JP2009213475A

JP2009213475A - Ｈｉｖ伝播を含めた膜融合関連現象を阻害する方法および組成物

Info

Publication number: JP2009213475A
Application number: JP2009094324A
Authority: JP
Inventors: Dani P Bolognesi; ボログネシー，ダニ，ピー．; Thomas J Matthews; マシューズ，トーマス，ジェイ; Cart T Wild; ワイルド，カート，ティー．; Shawn O'lin Barney; バーネイ，ショーン，オーリン; Dennis M Lambert; ラムバート，デニス，エム．; Stephen R Petteway Jr; ペッテウェイ，ステファン，アール．，ジュニア; Alphonse J Langlois; ラングロワ，アルフォンス，ジェイ．
Original assignee: Trimeris Inc; Duke University
Current assignee: Trimeris Inc; Duke University
Priority date: 1994-12-20
Filing date: 2009-04-08
Publication date: 2009-09-24
Also published as: WO1996019495A1; US6068973A; EP0793675B9; US20040033235A1; US6093794A; EP0793675B1; EP0793675A4; ES2252747T3; AU4473496A; US6824783B1; US6479055B1; US7988974B2; CA2208420C; US20040052820A1; US6054265A; ATE308558T1; KR987000333A; US7122190B2; KR100558087B1; US6228983B1

Abstract

【課題】効力のある抗レトロウイルス活性を示すペプチドを提供する。
【解決手段】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１_LAI膜貫通タンパク質（ＴＭ）ｇｐ４１のアミノ酸６３８から６７３に対応するペプチドであるＤＰ１７８、並びにＤＰ１７８の断片、類似体および相同体、および未感染細胞へのヒトおよび非ヒトレトロウイルス（特にＨＩＶ）伝播の阻害剤としての該ペプチドの使用。
【選択図】なし

Description

１．序論
本発明は、第一に、ＨＩＶ−１_LAI 膜貫通タンパク質（ＴＭ）ｇｐ４１のアミノ酸６３８から６７３に対応するペプチドであるＤＰ１７８（配列番号１）およびＤＰ１７８（配列番号１）の部分または類似体に関し、これらのペプチドは抗膜融合能、抗ウイルス活性（例えば、未感染ＣＤ４⁺ 細胞へのＨＩＶ伝播を阻害する能力）、または超らせんペプチド構造を必要とする細胞内プロセスをモジュレートする能力を示す。さらに、本発明は、抗融合誘導または抗ウイルス化合物としての、あるいは超らせんペプチド構造を必要とする細胞内現象の阻害剤としての、ＤＰ１７８（配列番号１）およびＤＰ１７８部分および／または類似体の使用に関する。本発明はまた、ＨＩＶ−１_LAI 膜貫通タンパク質（ＴＭ）ｇｐ４１のアミノ酸５５８から５９５に対応するペプチドであるＤＰ１０７（配列番号８９）に類似したペプチドに関し、これらのペプチドは他のウイルス（例えば、エンベロープをもつウイルス）および／または他の生物中に存在するアミノ酸配列を有する。本発明はさらに、かかるペプチドの使用に関する。こうしたペプチドは抗膜融合能、抗ウイルス活性、または超らせんペプチド構造を必要とする細胞内プロセスをモジュレートする能力を示す。本発明はさらに、ＤＰ１７８とＤＰ１０７間の、および／またはＤＰ１０７様ペプチドとＤＰ１７８様ペプチド間の相互作用を破壊する化合物の同定方法に関する。さらに、本発明は診断薬としての本発明ペプチドの使用に関する。例えば、ＤＰ１７８ペプチドはＨＩＶサブタイプに特異的な診断薬として使用することができる。本発明は、第一に、ＤＰ１７８（配列番号１）ペプチドとＤＰ１７８に相同な配列のペプチドが未感染ＣＤ４⁺ 細胞へのＨＩＶ−１伝播の強力な非細胞毒性の阻害剤であることを示す実施例により実証される。本発明はさらに、ＤＰ１０７とＤＰ１７８に対して構造および／またはアミノ酸モチーフ類似性を有するペプチドを種々のウイルスおよび非ウイルス生物において同定する実施例により実証され、また、このように同定されたいくつかの異なるウイルス系に由来する多数のペプチドが抗ウイルス活性をもつことを示す実施例において検証される。

