JP2009505651A - Method for detection of microbial and antibiotic resistance markers and nucleic acid oligonucleotides therefor - Google Patents
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Abstract
本発明は、試料中の一つまたは複数の微生物ならびに／または一つまたは複数の抗生物質耐性マーカーを検出するための、明瞭な核酸領域の存在を識別することを含む方法に関する。そのような諸方法で使うのに好適なプライマーおよびプローブが提供される。The present invention relates to a method comprising identifying the presence of a distinct nucleic acid region for detecting one or more microorganisms and / or one or more antibiotic resistance markers in a sample. Primers and probes suitable for use in such methods are provided.
Description
本発明は、微生物の23S RNA遺伝子の配列および抗生物質耐性遺伝子に関係し、また、それらのハイブリダイゼーションおよび／または核酸増幅反応ならびに／または試料中での一つまたは複数の微生物および／または抗生物質耐性遺伝子の存在を検出するための他の識別方法のためのテンプレートとしての使用に関係する。本発明はさらに、前記配列の増幅および前記配列へのハイブリダイゼーションに好適な核酸増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブに関する。 The present invention relates to the sequence of the 23S RNA gene of microorganisms and antibiotic resistance genes, and also to their hybridization and / or nucleic acid amplification reactions and / or one or more microorganisms and / or antibiotics in a sample It relates to its use as a template for other identification methods for detecting the presence of resistance genes. The present invention further relates to nucleic acid amplification primers and hybridization probes suitable for amplification of the sequence and hybridization to the sequence.
核酸（NA: nucleic acid）の発見以来、試料中の特定のDNAまたはRNA配列の存在、不在または量の検出に関係する技術は学界および産業界において多大な関心を集めている。増幅技法、特にポリメラーゼ連鎖反応（PCR: Polymerase Chain Reaction）およびハイブリダイゼーションの発明は、核酸配列の存在、不在または量の検出のためのあらゆる種類の検定の発展に大いに貢献した。現在、生物体から核酸含有試料を採取し、その中のある特定の核酸配列（標的配列）の存在、不在または量を決定することが可能である。複数の標的配列について同時にそのような解析、いわゆる標的配列の多重検出（multiplex detection）を実行し、それによりスループットを上げるとともに診断上の有意性を改善する技術が利用可能である。 Since the discovery of nucleic acids (NA), techniques related to the detection of the presence, absence or amount of specific DNA or RNA sequences in a sample have received great interest in academia and industry. Amplification techniques, especially the invention of Polymerase Chain Reaction (PCR) and hybridization, have greatly contributed to the development of all kinds of assays for the detection of the presence, absence or quantity of nucleic acid sequences. Currently, it is possible to take a nucleic acid-containing sample from an organism and determine the presence, absence or amount of a particular nucleic acid sequence (target sequence) therein. Techniques are available for performing such analysis on multiple target sequences simultaneously, so-called multiplex detection of target sequences, thereby increasing throughput and improving diagnostic significance.
現在、核酸配列に基づく検出は、たとえば糖尿病の血糖濃度測定の場合がそうであるように、まだ日常的に実行されてはいない。一般には設備の整った実験室およびよく訓練されたスタッフが必要であり、信頼できる結果を与えるために入念な手順を使う必要がある。さらに、現在の解析方法は骨が折れるばかりでなく、時間もかかる。典型的には、DNAまたはRNA配列解析のための現在の手順は数日かかり、それはなかでも、試料採取、試料培養、試料からのDNAまたはRNAの単離、試料中の標的配列の存在、不在または量の解析のためのその後の検定、得られた結果の処理および該結果の対応する呈示のためのさまざまなシステムの要求のためである。 Currently, detection based on nucleic acid sequences has not yet been routinely performed, as is the case, for example, in the measurement of diabetes blood glucose levels. In general, a well-equipped laboratory and well-trained staff are required and careful procedures must be used to give reliable results. Furthermore, current analysis methods are not only laborious but also time consuming. Typically, current procedures for DNA or RNA sequence analysis take several days, including, among other things, sampling, sample culture, isolation of DNA or RNA from a sample, presence or absence of a target sequence in a sample Or for subsequent testing for analysis of quantities, processing of the results obtained and various system requirements for corresponding presentation of the results.
この時間のかかる解析は、高度に特異的なハイブリダイゼーションおよび増幅方法を標的配列の全体または部分に適用し、それによりある特定の核酸配列の存在、不在または量の決定を可能にすることによって劇的に改善できる。きわめて敏感で特異的なPCRおよび／またはハイブリダイゼーションが適用でき、それらは今度はある特定の核酸標的配列に対するきわめて特異的なプライマーを要求する。当技術分野ではいくつかの細菌株の核酸配列が知られている。たとえば、Staphylococcus aureus核酸配列はJ Clin Microbiol. (2000), 38(2), 781-8, Journal of Microbiological Methods (2004), 58, 403- 411, J Clin Microbiol. (2004), 42(3), 1048-57, US5,582,975, WO 90/14444, WO03/095677およびUS 5,958,679で開示され；Staphylococcus epidermidis核酸配列はJournal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411およびWO 03/095677で開示され；Pseudomonas aeruginosaの核酸配列はJournal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411, J Clin Microbiol. (2004), 42(3), 1048-57およびWO03/095677で開示され；Klebsiella pneumoniae核酸配列はJournal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411およびWO 03/095677で開示され；Enterococcus faecalis核酸配列はJournal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411で開示され；Enterococcus faecium核酸配列はJournal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411およびWO 03/095677で開示され；Escherichia coli核酸配列はJournal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411, J Clin Microbiol. (2004), 42(3), 1048-57およびWO 03/095677で開示され；Enterobacter cloacae核酸配列はUS5,958,679で開示されている。当技術分野では、ある種の抗生物質耐性遺伝子の核酸配列が知られている。たとえば、βラクタマーゼSHV核酸はJ. Clin Microbiol (2001) 39, 3193-3196, J. Clin Microbiol (1998) 36, 3105-3110, J. Clin Microbiol (1999) 37, 4020-4027, US2004/0002080およびUS6,242,223から知られており；βラクタマーゼGES-2核酸はInternational Journal of Antimicrobial Agents (2004) 24, 35-38およびJ. Antimicrobial Chemotherapy (2002) 49, 561-565から知られており；メチシリン耐性MecA核酸はJ Clin Microbiol. (2002), 40(5), 1821-3, J Clin Microbiol. (1995), 33(11), 2864-7, J Clin Microbiol. 2000 Jun_38(6)_2429-33, WO02082086A2およびUS5,437,978から知られており；spA核酸はJ. Clin Microbiol (2003) 41, 5442-5448およびUS5,702,895から知られており；vanA核酸はJ. Clin. Microbiol. (1997), 703-707およびJ. Clin. Microbiol. (2000) 3092-3095から知られており；vanB核酸はJ. Clin. Microbiol. (1997), 703-707およびJ. Clin. Microbiol. (2000) 3092-3095から知られており;vanC核酸はJ. Clin. Microbiol. (1997), 703-707およびJ. Clin. Microbiol. (2000) 3092-3095から知られており；βラクタマーゼ耐性TEM-1H核酸はAntimicrobial Agents And Chemotherapy (2001), 2407-2413, US2004/0002080およびUS6,242,223から知られている。 This time consuming analysis is accomplished by applying highly specific hybridization and amplification methods to all or part of the target sequence, thereby allowing the determination of the presence, absence or amount of a particular nucleic acid sequence. Can be improved. Very sensitive and specific PCR and / or hybridization can be applied, which in turn require highly specific primers for a particular nucleic acid target sequence. Nucleic acid sequences of several bacterial strains are known in the art. For example, the Staphylococcus aureus nucleic acid sequence is J Clin Microbiol. (2000), 38 (2), 781-8, Journal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411, J Clin Microbiol. (2004), 42 (3) , 1048-57, US5,582,975, WO 90/14444, WO03 / 095677 and US 5,958,679; Staphylococcus epidermidis nucleic acid sequences are disclosed in Journal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411 and WO 03/095677 The nucleic acid sequence of Pseudomonas aeruginosa is disclosed in Journal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411, J Clin Microbiol. (2004), 42 (3), 1048-57 and WO03 / 095677; the Klebsiella pneumoniae nucleic acid sequence is Journal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411 and WO 03/095677; Enterococcus faecalis nucleic acid sequence is disclosed in Journal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411; Enterococcus faecium nucleic acid sequence is Journal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411 and WO 03/095677 Escherichia coli nucleic acid sequences are disclosed in Journal of Microbiological Methods (2004), 58, 403-411, J Clin Microbiol. (2004), 42 (3), 1048-57 and WO 03/095677; Enterobacter cloacae nucleic acid sequences Is disclosed in US 5,958,679. Nucleic acid sequences for certain antibiotic resistance genes are known in the art. For example, β-lactamase SHV nucleic acids are described in J. Clin Microbiol (2001) 39, 3193-3196, J. Clin Microbiol (1998) 36, 3105-3110, J. Clin Microbiol (1999) 37, 4020-4027, US2004 / 0002080 and Known from US 6,242,223; β-lactamase GES-2 nucleic acid is known from International Journal of Antimicrobial Agents (2004) 24, 35-38 and J. Antimicrobial Chemotherapy (2002) 49, 561-565; methicillin resistance MecA nucleic acid is described in J Clin Microbiol. (2002), 40 (5), 1821-3, J Clin Microbiol. (1995), 33 (11), 2864-7, J Clin Microbiol. 2000 Jun_38 (6) _2429-33, WO02082086A2 and US 5,437,978 are known; spA nucleic acids are known from J. Clin Microbiol (2003) 41, 5442-5448 and US 5,702,895; vanA nucleic acids are known from J. Clin. Microbiol. (1997), 703 -707 and J. Clin. Microbiol. (2000) 3092-3095; vanB nucleic acids are J. Clin. Microbiol. (1997), 703-707 and J. Clin. Microbiol. (2000) 3092- VanC nucleic acid is known from J. Clin. Microbiol. (1997), 703-707 and J. Clin. Microbiol. (2000) 3092-3095; β-lactamase resistant TEM-1H nucleic acid is Antimicrobial Agents And Chemotherapy (2001), 2407-2413, US2004 / 0002080 and US6,242,223.
しかしながら、核酸検出の当技術分野における問題は、信頼性のあるプライマーまたはプローブを提供することである。特に多重検出が用いられる場合、交差反応および偽陽性もしくは偽陰性の結果が問題になる。本発明は、特異的で信頼できる単一モードおよび多重の核酸検出に好適な方法、配列およびプライマーを提供することによって、当技術分野の前記問題を克服することをねらいとする。 However, a problem in the art of nucleic acid detection is to provide reliable primers or probes. Particularly when multiplex detection is used, cross-reaction and false positive or false negative results are problematic. The present invention aims to overcome the above problems in the art by providing methods, sequences and primers suitable for specific and reliable single mode and multiplex nucleic acid detection.
本発明のある実施形態は、試料中の一つまたは複数の微生物および／または一つまたは複数の抗生物質耐性マーカーを検出する方法であって、明瞭な（distinct）核酸領域の存在を識別することを含む方法である。 One embodiment of the invention is a method for detecting one or more microorganisms and / or one or more antibiotic resistance markers in a sample, wherein the presence of distinct nucleic acid regions is identified. It is a method including.
本発明のもう一つの実施形態は、ある微生物についての前記明瞭な核酸領域が23S RNA配列遺伝子中にある、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region for a microorganism is in a 23S RNA sequence gene.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域の識別が核酸増幅を使って行われる、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region identification is performed using nucleic acid amplification.
本発明のもう一つの実施形態は、二つ以上の明瞭な核酸領域を検出するために多重PCRが使われる、上記のような方法である。 Another embodiment of the invention is a method as described above, wherein multiplex PCR is used to detect two or more distinct nucleic acid regions.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域がハイブリダイゼーションを使って識別される、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region is identified using hybridization.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterobacter cloacaeであり、配列番号3および4または配列番号5および6によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is as described above, wherein the microorganism is Enterobacter cloacae and comprises the use of a pair of amplification primers corresponding to the sequences represented by SEQ ID NOs: 3 and 4 or SEQ ID NOs: 5 and 6. Is the method.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterobacter cloacaeであり、配列番号3ないし6のうちいずれか一つによって表される配列に対応するハイブリダイゼーション・プローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention as described above, wherein the microorganism is Enterobacter cloacae, comprising the use of a hybridization probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 6. Is the method.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号1または2に対応し、微生物がEnterobacter cloacaeである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is the method as described above, wherein the distinct nucleic acid region corresponds to SEQ ID NO: 1 or 2, and the microorganism is Enterobacter cloacae.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterococcus faecalisであり、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12または配列番号15および11によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is that the microorganism is Enterococcus faecalis and is represented by SEQ ID NO: 9 and 11, SEQ ID NO: 9 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 12, or SEQ ID NO: 15 and 11. A method as described above, comprising the use of a pair of amplification primers corresponding to a sequence of
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterococcus faecalisであり、配列番号9ないし15のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said microorganism is Enterococcus faecalis and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 9-15. .
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号7または8に対応し、微生物がEnterococcus faecalisである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to SEQ ID NO: 7 or 8, and the microorganism is Enterococcus faecalis.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterococcus faeciumであり、配列番号18および19、配列番号19および20または配列番号20および21によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is the use of a pair of amplification primers corresponding to the sequences represented by SEQ ID NO: 18 and 19, SEQ ID NO: 19 and 20, or SEQ ID NO: 20 and 21, wherein the microorganism is Enterococcus faecium. Including the method as described above.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEnterococcus faeciumであり、配列番号19ないし21によって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said microorganism is Enterococcus faecium and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by SEQ ID NO: 19-21.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号16または17に対応し、微生物がEnterococcus faeciumである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to SEQ ID NO: 16 or 17, and the microorganism is Enterococcus faecium.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEscherichia coliであり、配列番号24および25、配列番号24および26、配列番号27および29または配列番号28および29によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is an amplification wherein said microorganism is Escherichia coli and corresponds to a sequence represented by SEQ ID NO: 24 and 25, SEQ ID NO: 24 and 26, SEQ ID NO: 27 and 29 or SEQ ID NO: 28 and 29 A method as described above, including the use of primer pairs.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がEscherichia coliであり、配列番号24ないし29のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said microorganism is Escherichia coli and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 24-29. .
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号22または23に対応し、微生物がEscherichia coliである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to SEQ ID NO: 22 or 23 and the microorganism is Escherichia coli.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がKlebsiella pneumoniaeであり、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36または配列番号37および33によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
Another embodiment of the present invention is an amplification wherein said microorganism is Klebsiella pneumoniae and corresponds to a sequence represented by
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がKlebsiella pneumoniaeであり、配列番号32ないし37のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said microorganism is Klebsiella pneumoniae and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 32 to 37 .
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号30または31に対応し、微生物がKlebsiella pneumoniaeである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to SEQ ID NO: 30 or 31 and the microorganism is Klebsiella pneumoniae.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がPseudomonas aeruginosaであり、配列番号40および41または配列番号40および42によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is as described above, wherein said microorganism is Pseudomonas aeruginosa and comprises the use of a pair of amplification primers corresponding to the sequences represented by SEQ ID NO: 40 and 41 or SEQ ID NO: 40 and 42 Is the method.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がPseudomonas aeruginosaであり、配列番号40ないし42のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said microorganism is Pseudomonas aeruginosa and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 40 to 42 .
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号38または39によって表される配列に対応し、微生物がPseudomonas aeruginosaである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to a sequence represented by SEQ ID NO: 38 or 39 and the microorganism is Pseudomonas aeruginosa.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がStaphylococcus aureusであり、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention, wherein the microorganism is Staphylococcus aureus and is represented by SEQ ID NOs: 45 and 46, SEQ ID NOs: 48 and 47, SEQ ID NOs: 48 and 49, SEQ ID NOs: 48 and 51, SEQ ID NOs: 50 and 51 A method as described above, comprising the use of a pair of amplification primers corresponding to a sequence of
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がStaphylococcus aureusであり、配列番号45ないし51のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said microorganism is Staphylococcus aureus and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 45 to 51. .
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号43または44に対応し、微生物がStaphylococcus aureusである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to SEQ ID NO: 43 or 44 and the microorganism is Staphylococcus aureus.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がStaphylococcus epidermidisであり、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60または配列番号63および61によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
Another embodiment of the present invention is that the microorganism is Staphylococcus epidermidis and is SEQ ID NO: 54 and 55, SEQ ID NO: 54 and 56, SEQ ID NO: 54 and 57, SEQ ID NO: 58 and 57, SEQ ID NO: 58 and 59, SEQ ID NO: Including the use of pairs of amplification primers corresponding to the sequences represented by 58 and 60,
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がStaphylococcus epidermidisであり、配列番号54ないし63のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said microorganism is Staphylococcus epidermidis and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 54 to 63 .
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号52または53に対応し、微生物がStaphylococcus epidermidisである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to SEQ ID NO: 52 or 53 and the microorganism is Staphylococcus epidermidis.
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がCandida albicansであり、配列番号66および67、配列番号68および69または配列番号70および71によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。
Another embodiment of the present invention is the use of a pair of amplification primers corresponding to the sequences represented by
本発明のもう一つの実施形態は、前記微生物がCandida albicansであり、配列番号66ないし71のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said microorganism is Candida albicans and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 66 to 71 .
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号64または65に対応し、微生物がCandida albicansである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to SEQ ID NO: 64 or 65 and the microorganism is Candida albicans.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがblages-2であり、配列番号74および75または配列番号76および77によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the invention involves the use of a pair of amplification primers corresponding to the sequence represented by SEQ ID NOs: 74 and 75 or SEQ ID NOs: 76 and 77, wherein the antibiotic resistance marker is blages-2 This is the method as described above.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがblages-2であり、配列番号74ないし77のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention involves the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 74-77 , wherein the antibiotic resistance marker is blages-2 It is a method like this.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号72または73によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがblages-2である、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to a sequence represented by SEQ ID NO: 72 or 73 and the antibiotic resistance marker is blages-2 .
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがblashvであり、配列番号80および81または配列番号82および83によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention comprises the use of a pair of amplification primers corresponding to the sequences represented by SEQ ID NOs: 80 and 81 or SEQ ID NOs: 82 and 83, wherein the antibiotic resistance marker is blashv It is a method like this.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがblashvであり、配列番号80ないし83のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention includes the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 80-83 , wherein the antibiotic resistance marker is blashv , as described above Is the method.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号78または79によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがblashvである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to a sequence represented by SEQ ID NO: 78 or 79 and the antibiotic resistance marker is blashv .
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがmecAであり、配列番号86および87または配列番号88および89によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention comprises the use of a pair of amplification primers as described above, wherein said antibiotic resistance marker is mecA and corresponds to the sequence represented by SEQ ID NO: 86 and 87 or SEQ ID NO: 88 and 89 It is a method like this.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがmecAであり、配列番号86ないし89によって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said antibiotic resistance marker is mecA and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by SEQ ID NOs 86-89.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号84または85によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがmecAである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to a sequence represented by SEQ ID NO: 84 or 85 and the antibiotic resistance marker is mecA.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがspAであり、配列番号92および93または配列番号94および95によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention comprises the use of a pair of amplification primers as described above, wherein the antibiotic resistance marker is spA and corresponds to a sequence represented by SEQ ID NO: 92 and 93 or SEQ ID NO: 94 and 95 It is a method like this.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがspAであり、配列番号92ないし95のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein the antibiotic resistance marker is spA and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 92 to 95 It is.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号90または91によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがSpaである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to a sequence represented by SEQ ID NO: 90 or 91 and the antibiotic resistance marker is Spa.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanAであり、配列番号98および99または配列番号100および101によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention comprises the use of a pair of amplification primers as described above, wherein the antibiotic resistance marker is VanA and comprises the pair of amplification primers corresponding to the sequences represented by SEQ ID NO: 98 and 99 or SEQ ID NO: 100 and 101 It is a method like this.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanAであり、配列番号98ないし101によって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said antibiotic resistance marker is VanA and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by SEQ ID NO: 98-101.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号96または97によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがVanAである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to a sequence represented by SEQ ID NO: 96 or 97 and the antibiotic resistance marker is VanA.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanBであり、配列番号104および105または配列番号106および107によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention comprises the use of a pair of amplification primers as described above, wherein the antibiotic resistance marker is VanB and comprises a pair of amplification primers corresponding to the sequences represented by SEQ ID NOs: 104 and 105 or SEQ ID NOs: 106 and 107 It is a method like this.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanBであり、配列番号104ないし107のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein the antibiotic resistance marker is VanB and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 104 to 107 It is.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号102または103によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがVanBである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to the sequence represented by SEQ ID NO: 102 or 103 and the antibiotic resistance marker is VanB.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanCであり、配列番号110および111または配列番号112および113によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention, wherein the antibiotic resistance marker is VanC and comprises the use of a pair of amplification primers corresponding to the sequences represented by SEQ ID NO: 110 and 111 or SEQ ID NO: 112 and 113, It is a method like this.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがVanCであり、配列番号110ないし113のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein the antibiotic resistance marker is VanC and comprises the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 110 to 113 It is.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号108または109によって表される配列に対応し、抗生物質耐性マーカーがVanCである、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to a sequence represented by SEQ ID NO: 108 or 109 and the antibiotic resistance marker is VanC.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがMDR-1であり、配列番号116および117または配列番号118および119によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the invention comprises the use of a pair of amplification primers corresponding to the sequence represented by SEQ ID NO: 116 and 117 or SEQ ID NO: 118 and 119, wherein the antibiotic resistance marker is MDR-1. This is the method as described above.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがMDR-1であり、配列番号116ないし119のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention includes the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 116-119, wherein the antibiotic resistance marker is MDR-1 It is a simple method.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号114または115に対応し、抗生物質耐性マーカーがMDR-1である、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to SEQ ID NO: 114 or 115 and the antibiotic resistance marker is MDR-1.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがCDR-1であり、配列番号122および123または配列番号124および125によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the invention comprises the use of a pair of amplification primers corresponding to the sequence represented by SEQ ID NO: 122 and 123 or SEQ ID NO: 124 and 125, wherein the antibiotic resistance marker is CDR-1. This is the method as described above.
