本明細書で説明される通りである。

代表的な実施形態では、該ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドであり、任意選択的に、該結合組織は軟骨及び／又は滑膜である。更なる選択肢として、該ウイルスベクターは本明細書で述べるような二重鎖パルボウイルスベクターでよい。

本発明は、結合組織障害（例えば、関節障害）を治療する方法も包含する。代表的な実施形態では、本発明は、上述のようなウイルスベクターを形質導入された細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、結合組織障害（例えば、関節障害）を治療する細胞ベースの方法を提供する。本発明の本態様に従って、該方法は、（ａ）該対象から細胞を除去するステップと、（ｂ）該細胞及び／又はその子孫に該ウイルスベクターを導入するステップと、（ｃ）（ｂ）の細胞及び／又はその子孫を該対象に投与するステップとを含み得る。あるいは、該細胞はドナー対象から採取することができ、該ウイルスベクターが該細胞及び／又はその子孫に導入され、該細胞及び／又はその子孫が該対象に投与される。非限定的例として、該細胞は、軟骨細胞、滑膜細胞、線維軟骨細胞及び／又は骨髄由来間葉系幹細胞でよい。

別の手法として、ウイルスベクターは結合組織障害を治療するため、対象に直接投与され得る。従って、本発明は、対象における結合組織障害（例えば、関節障害）を治療する方法を提供し、該方法は、（ａ）ＡＡＶカプシドと、（ｂ）５’ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、異種ヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、該組換え核酸配列は該ＡＡＶカプシド内に包まれる組換え核酸とを含むウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。

前述の方法に従って、該異種ヌクレオチド配列は、任意の治療用ポリペプチド（例えば、成長因子、抗異化作用因子又はそれらの組合せ）又は非翻訳ＲＮＡをコードすることができる。治療用ポリペプチド、成長因子、抗異化作用因子及び非翻訳ＲＮＡは、本明細書で考察される通りである。特定の実施形態では、該異種ヌクレオチド配列は、インスリン様成長因子Ｉ及び／又はインスリン様成長因子ＩＩ、インターロイキン受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＲＡＰ）、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−７）、ＲＡＮＫＬ及び／又はＶＥＧＦあるいはそれらの組合せをコードする。ウイルスベクターも本明細書で述べられる通りである。特定の実施形態では、該ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドであり、任意選択的に、該結合組織障害は、軟骨障害、半月板障害及び／又は滑膜障害である。該ウイルスベクターは二重鎖パルボウイルスベクターでよく、これも本明細書で述べられる通りである。

本発明は、限定されないが、骨障害及び／又は関節障害（軟骨障害、滑膜障害及び／又は半月板障害を含む）を含む任意の結合組織障害を治療するように実施され得る。例示的な結合組織障害には、骨折、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、軟骨障害（例えば、部分的もしくは完全な軟骨断裂、変性損傷及び／又は機械的損傷［外傷］のような軟骨欠損並びに／あるいはＡＣＬ靱帯断裂による軟骨損傷）、半月板断裂、スポーツ傷害（例えば、急性スポーツ傷害）、股関節形成異常又は前述の任意の組合せが含まれるが、これらには限定されない。

非限定的例として、軟骨障害（例えば、部分的もしくは完全な軟骨断裂又は軟骨欠損）、変形性関節症又はそれらの組合せを治療するため、インスリン様成長因子Ｉ及び／又はＩＩ、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−７）、ＶＥＧＦ並びに／あるいはＲＡＮＫＬをコードする核酸が対象に投与され得る。

別の例として、関節リウマチ及び／又は関節炎を治療するため、ＩＲＡＰをコードする核酸が対象に投与され得る。

更なる例として、骨折を治療するため、骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−７）、ＶＥＧＦ及び／又はＲＡＮＫＬをコードする核酸が対象に投与され得る。

更に他の代表的な実施形態では、骨髄由来の間葉系幹細胞が患者から除去され、あるいはドナーから得られ、ウイルスベクターがこれらに導入される。該ウイルスベクターは、ＩＧＦ−１及び／又はＩＩ、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−７）、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＫＬ並びに／あるいはＳｏｘ９を含むがそれらに限定されない、対象とする任意の異種ヌクレオチド配列を送達することができる。改変された細胞（又はその子孫）は骨欠損（例えば、骨折）又は軟骨欠損に移植され、そこで、それぞれ骨細胞又は滑膜細胞に分化することができる。

本発明は、軟骨の治癒及び／又は再生を亢進する方法も包含する。例示すると、特定の実施形態では、本発明は、軟骨の治癒及び／又は再生を亢進する細胞ベースの方法を提供し、該方法は、成長因子（例えば、インスリン様成長因子Ｉ）をコードする核酸を送達するウイルスベクターにより上述のように形質導入された細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。本発明の本態様に従って、該方法は、（ａ）該対象から細胞を除去するステップと、（ｂ）該細胞及び／又はその子孫に該ウイルスベクターを導入するステップと、（ｃ）（ｂ）の細胞及び／又はその子孫を該対象に投与するステップとを含み得る。あるいは、該細胞はドナー対象から採取することができ、該ウイルスベクターが該細胞に導入され、該細胞及び／又はその子孫が該対象に投与される。非限定的例として、該細胞は、軟骨細胞、滑膜細胞、線維軟骨細胞及び／又は骨髄由来間葉系幹細胞でよい。特定の実施形態では、該ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドを含み、且つ／あるいは該ウイルスベクターは二重鎖パルボウイルスベクターである。

他の実施形態に従って、本発明は、軟骨の治癒及び／又は再生を亢進する方法を提供し、該方法は、（ａ）ＡＡＶカプシドと、（ｂ）５’ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、成長因子（例えば、インスリン様成長因子Ｉ）とをコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換え核酸であって、該組換え核酸配列は該ＡＡＶカプシド内に包まれる組換え核酸とを含むウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。特定の実施形態では、該ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドを含み、且つ／あるいは該ウイルスベクターは二重鎖パルボウイルスベクターである。

軟骨の治癒及び／又は再生を「亢進する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「亢進する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「亢進する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」（及びそれらの文法的変形）とは、対象に対するある程度の利益である、軟骨の治癒及び／又は再生の増大及び／又は促進を意味し、例えば、少なくとも約２５％、５０％、７０％、８５％、１００％、２００％、３００％、５００％以上の増大及び／又は促進である。

本発明は、更に、関節炎（例えば、軟骨及び／又は滑膜）を低減する方法を提供する。例示すると、特定の実施形態では、本発明は、関節炎を低減する細胞ベースの方法を提供し、該方法は、上述のように、抗炎症因子及び／又は抗異化作用因子（例えば、ＩＲＡＰ及び／又はＴＮＦ−α可溶性受容体）をコードする核酸を送達するウイルスベクターが形質導入された細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。本発明の本態様に従って、該方法は、（ａ）該対象から細胞を除去するステップと、（ｂ）該細胞及び／又はその子孫に該ウイルスベクターを導入するステップと、（ｃ）（ｂ）の細胞及び／又はその子孫を該対象に投与するステップとを含み得る。あるいは、該細胞はドナー対象から採取することができ、該ウイルスベクターが該細胞に導入され、該細胞及び／又はその子孫が該対象に投与される。非限定的例として、該細胞は、軟骨細胞、滑膜細胞、線維軟骨細胞及び／又は骨髄由来の間葉系幹細胞であってよい。特定の実施形態では、該ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドを含み、且つ／あるいは該ウイルスベクターは二重鎖パルボウイルスベクターである。

また、本発明は、対象における関節炎を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）ＡＡＶカプシドと、（ｂ）５’ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、抗炎症因子及び／又は抗異化作用因子（例えば、ＩＲＡＰ及び／又はＴＮＦ−α可溶性受容体）をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、該組換え核酸配列は該ＡＡＶカプシド内に包まれる組換え核酸とを含むウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。特定の実施形態では、該ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドを含み、且つ／あるいは該ウイルスベクターは二重鎖パルボウイルスベクターである。

炎症を、「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低減する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低減する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」（及びそれらの文法的変形）とは、関節炎の減少及び／又は遅延及び／又は予防を意味し、例えば、少なくとも約２５％、３５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の関節炎の減少及び／又は遅延及び／又は予防である。