２．発明の背景
2.1. 膜融合現象
膜融合は至る所で起こる細胞生物学的過程である（詳細には、White, J.M., 1992, Science 258:917-924を参照のこと）。飲食作用（エンドサイトーシス）、構成的分泌、膜成分のリサイクルといった細胞の管理維持機能を媒介する融合現象はあらゆる真核細胞内で絶えず起こっている。

別の融合現象が特殊化した細胞内で起こる。例えば、細胞内では、融合現象がホルモン、酵素および神経伝達物質の調節されたエキソサイトーシスにおいて起こるような過程に関与している。細胞間では、このような融合現象が特に、例えば精子−卵融合や筋芽細胞融合において、重要な役目を果たしている。

融合現象は疾病状態とも関連している。例えば、炎症反応中の巨細胞の形成、エンベロープをもつあらゆるウイルスの細胞への侵入に融合現象が係わっており、また、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の場合には、例えば、ウイルスにより誘導される細胞−細胞融合（細胞死に結びつく）に関与している。

2.2. ヒト免疫不全ウイルス
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と呼ばれる、免疫系が徐々に弱まっていく疾病の主原因である (Barre-Sinoussi, F.ら, 1983, Science 220:868-870; Gallo, R.ら, 1984, Science 224:500-503)。ＨＩＶには少なくとも２つの別個のタイプがあり、ＨＩＶ−１(Barre-Sinoussi, F. ら, 1983, Science 220:868-870; Gallo, R.ら, 1984, Science 224:500-503)とＨＩＶ−２ (Clavel, F.ら, 1986, Science 233:343-346; Guyader, M.ら,1987, Nature 326:662-669) である。さらに、これらのタイプの各集団にはかなり多くの遺伝的異質性が存在する。ＨＩＶウイルスによるヒトＣＤ４⁺ Ｔリンパ球の感染は該細胞型の激減をもたらし、結果的に日和見感染、神経機能障害、新生物増殖を起こさせ、最後には死へ至らしめる。

ＨＩＶはレトロウイルスのレンチウイルスファミリーの仲間である (Teich, N. ら, 1984, RNA Tumor Viruses, Weiss, R.ら編, CSH-Press, pp. 949-956) 。レトロウイルスはエンベロープをもつ小型のウイルスで、２倍体の一本鎖ＲＮＡゲノムを含み、ウイルスがコードする逆転写酵素であるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより産生されるＤＮＡ中間体を経て複製する (Varmus, H., 1988, Science 240:1427-1439)。その他のレトロウイルスとしては、例えばヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ、−II、−III ）やネコ白血病ウイルスなどの腫瘍ウイルスがある。

ＨＩＶウイルス粒子は、ウイルスＲＮＡゲノムと初期の複製過程で必要とされる酵素類を含む、キャプシドタンパク質から構成されたウイルスコアから成っている。ミリスチル化Ｇａｇタンパク質がウイルスコアのまわりのウイルス外殻を形成し、該ウイルス外殻は感染細胞膜に由来するエンベロープ脂質膜により包まれる。ＨＩＶエンベロープの表面糖タンパク質は単一の１６０Ｋｄの前駆体タンパク質として合成され、この前駆体タンパク質はウイルス出芽中に細胞性プロテアーゼにより２つの糖タンパク質ｇｐ４１とｇｐ１２０に開裂される。ｇｐ４１は膜貫通タンパク質で、ｇｐ１２０はおそらく３量体または多量体の形でｇｐ４１と非共有結合的に結合した状態の細胞外タンパク質である (Hammarskjold, M. and Rekosh, D., 1989, Biochem. Biophys. Acta 989:269-280)。

ＨＩＶはＣＤ４⁺ 細胞を標的とする。なぜなら、ＣＤ４細胞表面タンパク質がＨＩＶ−１ウイルスの細胞受容体として働くからである (Dalgleish, A. ら, 1984, Nature 312:763-767; Klatzmann ら, 1984, Nature 312:767-768; Maddonら, 1986, Cell 47:333-348)。細胞へのウイルス侵入は細胞のＣＤ４⁺ 受容体分子と結合するｇｐ１２０に依存し (McDougal, J.S.ら, 1986, Science 231:382-385; Maddon, P.J. ら, 1986, Cell 47:333-348)、かくしてｇｐ１２０はＣＤ４⁺細胞に対するＨＩＶ向性を説明し、一方ｇｐ４１はウイルス膜中にエンベロープの糖タンパク質複合体を固定する。

