JP2009229714A - コヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートおよびその製造方法、コヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置、並びに、コヒーレント・ラマン顕微鏡の調整法 - Google Patents

Abstract

【課題】コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を客観的かつ定量的に評価できる解像度評価用チャートを提供する。
【解決手段】コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャート１０であって、照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板１１と、基板１１上に二次元的に形成され、基板１１とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層１２と、を有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートおよびその製造方法、コヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置、並びに、コヒーレント・ラマン顕微鏡の調整法に関するものである。

光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されている。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。

このような背景の中、様々な分光過程を用いた高機能な顕微鏡が提案され、試料の形状のみならず、試料に含まれている分子の同定や構造解析が可能となっている。その中でも、生体試料や工業材料を染色せずに、それらの光応答を観測することにより、構造を解析するラマン分光法が存在し、顕微鏡分野への応用が期待されている（例えば、特許文献１参照）。

ラマン分光とは、ラマン効果と呼ばれている一種の非線型光学効果を基礎にしている。強いフォトンフラックスで光が分子や原子に散乱されると、分子の量子状態が変化して、それらの系全体のエネルギーが変化する。そのとき、変化したエネルギー分が散乱された光子に移行し、結果として入射した光と異なる波長の光が発生する。このような現象をラマン散乱と言う。このラマン散乱には、（１）非共鳴ラマン散乱、（２）真正共鳴ラマン散乱、（３）前期共鳴ラマン散乱、（４）コヒーレント・ラマン散乱がある。以下、これらのラマン散乱について、図５および図６を参照して、さらに詳細に説明する。

図５（ａ）は、非共鳴ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。非共鳴ラマン散乱は、原子および分子の立場からみると、２次の摂動論で説明できる。すなわち、図５（ａ）に示すように、Ｓ（imaginary）と言う仮想的な量子準位を仮定した一種の２光子過程である。この２光子励起過程では、最低電子状態で、かつ最低振動回転準位、すなわち基底状態Ｓ０にあった分子は、例えば、非常に強いレーザ光で、一度、仮想的な量子準位Ｓ（imaginary）に励起され、その後、最低電子状態の高い振動回転準位（Ｖ２）に脱励起する。結果的には、図５（ａ）から明らかなように、入射した光が、原子または分子に、（Ｅｉ−Ｅ０）の光子エネルギーを与え、非共鳴ラマン散乱後は、光はその分、光子エネルギーを損失して、見かけ上、光の波長がλ１であったのが、長波長のλ２に変化して散乱される。一般に、非共鳴ラマン散乱を含む仮想的な量子準位を前提とした２光子過程は、極めて遷移確率が小さく、この過程を誘発するためには、フェムト秒オーダの超短パルスレーザを必要とする場合もある。

図５（ｂ）は、真正共鳴ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。真正共鳴ラマン散乱は、非共鳴ラマン散乱が特殊な条件を満たす場合の散乱過程で、図５（ａ）に示すように、Ｓ（imaginary）が、実在する第１電子励起状態Ｓ１に一致した場合である。この場合は、基底状態Ｓ０の分子が、実在する第１電子励起状態Ｓ１に励起され、その後、最低電子状態の高い振動回転準位（Ｖ２）に脱励起する過程に対応する。見かけ上、図１（ｂ）に示すように、あたかもＳ０→Ｓ１励起後、λ２という蛍光を発光する過程と一致する。この真正共鳴ラマン散乱は、実在する量子状態を利用するので、極めて散乱確率が高く、非共鳴ラマン散乱と比較すると格段に強い光強度でラマン散乱を発現できる。

図５（ｃ）は、前期共鳴ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。前期共鳴ラマン散乱は、真正共鳴ラマン散乱と非共鳴ラマン散乱との中間の性質をもつ。すなわち、第１電子励起状態Ｓ１の近傍にＳ（imaginary）が存在する場合である。

図６は、コヒーレント・ラマン散乱を説明する図で、図６（ａ）はコヒーレント・アンチストークスラマン散乱（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering；CARS）のエネルギーダイアグラム、図６（ｂ）はコヒーレント・ストークスラマン散乱（Coherent Stokes Raman Scattering；CSRS）のエネルギーダイアグラムである。コヒーレント・ラマン散乱（Coherent Raman Scattering）は、時間領域で振動ダイナミクスを研究する手段の一つで、実験および理論の両側面から様々な研究が行われている。

このコヒーレント・ラマン散乱は、三次の非線形光学過程の一つで、一般に角振動数の異なる二つのレーザ光（ω１光、ω２光）を用いる。はじめに分子と相互作用するω１光およびω２光のレーザ光は、ポンプ光およびストークス光とも呼ばれる。これら二つの入射光の角振動数差が、試料分子の持つ振動モードの角振動数Ωと一致すると、多数の試料分子の振動モードが共鳴的に、かつ位相を揃えて、すなわちコヒーレントに励振される。発生した振動分極は、位相緩和時間の間持続しているので、その間にプローブ光であるもう一つのω１光と分子が相互作用することにより、三次の非線形分極に由来する分極波としてコヒーレント・ラマン散乱光を取り出すことができる。