本発明は、研究並びに獣医学及び医療用途に使用を見出すものである。一般的に、好適な対象は哺乳動物対象である。本明細書で用いられるような「哺乳動物」という用語は、限定的ではないが、ヒト、非ヒト霊長動物、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯動物（例えば、ラット又はマウス）などを含む。ヒト対象には、新生児、乳幼児、若年者、成人及び高齢者対象が含まれる。

特定の実施形態では、対象は、結合組織障害を有し、あるいはそのリスクを有するとともに、本発明の方法を「必要」、例えば、本発明の方法の治療及び／又は予防効果を必要とするヒト又は動物対象（例えば、ウマ、イヌ又はネコ）である。例えば、該対象は、骨折、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、軟骨障害（例えば、部分的もしくは完全な軟骨断裂、変性損傷及び／又は機械的損傷［外傷］のような軟骨欠損並びに／あるいはＡＣＬ靱帯断裂後の軟骨損傷）、半月板断裂、スポーツ傷害及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される結合組織障害を有し、あるいはそのリスクを有し得る。

他の実施形態では、本発明の方法に用いられる対象は結合組織障害の動物モデル（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ又はブタ）である。

［医薬製剤及び送達経路］
特定の実施形態では、本発明は、医薬的に許容可能な担体中の本発明のウイルス粒子又は細胞と、任意選択的に、他の薬剤、医薬製剤、安定化剤、緩衝剤、担体、補助剤、希釈剤などを含む医薬組成物を提供する。注射では、通常、該担体は液体である。他の投与方法では、該担体は固体又は液体でよい。

「医薬的に許容可能」とは、（ｉ）該組成物をその使用目的に適さないようにすることなく、該組成物の他の成分と適合性があり、（ｉｉ）有意な不適当な有害副作用（例えば、毒性、刺激及びアレルギー反応）がなく、本明細書で示すような対象に用いるのに好適な材料を意味する。副作用は、そのリスクが該組成物により付与される利益を上回ると、「不適当」である。医薬的に許容可能な担体の例には、限定されずに任意の標準的な医薬担体が含まれ、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳剤のような乳剤、マイクロエマルションなどが含まれる。医薬的に許容可能な担体又は本発明の組成物は無菌担体又は組成物でもよい。

本発明の一態様は、ヌクレオチド配列を含むウイルスベクターをインビトロ（エクスビボを含む）にて細胞に移入する方法である。ウイルス粒子は、特定の標的細胞に適切な標準的な形質導入方法により、適切な感染多重度にて細胞に導入され得る。投与するウイルスの力価は、標的細胞の型及び数並びに特定のウイルスベクターに依存して異なってよく、不必要な試験を行うことなく当業者により決定され得る。特定の実施形態では、細胞は少なくとも約５×１０^２もしくは１０^３形質導入単位又は更には少なくとも約１０^４、１０^５、１０^６もしくは１０^７形質導入単位で接触される。

該細胞は、軟骨細胞、滑膜細胞、線維軟骨細胞、骨細胞又は骨髄由来の間葉系幹細胞を含むが、これらには限定されない任意の結合組織細胞でよい。更に、該細胞は本明細書で述べるように任意の起源種由来でよい。特定の実施形態では、該細胞はヒト由来又はウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジもしくはブタ由来である。

代表的な実施形態では、該細胞は軟骨細胞又は滑膜細胞であり、該ウイルスベクターはＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドを含む。任意選択的に、該ウイルスベクターは、更に、二重鎖パルボウイルスベクターでよい。

該ウイルスベクターは、対象に改変された細胞を投与することを目的として、インビトロで細胞に導入され得る。例えば、細胞を、対象から除去することができ、該ウイルスベクターを該細胞及び／又はその子孫に導入することができ、次に、該細胞及び／又はその子孫を該対象へ元に戻すことができる。エクスビボでの増殖及び／又は操作のため、細胞を対象から除去し、次に、該対象に導入し戻す方法は当分野で公知である。例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ社は、症候性軟骨欠損の修復に用いる対象の自家軟骨細胞を培養する市販のプロセスであるＣａｒｔｉｃｅｌ（登録商標）を提供している。あるいは、該ウイルスベクターを、ドナー対象由来細胞、培養細胞又は他の任意の好適な供給源由来の細胞に導入することができ、該細胞及び／又はその子孫を、それを必要とする対象に投与することができる。

エクスビボでの操作に好適な結合組織細胞は上述の通りである。対象に投与する細胞の用量は、年齢、該対象の病状及び種、細胞型、細胞により発現する核酸、投与方法などにより異なる。通常、１回の投与当たり、少なくとも約１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７又は１０^８から約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９又は１０^１０個の細胞が（下限が上限未満となる条件を満たす任意の組合せにて）医薬的に許容可能な担体中にて投与され得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターを形質導入された細胞及び／又はその子孫は、医薬担体と組み合わせて治療有効量で対象に投与される。

特定の実施形態では、二重鎖パルボウイルスベクターの有効用量は、類似の非二重鎖ｒＡＡＶベクターに対して少なくとも約１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍以上低減される。

本発明の更なる態様は、本発明のウイルスベクターを対象に直接投与する方法である。ヒト対象又は動物への該ウイルスベクターの投与は、ウイルスベクターを投与する、当分野で公知の任意の手段により可能である。特定の実施形態では、該ウイルスベクターは医薬的に許容可能な担体中で治療有効用量で送達される。このような剤形を調製する方法は当業者には公知であり、あるいは明らかである。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい。

対象に投与されるウイルスベクターの用量は、投与方法、治療される疾患もしくは病状、個々の対象の病状、特定のウイルスベクター及び送達される核酸に依存し、ルーチン式に決定され得る。例示的な投与は、少なくとも約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４もしくは１０^１５形質導入単位以上の用量であり、例えば、約１０^６、１０^７又は１０^８から１０^１０、１０^１１、１０^１２又は１０^１３形質導入単位である。

特定の実施形態では、二重鎖パルボウイルスベクターの有効用量は、類似の非二重鎖ｒＡＡＶベクターに対して少なくとも約１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍以上低減される。

一部の実施形態では、該ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドを含み、対象とする核酸を軟骨及び／又は滑膜に送達するのに用いられる。任意選択的に、該ウイルスベクターは二重鎖パルボウイルスベクターである。

特定の実施形態では、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、又はＡＡＶ６カプシドを含み、成長因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−７）、ＶＥＧＦ及び／又はＲＡＮＫＬをコードする異種ヌクレオチド配列を含むウイルスベクターは、軟骨の治癒及び／又は再生を亢進し、軟骨障害を治療し、且つ／あるいは変形性関節症を治療するために投与される。任意選択的に、該ウイルスベクターは二重鎖パルボウイルスベクターである。

更に、他の例示的な実施形態では、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、又はＡＡＶ６カプシドを含み、抗異化作用因子をコードする異種ヌクレオチド配列を含むウイルスベクターは、炎症を低減し、且つ／あるいは変形性関節症を治療するために投与される。任意選択的に、該ウイルスベクターは二重鎖パルボウイルスベクターである。

本発明の方法に従って、所望のレベルの遺伝子産物をもたらすため、種々の間隔期間にわたり、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年など、２回以上の投与（例えば、２回、３回、４回以上の投与）が用いられ得る。

本発明の方法は、結合組織障害を治療するための他の任意の好適な治療法を併用して実施され得る。

本発明のウイルスベクター、細胞及び医薬製剤は当分野で公知の任意の方法により投与することができ、これには、直接注射、例えば、関節（例えば、軟骨、滑膜、半月板及び／又は骨髄）への直接注射、静脈内投与（任意選択的に、対象とする標的細胞を標的とするように改変されたベクターにより）又はベクター、細胞もしくは医薬製剤を含有する生体材料（例えば、コラーゲンゲル）の適用による方法（例えば、骨折のような骨欠損又は軟骨断裂もしくは半月板断裂のような軟骨又は半月板欠損を充填する移植）が含まれるが、これらには限定されない。別の例として、該ウイルス又は細胞をデポ又は徐放製剤にて投与することができる。更に、ウイルスベクターは外科的に移植可能なマトリックス、例えば、骨移植片もしくは骨移植片代替物、縫合材又は他の外科的に移植可能な材料に乾燥状態で送達され得る（例えば、米国特許公開公報第ＵＳ−２００４−００１３６４５−Ａ１号に述べられているように）。