本発明のもう一つの実施形態は、前記抗生物質耐性マーカーがCDR-1であり、配列番号122ないし125のうちいずれか一つによって表される配列に対応するプローブの使用を含む、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention includes the use of a probe corresponding to the sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 122-125, wherein the antibiotic resistance marker is CDR-1 as described above It is a method.
本発明のもう一つの実施形態は、前記明瞭な核酸領域が配列番号120または121に対応し、抗生物質耐性マーカーがCDR-1である、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said distinct nucleic acid region corresponds to SEQ ID NO: 120 or 121 and the antibiotic resistance marker is CDR-1.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号9および10、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12、配列番号15および11、配列番号18および19、配列番号20および19、配列番号20および21、配列番号24および26、配列番号24および25、配列番号27および29、配列番号28および29、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36、配列番号37および33、配列番号40および41、配列番号40および42、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60、配列番号63および61、配列番号66および67、配列番号68および69、配列番号70および71、配列番号74および75、配列番号76および77、配列番号80および81、配列番号82および83、配列番号86および87、配列番号88および89、配列番号92および93、配列番号94および95、配列番号98および99、配列番号100および101、配列番号104および105、配列番号106および107、配列番号110および111、配列番号112および113、配列番号116および117、配列番号118および119、配列番号122および123ならびに配列番号124および125によって表される配列から選択される増幅プライマーの一つまたは複数の対をあらかじめロードされた容器である。 Another embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 9 and 11, SEQ ID NO: 9 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 12, SEQ ID NO: 15 and 11, SEQ ID NO: 18 and 19, SEQ ID NO: 20 and 19, SEQ ID NO: 20 and 21, SEQ ID NO: 24 and 26, SEQ ID NO: 24 and 25, SEQ ID NO: 27 and 29, SEQ ID NO: 28 and 29, SEQ ID NO: 32 and 34, SEQ ID NO: 32 and 33, SEQ ID NO: 35 and 36, SEQ ID NO: 37 and 33, SEQ ID NO: 40 and 41, SEQ ID NO: 40 and 42, SEQ ID NO: 45 and 46, SEQ ID NO: 48 and 47, SEQ ID NO: 48 and 49, SEQ ID NOs 48 and 51, SEQ ID NOs 50 and 51, SEQ ID NOs 54 and 55, SEQ ID NOs 54 and 56, SEQ ID NOs 54 and 57, SEQ ID NOs 58 and 57, SEQ ID NOs 58 and 59, SEQ ID NOs 58 and 60, SEQ ID NO: 58 and 61, SEQ ID NO: 58 and 62, SEQ ID NO: 63 and 59, SEQ ID NO: 63 and 60, SEQ ID NO: 63 and 61, SEQ ID NO: 66 and 67, SEQ ID NO: 68 and 69, SEQ ID NO: 70 and 71, SEQ ID NO: 74 and 75, SEQ ID NO: 76 and 77, SEQ ID NO: 80 and 81, SEQ ID NO: 82 and 83, SEQ ID NO: 86 and 87, SEQ ID NO: 88 and 89, SEQ ID NO: 92 and 93, SEQ ID NO: 94 and 95, SEQ ID NO: 98 and 99, SEQ ID NO: 100 and 101, SEQ ID NO: 104 and 105, Selected from the sequences represented by SEQ ID NO: 106 and 107, SEQ ID NO: 110 and 111, SEQ ID NO: 112 and 113, SEQ ID NO: 116 and 117, SEQ ID NO: 118 and 119, SEQ ID NO: 122 and 123 and SEQ ID NO: 124 and 125. A container preloaded with one or more pairs of amplification primers.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125のうちいずれか一つによって表される配列から選択される一つまたは複数のプローブをあらかじめロードされた容器である。 Another embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 3-6, SEQ ID NO: 9-15, SEQ ID NO: 18-21, SEQ ID NO: 24-29, SEQ ID NO: 32-37, SEQ ID NO: 40-42, SEQ ID NO: 45- 51, SEQ ID NO: 54 to 63, SEQ ID NO: 66 to 71, SEQ ID NO: 74 to 77, SEQ ID NO: 80 to 83, SEQ ID NO: 86 to 89, SEQ ID NO: 92 to 95, SEQ ID NO: 98 to 101, SEQ ID NO: 104 to 107, A container preloaded with one or more probes selected from the sequence represented by any one of SEQ ID NO: 110 to 113, SEQ ID NO: 116 to 119 and SEQ ID NO: 122 to 125.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号9および10、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12、配列番号15および11、配列番号18および19、配列番号20および19、配列番号20および21、配列番号24および26、配列番号24および25、配列番号27および29、配列番号28および29、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36、配列番号37および33、配列番号40および41、配列番号40および42、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60、配列番号63および61、配列番号66および67、配列番号68および69、配列番号70および71、配列番号74および75、配列番号76および77、配列番号80および81、配列番号82および83、配列番号86および87、配列番号88および89、配列番号92および93、配列番号94および95、配列番号98および99、配列番号100および101、配列番号104および105、配列番号106および107、配列番号110および111、配列番号112および113、配列番号116および117、配列番号118および119、配列番号122および123、ならびに配列番号124および125によって表される配列から選択される増幅プライマーの一つまたは複数の対を有するキットである。 Another embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 9 and 11, SEQ ID NO: 9 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 12, SEQ ID NO: 15 and 11, SEQ ID NO: 18 and 19, SEQ ID NO: 20 and 19, SEQ ID NO: 20 and 21, SEQ ID NO: 24 and 26, SEQ ID NO: 24 and 25, SEQ ID NO: 27 and 29, SEQ ID NO: 28 and 29, SEQ ID NO: 32 and 34, SEQ ID NO: 32 and 33, SEQ ID NO: 35 and 36, SEQ ID NO: 37 and 33, SEQ ID NO: 40 and 41, SEQ ID NO: 40 and 42, SEQ ID NO: 45 and 46, SEQ ID NO: 48 and 47, SEQ ID NO: 48 and 49, SEQ ID NOs 48 and 51, SEQ ID NOs 50 and 51, SEQ ID NOs 54 and 55, SEQ ID NOs 54 and 56, SEQ ID NOs 54 and 57, SEQ ID NOs 58 and 57, SEQ ID NOs 58 and 59, SEQ ID NOs 58 and 60, SEQ ID NO: 58 and 61, SEQ ID NO: 58 and 62, SEQ ID NO: 63 and 59, SEQ ID NO: 63 and 60, SEQ ID NO: 63 and 61, SEQ ID NO: 66 and 67, SEQ ID NO: 68 and 69, SEQ ID NO: 70 and 71, SEQ ID NO: 74 and 75, SEQ ID NO: 76 and 77, SEQ ID NO: 80 and 81, SEQ ID NO: 82 and 83, SEQ ID NO: 86 and 87, SEQ ID NO: 88 and 89, SEQ ID NO: 92 and 93, SEQ ID NO: 94 and 95, SEQ ID NO: 98 and 99, SEQ ID NO: 100 and 101, SEQ ID NO: 104 and 105, Selected from the sequences represented by SEQ ID NO: 106 and 107, SEQ ID NO: 110 and 111, SEQ ID NO: 112 and 113, SEQ ID NO: 116 and 117, SEQ ID NO: 118 and 119, SEQ ID NO: 122 and 123, and SEQ ID NO: 124 and 125. A kit having one or more pairs of amplification primers.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択される一つまたは複数のプローブを有するキットである。 Another embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 3-6, SEQ ID NO: 9-15, SEQ ID NO: 18-21, SEQ ID NO: 24-29, SEQ ID NO: 32-37, SEQ ID NO: 40-42, SEQ ID NO: 45- 51, SEQ ID NO: 54 to 63, SEQ ID NO: 66 to 71, SEQ ID NO: 74 to 77, SEQ ID NO: 80 to 83, SEQ ID NO: 86 to 89, SEQ ID NO: 92 to 95, SEQ ID NO: 98 to 101, SEQ ID NO: 104 to 107, A kit having one or more probes selected from the sequences represented by SEQ ID NO: 110 to 113, SEQ ID NO: 116 to 119 and SEQ ID NO: 122 to 125.
本発明のもう一つの実施形態は、上記のような一つまたは複数の容器を有するキットである。 Another embodiment of the present invention is a kit having one or more containers as described above.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号9および10、配列番号9および11、配列番号9および12、配列番号13および14、配列番号15および12、配列番号15および11、配列番号18および19、配列番号20および19、配列番号20および21、配列番号24および26、配列番号24および25、配列番号27および29、配列番号28および29、配列番号32および34、配列番号32および33、配列番号35および36、配列番号37および33、配列番号40および41、配列番号40および42、配列番号45および46、配列番号48および47、配列番号48および49、配列番号48および51、配列番号50および51、配列番号54および55、配列番号54および56、配列番号54および57、配列番号58および57、配列番号58および59、配列番号58および60、配列番号58および61、配列番号58および62、配列番号63および59、配列番号63および60、配列番号63および61、配列番号66および67、配列番号68および69、配列番号70および71、配列番号74および75、配列番号76および77、配列番号80および81、配列番号82および83、配列番号86および87、配列番号88および89、配列番号92および93、配列番号94および95、配列番号98および99、配列番号100および101、配列番号104および105、配列番号106および107、配列番号110および111、配列番号112および113、配列番号116および117、配列番号118および119、配列番号122および123、配列番号124および125によって表される配列から選択される増幅プライマーの一つまたは複数の対を有する装置である。 Another embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 9 and 11, SEQ ID NO: 9 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 12, SEQ ID NO: 15 and 11, SEQ ID NO: 18 and 19, SEQ ID NO: 20 and 19, SEQ ID NO: 20 and 21, SEQ ID NO: 24 and 26, SEQ ID NO: 24 and 25, SEQ ID NO: 27 and 29, SEQ ID NO: 28 and 29, SEQ ID NO: 32 and 34, SEQ ID NO: 32 and 33, SEQ ID NO: 35 and 36, SEQ ID NO: 37 and 33, SEQ ID NO: 40 and 41, SEQ ID NO: 40 and 42, SEQ ID NO: 45 and 46, SEQ ID NO: 48 and 47, SEQ ID NO: 48 and 49, SEQ ID NOs 48 and 51, SEQ ID NOs 50 and 51, SEQ ID NOs 54 and 55, SEQ ID NOs 54 and 56, SEQ ID NOs 54 and 57, SEQ ID NOs 58 and 57, SEQ ID NOs 58 and 59, SEQ ID NOs 58 and 60, SEQ ID NO: 58 and 61, SEQ ID NO: 58 and 62, SEQ ID NO: 63 and 59, SEQ ID NO: 63 and 60, SEQ ID NO: 63 and 61, SEQ ID NO: 66 and 67, SEQ ID NO: 68 and 69, SEQ ID NO: 70 and 71, SEQ ID NO: 74 and 75, SEQ ID NO: 76 and 77, SEQ ID NO: 80 and 81, SEQ ID NO: 82 and 83, SEQ ID NO: 86 and 87, SEQ ID NO: 88 and 89, SEQ ID NO: 92 and 93, SEQ ID NO: 94 and 95, SEQ ID NO: 98 and 99, SEQ ID NO: 100 and 101, SEQ ID NO: 104 and 105, Selected from the sequences represented by SEQ ID NO: 106 and 107, SEQ ID NO: 110 and 111, SEQ ID NO: 112 and 113, SEQ ID NO: 116 and 117, SEQ ID NO: 118 and 119, SEQ ID NO: 122 and 123, SEQ ID NO: 124 and 125 A device having one or more pairs of amplification primers.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択される一つまたは複数のプローブを有する装置である。 Another embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 3-6, SEQ ID NO: 9-15, SEQ ID NO: 18-21, SEQ ID NO: 24-29, SEQ ID NO: 32-37, SEQ ID NO: 40-42, SEQ ID NO: 45- 51, SEQ ID NO: 54 to 63, SEQ ID NO: 66 to 71, SEQ ID NO: 74 to 77, SEQ ID NO: 80 to 83, SEQ ID NO: 86 to 89, SEQ ID NO: 92 to 95, SEQ ID NO: 98 to 101, SEQ ID NO: 104 to 107, An apparatus having one or more probes selected from the sequences represented by SEQ ID NO: 110 to 113, SEQ ID NO: 116 to 119 and SEQ ID NO: 122 to 125.
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の一つまたは複数の微生物および／または一つまたは複数の抗生物質耐性マーカーを検出するための、上記のような容器、キットまたは装置の使用である。 Another embodiment of the invention is the use of a container, kit or device as described above for detecting one or more microorganisms and / or one or more antibiotic resistance markers in a sample. .
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択されるプローブを有する組成物である。 Another embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 3-6, SEQ ID NO: 9-15, SEQ ID NO: 18-21, SEQ ID NO: 24-29, SEQ ID NO: 32-37, SEQ ID NO: 40-42, SEQ ID NO: 45- 51, SEQ ID NO: 54 to 63, SEQ ID NO: 66 to 71, SEQ ID NO: 74 to 77, SEQ ID NO: 80 to 83, SEQ ID NO: 86 to 89, SEQ ID NO: 92 to 95, SEQ ID NO: 98 to 101, SEQ ID NO: 104 to 107, A composition having a probe selected from the sequences represented by SEQ ID NO: 110 to 113, SEQ ID NO: 116 to 119 and SEQ ID NO: 122 to 125.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3ないし6、配列番号9ないし15、配列番号18ないし21、配列番号24ないし29、配列番号32ないし37、配列番号40ないし42、配列番号45ないし51、配列番号54ないし63、配列番号66ないし71、配列番号74ないし77、配列番号80ないし83、配列番号86ないし89、配列番号92ないし95、配列番号98ないし101、配列番号104ないし107、配列番号110ないし113、配列番号116ないし119および配列番号122ないし125によって表される配列から選択される二つ以上のプローブを有する組成物である。 Another embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 3-6, SEQ ID NO: 9-15, SEQ ID NO: 18-21, SEQ ID NO: 24-29, SEQ ID NO: 32-37, SEQ ID NO: 40-42, SEQ ID NO: 45- 51, SEQ ID NO: 54 to 63, SEQ ID NO: 66 to 71, SEQ ID NO: 74 to 77, SEQ ID NO: 80 to 83, SEQ ID NO: 86 to 89, SEQ ID NO: 92 to 95, SEQ ID NO: 98 to 101, SEQ ID NO: 104 to 107, A composition having two or more probes selected from the sequences represented by SEQ ID NO: 110 to 113, SEQ ID NO: 116 to 119 and SEQ ID NO: 122 to 125.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3および4、配列番号7および8、配列番号11および12、配列番号15および16、配列番号19および20、配列番号23および24、配列番号27および28、配列番号31および32、配列番号35および36、配列番号39および40、配列番号43および44、配列番号47および48、配列番号51および52、配列番号55および56ならびに配列番号59および60によって表される配列から選択される増幅プライマーの対を有する組成物である。 Another embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 15 and 16, SEQ ID NO: 19 and 20, SEQ ID NO: 23 and 24, SEQ ID NO: 27 and 28, SEQ ID NO: 31 and 32, SEQ ID NO: 35 and 36, SEQ ID NO: 39 and 40, SEQ ID NO: 43 and 44, SEQ ID NO: 47 and 48, SEQ ID NO: 51 and 52, SEQ ID NO: 55 and 56 and SEQ ID NO: 59 and 60. A composition having a pair of amplification primers selected from the sequences represented.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号3および4、配列番号7および8、配列番号11および12、配列番号15および16、配列番号19および20、配列番号23および24、配列番号27および28、配列番号31および32、配列番号35および36、配列番号39および40、配列番号43および44、配列番号47および48、配列番号51および52、配列番号55および56ならびに配列番号59および60によって表される配列から選択される増幅プライマーの二つ以上の対を有する組成物である。 Another embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 15 and 16, SEQ ID NO: 19 and 20, SEQ ID NO: 23 and 24, SEQ ID NO: 27 and 28, SEQ ID NO: 31 and 32, SEQ ID NO: 35 and 36, SEQ ID NO: 39 and 40, SEQ ID NO: 43 and 44, SEQ ID NO: 47 and 48, SEQ ID NO: 51 and 52, SEQ ID NO: 55 and 56 and SEQ ID NO: 59 and 60. A composition having two or more pairs of amplification primers selected from the sequences represented.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号131ないし157によって表される配列から選択される23S RNA遺伝子の配列である。 Another embodiment of the invention is the sequence of a 23S RNA gene selected from the sequences represented by SEQ ID NOs: 131-157.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号158ないし261によって表される配列から選択される抗生物質耐性マーカーの配列である。 Another embodiment of the invention is the sequence of an antibiotic resistance marker selected from the sequences represented by SEQ ID NOs: 158-261.
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said sequence represented by said SEQ ID NO is the complement of said SEQ ID NO.
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列（homologous sequence(s)）である、上記のような方法である。 Another embodiment of the present invention is a method as described above, wherein said sequence represented by said SEQ ID NO is a homologous sequence (s) of said SEQ ID NO.
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、上記のような容器、キット、装置または使用である。 Another embodiment of the present invention is a container, kit, device or use as described above, wherein said sequence represented by said SEQ ID NO is the complement of said SEQ ID NO.
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列（homologous sequence(s)）である、上記のような容器、キット、装置または使用である。 Another embodiment of the present invention is a container, kit, device or use as described above, wherein said sequence represented by said SEQ ID NO is a homologous sequence (s) of said SEQ ID NO.
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、上記のような組成物である。 Another embodiment of the present invention is a composition as described above, wherein said sequence represented by said SEQ ID NO is the complement of said SEQ ID NO.
本発明のもう一つの実施形態は、配列番号によって表される配列が前記配列番号の類似配列である、上記のような組成物である。 Another embodiment of the present invention is a composition as described above, wherein the sequence represented by SEQ ID NO is an analogous sequence of said SEQ ID NO.
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、上記のような23S RNA遺伝子の配列である。 Another embodiment of the present invention is a sequence of a 23S RNA gene as described above, wherein the sequence represented by the SEQ ID NO is the complement of the SEQ ID NO.
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列である、上記のような23S RNA遺伝子の配列である。 Another embodiment of the present invention is a sequence of a 23S RNA gene as described above, wherein the sequence represented by the SEQ ID NO is a sequence similar to the SEQ ID NO.
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の相補物である、上記のような抗生物質耐性マーカーの配列である。 Another embodiment of the present invention is a sequence of an antibiotic resistance marker as described above, wherein said sequence represented by said SEQ ID NO is the complement of said SEQ ID NO.
本発明のもう一つの実施形態は、前記配列番号によって表される前記配列が前記配列番号の類似配列である、上記のような抗生物質耐性マーカーの配列である。 Another embodiment of the present invention is the sequence of an antibiotic resistance marker as described above, wherein said sequence represented by said SEQ ID NO is a similar sequence to said SEQ ID NO.
本発明は、微生物の23S RNA遺伝子の配列および抗生物質耐性遺伝子に関係し、また、それらのハイブリダイゼーションおよび／または核酸増幅反応ならびに／または試料中での一つまたは複数の微生物および／または抗生物質耐性遺伝子の存在を検出するための他の識別方法のためのテンプレートとしての使用に関係する。本発明はさらに、前記配列の増幅および前記配列へのハイブリダイゼーションに好適な核酸増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブに関する。 The present invention relates to the sequence of the 23S RNA gene of microorganisms and antibiotic resistance genes, and also to their hybridization and / or nucleic acid amplification reactions and / or one or more microorganisms and / or antibiotics in a sample It relates to its use as a template for other identification methods for detecting the presence of resistance genes. The present invention further relates to nucleic acid amplification primers and hybridization probes suitable for amplification of the sequence and hybridization to the sequence.
前記試料は関心のあるいかなる試料でもよい。動物（たとえば、人間、農業用家畜、家畜、科学用家畜、動物学的家畜）に由来しても、非動物（たとえば、固体および液体の消費品、水システム、下水システム、土壌、加熱／冷却システム）に由来してもよい。試料が人間である場合は、たとえば、血液、唾液、尿、便、任意の体液または組織であってよい。試料は、調査を許し、テンプレート核酸を提供できるいかなるものでもよい。 The sample can be any sample of interest. Non-animal (eg solid and liquid consumables, water systems, sewage systems, soil, heating / cooling systems), even from animals (eg humans, agricultural livestock, livestock, scientific livestock, zoological livestock) ). If the sample is a human, it can be, for example, blood, saliva, urine, stool, any body fluid or tissue. The sample may be anything that can be investigated and can provide a template nucleic acid.
本発明のある実施形態によれば、本発明に基づいて有用な微生物の種は、Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniaeおよびCandida albicansのうちの一つまたは複数である。 According to certain embodiments of the present invention, the microorganism species useful according to the present invention are Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumonialb and Candida One or more of the above.