すなわち、ポンプ光およびストークス光と、プローブ光との間の遅延時間を変化させることにより、分子振動の位相緩和時間に関する情報を得ることができる。特に、図６（ａ）に示すように、振動数が＋Ω大きくなったラマン散乱光は、ＣＡＲＳと呼ばれる。また、図６（ｂ）に示すように、振動数が−Ω小さくなったラマン散乱光は、ＣＳＲＳと呼ばれる。特に、ＣＡＲＳの場合は、励起光より短波長側で信号光を検出するので、自家蛍光によるバックグラウンド等の影響を受けにくく、良好なＳ／Ｎで信号光を検出できることから、近年では、分光分析型顕微鏡等に幅広く適用され始めている。

このように、ＣＡＲＳ過程は、非線形光学過程であるため、レーザ光、すなわちポンプ光（プローブ光）およびストークス光が強く集光された特定の微小３次元部分からのみ信号光が発生する。その結果、共焦点顕微鏡のようにピンホールを導入する必要がなく、走査型レーザ顕微鏡にＣＡＲＳ過程を導入することにより、本質的に高い三次元空間分解能を実現することができる。しかも、無染色で生物試料を観察できることから、その商品化が強く期待できる。

特表２００２−５２０６１２号公報

ところで、通常の光学顕微鏡では、例えば、蛍光顕微鏡や透過型明視野顕微鏡のように、照明光と信号光とが比例する。しかも、複数の波長の光を精度良く同じ空間に集光する必要もないので、顕微鏡の組み立て・調整、および観察時の微調整も煩雑ではなく、ユーザフレンドリの顕微鏡システムを提供できた。加えて、空間形状が精度良くキャリブレーションされたテストチャート（顕微鏡解像度チャート）がある。したがって、この顕微鏡解像度チャートを観察しながら光学調整を行うことにより、結像性能の最適化が可能となる。具体的には、図７（ａ）に示すように、顕微鏡解像度チャート１００に形成された波長オーダの細線パターンを観察して、図７（ｂ）に示すように、画像計測することにより、コントラス伝達関数や２次元点像分布関数を定量的に評価できる。これらの評価物理量を最適化するように、顕微鏡対物レンズの選定、光軸調整、検出器の調整、ステージ走査機構のチェックといった綿密なシステム調整（顕微鏡調整）が簡単にできる。

しかしながら、コヒーレント・ラマン過程を用いた顕微鏡法では、状況を異にする。確かに、上述したように、コヒーレント・ラマン過程を用いた顕微鏡、特に、ＣＡＲＳ顕微鏡は、通常の光学顕微鏡にない優れた機能を有しているが、これを実現するためのシステム調整には難しい面がある。その主な理由としては、コヒーレント・ラマン過程は、２色の光源を用いた３次の非線形光学効果を用いているからである。すなわち、ポンプ光強度Ｐ_１、ストークス光強度Ｐ_２とすると、得られるラマン散乱信号すなわち信号強度Ｉは、下記の（１）式で与えられる。

また、最新のより進んだＣＡＲＳ過程を用いた顕微鏡法では、２色の光ではなく、３色の光を用いる、より精密な計測法も研究されつつある。図６において、基底状態から励起するω１の照明光（ポンプ光）と励起振動準位から励起するω１の照明光は、同じ波長の光（プローブ光）を用いていることから、結果的にポンプ光とプローブ光が同じになり、２色の光源となる。しかし、ポンプ光とプローブ波長は異なっても良い。すなわち、プローブ光の波長をω１′とすると、波長ω１′を可変として任意の振動準位に共鳴させ、これによる様々な振動準位が混在する中、特定の振動準位に起因するＣＡＲＳ散乱光を検出する方法である。この様な計測法は、マルチプレックスアンチコヒーレントラマン顕微鏡法と言う。この場合、効率的にＣＡＲＳ散乱光を得るためには、３色の光を完全に同軸で光学調整する必要ある。

（１）式から明らかなように、ラマン散乱の信号強度Ｉは、コヒーレント・ラマン散乱過程が非線形効果のために、試料集光面におけるポンプ光の強度のべき乗とストークス光の強度との積に比例している。したがって、ポンプ光およびストークス光の空間的および時間的領域におけるオーバーラップの状態、またポンプ光およびストークス光の強度によって、ラマン散乱信号の発生条件が大きく変化することになる。より詳しくは、試料集光面近傍で発生する信号空間分布が大きく変化することになる。このため、場合によっては、結像性能が大きく劣化する。例えば、基本的には、ポンプ光およびストークス光は、３次元的に重複していないとラマン信号が得られないため、Ｓ／Ｎが極度に悪くなるだけではなく、点像分布関数が広がり、空間分解能が極端に劣化する。また、ポンプ光およびストークス光の強度調整を誤っても、終状態が飽和して、点像分布関数が大きく変化し、空
間分解能が悪くなる。マルチプレックスＣＡＲＳ顕微鏡法においては、より顕著に調整条件に反映する。

