JP2009541221A - Biodegradable polymeric MRI contrast agents and their preparation and use - Google Patents
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Abstract
【課題】分解可能な高分子磁気共鳴イメージング造影剤を調製するための新規な方法が開示される。種々の診断法における使用のための規定又は制御された分子量分布の、分解可能な高分子磁気共鳴イメージング造影剤と、これらの薬剤を合成し、使用し、かつ分解するための方法とが開示される。
【解決手段】本発明の種々の観点において開示された高分子造影剤は、分解可能な常磁性ポリジスルフィド化合物であり、延長された血漿保持と、種々の組織、臓器、又は腫瘍における増大された透過性及び保持時間とを示すが、そしてなお身体から迅速に除去され得る。Disclosed is a novel method for preparing degradable polymeric magnetic resonance imaging contrast agents. Disclosed are degradable polymeric magnetic resonance imaging contrast agents of defined or controlled molecular weight distribution for use in various diagnostic methods and methods for synthesizing, using, and degrading these agents. The
The macromolecular contrast agents disclosed in various aspects of the present invention are degradable paramagnetic polydisulfide compounds that have prolonged plasma retention and increased in various tissues, organs, or tumors. Shows permeability and retention time, but can still be quickly removed from the body.
Description
優先権主張
本出願は、２００６年６月１６日出願の、「生分解性高分子ＭＲＩ造影剤並びにその調製及び使用法（ＢＩＯＤＥＧＲＡＤＡＢＬＥ ＭＡＣＲＯＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＭＲＩ ＣＯＮＴＲＡＳＴ ＡＧＥＮＴＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ ＴＨＥＲＯＦ）」に関する米国仮特許出願第６０／８１４，４４９号の出願日の利益を主張する。
Priority Claim This application is a US provisional patent filed on June 16, 2006 for "Biodegradable Macromolecular MRI Contrast Agent and its Preparation and Use (BIODEGRABLE MACROMOLECULAR MRI CONTRAST AGENTS OF METHODS OF PREPARATION AND USE THEOROF)". Claim the benefit of the filing date of application 60 / 814,449.
合衆国政府の支援による研究開発に関する陳述
本明細書に記載の研究は、合衆国国立衛生研究所助成金（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｒａｎｔｓ）ＣＡ０９５８７３により支援された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有してよい。
US Government Assisted Research and Development Statement The work described herein was supported by the National Institute of Health Grants CA 0958873. The United States government may have certain rights in the invention.
本発明は、全般的に、診断用イメージングにおいて使用される生分解性高分子造影剤、並びにかかる化合物を合成し、精製し、使用し、かつ分解する方法に関する。 The present invention relates generally to biodegradable polymeric contrast agents used in diagnostic imaging and methods for synthesizing, purifying, using and degrading such compounds.
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、医療診断用の非侵襲的な方法である。常磁性金属錯体は、正常組織と疾病組織との間のイメージコントラストを増強するための造影剤としてしばしば使用される。診断法において通常使用される常磁性金属イオンは、マンガン（Ｍｎ２＋）、鉄（Ｆｅ３＋）、及びガドリニウム（Ｇｄ３＋）を包含する。Ｇｄ３＋のキレートは、その長い電子緩和時間及び高い磁気モーメントの故に、ＭＲＩ造影剤としてしばしば使用される。低分子ガドリニウム錯体、例えばＧｄ（ＩＩＩ）（ＤＴＰＡ）［ジエチレントリアミンペンタアセテート］、Ｇｄ（ＩＩＩ）（ＤＯＴＡ）［１，４，７，１０−テトラアザドデカン四酢酸］、Ｇｄ（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）（ジエチレントリアミン五酢酸ビスメチルアミド）、及びその誘導体を含む、ガドリニウムを主成分とする造影剤が、臨床診療におけるＭＲＩ用の造影剤として日常的に使用されている。こうした薬剤は、細胞外造影剤であって、血管から細胞外の体液間隙内へ迅速に溢出し、かつ、その小さいサイズの故に組織保持時間が短く、短いイメージングタイムウインドウ及び低いシグナル対ノイズ比を含む、いくつかの不都合を生じる。造影剤の循環及び保持を引き延ばすため、医用高分子へのＧｄ（ＩＩＩ）キレートの化学的コンジュゲーション（非特許文献１）か、又はポリマー主鎖への取込み（非特許文献２）によって造影剤のサイズを増大することに、かなりの量の努力がなされてきた。 Magnetic resonance imaging (MRI) is a non-invasive method for medical diagnosis. Paramagnetic metal complexes are often used as contrast agents to enhance image contrast between normal and diseased tissue. Paramagnetic metal ions commonly used in diagnostic methods include manganese (Mn 2+ ), iron (Fe 3+ ), and gadolinium (Gd 3+ ). Gd 3+ chelates are often used as MRI contrast agents because of their long electron relaxation times and high magnetic moments. Low molecular gadolinium complexes such as Gd (III) (DTPA) [diethylenetriaminepentaacetate], Gd (III) (DOTA) [1,4,7,10-tetraazadodecanetetraacetic acid], Gd (DTPA-BMA) (diethylenetriamine) Contrast agents based on gadolinium, including pentaacetic acid bismethylamide) and derivatives thereof, are routinely used as contrast agents for MRI in clinical practice. These agents are extracellular contrast agents that quickly overflow from the blood vessel into the extracellular fluid gap, and because of their small size, have a short tissue retention time, a short imaging time window and a low signal-to-noise ratio. Several inconveniences occur. In order to prolong the circulation and retention of the contrast agent, chemical conjugation of the Gd (III) chelate to a medical polymer (Non-patent Document 1) or incorporation into the polymer backbone (Non-patent Document 2) A considerable amount of effort has been made to increase the size.
高分子ＭＲＩ造影剤は、長時間循環型又は血液プール剤と呼ばれることもあり、血液プール中でのその長い保持時間の故に特に有用である。例えば、アルブミン−（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）コンジュゲートの半減期は、血中で約３時間である（非特許文献３）。Ｇｄ−ＤＴＰＡ標識デキストラン（分子量 〜７５ｋＤａ）は、ラットでは、Ｇｄ−ＤＴＰＡの１３分間に比較して６．１時間の長い半減期を有する（非特許文献４）。高分子造影剤はまた、小サイズの分子に比較して長い回転時間からの結果として生じる、増大されたプロトンＴ１緩和度も有する（非特許文献５）。増大された透過性及び保持の故に、これらの造影剤は固形腫瘍中に効果的に蓄積し、そしてＭＲ癌イメージングにおけるコントラスト増強に可能性を有する。 Polymeric MRI contrast agents, sometimes referred to as long-circulating or blood pool agents, are particularly useful because of their long retention time in the blood pool. For example, the half-life of albumin- (Gd-DTPA) conjugate is about 3 hours in blood (Non-patent Document 3). Gd-DTPA-labeled dextran (molecular weight ˜75 kDa) has a longer half-life of 6.1 hours in rats compared to 13 minutes for Gd-DTPA (Non-Patent Document 4). Macromolecular contrast agents also have an increased proton T 1 relaxation that results from longer rotation times compared to smaller sized molecules (5). Because of increased permeability and retention, these contrast agents accumulate effectively in solid tumors and have potential for contrast enhancement in MR cancer imaging.