本発明のもう一つの実施形態によれば、本発明に基づいて有用な抗生物質耐性マーカーは、mecA（メチシリン耐性遺伝子；Bラクタムへの耐性を与える）、vanA（バンコマイシン耐性遺伝子A）、vanB（バンコマイシン耐性遺伝子B）、vanC（バンコマイシン耐性遺伝子C）、blashv（βラクタム耐性遺伝子）、blages-2（βラクタム耐性遺伝子）、spA（Staphylococcus-aureusタンパク質A）、MDR-1（菌類における多剤耐性［multi-drug resistance］遺伝子1）およびCDR-1（菌類における多剤耐性遺伝子2）のうちの一つまたは複数である。
According to another embodiment of the present invention, antibiotic resistance markers useful according to the present invention are mecA (methicillin resistance gene; conferring resistance to B-lactam), vanA (vancomycin resistance gene A), vanB ( Vancomycin resistance gene B), vanC (vancomycin resistance gene C), bla shv (β-lactam resistance gene), blages -2 (β-lactam resistance gene), spA (Staphylococcus-aureus protein A), MDR-1 (multiple in fungi) One or more of multi-drug resistance gene 1) and CDR-1 (
本発明によれば、23S RNAまたは抗生物質耐性マーカーの核酸配列は、配列特異的な核酸検出法のためのテンプレートのはたらきをする。ある検出法は、一つまたは複数の明瞭な領域、すなわち23S RNA遺伝子の領域（23S RNA自身を含む）または抗生物質マーカーの領域であって、該領域の存在を検出することによってある種（species）または抗生物質耐性マーカーの識別を可能にするために十分はっきりしたものの存在を検出することに関わる。検出は、前記明瞭な領域のうち少なくともある部分の増幅によってもよい。代替的または追加的に、検出は、抗核酸抗体の使用または配列決定によってでもよい。検出は、他の種または分類群からの総核酸が試料中に存在するときに生じうる。前記明瞭な領域は、たとえば、
・複数の種の間で保存されない配列部分を有していても、
・複数の抗生物質耐性マーカーの間で保存されない配列部分を有していても、
・保存される配列部分の間にある保存されないいくつかの残基を有して、増幅反応の生成物の長さに基づく識別を可能にしても、
・ある種の条件のもとでプライマーまたはプローブの結合を許す、ある種に特有のある物理的な折り畳み属性または関連するタンパク質を有していてもよい。
According to the present invention, the 23S RNA or antibiotic resistance marker nucleic acid sequence serves as a template for sequence-specific nucleic acid detection methods. Some detection methods include one or more distinct regions, ie, regions of the 23S RNA gene (including 23S RNA itself) or antibiotic marker regions, by detecting the presence of the region. ) Or to detect the presence of something clear enough to allow identification of antibiotic resistance markers. Detection may be by amplification of at least some portion of the distinct region. Alternatively or additionally, detection may be by use of anti-nucleic acid antibodies or sequencing. Detection can occur when total nucleic acid from other species or taxa is present in the sample. The clear region is, for example,
Even if it has a sequence part that is not conserved among multiple species,
Even if it has a sequence portion that is not conserved among multiple antibiotic resistance markers,
Having some non-conserved residues between conserved sequence parts to allow discrimination based on the product length of the amplification reaction,
It may have certain physical folding attributes or related proteins that are unique to certain species that allow the binding of primers or probes under certain conditions.
明瞭な領域は、一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入されている類似配列を含む。ある類似配列において許される置換、削除および／または挿入の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000残基以下などである。あるいはまた、前記の数は、残基の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%未満である。類似配列は、変わっていない残基の一部または全部に基づいて、相変わらず、前記明瞭な領域の識別を許す。明瞭な領域は、該明瞭な領域の相補配列をも含む。 Clear regions include similar sequences in which one or more bases have been deleted, substituted and / or inserted. The number of substitutions, deletions and / or insertions allowed in a similar sequence is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 , 1000 residues or less. Alternatively, the number is 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13% of the residues, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% , 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47 %, 48%, 49%, less than 50%. Similar sequences still allow the distinct regions to be identified based on some or all of the unchanged residues. A distinct region also includes the complementary sequence of the distinct region.
〈増幅〉
核酸増幅（たとえばPCR）が使われる場合、プライマー対とは、その種または耐性遺伝子の一つまたは複数の明瞭な領域が存在しているときにのみ増幅産物（アンプリコン）を提供するような配列および長さのものである。あるいはまた、プライマーは、関心のある種についての特定の長さまたはパターンをもち、他の配列の増幅から生じる増幅産物とは区別できる産物を与えてもよい。代替的または追加的に、増幅プライマーは、その種の識別を可能にする、産物の相対量を与えてもよい（たとえば、電気泳動ゲル上の一つまたは複数の強い帯）。増幅結果を関心のある核酸の存在に対応させる任意の方法が本発明の範囲内である。
<amplification>
When nucleic acid amplification (eg, PCR) is used, a primer pair is a sequence that provides an amplification product (amplicon) only when one or more distinct regions of that species or resistance gene are present And of length. Alternatively, a primer may provide a product that has a specific length or pattern for the species of interest and is distinguishable from amplification products resulting from amplification of other sequences. Alternatively or additionally, amplification primers may provide a relative amount of product that allows for the identification of that species (eg, one or more strong bands on an electrophoresis gel). Any method that matches the amplification result to the presence of the nucleic acid of interest is within the scope of the invention.
PCRのような核酸増幅方法は当技術分野においてよく知られており（ここに参照によって組み込まれる米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照）、Roche、Invitrogen、Qiagen、Promegaといったさまざまな商業的な販売元がPCR試薬を販売し、PCRプロトコルを公表しているが、明確のため、若干の一般的なPCR情報を以下に与えておく。 Nucleic acid amplification methods such as PCR are well known in the art (see U.S. Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202, incorporated herein by reference), and include various commercial methods such as Roche, Invitrogen, Qiagen, Promega. The vendor sells PCR reagents and publishes PCR protocols, but for the sake of clarity, some general PCR information is given below.
PCRプロセスを開始するために、試料中の標的核酸が変性される（試料の核酸が二本鎖であるとして）。変性は典型的には試料を95°C程度まで加熱することによって達成される。 To initiate the PCR process, the target nucleic acid in the sample is denatured (assuming the sample nucleic acid is double stranded). Denaturation is typically achieved by heating the sample to the order of 95 ° C.
ひとたび鎖が分離されたら、PCRの次の段階は、試料の温度を融点TM以下まで下げることによって、分離された鎖をプライマーとハイブリダイゼーションすることを含む。プライマーは、標的領域または部分配列をはさむ。次いで、試料温度を最適延長温度（たとえば70ないし75°C）まで上げることによってプライマーが延長されて、標的鎖の相補的なコピーが作られる。変性、ハイブリダイゼーションおよび延長のサイクルは、所望の量の増幅された核酸を得るために必要なだけ繰り返される。 Once strands are separated, the next step of PCR, by lowering the temperature of the sample to below the melting point T M, which comprises primers hybridizing the separated strands. The primer sandwiches the target region or partial sequence. The primer is then extended by raising the sample temperature to an optimal extension temperature (eg, 70 to 75 ° C.) to make a complementary copy of the target strand. The cycle of denaturation, hybridization and extension is repeated as necessary to obtain the desired amount of amplified nucleic acid.
PCRにおけるプライマーのテンプレート依存延長は、反応媒体中の十分な量の４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）の存在において、重合剤によって触媒される。前記反応媒体は、適切な塩、金属カチオンおよびpH緩衝系からなる。好適な重合剤は、テンプレート依存DNA合成を触媒すると知られている酵素である。たとえば、テンプレートがRNAであれば、RNAを相補的なDNA（cDNA）配列に変換する好適な重合剤は、逆転写酵素（RT: reverse transcriptase）で、たとえば鳥骨髄芽球症（arian myeloblastosis）ウイルスRTなどである。増幅のための標的がDNAとなると、好適なポリメラーゼにはたとえば、E. coli DNAポリメラーゼIまたはそのクレノウ（Klenow）断片、T4 DNAポリメラーゼおよびTaqポリメラーゼというThermus aquaticusから単離された熱安定なDNAポリメラーゼが含まれる。この最後の酵素Taq DNAポリメラーゼは、核酸の増幅および配列決定に広く使われている。DNAポリメラーゼを使うための反応条件は当技術分野において既知であり、たとえば、論文Methods in Enzymology、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manualに記載されている。 Template-dependent extension of primers in PCR is catalyzed by the polymerizing agent in the presence of a sufficient amount of four deoxyribonucleotide triphosphates (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) in the reaction medium. The reaction medium consists of a suitable salt, metal cation and pH buffer system. A suitable polymerizing agent is an enzyme known to catalyze template-dependent DNA synthesis. For example, if the template is RNA, a suitable polymerizing agent that converts RNA to a complementary DNA (cDNA) sequence is reverse transcriptase (RT), for example, arian myeloblastosis virus RT. Once the target for amplification is DNA, suitable polymerases include, for example, E. coli DNA polymerase I or its Klenow fragment, T4 DNA polymerase and Taq polymerase, a thermostable DNA polymerase isolated from Thermus aquaticus Is included. This last enzyme, Taq DNA polymerase, is widely used for nucleic acid amplification and sequencing. Reaction conditions for using DNA polymerase are known in the art and are described, for example, in the article Methods in Enzymology, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
PCR工程の間、鎖の分離およびプライマーのアニーリングおよび延長が平衡状態で起こるよう、温度は注意深く制御される。温度の制御は典型的には、サーモサイクラーから生成される乾熱（dry heat）を使って達成される。 During the PCR process, the temperature is carefully controlled so that strand separation and primer annealing and extension occur at equilibrium. Temperature control is typically achieved using dry heat generated from a thermocycler.
PCR工程の好ましい実施形態では、反応は、Taq DNAポリメラーゼのような熱安定なDNAポリメラーゼ酵素によって触媒され、温度を上げて実行される。好ましい温度は、酵素が熱安定であり、かつ核酸が一本鎖および二本鎖の平衡状態にあるような温度である。それにより、十分なプライマーがテンプレート鎖にアニールし、そこそこの重合率が許容される。鎖分離は、二本鎖の変性を引き起こすために十分高い温度に十分な時間、だがポリメラーゼの不可逆的な変性を引き起こすほどではないように、反応を加熱することによって達成される。 In a preferred embodiment of the PCR process, the reaction is catalyzed by a thermostable DNA polymerase enzyme such as Taq DNA polymerase and carried out at an elevated temperature. Preferred temperatures are those at which the enzyme is thermostable and the nucleic acid is in single and double stranded equilibrium. Thereby, sufficient primer anneals to the template strand and a moderate polymerization rate is allowed. Strand separation is achieved by heating the reaction to a temperature high enough to cause double-strand denaturation, but not so much as to cause irreversible denaturation of the polymerase.
PCR法は、各段階後に新たな試薬が加えられる段階的な仕方で、あるいは所与の回数の段階後に試薬のすべてが加えられる仕方で、実行できる。たとえば、鎖分離が熱によって誘起され、ポリメラーゼが熱に敏感な場合、ポリメラーゼは鎖分離の毎ラウンド後に加えられる必要がある。しかしながら、たとえば変性にヘリカーゼが使われる場合、あるいは延長に熱安定なポリメラーゼが使われる場合、すべての試薬を最初に加えてもよい。あるいはまた、試薬のモル比が反応に重要な場合には、試薬は、合成反応によって消費されるにつれて定期的に補充されてもよい。 PCR methods can be performed in a step-wise manner in which new reagents are added after each step, or in a manner in which all of the reagents are added after a given number of steps. For example, if strand separation is induced by heat and the polymerase is heat sensitive, the polymerase needs to be added after each round of strand separation. However, if helicase is used for denaturation, or if a thermostable polymerase is used for extension, all reagents may be added first. Alternatively, if the molar ratio of reagents is important for the reaction, the reagents may be replenished periodically as they are consumed by the synthesis reaction.
PCR産物の存在、大きさおよび／または量を検出する方法は当技術分野において既知であり、電気泳動、クロマトグラフィー、毛細管ゾーン電気泳動、分析遠心法などの使用を含む。そのような方法は、標識（たとえば、蛍光、化学ルミネセンス、放射性同位体、酵素標識（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼまたはアルカリ・ホスファターゼのような）、染料、抗体など）の使用と組み合わされてもよい。検出はまた、溶液中で、あるいは検出されるべきDNAに向けられた固体支持体または抗体上に固定されて、ハイブリダイゼーション・プローブ（後述）の使用によって達成されてもよい。 Methods for detecting the presence, size and / or quantity of PCR products are known in the art and include the use of electrophoresis, chromatography, capillary zone electrophoresis, analytical centrifugation, and the like. Such methods may be combined with the use of labels (eg, fluorescence, chemiluminescence, radioisotopes, enzyme labels (such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase), dyes, antibodies, etc.). Detection may also be accomplished by use of a hybridization probe (discussed below) in solution or immobilized on a solid support or antibody directed to the DNA to be detected.
本発明のある実施形態によれば、増幅は容器上（on）または容器内（in）で実行される。容器は単一試料用でも複数試料用でもよい。単一試料用容器は、管、瓶、エッペンドルフ管などを含み、当業者には知られている。複数試料用容器は、これに限られないが、マルチウェル・プレート（multi-well plate）、固相スライド、固相膜（たとえばナイロンまたはニトロセルロース）、ミクロスフィア、ガラス・スライド、マイクロアレイ、チップなどを含む。単一試料用容器は、上述の基板を単一試料モードで使ってもよい。複数試料用容器は、たとえば、単一の熱サイクル・ブロックを使って同時に進行する複数ないし多数のPCRを許す。容器は、高スループットのスクリーニングまたはマイクロアレイ・デバイスと適合性があってもよい。プライマーまたは試料の一つまたは複数の対は、固相に固定されてもよい。すでに一つまたは複数の対のプライマーを含む容器が提供されてもよい。そのようなあらかじめロードされた容器は、指定された微生物および／または耐性遺伝子の検出のためのプライマーの組み合わせを含んでいてもよい。あらかじめロードされた容器は、操作者にとって関心のある明瞭な領域の限られた組み合わせの検出（たとえば、単にE. coliおよびvanAまたはvanBまたはvanCの検出）に好適なプライマーの組み合わせを含んでいてもよい。具体的な組み合わせの検出のためのいくつかの変形が利用可能にされてもよい。そのようなあらかじめロードされた容器は、キットの一部として利用可能であってもよいし、単独で利用可能であってもよい。 According to certain embodiments of the invention, amplification is performed on a container (on) or in a container (in). The container may be for a single sample or multiple samples. Single sample containers include tubes, bottles, Eppendorf tubes and the like and are known to those skilled in the art. Multi-sample containers include, but are not limited to, multi-well plates, solid-phase slides, solid-phase membranes (eg nylon or nitrocellulose), microspheres, glass slides, microarrays, chips, etc. including. The single sample container may use the above-described substrate in single sample mode. Multiple sample vessels allow multiple PCRs to proceed simultaneously using, for example, a single thermal cycle block. The container may be compatible with high throughput screening or microarray devices. One or more pairs of primers or samples may be immobilized on a solid phase. A container may be provided that already contains one or more pairs of primers. Such preloaded containers may contain a combination of primers for detection of designated microorganisms and / or resistance genes. The preloaded container may contain primer combinations suitable for detecting limited combinations of distinct regions of interest to the operator (eg, simply detecting E. coli and vanA or vanB or vanC). Good. Several variations for the detection of specific combinations may be made available. Such pre-loaded containers may be available as part of the kit or may be used alone.
本発明のある側面によれば、二対以上の増幅プライマーが、二つ以上の異なる種の存在または二つ以上の異なる抗生物質耐性マーカーの存在または少なくとも一つの種および少なくとも一つの抗生物質耐性マーカーの存在を同時に検出するために使われる。それにより得られる増幅産物は、前記の種および／または抗生物質耐性マーカーの存在の識別を可能にするのに十分、属性が異なっている。同時増幅は、同じ温度サイクル条件のもとで実行されてもよいが、異なるウェルまたはスペースにおいて（たとえば、異なるプライマー対については別々のウェルをもつマイクロアレイ上で）実行されてもよい。任意的に、バッファは増幅プライマーの異なる対について同じであってもよい。異なるプライマー対は、温度および任意的にはバッファの条件が同一なもとで機能するために、ある配列および長さで設計されている。 According to one aspect of the invention, two or more pairs of amplification primers are present in the presence of two or more different species or in the presence of two or more different antibiotic resistance markers or at least one species and at least one antibiotic resistance marker. Used to detect the presence of The resulting amplification products are sufficiently different in attributes to allow discrimination of the presence of said species and / or antibiotic resistance markers. Co-amplification may be performed under the same temperature cycling conditions, but may be performed in different wells or spaces (eg, on a microarray with separate wells for different primer pairs). Optionally, the buffer may be the same for different pairs of amplification primers. Different primer pairs are designed with a certain sequence and length to function under the same temperature and optionally buffer conditions.
本発明のもう一つの側面では、増幅プライマーは同じウェルまたはスペースを占める。すなわち、すべてのプライマーは同じ反応中に存在する（多重化）。多重モードは、増幅プライマー対を二セット以上使った、異なる標的領域の同時増幅に関わる。したがって、温度および任意的にバッファのような条件は、多重PCRプライマーの対について同一である。よって、プライマーはさらに、プライマー対どうしの間の交差反応を起こさせず、似通った融点をもち、同一のバッファ条件で機能するよう設計される。 In another aspect of the invention, the amplification primers occupy the same well or space. That is, all primers are present in the same reaction (multiplexing). Multiplex mode involves simultaneous amplification of different target regions using more than one set of amplification primer pairs. Thus, conditions such as temperature and optionally buffer are the same for multiple PCR primer pairs. Thus, the primer is further designed to function in the same buffer conditions with similar melting points without causing cross-reactions between primer pairs.
多重化されたPCRのためのすべての対が互いに8°C以内のTmをもち、平均Tmが45°Cから約70°Cまでの間であることが好ましく、平均Tmは60°Cから66°Cまでの間であることがより好ましい。 It is preferred that all pairs for multiplexed PCR have a Tm within 8 ° C of each other, the average Tm is between 45 ° C and about 70 ° C, and the average Tm is between 60 ° C and 66 ° C. More preferably, the temperature is up to ° C.
同時増幅は、ある範囲の細菌種および／または抗生物質耐性マーカーが単一のマイクロアレイ上で、あるいは単一の反応容器内で検出されることを可能にし、よって高速で、経済的で、精確なスクリーニングを許す。 Co-amplification allows a range of bacterial species and / or antibiotic resistance markers to be detected on a single microarray or in a single reaction vessel, thus being fast, economical and accurate Allow screening.
増幅プライマーは標的に対して完全に相補的であってもよい。すなわち、不一致がなくてもよい。また、プライマーが標的と完全に相補的ではないが、それでも標的の増幅を許容するというのも本発明の範囲内である。プライマーは、標的テンプレートに一つまたは複数の不一致、欠失および／または挿入があるところにも結合しうる。標的テンプレート中に許される不一致、欠失および／または挿入の数は、天然の相補的領域内で1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の残基であってもよく、それでも標的領域の増幅が許容される。あるいはまた、前記の数は天然の相補的領域内のテンプレート残基の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%未満であってもよい。当業者には既知であるように、そのような値は、プライマーの長さおよび組成に依存する。好ましくは、不一致、欠失および／または挿入は、相補的領域の中央からテンプレートの3′末端に向かう配列部分に制限される。 The amplification primer may be completely complementary to the target. That is, there may be no mismatch. It is also within the scope of the present invention that the primer is not perfectly complementary to the target, but still allows target amplification. A primer may also bind where there is one or more mismatches, deletions and / or insertions in the target template. The number of mismatches, deletions and / or insertions allowed in the target template is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 residues within the natural complementary region. However, amplification of the target region is still allowed. Alternatively, the number is 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11% of the template residues in the natural complementary region , 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28 %, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, It may be less than 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%. As known to those skilled in the art, such values depend on the length and composition of the primers. Preferably, mismatches, deletions and / or insertions are restricted to the sequence portion from the center of the complementary region toward the 3 'end of the template.
プライマーは、一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。プライマーにおいて許される置換、欠失および／または挿入の数は、天然の相補的領域内で1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の残基であってもよい。あるいはまた、前記の数は天然の相補的領域の両末端の中のプライマー残基の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%未満である。当業者には既知であるように、そのような値は、プローブの長さおよび組成に依存する。好ましくは、不一致、欠失および／または挿入は、相補的領域の中央からプライマーの3′末端に向かう配列部分に制限される。さらに、増幅プライマーは、たとえば修飾された塩基または骨格（たとえば、チオリン酸、アルキルチオリン酸、ペプチド核酸；あるいは介入剤（intercalating agents）を含んでいてもよい）により化学修飾されていてもよい。導入される変形または修飾は、要求される特異性および感度（sensitivity）を得るためにそのオリゴヌクレオチドが使われるべき条件に関して適応を必要とすることがありうるが、増幅反応の最終的な結果は本質的には同じになる。 A primer includes a similar sequence with one or more bases deleted, substituted and / or inserted. The number of substitutions, deletions and / or insertions allowed in a primer may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 residues within the natural complementary region. Good. Alternatively, the number is 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% of the primer residues in both ends of the natural complementary region. %, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43% 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, less than 50%. As known to those skilled in the art, such values depend on the length and composition of the probe. Preferably, mismatches, deletions and / or insertions are limited to the portion of the sequence from the center of the complementary region toward the 3 'end of the primer. In addition, amplification primers may be chemically modified, for example, with modified bases or backbones (eg, may include thiophosphates, alkylthiophosphates, peptide nucleic acids; or intercalating agents). Variations or modifications introduced may require adaptation with respect to the conditions under which the oligonucleotide should be used to obtain the required specificity and sensitivity, but the final result of the amplification reaction is Essentially the same.
欠失、置換、挿入または修飾の導入は、アニーリングの速度論、アニーリングの可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性などといった特性にポジティブに影響するために有利となることがある。 The introduction of deletions, substitutions, insertions or modifications may be advantageous to positively affect properties such as annealing kinetics, reversibility of annealing, biological stability of oligonucleotide molecules, and the like.
さらに、増幅プライマーは、5′方向に、一つまたは複数の追加的な塩基、修飾された塩基または化学基（たとえばタグ）で延長されてもよい。そのような修飾は当業者には既知であり、通常、増幅には影響しない。 In addition, amplification primers may be extended with one or more additional bases, modified bases or chemical groups (eg, tags) in the 5 'direction. Such modifications are known to those skilled in the art and usually do not affect amplification.