任意の所与の症例における最も好適な経路はルーチンに決定することができ、治療される病状の性質及び重症度、対象のサイズ、種及び病状並びに用いられる特定のベクターの性質を含む様々な要素に依存する。

結合組織への直接投与（例えば、関節又は骨への直接投与）は、当分野で公知の任意の好適な方法により達成可能であり、例えば、結合組織、関節もしくは骨内又はその近傍での注射による方法、あるいは、例えば、生体材料と組み合わせた細胞の移植による方法、あるいは局所投与の他の任意の方法、例えば、米国特許公開公報第ＵＳ−２００４−００１３６４５−Ａ１号に述べられているような、外科的に移植可能なマトリックスへの乾燥したウイルスベクターの投与である。

特定の実施形態では、本発明のウイルスベクター又は細胞は、生体材料と組み合わせて結合組織に（例えば、骨折、半月板断裂又は軟骨断裂又は他の欠損に）移植することができる。例えば、ウイルスベクター又はウイルスベクターを形質導入された細胞は、ポリマー（例えば、コラーゲンゲル又はフィブリン接着剤）のような生体材料と組み合わせることができ、該ウイルスベクター又は細胞と組み合わせた該生体材料は、骨、軟骨、半月板、滑膜などの欠損を充填するのに用いられる。

本発明の本態様は、多種多様な生体適合性マトリックスにより実施することができる。任意選択的に、該マトリックスは生分解性である。好適な生分解性マトリックスは当分野で公知であり、非限定的にコラーゲン−ＧＡＧ、コラーゲン、フィブリン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）及びＰＬＡ−ＰＧＡコポリマーを含む。更なる生分解性材料には、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフマレート（ｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅｓ））、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン及びポリサッカライドが含まれる。非生分解性ポリマーも用いられ得る。例えば、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン及びそれらの誘導体は、移植された細胞に付加的な刺激を付与し得る有用な電導性ポリマーである。他の非生分解性であるが生体適合性のポリマーには、ポリスチレン、ポリエステル、非生分解性ポリウレタン、ポリウレア、ポリ（エチレンビニルアセテート）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリ（エチレンオキシド）が含まれる。これは、本発明の実施に好適なポリマーの例示的であって包括的ではない一覧であることを当業者は認識する。

該ウイルスベクター及び／又は細胞は、例えば、米国特許公開公報２００６／００７８５４２ Ａ１（Ｍａｈ ｅｔ ａｌ．）に述べられているような水溶性生体適合性ゲルと組み合わせて直接（例えば、注射又は移植により）投与することもできる。生体適合性ゲルは、ゾル、マトリックス、バイオゲル、ヒドロゲル、ポリマー、ポリサッカライド、オリゴサッカライド又は粘稠懸濁液を含んでもよく、これらは任意選択的に、架橋、安定化、化学的結合あるいは修飾され得る。生体適合性ゲルは１つ以上の市販のゲル化合物を含んでもよく、これには、例えば、アルギン酸ヒドロゲルＳＡＦ−Ｇｅｌ（ＣｏｎｖａＴｅｃ社、ニュージャージー州プリンストン）、Ｄｕｏｄｅｒｍ Ｈｙｄｒｏａｃｔｉｖｅ Ｇｅｌ（ＣｏｎｖａＴｅｃ社）、Ｎｕ−ゲル（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ社、テキサス州アーリントン（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ））；Ｃａｒｒａｓｙｎ（Ｖ）Ａｃｅｍａｎｎａｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、テキサス州アービング（Ｉｒｖｉｎｇ））；グリセリンゲルＥｌｔａ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｓｗｉｓｓ−Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、テキサス州ダラス）、Ｋ−Ｙ Ｓｔｅｒｉｌｅ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ社）又はそれらの組合せが含まれる。

非経口投与に好適な医薬組成物は、本発明の組成物の水性及び非水性無菌注射液を含んでもよく、これらの調製物は対象レシピエントの血液及び／又は他の体液と等張であることが好ましい。これらの調製物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び溶質を含んでもよく、これらは、該組成物を対象レシピエントの血液及び／又は他の体液と等張にさせる。水性及び非水性無菌懸濁液、溶液及び乳液は懸濁剤及び増粘剤を含み得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油及びオレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、乳液又は懸濁液が含まれ、生理食塩水及び緩衝媒体が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液あるいは固定油が含まれる。静注用ビヒクルには、流体及び栄養補充物、電解質補充物（例えば、リンガーのデキストロース液をベースにしたもの）などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスなどのような保存剤及び他の添加剤も存在してよい。

注射剤は、液状溶液又は懸濁液、注射前の液状の溶液又は懸濁液に好適な固体形態あるいは乳剤として従来の形態にて調製され得る。即時注射液及び懸濁液は、前述のような種類の無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。例えば、密封容器内の単位剤形での本発明の注射用安定性無菌組成物が提供され得る。該組成物は凍結乾燥物の形態で提供することができ、これは、好適な医薬的に許容可能な担体と再構成され、対象への注射に好適な液状組成物を形成することができる。該単位剤形は本発明の組成物の約１μｇから約１０グラムでよい。該組成物が実質的に水不溶性である場合、生理的に許容可能な乳化剤の十分な量が水性担体中の該組成物を乳化するのに十分な量にて含まれ得る。このような有用な乳化剤の１つはホスファチジルコリンである。

該組成物は、単位投与又は複数投与容器、例えば、密封アンプル又はバイアルにて提示することができ、使用直前に無菌液体担体、例えば、生理食塩水又は注射用の水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。

ここまで本発明について述べ、以下の実施例において同発明について更に詳細に説明する。該実施例は単に例示することを目的として本明細書に含まれるものであり、本発明を限定するものではない。

［材料及び方法］
［細胞培養の調製及び形質導入］
未成熟子ウマの大腿膝蓋関節及び肩甲上腕関節からウマ軟骨細胞及び滑膜細胞を採取した。培養液１ｍｌ当たり０．７５ｍｇのコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）中で関節を分解消化した。組織の分解消化後、細胞を計数し、液体窒素中に保存した。Ｌ−グルタミン（３００μｇ／ｍｌ）、α−ケトグルタル酸（３０μｇ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社、ニューヨーク州グランドアイランド）に、５０％集密度で細胞単層を播種した。２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ、ニューヨーク州コーニング）にて培養物を二重に増殖させた。

［ＡＡＶ血清型の初期スクリーニング］
播種後２日目に、無血清培養液で細胞を洗浄した。次に、１００００、１０００、１００及び１０ウイルス粒子／細胞での、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に誘導された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）構築物を送達する自己相補的ｒＡＡＶ血清型１、２、３（血清型３Ｂ）、４、６もしくは８ベクター、あるいは１０００、１００、１０及び１ウイルス粒子／細胞にて最低力価を有するｒＡＡＶ血清型５を細胞に形質導入した。無血清最小必須培地（ＧＩＢＣＯ社、ニューヨーク州グランドアイランド）中、３７℃で４時間、細胞にウイルスを取り込ませ、次に、上述のＨａｍ’ｓ Ｆ１２補足増殖培地で栄養を与えた。４８時間ごとに増殖培地を交換した。４７２ｎｍでの励起、５１２ｎｍでの発光、及び４９５ｎｍ発光カットオフフィルタによるＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ−ＸＳ蛍光光度計を用いて、蛍光を毎日測定した。１０回の読取り／ウェルを用いてウェル表面全体を走査した。２０倍光学ズーム＋１．５倍エクストラズーム、並びに３３０〜３８５ｎｍの励起及び４２０ｎｍ超の発光を有するＷＵフィルタを備えたオリンパス社製ＩＸ７０蛍光顕微鏡も用いて、ＧＦＰの蛍光をモニタした。該細胞が蛍光を発する期間をモニタするため、９０日間にわたり毎日、この顕微鏡及びＢｉｏＱｕａｎｔソフトウェアを用いて画像を得た。

