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JP2009500019A - 生体分子の精製のための浮遊性粒子のネットワーク、及び生体分子の精製のための浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークの使用 - Google Patents

生体分子の精製のための浮遊性粒子のネットワーク、及び生体分子の精製のための浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークの使用 Download PDF

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JP2009500019A JP2008519616A JP2008519616A JP2009500019A JP 2009500019 A JP2009500019 A JP 2009500019A JP 2008519616 A JP2008519616 A JP 2008519616A JP 2008519616 A JP2008519616 A JP 2008519616A JP 2009500019 A JP2009500019 A JP 2009500019A
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Abstract

生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークであって、このネットワークは互いに共有結合した２つ以上の浮遊性粒子を含み、ここでこのネットワークはそのネットワークの最長寸法に沿って約３０μｍ〜約１ｃｍの大きさに及ぶ、生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワーク。浮遊性粒子はシリカ表面を有し得る。このネットワークは約１．２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有し得る。浮遊性粒子のネットワークを作製する方法、及び浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークを使用して、標的となる生物材料を単離する方法も記載されている。

Description

本発明は、生体分子の精製、並びに生体分子の精製のための方法及びキットに関する。特に、本発明は、生体分子の精製に使用した浮遊性粒子のネットワークに関する。具体的には、浮遊性粒子は互いに共有結合し、浮遊性粒子のネットワークを形成する。本発明は、生体分子の精製のために浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークを使用する方法及びキットにも関する。特に本発明は、標的となる生体分子を、破壊された生物材料の溶液（例えば、細菌、植物組織又は動物組織の溶解物又はホモジネート等）から分離するために、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークを使用することに関する。
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００５年７月１日に出願された米国仮特許出願第６０／６９５，５４５号の利益を主張している。
生体分子の精製は、分子生物学における多くの用途に重要な工程である。したがって、様々な構成要素及び方法が開発され、これにより、標的となる生物材料が高い収率で効率的に単離されている。例えば、米国特許第６，０２７，９４５号（Smith他）は、シリカ磁性粒子を使用して、標的となる生物材料を単離する方法を開示している。Smith他特許は、媒体中でシリカ磁性粒子と標的となる生物材料との複合体を形成すること、及び標的となる生物材料を磁力を利用して分離することを伴う方法を開示している。
さらに、米国特許第６，７８７，３０７号Ｂ１（Bitner他）（その全体が参照により本明細書に援用される）は、シラン処理シリカ基質を使用する溶解物クリアランス（clearance）及び核酸単離を開示している。Bitner他特許は、シラン処理シリカ基質が、タンパク質、脂質、細胞残屑、又は非標的の核酸等の様々な混入物質から、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ断片、染色体ＤＮＡ、又はＲＮＡを単離するのに使用され得ることを開示している。シラン処理シリカ基質としては、シリカ系固相及び固相の表面に共有結合的に付着した複数のシランリガンドが挙げられる。固相としては、好ましくはシリカゲル、シリカ酸化物、固体シリカ（例えばガラスファイバー、ガラスビーズ又は珪藻土等）、又は上記の２つ以上の混合物の形態におけるシリカが挙げられる。
これらの進歩にもかかわらず、特に濾過及び／又は遠心分離を伴う方法において単離された生物材料の収率を高める必要性が当該技術分野で依然として残っている。本発明は、この課題を解消することに関する。
包括的に、本発明は、浮遊性粒子のネットワーク並びに生体分子の精製における浮遊性粒子及び浮遊性粒子のネットワークの使用に関する。
一態様において、生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークは、互いに共有結合した２つ以上の浮遊性粒子を含み、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約３０μｍ〜約１ｃｍの大きさに及ぶ。
好ましくは、浮遊性粒子はシリカ又はシリカ含有表面を有する。また好ましくは、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークは、約１．２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有する。
好ましくは、このネットワークは、そのネットワークの最長寸法に沿って約３０μｍ〜約１ｍｍの大きさに及ぶ。より好ましくは、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約５００μｍの大きさに及ぶ。
第２の態様において、本発明は、生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法に関する。この方法は、（ａ）ＳｉＯ２を含むアルカリ溶液に浮遊性粒子を入れる工程と、（ｂ）ＳｉＯ２が縮合するように溶液に酸を添加する工程であって、浮遊性粒子が互いに共有結合し、浮遊性粒子のネットワークを形成する、添加する工程とを含む。
好ましくは、浮遊性粒子は、シリカ又はシリカ含有表面を有する。シリカ含有表面は、ホウ酸塩、アルミナ、ゼオライト、ジルコニア又はフルオリン等の他の要素又は化合物を組み込むことができるが、これらに限定されない。また好ましくは、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークが約１．２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有する。
好ましくは、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約１ｍｍの大きさに及ぶ。より好ましくは、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約５００μｍの大きさに及ぶ。
第３の態様において、本発明は、生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法に関する。この方法は、（ａ）アルカリ溶液に、シリカ又はシリカ含有表面を有する浮遊性粒子を入れる工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られたものを酸付加塩溶液と組合せる工程とを含む。
好ましくは、浮遊性粒子はシリカ又はシリカ含有表面を有する。また好ましくは、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークは、約１．２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有する。
好ましくは、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約３０μｍ〜約１ｍｍの大きさに及ぶ。より好ましくは、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約５００μｍの大きさに及ぶ。
第４の態様において、本発明は、生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークを使用して、標的となる生物材料を単離する方法に関する。この方法は、（ａ）浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークを生物材料に加える工程と、（ｂ）結合溶液を添加する工程と、（ｃ）細胞溶解を行う工程と、（ｄ）加重、遠心分離、真空濾過、又は正圧濾過を行う工程であって、それにより、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークに関連するようになる非標的の生物材料を除去する、加重、遠心分離、真空濾過、又は正圧濾過を行う工程とを含む。結合溶液が、標的となる生物材料又は非標的の生物材料の選択的吸着を促進するのに十分な濃度で、ネットワークに添加される。本発明の或る特定の実施の形態では、結合溶液と細胞溶解液とは同じである。
好ましくは、結合溶液は、カオトロピック及びアルコールの少なくとも一方を含む。
好ましくは、この方法は、標的となる生物材料を精製する工程も含む。好ましくは、生物材料は、細菌、植物組織、動物組織、又は動物の体液の少なくとも１つである。また好ましくは、この方法は、細胞溶解を行った後に、溶液を加熱する工程を含む。
好ましくは、浮遊性粒子はシリカ又はシリカ含有表面を有する。また好ましくは、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークは、約１．２ｇ／ｃｍ２未満の密度を有する。
好ましくは、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約３０μｍ〜約１ｍｍの大きさに及ぶ。より好ましくは、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約５００μｍの大きさに及ぶ。
第５の態様において、本発明は、生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークを使用して、標的となる生物材料を単離する方法に関する。この方法は、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークを、溶解した生物材料と混合する工程と、（ｂ）加重、遠心分離、真空濾過、又は正圧濾過を行う工程であって、それにより、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークと結び付いた非標的の生物材料を清浄化する、加重、遠心分離、真空濾過、又は正圧濾過を行う工程とを含む。