識別が二重増幅、すなわちネストされたPCRなどによる明瞭な領域を包含する領域の増幅およびそれに続く該明瞭な領域の増幅を含むことが、一つの側面である。第一の反応からの生成物（任意的に精製される）が第二の反応においてテンプレートとして適用されてもよい。あるいはまた、第一の反応が限られた数のサイクルにわたって進行することを許容されてから第二の反応に関係するプライマーが同じ反応容器に加えられてもよい。そのような変形は当業者には既知である。 It is an aspect that the discrimination includes double amplification, ie amplification of a region encompassing a distinct region, such as by nested PCR, followed by amplification of the distinct region. The product from the first reaction (optionally purified) may be applied as a template in the second reaction. Alternatively, the primer associated with the second reaction may be added to the same reaction vessel after the first reaction is allowed to proceed for a limited number of cycles. Such variations are known to those skilled in the art.
〈ハイブリダイゼーション〉
ハイブリダイゼーション・プローブが使われる場合、該プローブの配列および長さは、ある明瞭な領域の核酸が反応中に存在するときにのみハイブリダイゼーションが指示されるような配列および長さのものであってよい。ハイブリダイゼーション・プローブの選択的な結合を達成するための方法および手順は当業者には既知である。代替的または追加的に、プローブはバックグラウンドまたは他のハイブリダイゼーションに対して当該種（species）の識別を可能にするための特定の相対信号強度を提供してもよい。関心のある核酸の存在に対してハイブリダイゼーション反応の結果をマッチさせるいかなる方法も、本発明の範囲内である。
<Hybridization>
When a hybridization probe is used, the sequence and length of the probe should be of a sequence and length such that hybridization is indicated only when a certain region of nucleic acid is present in the reaction. Good. Methods and procedures for achieving selective binding of hybridization probes are known to those skilled in the art. Alternatively or additionally, the probe may provide a specific relative signal strength to allow identification of the species for background or other hybridization. Any method that matches the result of the hybridization reaction to the presence of the nucleic acid of interest is within the scope of the invention.
ハイブリダイゼーション反応を実行する方法および条件は当技術分野において既知であり、たとえばMolecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) (Joseph Sambrook, Peter MacCallum, David Russell, Cold Spring Habor Laboratory Press)に見出すことができる。 Methods and conditions for performing hybridization reactions are known in the art and can be found, for example, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) (Joseph Sambrook, Peter MacCallum, David Russell, Cold Spring Habor Laboratory Press) .
所望の特性をもつプローブを設計するために、当業者に既知の次の有用なガイドラインが適用できる。 The following useful guidelines known to those skilled in the art can be applied to design probes with the desired properties.
ここに記載されるようなハイブリダイゼーション反応の広がりおよび特異性はいくつかの因子によって影響されるため、それらの因子の一つまたは複数の操作が、特定のプローブの厳密な感度および特異性を、標的に対して完璧に相補的であるか否かにかかわりなく、決定する。さまざまな検定条件の重要性および効果はのちに説明する。 Because the breadth and specificity of a hybridization reaction as described herein is affected by several factors, manipulation of one or more of those factors can affect the strict sensitivity and specificity of a particular probe, Determine whether or not it is perfectly complementary to the target. The importance and effect of various test conditions will be explained later.
［プローブ：標的］という核酸ハイブリッドの安定性は、検定条件と適合するよう選ばれるべきである。これは、たとえば、ATに富む長い配列を回避することによって、G:C塩基対でハイブリッドを終端することによって、および適切なTmをもつプローブを設計することによって達成されうる。プローブの開始点および終点の選択は、そのプローブの長さおよび%GCが、最終的な検定が実行される温度より約2ないし10°C高いTmにつながるようになされるべきである。プローブの塩基組成は重要である。というのも、G-C塩基対は追加的な水素結合のため、A-T塩基対に比べより大きな熱的安定性を示すからである。よって、C-C含有率の高い相補的核酸に関わるハイブリダイゼーションのほうがより高温でより安定である。 The stability of the [probe: target] nucleic acid hybrid should be chosen to be compatible with the assay conditions. This can be achieved, for example, by avoiding long AT-rich sequences, by terminating hybrids with G: C base pairs, and by designing probes with the appropriate Tm. The selection of the probe start and end points should be such that the probe length and% GC lead to a Tm of about 2 to 10 ° C. above the temperature at which the final assay is performed. The base composition of the probe is important. This is because G-C base pairs exhibit greater thermal stability than A-T base pairs due to the additional hydrogen bonds. Thus, hybridization involving complementary nucleic acids with a high C-C content is more stable at higher temperatures.
プローブを設計するときには、プローブが使われるときのイオン強度およびインキュベーション温度といった条件も考慮に入れるべきである。ハイブリダイゼーションの度合いは、反応混合物のイオン強度が増すにつれて上昇することおよびハイブリッドの熱的安定性はイオン強度とともに上昇することが知られている。他方、ホルムアミド、尿素、DMSOおよびアルコールといった水素結合を破る化学試薬は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを上げる。そのような試薬による水素結合の不安定化は、Tmを大幅に下げることができる。一般に、約10ないし50塩基の長さのプローブの最適ハイブリダイゼーションは、所与の二本鎖の融点より約5°C下で起こる。最適より低い温度でのインキュベーションは、ハイブリダイズするためのミスマッチした塩基配列を許容することがあり、したがって特異性が下がる結果となりうる。 When designing a probe, conditions such as ionic strength and incubation temperature when the probe is used should also be taken into account. It is known that the degree of hybridization increases as the ionic strength of the reaction mixture increases and the thermal stability of the hybrid increases with ionic strength. On the other hand, chemical reagents that break hydrogen bonds, such as formamide, urea, DMSO and alcohol, increase the stringency of hybridization. Destabilization of hydrogen bonds by such reagents can greatly reduce Tm. In general, optimal hybridization of probes about 10-50 bases in length occurs at about 5 ° C. below the melting point of a given duplex. Incubation at sub-optimal temperatures may allow mismatched base sequences to hybridize and may therefore result in reduced specificity.
高いストリンジェンシーの条件下でのみハイブリダイズするプローブをもつことが望ましい。高ストリンジェンシー条件下では、高度に相補的な核酸ハイブリッドのみが形成される。十分な相補性をもたないハイブリッドは形成されないか、弱めの信号として指示される。したがって、検定条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する二つの核酸鎖の間で必要とされる相補性の量を決める。ストリンジェンシーの度合いは、標的との間および非標的核酸との間に形成されるハイブリッドの安定性の差を最大にするように選ばれる。 It is desirable to have a probe that hybridizes only under conditions of high stringency. Under high stringency conditions, only highly complementary nucleic acid hybrids are formed. Hybrids that do not have sufficient complementarity do not form or are indicated as weak signals. Thus, the stringency of the assay conditions determines the amount of complementarity required between the two nucleic acid strands forming the hybrid. The degree of stringency is chosen to maximize the difference in stability of the hybrid formed between the target and non-target nucleic acid.
ハイブリダイゼーションに対して禁止的なほど強い内部構造を形成することが知られている標的DNAまたはRNA内の領域はそれほど好ましくない。同様に、広範な自己相補性をもつプローブも避けるべきである。ハイブリダイゼーションは、相補的な核酸の一本鎖が二つ結びついて水素結合した二本鎖を形成することである：二つの一本鎖の一方があるハイブリッドに完全または部分的に関わっている場合、それは新たなハイブリッドの形成に参加することはできにくくなることが含意される。十分な自己相補性があれば、一つの型のプローブの諸分子内で分子内または分子間ハイブリッドが形成されることもできる。そのような構造は、注意深いプローブ設計を通じて回避できる。関心のある配列のかなりの部分が一本鎖であるようなプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および広がりを大幅に増すことができる。この種の相互作用を検索するためのコンピュータ・プログラムが入手可能である。しかしながら、ある種の事例では、この種の相互作用を回避することができないこともありうる。 Regions within the target DNA or RNA that are known to form internal structures that are so strong as to be prohibitive to hybridization are less preferred. Similarly, probes with broad self-complementarity should be avoided. Hybridization is the joining of two complementary nucleic acid single strands to form hydrogen-bonded duplexes: when one of the two single strands is completely or partially involved in a hybrid It is implied that it becomes difficult to participate in the formation of new hybrids. With sufficient self-complementarity, intramolecular or intermolecular hybrids can be formed within the molecules of one type of probe. Such a structure can be avoided through careful probe design. By designing probes such that a significant portion of the sequence of interest is single stranded, the rate and spread of hybridization can be greatly increased. Computer programs are available for searching for this type of interaction. However, in certain cases, this type of interaction may not be avoided.
配列の存在を検出する方法は、これに限られないが、サザンブロット、ノーザンブロット、親和性クロマトグラフィーおよび固相検定（solid-phase assay）を含みうる。諸方法は、当業者には理解されるように、蛍光マーカー、放射性同位体マーカー、酵素リンクされたマーカー、染料、抗体、プローブにリンクされた酵素の使用を含んでいてもよい。 Methods for detecting the presence of a sequence can include, but are not limited to, Southern blots, Northern blots, affinity chromatography and solid-phase assays. Methods may include the use of fluorescent markers, radioisotope markers, enzyme linked markers, dyes, antibodies, probes linked enzymes, as will be appreciated by those skilled in the art.
本発明のある実施形態によれば、解析は容器上（on）または容器内（in）で実行される。容器は単一試料用でも複数試料用でもよい。単一試料用容器は、管、瓶、エッペンドルフ管などを含み、当業者には知られている。複数試料用容器は、これに限られないが、マルチウェル・プレート（multi-well plate）、固相サポート、固相スライド、固相膜（たとえばナイロンまたはニトロセルロース）、多孔性構造、ミクロスフィア、ガラス・スライド、マイクロアレイ、チップなどを含む。単一試料用容器は、上述の基板を単一試料モードで使ってもよい。試料は、たとえばマルチプル・アプリケータ（multiple applicator）、ソフト・リソグラフィーまたはマイクロ接触印刷（microcontact printing）、インクジェット技術などを使って加えられてもよい。一つまたは複数のプローブまたは試料が、固相に（たとえば固相サポートに）固定されてもよい。複数試料固体サポートは、単一のハイブリダイゼーション・オーブンもしくはプラットフォームおよび／または単一セットの試薬を使って、たとえば数個または多数のハイブリダイゼーションが同時に進行することを許す。固体サポートは、高スループットのスクリーニングまたはマイクロアレイ・デバイスと適合性があってもよい。すでに一つまたは複数のプローブを含む容器が提供されてもよい。そのようなあらかじめロードされた容器は、指定された微生物および／または耐性遺伝子の検出のためのプローブの組み合わせを含んでいてもよい。あらかじめロードされた容器は、操作者にとって関心のある明瞭な領域の限られた組み合わせの検出（たとえば、単にE.coliおよびvanAまたはvanBまたはvanCの検出）に好適なプローブの組み合わせを含んでいてもよい。具体的な組み合わせの検出のためのいくつかの変形が利用可能にされてもよい。そのようなあらかじめロードされた容器は、キットの一部として利用可能であってもよいし、単独で利用可能であってもよい。 According to an embodiment of the invention, the analysis is performed on the container (on) or in the container (in). The container may be for a single sample or multiple samples. Single sample containers include tubes, bottles, Eppendorf tubes and the like and are known to those skilled in the art. Multi-sample containers include, but are not limited to, multi-well plates, solid phase supports, solid phase slides, solid phase membranes (eg nylon or nitrocellulose), porous structures, microspheres, Includes glass slides, microarrays, chips, etc. The single sample container may use the above-described substrate in single sample mode. The sample may be applied using, for example, multiple applicators, soft lithography or microcontact printing, ink jet technology, and the like. One or more probes or samples may be immobilized on a solid phase (eg, on a solid support). A multiple sample solid support allows, for example, several or multiple hybridizations to proceed simultaneously using a single hybridization oven or platform and / or a single set of reagents. The solid support may be compatible with high throughput screening or microarray devices. Containers that already contain one or more probes may be provided. Such pre-loaded containers may contain a combination of probes for detection of designated microorganisms and / or resistance genes. The preloaded container may contain a probe combination suitable for detecting a limited combination of distinct areas of interest to the operator (eg, simply detecting E. coli and vanA or vanB or vanC). Good. Several variations for the detection of specific combinations may be made available. Such pre-loaded containers may be available as part of the kit or may be used alone.
本発明のある側面によれば、二つ以上のハイブリダイゼーション・プローブが、二つ以上の異なる種の存在または二つ以上の異なる抗生物質耐性マーカーの存在または少なくとも一つの種および少なくとも一つの抗生物質耐性マーカーの存在を同時に検出するために使われる。それにより得られるハイブリダイゼーション産物は、前記の種および／または抗生物質耐性マーカーの存在の識別を可能にするのに十分、属性が異なっている。同時ハイブリダイゼーションは、同じ温度条件のもとで実行されてもよいが、異なるウェルまたはスペースにおいて（たとえば、異なるプライマー対については別々のウェルをもつマイクロアレイ上で）実行されてもよい。任意的に、バッファは異なるプローブについて同じであってもよい。こうして、異なるプローブは、温度および任意的にはバッファの条件が同一なもとで機能するために、ある配列および長さで設計されている。 According to one aspect of the invention, two or more hybridization probes are present in the presence of two or more different species or in the presence of two or more different antibiotic resistance markers or at least one species and at least one antibiotic. Used to simultaneously detect the presence of resistance markers. The resulting hybridization products are sufficiently different in attributes to allow discrimination of the presence of said species and / or antibiotic resistance markers. Simultaneous hybridization may be performed under the same temperature conditions, but may be performed in different wells or spaces (eg, on a microarray with separate wells for different primer pairs). Optionally, the buffer may be the same for different probes. Thus, different probes are designed with a certain sequence and length in order to function under the same temperature and optionally buffer conditions.
本発明のもう一つの側面では、ハイブリダイゼーション・プローブは同じウェルまたはスペースを占める。すなわち、すべてのプローブは同じ反応中に存在する。したがって、温度および任意的にバッファのような条件は、諸プローブについて同一である。よって、プローブはさらに、交差反応を起こさせず、二つ以上の種、DNA耐性遺伝子またはその両方の存在が信頼できる形で識別されることを許容する結果を与えるようよう設計される。 In another aspect of the invention, the hybridization probes occupy the same well or space. That is, all probes are present in the same reaction. Thus, conditions such as temperature and optionally buffer are the same for the probes. Thus, the probes are further designed to give a result that does not cause cross-reactivity and allows the presence of two or more species, DNA resistance genes or both to be reliably identified.
そのような同時ハイブリダイゼーションは、交差結合からの誤った結果の起こりやすさを最小化して、ある範囲の細菌種および／または抗生物質耐性マーカーが単一のマイクロアレイ上で、あるいは単一の反応内で検出されることを可能にする。 Such simultaneous hybridization minimizes the likelihood of false results from cross-linking, allowing a range of bacterial species and / or antibiotic resistance markers to be on a single microarray or within a single reaction. Allows to be detected at.
ハイブリダイゼーション・プローブは標的に対して完全に相補的であってもよい。すなわち、不一致がなくてもよい。また、プローブが標的と完全に相補的ではないが、それでも標的の識別および弁別を許容するというのも本発明の範囲内である。プローブは、標的テンプレートに一つまたは複数の不一致、欠失および／または挿入があるときでも結合しうる。標的テンプレート中に許される不一致、欠失および／または挿入の数は、天然の相補的領域の両末端の中で1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の残基であってもよい。あるいはまた、前記の数は天然の相補的領域の両末端の中のテンプレート残基の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%未満であってもよい。当業者には既知であるように、そのような値は、プローブの長さおよび組成に依存する。 The hybridization probe may be completely complementary to the target. That is, there may be no mismatch. It is also within the scope of the present invention that the probe is not perfectly complementary to the target, but still allows target identification and discrimination. A probe may bind even when there are one or more mismatches, deletions and / or insertions in the target template. The number of mismatches, deletions and / or insertions allowed in the target template is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 in both ends of the natural complementary region. It may be a residue. Alternatively, the number is 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% of the template residues in both ends of the natural complementary region. %, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43% 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, less than 50%. As known to those skilled in the art, such values depend on the length and composition of the probe.
プローブ配列は、一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。プローブにおいて許される置換、欠失および／または挿入の数は、天然の相補的領域の両末端の中で1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の残基であってもよい。あるいはまた、前記の数は天然の相補的領域の両末端の中のプライマー残基の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%未満である。当業者には既知であるように、そのような値は、プローブの長さおよび組成に依存する。さらに、プローブは、たとえば修飾された塩基または骨格（たとえば、チオリン酸、アルキルチオリン酸、ペプチド核酸；あるいは介入剤（intercalating agents）を含んでいてもよい）により化学修飾されていてもよい。導入される変形または修飾は、要求される特異性および感度（sensitivity）を得るためにそのオリゴヌクレオチドが使われるべき条件に関して適応を必要とすることがありうるが、ハイブリダイゼーションの最終的な結果は本質的には同じになる。これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション速度論、ハイブリダイゼーションの可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性などといった特性にポジティブに影響するために有利となることがある。 Probe sequences include similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted. The number of substitutions, deletions and / or insertions allowed in the probe is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 residues in both ends of the natural complementary region It may be. Alternatively, the number is 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% of the primer residues in both ends of the natural complementary region. %, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43% 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, less than 50%. As known to those skilled in the art, such values depend on the length and composition of the probe. In addition, the probe may be chemically modified, eg, with a modified base or backbone (eg, may contain thiophosphate, alkylthiophosphate, peptide nucleic acid; or intercalating agents). Variations or modifications introduced may require adaptation with respect to the conditions under which the oligonucleotide should be used in order to obtain the required specificity and sensitivity, but the net result of hybridization is Essentially the same. The introduction of these modifications may be advantageous for positively affecting properties such as hybridization kinetics, reversibility of hybridization, biological stability of oligonucleotide molecules, and the like.
本発明に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、明瞭な領域の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の塩基の配列またはその相補配列にアニーリングすることができる。 Hybridization probes according to the present invention comprise 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more distinct regions. It can anneal to a base sequence or its complementary sequence.
ハイブリダイゼーションのテンプレートが増幅産物であることが一つの側面である。すなわち、明瞭な領域を包含する核酸がまず増幅され、該増幅の産物を使ってハイブリダイゼーションが進行するということである。 One aspect is that the hybridization template is an amplification product. That is, a nucleic acid including a clear region is first amplified, and hybridization proceeds using the amplification product.
１．Enterobacter cloacae
本発明のある側面によれば、Enterobacter cloacaeの23S RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表１および表２に示されたヌクレオチド配列（配列番号1または2）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は前記明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
1. Enterobacter cloacae
According to one aspect of the present invention, a distinct region of the Enterobacter cloacae 23S RNA gene comprises the nucleotide sequence shown in Tables 1 and 2 (SEQ ID NO: 1 or 2). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence similar to or complementary to the distinct region.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号1の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1251から2050までの間の任意の領域を増幅することができる。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1279から1998までの間（表２、配列番号2）の任意の領域を増幅することができる対である。 A pair of amplification primers according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 1. Preferably, the amplification primer pair is capable of amplifying any region between residues 1251 and 2050. Even more preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between residues 1279 and 1998 (Table 2, SEQ ID NO: 2).
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1279から1998までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1279（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1998（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Enterobacter cloacaeを検出するのに好適な増幅プライマーは、表３の配列を含む。順方向（F: forwards）プライマーおよび逆方向（R: reverse）プライマーの組み合わせは、表３に示されるように、配列番号3（F）と配列番号4（R）、配列番号5（F）と配列番号6（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between residues 1279 and 1998. The primer ranges from residue 1279 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1998 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting Enterobacter cloacae comprise the sequences in Table 3. The combinations of forward (F) forwards and reverse (R) reverse primers are shown in Table 3, SEQ ID NO: 3 (F), SEQ ID NO: 4 (R), SEQ ID NO: 5 (F) Contains SEQ ID NO: 6 (R). However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号1またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1279から1998までの間の領域（配列番号2）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる対である。該プローブが、残基1279（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1998（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域にハイブリダイズすることができることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Enterobacter cloacaeを検出するのに好適なプローブは、配列番号3ないし6によって表される配列およびその相補配列を含む。 According to one embodiment of the invention, the hybridization probe is a pair capable of hybridizing to the region between residues 1279 to 1998 (SEQ ID NO: 2) or its complementary sequence. The probes range from residues 1279 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residues) to 1998 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention to be able to hybridize to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the present invention, a probe suitable for detecting Enterobacter cloacae comprises the sequence represented by SEQ ID NOs: 3 to 6 and its complementary sequence.
本発明のもう一つの側面は、表３のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Enterobacter cloacaeを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号3ないし6のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention is a method of identifying Enterobacter cloacae by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 3 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to one embodiment of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 3-6.
本発明のもう一つの側面は、表３に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 3.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
２．Enterococcus faecalis
本発明のある側面によれば、Enterococcus faecalisの23S RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表４および表５に示されたヌクレオチド配列（配列番号7または8）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の類似配列である。
2. Enterococcus faecalis
According to one aspect of the present invention, one distinct region of the Enterococcus faecalis 23S RNA gene comprises the nucleotide sequence shown in Tables 4 and 5 (SEQ ID NO: 7 or 8). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence similar to the SEQ ID NO.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号7の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1259から1978までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1268から1940までの間（表５、配列番号8）の任意の領域を増幅することができる対である。 An amplification primer pair according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 7. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between residues 1259 and 1978. Even more preferably, the pair of amplification primers is a pair capable of amplifying any region between residues 1268 and 1940 (Table 5, SEQ ID NO: 8).