しかしながら、高分子造影剤には、遅い排出と長期間の組織Ｇｄ蓄積とに関連した潜在的毒性があり、そのためそのさらなる開発を妨げている。低いクリアランス速度のため、Ｇｄ高分子剤の使用は、骨及び他の組織中にＧｄの蓄積を生じる結果となり、結果的に毒性及び有害な副作用を生じることがある。高分子ＭＲＩ造影剤のプロトタイプ、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−アルブミンコンジュゲートは、その遅い排出の結果として起こる高いＧｄ蓄積を、骨及び肝臓において示し（非特許文献３）、このことが、エンドサイトーシスによる該薬剤の細胞取込みと、リソゾーム内での低いｐＨ及び酵素的分解に起因するＧｄ−ＤＴＰＡ錯体の解離との可能性を高めた（非特許文献６，７）。Ｇｄの高く長期間の組織蓄積はまた、他の高分子Ｇｄ（ＩＩＩ）錯体についても観察された。Ｇｄ−ＤＯ３Ａの、カルボキシメチルヒドロキシエチルデンプンへのコンジュゲーションが、注射後７日のラットの体内で、注射用量の約４７％が検出された微分子剤（７２ｋＤａ）になったことが報告されている（非特許文献８）。Ｇｄ−ＤＴＰＡポリプロピレンイミンデンドリマー（第２世代）コンジュゲート（７ｋＤａ）は、注射後１４日のラットで、注射した用量の４５％の保持を生じる結果となった（非特許文献９）。造影剤の長期間のインビボの高い蓄積は、キレートからの毒性Ｇｄ（ＩＩＩ）の代謝的放出の可能性を有意に高めている。
However, polymeric contrast agents have potential toxicity associated with slow excretion and long-term tissue Gd accumulation, thus hindering further development. Due to the low clearance rate, the use of Gd polymer agents can result in accumulation of Gd in bone and other tissues, resulting in toxicity and adverse side effects. A prototype of a polymeric MRI contrast agent, (Gd-DTPA) -albumin conjugate, shows high Gd accumulation in bone and liver as a result of its slow excretion (Non-Patent Document 3), which indicates endocytosis. Increased the possibility of cell uptake of the drug by the lysosome and dissociation of the Gd-DTPA complex due to low pH and enzymatic degradation in the lysosome (
本発明者らは最近、高分子剤のインビボ分解によりＧｄキレートの排出を促進するための、ポリジスルフィドＧｄ（ＩＩＩ）錯体を主成分とする生分解性高分子ＭＲＩ造影剤をデザイン及び開発した（非特許文献１０−１２）。ポリマー主鎖中のジスルフィド結合は、遊離の血漿チオール、例えばグルタチオン及びシステインによるか、又は酵素的分解により、迅速に還元可能である。最初のポリジスルフィドＭＲＩ造影剤、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスタミンコポリマー（ＧＤＣＣ）は、臨床的に利用可能なＭＲＩ造影剤、Ｇｄ−（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）よりも、ラットにおいてより有意な血液プールを生じ、次いで血液プールから素早く除去されたことが示されている。ＧＤＣＣは、臨床的に使用されるＧｄ−（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）に匹敵する、最小の長期間Ｇｄ組織蓄積を示した。 The present inventors recently designed and developed a biodegradable polymeric MRI contrast agent based on polydisulfide Gd (III) complex to promote Gd chelate excretion by in vivo degradation of the polymeric agent ( Non-patent literature 10-12). Disulfide bonds in the polymer backbone can be rapidly reduced by free plasma thiols, such as glutathione and cysteine, or by enzymatic degradation. The first polydisulfide MRI contrast agent, (Gd-DTPA) -cystamine copolymer (GDCC), has a more significant blood pool in rats than the clinically available MRI contrast agent, Gd- (DTPA-BMA). It has been shown to have occurred and then quickly removed from the blood pool. GDCC showed minimal long-term Gd tissue accumulation comparable to clinically used Gd- (DTPA-BMA).
ジスルフィド結合の周りの官能基は、常磁性のポリジスルフィド剤の分解速度を調整するため、及び種々の薬物動態学的特性をもつ生分解性高分子剤を調製するために導入されてきた。２つの修飾されたジスルフィドＭＲＩ造影剤、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスチンコポリマー（ＧＤＣＰ）及び（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスチンジエチルエステルコポリマー（ＧＤＣＥＰ）と、コントラスト増強腫瘍ＭＲイメージングにおけるこれらの薬剤の予備的な結果とが、非特許文献１１に報告されている。 Functional groups around disulfide bonds have been introduced to adjust the degradation rate of paramagnetic polydisulfide agents and to prepare biodegradable polymer agents with various pharmacokinetic properties. Two modified disulfide MRI contrast agents, (Gd-DTPA) -cystine copolymer (GDCP) and (Gd-DTPA) -cystine diethyl ester copolymer (GDPEP), and preliminary use of these agents in contrast-enhanced tumor MR imaging The results are reported in Non-Patent Document 11.
本発明は、なかんずく、規定又は制御された分子量及び／又は分子量分布をもつ、分解可能な高分子造影剤を提供する。好ましい実施態様においては、該造影剤はポリジスルフィドを含んでなる。もう１つの好ましい実施多様においては、これらの造影剤は金属、例えば、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、及びＧｄ３＋との錯体である。種々の造影剤の例は、特許文献１、非特許文献１０、非特許文献１１、又は非特許文献１２に開示されている。これらの造影剤は、種々の医学的方法、例えば診断及び治療法において使用可能である。１つの実施態様においては、これらの造影剤は磁気共鳴イメージングにおいて使用される。別の実施態様においては、これらの造影剤はＸ線コンピュータトモグラフィー（断層撮影法）において使用される。別の実施態様においては、分解可能なポリマーは、シンチグラフィー、ポジトロンエミッショントモグラフィ、及び放射線療法用の、放射性金属イオンとキレートを形成し得る。本発明のもう１つの観点においては、造影剤錯体は、標的化分子を包含する。制限なく、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、他のタンパク質、及び他の化学的実体を含む標的化分子の取込みは、標的化能をもつ高分子造影剤を生じる結果となる。
The present invention provides, inter alia, degradable polymeric contrast agents having a defined or controlled molecular weight and / or molecular weight distribution. In a preferred embodiment, the contrast agent comprises polydisulfide. In another preferred implementation variety, these contrast agents are complexes with metals such as Mn 2+ , Fe 3+ , and Gd 3+ . Examples of various contrast agents are disclosed in Patent Literature 1,
本発明は、分解可能な高分子造影剤を、水性媒体中で調製する方法を提供する。好ましい実施態様においては、反応媒体は塩基性水溶液である。重合化用の媒体として水溶液を使用することは、溶液の汚染を避け、また製造のための容易なスケールアップも促進する。 The present invention provides a method for preparing degradable polymeric contrast agents in an aqueous medium. In a preferred embodiment, the reaction medium is a basic aqueous solution. Using an aqueous solution as a polymerization medium avoids solution contamination and also facilitates easy scale-up for manufacturing.
本発明は、分解可能な高分子リガンド及び造影剤を精製する方法を提供する。１つの実施態様においては、該リガンド及び造影剤は、クロマトグラフ法により精製される。もう１つの実施態様においては、該造影剤は限外濾過により精製される。Ｇｄを含んでなる生分解性高分子ＭＲＩ造影剤はまた、造影剤溶液のｐＨを上げて、任意の残留する遊離Ｇｄ（ＩＩＩ）イオンを、Ｇｄ２Ｏ３沈澱として除去することによっても精製可能である。 The present invention provides a method for purifying degradable polymeric ligands and contrast agents. In one embodiment, the ligand and contrast agent are purified by chromatographic methods. In another embodiment, the contrast agent is purified by ultrafiltration. Biodegradable polymeric MRI contrast agents comprising Gd can also be purified by raising the pH of the contrast solution and removing any remaining free Gd (III) ions as Gd 2 O 3 precipitates. It is.
本発明はまた、分解可能な高分子造影剤を分画して、より狭くかつ所望の分子量分布をもつ造影剤を与える方法も提供する。本発明の１つの実施態様においては、造影剤は、サイズ排除クロマトグラフィーのようなクロマトグラフ法により分画される。 The present invention also provides a method for fractionating a degradable polymeric contrast agent to provide a contrast agent having a narrower and desired molecular weight distribution. In one embodiment of the invention, the contrast agent is fractionated by chromatographic methods such as size exclusion chromatography.
本発明はまた、分解可能な高分子造影剤の分子量及び／又は分子量分布を制御する方法も提供する。１つの実施態様においては、造影剤の分子量は、重合化条件、例えば反応温度及び／又は重合化反応体の供給比を変えることにより制御される。 The present invention also provides a method for controlling the molecular weight and / or molecular weight distribution of a degradable polymeric contrast agent. In one embodiment, the molecular weight of the contrast agent is controlled by changing the polymerization conditions, such as the reaction temperature and / or the feed ratio of the polymerization reactants.
本発明は、一種以上の分解可能な高分子造影剤を投与すること、及び磁気共鳴イメージを得ることにより、哺乳類の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための方法を提供する。いくつかの実施態様においては、高分子造影剤は、内在性及び外来性の双方の化合物により分解されることが可能である。１つの実施態様においては、高分子造影剤は、内在性のメルカプタン及び／又は酵素により、小さい安定なキレートへ分解される。 The present invention provides a method for obtaining a magnetic resonance image of a mammalian tissue or organ by administering one or more degradable polymeric contrast agents and obtaining a magnetic resonance image. In some embodiments, the polymeric contrast agent can be degraded by both endogenous and exogenous compounds. In one embodiment, the polymeric contrast agent is degraded to small stable chelates by endogenous mercaptans and / or enzymes.