以上のことから明らかなように、ＣＡＲＳ顕微鏡の場合は、通常の顕微鏡よりも、はるかに正確で慎重なシステム調整が要求される。そこで、従来、ＣＡＲＳ顕微鏡では、直径２００ｎｍ程度のポリスチレンビーズの像を基板上に展開し、それを観察することでシステム調整を行っていた。

しかしながら、この従来の調整法では、以下の理由から、厳密な定量評価は不可能である。
（１）基本的には、ポリスチレンビーズを単分散して、孤立したビーズ像を計測するので、顕微鏡性能として最も重要な２点分解能やコントラスト伝達関数など計測できない。
（２）ポリスチレンビーズの径は遠心分離機等で選別されているものの、最大で２０％程度のバラツキがある。

これは、ひとえに、簡便に入手できるＣＡＲＳ顕微鏡対応の解像度評価用チャートが存在していないことに起因する。すなわち、ラマン活性物質を、波長オーダより微細な高い空間制御精度で、２次元または３次元配列した標準サンプルが存在しないことによる。このことが、ＣＡＲＳ顕微鏡システムとしての結像性能評価の作業や、これを基にした調整を不確実で非能率なものにしていた。

したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の第１の目的は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を客観的かつ定量的に評価できる解像度評価用チャートを提供することにある。

さらに、本発明の第２の目的は、上記の解像度評価用チャートを簡単に製造できる製造方法を提供することにある。

さらに、本発明の第３の目的は、コヒーレント・ラマン顕微鏡に用いるのに最適な光源装置を提供することにある。

さらに、本発明の第４の目的は、コヒーレント・ラマン顕微鏡を容易に最適化できる調整法を提供することにある。

上記第１の目的を達成する請求項１に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートであって、
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板と、
該基板上に二次元的に形成され、前記基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層と、
を有することを特徴とするものである。

さらに、上記第１の目的を達成する請求項２に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートであって、
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板と、
該基板上に形成され、前記基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層と、
該ラマン活性層上に二次元的に形成され、前記ラマン活性物質とは異なる振動スペクトルを有し、照明光励起に対して蛍光を発光せず、かつ照明光を反射または吸収するマスク層と、
を有することを特徴とするものである。

請求項３に係る発明は、請求項１または２に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートにおいて、
前記ラマン活性物質は、有機物からなることを特徴とするものである。

請求項４に係る発明は、請求項３に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートにおいて、
前記ラマン活性物質は、ポンプ光およびストークス光の照明光の振動数差に共鳴する振動準位を有する化学基を含むことを特徴とするものである。

請求項５に係る発明は、請求項４に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートにおいて、
前記化学基は、ＣＨ基であることを特徴とするものである。

請求項６に係る発明は、請求項５に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャートにおいて、
前記ラマン活性物質は、ポリエチレンを含むことを特徴とするものである。

さらに、上記第２の目的を達成する請求項７に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートを製造するにあたり、
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板上に、該基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層を形成するラマン活性層形成工程と、
前記基板上に形成された前記ラマン活性層を二次元的に除去してラマン活性層の二次元パターンを形成するパターン形成工程と、
を含むことを特徴とするものである。

さらに、上記第２の目的を達成する請求項８に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートを製造するにあたり、
照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板上に、該基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層を形成するラマン活性層形成工程と、
前記基板上に形成された前記ラマン活性層上に、前記ラマン活性物質とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光せず、かつ照明光を反射または吸収するマスク層を二次元的に形成するマスク層形成工程と、
を含むことを特徴とするものである。

請求項９に係る発明は、請求項７または８に記載の解像度評価用チャートの製造方法において、
前記ラマン活性層形成工程は、有機物からなるラマン活性物質を、スピンコート法またはディップコート法により前記基板上に展開して、前記ラマン活性層を形成することを特徴とするものである。

請求項１０に係る発明は、請求項７に記載の解像度評価用チャートの製造方法において、
前記パターン形成工程は、前記ラマン活性層の二次元パターンを、ナノインプリンティング法により形成することを特徴とするものである。

請求項１１に係る発明は、請求項８に記載の解像度評価用チャートの製造方法において、
前記マスク層形成工程は、前記マスク層を蒸着法により形成することを特徴とするものである。

さらに、上記第３の目的を達成する請求項１２に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡に用いる光源装置であって、
レーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源からのレーザ光を入射して、該レーザ光とともに、該レーザ光よりも長波長側にシフトしたラマン光を出射する有機結晶を含むレーザ媒質と、
を有することを特徴とするものである。

請求項１３に係る発明は、請求項１２に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置において、
前記レーザ媒質からの出射光路中に、１次ラマン光よりも長波長の高次ラマン光成分を除去する分光分散素子を設けたことを特徴とするものである。

請求項１４に係る発明は、請求項１３に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置において、
前記分光分散素子は、多層膜フィルタまたは回折格子からなることを特徴とするものである。

請求項１５に係る発明は、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置において、
前記有機結晶は、ＣＨ基を含むことを特徴とするものである。

請求項１６に係る発明は、請求項１５に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置において、
前記有機結晶は、ポリエチレンを含むことを特徴とするものである。