［選定ＡＡＶ血清型の最適化及び用量応答］
該血清型の初期スクリーニングから、更なる最適化及び用量応答のために４つの最適なＡＡＶ血清型（血清型２、３、５及び６）を用いた。播種後２日目に、８０００、４０００、２０００、１０００及び５００ウイルス粒子／細胞にて、血清型２、３及び６を軟骨細胞及び滑膜細胞に形質導入した。血清型５は４０００、２０００、１０００及び５００ウイルス粒子／細胞にて形質導入した。上記方法により、毎日、細胞の蛍光をモニタした。細胞が１００％超の集密度に達すると、形質導入細胞の生存率を定量し、トリパンブルー（ＧＩＢＣＯ社、ニューヨーク州グランドアイランド）染色を用いて総生存細胞数対死滅細胞数を計算した。

［滑膜細胞及び軟骨細胞に対する血清型の毒性］
定量的ＰＣＲとウマＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３及びアグリカナーゼの相対的遺伝子発現により、ＡＡＶ血清型の毒性を測定した。全遺伝子の発現をウマＧＡＰＤＨの発現レベルと比較した。ＲＮＥＡＳＹミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ））を用いて細胞からＲＮＡを抽出した。ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩＩ第一鎖合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））により、５０ｎｇの総ＲＮＡ及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて相補的ＤＮＡを作製した。ウマＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３及びＧＡＰＤＨプライマー／プローブは、Ｌｕｃｙ Ｗｈｉｔｔｉｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（カリフォルニア州立大学デービス校、カリフォルニア州デービス）から入手した。アグリカナーゼ配列は以下の通りであった。順方向プライマー５’−ＧＣＣＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡ−３’（配列番号１）、逆方向プライマー５’−ＣＣＡＡＣＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＡＡＴＴＧＴ−３’（配列番号２）及びプローブ５’−ＦＡＭ−ＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＣＴＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３）。５０℃で２分間の維持；９５℃で１０分間の変性、次に、９５℃で１５秒間の変性、及び６０℃で３０秒間のアニールの４０サイクルにより、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ）にて、１サンプル（二重）当たり２．５ｎｇのＲＮＡを用いて定量的ＰＣＲを行った。

［結果］
図１はＡＡＶ−ＧＦＰ血清型１、２、３、４、５、６又は８による形質導入後７日目での軟骨細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。最上段は１細胞当たり１０，０００ウイルス粒子を表し、二段目は１細胞当たり１０００、三段目は１００、最下段は１０ウイルス粒子を表す。この初期スクリーニングからの軟骨細胞の最適な血清型は、ＡＡＶ−ＧＦＰ血清型２、３、５及び６であった。

図２はＡＡＶ−ＧＦＰ血清型１、２、３、４、５、６又は８による形質導入後７日目での滑膜細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。最上段は１細胞当たり１０，０００ウイルス粒子を表し、二段目は１細胞当たり１０００、三段目は１００、最下段は１０ウイルス粒子を表す。この初期スクリーニングからの滑膜細胞の最適な血清型は、ＡＡＶ−ＧＦＰ血清型２、３、５及び６であった。

図３はＡＡＶ−ＧＦＰ血清型２、３、５及び６に対する第２セットの軟骨細胞の形質導入を表す蛍光顕微鏡写真を示す。最上段は１細胞当たり８０００ウイルス粒子を表し、二段目は４０００、三段目は２０００、四段目は１０００、最下段は５００を表す。血清型２及び６は最適な形質導入を示し、血清型２と６との効率差は最小限であった。しかし、血清型２を形質導入された軟骨細胞の細胞形態は円形及び円鋸歯状細胞型を示し、単層の軟骨細胞には非定型な特徴である。全体的形態から、ＡＡＶ−ＧＦＰ血清型６は、１細胞当たり８０００と４０００とのウイルス粒子に形質導入の効率差がほとんどなく、ウマ軟骨細胞に最適な血清型であるように思われる。

図４はＡＡＶ−ＧＦＰ血清型２、３、５及び６に対する第２セットの滑膜細胞の形質導入を表す蛍光顕微鏡写真を示す。最上段は１細胞当たり８０００ウイルス粒子を表し、二段目は４０００、三段目は２０００、四段目は１０００、最下段は５００を表す。血清型２及び３は最適な形質導入を示し、血清型２と３との効率差は最小限であった。しかし、血清型２を形質導入された滑膜細胞の細胞形態は円形及び円鋸歯状細胞型を示し、単層の滑膜細胞には非定型な特徴である。全体的形態から、ＡＡＶ−ＧＦＰ血清型３は、１細胞当たり８０００と４０００とのウイルス粒子に形質導入の効率差がほとんどなく、ウマ滑膜細胞に最適な血清型であるように思われる。

図５は継代３（５１日目）までの軟骨細胞（上図）及び滑膜細胞（下図）における異なるＡＡＶ血清型の形質導入効率を表す。軟骨細胞における４つの血清型（２、３、５及び６）の形質導入効率は、３日目で４８％〜８５％の範囲であった。形質導入効率は７日目で上昇し、次に、１７日目で３８％（血清型５）〜６５％（血清型６）低下した。形質導入効率は継代２を通して３０〜５０パーセントの範囲で継続した。この時点（３５日目）で細胞集団は細胞増殖及び継代により、約２５％の初期細胞のみからなった。

滑膜細胞に対する形質導入効率は３８％（血清型５）〜８２％（血清型２及び３）の範囲であった。形質導入効率は７日目まで上昇し、１７日目（継代１）で低下した。血清型３は継代３まで最適な形質導入効率を維持するように思われた。軟骨細胞と同様に、５１日目で細胞集団は細胞増殖及び継代により、約２５％の初期細胞のみからなった。

図６は全血清型に対して１細胞当たり４０００ウイルス粒子でのＡＡＶ−ＧＦＰ血清型２、３、５及び６の１日目から７日目までの蛍光光度計で測定した相対的蛍光度を表す。血清型６は血清型２、５及び６に対して最適な蛍光度を示した。滑膜細胞（下部パネル）における相対的蛍光度は、血清型２と３が４日を通して互いに同等であり、７日目で血清型３は血清型２を上回る蛍光度を有した。

図７は軟骨細胞（上部パネル）及び滑膜細胞（下部パネル）の細胞生存率を表す。細胞生存率は、継代１（１５日目）、２（３６日目）及び３（５２日目）にて定量した。軟骨細胞の細胞生存率は継代１及び３にて血清型６に対して最適であった。滑膜細胞の細胞生存率は継代１（１５日目）にて血清型６に対して最適であった。

図８及び図９は血清型６が形質導入された軟骨細胞（図８）及び血清型３が形質導入された滑膜細胞（図９）に対する炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。１細胞当たり０〜２０００のウイルス粒子投与量では最小差が存在した（４０００及び８０００の力価では十分なＲＮＡが採取されなかった）。図１０は軟骨細胞における血清型２のＭＭＰ１ ＲＮＡ発現（左上図）を示し、ウイルス力価の上昇での血清型２に対するＭＭＰ１の微増を示唆している。ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３及びアグリカナーゼ１のＲＮＡ発現プロファイルは、血清型による相違を示さなかった。

［ｓｃＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ材料及び方法］
ウマ後膝関節由来の軟骨細胞及び滑膜細胞を５０％集密度で４８ウェル培養ディッシュにて二重に培養した。４０００粒子／細胞にて血清型６（Ｓ６）ｓｃＡＡＶ−インスリン成長因子Ｉ（ｓｃＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ）を軟骨細胞に形質導入し、４０００粒子／細胞にて血清型３（Ｓ３）ｓｃＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉを滑膜細胞に形質導入した。トリプシン処理前に形質導入後３日間、細胞を単層にて増殖させ、次に、アルギネート中で培養した。アルギネート中の増殖がＩＧＦ産生に作用を及ぼすかを検討するため、細胞の一部を持ち上げ、単層にて再プレーティングした。