本発明はまた、一種以上のジスルフィド結合還元化合物か、又は高分子造影剤の分解を刺激する他の化合物を投与することにより、高分子造影剤を分解するか、又は分解を刺激する方法も提供する。１つの実施態様においては、外来性メルカプタンが哺乳類へ送達される。本発明のいくつかの実施態様のもう１つの目的は、高分子造影剤を他の薬剤と組合せて投与することである。様々な観点において、薬学的に許容される薬剤、例えば希釈剤及び担体もまた投与される。 The present invention also provides a method of degrading or stimulating degradation of a polymeric contrast agent by administering one or more disulfide bond reducing compounds or other compounds that stimulate degradation of the polymeric contrast agent. To do. In one embodiment, exogenous mercaptan is delivered to the mammal. Another object of some embodiments of the present invention is to administer a polymeric contrast agent in combination with other agents. In various aspects, pharmaceutically acceptable agents such as diluents and carriers are also administered.
本発明の１つの観点は、哺乳類の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための方法であって、有効量の一種以上の高分子造影剤を該哺乳類に投与すること、及び磁気共鳴イメージを得ることによる該方法を包含する。好ましい実施態様においては、一種以上の高分子造影剤は、内在性メルカプタン及び／又は酵素により分解される。 One aspect of the present invention is a method for obtaining a magnetic resonance image of a mammalian tissue or organ, administering an effective amount of one or more polymeric contrast agents to the mammal, and obtaining the magnetic resonance image. Including the method. In a preferred embodiment, the one or more polymeric contrast agents are degraded by endogenous mercaptans and / or enzymes.
本発明の１つの観点によれば、前記高分子造影剤の分解を刺激する一種以上の化合物もまた投与される。もう１つの観点においては、一種以上のジスルフィド結合還元化合物もまた投与される。ジスルフィド結合還元化合物は、以下の一種以上からなる群より選択される：メルカプタン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ヒドラジン、ホスフィン、亜鉛、スズ（ＩＩ）、硫化ナトリウム、過ギ酸、過酸化水素。 According to one aspect of the invention, one or more compounds that stimulate the degradation of the polymeric contrast agent are also administered. In another aspect, one or more disulfide bond reducing compounds are also administered. The disulfide bond reducing compound is selected from the group consisting of one or more of the following: mercaptan, NADH, NADPH, hydrazine, phosphine, zinc, tin (II), sodium sulfide, performic acid, hydrogen peroxide.
本発明の種々の観点において使用されるメルカプタンは、以下の一種以上からなる群より選択される：システイン及びその誘導体、グルタチオン及びその誘導体、システイニルグリシン及びその誘導体、２，３−ジメルカプトコハク酸その誘導体、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸及びその誘導体、２−メルカプトエタノール、ペニシラミン及びその誘導体、メルカプト酢酸及びその誘導体、メルカプトアニソール、２−メルカプト安息香酸及びその誘導体、４−メルカプト安息香酸及びその誘導体、２−メルカプト−５−ベンズイミダゾールスルホン酸及びその誘導体、２−メルカプトベンゾチアゾール、３−メルカプトイソ酪酸、メルカプトシクロヘキサン、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルアミン、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、３−メルカプト−１−プロパノール、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸、ジエチルジチオカルバメート、ジチオエリトリトール、及びジチオグリコール。 The mercaptan used in the various aspects of the present invention is selected from the group consisting of one or more of the following: cysteine and its derivatives, glutathione and its derivatives, cysteinyl glycine and its derivatives, 2,3-dimercaptosuccin Acid derivatives thereof, 2,3-dimercapto-1-propanesulfonic acid and derivatives thereof, 2-mercaptoethanol, penicillamine and derivatives thereof, mercaptoacetic acid and derivatives thereof, mercaptoanisole, 2-mercaptobenzoic acid and derivatives thereof, 4-mercapto Benzoic acid and its derivatives, 2-mercapto-5-benzimidazolesulfonic acid and its derivatives, 2-mercaptobenzothiazole, 3-mercaptoisobutyric acid, mercaptocyclohexane, 2-mercaptoethanesulfonic acid, 2-mercaptoethylamino 2-mercaptoethylamine hydrochloride, 3-mercapto-1,2-propanediol, 3-mercapto-1-propanesulfonic acid, 3-mercapto-1-propanol, 2-mercaptopropionic acid, 3-mercaptopropionic acid, diethyl Dithiocarbamate, dithioerythritol, and dithioglycol.
本発明の１つの観点によれば、二種以上の高分子造影剤が同時に投与される。１つの実施態様においては、高分子コントラスト製剤は、第１の高分子造影剤と第２の高分子造影剤とを含んでなり、これにおいて該第２の高分子造影剤は、前記第１の高分子造影剤の投与後に投与される。 According to one aspect of the invention, two or more polymeric contrast agents are administered simultaneously. In one embodiment, the polymer contrast formulation comprises a first polymer contrast agent and a second polymer contrast agent, wherein the second polymer contrast agent comprises the first polymer contrast agent. Administered after administration of the polymeric contrast agent.
もう１つの実施態様においては、少なくとも１つの高分子造影剤は、希釈剤、担体、抗体、抗体Ｆａｂ’フラグメント、抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及び送達系からなる群より選択される、一種以上の生理学的に許容される薬剤と一緒に投与される。 In another embodiment, the at least one macromolecular contrast agent is selected from the group consisting of a diluent, a carrier, an antibody, an antibody Fab ′ fragment, an antibody F (ab ′) 2 fragment, and a delivery system. It is administered together with the above physiologically acceptable drugs.
好ましい実施態様においては、少なくとも１つの高分子造影剤は、常磁性金属錯体、放射性金属錯体、治療薬、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、薬物送達系、及び遺伝子送達系からなる群より選択される、一種以上の造影剤と一緒に投与される。 In a preferred embodiment, the at least one polymeric contrast agent is selected from the group consisting of paramagnetic metal complexes, radioactive metal complexes, therapeutic agents, proteins, DNA, RNA, drug delivery systems, and gene delivery systems. It is administered together with the above contrast agents.
本発明のいくつかの実施態様の目的は、制限なく、肝臓、脾臓、肺、心臓、腎臓、腫瘍、卵巣、膵臓、胆管系、腹膜、筋肉、頭部、頸部、食道、骨髄、リンパ節、リンパ管、神経系、脳、脊髄、毛細血管、胃、小腸、及び大腸を含む、健康又は腫瘍性の組織又は臓器の、磁気共鳴イメージを得ることである。 The purpose of some embodiments of the present invention is, without limitation, liver, spleen, lung, heart, kidney, tumor, ovary, pancreas, bile duct, peritoneum, muscle, head, neck, esophagus, bone marrow, lymph node Obtaining magnetic resonance images of healthy or neoplastic tissues or organs, including lymphatic vessels, nervous system, brain, spinal cord, capillaries, stomach, small intestine, and large intestine.
本発明のいくつかの実施態様の目的は、健康又は腫瘍性の組織又は臓器の、磁気共鳴イメージを得るための方法を提供することであり、該方法は、一種以上の造影剤について適当な分子量範囲を選択することを含んでなる。１つの実施態様においては、高い（好ましくは４０ｋＤａより大きい）分子量の造影剤が、心臓及び血管系のイメージングについて、より長くかつ有意なコントラスト増強を提供する。もう１つの実施態様においては、低い（好ましくは４０ｋＤａより小さい）分子量の造影剤が、腫瘍組織において、高分子量の薬剤よりも有意な増強を生じる結果となる。 An object of some embodiments of the present invention is to provide a method for obtaining magnetic resonance images of healthy or neoplastic tissues or organs, the method comprising an appropriate molecular weight for one or more contrast agents. Selecting a range. In one embodiment, high (preferably greater than 40 kDa) molecular weight contrast agents provide longer and significant contrast enhancement for cardiac and vascular imaging. In another embodiment, a low (preferably less than 40 kDa) molecular weight contrast agent results in a significant enhancement in tumor tissue over a high molecular weight agent.