好ましくは、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークが、標的となる生物材料又は非標的の生物材料の浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークとの結合を促進する溶解液又は結合溶液との組み合わせで提供され得る。好ましくは、この方法は、標的となる生物材料を精製する工程も含む。また好ましくは、生物材料は、細菌、植物組織、動物組織、又は動物の体液の少なくとも１つである。また好ましくは、この方法は、加重、遠心分離、真空濾過、又は正圧濾過による清浄化を行う前に溶液を加熱する工程を含む。
好ましくは、浮遊性粒子はシリカ又はシリカ含有表面を有する。また好ましくは、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークは、約１．２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有する。
好ましくは、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約３０μｍ〜約１ｍｍの大きさに及ぶ。より好ましくは、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約５００μｍの大きさに及ぶ。
第６の態様において、本発明は、生物材料の溶解物を清浄化するためのキットに関する。このキットは、溶解液と、浮遊性粒子、浮遊性粒子のネットワーク、並びに浮遊性粒子及び浮遊性粒子のネットワークから成る群より選択される少なくとも１つの成員とを収容している容器を含む。代替的には、このキットは、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークを収容している第１の容器と、溶解液を収容している第２の容器とを含む。
好ましくは、浮遊性粒子はシリカ又はシリカ含有表面を有する。また好ましくは、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークは、約１．２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有する。
好ましくは、このネットワークは、当該ネットワークの最長寸法に沿って約３０μｍ〜約１ｍｍの大きさに及ぶ。より好ましくは、このネットワークは、そのネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約５００μｍの大きさに及ぶ。
本発明のこれらの特徴及び利点並びに他の特徴及び利点のより良好な理解が、本発明の好ましい実施形態が例示及び記載されている、添付の記載及び実施例に対する参照によって為され得る。
本発明は、精製される標的となる生体分子の収率が効果的に増大し得るという点で有益である。浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークが、精製プロセスにおいて濾過（特に真空濾過又は正圧濾過）工程中にフィルターの目詰まりを低減させるのを助けることができるので、収率が効率的に増大する。また、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークが、標的となる生物材料と、様々な汚染物質とを含む溶液が遠心分離中に通るフィルターとして有用であり得るので、この浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークは、精製プロセスにおいて遠心分離工程中に標的となる生体分子の収率を改善するのを助けることもできる。
したがって、本発明の浮遊性粒子及び浮遊性粒子のネットワークを使用する方法は広く利用されており、例えば、溶解物の清浄化、プラスミド精製、プラスミドＤＮＡからのゲノムＤＮＡ分離、及びＲＮＡからのゲノムＤＮＡ分離に使用することができる。もちろん、本方法はこれらに限定されない。それぞれの使用のために、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークは、生物材料を溶液から濾過する機能を働かせる。濾過機能は精製手順によって異なっていてもよい。例えば、幾つかの精製方法において、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークを非標的の生物材料と結び付けることが好ましく、これにより、標的となる生物材料が通過し、溶液中に残留する。他の精製方法において、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークと結び付くことが好ましく、これにより、非標的の生物材料が通過し、溶液中に残留する。
破壊された生物材料の溶液を濾過するための浮遊性粒子のネットワークの使用はまた、溶液中の浮遊性粒子のネットワークの「ラフティング」効果のために有益である。個々の浮遊性粒子に比べて、浮遊性粒子のネットワークが溶液中で浮上する流体力学的抗力が低減することにより、この「ラフティング」効果が発生する。流体力学的抗力の低減により、浮遊性粒子のネットワークが溶液上に浮かび、精製プロセスの濾過工程又は遠心分離工程中、他の細胞残屑でフィルターが目詰まりするのを防ぐ。
浮遊性粒子のネットワークを形成するために、個々の浮遊性粒子が互いに共有結合する。例えば、浮遊性粒子のネットワークが、浮遊性粒子をシリカ又はシリカを含有する組成物で被覆し、それから縮合反応で粒子を共に溶解させることによって形成され得る。もちろん、浮遊性粒子がシリカ表面を既に有している場合は、この粒子は、さらにシリカを加えることなく互いに共有結合することができる。本発明に好適な浮遊性粒子の種類は特に限定されていない。好ましい浮遊性粒子の例としては、ポリウレタン粒子、ポリビニリデン二フッ化粒子、高密度ポリエチレン粒子、Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）Ｓ６０／１０，０００及びＨ５０／１０，０００ガラス球（3M Company、米国ミネソタ州セントポール）が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
さらに、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークで働く特定の機能によって、浮遊性粒子の表面が修飾され得る。浮遊性粒子のネットワークの形成前に修飾が行われてもよく、又は代替的には浮遊性粒子のネットワークの表面が、このネットワークが形成された後に修飾されてもよい。例えば、浮遊性粒子はシラン処理されてもよく、シラン処理された浮遊性粒子を作製する方法は、以下の実施例に記載されている。
作製方法及び表面処理方法にかかわらず、本発明の浮遊性粒子のネットワークには、互いに共有結合した２つ以上の浮遊性粒子が含まれる。得られたネットワークは、そのネットワークの最長寸法に沿って約３０μｍ〜約１ｃｍの大きさに及ぶ。好ましくは、このネットワークは、そのネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約１ｍｍの大きさに及ぶ。より好ましくは、このネットワークは、そのネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約５００μｍの大きさに及ぶ。さらに、浮遊性粒子のネットワークは、約１．２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有することが好ましい。さらに好ましくは、浮遊性粒子のネットワークは、０．５〜０．８ｇ／ｃｍ３の密度を有する。
上述のように、浮遊性粒子及び浮遊性粒子のネットワークは、生物材料の溶解物を清浄化するのに使用され得る。１つのアプローチでは、この粒子又はこのネットワークは、標的となる生物材料が浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークと結合しないように設計される。このようなシナリオでは、例えば浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークが最初に生物材料の容器に加えられ得る。それから、細胞溶解が行われる。その後、破壊された生物材料の選択的吸着を促進するのに十分な濃度で結合溶液が添加される。結合溶液を細胞溶解の前後のいずれで添加してもよいことに留意されたい。さらに、１つの溶液が結合溶液及び細胞溶解液の両方として働くことができることに留意されたい。破壊された細胞含有物が浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークと接触する。非標的の生物材料が浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークに対する親和性を有しているので、この非標的の生物材料は浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークとの複合体を形成する。それから、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークと結び付いた非標的の生物材料が加重、遠心分離、真空濾過又は正圧濾過除去の工程を介して清浄化される。上記の工程を、標的となる生物材料の収率を増大させるのに望ましいように繰り返すことができる。もちろんこの方法は、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークの添加の前に細胞溶解を行なうように変更してもよく、この方法は、標的となる生物材料が浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークに選択的に吸着されるように変更することもできる。磁気精製工程が用いられる場合、生物材料を含む溶液に、磁性粒子を含む溶液（例えば、ＭａｇｎｅＳｉｌ（登録商標）常磁性粒子（Promega Corp.、ウィスコンシン州マディソン）を添加する必要がある。
上記の方法で使用される結合溶液は、カオトロピック、アルコール、又はこれらの混合物を含むことが好ましい。カオトロピック、アルコール、又はこれらの混合物の存在により、生物材料が浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークに吸着するのが容易になる。
本発明の方法論が、１種類の浮遊性粒子の使用、又は１種類の浮遊性粒子のネットワークの使用に限定されないことにも留意されたい。そうではなく、この方法論には、２種類以上の浮遊性粒子の使用、又は浮遊性粒子のネットワークと組合せた浮遊性粒子の使用が含まれ得る。またこの方法論には、２種類以上の異なる浮遊性粒子のネットワークの使用も含まれ得る。浮遊性粒子（複数可）及び／又は浮遊性粒子のネットワーク（複数可）の選択は、この粒子（複数可）及び／又はこのネットワーク（複数可）が使用される特定の用途によって変わる。さらに、この粒子及び／又はこのネットワークは、同時に又は連続して用いることができる。
さらに標的となる生物材料の収率を効果的に高めるために、溶解液を加熱する工程を上記の方法に加えてもよい。溶解液を加熱することにより細胞溶解の効率が増大し、このことが標的となる生物材料の収率を改善するのを助ける。例えば、標的となる生物材料の収率に対する溶解液を加熱する効果の実証は、以下の実施例１１を参照されたい。