アルギネートキャスティングのため、細胞を単層から持ち上げ、細胞ペレットをＰＢＳ中８０μｌの１．２％アルギネートを含む２０μｌの１倍ＰＢＳ中に再懸濁させた。そのアルギネート混合物を１０２ｍＭのＣａＣｌ_２に滴加して、ビーズを形成した。このＣａＣｌ_２を除去し、Ｌ−グルタミン（３００μｌ／ｍｌ）、α−ケトグルタル酸（３０μｌ／ｍｌ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ社、ニューヨーク州グランドアイランド）及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社、ユタ州ローガン（Ｌｏｇａｎ））を含むＦ−１２培地（（ＧＩＢＣＯ社、ニューヨーク州グランドアイランド）に置き換えた。形質導入後、３、７、１０及び１４日目に培地を回収した。次に、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製のｑｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＩＧＦサンドイッチＥＬＩＳＡキットを用いて、培地をアッセイしてＩＧＦ産生を調べた。

細胞増殖及びＩＧＦ産生に最適のアルギネート濃度を求めるため、ｓｃＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉの上記血清型を細胞に形質導入し、１．２、１．０、０．８及び０．６％アルギネート中で二重に増殖させた。細胞を３日間増殖させ、持ち上げ及びアルギネート中での培養前に計数した。これを第０日目と考えた。増殖培地を除去し、５〜１０分間、それをアルギネート分解緩衝液（５５ｍＭクエン酸Ｎａ、３０ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に置き換えることにより、アルギネートマトリックスから細胞を採取した。細胞をこの緩衝液に再懸濁させ、８０００×ｇで５分間、遠心分離し、緩衝液を吸引し、細胞ペレットをＰＢＳ ５００μｌ中に再懸濁させた。トリパンブルーによる染色及び計数のためにアリコートを除去した。７日目及び１４日目に培地を回収し、形質導入後３、７、１０及び１４日目に増殖をモニタした。

［結果］
軟骨細胞（図１１Ａ）及び滑膜細胞（図１１Ｂ）の単層培養は、１４日間にわたり、アルギネート培養と比較した場合、最大のＩＧＦ産生を有した。アルギネート培養におけるＩＧＦ産生の減少はアルギネート濃度に起因し得る。

軟骨細胞（図１２Ａ）及び滑膜細胞（図１２Ｂ）は、アルギネート中で培養される前の０日目に最大の増殖を有した。経時的に、０．８％アルギネートは他のアルギネート構築物より多い細胞増殖を有するようであった。

軟骨細胞では、ＩＧＦの最大の産生は０．８％アルギネート中にて７日目に生じた（図１３Ａ）。滑膜細胞は１．０％アルギネート中にて１４日目に最大のＩＧＦ産生を有した（図１３Ｂ）。両細胞型でＩＧＦ産生は７日目に０．６％アルギネートにて高かった。

［ＡＡＶ−ＧＦＰ材料及び方法］
［フローサイトメトリーによる形質導入効率の定量］
血清型の第二のスクリーニングから、フローサイトメトリーを用いたＧＦＰ細胞集団の選択に４つの最適なＡＡＶ血清型（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６）を用いた。４頭の子ウマ由来の軟骨細胞及び滑膜細胞を二重に播種した。細胞が５０％集密度になると、４０００、２０００及び１０００粒子／細胞にてＳ２、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６を形質導入した。蛍光光度計示度、血球計計数及びフローサイトメトリーによりＧＦＰ蛍光をモニタすることにより、形質導入効率を測定した。３、７、１０及び１４日目に蛍光光度計示度を得た。細胞を０．２５％トリプシンで処理し、単層から細胞を持ち上げ、増殖培地５００μｌ中に再懸濁させ、７日及び１４日目にフローサイトメトリーにより分類するため、複製ウェルを各状態で１つの微量遠心管に合体させた。３０ｐｓｉのシース圧及び１２，０００イベント／秒の流量で用いられる１００ミクロン・フローセルチップ並びにレーザー出力１１０を有する４８８ｎｍレーザー線を備えたＭｏＦｌｏ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ／Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄａｋｏ社、コロラド州フォートコリンズ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ））にて分類を行った。中性密度２．０フィルタ、次に、５３０／５４０帯域通過フィルタ及びログシグナル（ｌｏｇ ｓｉｇｎａｌ）を有する４００〜４５０の高電圧により、ＧＦＰ蛍光に基づき細胞を分類した。ＳＵＭＭＩＴソフトウェア（バージョン４．０、Ｄａｋｏ社、コロラド州フォートコリンズ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ））を用いてヒストグラムを回収し、分類パラメータを設定した。７日及び１４日目に血球計計数を得た。簡潔に述べると、５０μｌの細胞懸濁液を同量のトリパンブルーと混合し、細胞を血球計に配置し、生存細胞、死滅細胞及び蛍光細胞の数を計算した。分類後、血球計計数により判定した細胞集団の８０％をＲＮＡ単離のために保存し、一方、細胞集団の２０％を最長で１４日目まで更なる蛍光のモニタリングのため、２４ウェルプレートの１つのウェルに再プレーティングした。

［ＡＡＶ血清型の形態的効果］
ＡＡＶ血清型２、３、５及び６の形質導入後、０、３、６、１０及び１４日目に細胞をスコアリングした。形態的特徴に基づき、０〜５のスコアを細胞に付した。異常な形態的特徴は、円形、円鋸歯状又はプレートからの離昇であると考えた。スコアリングは以下の通りであった。１＝細胞の１〜２０％が異常な細胞形態を有し、２＝２１〜４０、３＝４１〜６０、４＝６１〜８０、５＝８１〜１００％の異常を有した。２００倍率での５像を評価し、平均スコアを求めた。

［定量的ＰＣＲを用いた炎症性分子の評価］
定量的ＰＣＲとウマＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３及びアグリカナーゼ（ＡＧＧＲアーゼ）の相対的遺伝子発現により、ＡＡＶ血清型の毒性を測定した。全遺伝子の発現をウマＧＡＰＤＨの発現レベルと比較した。ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ及びＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ））を用いて、７日目に細胞からＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ第一鎖合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））により、５０ｎｇの総ＲＮＡ及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて相補的ＤＮＡを作製した。ウマＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３及びＧＡＰＤＨプライマー／プローブは、Ｌｕｃｙ Ｗｈｉｔｔｉｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（カリフォルニア州立大学デービス校、カリフォルニア州デービス）から入手した。これらの遺伝子の配列は以下の通りであった。ＭＭＰ−１順方向５’−ＡＡＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡ−３’（配列番号４）、逆方向５’−ＧＧＧＴＡＴＣＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＡＴＣＣＴ−３’（配列番号５）、プローブ５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＡＴＴＡＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＣＧＧＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号６）；ＭＭＰ−３順方向５’−ＡＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＧＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号７）、逆方向５’−ＡＣＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣ−３’（配列番号８）、プローブ５’−ＦＡＭ−ＡＧＧＧＡＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号９）。アグリカナーゼ配列は、順方向５’−ＧＣＣＴＴＣＡＣＴ ＧＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡ−３’（配列番号１）、逆方向５’−ＣＣＡＡＣＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＡＡＴＴＧＴ−３’（配列番号２）及びプローブ５’−ＦＡＭ−ＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＣＴＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３）であった。９５℃で３分間の維持；次に、単一収集モードによる９５℃で１０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニール及び７２℃で１秒間の伸長の４０サイクルにより、３８４ウェルＲｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｌｃｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナ州インディアナポリス）にて、１サンプル（二重）当たり２．５ｎｇのＲＮＡを用いて定量的ＰＣＲを行った。各遺伝子についてサンプルサイクル閾値データを基準に正規化し、対象遺伝子対ＧＡＰＤＨ比に関し、互いを比較した。

［結果］
種々の血清型のＡＡＶ−ＧＦＰによる軟骨細胞の７日目及び１４日目における形質導入効率を、それぞれ図１４Ａ及び１４Ｂに示す。種々の血清型のＡＡＶ−ＧＦＰによる滑膜細胞の７日目及び１４日目における形質導入効率を、それぞれ図１４Ｃ及び１４Ｄに示す。