従来、ポリジスルフィドリガンドは、有機溶媒中で調製されており、例えば、ポリジスルフィドリガンドは、ＤＴＰＡジアンヒドリド及びジスルフィド含有ジアミンの、ＤＭＳＯ中での縮合重合により得られる。一般的に有機溶媒は、それらが大規模な製造プロセスにおいて使用される場合は特に、環境にやさしくない。加えて、それはポリジスルフィド剤の適用に先立ち、有機溶媒を除去するための余分の工程を要する。 Conventionally, polydisulfide ligands have been prepared in organic solvents, for example, polydisulfide ligands are obtained by condensation polymerization of DTPA dianhydride and disulfide-containing diamines in DMSO. In general, organic solvents are not environmentally friendly, especially when they are used in large-scale manufacturing processes. In addition, it requires an extra step to remove the organic solvent prior to application of the polydisulfide agent.
本発明は、分解可能な高分子造影剤を水性媒体中で調製する方法であり、したがって、より少ない汚染及びスケールアップの容易さの点で、従来法を超える利点をもつ方法を提供する。好ましくは、該水性媒体は塩基性水溶液である。この新規な方法を用いて、種々の化学構造及び分子量をもつ、ポリジスルフィドＭＲＩ造影剤が首尾よく作成されてきた。例えば、マウスにおけるインビボのＭＲイメージングは、ポリジスルフィドＭＲＩ造影剤が、よりサイズの小さい臨床的に使用された薬剤に比較して、血液プール中で長い保持時間をもつことを示した。これらのポリジスルフィド造影剤は、腫瘍及び他の心臓血管疾患の診断に向けて大いに期待できる。 The present invention is a method for preparing degradable polymeric contrast agents in an aqueous medium and thus provides a method that has advantages over conventional methods in terms of less contamination and ease of scale-up. Preferably, the aqueous medium is a basic aqueous solution. Using this novel method, polydisulfide MRI contrast agents with various chemical structures and molecular weights have been successfully made. For example, in vivo MR imaging in mice showed that polydisulfide MRI contrast agents have a long retention time in the blood pool compared to smaller size clinically used agents. These polydisulfide contrast agents are highly promising for the diagnosis of tumors and other cardiovascular diseases.
本発明は、分解可能な高分子造影剤を調製する方法を提供する。該造影剤は、種々のクロマトグラフ法、例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）、及びＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）により精製可能である。１つの特別の実施態様においては、該造影剤は、Ｇ−２５媒体でパックされたカラムを具備したＳＥＣにより精製される。該造影剤はまた、種々の濾過法、例えば、所望の分子量カットオフをもつフィルターを用いた限外濾過によっても精製可能である。 The present invention provides a method for preparing degradable polymeric contrast agents. The contrast agent can be purified by various chromatographic methods such as HPLC (high performance liquid chromatography), GPC (gel permeation chromatography), and SEC (size exclusion chromatography). In one particular embodiment, the contrast agent is purified by SEC with a column packed with G-25 media. The contrast agent can also be purified by various filtration methods, such as ultrafiltration using a filter with the desired molecular weight cutoff.
本発明はまた、種々の臨床適用のための、様々な分子量、及び／又は狭い分子量分布をもつ、生分解性高分子ＭＲＩ造影剤を調製する方法も提供する。種々の分子量の生分解性高分子ＭＲＩ造影剤は、反応条件を変えることにより、例えば、反応温度を変えることによるか、又は重合化反応体の供給比を変えることにより、容易に制御可能である。反応条件を調整するための方法は、本明細書の実施例に例示されている。他の反応条件、例えば反応媒体のｐＨ、反応時間、反応体の混合速度、及び他の因子もまた、分子量及び／又は分子量分布に影響し得ることに注目されるべきである。 The present invention also provides methods for preparing biodegradable polymeric MRI contrast agents with various molecular weights and / or narrow molecular weight distributions for various clinical applications. Biodegradable polymeric MRI contrast agents of various molecular weights can be easily controlled by changing the reaction conditions, for example, by changing the reaction temperature or by changing the feed ratio of the polymerization reactants . Methods for adjusting the reaction conditions are illustrated in the examples herein. It should be noted that other reaction conditions such as reaction medium pH, reaction time, reactant mixing rate, and other factors may also affect molecular weight and / or molecular weight distribution.
高分子量の生分解性薬剤、例えば、１０８ｋＤａのものは、心臓及び血管系のイメージングについては、対応する低分子量の薬剤よりも、より長くかつ有意なコントラスト増強を提供することが示されている。低分子量のポリマー薬剤、例えば２３ｋＤａのものは、腫瘍組織において、高分子量薬剤よりもさらに有意な増強を生じる結果となった。それ故、本発明はまた、健康又は腫瘍性の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための方法であって、特定の適用に適した分子量をもつ、一種以上の造影剤を選択することを含んでなる該方法も提供する。 High molecular weight biodegradable drugs, such as those of 108 kDa, have been shown to provide longer and significant contrast enhancement for cardiac and vascular imaging than the corresponding low molecular weight drugs. Low molecular weight polymer drugs, such as those of 23 kDa, resulted in a more significant enhancement in tumor tissue than high molecular weight drugs. Thus, the present invention also provides a method for obtaining a magnetic resonance image of a healthy or neoplastic tissue or organ, comprising selecting one or more contrast agents having a molecular weight suitable for a particular application. This method is also provided.
高分子造影剤は、所望よりも広い分子量分布を有してもよい。例えば、常磁性ポリジスルフィドの、その薬物動態及びインビボのコントラスト増強に対するサイズ効果を正確に評価するためには、より狭い分子量分布をもつ常磁性ポリジスルフィドが、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた分画により調製される。限外濾過又は透析といった、他の方法もまた部分的な分画を提供し得ることに注目されるべきである。 The polymeric contrast agent may have a broader molecular weight distribution than desired. For example, to accurately assess the size effect of paramagnetic polydisulfides on their pharmacokinetics and in vivo contrast enhancement, paramagnetic polydisulfides with narrower molecular weight distributions can be obtained by fractionation using size exclusion chromatography. Prepared. It should be noted that other methods, such as ultrafiltration or dialysis, can also provide partial fractionation.
ポリジスルフィド造影剤の構造、電荷、及び／又はサイズが、その分解、薬物動態、及びインビボのコントラスト増強に影響を及ぼし得ることが認識されよう。例えば、ポリジスルフィドＧｄ（ＩＩＩ）錯体、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスチンコポリマー（ＧＤＣＰ）、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−グルタチオン（酸化型）コポリマー（ＧＤＧＰ）、及び（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスチンジエチルエステルコポリマー（ＧＤＣＥＰ）は、マウスにおいて様々に挙動する。これらのポリジスルフィド造影剤の分解、薬物動態、及びインビボのコントラスト増強に関するデータ及び分析は、図５及び６に示され、かつ非特許文献１２において詳述されており、その内容全体は参考として本明細書に含まれている。ポリジスルフィド造影剤の、構造、サイズ、及び／又は電荷の影響は、最適のポリジスルフィドＧｄ（ＩＩＩ）錯体が、構造的最適化によって、種々の臨床適用のための安全かつ効果的な生分解性高分子ＭＲＩ造影剤として、デザイン及び調製され得ることを示唆している。さらに、様々な薬物動態をもつ造影剤が、様々な適用に適切であってよい。一般に、許容できる程度に長い血液循環をもつ薬剤は、コントラスト増強心臓血管イメージング及び癌イメージングにおいてより有効である。それ故、本発明はまた、健康及び腫瘍性の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための方法であって、特別の適用に向け、適当な薬物動態、分解、及び／又はインビボ増強特性をもつ一種以上の造影剤を選択することを含んでなる、該方法も提供する。 It will be appreciated that the structure, charge, and / or size of a polydisulfide contrast agent can affect its degradation, pharmacokinetics, and in vivo contrast enhancement. For example, polydisulfide Gd (III) complex, (Gd-DTPA) -cystine copolymer (GDCP), (Gd-DTPA) -glutathione (oxidized) copolymer (GDGP), and (Gd-DTPA) -cystine diethyl ester copolymer ( GDCEP) behaves differently in mice. Data and analysis on the degradation, pharmacokinetics, and in vivo contrast enhancement of these polydisulfide contrast agents are shown in FIGS. 5 and 6 and are detailed in [12], the entire contents of which are hereby incorporated by reference. Included in the description. The structure, size, and / or charge effects of polydisulfide contrast agents indicate that the optimal polydisulfide Gd (III) complex can be safely and effectively biodegradable for various clinical applications by structural optimization. It suggests that it can be designed and prepared as a polymeric MRI contrast agent. In addition, contrast agents with different pharmacokinetics may be appropriate for different applications. In general, agents with an acceptable long blood circulation are more effective in contrast-enhanced cardiovascular imaging and cancer imaging. Thus, the present invention is also a method for obtaining magnetic resonance images of healthy and neoplastic tissues or organs, with appropriate pharmacokinetic, degradation, and / or in vivo enhancement properties for special applications There is also provided the method comprising selecting one or more contrast agents.