本発明の別の態様において、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークはキットに封入されていてもよい。１つの標準的なキットは、浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークの容器と、溶解液の容器とを備える。別のキットは、第１の種類の浮遊性粒子の容器、第２の種類の浮遊性粒子の容器、及び溶解液の容器を備えていてもよい。さらにキットは、浮遊性粒子のネットワークの容器と、浮遊性粒子の容器と、溶解液の容器とを備えていてもよい。実際には、キットが用いられる特定の用途に応じて、キットは、浮遊性粒子の種類及び／又は浮遊性粒子のネットワークの種類の任意の組合せを備えていてもよい。代替的にキットは、溶解液、並びに浮遊性粒子と、浮遊性粒子のネットワークと、浮遊性粒子及び浮遊性粒子のネットワークとから成る群より選択される少なくとも１つの成員とを収容している容器を備えていてもよい。さらにこのキットは除去カラム等を備えていてもよい。この除去カラムが、標的となる生物材料を非標的の生物材料から分離するのを助ける。
本発明の当業者は、本発明の開示を用いて、本発明の原理を説明する本発明の開示において用いられるもの以外の他の浮遊性粒子を選択することができる。
本開示の実施例は本発明の範囲を制限するものではない。本発明に対する修正は当業者に明らかである。
［実施例］
容器（vessel）内のバッチ合成によるＳｉＯ２添加による浮遊性粒子のネットワークの作製
５０ｍｌ容のプラスチック製のスクリューキャップチューブ内に、４．５５ｇのケイ酸を５．２ｍｌの５６％ＫＯＨ（重量／体積）に添加した。最終容量が５０ｍｌになるように水を添加した。それから、溶液の可溶化を容易にするために、このチューブを時々撹拌しながら５０℃の水でインキュベートした。
浮遊性粒子として７．５ｇのＳ６０／１０，０００ガラス球を含む５０ｍｌ容のスクリューキャップチューブにこの溶液を１０ｍｌ添加した。溶液中でガラス球を再懸濁させるために、このチューブを何回か反転させた。蓋をしたままこのチューブを反転させて（スクリューキャップを下にして）、１×ｇでガラス球を浮き上がらせた。２０分後、このチューブをゆっくり反転させ、液体をピペットで取り除いた（最初の１０ｍｌの溶液中の約８．８ｍｌが取り除かれた）。それから、５．０ＭのＨＣｌ ７．５ｍｌをこのチューブに添加し、チューブをゆっくり混合させた。ＨＣｌの添加により、ＳｉＯ２で被覆されたガラス球が、縮合反応を介して浮遊性粒子のネットワークの塊と共有結合した。
浮遊性粒子のネットワークの混合物を１０ｍｌ容のプラスチック製のピペットで吸い上げ、このピペットを２０分間、垂直位に（先端を下にして）置いた。２０分後、浮遊性粒子のネットワークはピペットの上部に浮かび、ピペットの底部にあるＨＣｌ溶液を取り除き、廃棄した。水溶液をピペットで吸い上げ、それからこの混合物をピペットで新しい５０ｍｌ容のチューブに入れ、何回かピペッティングする（pipettings up and down）ことでゆっくりと混合した。それから溶液をピペットの中に吸い上げ、このピペットを２０分間、垂直位に（先端を下にして）置いた。合計で５回水洗浄するために、このプロセスを繰り返した。５回目の洗浄後、この洗浄液を廃棄し、２６０ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ４．８）溶液を用いて、浮遊性粒子のネットワークを再懸濁し、溶液のｐＨを中和した。それから上記の方法を使用して、浮遊性粒子のネットワークをもう１回水で洗浄した。
カラム合成によるＳｉＯ２の添加による浮遊性粒子のネットワークの作製
最初に、浮遊性粒子として、Ｓ６０／１０，０００ガラス球を、水表面上に無傷の（intact）ガラス球が浮かばないように、ビーカー中の水溶液で撹拌した。これにより、無傷のガラス球が壊れたガラス球及びガラス球粒子から分離され、水溶液中に沈んだ。
２６ｇの浮遊したガラス球を５０ｍｌ容のプラスチック製のチューブに入れた。上記の実施例１に記載した５ｍｌのＳｉＯ２／ＫＯＨ溶液をガラス球に加え、室温で１０分間完全に混合させた。それから、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラム（カタログ番号Ａ２４９０、 Promega Corporation（米国ウィスコンシン州マディソン））に、１つのカラム当たり約１４ｍｌのガラス球懸濁液を添加した。この除去カラム膜がガラス球粒子を保持し、液体を通過させた。その後、カラムの最大容量が２０ｍｌであったので、カラムがオーバーフローすることなく、ＨＣｌ溶液を一部充填したカラムに添加することができた。
ガラス球を含む除去カラムを１×ｇで流出させた（drain）。それから、それぞれのカラムに１．０ＮのＨＣｌ ５ｍｌを添加することで、ガラス球を洗浄した。ＨＣｌをカラムから流出させた。１．０ＮのＨＣｌ ５ｍｌを用いて、さらに２回の洗浄を同様に行なった。３回目のＨＣｌ添加の終わりに、ｐＨ試験紙を使用してカラムの底部にある溶離液をモニタリングし、ｐＨが２未満であったことを確認した。
それから、１つのカラムの１回の洗浄当たり７ｍｌの水を用いて、このカラムを３回洗浄した。その後、このカラムを４Ｍのグアニジンイソチオシアネート／１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）８ｍｌで洗浄し、液体を１×ｇで流出させた。
カラム合成方法によるさらなるシリカを用いない浮遊性粒子のネットワークの作製
この手順において後で使用するために、２つの溶液を調製した：（１）「ＬｉＣｌのＨＣｌ溶液」が４．２４ｇのＬｉＣｌと、５．０ｍｌの水と、１０ｍｌの濃ＨＣｌとを添加することによって調製され、（２）「ＣａＣｌ２のＨＣｌ溶液」が１４．７ｇのＣａＣｌ２と、１５ｍｌの水と、３０ｍｌの濃ＨＣｌとを添加することによって調製された。
それから、シリカ表面を有する浮遊性粒子として２．０ｇのＳ６０／１０，０００ガラス球を５０ｍｌ容のプラスチック製のチューブで秤量し、６．０ｍｌの６％ＬｉＯＨ水溶液を添加し、その内容物を完全に混合した。このチューブは「チューブＬｉ」である。同様に、２．０ｇのＳ６０／１０，０００ガラス球を２つ目の５０ｍｌ容のプラスチック製のチューブで秤量し、６．０ｍｌのＣａ（ＯＨ）２の飽和水溶液を添加し、その内容物を完全に混合した。このチューブは「チューブＣａ」である。
５０ｍｌ容のプラスチック製のチューブに入れたＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラム（カタログ番号Ａ２４６Ｂ、 Promega Corporation（米国ウィスコンシン州マディソン））に、この懸濁液を添加し、１×ｇで１０分間沈降させた。このチューブを５００×ｇで３０秒間遠心分離し、Ｓ６０／１０，０００ガラス球を除去カラムで保持しながら、この溶液をカラムに流した。
次に、４．０ｍｌの「ＬｉＣｌのＨＣｌ溶液」（上記）をチューブＬｉに添加し、４．０ｍｌの「ＣａＣｌ２のＨＣｌ溶液」（上記）をチューブＣａに添加した。それぞれの溶液をピペッティングによって完全に混合した。１×ｇで６０分間、このチューブを沈降させ、その後除去カラムの底部にある最後の流入溶液のｐＨを試験して、ｐＨ試験紙によってそれぞれの溶液のｐＨが約２であることが見出された。その後、１０ｍｌの水をピペッティングで混合することなくそれぞれのカラムに添加し、１×ｇで６０分間、このカラムを沈降させた。１つのカラム当たり１０ｍｌの水による合計３回の洗浄のために、この工程を繰り返した。それから、１．３２ＭのＫＯＡｃ（ｐＨ４．８）１０ｍｌを用い、水洗浄と同様に、それぞれのカラムを洗浄した。それぞれのカラムの底部におけるカラム流入溶液のｐＨが約４．８であることが見出された。それから上記のように、それぞれのカラム内の粒子を１０ｍｌの水で洗浄した。最後に、この粒子を除去カラムから取り出し、無菌の５０ｍｌ容のチューブに入れて、真空下で一晩乾燥させた。
シラン処理された浮遊性粒子の作製
ｇのＳ６０／１０，０００ガラス球を５０ｍｌ容のプラスチック製のスクリューキャップチューブ中の２０ｍｌの９５％メタノールで再懸濁した。３．０ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（Aldrich 44,016-7,米国ミズーリ州セントルイス）を加えた。プラットフォームシェイカー上で、反応チューブを室温で一晩混合した。それから、１０ｍｌの水を添加し、溶液濃度を増大させ、粒子を表面に浮かばせた。チューブの底部から３０ｍｌの溶液をピペットで吸い出した。それからこの粒子を３０ｍｌの水で洗浄し、粒子をチューブ中に浮かばせた。チューブの底部からピペットで３０ｍｌを取り除き、１０ｍｌの粒子を残した。再び、３０ｍｌの水で粒子を洗浄し、粒子をチューブ中に浮かばせた。合計３回の水洗浄でピペットにより、３０ｍｌの溶液を底部から取り除いた。シラン処理された粒子は、除去カラム（Promega、カタログ番号２４６Ｂ）に移し、５０ｍｌ容のチューブに入れ、２００×ｇで５分間、遠心分離した。この粒子を真空下（水銀柱１７インチ）で３時間、乾燥させた。
浮遊性粒子と浮遊性粒子のネットワークとのＤＮＡ結合能の比較
５０ｍｌ容のスクリューキャップチューブに入れた除去カラム（Promega、カタログ番号２４６Ｂ）に、以下の表１で示されるそれぞれの粒子を０．４ｇ秤量した。チューブ１及びチューブ２に関して、［００６９］段落の文章の最後までに示されている以下の実施例７のプロトコルに記載のように、４つの４００ｍｌのＪＭ１０９（ｐＧＥＭ）プラスミド溶解物を調製した：「この溶液をカラム中に２分間置き、それからチューブをＡ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラムによって２０００×ｇで１０分間遠心分離して、流入溶液を５０ｍｌ容の円錐チューブで捕捉した」。４つのチューブの溶解流入溶液を１つの清浄化した溶解物にプールした。以下の表１に列挙された粒子を含むそれぞれのカラムに、５ｍｌのこの清浄化した溶解物を添加し、カラムを１×ｇで沈降させた。合計５回、それぞれのカラムの流入溶液をこの粒子に再添加して、粒子表面のプラスミドＤＮＡへの曝露が飽和レベルに達したことを確実にした。このカラムを２０００×ｇで５分間、遠心分離して、１つのカラム当たり１０ｍｌの「プラスミドを含まない溶解液」を添加した。この「プラスミドを含まない溶解液」は以下のように調製された。
１２ｍｌの再懸濁溶液と、１２ｍｌの溶解液と、２０ｍｌの中和溶液（以下の実施例６に記載されるような）とをそれぞれ含む４つの５０ｍｌ容のチューブを混合し、２０００×ｇで１０分間遠心分離した。それから、上記のように１つのカラム当たり１０ｍｌの「プラスミドを含まない溶解液」を添加し、粒子と結合しないプラスミドＤＮＡを洗い流して、カラムを２０００×ｇで５分間遠心分離した。その後、１つのカラム当たり１０ｍｌのカラム洗浄溶液（実施例６に記載される）を添加し、このカラムを２０００×ｇで５分間遠心分離した。次に、１つのカラム当たり１０ｍｌのカラム洗浄溶液を添加し、合計で２回のカラム洗浄のために、このカラムを２０００×ｇで５分間遠心分離した。プラスミドＤＮＡを２．０ｍｌのヌクレアーゼ無含有水で溶離し、２６０ｎｍでの吸光を測定した。空の除去カラムが、粒子の非存在下で４１．５ｇのＤＮＡと結合したので、以下に記載されるように、粒子を含むカラムからＤＮＡの量を引く必要があった。これらの粒子がプラスミド調製物で使用される場合、残屑が粒子の表面積の有意な量を占める。したがって、以下の実施例６及び実施例７に記載されるものと同様のプラスミド調製物で使用される場合、粒子のＤＮＡ結合能が低減することが予測される。
Figure 2009500019