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1268から1940までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1268（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1940（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Enterococcus faecalisを検出するのに好適な増幅プライマーは、表６の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表６に示されるように、配列番号9（F）と11（R）、配列番号9（F）と12（R）、配列番号13（F）と14（R）、配列番号15（F）と12（R）、配列番号15（F）と11（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between residues 1268 and 1940. The primer ranges from residues 1268 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1940 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting Enterococcus faecalis comprise the sequences in Table 6. As shown in Table 6, the combinations of forward (F) primer and reverse (R) primer are SEQ ID NO: 9 (F) and 11 (R), SEQ ID NO: 9 (F) and 12 (R), sequence Includes numbers 13 (F) and 14 (R), SEQ ID NOs 15 (F) and 12 (R), and SEQ ID NOs 15 (F) and 11 (R). However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号7またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 7 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1279から1998までの間の領域（配列番号8）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる対である。該プローブが、残基1279（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1998（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Enterococcus faecalisを検出するのに好適なプローブは、配列番号9ないし15によって表される配列およびその相補配列を含む。 According to one embodiment of the invention, the hybridization probe is a pair capable of hybridizing to the region between residues 1279 to 1998 (SEQ ID NO: 8) or its complementary sequence. The probes range from residues 1279 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residues) to 1998 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the invention, suitable probes for detecting Enterococcus faecalis include the sequences represented by SEQ ID NOs: 9-15 and their complementary sequences.
本発明のもう一つの側面は、表６のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Enterococcus faecalisを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号9ないし15のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention is a method of identifying Enterococcus faecalis by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 6 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 9-15.
本発明のもう一つの側面は、表６に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 6.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
３．Enterococcus faecium
本発明のある側面によれば、Enterococcus faeciumの23S RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表７および表８に示されたヌクレオチド配列（配列番号16または17）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の類似配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
3. Enterococcus faecium
According to one aspect of the present invention, a distinct region of the Enterococcus faecium 23S RNA gene comprises the nucleotide sequence shown in Tables 7 and 8 (SEQ ID NO: 16 or 17). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence similar to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号16の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1381から1560までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1392から1547までの間（表８、配列番号17）の任意の領域を増幅することができる対である。 A pair of amplification primers according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 16. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between residues 1381 to 1560. Even more preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between residues 1392 and 1547 (Table 8, SEQ ID NO: 17).
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1392から1547までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1392（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1547（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Enterococcus faeciumを検出するのに好適な増幅プライマーは、表９の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表９に示されるように、配列番号18と19、配列番号19と20、配列番号20と21を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying the region between residues 1392 and 1547. The primers range from residues 1392 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1547 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting Enterococcus faecium comprise the sequences in Table 9. The forward (F) primer and reverse (R) primer combinations include SEQ ID NOs: 18 and 19, SEQ ID NOs: 19 and 20, and SEQ ID NOs: 20 and 21, as shown in Table 9. However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号16またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 16 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1392から1547までの間の領域（配列番号17）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基1392（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1547（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Enterococcus faeciumを検出するのに好適なプローブは、配列番号18ないし21のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。 According to one embodiment of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between residues 1392 and 1547 (SEQ ID NO: 17) or its complementary sequence. The probes range from residues 1392 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1547 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the invention, a probe suitable for detecting Enterococcus faecium comprises the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 18-21 and its complementary sequence.
本発明のもう一つの側面は、表９のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Enterococcus faeciumを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号18ないし21のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the present invention is a method for identifying Enterococcus faecium by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 9 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to one embodiment of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 18-21.
本発明のもう一つの側面は、表９に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 9.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
４．Escherichia coli
本発明のある側面によれば、Escherichia coliの23S RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表１０および表１１に示されたヌクレオチド配列（配列番号22または23）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
4). Escherichia coli
According to one aspect of the invention, one distinct region of the Escherichia coli 23S RNA gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 10 and Table 11 (SEQ ID NO: 22 or 23). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号22の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1201から1740までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1265から1667までの間（表１１、配列番号23）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 22. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1265から1667までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1265（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1265（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Escherichia coliを検出するのに好適な増幅プライマーは、表１２の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表１２に示されるように、配列番号24（F）と25（R）、配列番号24（F）と26（R）、配列番号27（F）と29（R）、配列番号28（F）と29（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the present invention is a pair capable of amplifying a region between residues 1265 and 1667. The primer ranges from residue 1265 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1265 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, amplification primers suitable for detecting Escherichia coli comprise the sequences in Table 12. The combinations of forward (F) primer and reverse (R) primer are shown in Table 12, SEQ ID NO: 24 (F) and 25 (R), SEQ ID NO: 24 (F) and 26 (R), sequence Includes numbers 27 (F) and 29 (R), SEQ ID NOs 28 (F) and 29 (R). However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号22またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 22 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1265から1667までの間の領域（配列番号23）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる対である。該プローブが、残基1265（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1667（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Escherichia coliを検出するのに好適なプローブは、配列番号24ないし29によって表される配列およびその相補配列を含む。 According to one embodiment of the invention, the hybridization probe is a pair capable of hybridizing to the region between residues 1265 to 1667 (SEQ ID NO: 23) or its complementary sequence. The probes range from residue 1265 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1667 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the invention, a probe suitable for detecting Escherichia coli comprises the sequence represented by SEQ ID NOs: 24-29 and its complementary sequence.
本発明のもう一つの側面は、表１２のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Escherichia coliを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号24ないし29のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the present invention is a method for identifying Escherichia coli by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 12 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 24-29.
本発明のもう一つの側面は、表１２に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 12.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
５．Klebsiella pneumoniae
本発明のある側面によれば、Klebsiella pneumoniaeの23S RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表１３および表１４に示されたヌクレオチド配列（配列番号30または31）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な配列は、該明瞭な配列の類似配列またはその相補配列である。
5. Klebsiella pneumoniae
According to one aspect of the invention, one distinct region of the Klebsiella pneumoniae 23S RNA gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 13 and Table 14 (SEQ ID NO: 30 or 31). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct sequence is a sequence similar to or distinct from the distinct sequence.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号30の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1251から1600までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1281から1560までの間（表１４、配列番号31）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the present invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 30. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1281から1560までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1281（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1560（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Klebsiella pneumoniaeを検出するのに好適な増幅プライマーは、表１５の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表１２に示されるように、配列番号32（F）と34（R）、配列番号32（F）と33（R）、配列番号35（F）と36（R）、配列番号37（F）と33（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号30またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 30 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1281から1560までの間の領域（配列番号31）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基1281（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1560（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Klebsiella pneumoniaeを検出するのに好適なプローブは、配列番号32ないし37によって表される配列およびその相補配列を含む。 According to one embodiment of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between residues 1281 to 1560 (SEQ ID NO: 31) or its complementary sequence. The probes range from residue 1281 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1560 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the present invention, a probe suitable for detecting Klebsiella pneumoniae comprises the sequence represented by SEQ ID NOs: 32 to 37 and its complementary sequence.
本発明のもう一つの側面は、表１５のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Klebsiella pneumoniaeを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号32ないし37のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the present invention is a method for identifying Klebsiella pneumoniae by amplification of nucleic acids using the primer pairs of Table 15 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 32-37.
本発明のもう一つの側面は、表１５に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 15.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
６．Pseudomonas aeruginosa
本発明のある側面によれば、Pseudomonas aeruginosaの23S RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表１６および表１７に示されたヌクレオチド配列（配列番号38または39）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
6). Pseudomonas aeruginosa
According to one aspect of the invention, a distinct region of the 23S RNA gene of Pseudomonas aeruginosa comprises the nucleotide sequence shown in Table 16 and Table 17 (SEQ ID NO: 38 or 39). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号38の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基51から750までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基104から704までの間（表１７、配列番号39）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 38. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基104から704までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基104（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から704（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Pseudomonas aeruginosaを検出するのに好適な増幅プライマーは、表１８の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表１８に示されるように、配列番号40（F）と41（R）、配列番号40（F）と42（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between residues 104-704. The primers are residues 104 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 704 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting Pseudomonas aeruginosa comprise the sequences in Table 18. The forward (F) and reverse (R) primer combinations include SEQ ID NOs: 40 (F) and 41 (R) and SEQ ID NOs: 40 (F) and 42 (R), as shown in Table 18. . However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号38またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 38 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基104から704までの間の領域（配列番号39）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基104（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から704（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Pseudomonas aeruginosaを検出するのに好適なプローブは、配列番号40ないし42のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。 According to an embodiment of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between residues 104 to 704 (SEQ ID NO: 39) or its complementary sequence. The probe is from residue 104 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 704 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the present invention, a probe suitable for detecting Pseudomonas aeruginosa comprises the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 40 to 42 and its complementary sequence.
本発明のもう一つの側面は、表１８のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Pseudomonas aeruginosaを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号40ないし42のうちのいずれか一つに対応する配列を有する。 Another aspect of the invention is a method of identifying Pseudomonas aeruginosa by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 18 in combination with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 40-42.
本発明のもう一つの側面は、表１８に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 18.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
７．Staphylococcus aureus
本発明のある側面によれば、Staphylococcus aureusの23S RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表１９および表２０に示されたヌクレオチド配列（配列番号43または44）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
7). Staphylococcus aureus
According to one aspect of the invention, one distinct region of the 23S RNA gene of Staphylococcus aureus comprises the nucleotide sequence shown in Table 19 and Table 20 (SEQ ID NO: 43 or 44). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号43の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1021から1320までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1037から1263までの間（表２０、配列番号44）の任意の領域を増幅することができる対である。 An amplification primer pair according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 43. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between residues 1021 to 1320. Even more preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between residues 1037 and 1263 (Table 20, SEQ ID NO: 44).
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1037から1263までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1037（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1263（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Staphylococcus aureusを検出するのに好適な増幅プライマーは、表２１の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表２１に示されるように、配列番号45（F）と46（R）、配列番号48（F）と47（R）、配列番号48（F）と49（R）、配列番号48（F）と51（R）、配列番号50（F）と51（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying the region between residues 1037 and 1263. The primers range from residues 1037 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1263 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting Staphylococcus aureus comprise the sequences in Table 21. The combinations of forward (F) primer and reverse (R) primer are shown in Table 21, SEQ ID NO: 45 (F) and 46 (R), SEQ ID NO: 48 (F) and 47 (R), sequence Number 48 (F) and 49 (R), SEQ ID NO: 48 (F) and 51 (R), SEQ ID NO: 50 (F) and 51 (R) are included. However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号43またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 43 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1037から1263までの間の領域（配列番号44）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる対である。該プローブが、残基1037（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1263（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Staphylococcus aureusを検出するのに好適なプローブは、配列番号45ないし51のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。 According to one embodiment of the invention, the hybridization probe is a pair capable of hybridizing to the region between residues 1037 to 1263 (SEQ ID NO: 44) or its complementary sequence. The probes range from residues 1037 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1263 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the present invention, a probe suitable for detecting Staphylococcus aureus comprises the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 45 to 51 and its complementary sequence.
本発明のもう一つの側面は、表２１のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Staphylococcus aureusを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号45ないし51のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention is a method for identifying Staphylococcus aureus by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 21 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 45-51.
本発明のもう一つの側面は、表２１に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 21.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
８．Staphylococcus epidermidis
本発明のある側面によれば、Staphylococcus epidermidisの23S RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表２２および表２３に示されたヌクレオチド配列（配列番号52または53）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
8). Staphylococcus epidermidis
According to one aspect of the invention, a distinct region of the 23S RNA gene of Staphylococcus epidermidis comprises the nucleotide sequence shown in Table 22 and Table 23 (SEQ ID NO: 52 or 53). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号52の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基501から1050までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1037から1263までの間（表２３、配列番号53）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the present invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 52. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基1037から1263までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基1037（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1263（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、Staphylococcus epidermidisを検出するのに好適な増幅プライマーは、表２４の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表２４に示されるように、配列番号54（F）と55（R）、配列番号54（F）と56（R）、配列番号54（F）と57（R）、配列番号58（F）と57（R）、配列番号58（F）と59（R）、配列番号58（F）と60（R）、配列番号58（F）と61（R）、配列番号58（F）と62（R）、配列番号63（F）と59（R）、配列番号63（F）と60（R）、配列番号63（F）と61（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying the region between residues 1037 and 1263. The primers range from residues 1037 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1263 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting Staphylococcus epidermidis comprise the sequences in Table 24. The combinations of forward (F) and reverse (R) primers are shown in Table 24, SEQ ID NOs: 54 (F) and 55 (R), SEQ ID NOs: 54 (F) and 56 (R), No. 54 (F) and 57 (R), SEQ ID No. 58 (F) and 57 (R), SEQ ID No. 58 (F) and 59 (R), SEQ ID No. 58 (F) and 60 (R), SEQ ID No. 58 (F) and 61 (R), SEQ ID NO: 58 (F) and 62 (R), SEQ ID NO: 63 (F) and 59 (R), SEQ ID NO: 63 (F) and 60 (R), SEQ ID NO: 63 (F ) And 61 (R). However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号52またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 52 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基1037から1263までの間の領域（配列番号53）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる対である。該プローブが、残基1037（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から1263（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Staphylococcus epidermidisを検出するのに好適なプローブは、配列番号54ないし63のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。 According to one embodiment of the invention, the hybridization probe is a pair capable of hybridizing to the region between residues 1037 to 1263 (SEQ ID NO: 53) or its complementary sequence. The probes range from residues 1037 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 1263 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the present invention, a probe suitable for detecting Staphylococcus epidermidis comprises the sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 54 to 63 and its complementary sequence.
本発明のもう一つの側面は、表２４のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Staphylococcus epidermidisを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号54ないし63のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the present invention is a method for identifying Staphylococcus epidermidis by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 24 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 54-63.
本発明のもう一つの側面は、表２４に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 24.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
９．Candida albicans
本発明のある側面によれば、Candida albicansの23S RNA遺伝子のある明瞭な領域が、表２５および表２６に示されたヌクレオチド配列（配列番号64または65）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
9. Candida albicans
According to one aspect of the invention, one distinct region of the Candida albicans 23S RNA gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 25 and Table 26 (SEQ ID NO: 64 or 65). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号64の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基181から778までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基214から739までの間（表２６、配列番号65）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 64. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基214から739までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基214（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から739（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。
An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying the region between
本発明のある側面によれば、Candida albicansを検出するのに好適な増幅プライマーは、表２７の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表２７に示されるように、配列番号66（F）と67（R）、配列番号68（F）と69（R）、配列番号70（F）と71（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 According to one aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting Candida albicans comprise the sequences in Table 27. The combinations of forward (F) primer and reverse (R) primer are as shown in Table 27, SEQ ID NO: 66 (F) and 67 (R), SEQ ID NO: 68 (F) and 69 (R), sequence Includes numbers 70 (F) and 71 (R). However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号64またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 64 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基214から739までの間の領域（配列番号65）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基214（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から739（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、Candida albicansを検出するのに好適なプローブは、配列番号66ないし71のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
According to one embodiment of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between
本発明のもう一つの側面は、表２７のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、Candida albicansを識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号66ないし71のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the present invention is a method for identifying Candida albicans by amplification of nucleic acids using the primer pairs of Table 27 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 66-71.
本発明のもう一つの側面は、表２７に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 27.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
１０．blages-2（βラクタム耐性遺伝子）
本発明のある側面によれば、blages-2遺伝子のある明瞭な領域が、表２８および表２９に示されたヌクレオチド配列（配列番号72または73）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
10. bla ges-2 (β-lactam resistance gene)
According to one aspect of the invention, one distinct region of the blades-2 gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 28 and Table 29 (SEQ ID NO: 72 or 73). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号72の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から653までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基140から482までの間（表２６、配列番号73）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 72. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基140から482までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基140（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から482（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、blages-2遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表３０の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表３０に示されるように、配列番号74（F）と75（R）、配列番号76（F）と77（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between residues 140-482. The primer ranges from residue 140 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 482 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting the blades-2 gene comprise the sequences in Table 30. The forward (F) and reverse (R) primer combinations include SEQ ID NOs: 74 (F) and 75 (R) and SEQ ID NOs: 76 (F) and 77 (R), as shown in Table 30. . However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号72またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 72 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基140から482までの間の領域（配列番号73）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基140（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から482（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、blages-2遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号74ないし77のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
According to certain embodiments of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between
本発明のもう一つの側面は、表３０のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、blages-2遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号74ないし77のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention is to identify the blades-2 gene by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 30 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. It is a method to do. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 74-77.
本発明のもう一つの側面は、表３０に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 30.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
１１．blashv（βラクタム耐性遺伝子）
本発明のある側面によれば、blashv遺伝子のある明瞭な領域が、表３１および表３２に示されたヌクレオチド配列（配列番号78または79）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
11. bla shv (β-lactam resistance gene)
According to one aspect of the invention, one distinct region of the blashv gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 31 and Table 32 (SEQ ID NO: 78 or 79). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号78の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から693までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基149から350までの間（表３２、配列番号79）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the present invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 78. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基149から350までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基149（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から350（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、blashv遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表３３の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表３３に示されるように、配列番号80と81、配列番号82と83を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the present invention is a pair capable of amplifying a region between residues 149-350. The primer ranges from residue 149 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 350 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting the blashv gene comprise the sequences in Table 33. The forward (F) primer and reverse (R) primer combinations include SEQ ID NOs: 80 and 81 and SEQ ID NOs: 82 and 83 as shown in Table 33. However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号78またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 78 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基149から350までの間の領域（配列番号79）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基149（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から350（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、blashv遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号80ないし83のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。 According to certain embodiments of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between residues 149-350 (SEQ ID NO: 79) or its complementary sequence. The probe has residues 149 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residues) to 350 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the present invention, a probe suitable for detecting the blashv gene comprises a sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 80 to 83 and its complementary sequence.
本発明のもう一つの側面は、表３３のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、blashv遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号80ないし83のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention is a method of identifying a blashv gene by amplification of a nucleic acid using the primer pairs of Table 33 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. It is. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 80-83.
本発明のもう一つの側面は、表３３に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 33.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
１２．mecA（メチシリン耐性遺伝子）
本発明のある側面によれば、mecA遺伝子のある明瞭な領域が、表３４および表３５に示されたヌクレオチド配列（配列番号84または85）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
12 mecA (methicillin resistance gene)
According to one aspect of the invention, one distinct region of the mecA gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 34 and Table 35 (SEQ ID NO: 84 or 85). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号84の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から611までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基184から484までの間（表３５、配列番号85）の任意の領域を増幅することができる対である。
A pair of amplification primers according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 84. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基184から484までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基184（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から484（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、mecA遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表３６の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表３６に示されるように、配列番号86（F）と87（R）、配列番号88（F）と89（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号84またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 84 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基149から349までの間の領域（配列番号85）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基184（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から484（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、mecA遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号86ないし89のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。 According to one embodiment of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between residues 149-349 (SEQ ID NO: 85) or its complementary sequence. The probe is from residue 184 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 484 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to an aspect of the present invention, a probe suitable for detecting the mecA gene includes a sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 86 to 89 and a complementary sequence thereof.
本発明のもう一つの側面は、表３６のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、mecA遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号86ないし89のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention is a method of identifying a mecA gene by amplification of a nucleic acid using the primer pairs in Table 36 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 86-89.
本発明のもう一つの側面は、表３６に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 36.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
１３．spA（Staphylococcus aureusタンパク質A）
本発明のある側面によれば、spA遺伝子のある明瞭な領域が、表３７および表３８に示されたヌクレオチド配列（配列番号90または91）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
13. spA (Staphylococcus aureus protein A)
According to one aspect of the invention, one distinct region of the spA gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 37 and Table 38 (SEQ ID NO: 90 or 91). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号90の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から501までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基292から409までの間（表３８、配列番号91）の任意の領域を増幅することができる対である。
A pair of amplification primers according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 90. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基292から409までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基292（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から409（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、spA遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表３９の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表３９に示されるように、配列番号92（F）と93（R）、配列番号94（F）と95（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between residues 292-409. The primers are residues 292 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 409 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting the spA gene comprise the sequences in Table 39. The forward (F) and reverse (R) primer combinations include SEQ ID NOs: 92 (F) and 93 (R) and SEQ ID NOs: 94 (F) and 95 (R), as shown in Table 39. . However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号90またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 90 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基292から409までの間の領域（配列番号46）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基292（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から409（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、spA遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号92ないし95のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
According to one embodiment of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between
本発明のもう一つの側面は、表３９のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、spA遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号92ないし95のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the present invention is a method for identifying spA genes by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 39 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 92-95.
本発明のもう一つの側面は、表３９に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 39.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
１４．VanA（バンコマイシン耐性遺伝子A）
本発明のある側面によれば、VanA遺伝子のある明瞭な領域が、表４０および表４１に示されたヌクレオチド配列（配列番号96または97）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
14 VanA (vancomycin resistance gene A)
According to one aspect of the invention, one distinct region of the VanA gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 40 and Table 41 (SEQ ID NO: 96 or 97). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号96の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から944までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基138から641までの間（表４１、配列番号97）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 96. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基138から641までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基138（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から641（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、VanA遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表４２の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表４２に示されるように、配列番号98（F）と99（R）、配列番号100（F）と101（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying the region between
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号96またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 96 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基138から641までの間の領域（配列番号97）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基138（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から641（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、VanA遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号98ないし101のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
According to certain embodiments of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between
本発明のもう一つの側面は、表４２のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、VanA遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号98ないし101のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention is a method of identifying a VanA gene by amplification of a nucleic acid using the primer pairs in Table 42 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 98-101.
本発明のもう一つの側面は、表４２に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 42.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
１５．VanB（バンコマイシン耐性遺伝子B）
本発明のある側面によれば、VanB遺伝子のある明瞭な領域が、表４３および表４４に示されたヌクレオチド配列（配列番号102または103）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
15. VanB (vancomycin resistance gene B)
According to one aspect of the invention, one distinct region of the VanB gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 43 and Table 44 (SEQ ID NO: 102 or 103). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号102の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から741までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基126から574までの間（表４４、配列番号103）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 102. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基126から574までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基126（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から574（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、VanB遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表４５の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表４５に示されるように、配列番号104（F）と105（R）、配列番号106（F）と107（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。
An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号102またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 102 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基126から574までの間の領域（配列番号103）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基126（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から574（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、VanB遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号102および103によって表される配列およびその相補配列を含む。 According to certain embodiments of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between residues 126 and 574 (SEQ ID NO: 103) or its complementary sequence. The probes range from residue 126 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 574 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the invention, suitable probes for detecting the VanB gene include the sequences represented by SEQ ID NOs: 102 and 103 and their complementary sequences.