ＡＡＶ−ＧＦＰ血清型２、３、５及び６の軟骨細胞における、炎症性分子ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３及びＡＧＧＲアーゼのＲＮＡ発現により測定されるような炎症プロファイルを、それぞれ図１５Ａ〜Ｄに示す。ＡＡＶ−ＧＦＰ血清型２、３、５及び６の滑膜細胞における、炎症性分子ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３及びＡＧＧＲアーゼのＲＮＡ発現により測定されるような炎症プロファイルを、それぞれ図１６Ａ〜Ｄに示す。

［ウマ骨髄幹細胞の採取及び培養］
２〜５歳のウマ対象の胸骨及び腸骨稜から骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を採集した。６０ｍｌ滅菌シリンジに３ｍｌの１００００倍ヘパリン及び３ｍｌの無菌濾過０．９％生理食塩水を充填することにより、５０００倍ヘパリン溶液を作製した。１００ｇで１分間、サンプルを遠心分離することにより、有核細胞を除去した。上層（血清）を除去し、新規の１５ｍｌ円錐形遠心管に入れた。該骨髄血清を２００ｇで５分間回転させ、有核細胞をペレット化した。該血清を該細胞ペレットから除去し、元の骨髄血管に加え戻した。該細胞ペレットを１倍ＰＢＳ中に再懸濁させ、７０μｍ細胞濾過器に通して濾過し、有核細胞集団を求めるため、ＮＨ_４Ｃｌ中、希釈率１：１０の細胞を計数した。次に、該ＰＢＳ細胞溶液を後の細胞播種のために保存した。元の骨髄血管を混合し、更に２回、上記プロセスに曝し、ＰＢＳを含む懸濁液中の有核細胞の更に２つのアリコートを生成した。該アリコートを１０００ｇで１０分間遠心分離し、該懸濁液中の全ての有核細胞及び赤血球を回収した。遠心分離後、該細胞ペレットをまとめ、播種培地（ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社、ニューヨーク州グランドアイランド）、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社、ユタ州ローガン（Ｌｏｇａｎ））、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ社、ニューヨーク州グランドアイランド）、３００μｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ社、ニューヨーク州グランドアイランド）及び５０Ｕ／ｍｌペニシリン／５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社、ニューヨーク州グランドアイランド））で再懸濁し、次の細胞密度にて培養フラスコ内に入れた。７．０×１０^６細胞でのＴ２５、２０×１０^６細胞でのＴ７５及び４０×１０^６細胞でのＴ１５０。コロニーが形成されるまで５％ＣＯ_２下にて３７℃で細胞を増殖させた。

まず、細胞をＰＢＳで洗浄し、９０秒間トリプシン処理することにより、骨髄幹細胞コロニーを増殖フラスコから持ち上げた。細胞を播種培地で懸濁し、血球計で計数し、２００ｇで５分間遠心分離し、骨髄幹細胞をペレット化した。次に、該ペレットを増殖培地（α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社、ニューヨーク州グランドアイランド）、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００μｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び５０Ｕ／ｍｌペニシリン／５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中に再懸濁させ、２５〜３０％集密度にて培養フラスコ中に播種した。次のようであった。４８０，０００細胞でのＴ２５及び１．５×１０^６細胞でのＴ７５。細胞を２４〜３６時間増殖させ、トリプシン処理により採取し、増殖培地を含む、より大きい培養フラスコ内に再播種した。コロニーから細胞を３回のみ継代培養した後、細胞を採取し、凍結培地（８５％ＦＢＳ及び５％ＤＭＳＯを含むα−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）中で凍結させ、アッセイに用いるまで液体窒素中で保存した。アッセイのため、細胞を液体窒素貯蔵庫から取り出し、３７℃水槽中で速やかに解凍した。細胞を播種培地中に懸濁させ、計数し、２００ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを増殖培地中に再懸濁させて３０％集密度（３０％＝１５，０００細胞／ｃｍ^２）にて単層培養物を生成し、４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ、ニューヨーク州コーニング）にプレーティングした。

［ＡＡＶ血清型（Ｓ１〜Ｓ８）のスクリーニング］
ＭＳＣを４８ウェル培養プレートの二層ウェルに播種し、４０００粒子／細胞の各ｓｃＡＡＶ−ＧＦＰ血清型（Ｓ１〜Ｓ８）を形質導入した。簡潔に述べると、細胞を０．５ｍｌの１倍ＰＢＳで洗浄し、上記のようにウイルスを０．２ｍｌのＤＭＥＭに加えた。無血清ＤＭＥＭ中、３７℃で４時間、細胞にウイルスを取り込ませ、次に、播種培地で栄養を与え、最終容量は０．５ｍｌとなった。０．５ｍｌ容量にて４８時間ごとに増殖培地を交換した。４７２ｎｍでの励起、５１２ｎｍでの発光及び４９５ｎｍ発光カットオフフィルタによるＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ−ＸＳ蛍光光度計を用いて、蛍光を毎日測定した。１０回の読取り／ウェルを用いてウェル表面全体を走査した。一貫性のない示度により、２０日目に蛍光光度計の読取りを中止した。２０倍光学ズーム＋１．５倍エクストラズーム、並びに３３０〜３８５ｎｍの励起及び４２０ｎｍ超の発光を有するＷＵフィルタを備えたオリンパス社製ＩＸ７０蛍光顕微鏡も用いて、ＧＦＰの蛍光をモニタした。当初の２０日間、３日ごとにこの顕微鏡及びＢｉｏＱｕａｎｔソフトウェアを用いて画像を得た。０．２５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））による処理と、蛍光顕微鏡及びトリパンブルー染色を用いた血球計にて蛍光細胞を計数することにより、３、７、１０、１４、１７及び２０日目に、約１００％集密度に達すると、形質導入効率及び生存率について細胞を評価した。

［結果］
形質導入後１０日目に４０００粒子／細胞でのＡＡＶ−ＧＦＰ形質導入ＭＳＣの形質導入画像を作成した。Ｓ２は最大の蛍光を発し、Ｓ３はＳ２の蛍光の約５０％であり、Ｓ５及びＳ６はＳ２の２０％であった。Ｓ３の形質導入効率は経時的に上昇するように思われる（図１７Ｂ）。ＡＡＶ−ＧＦＰで形質導入されたＭＳＣの生存率は、１７日目までは６０〜１００％であり、１７日目にはＭＳＣは過剰増殖したように思われ、培養プレートから離昇し始めた（図１７Ａ）。明らかにＭＳＣの形質導入がほとんどあるいは全くないことにより、１０日目を経過したＡＡＶ−ＧＦＰ血清型Ｓ１、Ｓ４及びＳ８の数値は示されていない。

前述の内容は本発明を例示するものであって、本発明を限定するものと捉えるべきではない。本発明は、上述の特許請求の範囲により定義され、特許請求の範囲の等価物は本明細書に含まれるものとする。