もう１つの観点においては、本発明は、規定又は制御された分子量及び／又は分子量分布をもつ、ポリジスルフィドＭＲＩ造影剤を提供する。本発明のポリジスルフィドＭＲＩ造影剤は、制限なく、米国特許第６，９８２，３２４号、非特許文献１０、非特許文献１１、又は参考文献１２に開示された種々の造影剤を包含する。種々の造影剤の１つの実施態様においては、該造影剤は、水性媒体中で調製される。もう１つの実施態様においては、規定された分子量及び／又は分子量分布の造影剤が、反応条件を変えることにより調製される。もう１つの実施態様においては、狭い分布範囲か、又は所望の分布範囲の造影剤が、限外濾過、サイズ排除、及び透析といった精製又は分画法により調製される。
In another aspect, the present invention provides a polydisulfide MRI contrast agent having a defined or controlled molecular weight and / or molecular weight distribution. The polydisulfide MRI contrast agent of the present invention includes, without limitation, various contrast agents disclosed in US Pat. No. 6,982,324,
もう１つの実施態様においては、本発明は、哺乳類の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための方法であって、有効量の一種以上の高分子造影剤を該哺乳類へ投与すること、及び磁気共鳴イメージを得ることによる方法を提供する。当業者は、磁気共鳴イメージを得るための多くの既知の方法が、科学及び医学の分野に存在することを理解するであろう。１つの好ましい実施態様においては、ＭＲＩ処置はヒト患者に対し行われる。当業者は、制限なく、肝臓、脾臓、肺、食道、骨髄、リンパ節、リンパ管、神経系、脳、脊髄、毛細血管、胃、小腸、大腸を含む、多様な組織又は臓器が、本発明の様々な観点を用いて検査されてよいことを認識するであろう。当業者は、正常組織及び腫瘍のような異常組織の双方が、検査可能であることを認識するであろう。 In another embodiment, the invention provides a method for obtaining a magnetic resonance image of a mammalian tissue or organ comprising administering an effective amount of one or more polymeric contrast agents to the mammal, and magnetic A method is provided by obtaining a resonance image. One skilled in the art will appreciate that many known methods for obtaining magnetic resonance images exist in the scientific and medical fields. In one preferred embodiment, MRI treatment is performed on a human patient. Those skilled in the art will recognize that various tissues or organs including, but not limited to, liver, spleen, lung, esophagus, bone marrow, lymph node, lymphatic vessel, nervous system, brain, spinal cord, capillary, stomach, small intestine, and large intestine are used in the present invention. It will be appreciated that various aspects of the inspection may be used. One skilled in the art will recognize that both normal tissues and abnormal tissues such as tumors can be examined.
本発明のもう１つの観点は、金属錯体を除去する方法に関する。好ましくは、クリアランス処理は、ＭＲＩ処置が完了するか、又は実質的に完了した後に行われる。１つの実施態様においては、メルカプタン又は他の類似の薬剤が、ＭＲＩ処置の後に投与される。種々の実施態様において、これらの薬剤は、高分子主鎖を切断することにより、排出プロセスを促進する。別法として、又は付加的に、ジスルフィド結合の切断によって常磁性金属錯体をポリマー担体から除去することにより、除去を生じる。いくつかの実施態様は、高分子から放出された常磁性金属錯体が、今日臨床的に使用される低分子のコントラスト剤に匹敵する速度で除去され得ることから、特に有利である。 Another aspect of the invention relates to a method for removing a metal complex. Preferably, the clearance process is performed after the MRI procedure is completed or substantially completed. In one embodiment, the mercaptan or other similar agent is administered after the MRI treatment. In various embodiments, these agents facilitate the excretion process by cleaving the polymer backbone. Alternatively or additionally, removal occurs by removing the paramagnetic metal complex from the polymer support by cleavage of disulfide bonds. Some embodiments are particularly advantageous because paramagnetic metal complexes released from macromolecules can be removed at a rate comparable to the low molecular contrast agents used clinically today.
１つの好ましい実施態様においては、該高分子化合物は、固形腫瘍組織中の蓄積には好都合な、延長された血液プール中の保持時間をもち、かつＭＲＩ後に迅速に除去される。これらの高分子剤、及びその記載された方法は、制限なく、血管造影法、プレチスモグラフィー、リンパ管造影法、マンモグラフィー、癌診断、及び機能及び動的ＭＲＩを含む、数多の医学的処置において不可欠なツールであろう。 In one preferred embodiment, the polymeric compound has an extended retention time in the blood pool that favors accumulation in solid tumor tissue and is rapidly removed after MRI. These polymeric agents and the methods described there are numerous medical procedures including, without limitation, angiography, plethysmography, lymphangiography, mammography, cancer diagnosis, and functional and dynamic MRI. Would be an indispensable tool.
本発明は、単なる例として示されかついかなる方法によっても本発明を制限することを意図していない、以下の制限しない実施例においてさらに記載される。 The invention is further described in the following non-limiting examples, which are given by way of example only and are not intended to limit the invention in any way.
ＤＴＰＡ−シスチンコポリマー、ＤＴＰＡ−シスチンジエチルエステルコポリマー、及び常磁性錯体ＧＤＣＰ及びＧＤＣＥＰの調製、ラット血漿中でのＧＤＣＰ及びＧＤＣＥＰの分解、ＭＲイメージング、及びデータ分析の例は、非特許文献１２（ゾング（Ｙ．Ｚｏｎｇ）、キー（Ｔ．Ｋｅ）、モウス（Ａ．Ｍ．Ｍｏｈｓ）、グオ（Ｊ．Ｇｕｏ）、パーカー（Ｄ．Ｌ．Ｐａｒｋｅｒ）、ルー（Ｚ．−Ｒ．Ｌｕ）著、「ポリジスルフィドＧｄ（ＩＩＩ）錯体のインビボのＭＲＩコントラスト増強に対するサイズ及び電荷の影響（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｃｈａｒｇｅ ｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ＭＲＩ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｇｄ（ＩＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリーズ（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．）」、２００６年、第１１２巻、ｐ．３５０−３５６）において提示されており、その内容全体は、参考として本明細書に含まれている。 Examples of preparation of DTPA-cystine copolymer, DTPA-cystine diethyl ester copolymer, and paramagnetic complexes GDCP and GDCEP, degradation of GDCP and GDEP in rat plasma, MR imaging, and data analysis are described in Non-Patent Document 12 (Zong ( Y. Zong, T. Ke, AM Mohs, J. Guo, Parker, Z.-R. Lu, “Poly Effect of size and charge on in vivo MRI contrast enhancement of polydisulphide Gd (III) complex, Journal of disulfide Gd (III) complex in vivo MRI contrast enhancement Of Controlled Releases, 2006, Vol. 112, p. 350-356), the entire contents of which are hereby incorporated by reference. .