さらに、上記第４の目的を達成する請求項１７に係る発明は、コヒーレント・ラマン顕微鏡を調整するにあたり、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の解像度評価用チャートを用い、該解像度評価用チャートの顕微鏡画像を撮影して得られるコントラスト伝達関数のコントラスト比が最大となるように調整することを特徴とするものである。

請求項１８に係る発明は、請求項１７に記載コヒーレント・ラマン顕微鏡の調整法において、
前記解像度評価用チャートを顕微鏡観察するための光源装置として、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の光源装置を用いることを特徴とするものである。

本発明の解像度評価用チャートによれば、照明光に対して、ラマン活性物質を含むラマン活性層の２次元パターンを有するので、この解像度評価用チャートの画像をコヒーレント・ラマン顕微鏡で撮影することにより、該コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を客観的かつ定量的に評価することが可能となる。

本発明の解像度評価用チャートの製造方法によれば、基板上に、ラマン活性物質を含むラマン活性層を形成した後、該ラマン活性層を２次元的に除去してラマン活性層の２次元パターンを形成するか、あるいは、基板上にラマン活性層を形成した後、該ラマン活性層上にマスク層を２次元的に形成してラマン活性層の２次元パターンを形成するので、解像度評価用チャートを簡単に製造できる。

本発明のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置によれば、有機結晶を含むレーザ媒質を有し、該レーザ媒質にレーザ光を入射させることにより、入射レーザ光とともに、該レーザ光よりも長波長側にシフトしたラマン光を出射するので、コヒーレント・ラマン顕微鏡に最適な光源装置を提供することが可能となる。

本発明のコヒーレント・ラマン顕微鏡の調整法によれば、ラマン活性物質を含むラマン活性層の２次元パターンを有する解像度評価用チャートを用い、その顕微鏡画像を撮影してコントラスト比が最大となるように調整するので、コヒーレント・ラマン顕微鏡を容易に最適化することが可能となる。

（実施の形態の概要）
先ず、本発明の実施の形態の概要について説明する。本発明者らは、ラマン過程を用いた顕微鏡の結像性能を正確に定量評価可能な標準の解像評価用チャートを考案できれば、これを撮影して顕微鏡画像を解析することにより、コヒーレント・ラマン顕微鏡の性能を最適化できる調整法が可能ではないかと考えた。

そのため、本発明者らは、先ず、コヒーレント・ラマン顕微鏡の標準の解像度評価用チャートを開発した。この解像度評価用チャートは、基本的には、基板上に、ラマン活性物質を含むラマン活性層を２次元展開し、その後、２次元の微細パターンを形成してなる。近年では、生体試料が多くなり、ＣＨ、ＯＨ、ＨＮ、ＣＯＯＨ等の化学基が重要な観察対象となりつつある。このため、解像度評価用チャートの一例としては、ラマン活性物質として有機薄膜を選択し、この有機薄膜を、例えばガラス基板やシリコン基板上にコートする。

有機薄膜は、一例として薄膜化し易いＰＭＭＡ（メタクリル酸メチル）を選択すれば、生体分子に特有なＣＨ、ＣＯＯＨが豊富に含まれているので好ましい。また、ＰＭＭＡは、酢酸エチルなどの化学溶媒や加熱により、容易に溶解させることが可能であり、スピンコート法によりナノメータオーダの均一な厚さの薄膜を２次元展開できる。加えて、可視光領域より長波長側で蛍光が全く出ないので、ラマン分光を行う際、高いＳ／Ｎが期待できる。これは、可視光の波長に対して十分無視でき得る値であり、例えば、深さ方向の分解能評価には最適となる。

また、薄膜形成に関しては、ディップコート法も適応できる。ディップコート法は、融解した有機材料（媒質）に基板を浸して一定速度で引き上げることにより、基板と媒質の間に作用する表面張力によって、基板表面に一定の厚みで媒質を均一に吸着させるもので、その厚みは、基板の引き上げ速度でコントロールすることができる。

スピンコート法もディップコート法も、市販の装置が販売されているので、簡便に、有機薄膜を形成することができる。また、スバッタ法により真空層中で、基板にラマン活性物質を蒸着させて薄膜を形成することもできる。スパッタ法の場合、ラマン活性物質は、有機物に限らず、無機物、半導体、金属であっても、基板上に２次元展開できる利点がある。

基板に平面展開して形成したラマン活性物質を含むラマン活性層は、例えば、微細な２次元パターンに加工する。この加工法としては、電子ビーム法やリソグラフィー法を適用でき、何れも数１０ナノメータレベルのラインおよびスペースからなる細線群のエッチングパターンを描画することができる。この作製精度は、電子顕微鏡で確認できるので、較正が簡単にできる。