ＡＡＶ−ＧＦＰ血清型１、２、３、４、５、６及び８（縦列左方から右方へ：血清型１（Ｓ１）、２（Ｓ２）、３（Ｓ３）、４（Ｓ４）、５（Ｓ５）、６（Ｓ６）及び８（Ｓ８））による形質導入後７日目での軟骨細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。最上段は１細胞当たり１０，０００ウイルス粒子を表し、二段目は１細胞当たり１０００、三段目は１００、最下段は１０ウイルス粒子を示す。 ＡＡＶ−ＧＦＰ血清型１、２、３、４、５、６及び８（縦列左方から右方へ：血清型１（Ｓ１）、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６及びＳ８）による形質導入後７日目での滑膜細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。最上段は１細胞当たり１０，０００ウイルス粒子を表し、二段目は１細胞当たり１０００、三段目は１００、最下段は１０ウイルス粒子を示す。 ＡＡＶ−ＧＦＰ血清型２、３、５及び６（縦列左方から右方へ：血清型２（Ｓ２）、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６）に対する第２セットの軟骨細胞の形質導入を示す蛍光顕微鏡写真である。最上段は１細胞当たり８０００ウイルス粒子を表し、二段目は４０００、三段目は２０００、四段目は１０００、最下段は５００を示す。 ＡＡＶ−ＧＦＰ血清型２、３、５及び６（縦列左方から右方へ：血清型２（Ｓ２）、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６）に対する第２セットの滑膜細胞の形質導入を示す蛍光顕微鏡写真である。最上段は１細胞当たり８０００ウイルス粒子を表し、二段目は４０００、三段目は２０００、四段目は１０００、最下段は５００を示す。 継代３（５１日目）までの軟骨細胞（上図）及び滑膜細胞（下図）におけるＡＡＶ血清型２（Ｓ２）、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６の形質導入効率を表す。 全血清型に対して１細胞当たり４０００ウイルス粒子でのＡＡＶ−ＧＦＰ血清型２（Ｓ２）、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６の１日目から７日目までの蛍光光度計で測定した軟骨細胞（上図）及び滑膜細胞（下図）の相対的蛍光度を表す。 軟骨細胞（上図）及び滑膜細胞（下図）の細胞生存率を表す。細胞生存率は継代１（１５日目）、継代２（３６日目）及び継代３（５２日目）にて定量した。 血清型６（Ｓ６）を形質導入された軟骨細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 血清型３（Ｓ３）を形質導入された滑膜細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 ＡＡＶ血清型２（Ｓ２）を形質導入された軟骨細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 アルギネート培養における、ウマ後膝関節由来のｒＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ Ｓ６形質導入軟骨細胞における、種々の増殖条件下でのＩＧＦの発現を示す。 アルギネート培養における、ウマ後膝関節由来のｒＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ Ｓ３形質導入滑膜細胞における、種々の増殖条件下でのＩＧＦの発現を示す。 ０、３、７、１０及び１４日目におけるアルギネート中のｒＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ Ｓ６形質導入軟骨細胞の細胞増殖を示す。 ０、３、７、１０及び１４日目におけるアルギネート中のｒＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ Ｓ３形質導入滑膜細胞の細胞増殖を示す。 ｒＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ Ｓ６形質導入軟骨細胞の細胞増殖及びＩＧＦ産生に最適のアルギネート濃度の判定を示す。 ｒＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ Ｓ３形質導入滑膜細胞の細胞増殖及びＩＧＦ産生に最適のアルギネート濃度の判定を示す。 ７日目における種々の力価でのＡＡＶ−ＧＦＰ Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６の軟骨細胞における形質導入効率を示す。 １４日目における種々の力価でのＡＡＶ−ＧＦＰ Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６の軟骨細胞における形質導入効率を示す。 ７日目における種々の力価でのＡＡＶ−ＧＦＰ Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６の滑膜細胞における形質導入効率を示す。 １４日目における種々の力価でのＡＡＶ−ＧＦＰ Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６の滑膜細胞における形質導入効率を示す。 種々のＡＡＶ−ＧＦＰ血清型が形質導入された軟骨細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 種々のＡＡＶ−ＧＦＰ血清型が形質導入された軟骨細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 種々のＡＡＶ−ＧＦＰ血清型が形質導入された軟骨細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 種々のＡＡＶ−ＧＦＰ血清型が形質導入された軟骨細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 種々のＡＡＶ−ＧＦＰ血清型が形質導入された滑膜細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 種々のＡＡＶ−ＧＦＰ血清型が形質導入された滑膜細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 種々のＡＡＶ−ＧＦＰ血清型を形質導入された滑膜細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 種々のＡＡＶ−ＧＦＰ血清型が形質導入された滑膜細胞における炎症性分子のＲＮＡ発現プロファイルを示す。 ＡＡＶ血清型Ｓ１〜Ｓ８を有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の生存率（Ａ）を示す。 ＡＡＶ血清型Ｓ１〜Ｓ８を有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の形質導入効率（Ｂ）を示す。

Claims (90)