真空精製（vacuum based purification）を用いた高コピープラスミドの溶解物のクリアランス
3MのＳｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）Ｈ５０／１０，０００ガラス球を以下のように処理した。
２５ｍｌの乾燥Ｈ５０／１０，０００ガラス球と、２０ｍｌのオートクレーブにかけた脱イオン水とをそれぞれ含む５つの５０ｍｌ容の円錐スクリューキャップチューブを室温で一晩反転させることによって混合した。５つ全てのチューブを共に６００ｍｌ容のガラスビーカーにプールし、それから５つの５０ｍｌ容のチューブに戻し分けた（split back out into）。ガラス球をそれぞれのチューブの上部に浮かばせた後、浮かんでいるのではなく沈降した少量のガラス球と共に以下の溶液を取り除いた。この溶液を以下の調合物に置き換えた：チューブＡは２５ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ４．８）であり、チューブＢは２５ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ４．８）、１ｍＭのＥＤＴＡであり、チューブＣは４．０９Ｍの塩酸グアニジン、７５９ｍＭのＫＯＡｃ、２．１２Ｍの氷酢酸（最終ｐＨ４．２）であり、チューブＤは、チューブＡと同じ２５ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ４．８）であった。全てのチューブを室温で１６時間反転させることによって混合した。それから、チューブＤの溶液を取り除き、４．０９Ｍの塩酸グアニジン、７５９ｍＭのＫＯＡｃ、２．１２Ｍの氷酢酸（最終ｐＨ４．２）に置き換えた。チューブＡ〜チューブＤを室温でさらに２４時間反転させることによって混合した。
５０ｍｌのルリアブロス（ＬＢ−ミラー）細菌プラスミド培養物ＤＨ５α（ｐＧＥＭ）を１２個の５０ｍｌ容の円錐スクリューキャップ遠心チューブで遠心分離した。これを、１つのチューブ当たり合計５回繰り返した。得られた１２個のチューブは、それぞれのペレットが１つのチューブ当たり４９０の細胞の吸光度単位（Ａ６００）を示す、１つのチューブ当たり２５０ｍｌの細菌培養ペレットをそれぞれ有していた。このチューブは後のプラスミドＤＮＡ抽出のために−２０℃で凍結させた。
Promega（ウィスコンシン州マディソン）のＡ２４９５プラスミド中型プラスミド精製システム（A2495 plasmid midi-plasmid purification system）を使用してプラスミド精製を行った。溶液の組成は以下である。
細胞再懸濁溶液：５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのＲｎａｓｅ Ａ；
細胞溶解液：０．２Ｍの水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ；
中和溶液：４．０９Ｍの塩酸グアニジン、７５９ｍＭの酢酸カリウム、２．１２Ｍの氷酢酸；
内毒素除去洗浄液：４．２Ｍの塩酸グアニジン、４０％イソプロパノール；
カラム洗浄液：１６２．８ｍＭの酢酸カリウム、２２．６ｍＭのトリス、０．１０９ｍＭのＥＤＴＡ。３２０ｍｌに、１７０ｍｌの９５％エタノールを添加する；
ヌクレアーゼ無含有水；
Ａ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラム、１００ｅａ；及び
Ａ２４５Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）結合カラム、１００ｅａ。
上記のＤＨ５α（ｐＧＥＭ）の１２個のチューブそれぞれに、６．０ｍｌの細胞再懸濁溶液を添加し、ゆっくりと混合した。それから、６．０ｍｌの細胞溶解液を添加し、ゆっくりと混合した。次に、１０ｍｌの中和溶液を添加し、ゆっくりと混合した。
Ａ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラムによって、チューブ１及びチューブ２を７０００×ｇで１５分間遠心分離し、流入溶液を５０ｍｌ容の円錐チューブで捕捉した。チューブ１及びチューブ２に関して、この溶液をＡ２４５Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）結合カラムに直接注ぎ、以下に記載されるように真空を適用させた。チューブ３及びチューブ４に関して、ガラス球を加えず、チューブを反転することで、この溶液をゆっくりと混合させた。チューブ５及びチューブ６に関して、上記のチューブＡからの１ｍｌのＨ５０／１０，０００ガラス球を加え、チューブを反転することでゆっくりと混合させた。チューブ７及びチューブ８に関して、上記のチューブＢからの１ｍｌのＨ５０／１０，０００ガラス球を加え、チューブを反転することでゆっくりと混合させた。チューブ９及びチューブ１０に関して、上記のチューブＣからの１ｍｌのＨ５０／１０，０００ガラス球を加え、チューブを反転することでゆっくりと混合させた。チューブ１１及びチューブ１２に関して、上記のチューブＤからの１ｍｌのＨ５０／１０，０００ガラス球を加え、チューブを反転することでゆっくりと混合させた。
上記のチューブ３〜チューブ１２の内容物を加え、（Ａ２４６Ｂ）除去カラムを単離した。それぞれの除去カラムで（Ａ２４５Ｂ）結合カラム上に覆い、結合カラムをＶａｃ−Ｍａｎ（登録商標）真空マニフィールド（Promega、カタログ番号Ａ７２３１）に挿入した。それぞれの重ねられたカラム対を室温で３分間静置し、それから液体が除去カラム膜を通るか、又はカラムが２分間目詰まりする（さらなる滴下が観察されなくなる）まで、カラムを真空にかけた。それから除去カラムを廃棄し、５ｍｌの内毒素除去洗浄液で結合カラムを連続的に洗浄した。その後、これまでの全ての溶液が結合膜を通った後、５ｍｌのカラム洗浄液を添加した。これまでの全てのカラム洗浄溶液が結合膜を通った後、５ｍｌのカラム洗浄液を添加し、溶液をカラムの結合膜で吸い出した。それから、カラムを連続真空下で１０分乾燥させた。次に、それぞれのカラムを５０ｍｌ容のチューブに入れ、それぞれのカラムを８００μｌのヌクレアーゼ無含有水で溶離した。室温で２分間静置した後、それぞれのチューブを２５００×ｇで５分間遠心分離した。
ＤＮＡの濃度及び収率は、Ａ２６０及びＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）（Invitrogen、カルフォルニア州カールスバッド）の分析での吸光によって測定された。
Figure 2009500019
遠心分離精製を用いた細胞濃縮及び溶解物のクリアランスによる高コピープラスミドＪＭ１０９（ｐｈｍＧＦＰ）
最初に、１．０ＭのＮａＣｌ／５０％エタノール（体積／体積）溶液５０ｍｌを調製した。それから、１ＭのＮａＣｌ／５０％エタノール溶液５．０ｍｌを3MのＳｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）Ｓ６０／１０，０００ガラス球の乾燥粒子１．５ｇに添加した。１ＭのＮａＣｌ／５０％エタノール溶液５．０ｍｌを１．５ｍｌの乾燥Ｓ６０／１０，０００ガラス球粒子のネットワークに添加し、１ＭのＮａＣｌ／５０％エタノール溶液５．０ｍｌを乾燥Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）Ｈ５０／１０，０００ガラス球１．５ｇに添加した。これらの溶液は以下で使用する。
５０ｍｌのルリアブロス（ＬＢ−ベルターニ)細菌プラスミド培養物ＪＭ１０９（ｐｈｍＧＦＰ）を８つの５０ｍｌ容の円錐スクリューキャップ遠心分離チューブで遠心分離した。これは、１つのチューブ当たり合計で５回繰り返した。８つのチューブ（チューブＡ）を得て、それぞれのペレットが１つのチューブ当たり２５０×１．６７の細胞の吸光度単位（Ａ６００）を示す、１つのチューブ当たり２５０ｍｌの細菌培養ペレットをそれぞれ有していた。同様に、５０ｍｌのルリアブロス（ＬＢ−ベルターニ）細菌プラスミド培養物ＪＭ１０９（ｐｈｍＧＦＰ）を８つの５０ｍｌ容の円錐スクリューキャップ遠心分離チューブで遠心分離した。これは、１つのチューブ当たり合計で４回繰り返し、それぞれの最終ペレットが１つのチューブ当たり２００×１．６７の細胞の吸光度単位（Ａ６００）を示していた（チューブＢ）。以下のプロトコルで２００ｍｌのペレットを２５０ｍｌのペレットと混ぜ合わせることによって、共に加えられた混ぜ合わせ細胞ペレットは、７５０吸光単位（Ａ６００）であった。このチューブは、後のプラスミドＤＮＡ抽出のために、−２０℃で凍結された。
Promega（ウィスコンシン州マディソン）のＡ２４９５プラスミド中型プラスミド精製システムを使用してプラスミド精製を行った。溶液の組成は以下である。
細胞再懸濁溶液：５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ；
細胞溶解液：０．２Ｍの水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ；
中和溶液：４．０９Ｍの塩酸グアニジン、７５９ｍＭの酢酸カリウム、２．１２Ｍの氷酢酸；
内毒素除去洗浄液：４．２Ｍの塩酸グアニジン、４０％イソプロパノール；
カラム洗浄液：１６２．８ｍＭの酢酸カリウム、２２．６ｍＭのトリス、０．１０９ｍＭのＥＤＴＡ。３２０ｍｌに、１７０ｍｌの９５％エタノールを添加する；
ヌクレアーゼ無含有水；
Ａ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラム；及び
Ａ２４５Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）結合カラム。
上記のＪＭ１０９（ｐｈｍＧＦＰ）の２００ｍｌのペレットが入った８つのチューブ（チューブＢ）それぞれに、３．０ｍｌの細胞懸濁溶液を添加し、激しくボルテックスする（vigorous vortexing）ことによって混合した。それから、再懸濁した細菌細胞をＪＭ１０９（ｐｈｍＧＦＰ）の２５０ｍｌのペレットが入った８つのチューブ（チューブＡ）それぞれに移した。それぞれのチューブを激しくボルテックスし、細菌細胞を再懸濁させた。
予め２００ｍｌの細菌細胞ペレットを含んでいた上記のチューブＢのそれぞれに、３．０ｍｌの以下の溶液を添加した。
チューブ１及びチューブ２：１．０ＭのＮａＣｌ／５０％エタノール溶液を添加した；
チューブ３及びチューブ４：Ｓ６０／１０，０００Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）ガラス球（上記）を含む溶液を添加した；
チューブ５及びチューブ６：Ｓ６０／１０，０００ガラス球粒子のネットワーク（上記）を含む溶液を添加した；
チューブ７及びチューブ８：Ｈ５０／１０，０００Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）ガラス球（上記）を含む溶液を添加した。
それから、８つのチューブそれぞれの溶液を、７５０の光学密度単位（Ａ６００）のＪＭ１０９（ｐｈｍＧＦＰ）を含む対応する８つのチューブ（チューブＡ）に添加し、激しくボルテックスした。