このようにして形成した細線群は、通常の光学顕微鏡における回折限界以下のサイズであるので、この細線群の顕微鏡画像を撮影すれば、得られた細線群のコントラストは、顕微鏡単体の光学性能を決定するコントラスト伝達関数となる。したがって、これを評価すれば、顕微鏡単体の結像性能が分かるので、コントラスト伝達関数が与えるコントラスト比が最大になるように顕微鏡システムを調整することができる。具体的には、ポンプ光およびストークス光の励起強度の調整、ポンプ光およびストークス光の光軸調整、光学フィルタの選択調整によるノイズの低減、検出器（例えば、光電子増倍管）の感度調整、顕微鏡対物レンズの調整等を、コントラスト伝達関数を用いて客観的に評価しながら調整することができる。

したがって、上記のようにして作製した解像度評価用チャートを用いることにより、調整者の主観的な評価に頼らず、標準化された作業として、誰もが、簡便にコヒーレント・ラマン顕微鏡を最適化することができる。

なお、２次元の微細パターンの作製に関しては、上記の電子ビーム法やリソグラフィー法のほか、ナノインプリンティング法を適用することもできる。ナノインプリンティング法は、予め作製した２次元の微細パターンの鋳型を、熱溶融性の薄膜層（ラマン活性層）に押し付けることにより、パターンニングする方法である。この方法によれば、簡便にパターンニングできるので、解像度評価用チャートを大量に廉価で供給できる。

また、ラマン活性層を直接加工するのではなく、ラマン活性層の上に、金属性の薄膜を蒸着して微細パターンを形成することも可能である。例えば、ラマン活性層の上に、吸収率の高いクロムや反射率の高い金薄膜をコートしても良い。この場合、金属薄膜でマスクされた領域のラマン活性層には照明光が到達しないので、この領域からはラマン信号は検出されない。

本発明は、さらに、コヒーレント・ラマン顕微鏡に好適な光源装置を提供する。コヒーレント・ラマン顕微鏡では、ポンプ光に対して、検出する化学基の振動周波数だけ相対的にシフトしたラマン散乱光を発生させる。通常は、近赤外のフェムト秒：チタン（Ti）サファイアレーザを用い、その基本波を直接ストークス光として用い、その一部を分岐して光パラメトリック発振器（ＯＰＯ:Optical Parametric Oscillator）等の非線形波長変換光学システムにより波長変換してポンプ光を生成する。この方法は、ポンプ光の波長を可変できることから、あらゆる固有振動数をもつ化学基に対応できるが、大掛かりで、極めて高度な光学調整が求められる。

そこで、本発明者らは、鋭意検討したところ、例えば、代表的な化学基に着目すれば、簡単に安定してポンプ光（プローブ光）およびストークス光を発生できることを見出した。例えば、生体試料に豊富に含まれるＣＨ基に対して顕微鏡調整を行うことを想定した場合は、同様にＣＨ基を含む有機結晶を用いてラマンレーザユニットを作製し、このユニットで波長変換される光を用いる。

例えば、結晶性のポリエチレンを用いた場合、化学結合基はＣＨ基のみなので、入射レーザ光に対して、２９００カイザーほど長波長側にシフトした極めて強いラマンレーザ光が発生する。同時に、その高次倍音波も発生するが、この高次倍音波をフィルタでカットすれば、極めて単色性の高い高強度のレーザ光を発生することができる。したがって、この入射レーザ光とラマンレーザ光を、コヒーレント・ラマン顕微鏡に用いれば、ＯＰＯを用いて波長チューニングすることなく、簡単に、ＣＨ化学基に対するポンプ光（プローブ光）とストークス光を発生することができる。しかも、ラマンレーザ光は、基本的に、励起レーザ光と完全に同期して発生するので、コヒーレント・ラマン顕微鏡に特有な、発生パルスのタイミング調整といった作業も簡略化できる。

このラマンレーザユニットをコヒーレント・ラマン顕微鏡の光源装置として導入すれば、有機物を含む生体試料の観察に活用することができる。さらに、顕微鏡の調整時に、上述したＰＭＭＡのような有機薄膜をラマン活性層に含む解像度評価用チャートを用いた場合は、光源装置からのポンプ光およびストークス光の振動数差と試料の振動数とが完全にマッチして、非常に強いラマン信号が得られるので、特に効果的である。また、ラマン活性層がポリエチレンの薄膜からなる解像度評価用チャートを用いた場合は、ＣＨ振動によるＳ／Ｎが極めて高いラマン信号を得ることができる。したがって、上記の解像度評価用チャートおよび光源装置を用いてコヒーレント・ラマン顕微鏡の調整を行えば、コヒーレント・ラマン顕微鏡を容易に最適化することができる。また、このような解像度評価用チャートおよび光源装置を、コヒーレント・ラマン顕微鏡の生産ラインに導入すれば、標準化された検査法を実現することができる。

以下、具体的な実施の形態について、図を参照して説明する。

（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る解像度評価用チャートを示すもので、図１（ａ）は拡大平面図、図１（ｂ）は要部断面図である。この解像度評価用チャート１０は、コヒーレント・ラマン顕微鏡で用いる照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板１１上に、該基板１１とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層１２の二次元パターンを形成したものである。