実施例１ 水性相におけるポリジスルフィドコポリマーの調製。分子量分布に対する反応温度の影響：
システイン（５ｍｍｏｌ、１．２００ｇ、＞９９％）を、２ｍｌの水溶液中に溶解し、この溶液のｐＨを、室温で、ＮａＯＨを用いて１１に調整した。次に、反応を３つの異なる温度、−１０℃（氷−ＮａＣｌ浴）、０℃（氷水浴）、及び室温において各々行なった。ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸ジアンヒドリド（ＤＴＰＡ−ＤＡ）（５ｍｍｏｌ、１．７８７ｇ）を、素早く攪拌しながら、１時間以内に分割添加した。反応混合物のｐＨは、飽和ＮａＯＨ水溶液で１１に維持した。３０％を超えるＤＴＰＡジアンヒドリドは、一定のｐＨ１１において３０分間で分割添加した。最後の部分のＤＴＰＡ−ＤＡの添加の５分後、１０％（重量で）のＨＣｌを添加して反応混合物のｐＨを７に調整した。コポリマーの分子量分布は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ＴＭを具備したＡＫＴＡＴＭＦＰＬＣシステム（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．）、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を用いて分析した。図１は、異なる温度において調製されたＤＴＰＡシスチンコポリマーの分子量分布を示す。これは、反応温度が分子量分布に対し、有意なインパクトをもつことを示している。高い反応温度は、コポリマーの分子量を増大する。
Example 1 Preparation of polydisulfide copolymer in aqueous phase. Effect of reaction temperature on molecular weight distribution:
Cysteine (5 mmol, 1.200 g,> 99%) was dissolved in 2 ml of aqueous solution and the pH of this solution was adjusted to 11 with NaOH at room temperature. The reaction was then performed at three different temperatures, -10 ° C (ice-NaCl bath), 0 ° C (ice water bath), and room temperature, respectively. Diethylenetriamine-N, N, N ′, N ″, N ″ -pentaacetic acid dianhydride (DTPA-DA) (5 mmol, 1.787 g) was added portionwise within 1 hour with rapid stirring. The pH of the reaction mixture was maintained at 11 with saturated aqueous NaOH. More than 30% DTPA dianhydride was added in portions over 30 minutes at a constant pH of 11. Five minutes after the addition of the last portion of DTPA-DA, 10% (by weight) HCl was added to adjust the pH of the reaction mixture to 7. The molecular weight distribution of the copolymer was analyzed by size exclusion chromatography (SEC) using an AKTA ™ FPLC system equipped with Superose 12 ™ (Amersham Bioscience Corp., Piscataway, NJ). FIG. 1 shows the molecular weight distribution of DTPA cystine copolymers prepared at different temperatures. This indicates that the reaction temperature has a significant impact on the molecular weight distribution. A high reaction temperature increases the molecular weight of the copolymer.
分子量分布に対するＤＴＰＡ−ＤＡ対ジアミンの供給比の影響
シスチン（５ｍｍｏｌ、１．２００ｇ）を２ｍｌの水中に溶解し、室温で、ｐＨをＮａＯＨにより１１に調整した。このシスチン溶液に対し、種々の対シスチンモル比のＤＴＰＡ−ＤＡ（０．９、１．０、１．１、１．２、及び１．３）を、素早く攪拌しながら１．５時間以内に分割添加した。反応混合物のｐＨは、飽和ＮａＯＨ水溶液でｐＨ１１に維持した。最後の部分のＤＴＰＡ−ＤＡの添加の５分後、１０％（重量で）のＨＣｌを添加して反応混合物のｐＨを７に調整した。種々のモル比で調製されたＤＴＰＡ−シスチンコポリマーの分子量を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。表２及び図２参照。シスチンに対する高いモル比（１．２及び１．３）のＤＴＰＡジアンヒドリドは、高い分子量を生じる。コポリマーの分子量は、それ故、モル比の減少と共に減少した。
Effect of DTPA-DA to diamine feed ratio on molecular weight distribution Cystine (5 mmol, 1.200 g) was dissolved in 2 ml of water and the pH was adjusted to 11 with NaOH at room temperature. For this cystine solution, various molar ratios of cystine to DTPA-DA (0.9, 1.0, 1.1, 1.2, and 1.3) were divided within 1.5 hours with rapid stirring. Added. The pH of the reaction mixture was maintained at pH 11 with saturated aqueous NaOH. Five minutes after the addition of the last portion of DTPA-DA, 10% (by weight) HCl was added to adjust the pH of the reaction mixture to 7. The molecular weight of DTPA-cystine copolymers prepared at various molar ratios was analyzed by size exclusion chromatography using a Superose 12 column. See Table 2 and FIG. High molar ratios (1.2 and 1.3) DTPA dianhydride to cystine yield high molecular weights. The molecular weight of the copolymer therefore decreased with decreasing molar ratio.
ＤＴＰＡ−シスチンの共重合：
シスチン（１０ｍｍｏｌ、２．４０３ｇ）を、室温で、ｐＨ１１において、５ｍｌのＮａＯＨ水溶液中に溶解し、次いで混合物を氷水浴中で冷却した。次に、ＤＴＰＡジアンヒドリド（１０ｍｍｏｌ、３．５７３ｇ）を、ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ１１を維持しながら、１時間以内で分割添加した。最後の部分のＤＴＰＡ−ＤＡの添加の５分後、１０％（重量で）のＨＣｌを添加してｐＨを７に調整し、この溶液を、６−８０００Ｄａの分子量カットオフをもつ膜を用いて、脱イオン水に対し２４時間透析した。コポリマー溶液を凍結乾燥し、３．２ｇの無色の固形生成物を得た（５４％）。ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ１２カラムを具備したＡＫＴＡＴＭＦＰＬＣシステムを用いたＳＥＣにより測定された、コポリマーの数（Ｍｎ）及び重量（Ｍｗ）平均分子量は、１８及び３３ｋＤａであった。このシステムは、標準のポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド］（ＰＨＰＭＡ）を用いてキャリブレートした。
DTPA-cystine copolymerization:
Cystine (10 mmol, 2.403 g) was dissolved in 5 ml NaOH aqueous solution at room temperature at pH 11 and then the mixture was cooled in an ice-water bath. Next, DTPA dianhydride (10 mmol, 3.573 g) was added portionwise within 1 hour while maintaining pH 11 using aqueous NaOH. Five minutes after the addition of the last portion of DTPA-DA, 10% (by weight) HCl was added to adjust the pH to 7, and this solution was used with a membrane having a molecular weight cut-off of 6-8000 Da. Dialyzed against deionized water for 24 hours. The copolymer solution was lyophilized to give 3.2 g of a colorless solid product (54%). The number of copolymers (Mn) and weight (Mw) average molecular weights as determined by SEC using an AKTA ™ FPLC system equipped with a Superose ™ 12 column were 18 and 33 kDa. The system was calibrated using standard poly [N- (2-hydroxypropyl) methylacrylamide] (PHPMA).
ＤＴＰＡ−グルタチオン（酸化型）の共重合：
グルタチオン（８ｍｍｏｌ、４．９０１ｇ酸化型）を、室温で、ｐＨ１１において、５ｍｌのＮａＯＨ水溶液中に溶解し、次いで混合物を氷水浴中で冷却した。次に、ＤＴＰＡジアンヒドリド（８ｍｍｏｌ、２．８５０ｇ）を、ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ１１を維持しながら、１時間以内に分割添加した。最後の部分のＤＴＰＡ−ＤＡの添加の５分後、１０％（重量で）のＨＣｌを添加してｐＨを７に調整し、この溶液を、６−８０００Ｄａの分子量カットオフをもつ膜を用いて、脱イオン水に対し２４時間透析した。コポリマー溶液を凍結乾燥し、４．００ｇの無色の固形生成物を得た（５２％）。ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ６カラムを具備したＡＫＴＡＴＭＦＰＬＣシステムを用いたＳＥＣにより測定された、コポリマーの数（Ｍｎ）及び重量（Ｍｗ）平均分子量は、３７及び６１ｋＤａであった。
DTPA-glutathione (oxidized) copolymerization:
Glutathione (8 mmol, 4.901 g oxidized form) was dissolved in 5 ml NaOH aqueous solution at room temperature at pH 11 and then the mixture was cooled in an ice-water bath. Next, DTPA dianhydride (8 mmol, 2.850 g) was added portionwise within 1 hour while maintaining pH 11 using aqueous NaOH. Five minutes after the addition of the last portion of DTPA-DA, 10% (by weight) HCl was added to adjust the pH to 7, and this solution was used with a membrane having a molecular weight cut-off of 6-8000 Da. Dialyzed against deionized water for 24 hours. The copolymer solution was lyophilized to give 4.00 g of a colorless solid product (52%). The number of copolymers (Mn) and weight (Mw) average molecular weights, determined by SEC using an AKTA ™ FPLC system equipped with a
ＤＴＰＡ及びシスタミンの共重合：
シスタミン塩酸塩（５ｍｍｏｌ、１．１２６ｇ）を、室温において、２ｍｌの脱イオン水中に溶解し、飽和ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを１１に維持した。次いでＤＴＰＡジアンヒドリド（６ｍｍｏｌ、２．１４４ｇ）を、素早い攪拌下に、ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ１１を維持しながら、室温で１時間以内に分割添加した。最後の部分のＤＴＰＡ−ＤＡの添加の５分後、１０％（重量で）のＨＣｌを添加してｐＨを７に調整し、この溶液を、６−８０００Ｄａの分子量カットオフをもつ膜を用いて、脱イオン水に対し２４時間透析した。コポリマー溶液を凍結乾燥し、１．４６ｇの無色の固形生成物を得た（５０％）。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムを具備したＡＫＴＡＴＭＦＰＬＣシステムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定された、コポリマーの数（Ｍｎ）及び重量（Ｍｗ）平均分子量は、３５及び４２Ｄａであった。