2.3. ＨＩＶ治療
ＨＩＶ感染は世界中に広がっており、ＨＩＶ関連疾患が全世界の主要な健康問題となっている。有効な治療薬デザインの成功にむけて大いなる努力が払われているにもかかわらず、目下のところＡＩＤＳを治す有効な抗レトロウイルス薬は皆無である。このような薬剤を開発しようとして、ＨＩＶの生活環のいくつかの段階が治療的介入の標的として考えられてきた (Mitsuya, H. ら, 1991, FASEB J. 5:2369-2381) 。例えば、ウイルスのコードする逆転写酵素が薬剤開発の中心となっていた。ＨＩＶに対して活性であることがわかったＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔなどの2',3'-ジデオキシヌクレオシド類似体を含めて、逆転写酵素を標的とした多数の薬剤が開発されている (Mitsuya, H. ら, 1991, Science 249:1533-1544)。これらのヌクレオシド類似体は有益ではあるものの、治療するものではない。たぶん、薬剤耐性のＨＩＶ変異体が急速に出現したためであろう (Lander, B.ら, 1989, Science 243:1731-1734)。その上、かかる薬剤はしばしば骨髄抑制、嘔吐、肝機能異常などの有害な副作用を示す。

また、ＨＩＶ感染のごく初期の段階である、細胞へのウイルス侵入をくい止めることができる薬剤の開発も行われている。ここで、ＨＩＶの細胞表面受容体であるＣＤ４が相当な関心を集めることとなる。例えば、組換え可溶性ＣＤ４は、一部のＨＩＶ−１株によるＣＤ４⁺ Ｔ細胞の感染を阻止することが判明した (Smith, D.H. ら, 1987, Science 238:1704-1707)。しかしながら、ある種の一次ＨＩＶ−１分離株は組換えＣＤ４による阻止にあまり感受性でない (Daar, E.ら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6574-6579)。加えて、組換え可溶性ＣＤ４の臨床試験は結論へ導く結果をもたらさなかった (Schooley, R.ら, 1990, Ann. Int. Med. 112:247-253; Kahn, J.O.ら, 1990, Ann. Int. Med. 112:254-261; Yarchoan, R.ら, 1989, Proc. Vth Int. Conf. on AIDS, p.564, MCP 137) 。

ＨＩＶ複製の後期段階はいくつかのウイルスタンパク質の決定的なウイルス特異的二次プロセシングを必要とするが、この段階も見込みのある抗ＨＩＶ薬の標的として提案された。後期段階のプロセシングはウイルスプロテアーゼの活性に依存し、このプロテアーゼを阻害する薬剤が開発されつつある (Erickson, J., 1990, Science 249:527-533)。これらの候補薬剤の臨床試験の結果はまだ論争中である。

ＨＩＶ感染の治療用ワクチンの開発も注目されている。ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１）はＡＩＤＳ患者中に存在する抗ＨＩＶ抗体の主な抗原であることがわかった (Barin ら, 1985, Science 228:1094-1096)。それゆえ、これまでのところ、こうしたタンパク質は抗ＨＩＶワクチン開発のための抗原として働く最も有望な候補であるようだ。このために、いくつかのグループがｇｐ１６０、ｇｐ１２０および／またはｇｐ４１の種々の部分を宿主免疫系の免疫原性標的として使用し始めた。例えば、Ivanoff, L. ら, 米国特許第5,141,867 号; Saith, G. ら, WO 92/22,654; Shafferman, A., WO 91/09,872; Formoso, C. ら, WO 90/07,119を参照のこと。しかしながら、これらの候補ワクチンに関する臨床試験の結果がでるのはまだ先のことである。

こうして、抗レトロウイルス薬のデザインおよび試験に向けて多大の努力が払われているが、真に有効で無毒性の治療が依然として必要とされている。

３．発明の概要
本発明は、第一に、ＨＩＶ−１分離株ＬＡＩ（ＨＩＶ−１_LAI ）由来の膜貫通タンパク質（ＴＭ）ｇｐ４１のアミノ酸６３８から６７３に対応する３６アミノ酸の合成ペプチドであり、強力な抗ＨＩＶ−１活性を示すＤＰ１７８（配列番号１）に関する。第６節で後述する実施例により示されるように、ＤＰ１７８（配列番号１）の抗ウイルス活性は非常に高いので、重量基準で、ＤＰ１７８（配列番号１）がその阻害効果を示す程度の低濃度で効力を示す抗ＨＩＶ薬は他に知られていない。