それから、６．０ｍｌの細胞溶解液をチューブＢに添加し、ゆっくりと混合した後、溶解物をチューブＡセットの対応するチューブに移して、ゆっくりと混合した。チューブＢは廃棄した。次に、１つのチューブ当たり９ｍｌの中和溶液を添加して、ゆっくりと混合した。それぞれ５０ｍｌ容の円錐底チューブに含まれていたＡ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラムに、それぞれのチューブの内容物を加えた。この溶液をカラム中に２分間置き、それからチューブをＡ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラムによって２０００×ｇで１０分間遠心分離して、この流入溶液を５０ｍｌ容の円錐チューブで捕捉した。
１つのチューブ当たりの内容物の容量は、
チューブ１、チューブ２＝１４ｍｌ、１４ｍｌ（共にチューブは目詰まりした）；
チューブ３、チューブ４＝１７ｍｌ、１７ｍｌ；
チューブ５、チューブ６＝１４ｍｌ、１５ｍｌ；及び
チューブ７、チューブ８＝１７ｍｌ、１８ｍｌ（チューブ３〜チューブ８は目詰まりしなかった）
であった。
５０ｍｌ容のチューブにそれぞれ含まれていた別々の（Ａ２４５Ｂ）結合カラムに、それぞれのチューブの流入内容物を加えた。このチューブを２０００×ｇで１０分間遠心分離した。５ｍｌの内毒素除去洗浄液でそれぞれの結合カラムを洗浄し、２０００×ｇで５分間遠心分離した。それから、５ｍｌのカラム洗浄液を添加し、２０００×ｇで５分間遠心分離した。次に、カラム／チューブ当たり２回目の洗浄用のカラム洗浄液を５ｍｌ添加した。このチューブを２０００×ｇで５分間遠心分離した。その後、それぞれのカラムを適切に印を付けた５０ｍｌ容のチューブに入れ、それぞれのカラムを８００μｌのヌクレアーゼ無含有水で溶離させた。室温で２分間静置した後、それぞれのカラム／チューブを２０００×ｇで５分間遠心分離した。
ＤＮＡの濃度及び収率は、Ａ２６０及びＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）（Invitrogen、カルフォルニア州カールスバッド）の分析での吸光によって測定された。
Figure 2009500019
ガラス球を使用した溶解物のクリアランスを最適化するための一般的方法
浮遊性粒子が、溶解物のクリアランスに直接的に有用である一方で、標的となる生物材料を除去しない残屑の除去の実施は、塩又は有機分子の付加によって最適化され得ることが多い。本発明の範囲を制限することなく、ＮａＣｌ又はアルコール等の分子の使用により、このような最適化方法の枠組みが与えられ得る。最適には、相当量の標的となる分子（複数可）を除去することなく、最大量の残屑を除去する濃度で塩又は有機分子を加える。一例としてＮａＣｌを使用した場合、理想量はタンパク質を最大限に塩析するのに十分高いが（例えば）、依然として標的となる核酸を除去させないほど低すぎる。エタノールの場合、最適量は、標的となる核酸を析出させることなく、溶液からの不要な残屑の析出を容易にするのに十分である。ＮａＣｌ及びアルコールを組合せて使用する場合、溶液からＮａＣｌを析出させないように十分低い濃度を維持することが重要である。このことは一般的に塩又は有機分子の濃度範囲を試験し、濁度、色度、粘度、又は目詰まりすることなくフィルターを通る能力等の定性的側面において溶解物の清浄化の実施を観察するのに有用である。標的となる核酸の純度及び収率等の定量的測定が、最適条件をより綿密に定義するのに有用である。以下の実施例（実施例９）は、このような定性的方法を用いて例示される。
溶解物の清浄化においてＮａＣｌ及びエタノールを使用する定性的評価
大腸菌株ＪＭ１０９（ｐｈＭＧＦＰ）は、１つのフラスコ当たり１ＬのＬＢミラー培地を３００ｒｐｍで振盪することによって、３７℃で１７時間、５つのＥｒｌｅｎｍｙｅｒフラスコ（それぞれ２Ｌ容）中のＬＢミラー培地で培養させた。細胞密度がＡ６００で測定された。この細胞を遠心分離し、ペレットを−２０℃で保存した。１つの試料当たり１２００のＯＤ単位（Ａ６００）を用いた。この細胞をボルテックスすることによって以下の溶液中で再懸濁した。
Figure 2009500019
一度細胞を再懸濁したら、１ｍｌの９５％エタノールをチューブ２に添加し、それからボルテックスした。チューブ３に、４５％エタノールと、０．６２５ＭのＮａＣｌと、２５ｇ／４０ｍｌのＨ５０ Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）ガラス球とを含む２．５ｍｌの溶液を添加し、このチューブをボルテックスした。この手順の後、チューブ２及びチューブ３は視覚的に十分に再懸濁されたように見えたが、チューブ１及びチューブ４は視覚的に細胞塊を完全には再懸濁しているようには見えなかった。
５ｍｌの細胞溶解液（全ての溶液配合物に関して実施例６を参照）をそれぞれのチューブに添加し、それらをゆっくりと５回反転させることによってこのチューブを混合させた。１つのチューブ当たり１０ｍｌの中和溶液を添加し、上記のように反転によってチューブを混合させた。２分のインキュベーションの後、溶解物を除去カラムに加え、カラムを５０ｍｌ容のCorningのチューブに入れた。それから、このチューブをＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ ＭＰ４スイングバケット遠心器で、１５００×ｇで５分間、遠心分離した。除去カラムフィルターを通った溶液の容量及び混濁度を試験した。
チューブ１：１５ｍｌの溶解物、非常に混濁
チューブ２：１０ｍｌの溶解物、非常に混濁
チューブ３：１４ｍｌの溶解物、わずかに混濁
チューブ４：８ｍｌの溶解物、非常に混濁
それから、１５００×ｇで５分間遠心分離することで、チューブ１及びチューブ３を第２の除去カラムに通した。チューブ１は混濁したままであったが、チューブ３では清浄な溶解物が見られた。
加水分解性Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）Ｈ５０ガラス球を調製する方法
粒子表面上にエポキシ基を含むように、3MはＳｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）Ｈ５０ガラス球を修正している。１０ｇのＳｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）Ｈ５０ガラス球を１ＮのＨＣｌ（ｐＨ２．３）（１０ＭのＮａＯＨを用いて調製)で最終的に１００ｍｇ／ｍｌの濃度まで懸濁した。オービタルシェイカーを使用して３００ｒｐｍで１６時間、この懸濁液を激しく混合した。この容器を室温で２０分間相分離させ、浮遊性の加水分解性ガラス球を表面に浮かせた。水相及びガラス球の非浮遊性分画の除去が、ガラスピペットで浮遊性ガラス球の相をゆっくりと貫通させること及び使用済みの液体を吸い出すことによって達成された。それから、容器を回転させること、その後の相分離及び廃棄物の除去手順を繰り返すことによって、ガラス球を１００ｍｌの殺菌Ｈ２Ｏで２回洗浄した。５ＭのＮａＣｌ １０ｍｌ及び５２．６ｍｌの９５％ＥｔＯＨをガラス球スラリーに添加し、それから殺菌Ｈ２Ｏを最終的な容量が１００ｍｌになるまで添加した。最終配合物は、１００ｍｇ／ｍｌのガラス球／０．５ＭのＮａＣｌ／５０％ＥｔＯＨであった。
濾過助剤としての加水分解性Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）Ｈ５０ガラス球の使用
高コピープラスミド含有細菌株ＪＭ１０９（ｐｈＭＧＦＰ）の培養物を一晩培養し、その培養物のＯ．Ｄ．を６００ｎｍで測定した。５００、１０００、１２５０、１５００、及び２０００Ｏ.Ｄ.と定義された細胞集団を適切な量の一晩培養物を遠心分離することで４通り調製した。ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）プラスミド中型システム（上記の実施例６を参照）及び以下の試薬組成物を用いてプラスミドの精製を行なった。
細胞再懸濁溶液：５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ；
細胞溶解液：０．２ＭのＮａＯＨ、１％ＳＤＳ；
中和溶液：４．０９Ｍの塩酸グアニジン、７５９ｍＭの酢酸カリウム、２．１２Ｍの氷酢酸；
内毒素除去洗浄液：４Ｍの塩酸グアニジン、４０％イソプロパノール；
カラム洗浄溶液：６０ｍＭの酢酸カリウム、８．３ｍＭのＥＤＴＡ、６０％ＥｔＯＨ；
Ａ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラム；及び
Ａ２４５Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）結合カラム＊
＊備考：これらの実験に関して、カラムの結合能を増大させるのに使用する前に、それぞれの結合カラムに、第２の同一の結合ディスクを加えた。
それぞれの異なる細胞集団を表す複製細胞ペレット（Ｏ.Ｄ.６００ｓ）を６．０ｍｌの細胞再懸濁溶液で再懸濁し、５０ｍｌ容の円錐チューブに移した。６．０ｍｌの細胞溶解液をそれぞれの試料に添加し、３分間反転させることによって混合した。それぞれの複製セットから１つの試料に、１００ｍｇ／ｍｌのＨ５０ガラス球２．０ｍｌを加え、１０〜１５分間ゆっくりと反転させることによって混合した。６．０ｍｌの中和溶液を全ての試料に添加した。
それぞれの試料を迅速に反転させることによって混合し、それから直ぐに５０ｍｌ容の円錐チューブに入れた除去カラムに移した。スイングバケット遠心器で、３０００×ｇで５分間、遠心分離することで、清浄化した溶解物を回収した。以下の表は、ガラス球を加えた複製セットと、ガラス球を加えなかった複製セットとの間の清浄化した溶解物の容量に対して得られた効果を示している。
Figure 2009500019
濾過効率及び溶解物の再利用の影響としてのプラスミド回収率の増大
それから、清浄化した溶解物を５０ｍｌ容の円錐チューブ中の２−ディスク結合カラムに移し、１５００×ｇで３分間遠心分離した。結合工程からの流入溶液をそれぞれの試料から回収し、廃棄した。５ｍｌの内毒素除去洗浄液及びその後２０ｍｌのカラム洗浄液を使用して、結合カラムを連続的に洗浄した。それぞれの工程で１５００×ｇで３分間の遠心分離を用いた。最終的に、空のカラムを３０００×ｇで５分間遠心分離した。３．０ｍｌの殺菌Ｈ２Ｏを添加し、その後３０００×ｇで５分間遠心分離することによってプラスミドＤＮＡを溶離した。それから、２０ｍｌの殺菌Ｈ２Ｏを使用してそれぞれの結合カラムを洗い流し、３０００×ｇで５分間遠心分離した。
それぞれの試料に対して、ここで第１の結合工程からの流入溶液を結合カラムに再充填し、結合手順、洗浄手順、乾燥手順、溶離手順、及びカラム洗い流し手順を同一の様式で繰り返した。その後、２つの結合及び溶離が続き、それぞれの試料を表す合計で４つの３．０ｍｌの溶離液が得られた。これは、条件間の全収率の違いが単純に結合効率又はカラム結合能の影響によるものではなかったことを確認するために行なった。収率の推定を吸光度測定によって行い、４つの溶離セットに対して得られた収率を組合せて、プラスミドＤＮＡの全収率に反映させた。以下の結果が得られた。
Figure 2009500019
細胞溶解反応のマイクロ波処理による溶解効率の増大