Copolymerization of DTPA and cystamine:
Cystamine hydrochloride (5 mmol, 1.126 g) was dissolved in 2 ml of deionized water at room temperature and the pH was maintained at 11 using saturated aqueous NaOH. DTPA dianhydride (6 mmol, 2.144 g) was then added portionwise within 1 hour at room temperature under rapid stirring while maintaining pH 11 with aqueous NaOH. Five minutes after the addition of the last portion of DTPA-DA, 10% (by weight) HCl was added to adjust the pH to 7, and this solution was used with a membrane having a molecular weight cut-off of 6-8000 Da. Dialyzed against deionized water for 24 hours. The copolymer solution was lyophilized to give 1.46 g of a colorless solid product (50%). The number of copolymers (Mn) and weight (Mw) average molecular weights as measured by size exclusion chromatography (SEC) using an AKTA ™ FPLC system equipped with a
実施例２ 常磁性ポリジスルフィドコポリマー錯体の調製。ＤＴＰＡジスルフィドコポリマーの、Ｇｄ３＋との錯化：
常磁性錯体、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスチンコポリマー（ＧＤＣＰ）、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−グルタチオンコポリマー（ＧＤＧＰ）、及び（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスタミン（ＧＤＣＣ）は、ＤＴＰＡ−シスチンコポリマー（ＤＣＰ）、ＤＴＰＡ−グルタチオンコポリマー（ＤＧＰ）、及びＤＴＰＡ−シスタミンコポリマー（ＤＣＣ）を、各々Ｇｄ３＋との錯化により調製した。手短にいえば、０．５ｇのＤＣＰ又はＤＧＰ又はＤＣＣを、脱イオン水中に溶解した。キシレノールオレンジを、遊離Ｇｄ３＋の指示薬として添加することができる。次いで、ｐＨ５．５−６．０において、わずかに過剰のＧｄ（ＯＡｃ）３を、この溶液に対しその色が橙色から赤色に変わるまで添加した。次に、５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを１０に調整して、過剰のＧｄ３＋をＧｄ２Ｏ３として沈澱した。遠心分離の後、上清を収集し、乾燥して、ＧＤＣＰ又はＧＤＧＰ又はＧＤＣＣを得た。
Example 2 Preparation of paramagnetic polydisulfide copolymer complex. Complexation of DTPA disulfide copolymer with Gd 3+ :
Paramagnetic complexes, (Gd-DTPA) -cystine copolymer (GDCP), (Gd-DTPA) -glutathione copolymer (GDGP), and (Gd-DTPA) -cystamine (GDCC) are DTPA-cystine copolymer (DCP), DTPA. -Glutathione copolymer (DGP) and DTPA-cystamine copolymer (DCC) were each prepared by complexation with Gd3 + . Briefly, 0.5 g DCP or DGP or DCC was dissolved in deionized water. Xylenol orange can be added as an indicator of free Gd 3+ . Then, at pH 5.5-6.0, a slight excess of Gd (OAc) 3 was added to the solution until its color changed from orange to red. The pH was then adjusted to 10 with 5M NaOH to precipitate excess Gd 3+ as Gd 2 O 3 . After centrifugation, the supernatant was collected and dried to obtain GDCP or GDGP or GDCC.
実施例３ 常磁性ポリジスルフィドコポリマー錯体の精製
常磁性ポリジスルフィドコポリマー錯体の精製は、さらに、クロマトグラフ法によるか、又は限外濾過法により、残留Ｇｄ３＋を除去するためのクエン酸の存在下に行った。
Example 3 Purification of Paramagnetic Polydisulfide Copolymer Complex The purification of the paramagnetic polydisulfide copolymer complex can be further purified by chromatographic methods or by ultrafiltration in the presence of citric acid to remove residual Gd 3+. went.
第１の精製方法においては、Ｇ−２５媒体でパックされたカラムによるサイズ排除クロマトグラフィーにより、遊離のＧｄ３＋を除去した。カラムは純水で溶出し、ポリマー分画を収集した。 In the first purification method, free Gd 3+ was removed by size exclusion chromatography on a column packed with G-25 medium. The column was eluted with pure water and the polymer fraction was collected.
第２の方法においては、ＭＷＣＯ＝１００００Ｄａ（タンパク質）の半透性膜を具備した限外濾過チャンバー内にポリマー溶液を入れた。この溶液を、加圧下に攪拌し、チャンバー内で数回希釈した。濃縮されたポリマー溶液を乾燥するまで蒸発させた。限外濾過で精製されたポリマーからのＳＥＣプロフィールは、ＳＥＣにより精製されたものと類似していた（図３）。 In the second method, the polymer solution was placed in an ultrafiltration chamber equipped with a semipermeable membrane with MWCO = 10000 Da (protein). This solution was stirred under pressure and diluted several times in the chamber. The concentrated polymer solution was evaporated to dryness. The SEC profile from the polymer purified by ultrafiltration was similar to that purified by SEC (Figure 3).
実施例４ 常磁性ポリジスルフィドコポリマー錯体の分画
ポリジスルフィドＧｄ−ＤＴＰＡ錯体の分画は、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）により、Ｈｉｌｏａｄ（ハイロード）ＴＭ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（スーパーデックス）ＴＭ２００、又はＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ６ ＸＫ５０／１００調製用グレードカラム（アマシャム・バイオサイエンス）を具備した、ＡＫＴＡＴＭＦＰＬＣシステムを用いて行なった。手短にいえば、５０ｍｇのＧＤＣＰ又はＧＤＧＰを水中に溶解し、前述のカラムに負荷した。流相は、０．０２Ｍのトリス緩衝液ｐＨ７．４であり、流速は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ＴＭ２００カラムでは６０ｍｌ／時間、ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ６カラムでは５．０ｍｌ／分であった。分画を収集し、その分子量を、ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ６カラムを具備したＳＥＣにより測定した（表３）。ポリジスルフィド造影剤のＧｄ含有量は、誘導結合プラズマ発光分光分析（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を用いて測定した。
Example 4 Fractionation of Paramagnetic Polydisulfide Copolymer Complex Fractionation of polydisulfide Gd-DTPA complex was determined by SEC (size exclusion chromatography) using the
ＡＫＴＡｐｒｉｍｅＴＭプラスＦＰＬＣ及びＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ６調製用グレードＸＫ５０／１００カラムを用いた、Ｇｄ−ＤＴＰＡシスタミン錯体（ＧＤＣＣ）の分画のための方法は、以下のように示される：（１）分画に先立ち、ＦＰＬＣのポンプを、トリス緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて洗浄し、次いで、カラムを、同じ緩衝液を用いて、全１８時間にわたり４．５ｍｌ／分で洗浄する。（２）２．７ｍｌのＧｄ−ＤＴＰＡシスタミンコポリマー溶液を、２５０ｍｇの凍結乾燥ポリマー／ｍｌの脱イオン水、の濃度に調製し、次いで、０．２μＬのフィルターを通してＦＰＬＣへ注入する。流速を５．０ｍｌ／分にセットする。（３）最初の７００ｍｌの溶出液を捨て、以後の１２００ｍｌ中の分画を収集する。各分画は、２０ｍｌの溶出液を含有する。
The method for fractionation of Gd-DTPA cystamine complex (GDCC) using AKTAprime ™ plus FPLC and
Ｇｄ−ＤＴＰＡシスタミン錯体の分画のキャラクタリゼーションは、ＡＫＴＡ Ｐ−９２０ ＦＰＬＣ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ １０／２００ ＧＬカラム、及びＫｎａｕｅｒＲＩ検出器により、ＰＨＰＭＡを標準として用いて行なう。流速は５．０ｍｌ／分にセットする。主要な分画のキャラクタリゼーションを図４に示す。いくつかの組合せた分画、及び分画の、数平均、重量平均分子量、及び多分散指数（ＰＤＩ）を、表４にリストする。
The characterization of the fraction of Gd-DTPA cystamine complex is AKTA P-920 FPLC,
実施例５ ＭＲイメージングにおけるＧｄ−含有ポリジスルフィドＭＲＩ造影剤の適用
ＧＤＣＰ及びＧＤＧＰによるインビボのコントラスト増強を、ヒト乳癌（ＭＢ−２３１）をもつ雌の無胸腺ヌードマウス（チャールズ・リバー・ラボ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ））において、ヒトのリストコイルを具備したシーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ）Ｔｒｉｏ ３Ｔスキャナーを用いて調べた。マウスは、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋肉内投与により麻酔した。このマウスのコントラスト増強ＭＲイメージを、尾静脈からの、用量０．１ｍｍｏｌ−Ｇｄ／ｋｇにおける造影剤の、注射前、及び注射後２分、５分、１０分、１５分、３０分、及び６０分において、スピンエコーシーケンスを用いて得た。イメージングパラメータは、２．７ｍｓ ＴＥ、７．８ｍｓ ＴＲ、２５℃ＲＦチップアングル、アキシアルスライス厚０．５ｍｍであった。
Example 5 Application of Gd-containing polydisulfide MRI contrast agent in MR imaging In vivo contrast enhancement by GDCP and GDGP was performed in female athymic nude mice with human breast cancer (MB-231) (Charles River Labs). Lab)) using a Siemens Trio 3T scanner equipped with a human wrist coil. Mice were anesthetized by intramuscular administration of a mixture of ketamine (80 mg / kg) and xylazine (12 mg / kg). Contrast-enhanced MR images of the mice were obtained from the tail vein at a dose of 0.1 mmol-Gd / kg of contrast agent before injection and at 2 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 30 minutes and 60 minutes after injection. In minutes, a spin echo sequence was used. Imaging parameters were 2.7 ms TE, 7.8 ms TR, 25 ° C. RF chip angle, and axial slice thickness 0.5 mm.