本発明のもう一つの側面は、表４５のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、VanB遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号104ないし107のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention is a method of identifying a VanB gene by amplification of a nucleic acid using the primer pairs in Table 45 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 104-107.
本発明のもう一つの側面は、表４５に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 45.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
１６．VanC（バンコマイシン耐性遺伝子C）
本発明のある側面によれば、VanC遺伝子のある明瞭な領域が、表４６および表４７に示されたヌクレオチド配列（配列番号108または109）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
16. VanC (vancomycin resistance gene C)
According to one aspect of the invention, one distinct region of the VanC gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 46 and Table 47 (SEQ ID NO: 108 or 109). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号108の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から438までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基27から407までの間（表４７、配列番号109）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 108. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基27から407までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基27（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から407（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、VanC遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表４８の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表４８に示されるように、配列番号110（F）と111（R）、配列番号112（F）と113（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between residues 27-407. The primer ranges from residue 27 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 407 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, amplification primers suitable for detecting the VanC gene comprise the sequences in Table 48. The forward (F) and reverse (R) primer combinations include SEQ ID NO: 110 (F) and 111 (R), SEQ ID NO: 112 (F) and 113 (R), as shown in Table 48. . However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号108またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 108 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基27から407までの間の領域（配列番号109）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基27（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から407（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、VanC遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号110ないし113のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
According to an embodiment of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between
本発明のもう一つの側面は、表４８のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、VanC遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号110ないし113のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention is a method for identifying VanC genes by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 48 together with the indicated or other suitable forward primer and reverse primer combinations. is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 110-113.
本発明のもう一つの側面は、表４８に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 48.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
１７．MDR-1
本発明のある側面によれば、MDR-1遺伝子のある明瞭な領域が、表４９および表５０に示されたヌクレオチド配列（配列番号114または115）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
17. MDR-1
According to one aspect of the invention, one distinct region of the MDR-1 gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 49 and Table 50 (SEQ ID NO: 114 or 115). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号108の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基201から850までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基275から834までの間（表５０、配列番号115）の任意の領域を増幅することができる対である。
An amplification primer pair according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 108. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基275から834までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基275（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から834（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、MDR-1遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表５１の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表５１に示されるように、配列番号116（F）と117（R）、配列番号118（F）と119（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between residues 275 and 834. The primer ranges from residue 275 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 834 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting the MDR-1 gene comprise the sequences in Table 51. The forward (F) primer and reverse (R) primer combinations include SEQ ID NOs: 116 (F) and 117 (R) and SEQ ID NOs: 118 (F) and 119 (R) as shown in Table 51. . However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号114またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 114 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基275から834までの間の領域（配列番号115）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基275（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から834（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、MDR-1遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号116ないし119のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。 According to one embodiment of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between residues 275 to 834 (SEQ ID NO: 115) or its complementary sequence. The probes range from residue 275 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 834 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the present invention to be able to bind to regions between up to 2 or 1 residues). According to one aspect of the present invention, a probe suitable for detecting the MDR-1 gene comprises a sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 116 to 119 and its complementary sequence.
本発明のもう一つの側面は、表５１のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、MDR-1遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号116ないし119のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention identifies the MDR-1 gene by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 51 with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. Is the method. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOS: 116-119.
本発明のもう一つの側面は、表５１に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 51.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
１８．CDR-1
本発明のある側面によれば、CDR-1遺伝子のある明瞭な領域が、表５２および表５３に示されたヌクレオチド配列（配列番号120または121）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、該明瞭な領域の類似配列またはその相補配列である。
18. CDR-1
According to one aspect of the invention, one distinct region of the CDR-1 gene comprises the nucleotide sequence shown in Table 52 and Table 53 (SEQ ID NO: 120 or 121). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. According to another aspect of the invention, the distinct region is a similar sequence of the distinct region or a complementary sequence thereof.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、配列番号120の少なくとも30塩基の任意の領域を増幅することのできる対である。好ましくは、増幅プライマーの対は、残基1から387までの間の任意の領域を増幅することができる対である。より一層好ましくは、増幅プライマーの対は、残基111から178までの間（表５３、配列番号121）の任意の領域を増幅することができる対である。
A pair of amplification primers according to an embodiment of the invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 120. Preferably, the amplification primer pair is a pair capable of amplifying any region between
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、残基111から178までの間の領域を増幅することができる対である。該プライマーが、残基111（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から178（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域を増幅することができることが、本発明の範囲内である。本発明のある好ましい側面によれば、CDR-1遺伝子を検出するのに好適な増幅プライマーは、表５４の配列を含む。順方向（F）プライマーおよび逆方向（R）プライマーの組み合わせは、表５４に示されるように、配列番号122（F）と123（R）、配列番号124（F）と125（R）を含む。ただし、融点の類似性を考えると、他のプライマー対の組み合わせが可能である。そのような組み合わせは組成物の中に存在していてもよい。 An amplification primer pair according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region between residues 111-178. The primers range from residues 111 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue) to 178 (± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 It is within the scope of the invention that regions between up to 2 or 1 residues) can be amplified. According to one preferred aspect of the invention, suitable amplification primers for detecting the CDR-1 gene comprise the sequences in Table 54. The forward (F) and reverse (R) primer combinations include SEQ ID NOs: 122 (F) and 123 (R) and SEQ ID NOs: 124 (F) and 125 (R) as shown in Table 54 . However, in view of the similarity of melting points, other primer pair combinations are possible. Such a combination may be present in the composition.
本発明のある側面に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号120またはその相補配列へのアニーリングができる。 A hybridization probe according to one aspect of the invention is capable of annealing to SEQ ID NO: 120 or its complementary sequence.
本発明のある実施形態によれば、ハイブリダイゼーション・プローブは、残基111から178までの間の領域（配列番号121）またはその相補配列にハイブリダイズすることができる。該プローブが、残基111（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）から178（±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基）までの間の領域に結合できることが、本発明の範囲内である。本発明のある側面によれば、MDR-1遺伝子を検出するのに好適なプローブは、配列番号122ないし125のうちのいずれか一つによって表される配列およびその相補配列を含む。
According to one embodiment of the invention, the hybridization probe can hybridize to the region between
本発明のもう一つの側面は、表５４のプライマー対を、指示されたまたはその他の好適な順方向プライマーおよび逆方向プライマーの組み合わせと一緒に使った核酸の増幅によって、CDR-1遺伝子を識別する方法である。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。本発明のある実施形態によれば、そのようなハイブリダイゼーション・プローブは、配列番号122ないし125のうちのいずれか一つに対応する好適な配列を有する。 Another aspect of the invention distinguishes CDR-1 genes by amplification of nucleic acids using the primer pairs in Table 54 together with the indicated or other suitable forward and reverse primer combinations. Is the method. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification. According to certain embodiments of the invention, such a hybridization probe has a suitable sequence corresponding to any one of SEQ ID NOs: 122-125.
本発明のもう一つの側面は、表５４に示される配列に対応するオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）である。 Another aspect of the invention is an oligonucleotide (primer or probe) corresponding to the sequence shown in Table 54.
上述の明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブの類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
〈図１〉
この図は、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Enterobacter cloacae、Escherichia coli、Enterococcus faecalis、Pseudomonas aeruginosa、Enterococcus faecium、Klebsiella pneumoniaeおよびCandida albicansのそれぞれの23S RNAの配列を整列させ、同一性の指示（*で示す）を示している。
<Figure 1>
This figure aligns the sequences of the 23S RNA of Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae and Candida albicans. Is shown.
本発明のある側面によれば、微生物の23S RNA遺伝子の明瞭な領域は、図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号131ないし157）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は前記配列番号の相補配列である。本発明のある側面は、図１に示される配列番号131ないし157のいずれかによって表される配列またはその相補配列に対応する核酸である。 According to one aspect of the invention, the distinct region of the microbial 23S RNA gene comprises the nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NOs: 131-157). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. One aspect of the present invention is a nucleic acid corresponding to the sequence represented by any of SEQ ID NOs: 131 to 157 shown in FIG. 1 or a complementary sequence thereof.
本発明のある側面によれば、微生物の23S RNA遺伝子の明瞭な領域は、該微生物に特異的な増幅プライマーの対を使って得られる、図１に示されるヌクレオチド配列を含む。該増幅プライマーは上述されており、その微生物に依存する：
Enterobacter cloacae：配列番号3と4または配列番号5と6、
Enterococcus faecalis： 配列番号9と10、配列番号9と11、配列番号9と12、配列番号13と14、配列番号15と12または配列番号15と11、
Enterococcus faecium：配列番号18と19、配列番号20と19または配列番号20と21、
Escherichia coli：配列番号24と26、配列番号24と25、配列番号27と29または配列番号28と29、
Klebsiella pneumoniae：配列番号32と34、配列番号32と33、配列番号35と36または配列番号37と33、
Pseudomonas aeruginosa：配列番号40と41または配列番号40と42、
Staphylococcus aureus：配列番号45と46、配列番号48と47、配列番号48と49、配列番号48と51または配列番号50と51、
Staphylococcus epidermidis：配列番号54と55、配列番号54と56、配列番号54と57、配列番号58と57、配列番号58と59、配列番号58と60、配列番号58と61、配列番号58と62、配列番号63と59、配列番号63と60または配列番号63と61、
Candida albicans：配列番号66と67、配列番号68と69または配列番号70と71。
According to one aspect of the invention, a distinct region of a microbial 23S RNA gene comprises the nucleotide sequence shown in FIG. 1 obtained using a pair of amplification primers specific for the microbial organism. The amplification primer is described above and depends on the microorganism:
Enterobacter cloacae: SEQ ID NO: 3 and 4 or SEQ ID NO: 5 and 6,
Enterococcus faecalis: SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 9 and 11, SEQ ID NO: 9 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 12, or SEQ ID NO: 15 and 11,
Enterococcus faecium: SEQ ID NO: 18 and 19, SEQ ID NO: 20 and 19, or SEQ ID NO: 20 and 21,
Escherichia coli: SEQ ID NO: 24 and 26, SEQ ID NO: 24 and 25, SEQ ID NO: 27 and 29, or SEQ ID NO: 28 and 29,
Klebsiella pneumoniae: SEQ ID NO: 32 and 34, SEQ ID NO: 32 and 33, SEQ ID NO: 35 and 36 or SEQ ID NO: 37 and 33,
Pseudomonas aeruginosa: SEQ ID NO: 40 and 41 or SEQ ID NO: 40 and 42,
Staphylococcus aureus: SEQ ID NO: 45 and 46, SEQ ID NO: 48 and 47, SEQ ID NO: 48 and 49, SEQ ID NO: 48 and 51 or SEQ ID NO: 50 and 51,
Staphylococcus epidermidis: SEQ ID NO: 54 and 55, SEQ ID NO: 54 and 56, SEQ ID NO: 54 and 57, SEQ ID NO: 58 and 57, SEQ ID NO: 58 and 59, SEQ ID NO: 58 and 60, SEQ ID NO: 58 and 61, SEQ ID NO: 58 and 62 , SEQ ID NO: 63 and 59, SEQ ID NO: 63 and 60 or SEQ ID NO: 63 and 61,
Candida albicans: SEQ ID NO: 66 and 67, SEQ ID NO: 68 and 69 or SEQ ID NO: 70 and 71.
本発明のもう一つの側面によれば、明確な領域は、該明確な領域の類似配列またはその相補配列である。 According to another aspect of the invention, the well-defined region is a similar sequence of the clear region or its complementary sequence.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、図１の配列番号の少なくとも30塩基の任意の領域、その相補配列または該領域もしくは相補配列の類似配列を増幅することのできる対である。 A pair of amplification primers according to an embodiment of the present invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 1, the complementary sequence thereof, or a similar sequence of the region or the complementary sequence.
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、明瞭な領域に対応する、図１に挙げられた配列の領域を増幅することのできる対である。該明瞭な領域は、配列番号1または2（Enterobacter cloacae）、配列番号7または8（Enterococcus faecalis）、配列番号16または17（Enterococcus faecium）、配列番号22または23（Escherichia coli）、配列番号30または31（Klebsiella pneumoniae）、配列番号38または39（Pseudomonas aeruginosa）、配列番号43または44（Staphylococcus aureus）、配列番号52または53（Staphylococcus epidermidis）、配列番号64および65（Candida albicans）によって表されるものである。 A pair of amplification primers according to another embodiment of the invention is a pair capable of amplifying a region of the sequence listed in FIG. 1 that corresponds to a distinct region. The clear region is SEQ ID NO: 1 or 2 (Enterobacter cloacae), SEQ ID NO: 7 or 8 (Enterococcus faecalis), SEQ ID NO: 16 or 17 (Enterococcus faecium), SEQ ID NO: 22 or 23 (Escherichia coli), SEQ ID NO: 30 or Represented by 31 (Klebsiella pneumoniae), SEQ ID NO: 38 or 39 (Pseudomonas aeruginosa), SEQ ID NO: 43 or 44 (Staphylococcus aureus), SEQ ID NO: 52 or 53 (Staphylococcus epidermidis), SEQ ID NO: 64 and 65 (Candida albicans) It is.
該プライマーが、上記の図１の対応する領域であって一端または両端から±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基の領域を増幅できることが、本発明の範囲内である。 The present invention is capable of amplifying a region corresponding to the above-mentioned FIG. 1 and having ± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue from one or both ends. Is within the range.
本発明に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、明瞭な領域またはその相補配列に対応する、図１に挙げられた配列の領域にハイブリダイズできる。該明瞭な領域は、配列番号1または2（Enterobacter cloacae）、配列番号7または8（Enterococcus faecalis）、配列番号16または17（Enterococcus faecium）、配列番号22または23（Escherichia coli）、配列番号30または31（Klebsiella pneumoniae）、配列番号38または39（Pseudomonas aeruginosa）、配列番号43または44（Staphylococcus aureus）、配列番号52または53（Staphylococcus epidermidis）、配列番号64および65（Candida albicans）によって表されるものである。 A hybridization probe according to the present invention can hybridize to a region of the sequence listed in FIG. 1 corresponding to a distinct region or its complementary sequence. The clear region is SEQ ID NO: 1 or 2 (Enterobacter cloacae), SEQ ID NO: 7 or 8 (Enterococcus faecalis), SEQ ID NO: 16 or 17 (Enterococcus faecium), SEQ ID NO: 22 or 23 (Escherichia coli), SEQ ID NO: 30 or Represented by 31 (Klebsiella pneumoniae), SEQ ID NO: 38 or 39 (Pseudomonas aeruginosa), SEQ ID NO: 43 or 44 (Staphylococcus aureus), SEQ ID NO: 52 or 53 (Staphylococcus epidermidis), SEQ ID NO: 64 and 65 (Candida albicans) It is.
該プローブが、上記の図１の対応する配列であって一端または両端から±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基の配列に結合できることが、本発明の範囲内である。 According to the present invention, the probe can bind to the corresponding sequence of FIG. 1 described above and has a sequence of ± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue from one or both ends Is within the range.
本発明のもう一つの側面は、明瞭な領域に対応する、図の配列の領域に向けられたプライマーの対を使った核酸の増幅によって、明瞭な領域を識別する方法である。該明瞭な領域は、配列番号1または2（Enterobacter cloacae）、配列番号7または8（Enterococcus faecalis）、配列番号16または17（Enterococcus faecium）、配列番号22または23（Escherichia coli）、配列番号30または31（Klebsiella pneumoniae）、配列番号38または39（Pseudomonas aeruginosa）、配列番号43または44（Staphylococcus aureus）、配列番号52または53（Staphylococcus epidermidis）、配列番号64および65（Candida albicans）によって表されるものである。 Another aspect of the invention is a method for identifying distinct regions by amplification of nucleic acids using a pair of primers directed to the region of the sequence of the figure corresponding to the distinct region. The clear region is SEQ ID NO: 1 or 2 (Enterobacter cloacae), SEQ ID NO: 7 or 8 (Enterococcus faecalis), SEQ ID NO: 16 or 17 (Enterococcus faecium), SEQ ID NO: 22 or 23 (Escherichia coli), SEQ ID NO: 30 or Represented by 31 (Klebsiella pneumoniae), SEQ ID NO: 38 or 39 (Pseudomonas aeruginosa), SEQ ID NO: 43 or 44 (Staphylococcus aureus), SEQ ID NO: 52 or 53 (Staphylococcus epidermidis), SEQ ID NO: 64 and 65 (Candida albicans) It is.
本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。 One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification.
明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブに対応する上述した領域の類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described regions corresponding to distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
〈図２〉
この図は、mecA、vanA、vanB、vanC、blashv、blages-2、spA、MDR-1およびCDR-1のそれぞれの配列決定された遺伝子の整列を、コンセンサス（consensus）配列とともに示している。
<Figure 2>
This figure shows the sequence alignment of each of mecA, vanA, vanB, vanC, bla shv , blades -2 , spA, MDR-1 and CDR-1 along with the consensus sequence .
本発明のある側面によれば、抗生物質耐性遺伝子のある明瞭な領域が、図２に示されたヌクレオチド配列（配列番号158ないし261）を含む。本発明のもう一つの側面によれば、明瞭な領域は、前記配列番号の相補配列である。本発明のある側面は、図２に示される配列番号158ないし261のうちのいずれかによって表される配列またはその相補配列に対応する核酸である。 According to one aspect of the invention, a distinct region of the antibiotic resistance gene comprises the nucleotide sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NOs: 158-261). According to another aspect of the invention, the distinct region is a sequence complementary to the SEQ ID NO. One aspect of the present invention is a nucleic acid corresponding to a sequence represented by any of SEQ ID NOs: 158 to 261 shown in FIG. 2 or a complementary sequence thereof.
本発明のある側面によれば、抗生物質耐性遺伝子の明瞭な領域は、図２に示されたヌクレオチド配列を含む。該配列は、配列番号72または73（blages-2）、配列番号78または79（blashv）、配列番号84または85（mecA）、配列番号90または91（spA）、配列番号96または97（vanA）、配列番号102または103（vanB）、配列番号108または109（vanC）、配列番号114または115（MDR-1）、配列番号120または121（CDR-1）によって表される明瞭な領域に対応するものである。 According to one aspect of the invention, the distinct region of the antibiotic resistance gene comprises the nucleotide sequence shown in FIG. The sequence is SEQ ID NO: 72 or 73 ( blages-2 ), SEQ ID NO: 78 or 79 (bla shv ), SEQ ID NO: 84 or 85 (mecA), SEQ ID NO: 90 or 91 (spA), SEQ ID NO: 96 or 97 ( vanA), SEQ ID NO: 102 or 103 (vanB), SEQ ID NO: 108 or 109 (vanC), SEQ ID NO: 114 or 115 (MDR-1), SEQ ID NO: 120 or 121 (CDR-1) Corresponding.
本発明のある実施形態によれば、抗生物質耐性遺伝子の明瞭な領域は、該微生物に特異的な増幅プライマーの対を使って得られる、図２に示されるヌクレオチド配列を含む。該増幅プライマーは上述されており、そのマーカーに依存する：
blages-2マーカー：配列番号74と75または配列番号76と77、
blashvマーカー：配列番号80と81または配列番号82と83、
mecAマーカー：配列番号86と87または配列番号88と89、
spAマーカー：配列番号92と93または配列番号94と95、
VanAマーカー：配列番号98と99または配列番号100と101、
VanBマーカー：配列番号104と105または配列番号106と107、
VanCマーカー：配列番号110と111または配列番号112と113、
MDR-1マーカー：配列番号116と117または配列番号118と119および
CDR-1マーカー：配列番号122と123または配列番号124と125。
According to one embodiment of the invention, the distinct region of the antibiotic resistance gene comprises the nucleotide sequence shown in FIG. 2, obtained using a pair of amplification primers specific for the microorganism. The amplification primer is described above and depends on the marker:
bla ges-2 marker: SEQ ID NO: 74 and 75 or SEQ ID NO: 76 and 77,
bla shv marker: SEQ ID NO: 80 and 81 or SEQ ID NO: 82 and 83,
mecA marker: SEQ ID NO: 86 and 87 or SEQ ID NO: 88 and 89,
spA marker: SEQ ID NO: 92 and 93 or SEQ ID NO: 94 and 95,
VanA marker: SEQ ID NO: 98 and 99 or SEQ ID NO: 100 and 101,
VanB marker: SEQ ID NO: 104 and 105 or SEQ ID NO: 106 and 107,
VanC marker: SEQ ID NO: 110 and 111 or SEQ ID NO: 112 and 113,
MDR-1 marker: SEQ ID NO: 116 and 117 or SEQ ID NO: 118 and 119 and
CDR-1 marker: SEQ ID NO: 122 and 123 or SEQ ID NO: 124 and 125.
本発明のもう一つの側面によれば、明確な領域は、該明確な領域の類似配列またはその相補配列である。 According to another aspect of the invention, the well-defined region is a similar sequence of the clear region or its complementary sequence.
本発明のある実施形態に基づく増幅プライマーの対は、図２の配列番号の少なくとも30塩基の任意の領域、その相補配列または該領域もしくは相補配列の類似配列を増幅することのできる対である。 A pair of amplification primers according to an embodiment of the present invention is a pair capable of amplifying any region of at least 30 bases of SEQ ID NO: 2, the complementary sequence thereof, or a similar sequence of the region or the complementary sequence.