それぞれの異なる細胞集団を表す複製細胞ペレット（Ｏ.Ｄ.６００ｓ）の第２のセットを６．０ｍｌの細胞再懸濁溶液で再懸濁し、５０ｍｌ容の円錐チューブに移した。６．０ｍｌの細胞溶解液をそれぞれの試料に添加し、３分間反転させることによって混合した。それから、細胞溶解物の液体／気体の界面がビーカーの水位よりも低くなるのに十分な水を充填したガラスビーカーに全ての試料チューブを入れた。このビーカーを高温に設定された６００Ｗのマイクロ波オーブンに入れ、４０秒間マイクロ波処理した。それぞれの試料チューブを２０秒間反転させることによりゆっくりと混合し、それから水のビーカーに戻し、モニタリングした溶解物の温度が約５５℃に達するまでさらに２０秒間マイクロ波処理した。最後に、全てを２０秒間反転させることにより混合し、その後冷めるまで１５分間氷浴に入れた。それぞれの複製セットから１つの試料に、１００ｍｇ／ｍｌの加水分解性（実施例１０）Ｈ５０ガラス球２．０ｍｌを加え、１０〜１５分間ゆっくりと反転させることによって混合した。６．０ｍｌの中和溶液を全ての試料に添加した。試料を迅速に反転させることによって混合し、それから直ぐに５０ｍｌ容の円錐チューブに入れた除去カラムに移した。スイングバケット遠心器で、３０００×ｇで５分間、遠心分離することで、清浄化した溶解物を回収した。ガラス球を加えた複製セットと、ガラス球を加えなかった複製セットとの間の清浄化した溶解物の容量に対する効果が得られた。
Figure 2009500019
それから、清浄化した溶解物を５０ｍｌ容の円錐チューブ中の２−ディスク結合カラムに移し、１５００×ｇで３分間遠心分離した。結合工程からの流入溶液をそれぞれの試料から回収し、廃棄した。５ｍｌの内毒素除去洗浄液及びその後２０ｍｌのカラム洗浄液を使用して、結合カラムを連続的に洗浄した。それぞれの工程で１５００×ｇで３分間の遠心分離を用いた。最終的に、空のカラムを３０００×ｇで５分間遠心分離した。３．０ｍｌの殺菌Ｈ２Ｏを添加し、その後３０００×ｇで５分間遠心分離することによってプラスミドＤＮＡを溶離した。それから、２０ｍｌの殺菌Ｈ２Ｏを使用してそれぞれの結合カラムを洗い流し、３０００×ｇで５分間遠心分離した。
それから、それぞれの試料に対して、第１の結合工程からの流入溶液をそれぞれの結合カラムに再充填し、結合手順、洗浄手順、乾燥手順、溶離手順、及びカラム洗い流し手順を同一の様式で繰り返した。その後、２回の結合及び溶離が続き、それぞれの試料を表す合計で４つの３．０ｍｌの溶離液が得られた。これは、条件間の全収率の違いが単純に結合効率又はカラム結合能の影響によるものではなかったことを確認するために行なった。収率の推定を吸光度測定によって行い、４つの溶離セットに対して得られた収率を組合せて、プラスミドＤＮＡの全収率に反映させた。以下の結果が得られた。
Figure 2009500019
カラム合成方法によりＳｉＯ２で被覆されたＰＶＤＦ（二フッ化ポリビニリデン）粒子の浮遊性ネットワークの作製
２つの溶液をこの手順で後の使用のために調製した：（１）「ＳｉＯ２−ＫＯＨ」（５．８％ＫＯＨ中の９．０％ＳｉＯ２の最終的な配合物で作られた）、及び（２）１．０ＮのＨＣｌ。
ｇのＨｙｌａｒ４６１ＰＶＤＦ粒子（Solvay Solexis、ベルギー、ブリュッセル）が除去カラムで秤量され（実施例７を参照）、７ｍｌのＳｉＯ２−ＫＯＨを添加し、内容物をゆっくりと混合した。５０ｍｌ容のプラスチック製のチューブに入れたPromega（米国ウィスコンシン州マディソン）のカタログ番号Ａ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラムに懸濁液を添加し、その溶液を１×ｇで２０分間除去カラムに滴下させた。
１ＮのＨＣｌ １０ｍｌをこのカラムに添加した。このカラムを１×ｇで５分間滴下させ、それからカラムの底部の最後の流入溶液のｐＨを試験して、ｐＨ試験紙によってｐＨが約２であることを見出した。それぞれ１５ｍｌの水を３回移し替えて、この粒子をカラムから５０ｍｌ容のプラスチック製のチューブに移し、この粒子は１０ｍｌ容のプラスチック製のピペットを用いて混合し、５０ｍｌ容のチューブに移した。１０分後、１×ｇで浮遊性粒子のネットワークより下にある溶液を１０ｍｌ容のピペットを使用して取り除いた。２００ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ４．８）３０ｍｌを添加し、内容物を混合した。１０分後、１×ｇで底部の溶液を取り除いた。取り除いた溶液のｐＨをｐＨ試験紙で試験し、ｐＨが約４．８であることを見出した。３０ｍｌの水を添加し、内容物を混合した。１０分後、１×ｇで下にある溶液を取り除いた。浮遊性粒子のネットワークを５ｍｌの水で再懸濁した。３０分後、１×ｇでこの溶液をピペッティングで取り除き、浮遊性粒子のネットワークを２０〜２２℃及び１ａｔｍで一晩乾燥させた。
カラム合成方法によりＳｉＯ２で被覆された高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）粒子の浮遊性ネットワークの作製
２つの溶液をこの手順で後の使用のために調製した：（１）「ＳｉＯ２−ＫＯＨ」（５．８％ＫＯＨ中の９．０％ＳｉＯ２の最終的な配合で作られた）、及び（２）１．０ＮのＨＣｌ。
３．０ｇのＩｎｈａｎｃｅ ＨＤ−１８００表面修飾ＨＤＰＥ ＰＤ−０４５．０１−１（Fluoro-Seal、テキサス州ヒューストン）を５０ｍｌ容のプラスチック製のチューブ中で秤量し、４．０ｍｌのＳｉＯ２−ＫＯＨを添加し、内容物をゆっくりと混合した。５０ｍｌ容のプラスチック製のチューブに入れたPromega（米国ウィスコンシン州マディソン）のカタログ番号Ａ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラムに懸濁液を添加し、その溶液を１×ｇで４０分間除去カラムに滴下させた。
１ＮのＨＣｌ １０ｍｌをこのカラムに添加した。このカラムを１×ｇで６０分間滴下させ、それからカラムの底部に残った最後の流入溶液のｐＨを試験して、ｐＨ試験紙によってｐＨが約２であることを見出した。２００ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ４．８）１０ｍｌを添加した。３０分後、１×ｇで底部の溶液を取り除いた。カラムの底部にある溶液のｐＨをｐＨ試験紙で試験し、ｐＨが約４．８であることを見出した。１０ｍｌの水を添加し、このカラムを１×ｇで４０分間滴下させた。１０ｍｌの水を添加し、このカラムを１×ｇでさらに９０分間滴下させた。浮遊性粒子のＨＤＰＥ−シリカネットワークを無菌の５０ｍｌ容のチューブに取り出し、残った溶液をピペットを用いて取り除いた。浮遊性粒子のＨＤＰＥ−シリカネットワークを２０〜２２℃、１ａｔｍで一晩乾燥させた。
ＰＶＤＦと、ＰＶＤＦ−シリカのネットワークと、ＨＤＰＥと、ＨＤＰＥ−シリカ浮遊性粒子のネットワークとを使用する溶解物の清浄化
５０ｍｌのルリアブロス（ＬＢ−ミラー）細菌プラスミド培養物ＪＭ１０９（ｐＴＭＶ２６６）（低コピークロラムフェニコール耐性及びタバコモザイクウイルス配列を含有するプラスミド）を１６個の５０ｍｌ容の円錐スクリューキャップ遠心チューブで遠心分離した。これを１つのチューブ当たり合計で６回繰り返した。１つのチューブ当たりそれぞれ３００ｍｌの細菌培養ペレット（１ｍｌ当たり２．２のＡ６００）を有する１６個のチューブが得られた。このチューブは、「チューブＡ ６６０ＯＤ」とラベルを付し、後のプラスミドＤＮＡ抽出のために、−２０℃で凍結した。
５０ｍｌのルリアブロス（ＬＢ−ミラー）細菌プラスミド培養物ＪＭ１０９（ｐＴＭＶ２６６）を１６個の５０ｍｌ容の円錐スクリューキャップ遠心チューブで遠心分離した。これを１つのチューブ当たり合計で５回繰り返した。それから、１つのチューブ当たりさらに１０ｍｌを遠心分離した。１つのチューブ当たりそれぞれ２６０ｍｌの細菌培養ペレット（１ｍｌ当たり１．９のＡ６００）を有する１６個のチューブが得られた。このチューブは、「チューブＢ ４９０ＯＤ」とラベルを付し、後のプラスミドＤＮＡ抽出のために、−２０℃で凍結した。
Promega（ウィスコンシン州マディソン）のＡ２４９５プラスミド中型プラスミド精製システムを使用してプラスミド精製を行った。溶液の組成は以下である。
細胞再懸濁溶液：５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのＲｎａｓｅ Ａ；
細胞溶解液：０．２Ｍの水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ；
中和溶液：４．０９Ｍの塩酸グアニジン、７５９ｍＭの酢酸カリウム、２．１２Ｍの氷酢酸；
カラム洗浄液：１６２．８ｍＭの酢酸カリウム、２２．６ｍＭのトリス、０．１０９ｍＭのＥＤＴＡ。３２０ｍｌに、１７０ｍｌの９５％エタノールを添加する；
Ａ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラム（溶解物の清浄化に使用した）；及び
Ａ２４５Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）結合カラム（プラスミドＤＮＡの精製に使用した）。
上記の「チューブＢ」細胞ペレットの１４個のチューブに、４．０ｍｌの細胞再懸濁溶液を添加し、激しいボルテックスによって混合した。それから、再懸濁した細菌細胞を１４個のそれぞれの「チューブＡ」に移した。それぞれのチューブを激しくボルテックスし、細菌細胞を再懸濁した。１．０ｍｌの細胞再懸濁溶液をそれぞれの「チューブＢ」に添加し、このチューブを洗い流して、再懸濁した細胞をこれらのそれぞれの「チューブＡ」対応物（counterpart）に加え、５ｍｌの再懸濁溶液中に光学密度単位（Ａ６００）が１１５０である組合せた細胞集団が与えられた。チューブＢは廃棄した。
それから、５ｍｌの細胞溶解液をチューブＡに添加し、ゆっくりと混合した。その後、１つのチューブ当たり９ｍｌの中和溶液を添加し、ゆっくりと混合した。
上記のチューブＡそれぞれに、以下のものを加えた：
チューブ１及びチューブ２：浮遊性粒子は加えなかった；
チューブ３及びチューブ４：０．７ｇのＰＶＤＦ（実施例１２を参照）を加えた；
チューブ５及びチューブ６：０．５ｇの浮遊性粒子のＰＶＤＦネットワーク（実施例１２を参照）を加えた；
チューブ７及びチューブ８：０．７ｇのＨＤＰＥ（実施例１３を参照）を加えた；
チューブ９及びチューブ１０：０．７ｇの浮遊性粒子のＨＤＰＥネットワーク（実施例１３を参照）を加えた；
チューブ１１及びチューブ１２：０．７ｇのＳｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）Ｈ５０加水分解性（実施例５を参照）ガラス球を加えた；並びに
チューブ１３及びチューブ１４：試料は２２００×ｇで１０分間遠心分離し、液体をピペット吸引により（残屑内のポケットから）取り除いた。
それぞれのチューブを混合し、それぞれ５０ｍｌ容のチューブに含まれていた、Ａ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラムに加えた。この溶液を２分間カラム中に静置させ、それからこのチューブを２２００×ｇで１０分間遠心分離し、流入用液を５０ｍｌ容のチューブで捕捉した。濾過／遠心分離の後の５０ｍｌ容のチューブ当たりの含有物の容量は、以下の結果の表に示されたようなものであった。
それぞれのチューブの内容物をＡ２４５Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）結合カラムに加え、それからこのチューブを２２００×ｇで１０分間遠心分離した。流入溶液を廃棄し、結合カラムを１つのチューブ当たり５ｍｌの内毒素洗浄液で洗浄して、２２００×ｇで１０分間遠心分離した。洗浄流入溶液を廃棄し、カラムを１つのチューブ当たり２０ｍｌのカラム洗浄液で洗浄して、２２００×ｇで１０分間遠心分離した。このカラムを無菌の５０ｍｌ容のチューブに移し、８００μｌのヌクレアーゼ無含有水で溶離した。２１℃で５分後、チューブを２２００×ｇで５分間遠心分離し、第２の溶離液であるヌクレアーゼ無含有水を１つのカラム当たり８００μｌ添加した。２１℃で５分後、カラムを２２００×ｇで５分間遠心分離し、このようにして溶離液１及び溶離液２を組合せた。試料ＤＮＡを分析し、−２０℃で凍結した。結果を以下の表に示す。