1. 核酸を結合組織細胞に送達する方法であって、
   （ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと、
   （ｂ）５’ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、異種ヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、前記ＡＡＶカプシド内に包まれる組換え核酸と
   を含むウイルスベクターに前記細胞を接触させるステップを含む方法。
2. 前記細胞が関節組織細胞又はその前駆体である、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞が、滑膜細胞、軟骨細胞又は線維軟骨細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 前記細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
5. 前記細胞を、インビトロで前記ウイルスベクターに接触させる、請求項１に記載の方法。
6. 前記異種ヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
7. 前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
8. 前記治療用ポリペプチドが、成長因子、抗異化作用因子又はそれらの組合せである、請求項７に記載の方法。
9. 前記治療用ポリペプチドが、インスリン様成長因子Ｉ及び／又はＩＩ、インターロイキン受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＲＡＰ）、形質転換成長因子β、骨形態形成タンパク質、ＶＥＧＦ及び／又はＲＡＮＫＬ、あるいはそれらの任意の組合せである、請求項７に記載の方法。
10. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、又はＡＡＶ１２カプシドである、請求項１に記載の方法。
11. 前記ＡＡＶ末端反復が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、又はＡＡＶ１２末端反復である、請求項１又は１０に記載の方法。
12. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、又はＡＡＶ６カプシドであり、任意選択的に、前記細胞が軟骨細胞及び／又は滑膜細胞である、請求項１に記載の方法。
13. 前記ウイルスベクターが二重鎖パルボウイルスベクターであって、前記組換え核酸が、前記ＡＡＶ末端反復と、前記異種ヌクレオチド配列と、非分解性の末端反復とを含む、請求項１に記載の方法。
14. 核酸を対象の結合組織に送達する方法であって、請求項５に記載の方法により作製された細胞を前記対象に投与するステップを含む方法。
15. 前記ウイルスベクターと、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が、対象に投与される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記結合組織が関節組織である、請求項１４に記載の方法。
17. 前記結合組織が、軟骨、骨、滑膜、及び／又は半月板である、請求項１４に記載の方法。
18. 前記結合組織が骨髄である、請求項１４に記載の方法。
19. 前記対象がヒトである、請求項１４に記載の方法。
20. 前記結合組織が、膝関節組織、肘関節組織、股関節組織、足関節組織、肩関節組織、手関節組織、指関節組織、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される関節組織である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記対象が、ウマ、イヌ又はネコである、請求項１４に記載の方法。
22. 前記結合組織が、手関節組織、肘関節組織、股関節組織、大腿膝蓋関節組織、大腿脛骨関節組織、肩甲上腕関節組織及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される関節組織である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記対象が、骨折、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、軟骨障害、半月板障害、滑膜障害、スポーツ傷害及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される結合組織障害を有し、あるいは発症するリスクを有する、請求項１４に記載の方法。
24. 前記軟骨障害が軟骨断裂又は軟骨欠損である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記方法が、
    （ａ）前記対象から細胞を除去するステップと、
    （ｂ）前記細胞及び／又はその子孫に前記ウイルスベクターを導入するステップと、
    （ｃ）（ｂ）の細胞及び／又はその子孫を前記対象に投与するステップと
    を含む、請求項１４に記載の方法。
26. 前記細胞がドナー由来である、請求項１４に記載の方法。
27. 前記細胞が前記対象の関節に直接投与される、請求項１４に記載の方法。
28. 前記細胞が前記対象の骨に直接投与される、請求項１４に記載の方法。
29. 対象における結合組織障害を治療する方法であって、請求項５に記載の方法により作製された細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
30. 前記異種ヌクレオチド配列が、成長因子、抗異化作用因子、又はそれらの組合せをコードする、請求項２９に記載の方法。
31. 前記異種ヌクレオチド配列が、インスリン様成長因子Ｉ及び／又はインスリン様成長因子ＩＩ、インターロイキン受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＲＡＰ）、形質転換成長因子β、骨形態形成タンパク質、ＶＥＧＦ及び／又はＲＡＮＫＬ、あるいはそれらの任意の組合せをコードする、請求項２９に記載の方法。
32. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はＡＡＶ１２カプシドである、請求項２９に記載の方法。
33. 前記ＡＡＶ末端反復が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はＡＡＶ１２末端反復である、請求項２９又は３２に記載の方法。
34. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドであり、任意選択的に、前記細胞が軟骨細胞及び／又は滑膜細胞である、請求項２９に記載の方法。
35. 前記ウイルスベクターが二重鎖パルボウイルスベクターであって、前記組換え核酸が、前記ＡＡＶ末端反復と、前記異種ヌクレオチド配列と、非分解性の末端反復とを含む、請求項２９に記載の方法。
36. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドであり、任意選択的に、前記細胞が軟骨細胞又は滑膜細胞である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記対象がヒトである、請求項２９に記載の方法。
38. 前記結合組織が、膝関節組織、肘関節組織、股関節組織、足関節組織、肩関節組織、手関節組織、指関節組織及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される関節組織である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記対象が、ウマ、イヌ又はネコである、請求項２９に記載の方法。
40. 前記結合組織が、手関節組織、肘関節組織、股関節組織、大腿膝蓋関節組織、大腿脛骨関節組織、肩甲上腕関節組織、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される関節組織である、請求項３９に記載の方法。
41. 前記結合組織障害が、骨折、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、軟骨障害、半月板障害、滑膜障害、スポーツ傷害及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
42. 前記軟骨障害が軟骨断裂又は軟骨欠損である、請求項４１に記載の方法。
43. 軟骨障害、変形性関節症、又はそれらの組合せを治療するために、インスリン様成長因子Ｉ及び／又はインスリン様成長因子ＩＩ、形質転換成長因子β、骨形態形成タンパク質、ＶＥＧＦ及び／又はＲＡＮＫＬあるいはそれらの任意の組合せが対象に投与される、請求項４１に記載の方法。
44. 関節リウマチ及び／又は炎症を治療するため、ＩＲＡＰが対象に投与される、請求項４１に記載の方法。
45. 前記方法が、
    （ａ）前記対象から細胞を除去するステップと、
    （ｂ）前記細胞及び／又はその子孫に前記ウイルスベクターを導入するステップと、
    （ｃ）（ｂ）の細胞及び／又はその子孫を前記対象に投与するステップと
    を含む、請求項２９に記載の方法。
46. 前記細胞がドナー由来である、請求項２９に記載の方法。
47. 前記ウイルスベクターが前記対象の関節に直接投与される、請求項２９に記載の方法。
48. 前記ウイルスベクターが前記対象の骨に直接投与される、請求項２９に記載の方法。
49. 前記細胞と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が、前記対象に投与される、請求項２９に記載の方法。
50. 核酸を対象における結合組織に投与する方法であって、
    （ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと、
    （ｂ）５’ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、異種ヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、前記ＡＡＶカプシド内に包まれる組換え核酸と
    を含むウイルスベクターを前記対象に投与するステップを含む方法。
51. 前記異種ヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする、請求項５０に記載の方法。
52. 前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項５１に記載の方法。
53. 前記治療用ポリペプチドが、成長因子、抗異化作用因子又はそれらの組合せである、請求項５２に記載の方法。
54. 前記治療用ポリペプチドが、インスリン様成長因子Ｉ及び／又はインスリン様成長因子ＩＩ、インターロイキン受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＲＡＰ）、形質転換成長因子β、骨形態形成タンパク質、ＶＥＧＦ及び／又はＲＡＮＫＬあるいはそれらの任意の組合せである、請求項５２に記載の方法。
55. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はＡＡＶ１２カプシドである、請求項５０に記載の方法。
56. 前記ＡＡＶ末端反復が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はＡＡＶ１２末端反復である、請求項５０又は５５に記載の方法。
57. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドであり、任意選択的に、前記結合組織が軟骨及び／又は滑膜である、請求項５０に記載の方法。
58. 前記ウイルスベクターが二重鎖パルボウイルスベクターであって、前記組換え核酸が、前記ＡＡＶ末端反復と、前記異種ヌクレオチド配列と、非分解性の末端反復とを含む、請求項５０に記載の方法。
59. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドであり、任意選択的に、前記結合組織が軟骨及び／又は滑膜である、請求項５８に記載の方法。
60. 前記結合組織が関節組織である、請求項５０に記載の方法。
61. 前記結合組織が、軟骨、骨、滑膜及び／又は半月板である、請求項５０に記載の方法。
62. 前記結合組織が骨髄である、請求項５０に記載の方法。
63. 前記対象がヒトである、請求項５０に記載の方法。
64. 前記結合組織が、膝関節組織、肘関節組織、股関節組織、足関節組織、肩関節組織、手関節組織、指関節組織及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される関節組織である、請求項６３に記載の方法。
65. 前記対象が、ウマ、イヌ又はネコである、請求項５０に記載の方法。
66. 前記結合組織が、手関節組織、肘関節組織、股関節組織、大腿膝蓋関節組織、大腿脛骨関節組織、肩甲上腕関節組織及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される関節組織である、請求項６５に記載の方法。
67. 前記対象が、骨折、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、軟骨障害、半月板障害、滑膜障害、スポーツ傷害及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される結合組織障害を有し、あるいは発症するリスクを有する、請求項５０に記載の方法。
68. 前記軟骨障害が軟骨断裂又は軟骨欠損である、請求項６７に記載の方法。
69. 前記ウイルスベクターが前記対象の関節に直接投与される、請求項５０に記載の方法。
70. 前記ウイルスベクターが前記対象の骨に直接投与される、請求項５０に記載の方法。
71. 前記ウイルスベクターと、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が、前記対象に投与される、請求項５０に記載の方法。
72. 結合組織障害を治療する方法であって、
    （ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドと、
    （ｂ）５’ ＡＡＶ末端反復と、３’ＡＡＶ末端反復と、異種ヌクレオチド配列とを含む組換え核酸（前記組換え核酸は前記ＡＡＶカプシド内に包まれる）と
    を含むウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
73. 前記異種ヌクレオチド配列が、成長因子、抗異化作用因子又はそれらの組合せをコードする、請求項７２に記載の方法。
74. 前記異種ヌクレオチド配列が、インスリン様成長因子Ｉ、インターロイキン受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＲＡＰ）又はそれらの組合せをコードする、請求項７２に記載の方法。
75. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はＡＡＶ１２カプシドである、請求項７２に記載の方法。
76. 前記ＡＡＶ末端反復が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はＡＡＶ１２末端反復である、請求項７２又は７５に記載の方法。
77. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドであり、任意選択的に、前記結合組織障害が軟骨障害及び／又は滑膜障害である、請求項７２に記載の方法。
78. 前記ウイルスベクターが二重鎖パルボウイルスベクターであって、前記組換え核酸が、前記ＡＡＶ末端反復と、前記異種ヌクレオチド配列と、非分解性の末端反復とを含む、請求項７２に記載の方法。
79. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ６カプシドであり、任意選択的に、前記結合組織障害が軟骨障害及び／又は滑膜障害である、請求項７８に記載の方法。
80. 前記対象がヒトである、請求項７２に記載の方法。
81. 前記結合組織が、膝関節組織、肘関節組織、股関節組織、足関節組織、肩関節組織、手関節組織、指関節組織、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される関節組織である、請求項８０に記載の方法。
82. 前記対象が、ウマ、イヌ又はネコである、請求項７２に記載の方法。
83. 前記結合組織が、手関節組織、肘関節組織、股関節組織、大腿膝蓋関節組織、大腿脛骨関節組織、肩甲上腕関節組織及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される関節組織である、請求項８２に記載の方法。
84. 前記結合組織障害が、骨折、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、軟骨障害、半月板障害、滑膜障害、スポーツ傷害及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項７２に記載の方法。
85. 前記軟骨障害が軟骨断裂又は軟骨欠損である、請求項８４に記載の方法。
86. 軟骨障害、変形性関節症又はそれらの組合せを治療するため、インスリン様成長因子Ｉ及び／又はインスリン様成長因子ＩＩ、形質転換成長因子β、骨形態形成タンパク質、ＶＥＧＦ及び／又はＲＡＮＫＬあるいはそれらの任意の組合せが対象に投与される、請求項８４に記載の方法。
87. 関節リウマチ及び／又は炎症を治療するため、ＩＲＡＰが対象に投与される、請求項８４に記載の方法。
88. 前記ウイルスベクターが前記対象の関節に直接投与される、請求項７２に記載の方法。
89. 前記ウイルスベクターが対象の骨に直接投与される、請求項７２に記載の方法。
90. 前記ウイルスベクターと医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が、前記対象に投与される、請求項７２に記載の方法。

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