本発明のもう一つの実施形態に基づく増幅プライマーの対は、図２に挙げられた配列の領域を増幅することのできる対である。該配列は、配列番号72または73（blages-2）、配列番号78または79（blashv）、配列番号84または85（mecA）、配列番号90または91（spA）、配列番号96または97（vanA）、配列番号102または103（vanB）、配列番号108または109（vanC）、配列番号114または115（MDR-1）、配列番号120または121（CDR-1）によって表される明瞭な領域に対応するものである。 A pair of amplification primers according to another embodiment of the present invention is a pair capable of amplifying a region of the sequence listed in FIG. The sequence is SEQ ID NO: 72 or 73 ( blages-2 ), SEQ ID NO: 78 or 79 (bla shv ), SEQ ID NO: 84 or 85 (mecA), SEQ ID NO: 90 or 91 (spA), SEQ ID NO: 96 or 97 ( vanA), SEQ ID NO: 102 or 103 (vanB), SEQ ID NO: 108 or 109 (vanC), SEQ ID NO: 114 or 115 (MDR-1), SEQ ID NO: 120 or 121 (CDR-1) Corresponding.
該プライマーが、上記の図２の対応する領域であって一端または両端から±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基の領域を増幅できることが、本発明の範囲内である。 The present invention is capable of amplifying a region corresponding to the above-described FIG. 2 and having ± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residue from one or both ends. Is within the range.
本発明に基づくハイブリダイゼーション・プローブは、明瞭な領域またはその相補配列に対応する、図２に挙げられた配列の領域にハイブリダイズできる。該明瞭な領域は、配列番号72または73（blages-2）、配列番号78または79（blashv）、配列番号84または85（mecA）、配列番号90または91（spA）、配列番号96または97（vanA）、配列番号102または103（vanB）、配列番号108または109（vanC）、配列番号114または115（MDR-1）、配列番号120または121（CDR-1）によって表される明瞭な領域に対応するものである。 Hybridization probes according to the present invention can hybridize to regions of the sequence listed in FIG. 2 that correspond to distinct regions or their complementary sequences. The clear region is SEQ ID NO: 72 or 73 ( blages-2 ), SEQ ID NO: 78 or 79 (bla shv ), SEQ ID NO: 84 or 85 (mecA), SEQ ID NO: 90 or 91 (spA), SEQ ID NO: 96 or 97 (vanA), SEQ ID NO: 102 or 103 (vanB), SEQ ID NO: 108 or 109 (vanC), SEQ ID NO: 114 or 115 (MDR-1), SEQ ID NO: 120 or 121 (CDR-1) It corresponds to a region.
該プローブが、上記の図２の対応する配列であって一端または両端から±10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基の配列に結合できることが、本発明の範囲内である。 The present invention is capable of binding the probe to the corresponding sequence of FIG. 2 described above and having a sequence of ± 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 residues from one or both ends. Is within the range.
本発明のもう一つの側面は、明瞭な領域またはその相補配列に対応する、図２の配列の領域のほうに向けられたプライマーの対を使った核酸の増幅によって、明瞭な領域を識別する方法である。該明瞭な領域は、配列番号72または73（blages-2）、配列番号78または79（blashv）、配列番号84または85（mecA）、配列番号90または91（spA）、配列番号96または97（vanA）、配列番号102または103（vanB）、配列番号108または109（vanC）、配列番号114または115（MDR-1）、配列番号120または121（CDR-1）によって表されるものである。本発明のあるさらなる側面は、該増幅の産物に特異的な一つまたは複数のハイブリダイゼーション・プローブを使ったその後の検出段階である。 Another aspect of the present invention is a method for identifying distinct regions by amplification of nucleic acids using a pair of primers directed toward the region of the sequence of FIG. 2, corresponding to the distinct region or its complementary sequence. It is. The clear region is SEQ ID NO: 72 or 73 ( blages-2 ), SEQ ID NO: 78 or 79 (bla shv ), SEQ ID NO: 84 or 85 (mecA), SEQ ID NO: 90 or 91 (spA), SEQ ID NO: 96 or Represented by 97 (vanA), SEQ ID NO: 102 or 103 (vanB), SEQ ID NO: 108 or 109 (vanC), SEQ ID NO: 114 or 115 (MDR-1), SEQ ID NO: 120 or 121 (CDR-1) is there. One further aspect of the invention is a subsequent detection step using one or more hybridization probes specific for the product of the amplification.
明瞭な領域、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブに対応する上述した領域の類似配列は本発明の範囲内である。明瞭な領域、プローブおよびプライマーは、上述のように一つまたは複数の塩基が削除、置換および／または挿入された類似配列を含む。 Similar sequences of the above-described regions corresponding to distinct regions, amplification primers and hybridization probes are within the scope of the present invention. Clear regions, probes and primers contain similar sequences with one or more bases deleted, substituted and / or inserted as described above.
〈組み合わせ〉
上述したように、本発明は、核酸の二つまたはそれ以上（たとえば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上）の明瞭な領域の同時検出にも関する。本発明のある実施形態は、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Enterobacter cloacae、Escherichia coli、Enterococcus faecalis、Pseudomonas aeruginosa、Enterococcus faecium、Klebsiella pneumoniaeおよびCandida albicansの二つまたはそれ以上（たとえば3、4、5、6、7、8、9またはそれ以上）の検出を、その中の23S RNAの明瞭な領域に対応する核酸を検出することによって行う方法である。
<combination>
As mentioned above, the present invention provides for two or more nucleic acids (eg, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, Also relates to the simultaneous detection of 19, 20 or more distinct regions. Certain embodiments of the invention may include two or more of Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae and Candida albicans, 7, 8, 9 or more) is detected by detecting a nucleic acid corresponding to a distinct region of 23S RNA therein.
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、
配列番号1または2（Enterobacter cloacae）、
配列番号7または8（Enterococcus faecalis）、
配列番号16または17（Enterococcus faecium）、
配列番号22または23（Escherichia coli）、
配列番号30または31（Klebsiella pneumoniae）、
配列番号38または39（Pseudomonas aeruginosa）、
配列番号43または44（Staphylococcus aureus）、
配列番号52または53（Staphylococcus epidermidis）および
配列番号64および65（Candida albicans）
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9またはそれ以上）に対応する核酸を検出することによって行う方法である。
Another embodiment of the invention provides for the identification of at least two microorganisms in a sample,
SEQ ID NO: 1 or 2 (Enterobacter cloacae),
SEQ ID NO: 7 or 8 (Enterococcus faecalis),
SEQ ID NO: 16 or 17 (Enterococcus faecium),
SEQ ID NO: 22 or 23 (Escherichia coli),
SEQ ID NO: 30 or 31 (Klebsiella pneumoniae),
SEQ ID NO: 38 or 39 (Pseudomonas aeruginosa),
SEQ ID NO: 43 or 44 (Staphylococcus aureus),
SEQ ID NO: 52 or 53 (Staphylococcus epidermidis) and SEQ ID NO: 64 and 65 (Candida albicans)
By detecting nucleic acids corresponding to two or more of (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 or more).
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、図１に挙げられている核酸の少なくとも二つ（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）の領域を検出することによって行う方法であって、各領域は、配列番号1または2（Enterobacter cloacae）、配列番号7または8（Enterococcus faecalis）、配列番号16または17（Enterococcus faecium）、配列番号22または23（Escherichia coli）、配列番号30または31（Klebsiella pneumoniae）、配列番号38または39（Pseudomonas aeruginosa）、配列番号43または44（Staphylococcus aureus）、配列番号52または53（Staphylococcus epidermidis）または配列番号64および65（Candida albicans）の明瞭な領域に対応する領域である。 Another embodiment of the present invention uses at least two of the nucleic acids listed in FIG. 1 (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9) to identify at least two microorganisms in a sample. In which each region comprises SEQ ID NO: 1 or 2 (Enterobacter cloacae), SEQ ID NO: 7 or 8 (Enterococcus faecalis), SEQ ID NO: 16 or 17 (Enterococcus faecium), SEQ ID NO: 22 Or 23 (Escherichia coli), SEQ ID NO: 30 or 31 (Klebsiella pneumoniae), SEQ ID NO: 38 or 39 (Pseudomonas aeruginosa), SEQ ID NO: 43 or 44 (Staphylococcus aureus), SEQ ID NO: 52 or 53 (Staphylococcus epidermidis) or SEQ ID NO: 64 And regions corresponding to distinct regions of 65 (Candida albicans).
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、二つまたはそれ以上の（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）プライマー対を使って行う方法である。ここで、検出のための前記二つ以上の微生物および前記プライマー対は、以下から選択され、必須ではないが好ましくは、一つの微生物について一つのプライマー対が選択される：
Enterobacter cloacae：配列番号3と4または配列番号5と6、
Enterococcus faecalis： 配列番号9と10、配列番号9と11、配列番号9と12、配列番号13と14、配列番号15と12または配列番号15と11、
Enterococcus faecium：配列番号18と19、配列番号20と19または配列番号20と21、
Escherichia coli：配列番号24と26、配列番号24と25、配列番号27と29または配列番号28と29、
Klebsiella pneumoniae：配列番号32と34、配列番号32と33、配列番号35と36または配列番号37と33、
Pseudomonas aeruginosa：配列番号40と41または配列番号40と42、
Staphylococcus aureus：配列番号45と46、配列番号48と47、配列番号48と49、配列番号48と51または配列番号50と51、
Staphylococcus epidermidis：配列番号54と55、配列番号54と56、配列番号54と57、配列番号58と57、配列番号58と59、配列番号58と60、配列番号58と61、配列番号58と62、配列番号63と59、配列番号63と60または配列番号63と61、
Candida albicans：配列番号66と67、配列番号68と69または配列番号70と71。
Another embodiment of the invention distinguishes at least two microorganisms in a sample using two or more (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9) primer pairs. Is the method. Here, the two or more microorganisms and the primer pairs for detection are selected from the following, preferably but not necessarily, one primer pair is selected for one microorganism:
Enterobacter cloacae: SEQ ID NO: 3 and 4 or SEQ ID NO: 5 and 6,
Enterococcus faecalis: SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 9 and 11, SEQ ID NO: 9 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 12, or SEQ ID NO: 15 and 11,
Enterococcus faecium: SEQ ID NO: 18 and 19, SEQ ID NO: 20 and 19, or SEQ ID NO: 20 and 21,
Escherichia coli: SEQ ID NO: 24 and 26, SEQ ID NO: 24 and 25, SEQ ID NO: 27 and 29, or SEQ ID NO: 28 and 29,
Klebsiella pneumoniae: SEQ ID NO: 32 and 34, SEQ ID NO: 32 and 33, SEQ ID NO: 35 and 36 or SEQ ID NO: 37 and 33,
Pseudomonas aeruginosa: SEQ ID NO: 40 and 41 or SEQ ID NO: 40 and 42,
Staphylococcus aureus: SEQ ID NO: 45 and 46, SEQ ID NO: 48 and 47, SEQ ID NO: 48 and 49, SEQ ID NO: 48 and 51 or SEQ ID NO: 50 and 51,
Staphylococcus epidermidis: SEQ ID NO: 54 and 55, SEQ ID NO: 54 and 56, SEQ ID NO: 54 and 57, SEQ ID NO: 58 and 57, SEQ ID NO: 58 and 59, SEQ ID NO: 58 and 60, SEQ ID NO: 58 and 61, SEQ ID NO: 58 and 62 , SEQ ID NO: 63 and 59, SEQ ID NO: 63 and 60 or SEQ ID NO: 63 and 61,
Candida albicans: SEQ ID NO: 66 and 67, SEQ ID NO: 68 and 69 or SEQ ID NO: 70 and 71.
本発明のもう一つの側面は、次のプライマー対、すなわち
Enterobacter cloacae：配列番号3と4、
Enterococcus faecalis：配列番号9と12、
Enterococcus faecium：配列番号18と19、
Escherichia coli：配列番号24と25、
Klebsiella pneumoniae：配列番号32と33、
Pseudomonas aeruginosa：配列番号40と42、
Staphylococcus aureus：配列番号48と49、
Staphylococcus epidermidis：配列番号54と55、
Candida albicans：配列番号66と67、
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）を有する組成物である。
Another aspect of the invention is the following primer pair:
Enterobacter cloacae: SEQ ID NOs: 3 and 4,
Enterococcus faecalis: SEQ ID NOs: 9 and 12,
Enterococcus faecium: SEQ ID NO: 18 and 19,
Escherichia coli: SEQ ID NOs: 24 and 25,
Klebsiella pneumoniae: SEQ ID NOs: 32 and 33,
Pseudomonas aeruginosa: SEQ ID NOs: 40 and 42,
Staphylococcus aureus: SEQ ID NOs: 48 and 49,
Staphylococcus epidermidis: SEQ ID NOs: 54 and 55,
Candida albicans: SEQ ID NO: 66 and 67,
Of the composition (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9).
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、検出対象の該二つ以上の生物に対応する下記の二つまたはそれ以上の（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）単一プローブ、すなわち
Enterobacter cloacae：配列番号3ないし6のうちの任意のもの、
Enterococcus faecalis： 配列番号9ないし15のうちの任意のもの、
Enterococcus faecium：配列番号18ないし21のうちの任意のもの、
Escherichia coli：配列番号24ないし29のうちの任意のもの、
Klebsiella pneumoniae：配列番号32ないし37のうちの任意のもの、
Pseudomonas aeruginosa：配列番号40ないし42のうちの任意のもの、
Staphylococcus aureus：配列番号45ないし51のうちの任意のもの、
Staphylococcus epidermidis：配列番号54ないし63のうちの任意のもの、
Candida albicans：配列番号66ないし71のうちの任意のもの、
を使って行う方法であって、必須ではないが好ましくは、一つの微生物について一つのプローブが選択される。
Another embodiment of the present invention relates to the identification of at least two microorganisms in a sample by the following two or more (eg at least 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9) a single probe, ie
Enterobacter cloacae: any of SEQ ID NOS: 3-6
Enterococcus faecalis: any of SEQ ID NOs: 9-15
Enterococcus faecium: any of SEQ ID NOS: 18-21
Escherichia coli: any of SEQ ID NOs: 24-29
Klebsiella pneumoniae: any of SEQ ID NOs: 32 to 37,
Pseudomonas aeruginosa: any of SEQ ID NOs: 40-42,
Staphylococcus aureus: any of SEQ ID NOs: 45-51,
Staphylococcus epidermidis: any of SEQ ID NOs: 54-63,
Candida albicans: any of SEQ ID NOs: 66-71,
Preferably, but not essential, one probe is selected for one microorganism.
本発明のもう一つの側面は、次のプローブ、すなわち
Enterobacter cloacae：配列番号3または4、
Enterococcus faecalis：配列番号9または12、
Enterococcus faecium：配列番号18または19、
Escherichia coli：配列番号24または25、
Klebsiella pneumoniae：配列番号32または33、
Pseudomonas aeruginosa：配列番号40または42、
Staphylococcus aureus：配列番号48または49、
Staphylococcus epidermidis：配列番号54または55、
Candida albicans：配列番号66または67、
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）を有する組成物であって、必須ではないが好ましくは、一つの微生物について一つのプローブが選択される。
Another aspect of the invention is the following probe:
Enterobacter cloacae: SEQ ID NO: 3 or 4,
Enterococcus faecalis: SEQ ID NO: 9 or 12,
Enterococcus faecium: SEQ ID NO: 18 or 19,
Escherichia coli: SEQ ID NO: 24 or 25,
Klebsiella pneumoniae: SEQ ID NO: 32 or 33,
Pseudomonas aeruginosa: SEQ ID NO: 40 or 42,
Staphylococcus aureus: SEQ ID NO: 48 or 49,
Staphylococcus epidermidis: SEQ ID NO: 54 or 55,
Candida albicans: SEQ ID NO: 66 or 67,
Preferably, one probe is selected for one microorganism, although it is not essential, which has two or more of the above (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9).
本発明のもう一つの実施形態は、抗生物質耐性マーカーmecA、spA、vanA、vanB、vanC、blashv、blages-2、MDR-1、CDR-1の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10）の検出を、その中の明瞭な領域に対応する核酸を検出することによって行う方法である。 Another embodiment of the present invention is an antibiotic resistance marker mecA, spA, vanA, vanB, vanC, bla shv , blages -2 , MDR-1, CDR-1 (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) is performed by detecting a nucleic acid corresponding to a clear region therein.
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの抗生物質耐性マーカーの識別を、
配列番号72または73（blages-2マーカー）、
配列番号78または79（blashvマーカー）、
配列番号84または85（mecAマーカー）、
配列番号90または91（spAマーカー）、
配列番号96または97（vanAマーカー）、
配列番号102または103（vanBマーカー）、
配列番号108または109（vanCマーカー）、
配列番号114または115（MDR-1マーカー）、
配列番号120または121（CDR-1マーカー）
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10）に対応する核酸を検出することによって行う方法である。
Another embodiment of the present invention is the identification of at least two antibiotic resistance markers in a sample,
SEQ ID NO: 72 or 73 ( blages-2 marker),
SEQ ID NO: 78 or 79 (bla shv marker),
SEQ ID NO: 84 or 85 (mecA marker),
SEQ ID NO: 90 or 91 (spA marker),
SEQ ID NO: 96 or 97 (vanA marker),
SEQ ID NO: 102 or 103 (vanB marker),
SEQ ID NO: 108 or 109 (vanC marker),
SEQ ID NO: 114 or 115 (MDR-1 marker),
SEQ ID NO: 120 or 121 (CDR-1 marker)
The method is performed by detecting a nucleic acid corresponding to two or more of (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10).
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、図２に挙げられている核酸配列の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）を検出することによって行う方法であって、各配列は検出対象の微生物に対応する。 Another embodiment of the present invention is the identification of at least two microorganisms in a sample by identifying two or more of the nucleic acid sequences listed in FIG. 2 (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8 Alternatively, the method is performed by detecting 9), and each sequence corresponds to a microorganism to be detected.
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの微生物の識別を、図１に挙げられている核酸の少なくとも二つ（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）の領域を検出することによって行う方法であって、各領域は配列番号72または73（blages-2マーカー）、配列番号78または79（blashvマーカー）、配列番号84または85（mecAマーカー）、配列番号90または91（spAマーカー）、配列番号96または97（vanAマーカー）、配列番号102または103（vanBマーカー）、配列番号108または109（vanCマーカー）、配列番号114または115（MDR-1マーカー）あるいは配列番号120または121（CDR-1マーカー）の明瞭な領域に対応する。 Another embodiment of the present invention uses at least two of the nucleic acids listed in FIG. 1 (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9) to identify at least two microorganisms in a sample. Each region is SEQ ID NO: 72 or 73 ( blages-2 marker), SEQ ID NO: 78 or 79 (bla shv marker), SEQ ID NO: 84 or 85 (mecA marker), SEQ ID NO: 90 or 91 (spA marker), SEQ ID NO: 96 or 97 (vanA marker), SEQ ID NO: 102 or 103 (vanB marker), SEQ ID NO: 108 or 109 (vanC marker), SEQ ID NO: 114 or 115 (MDR-1 marker) ) Or a clear region of SEQ ID NO: 120 or 121 (CDR-1 marker).
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの抗生物質耐性マーカーの識別を、二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10）のプライマー対を使って行う方法である。ここで、検出対象の抗生物質耐性マーカーとプライマー対とは、下記、すなわち：
blages-2マーカー：配列番号74と75または配列番号76と77、
blashvマーカー：配列番号80と81または配列番号82と83、
mecAマーカー：配列番号86と87または配列番号88と89、
spAマーカー：配列番号92と93または配列番号94と95、
VanAマーカー：配列番号98と99または配列番号100と101、
VanBマーカー：配列番号104と105または配列番号106と107、
VanCマーカー：配列番号110と111または配列番号112と113、
MDR-1マーカー：配列番号116と117または配列番号118と119および
CDR-1マーカー：配列番号122と123または配列番号124と125
から選択され、必須ではないが好ましくは一つのマーカーについて一つのプライマー対が選択される。
Another embodiment of the present invention provides for the identification of at least two antibiotic resistance markers in a sample by two or more (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) primers. This is a method that uses pairs. Here, the antibiotic resistance marker to be detected and the primer pair are as follows:
bla ges-2 marker: SEQ ID NO: 74 and 75 or SEQ ID NO: 76 and 77,
bla shv marker: SEQ ID NO: 80 and 81 or SEQ ID NO: 82 and 83,
mecA marker: SEQ ID NO: 86 and 87 or SEQ ID NO: 88 and 89,
spA marker: SEQ ID NO: 92 and 93 or SEQ ID NO: 94 and 95,
VanA marker: SEQ ID NO: 98 and 99 or SEQ ID NO: 100 and 101,
VanB marker: SEQ ID NO: 104 and 105 or SEQ ID NO: 106 and 107,
VanC marker: SEQ ID NO: 110 and 111 or SEQ ID NO: 112 and 113,
MDR-1 marker: SEQ ID NO: 116 and 117 or SEQ ID NO: 118 and 119 and
CDR-1 marker: SEQ ID NO: 122 and 123 or SEQ ID NO: 124 and 125
Preferably, but not necessarily, one primer pair is selected for one marker.
本発明のもう一つの実施形態は、下記のプライマー対、すなわち：
blages-2マーカー：配列番号76と77、
blashvマーカー：配列番号80と81、
mecAマーカー：配列番号88と89、
spAマーカー：配列番号92と93、
VanAマーカー：配列番号100と101、
VanBマーカー：配列番号106と107、
VanCマーカー：配列番号112と113、
MDR-1マーカー：配列番号116と117、
CDR-1マーカー：配列番号124と125
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）を含む組成物である。
Another embodiment of the invention is the following primer pair:
bla ges-2 marker: SEQ ID NO: 76 and 77,
bla shv marker: SEQ ID NO: 80 and 81,
mecA marker: SEQ ID NO: 88 and 89,
spA marker: SEQ ID NO: 92 and 93,
VanA marker: SEQ ID NO: 100 and 101,
VanB marker: SEQ ID NO: 106 and 107,
VanC marker: SEQ ID NO: 112 and 113,
MDR-1 marker: SEQ ID NO: 116 and 117,
CDR-1 marker: SEQ ID NO: 124 and 125
A composition comprising two or more of (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9).