Figure 2009500019
非核酸標的分子の精製前に、Ｓ６０粒子及びＳ６０粒子のネットワークを使用する残屑及び非標的のＤＮＡの除去
上記の実施例５は、多様な浮遊性粒子のＤＮＡ結合特性を示している。結果に見ることができるように、Ｓ６０／１０，０００ Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）ガラス球及び（シラン未処理）粒子のネットワークは、シラン処理された粒子又はシラン処理された粒子のネットワーク、又はＨ５０／１０，０００ Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）ガラス球より大きいＤＮＡ結合能を示していた。本実施例では、残屑の溶解物を除去し、且つ所望の非核酸の標的産物のその後の精製を妨げ得るプラスミドＤＮＡを取り除くのに、より高い結合能を有する粒子（Ｓ６０粒子及びＳ６０浮遊性粒子のネットワーク）を使用した。一般的にシラン処理された粒子は、標的となる核酸の精製には好ましいが（例えば実施例６及び実施例７で示されるように）、Ｓ６０浮遊性粒子及びＳ６０浮遊性粒子のネットワーク（本実施例で使用されるように）が、非核酸標的を精製するのに好ましい特性を示していた（非標的のＤＮＡが、標的となる分子（複数可）との望ましくない同時精製が行なわれる可能性がある場合）。
５０ｍｌのルリアブロス（ＬＢ−ミラー）細菌プラスミド培養物ＪＭ１０９（ｐＭＧＦＰ）を１６個の５０ｍｌ容の円錐スクリューキャップ遠心チューブで遠心分離した。これを１つのチューブ当たり合計で４回繰り返した。それから、１つのチューブ当たりさらに２５ｍｌを遠心分離した。１つのチューブ当たりそれぞれ２２５ｍｌの細菌培養ペレットを有する１６個のチューブが得られた。このチューブは、「チューブＡ」とラベルを付し、後のプラスミドＤＮＡ抽出のために、−２０℃で凍結した。
５０ｍｌのルリアブロス（ＬＢ−ミラー）細菌プラスミド培養物ＪＭ１０９（ｐＭＧＦＰ）を１６個の５０ｍｌ容の円錐スクリューキャップ遠心チューブで遠心分離した。これを１つのチューブ当たり合計で４回繰り返した。１つのチューブ当たりそれぞれ２００ｍｌの細菌培養ペレットを有する１６個のチューブが得られた。このチューブは、「チューブＢ」とラベルを付し、後のプラスミドＤＮＡ抽出のために、−２０℃で凍結した。
Promega（ウィスコンシン州マディソン）のＡ２４９５プラスミド中型プラスミド精製システムを使用してプラスミド精製を行った。溶液の組成は以下の通りである：
細胞再懸濁溶液：５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ；
細胞溶解液：０．２Ｍの水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ；
中和溶液：４．０９Ｍの塩酸グアニジン、７５９ｍＭの酢酸カリウム、２．１２Ｍの氷酢酸；
カラム洗浄液：１６２．８ｍＭの酢酸カリウム、２２．６ｍＭのトリス、０．１０９ｍＭのＥＤＴＡ。３２０ｍｌに、１７０ｍｌの９５％エタノールを添加する；
Ａ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラムは溶解物の清浄化に使用した；
Ａ２４５Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）結合カラムはプラスミドＤＮＡの精製に使用した。
上記の「チューブＢ」細胞ペレットの８つのチューブに、４．０ｍｌの細胞再懸濁溶液を添加し、激しいボルテックスによって混合した。それから、再懸濁した細菌細胞をＪＭ１０９（ｐｈｍＧＦＰ）の２２５ｍｌのペレットが入った８つのチューブ（チューブＡ）それぞれに移した。それぞれのチューブを激しくボルテックスし、細菌細胞を再懸濁した。１．０ｍｌの細胞再懸濁溶液を「チューブＢ」のそれぞれに添加し、このチューブを洗い流して、再懸濁した細胞をこれらのそれぞれの「チューブＡ」対応物に加え、５ｍｌの再懸濁溶液中に４２５ｍｌの細菌培養物の組合せた細胞集団を得た。チューブＢは廃棄した。
上記のチューブＡそれぞれに、以下のものを加えた：
チューブ１及びチューブ２：浮遊性粒子は加えなかった；
チューブ３及びチューブ４：０．５ｇのＳ６０／１０，０００ Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）ガラス球を加えた；
チューブ５及びチューブ６：１．０ｇのＳ６０／１０，０００ Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）ガラス球を加えた；
チューブ７及びチューブ８：０．５ｇのネットワーク−Ｓ６０粒子を加えた。
それから、５ｍｌの細胞溶解液をチューブＡに添加し、ゆっくりと混合した。その後、１つのチューブ当たり９ｍｌの中和溶液を添加して、ゆっくりと混合した。それぞれ５０ｍｌ容の円錐底チューブに含まれていたＡ２４６Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）除去カラムに、それぞれのチューブの内容物を加えた。この溶液をカラム中に２分間置き、それから２０００×ｇで１０分間遠心分離して、この流入溶液を５０ｍｌ容の円錐チューブで捕捉した。１つの５０ｍｌ容のチューブ当たりの内容物の容量は、
チューブ１、チューブ２＝１２．５ｍｌ、１２．５ｍｌ（共にチューブは目詰まりした）；
チューブ３、チューブ４＝１５．５ｍｌ、１５．５ｍｌ；
チューブ５、チューブ６＝１４．５ｍｌ、１４．５ｍｌ；及び
チューブ７、チューブ８＝１５ｍｌ、１５ｍｌ（チューブ３〜チューブ８は目詰まりしなかった）
であった。
それぞれのチューブの内容物をＡ２４５Ｂ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）結合カラムに加え、その後、このチューブを２０００×ｇで１０分間遠心分離した。この流入溶液を後の使用のために保存した。それぞれのカラムを１０ｍｌのカラム洗浄液（上記）で洗浄し、それからこのチューブを２０００×ｇで１０分間遠心分離した。
プラスミドＤＮＡを５ｍｌの水を添加することで溶離し、それからカラムを１０分間滴下させた後に、５ｍｌの水で２回目の溶離を行なった。その後、このカラムを２０００×ｇで５分間遠心分離した。それから、これまでに保存した溶解流入溶液をそれぞれの結合カラムに添加することによって、この結合カラムを再利用した。上記のようにカラムをカラム洗浄液で洗浄し、上記のようにＤＮＡを溶離させた。結果を以下の表に示す：
Figure 2009500019
核酸が精製のための所望の標的でない場合、所望の非核酸産物の精製前に、残屑並びに望ましくない核酸を取り除くのに浮遊性粒子を使用することができる。
Ｈ５０ Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）ガラス球と、ＰＶＤＦ浮遊性粒子と、ＨＤＰＥ浮遊性粒子と、Ｓ６０ Ｓｃｏｔｃｈｌｉｔｅ（商標）粒子と、（粒子なしと、遠心分離対照と）を用いた植物材料からのＤＮＡの精製
PromegaのＷｉｚａｒｄ（登録商標）食品用磁性ＤＮＡ精製システム（カタログ番号ＦＦ３７５１、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、ＤＮＡが３．５ｇのＧａｒｄｅｎｂｕｒｇｅｒ（登録商標）菜食主義者用の野菜の寄せ集めのバーガーパテ（Vegie medley-vegan burger patty）（Gardenburger Authentic Foods Company、ユタ州クリアウォーター）から精製された。以下に列挙されたそれぞれの試料を５０ｍｌ容のスクリューキャップチューブで処理した。３．５ｇのGardenburgerの材料（トウモロコシ、ダイズ、エンバク、コムギ、ニンジンを含む）をそれぞれのチューブに加えた。それから、５０μｌのＲＮａｓｅ Ａの添加後、５ｍｌの緩衝液Ａを添加し、内容物を混合した。その後、２．５ｍｌの緩衝液Ｂを添加し、内容物を混合して、２１℃で１０分間インキュベートした。それから、７．０ｍｌの析出溶液を添加し、内容物を混合した。粒子が加えられたチューブに関しては、１つのチューブ当たり０．５ｇの粒子を加えた。それぞれの試料の内容物を混合し、５０ｍｌ容のプラスチック製のスクリューキャップチューブにそれぞれ含まれていたこれらのそれぞれのＰｕｒｅＹｉｅｌｄ除去カラムに滴下した（実施例１５に記載のように）。１分後、チューブ内の除去カラムを２０００×ｇで３０分間回転させた。以下の表に示されるように、チューブの底部に存在する清浄化した溶解物の液量を測定した。
試料に存在する粒子の量を削減するために、「遠心分離対照」に２回目の遠心分離を行う必要があった。除去カラムをそれぞれのチューブから取り外した後、１つのチューブ当たり４００μｌのＭａｇｎｅＳｉｌ（商標）常磁性粒子が加えられた。混合の後、０．８容量のイソプロパノールが添加され（以下の表における容量＋ＭａｇｎｅＳｉｌ（商標）由来の４００μｌの添加）、２１℃で２分、５分、及び１０分後、このチューブを混合した。チューブを１分間マグネティックスタンド上に置いて、それから溶液を廃棄した（ＭａｇｎｅＳｉｌ（商標）常磁性粒子を残した）。マグネティックスタンドから取り除いた後、１つのチューブ当たり５ｍｌの緩衝液Ｂを添加し、混合した。このチューブをマグネティックスタンド上に戻し、１分後に溶液を廃棄した。マグネティックスタンドから取り除いた後、（１つのチューブ当たり）１５ｍｌの７０％（容量／容量）エタノール／水を洗浄液として添加した。このチューブをマグネティックスタンド上に置き、１分後に溶液を廃棄した。合計で３回洗浄するために７０％エタノールの洗浄工程を２回繰り返した。最後の洗浄液を廃棄した後、チューブをマグネティックラック上に置いたまま２１℃で４５分間空気乾燥させた。このチューブをマグネティックラックから取り出し、ＭａｇｎｅＳｉｌ（商標）常磁性粒子を５００μｌのヌクレアーゼ無含有水で２１℃で１５分間溶離した。このチューブをマグネティックスタンド上に戻し、１分後に、溶離したＤＮＡを含む溶液をそれぞれのチューブから取り出し、これらの１．５ｍｌ容のプラスチック製のチューブそれぞれに入れた。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）（Invitrogen、カルフォルニア州カールスバッド）を用いて、１つの試料当たりの全ＤＮＡ（ｎｇ）を測定した。結果を以下に示す：
Figure 2009500019

Claims (42)

  1. 生物材料の溶解物を清浄化する（clearing：除去処理する）ための浮遊性粒子のネットワークであって、
    互いに共有結合した２つ以上の浮遊性粒子を含み、該ネットワークが該ネットワークの最長寸法（longest dimension）に沿って約３０μｍ〜約１ｃｍの大きさに及ぶ、生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワーク。
  2. 前記浮遊性粒子がシリカ又はシリカ含有表面を有する、請求項１に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワーク。