図１は、ラマン活性層１２の二次元パターンとして、ライン幅５μｍのラマン活性層１２を５μｍ間隔（スペース）で形成した５μｍパターン部１３ａと、ライン幅３μｍのラマン活性層１２を３μｍ間隔で形成した３μｍパターン部１３ｂと、ライン幅１μｍのラマン活性層１２を１μｍ間隔で形成した１μｍパターン部１３ｃと、ライン幅５００ｎｍのラマン活性層１２を５００ｎｍ間隔で形成した５００ｎｍパターン部１３ｄと、ライン幅２５０ｎｍのラマン活性層１２を２５０ｎｍ間隔で形成した２５０ｎｍパターン部１３ｅと、ライン幅１００ｎｍのラマン活性層１２を１００ｎｍ間隔で形成した１００ｎｍパターン部１３ｆと、ライン幅５０ｎｍのラマン活性層１２を５０ｎｍ間隔で形成した５０ｎｍパターン部１３ｇとを、各ラマン活性層１２のラインが平行となるように形成した場合を示している。なお、各パターン部におけるライン幅および間隔は、模式的に示している。

基板１１は、例えば、コヒーレント・ラマン顕微鏡が一般的に使用する照明光の波長λに対して、深さ方向の分解能（縦分解能）に影響を与えない精度である、λ／２０程度の精度（例えば、１μｍの波長の照明光を用いた場合は、５０ｎｍの精度）で光学研磨したガラス基板を用いる。また、ラマン活性層１２は、図２に示すようなＣＨ基を含むＰＭＭＡをラマン活性物質として用い、このＰＭＭＡをスピンコート法により基板１１上にコートした後、ナノインプリンティングして形成する。

ここで、ＰＭＭＡは、１００℃程度で容易に溶融するので、加工し易く、簡単に製膜できる。また、基板１１の面精度も、一般の光学理論によれば、集光した２次元点像分布関数の形状が大幅に崩れないλ／４程度の平滑性を十分に上回っている。したがって、スピンコートのスピード条件を、例えば、１００００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍの間として、溶解したＰＭＭＡをコーティングすれば、ガラス基板上にＰＭＭＡ膜を１０ｎｍ単位で精度良く形成することができる。これにより、例えば、市販の装置を用いて、図１（ａ）に示したように、５０ｎｍパターン部１３ｇを含むラマン活性層１２の２次元パターンを形成することができる。

特に、ナノインプリンティング法によりラマン活性層１２の２次元パターンを形成する場合、ナノインプリンティング法は、導電体でも絶縁体でも、パターンニングできるので、光学顕微鏡としては十分な形状精度をもつ、コントラスト伝達関数の解像度評価用チャート１０を得ることができる。

したがって、この解像度評価用チャート１０を、コヒーレント・ラマン顕微鏡で撮影して、撮影されたラマン活性層１２の２次元パターンのコントラストを波動光学的に解析すれば、２点分解能、点像分布関数、ディストーション等を定量的に知ることができる。また、コントラスト伝達関数から、ポンプ光（プローブ光）とストークス光との光軸のアライメント状況も把握できる。特に、ナノインプリンティング法によりラマン活性層１２の２次元パターンを形成する場合は、限られた一点（点領域：１００ｎｍのサイズ）のみを残して、周りの有機材料を取り除くことができるので、２次元点像分布関数を直接測定することができる。すなわち、点領域は、照明光の集光サイズが小さいので、ラマン信号で２次元マップした像は、直接、２次元点像分布関数に対応する。

（第２実施の形態）
図３は、本発明の第２実施の形態に係る解像度評価用チャートを示すもので、図３（ａ）は拡大平面図、図３（ｂ）は要部断面図である。この解像度評価用チャート２０は、コヒーレント・ラマン顕微鏡で用いる照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板２１上に、該基板２１とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層２２を形成し、さらに、このラマン活性層２２上に、ラマン活性物質とは異なる振動スペクトルを有し、照明光励起に対して蛍光を発光せず、かつ照明光を反射または吸収するマスク層２３の２次元パターンを形成したものである。

基板２１は、図１に示した基板１１と同様に、例えば、コヒーレント・ラマン顕微鏡が一般的に使用する照明光の波長λに対して、深さ方向の分解能（縦分解能）に影響を与えない精度である、λ／２０程度の精度で光学研磨したガラス基板を用いる。また、ラマン活性層２２は、ＰＭＭＡをラマン活性物質として用い、このＰＭＭＡをスピンコート法により基板２１上に展開して形成する。

本実施の形態は、ラマン活性層２２を直接加工して２次元パターンを形成するのではなく、ラマン活性層２２上に、マスク層２３として、例えば、吸収率の高いクロムや反射率の高い金薄膜の２次元パターンを蒸着により形成して、間接的にラマン活性層２２の２次元パターンを形成する。