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも二つの抗生物質耐性マーカーの識別を、二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10）のプローブを使って行う方法である。ここで、検出対象の抗生物質耐性マーカーとプローブとは、下記、すなわち：
blages-2マーカー：配列番号74ないし77のうちの任意のもの、
blashvマーカー：配列番号80ないし83のうちの任意のもの、
mecAマーカー：配列番号86ないし89のうちの任意のもの、
spAマーカー：配列番号92ないし95のうちの任意のもの、
VanAマーカー：配列番号98ないし101のうちの任意のもの、
VanBマーカー：配列番号104ないし107のうちの任意のもの、
VanCマーカー：配列番号110ないし113のうちの任意のもの、
MDR-1マーカー：配列番号116ないし119のうちの任意のもの、
CDR-1マーカー：配列番号122ないし125のうちの任意のもの、
から選択され、必須ではないが好ましくは一つの微生物について一つのプローブが選択される。
Another embodiment of the present invention provides for the identification of at least two antibiotic resistance markers in a sample by two or more (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) probes. It is a method to do using. Here, the antibiotic resistance markers and probes to be detected are as follows:
bla ges-2 marker: any of SEQ ID NOs: 74-77 ,
bla shv marker: any of SEQ ID NOs: 80-83 ,
mecA marker: any of SEQ ID NOs: 86-89,
spA marker: any of SEQ ID NOs: 92 to 95,
VanA marker: any of SEQ ID NO: 98 to 101,
VanB marker: any of SEQ ID NOs: 104 to 107
VanC marker: any of SEQ ID NO: 110 to 113
MDR-1 marker: any of SEQ ID NOS: 116 to 119,
CDR-1 marker: any of SEQ ID NOS: 122 to 125,
Preferably, but not essential, one probe is selected for one microorganism.
本発明のもう一つの実施形態は、下記のプローブ、すなわち：
blages-2マーカー：配列番号76または77、
blashvマーカー：配列番号80または81、
mecAマーカー：配列番号88または89、
spAマーカー：配列番号92または93、
VanAマーカー：配列番号100または101、
VanBマーカー：配列番号106または107、
VanCマーカー：配列番号112または113、
MDR-1マーカー：配列番号116または117、
CDR-1マーカー：配列番号124または125
の二つまたはそれ以上（たとえば少なくとも3、4、5、6、7、8もしくは9）を含む組成物であって、必須ではないが好ましくは一つのマーカーについて一つのプローブが選択される。
Another embodiment of the invention is the following probe:
bla ges-2 marker: SEQ ID NO: 76 or 77,
bla shv marker: SEQ ID NO: 80 or 81,
mecA marker: SEQ ID NO: 88 or 89,
spA marker: SEQ ID NO: 92 or 93,
VanA marker: SEQ ID NO: 100 or 101,
VanB marker: SEQ ID NO: 106 or 107,
VanC marker: SEQ ID NO: 112 or 113,
MDR-1 marker: SEQ ID NO: 116 or 117
CDR-1 marker: SEQ ID NO: 124 or 125
A composition comprising two or more of (eg, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9), although not essential, preferably one probe is selected for one marker.
本発明のもう一つの実施形態は、抗生物質耐性マーカーmecA、spA、vanA、vanB、vanC、blashv、blages-2、MDR-1およびCDR-1の少なくとも一つ（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10またはそれ以上）と、微生物Enterobacter cloacae、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidisおよびCandida albicansの少なくとも一つ（たとえば2、3、4、5、6、7、8もしくは9またはそれ以上）とを、その中の明瞭な領域に対応する核酸を検出することによって検出する方法である。 Another embodiment of the present invention, the antibiotic resistance markers mecA, spA, vanA, vanB, vanC, bla shv, at least one (e.g. 2, 3, 4 of the bla ges-2, MDR-1 and CDR-1 , 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more) and the microorganisms Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococand epidermidis and at least one For example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 or more) is detected by detecting a nucleic acid corresponding to a distinct region therein.
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも一つの微生物と少なくとも一つの抗生物質耐性マーカーとを、上述した配列番号に対応する明瞭な領域を検出することによって識別する方法である。 Another embodiment of the present invention is a method for identifying at least one microorganism and at least one antibiotic resistance marker in a sample by detecting a distinct region corresponding to the above-mentioned SEQ ID NO.
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の少なくとも一つの微生物と少なくとも一つの抗生物質耐性マーカーとを、上述した配列番号に対応するプライマー対または単一プローブの二つ以上を使って識別する方法である。 Another embodiment of the invention discriminates between at least one microorganism and at least one antibiotic resistance marker in a sample using two or more of a primer pair or a single probe corresponding to the above SEQ ID NOs. Is the method.
本発明のもう一つの実施形態は、試料中の一つの微生物と少なくとも一つの抗生物質耐性マーカーとを、23S RNAに関係する上述した配列番号に対応するプライマー対または単一プローブの一つと、抗生物質耐性遺伝子に関係する上述した配列番号に対応する二つ以上（たとえば3、4、5、6、7、8、9もしくは10またはそれ以上）のプライマー対または単一プローブとを使って識別する方法である。
Another embodiment of the present invention relates to a microorganism in a sample and at least one antibiotic resistance marker, a primer pair corresponding to the above-mentioned SEQ ID NO related to 23S RNA or one single probe, and an antibiotic. Discriminate using two or more (
本発明のもう一つの実施形態は、次のプライマー対、すなわち
Enterobacter cloacae：配列番号3と4、
Enterococcus faecalis：配列番号9と12、
Enterococcus faecium：配列番号18と19、
Escherichia coli：配列番号24と25、
Klebsiella pneumoniae：配列番号32と33、
Pseudomonas aeruginosa：配列番号40と42、
Staphylococcus aureus：配列番号48と49、
Staphylococcus epidermidis：配列番号54と55、
Candida albicans：配列番号66と67
の一つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）と、次のプライマー対、すなわち
blages-2マーカー：配列番号76と77、
blashvマーカー：配列番号80と81、
mecAマーカー：配列番号88と89、
spAマーカー：配列番号92と93、
VanAマーカー：配列番号100と101、
VanBマーカー：配列番号106と107、
VanCマーカー：配列番号112と113、
MDR-1マーカー：配列番号116と117、
CDR-1マーカー：配列番号124と125
の一つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）とを含む組成物である。
Another embodiment of the present invention provides the following primer pair:
Enterobacter cloacae: SEQ ID NOs: 3 and 4,
Enterococcus faecalis: SEQ ID NOs: 9 and 12,
Enterococcus faecium: SEQ ID NO: 18 and 19,
Escherichia coli: SEQ ID NOs: 24 and 25,
Klebsiella pneumoniae: SEQ ID NOs: 32 and 33,
Pseudomonas aeruginosa: SEQ ID NOs: 40 and 42,
Staphylococcus aureus: SEQ ID NOs: 48 and 49,
Staphylococcus epidermidis: SEQ ID NOs: 54 and 55,
Candida albicans: SEQ ID NO: 66 and 67
One or more (eg at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9) and the following primer pair:
bla ges-2 marker: SEQ ID NO: 76 and 77,
bla shv marker: SEQ ID NO: 80 and 81,
mecA marker: SEQ ID NO: 88 and 89,
spA marker: SEQ ID NO: 92 and 93,
VanA marker: SEQ ID NO: 100 and 101,
VanB marker: SEQ ID NO: 106 and 107,
VanC marker: SEQ ID NO: 112 and 113,
MDR-1 marker: SEQ ID NO: 116 and 117,
CDR-1 marker: SEQ ID NO: 124 and 125
1 or more (eg, at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9).
本発明のもう一つの実施形態は、次のプローブ、すなわち
Enterobacter cloacae：配列番号3または4、
Enterococcus faecalis：配列番号9または12、
Enterococcus faecium：配列番号18または19、
Escherichia coli：配列番号24または25、
Klebsiella pneumoniae：配列番号32または33、
Pseudomonas aeruginosa：配列番号40または42、
Staphylococcus aureus：配列番号48または49、
Staphylococcus epidermidis：配列番号54または55、
Candida albicans：配列番号66または67
の、必須ではないが好ましくは一つの微生物について一つのプローブが選択された一つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）と、次のプローブ、すなわち
blages-2マーカー：配列番号76または77、
blashvマーカー：配列番号80または81、
mecAマーカー：配列番号88または89、
spAマーカー：配列番号92または93、
VanAマーカー：配列番号100または101、
VanBマーカー：配列番号106または107、
VanCマーカー：配列番号112または113、
MDR-1マーカー：配列番号116または117、
CDR-1マーカー：配列番号124または125
の、必須ではないが好ましくは一つのマーカーについて一つのプローブが選択された一つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）とを含む組成物である。
Another embodiment of the present invention comprises the following probes:
Enterobacter cloacae: SEQ ID NO: 3 or 4,
Enterococcus faecalis: SEQ ID NO: 9 or 12,
Enterococcus faecium: SEQ ID NO: 18 or 19,
Escherichia coli: SEQ ID NO: 24 or 25,
Klebsiella pneumoniae: SEQ ID NO: 32 or 33,
Pseudomonas aeruginosa: SEQ ID NO: 40 or 42,
Staphylococcus aureus: SEQ ID NO: 48 or 49,
Staphylococcus epidermidis: SEQ ID NO: 54 or 55,
Candida albicans: SEQ ID NO: 66 or 67
Preferably, but not necessarily, one or more (eg at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9) with one probe selected for one microorganism and the next probe,
bla ges-2 marker: SEQ ID NO: 76 or 77,
bla shv marker: SEQ ID NO: 80 or 81,
mecA marker: SEQ ID NO: 88 or 89,
spA marker: SEQ ID NO: 92 or 93,
VanA marker: SEQ ID NO: 100 or 101,
VanB marker: SEQ ID NO: 106 or 107,
VanC marker: SEQ ID NO: 112 or 113,
MDR-1 marker: SEQ ID NO: 116 or 117
CDR-1 marker: SEQ ID NO: 124 or 125
Preferably, but not necessarily, the composition comprises one or more (eg, at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9) with one probe selected for one marker.
本発明に基づく組成物（composition）は、溶液（solution）、混合物（mixture）、混成物（admixture）であってもよく、あるいは本発明の容器または装置の中（in）または上（on）の構成要素をなしていてもよい。 The composition according to the present invention may be a solution, a mixture, an admixture, or in or on the container or device of the present invention. It may be a component.
本発明のもう一つの実施形態は、上記の方法および組成物実施形態において定義される二つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）のプライマー対を含む容器である。 Another embodiment of the present invention is a container comprising two or more (eg at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9) primer pairs as defined in the method and composition embodiments above. It is.
本発明のもう一つの実施形態は、上記の方法および組成物実施形態において定義される二つ以上のプローブ（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）を含む容器である。 Another embodiment of the present invention is a container comprising two or more probes (eg, at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9) as defined in the method and composition embodiments above. is there.
本発明のもう一つの実施形態は、上記の方法および組成物実施形態において定義される二つ以上（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）のプライマー対を含むキットである。 Another embodiment of the present invention is a kit comprising two or more (eg at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9) primer pairs as defined in the method and composition embodiments above. It is.
本発明のもう一つの実施形態は、上記の方法および組成物実施形態において定義される二つ以上のプローブ（たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8もしくは9）を含むキットである。 Another embodiment of the present invention is a kit comprising two or more probes (eg, at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9) as defined in the method and composition embodiments above. is there.
本発明のある側面によれば、方法が一微生物当たり一つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子の存在を検出する。本発明のもう一つの側面によれば、方法が一微生物当たり一つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子およびまたその微生物の存在を検出する。 According to one aspect of the invention, the method detects the presence of one or more antibiotic resistance genes per microorganism. According to another aspect of the invention, the method detects the presence of one or more antibiotic resistance genes per microorganism and also the microorganism.
プライマーは有利なことに、単一の反応において複数のテンプレート配列の同時または多重化されたPCRを、プライマー二量体の形成や交差反応なしに許す。さらに、生成物の長さは種または抗生物質耐性マーカーに固有である。これは、たとえば電気泳動によって増幅反応の生成物を分離することを、および一つまたは複数のバンドに帰される長さを評価することによっていくつかの遺伝子を識別することを許容する。 Primers advantageously allow simultaneous or multiplexed PCR of multiple template sequences in a single reaction without the formation of primer dimers or cross-reactions. Furthermore, the product length is specific to the species or antibiotic resistance marker. This allows separating the products of the amplification reaction, for example by electrophoresis, and identifying several genes by assessing the length attributed to one or more bands.
標的配列の多重検出は、スループットを上げるという恩恵をもつばかりでなく、臨床応用における療法の、差分的な診断およびモニタリングをも許容する。たとえば、菌血症および敗血症の病気は、一つまたは複数の異なる病原によって引き起こされ、療法は、関わっている細菌および関わっている抗生物質耐性の細菌株の検出に強く依存し、それらが正しい抗生物質の適用をガイドすることになる。したがって、適正かつ効果的な療法のためには、一つまたは複数の病原およびその抗生物質耐性種――いわゆる病原および抗生物質耐性種のパネル（panel）――の特定の核酸配列の存在、不在または量を非常に特異的かつ敏感に検出することが本質的である。当業者には、菌血症および敗血症の治療がうまくいくのは、その病気の発生後、非常に狭い時間枠内のみであることはよく知られている。さらに、病気の検出が早いほど、療法はよりうまくいき、より速く効くことも当業者にはよく知られている。さらに、全体的な病原性の検出は、細菌および抗生物質耐性細菌株を含むパネルにのみ制約されることはなく、真菌株、ウイルス株、タンパク質および／またはハプテンのみを組み合わせたパネル、あるいはそれらを細菌および抗生物質耐性細菌株と一緒に組み合わせたパネルにもであることも当業者にはよく知られている。 Multiplex detection of target sequences not only has the benefit of increasing throughput, but also allows differential diagnosis and monitoring of therapies in clinical applications. For example, bacteremia and septic diseases are caused by one or more different pathogens, and the therapy relies heavily on the detection of the bacteria involved and the bacterial strains with antibiotic resistance involved, which are It will guide the application of the substance. Thus, for proper and effective therapy, the presence or absence of specific nucleic acid sequences of one or more pathogens and their antibiotic-resistant species—the so-called panel of pathogenic and antibiotic-resistant species— Or it is essential to detect the amount very specifically and sensitively. It is well known to those skilled in the art that treatment of bacteremia and sepsis is successful only within a very narrow time frame after the occurrence of the disease. Furthermore, it is well known to those skilled in the art that the sooner the disease is detected, the better the therapy and the faster it will work. Furthermore, overall pathogenicity detection is not limited to panels containing bacterial and antibiotic-resistant bacterial strains, but a panel combining fungal strains, virus strains, proteins and / or haptens alone, or It is also well known to those skilled in the art to be a panel combined with bacteria and antibiotic resistant bacterial strains.
〈プロダクト〉
本発明は、本稿で述べた明瞭な領域の識別を可能にする装置内で使うのに好適な一つまたは複数のプライマーまたはプローブを含むプロダクトを含む。そのようなプロダクトは、たとえば次のものを含む。
・一つまたは複数の増幅プライマー対を事前ロードされた一つまたは複数の容器（たとえばマイクロアレイまたは多試料容器）。多試料容器は、複数の明瞭な領域の同時検出を、同じ反応において、あるいは別個の反応として許容する。
・一つまたは複数のプライマー対ならびに任意的にバッファ、試薬および容器を含む、増幅反応を実行するためのキット。
・一つまたは複数の容器ならびに任意的にバッファ、試薬を含む、増幅反応を実行するためのキット。
・増幅反応を実行するための一つまたは複数のプライマー対を含む装置。
・一つまたは複数のプローブを事前ロードされた一つまたは複数の容器（たとえばマイクロアレイまたは多試料容器）。多試料容器は、複数の明瞭な領域の同時検出を、同じ反応において、あるいは別個の反応として許容する。
・一つまたは複数のプローブならびに任意的にバッファ、試薬および容器を含む、ハイブリダイゼーションを実行するためのキット。
・一つまたは複数の容器ならびに任意的にバッファ、試薬および容器を含む、ハイブリダイゼーションを実行するためのキット。
・ハイブリダイゼーションを実行するための一つまたは複数のプローブを含む装置。
・本稿で述べた一つまたは複数のプライマー対を含む組成物。
・本稿で述べた一つまたは複数のプローブを含む組成物。
<product>
The present invention includes a product that includes one or more primers or probes suitable for use in the apparatus that enables distinct region identification described herein. Such products include, for example:
One or more containers (eg, microarray or multi-sample containers) preloaded with one or more amplification primer pairs. Multi-sample containers allow simultaneous detection of multiple distinct regions in the same reaction or as separate reactions.
A kit for performing an amplification reaction comprising one or more primer pairs and optionally buffers, reagents and containers.
A kit for performing an amplification reaction, comprising one or more containers and optionally buffers, reagents.
An apparatus comprising one or more primer pairs for performing an amplification reaction.
One or more containers (eg microarray or multi-sample containers) preloaded with one or more probes. Multi-sample containers allow simultaneous detection of multiple distinct regions in the same reaction or as separate reactions.
A kit for performing hybridization comprising one or more probes and optionally buffers, reagents and containers.
A kit for performing hybridization comprising one or more containers and optionally buffers, reagents and containers.
An apparatus comprising one or more probes for performing hybridization.
A composition comprising one or more primer pairs as described herein.
A composition comprising one or more probes as described herein.
〈例〉
以下の諸例は、本発明のさまざまな方法および複合物（compound）を例示することを意図したものである。
<Example>
The following examples are intended to illustrate various methods and compounds of the present invention.
例１：試料の調製
患者の血液200μlを、直径106μm以下で、酸洗いされたガラス・ビーズ（Sigma-Aldrich）を含む容器にピペットで移した。市販のIKA MS2ミニシェイカー（Minishaker）で、懸濁物を環境温度で1ないし3分間攪拌した。
Example 1:
例２：核酸抽出および精製
核酸の抽出および精製を修正された市販のバイオロボットEZ1（biorobot EZ1）（Qiagen）上で実行した。攪拌した血液試料をリソスタフィンとともに37°Cで10分間インキュベートした。続く反応ステップで、核酸を磁気ビーズ上に固定した。外部磁場により種々の洗浄溶液（washing and rinsing solutions）中の磁気ビーズを活性化することによって、固定された核酸は細胞破片およびその他の細胞タンパク質から自由になる。最終的な溶出ステップで、核酸は磁性粒子から分離され、次いで別個の容器で多重PCRマスターミックス（Mastermix）（Qiagen）と混合される。混合後、その溶液は、多重プライマー対および人間コントロールのプライマー対をもつストリップ容器に分配される。
Example 2: Nucleic acid extraction and purification Nucleic acid extraction and purification was performed on a modified commercial biorobot EZ1 (biorobot EZ1) (Qiagen). The stirred blood sample was incubated with lysostaphin for 10 minutes at 37 ° C. In subsequent reaction steps, the nucleic acid was immobilized on magnetic beads. By activating magnetic beads in various washing and rinsing solutions with an external magnetic field, immobilized nucleic acids are freed from cell debris and other cellular proteins. In the final elution step, the nucleic acid is separated from the magnetic particles and then mixed with multiplex PCR Mastermix (Qiagen) in a separate container. After mixing, the solution is dispensed into strip containers with multiple primer pairs and human control primer pairs.
例３：多重PCR
多重PCRは、Qiagen Multiplex PCRキットを用い、市販のサーマルサイクラー、たとえばPerkin Elmer 9700上で実行した。普遍的な多重サイクリング手順に続いて、最初の初期活性化ステップが95°Cで15分間実行された。94°Cでの30秒間の変性、61°Cでの90秒間のアニーリングおよび72°Cでの90秒間の延長を含む3ステップ・サイクリングが続いた。サイクル数は感度要件に応じて30から45の間であった。72°Cでの10分間にわたる最終的な延長が増幅を終了させた。
Example 3: Multiplex PCR
Multiplex PCR was performed using a Qiagen Multiplex PCR kit on a commercially available thermal cycler, such as Perkin Elmer 9700. Following the universal multiplex cycling procedure, an initial initial activation step was performed at 95 ° C for 15 minutes. A 3-step cycling followed, including denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 61 ° C for 90 seconds and extension at 72 ° C for 90 seconds. The number of cycles was between 30 and 45 depending on sensitivity requirements. A final extension at 72 ° C for 10 minutes terminated the amplification.
例４：検出
増幅された核酸の検出は、DNA1000キット上で実行された。キットの一部であるチップは、2100バイオアナライザーを用いて読み出された。キットおよびアナライザーは、Agilent Technologiesから購入したものである。
Example 4: Detection Detection of amplified nucleic acid was performed on a DNA1000 kit. Chips that were part of the kit were read using a 2100 bioanalyzer. Kits and analyzers were purchased from Agilent Technologies.
メーカー推奨に従ってチップは調製され、基準をロードされ、核酸増幅され、次いで2100バイオアナライザーに挿入された。30分の解析実行時間ののち、パソコン上で走る独自ソフトウェアがバイオアナライザーからデータを読み出し、解析した。 Chips were prepared according to manufacturer recommendations, loaded with standards, nucleic acid amplified, and then inserted into a 2100 bioanalyzer. After 30 minutes of analysis execution time, proprietary software running on a personal computer read the data from the bioanalyzer and analyzed it.
Claims (83)
配列番号86および87または配列番号88および89によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、
請求項３または４記載の方法。 The antibiotic resistance marker is mecA;
Including the use of pairs of amplification primers corresponding to the sequences represented by SEQ ID NO: 86 and 87 or SEQ ID NO: 88 and 89,
The method according to claim 3 or 4.
配列番号86ないし89によって表される配列に対応するプローブの使用を含む、
請求項５記載の方法。 The antibiotic resistance marker is mecA;
Including the use of probes corresponding to the sequences represented by SEQ ID NOs 86-89,
The method of claim 5.
配列番号98および99または配列番号100および101によって表される配列に対応する増幅プライマーの対の使用を含む、
請求項３または４記載の方法。 The antibiotic resistance marker is VanA;
Including the use of a pair of amplification primers corresponding to the sequences represented by SEQ ID NO: 98 and 99 or SEQ ID NO: 100 and 101,
The method according to claim 3 or 4.
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