  3. 約１．２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有する、請求項１に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワーク。
  4. 前記ネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約１ｍｍの大きさに及ぶ、請求項１に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワーク。
  5. 前記ネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約５００μｍの大きさに及ぶ、請求項４に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワーク。
  6. 生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法であって、
    （ａ）ＳｉＯ２を含むアルカリ溶液に少なくとも２つの浮遊性粒子を入れる工程と、
    （ｂ）前記ＳｉＯ２が縮合するように前記溶液に酸を添加する工程であって、前記少なくとも２つの浮遊性粒子が互いに共有結合し、前記浮遊性粒子のネットワークを形成する、添加する工程と
    を含む、生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法。
  7. 前記少なくとも２つの浮遊性粒子がシリカ又はシリカ含有表面を有する、請求項６に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法。
  8. 前記ネットワークが、該ネットワークの最長寸法に沿って約３０μｍ〜約１ｍｍの大きさに及ぶ、請求項７に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法。
  9. 前記ネットワークが、該ネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約５００μｍに及ぶ大きさを有する、請求項８に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法。
  10. 前記ネットワークが、約１．２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有する、請求項６に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法。
  11. 生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法であって、
    （ａ）アルカリ溶液に、シリカ又はシリカ含有表面を有する少なくとも２つの浮遊性粒子を入れる工程と、
    （ｂ）工程（ａ）で得られたものを酸付加塩溶液と組合せる（combining）工程と
    を含む、生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法。
  12. 前記ネットワークが、該ネットワークの最長寸法に沿って約３０μｍ〜約１ｍｍの大きさに及ぶ、請求項１１に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法。
  13. 前記ネットワークが、該ネットワークの最長寸法に沿って約１００μｍ〜約５００μｍに及ぶ大きさを有する、請求項１２に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法。
  14. 前記ネットワークが、約１．２ｇ／ｃｍ３未満の密度を有する、請求項１１に記載の生物材料の溶解物を清浄化するための浮遊性粒子のネットワークを作製する方法。
  15. 標的となる生物材料を単離する方法であって、
    （ａ）浮遊性粒子、浮遊性粒子のネットワーク、又はそれらの混合物を生物材料の試料に加える工程と、
    （ｂ）結合溶液を添加する工程と、
    （ｃ）細胞溶解を行う工程と、
    （ｄ）重力、遠心分離真空濾過、又は正圧濾過によって、標的となる生物材料と非標的の生物材料とを分離する工程と
    を含み、前記結合溶液が、前記標的となる生物材料又は前記非標的の生物材料の選択的吸着を促進するのに十分な濃度で前記浮遊性粒子、前記浮遊性粒子のネットワーク、又はそれらの混合物に添加される、標的となる生物材料を単離する方法。
  16. 前記生物材料の試料が、細菌、植物組織、動物組織、又は動物の体液の少なくとも１つである、請求項１５に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  17. 前記標的となる生物材料を精製する工程をさらに含む、請求項１５に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  18. 前記結合溶液が、カオトロピック及びアルコールの少なくとも一方を含む、請求項１５に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  19. 細胞溶解を行った後に、前記溶液を加熱する工程をさらに含む、請求項１５に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  20. 前記標的となる生物材料がＤＮＡであり、前記非標的の生物材料がＲＮＡである、請求項１５に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  21. 前記標的となる生物材料がＲＮＡであり、前記非標的の生物材料がＤＮＡである、請求項１５に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  22. 前記標的となる生物材料がプラスミドＤＮＡであり、前記非標的の生物材料がゲノムＤＮＡである、請求項１５に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  23. 標的となる生物材料を単離する方法であって、
    （ａ）浮遊性粒子、浮遊性粒子のネットワーク、又はそれらの混合物を溶解した生物材料と混合する工程と、
    （ｂ）結合溶液を添加する工程と、
    （ｃ）重力、遠心分離、真空濾過、又は正圧濾過によって、前記生物材料を分離する工程と
    を含み、前記結合溶液が、前記標的となる生物材料又は前記非標的の生物材料の選択的吸着を促進するのに十分な濃度で前記浮遊性粒子、前記浮遊性粒子のネットワーク、又はそれらの混合物に添加される、標的となる生物材料を単離する方法。
  24. 前記生物材料が、細菌、植物組織、動物組織、又は動物の体液の少なくとも１つである、請求項２３に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  25. 前記標的となる生物材料を精製する工程をさらに含む、請求項２３に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  26. 前記結合溶液が、カオトロピック及びアルコールの少なくとも一方を含む、請求項２３に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  27. 重力又は遠心分離による分離の前に、前記溶液を加熱する工程をさらに含む、請求項２３に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  28. 前記標的となる生物材料がＤＮＡであり、前記非標的の生物材料がＲＮＡである、請求項２３に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  29. 前記標的となる生物材料がＲＮＡであり、前記非標的の生物材料がＤＮＡである、請求項２３に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  30. 前記標的となる生物材料がプラスミドＤＮＡであり、前記非標的の生物材料がゲノムＤＮＡである、請求項２３に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  31. 標的となる生物材料を単離する方法であって、
    （ａ）溶解した生物材料を
    （ｂ）浮遊性粒子、浮遊性粒子のネットワーク、又はそれらの混合物を含む結合溶液と組合せる工程と、
    （ｃ）重力、遠心分離、真空濾過、又は正圧濾過によって、前記生物材料を分離する工程と
    を含み、前記結合溶液が、前記標的となる生物材料又は前記非標的の生物材料の選択的吸着を促進するのに十分な濃度で前記浮遊性粒子、前記浮遊性粒子のネットワーク、又はそれらの混合物に添加される、標的となる生物材料を単離する方法。
  32. 前記生物材料が、細菌、植物組織、動物組織、又は動物の体液の少なくとも１つである、請求項３１に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  33. 前記標的となる生物材料を精製する工程をさらに含む、請求項３１に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  34. 前記結合溶液が、カオトロピック及びアルコールの少なくとも一方を含む、請求項３１に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  35. 重力、遠心分離、真空濾過、又は正圧濾過による分離の前に、前記溶液を加熱する工程をさらに含む、請求項３１に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  36. 前記標的となる生物材料がＤＮＡであり、前記非標的の生物材料がＲＮＡである、請求項３１に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  37. 前記標的となる生物材料がＲＮＡであり、前記非標的の生物材料がＤＮＡである、請求項３１に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  38. 前記標的となる生物材料がプラスミドＤＮＡであり、前記非標的の生物材料がゲノムＤＮＡである、請求項３１に記載の標的となる生物材料を単離する方法。
  39. 溶解液と、浮遊性粒子、浮遊性粒子のネットワーク、並びに浮遊性粒子及び浮遊性粒子のネットワークから成る群より選択される少なくとも１つの成員とを収容している容器を含むキット。
  40. 除去カラム（clearing column）をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
  41. 生物材料の溶解物を清浄化するためのキットであって、
    溶解液を収容している容器と、
    少なくとも１つの他の容器と
    を含み、前記少なくとも１つの他の容器が、少なくとも１つの浮遊性粒子を収容している容器、少なくとも１つの浮遊性粒子のネットワークを収容している容器、並びに少なくとも１つの浮遊性粒子及び少なくとも１つの浮遊性粒子のネットワークを収容している容器から成る群より選択される、生物材料の溶解物を清浄化するためのキット。
  42. 除去カラムをさらに含む、請求項４１に記載の生物材料の溶解物を清浄化するためのキット。
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