図３は、ラマン活性層２２およびマスク層２３の２次元パターンとして、ライン幅５μｍのラマン活性層２２およびマスク層２３を交互に形成した５μｍパターン部２４ａと、ライン幅３μｍのラマン活性層２２およびマスク層２３を交互に形成した３μｍパターン部２４ｂと、ライン幅１μｍのラマン活性層２２およびマスク層２３を交互に形成した１μｍパターン部２４ｃと、ライン幅５００ｎｍのラマン活性層２２およびマスク層２３を交互に形成した５００ｎｍパターン部２４ｄと、ライン幅２５０ｎｍのラマン活性層２２およびマスク層２３を交互に形成した２５０ｎｍパターン部２４ｅと、ライン幅１００ｎｍのラマン活性層２２およびマスク層２３を交互に形成した１００ｎｍパターン部２４ｆと、ライン幅５０ｎｍのラマン活性層２２およびマスク層２３を交互に形成した５０ｎｍパターン部２４ｇとを、各ラマン活性層２２およびマスク層２３のラインが平行となるように形成した場合を示している。なお、各パターン部におけるライン幅および間隔は、図１の場合と同様に、模式的に示している。

したがって、この解像度評価用チャート２０を、コヒーレント・ラマン顕微鏡で撮影して、撮影されたラマン活性層２２の２次元パターンのコントラストを波動光学的に解析すれば、第１実施の形態の解像度評価用チャート１０を用いた場合と同様に、２点分解能、点像分布関数、ディストーション等を定量的に知ることができる。

（第３実施の形態）
図４は、本発明の第３実施の形態に係る光源装置を用いるコヒーレント・ラマン顕微鏡の概略構成を示す図である。このコヒーレント・ラマン顕微鏡は、光源装置３１から出射する照明光を、反射ミラー３２、ビームスプリッタ３３および顕微鏡対物レンズ３４を経て、試料ステージ３５に保持された試料３６に集光する。試料３６からの散乱光は、顕微鏡対物レンズ３４およびビームスプリッタ３３を経て照明光カットフィルタ３７に入射させ、ここで照明光の波長成分をカットした後、分光器３８によりＣＡＲＳ光を取り出して光電子増倍管３９で受光する。なお、試料３６に集光する照明光は、試料ステージ３５または図示しない走査光学系により走査されるようになっている。

本実施の形態に係る光源装置３１は、パルスレーザ光源４１と、このパルスレーザ光源４１からのパルスレーザ光を入射して、入射光のパルスレーザ光、および該パルスレーザ光よりも長波長側にシフトしたラマン光を出射する有機結晶を含むレーザ媒質４２と、レーザ媒質４２からの１次ラマン光よりも長波長の高次ラマン光成分を除去する分光分散素子４３とを有する。

パルスレーザ光源４１は、例えば、尖頭値の高い近赤外のフェムト秒パルスを出射するチタン・サファイアレーザを用いる。レーザ媒質４２は、例えば、結晶化度が高いＣ−ＰＥＴ（結晶化ポリエチレンテレフタレート）を用いる。また、分光分散素子４３は、ハイパスフィルタまたは回折格子を用いる。

このように、レーザ媒質４２としてＣ−ＰＥＴを用いれば、Ｃ−ＰＥＴには、ＣＨ鎖が空間的に規則性をもって配列されているので、誘導ラマン光が生成し易い。例えば、ｃｍ単位のＣ−ＰＥＴブロックの端面を鏡面研磨して、チタン・サファイアレーザからなるパルスレーザ光源４１から出射される尖頭値の高い近赤外のフェムト秒パルスを入射させると、ＣＨ振動に対応する高次倍音を含み、２９００カイザー分、周波数が長波長側にシフトした強烈なコヒーレント光が誘導放出される。したがって、このレーザ媒質４２から出射する入射パルス光を含む１次ストークスラマン光を分光分散素子４３で取り出せば、光源装置３１から、それぞれ単色性に優れたポンプ光（プローブ光）およびストークス光を出射することができ、ＣＨ基観察に優れた顕微鏡光源として機能させることができる。当然のことながら、マルチプレックスＣＡＲＳ顕微鏡法に対しても、同様の効果を得ることができる。

（第４実施の形態）
本発明の第４実施の形態は、図４に示したコヒーレント・ラマン顕微鏡において、試料３６に代えて、図１または図３に示した解像度評価用チャートを試料ステージ３５にセットして、顕微鏡を調整する。ここで、解像度評価用チャートは、ラマン活性層がポリエチレンを含むものを用いる。

本実施の形態に係る調整法によれば、ポリエチレンを含むラマン活性層を有する解像度評価用チャートを用いるので、解像度評価用チャートから得られるラマン信号はＣＨ振動からのものであり、かつ、光源装置３１もＣＨ振動しか励起できない照明光を出射するので、非常に高いＳ／Ｎおよび精度で、顕微鏡の調整作業が可能となる。

したがって、本実施の形態に係る調整法は、現在、生物用のコヒーレント・ラマン顕微鏡の用途が、脂肪滴の観察など、ＣＨ振動観察に特化したものが多いことから、極めて有用性が高く、現実的な組み合わせである。

なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、発明の趣旨を逸脱しない範囲で、種々の変形または変更が可能である。

本発明の第１実施の形態に係る解像度評価用チャートを示す図である。 図１に示したラマン活性層に含まれる化学基を示す図である。 本発明の第２実施の形態に係る解像度評価用チャートを示す図である。 本発明の第３実施の形態に係る光源装置を用いるコヒーレント・ラマン顕微鏡の概略構成を示す図である。 非共鳴ラマン散乱、真正共鳴ラマン散乱、前期共鳴ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。 コヒーレント・ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。 従来の顕微鏡における調整法を説明するための図である。