種々の分子量のＧＤＣＰ及びＧＤＧＰの、注射前及び注射後の種々の時点におけるマウスの、三次元の最大値投影法（ＭＩＰ）ＭＲイメージングが、図５に示されている。強いコントラスト増強が、肝臓、腎臓、及び、心臓及び血管系内の血液において、全ての薬剤について投与２分後に観察され、シグナル強度はその後徐々に減少した。最大のＭＷをもつ双方の薬剤は、３０分まで血管を強く増強し得る。ＧＤＣＰ及びＧＤＧＰの、シグナル強度及び増強持続時間の双方が、分子量と共に増大した。膀胱における漸進的な増強は、全ての化合物について観察され、この薬剤の尿によるクリアランスを示唆している。高分子量の生分解性薬剤（１０８ｋＤａ）は、対応する低分子量の薬剤よりも、さらに延長されかつ有意なコントラスト増強を、心臓及び血管系のイメージングについて提供する。
Three-dimensional maximum projection (MIP) MR imaging of mice at various time points before and after injection of various molecular weights of GDCP and GDGP is shown in FIG. A strong contrast enhancement was observed in the liver, kidney, and blood in the heart and
腫瘍のＴ１強調アキシアルイメージはまた、ヒトのリストコイルにより、１０ｍｓ ＴＥ、４００ｍｓ ＴＲ、９０°ＲＦチップアングル、アキシアルスライス厚２ｍｍでのスピンエコーシーケンスを用いて得られた。Ｔ１強調腫瘍イメージは、ＧＤＣＰ及びＧＤＧＰの双方による強い増強を、注射後２分及び６０分までの腫瘍周辺部において示した（図６）。
腫瘍中心部におけるコントラスト増強は、周辺部よりも弱い。低分子量（２３ｋＤａ）のポリマー薬剤は、高分子量の薬剤よりもより有意な増強を、腫瘍組織において生じる結果となった。
A T1-weighted axial image of the tumor was also obtained with a human wrist coil using a spin echo sequence at 10 ms TE, 400 ms TR, 90 ° RF tip angle,
The contrast enhancement at the center of the tumor is weaker than at the periphery. The low molecular weight (23 kDa) polymer drug resulted in a more significant enhancement in the tumor tissue than the high molecular weight drug.
本発明は、いくつかの実施態様において記載されてきたが、本発明は、本開示の精神及び範囲内において、さらに修飾可能である。本出願はそれ故、本発明のその一般原則を用いての任意の変形、使用、及び適用をカバーすることを意図している。さらに本出願は、本開示からのかかる逸脱を、本発明がそれに属する当該技術分野において既知の又は慣例的なプラクティスの範囲内に入るものとしてカバーすることを意図しており、それらは添付のクレイムの制限内に入る。 While this invention has been described in several embodiments, the present invention can be further modified within the spirit and scope of this disclosure. This application is therefore intended to cover any variations, uses, and adaptations using its general principles of the invention. Furthermore, this application is intended to cover such deviations from this disclosure as being within the scope of known or routine practice in the art to which this invention pertains, which is incorporated in the appended claims. Enter within the limits.
本明細書に引用された、出版物、特許、及び特許出願を含む全ての非特許文献は、あたかも各非特許文献が個別にかつ特別に参考として含まれるべきことが示され、かつその記載全体が本明細書において示されたかのごとく同程度に、参考として本明細書に含まれる。本明細書において議論された非特許文献は、本出願の出願日に先立つその開示についてのみ提供されている。本明細書の何らも、本発明者らが、先行発明の力によって、かかる開示を先んじる権利を与えられないことを承認するものとして解釈されるべきではない。 All non-patent literature, including publications, patents, and patent applications cited herein are indicated as if each non-patent literature should be included individually and specifically as a reference, and the entire description. Are included herein by reference to the same extent as indicated in the specification. The non-patent documents discussed herein are provided solely for their disclosure prior to the filing date of the present application. Nothing herein is to be construed as an admission that the inventors are not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior invention.
Claims (23)
反応条件を選択することを含んでなり、これにおいて前記反応条件が、該造影剤の分子量及び／又は分子量分布を決定する該方法。 A method for preparing a polydisulfide contrast agent comprising:
Selecting the reaction conditions, wherein the reaction conditions determine the molecular weight and / or molecular weight distribution of the contrast agent.
サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、及び／又は透析により、該造影剤を精製することを含んでなる該方法。 The method of claim 1, 3 or 4, wherein:
The method comprising purifying the contrast agent by size exclusion chromatography, ultrafiltration, and / or dialysis.
サイズ排除クロマトグラフィーにより該造影剤を分画することを含んでなる該方法。 The method of claim 1, 3 or 4, wherein:
The method comprising fractionating the contrast agent by size exclusion chromatography.
少なくとも１つの反応体を反応媒体中に溶解すること、
該反応媒体のｐＨを必要に応じて調整すること、
少なくとも１つの他の反応体を該反応媒体に添加すること、
該反応体及び該反応媒体を、一定時間にわたり攪拌すること、及び
該反応媒体のｐＨを必要に応じて調整すること、
を含んでなる該方法。 The method of claim 1, 3 or 4, wherein:
Dissolving at least one reactant in a reaction medium;
Adjusting the pH of the reaction medium as necessary,
Adding at least one other reactant to the reaction medium;
Stirring the reactants and the reaction medium for a period of time, and adjusting the pH of the reaction medium as needed;
The method comprising.
ｐＨ＝１０又は＞１０において、過剰のＧｄ３+を沈澱することを含んでなる該方法。 4. The method of claim 3, further comprising:
The method comprising precipitating excess Gd 3+ at pH = 10 or> 10.
該反応体の結果として得られた生成物を凍結乾燥することを含んでなる該方法。 10. The method of claim 9, further comprising:
The process comprising lyophilizing the product resulting from the reactants.
該反応体の結果として得られた生成物を、透析、クロマトグラフィー、及び／又は限外濾過により精製することを含んでなる該方法。 10. The method of claim 9, further comprising:
The method comprising purifying the product resulting from the reactants by dialysis, chromatography, and / or ultrafiltration.
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて造影剤を分画することを含んでなる方法。 10. The method of claim 9, further comprising:
A method comprising fractionating a contrast agent using size exclusion chromatography.
請求項１６の造影剤か、又はその薬学的に許容される塩、或いは請求項１６の造影剤を一種以上の薬学的に許容される薬剤と一緒に、哺乳類に投与することを含んでなる該方法。 A method of applying the contrast agent of claim 16 in a medical method comprising:
17. The contrast agent of claim 16, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the contrast agent of claim 16, comprising administering to a mammal together with one or more pharmaceutically acceptable agents. Method.
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