本発明はさらに、かかる抗ウイルス活性を示し、かつ／または抗膜融合能、または超らせんペプチド構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示すＤＰ１７８の部分および類似体に関する。「ＤＰ１７８類似体」とは、ＨＩＶ−１_LAI のｇｐ４１タンパク質内に存在するＤＰ１７８ペプチド配列に対応するアミノ酸配列を含むが、ＨＩＶ−１_LAI 以外のウイルスおよび／または生物中に見いだされるペプチドのことである。それゆえ、このようなＤＰ１７８類似体ペプチドは、例えばＨＩＶ−１_LAI 以外のレトロウイルスのようなエンベロープをもつウイルスやエンベロープをもたないウイルスなどの、他のウイルス中に存在するＤＰ１７８様のアミノ酸配列に相当しうる。さらに、こうした類似ＤＰ１７８ペプチドは非ウイルス生物中に存在するＤＰ１７８様のアミノ酸配列に相当するものであってもよい。

本発明はさらに、ペプチドＤＰ１０７（配列番号８９）類似体に関する。ＤＰ１０７はＨＩＶ−１_LAI 膜貫通タンパク質（ＴＭ）ｇｐ４１のアミノ酸５５８−５９５に対応するペプチドである。本明細書中で用いる「ＤＰ１０７類似体」とは、ＨＩＶ−１_LAI のｇｐ４１タンパク質内に存在するＤＰ１０７ペプチド配列に対応するアミノ酸配列を含むが、ＨＩＶ−１_LAI 以外のウイルスおよび／または生物中に見いだされるペプチドを指す。それゆえ、このようなＤＰ１０７類似体ペプチドは、例えばＨＩＶ−１_LAI 以外のレトロウイルスのようなエンベロープをもつウイルスやエンベロープをもたないウイルスなどの、他のウイルス中に存在するＤＰ１０７様アミノ酸配列に相当しうる。さらに、こうしたＤＰ１０７類似体ペプチドは非ウイルス生物中に存在するＤＰ１０７様アミノ酸配列に相当するものであってもよい。

さらに、本発明のペプチドとしては、ここに記載される107x178x4 、ALLMOTI5および／またはPLZIP 検索モチーフにより認識または同定されるアミノ酸配列を有するＤＰ１０７類似体およびＤＰ１７８類似体がある。

本発明のペプチドは、例えば、抗融合活性、抗ウイルス活性を示すことができ、そして／または超らせんペプチド構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力をもち得る。本発明ペプチドの抗ウイルス活性に関して、かかる抗ウイルス活性として未感染ＣＤ４⁺ 細胞へのＨＩＶ伝播の阻止が挙げられが、これに限らない。加えて、本発明ペプチドの抗融合能、抗ウイルス活性または細胞内モジュレーター活性は本発明ペプチドの存在を必要とするにとどまり、特に、この種のペプチドに対する宿主免疫応答の刺激を必要としない。

本発明のペプチドは、例えば未感染細胞へのヒトおよび非ヒトレトロウイルス（特にＨＩＶ）伝播の阻止といった、膜融合関連現象の阻害剤として使用し得る。さらに、超らせんペプチド構造を必要とする細胞内現象のモジュレーターとして本発明のペプチドを使用することが意図される。

また、本発明のペプチドを用いて、それ自体が抗融合活性、抗ウイルス活性または細胞内モジュレーター活性を示す化合物を同定することができる。別の用途として、例えば、生物またはウイルスのタイプおよび／またはサブタイプに特異的な診断手段としての本発明ペプチドの使用が挙げられる。

本明細書中で用いる「抗融合誘導 (antifusogenic)」および「抗膜融合 (anti-membrane fusion) 」という用語は、２以上の成分間の膜融合現象のレベルを、ペプチドの不在下で該成分間に起こる膜融合のレベルに対して抑制または軽減する薬剤の能力を指す。該成分は例えば細胞膜やウイルス構造体（例：ウイルスエンベロープ、ピリ）であり得る。本明細書中で用いる「抗ウイルス」とは、例えば細胞−細胞融合またはフリーのウイルスの感染による細胞のウイルス感染を抑制する化合物の能力を指す。このような感染は、エンベロープをもつウイルスの場合に起こる膜融合や、ウイルス構造と細胞構造（例えば、細菌接合の際のウイルスピリと細菌膜との融合）の関与する他の融合現象を必然的に伴う。