符号の説明

１０，２０ 解像度評価用チャート
１１，２１ 基板
１２，２２ ラマン活性層
１３ａ，２４ａ ５μｍパターン部
１３ｂ，２４ｂ ３μｍパターン部
１３ｃ，２４ｃ １μｍパターン部
１３ｄ，２４ｄ ５００ｎｍパターン部
１３ｅ，２４ｅ ２５０ｎｍパターン部
１３ｆ，２４ｆ １００ｎｍパターン部
１３ｇ，２４ｇ ５０ｎｍパターン部
２３ マスク層
３１ 光源装置
３２ 反射ミラー
３３ ビームスプリッタ
３４ 顕微鏡対物レンズ
３５ 試料ステージ
３６ 試料
３７ 照明光カットフィルタ
３８ 分光器
３９ 光電子増倍管
４１ パルスレーザ光源
４２ レーザ媒質
４３ 分光分散素子

Claims (18)

1. コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートであって、
   照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板と、
   該基板上に二次元的に形成され、前記基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層と、
   を有することを特徴とするコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャート。
2. コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートであって、
   照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板と、
   該基板上に形成され、前記基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層と、
   該ラマン活性層上に二次元的に形成され、前記ラマン活性物質とは異なる振動スペクトルを有し、照明光励起に対して蛍光を発光せず、かつ照明光を反射または吸収するマスク層と、
   を有することを特徴とするコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャート。
3. 前記ラマン活性物質は、有機物からなることを特徴とする請求項１または２に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャート。
4. 前記ラマン活性物質は、ポンプ光およびストークス光の照明光の振動数差に共鳴する振動準位を有する化学基を含むことを特徴とする請求項３に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャート。
5. 前記化学基は、ＣＨ基であることを特徴とする請求項４に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャート。
6. 前記ラマン活性物質は、ポリエチレンを含むことを特徴とする請求項５に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の解像度評価用チャート。
7. コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートを製造するにあたり、
   照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板上に、該基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層を形成するラマン活性層形成工程と、
   前記基板上に形成された前記ラマン活性層を二次元的に除去してラマン活性層の二次元パターンを形成するパターン形成工程と、
   を含むことを特徴とする解像度評価用チャートの製造方法。
8. コヒーレント・ラマン顕微鏡の結像性能を評価するのに用いる解像度評価用チャートを製造するにあたり、
   照明光に対して光学的に平滑で、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しない基板上に、該基板とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光しないラマン活性物質を含むラマン活性層を形成するラマン活性層形成工程と、
   前記基板上に形成された前記ラマン活性層上に、前記ラマン活性物質とは異なる振動スペクトルを有し、かつ照明光励起に対して蛍光を発光せず、かつ照明光を反射または吸収するマスク層を二次元的に形成するマスク層形成工程と、
   を含むことを特徴とする解像度評価用チャートの製造方法。
9. 前記ラマン活性層形成工程は、有機物からなるラマン活性物質を、スピンコート法またはディップコート法により前記基板上に展開して、前記ラマン活性層を形成することを特徴とする請求項７または８に記載の解像度評価用チャートの製造方法。
10. 前記パターン形成工程は、前記ラマン活性層の二次元パターンを、ナノインプリンティング法により形成することを特徴とする請求項７に記載の解像度評価用チャートの製造方法。
11. 前記マスク層形成工程は、前記マスク層を蒸着法により形成することを特徴とする請求項８に記載の解像度評価用チャートの製造方法。
12. コヒーレント・ラマン顕微鏡に用いる光源装置であって、
    レーザ光を出射するレーザ光源と、
    該レーザ光源からのレーザ光を入射して、該レーザ光とともに、該レーザ光よりも長波長側にシフトしたラマン光を出射する有機結晶を含むレーザ媒質と、
    を有することを特徴とするコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置。
13. 前記レーザ媒質からの出射光路中に、１次ラマン光よりも長波長の高次ラマン光成分を除去する分光分散素子を設けたことを特徴とする請求項１２に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置。
14. 前記分光分散素子は、多層膜フィルタまたは回折格子からなることを特徴とする請求項１３に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置。
15. 前記有機結晶は、ＣＨ基を含むことを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置。
16. 前記有機結晶は、ポリエチレンを含むことを特徴とする請求項１５に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡用光源装置。
17. コヒーレント・ラマン顕微鏡を調整するにあたり、
    請求項１〜６のいずれか一項に記載の解像度評価用チャートを用い、該解像度評価用チャートの顕微鏡画像を撮影して得られるコントラスト伝達関数のコントラスト比が最大となるように調整することを特徴とするコヒーレント・ラマン顕微鏡の調整法。
18. 前記解像度評価用チャートを顕微鏡観察するための光源装置として、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の光源装置を用いることを特徴とする請求項１７に記載のコヒーレント・ラマン顕微鏡の調整法。

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