本発明のペプチドはまた、超らせんペプチド構造が関与する細胞内現象をモジュレートする能力をもつと予想される。本明細書中で用いる「モジュレートする」とは、本発明ペプチドの不在下での細胞内プロセスのレベルまたは活性と比べたときの、かかる細胞内プロセスに及ぼす刺激または抑制効果を意味する。

本発明の実施態様は以下に詳述されるが、そこでは極めて低濃度のＤＰ１７８（配列番号１）および非常に低濃度のＤＰ１７８同族体（配列番号３）がＨＩＶ−１媒介ＣＤ４⁺ 細胞−細胞融合（すなわち、シンシチウム形成）の強力な阻害剤であり、また、細胞フリーのウイルスによるＣＤ４⁺ 細胞感染の強力な阻害剤であることを示す。さらに、ＤＰ１７８（配列番号１）は、ＤＰ１７８（配列番号１）の阻害濃度より３log 高い濃度でさえ、細胞に対して無毒性である。

本発明は、部分的には、ＨＩＶのｇｐ４１タンパク質のＤＰ１０７ドメインとＤＰ１７８ドメインが互いと非共有結合で複合体を形成し、ウイルスの通常の感染にはそれらの相互作用が必要であるという驚くべき知見に基づいている。この知見については以下の第８節に示す実施例で説明する。それゆえ、本発明はさらに、ＤＰ１０７とＤＰ１７８との相互作用、および／またはＤＰ１０７様ペプチドとＤＰ１７８様ペプチドとの相互作用を破壊する、抗ウイルス化合物を含めた抗融合誘導化合物を同定する方法に関する。

本発明の更なる実施態様（特に、以下の第９〜16および19〜25節に示す実施例）は以下に詳述されるが、そこではＤＰ１０７およびＤＰ１７８に対して構造および／またはアミノ酸モチーフ類似性を有する種々のウイルスおよび非ウイルス源からのペプチドを同定し、その同定用の検索モチーフを記載する。さらに、多数の本発明ペプチドが実質的な抗ウイルス活性または抗ウイルス活性を推測させる活性をもつことを実証する実施例（第17、18、25〜29節）を提示する。

3.1. 定義
ペプチドは本明細書ではペプチド結合により共有結合で連結された２以上のアミノ酸からなる有機化合物として定義される。ペプチドは構成アミノ酸の数に関して言及されることがあり、すなわち、ジペプチドは２個のアミノ酸残基を含み、トリペプチドは３個のアミノ酸残基を含む、といったようにである。１０個またはそれより少数のアミノ酸を含むペプチドはオリゴペプチドと呼ばれるが、１０個より多いアミノ酸残基をもつものはポリペプチドである。こうしたペプチドは本明細書に記載するような修飾および追加のアミノまたはカルボキシ基を含んでいてもよい。

本明細書中で規定されるペプチド配列は次のようなアミノ酸残基の一文字表記で表される。
Ａ（アラニン）
Ｒ（アルギニン）
Ｎ（アスパラギン）
Ｄ（アスパラギン酸）
Ｃ（システイン）
Ｑ（グルタミン）
Ｅ（グルタミン酸）
Ｇ（グリシン）
Ｈ（ヒスチジン）
Ｉ（イソロイシン）
Ｌ（ロイシン）
Ｋ（リシン）
Ｍ（メチオニン）
Ｆ（フェニルアラニン）
Ｐ（プロリン）
Ｓ（セリン）
Ｔ（トレオニン）
Ｗ（トリプトファン）
Ｙ（チロシン）
Ｖ（バリン）

ＨＩＶ_LAI 由来のＤＰ１７８のアミノ酸配列（配列番号１）；ＨＩＶ−１_SF2 由来のＤＰ１７８相同体（ＤＰ−１８５；配列番号３）、ＨＩＶ−１_RF（配列番号４）、ＨＩＶ−１_MN（配列番号５）、２つのプロトタイプＨＩＶ−２単離物のアミノ酸配列由来のＤＰ１７８相同体、すなわち、ＨＩＶ−２_rod （配列番号６）およびＨＩＶ−１_NTHZ（配列番号７）；対照ペプチド：ＤＰ１７８に無関係で、ＨＩＶ−１の無細胞ウイルス感染を阻害するＤＰ−１１８（配列番号１０）；ＤＰ１７８に無関係で、やはりＨＩＶ−１の無細胞ウイルス感染を阻害するＤＰ−１２５（配列番号８）；ＤＰ１７８に無関係で、無細胞ウイルス感染アッセイを用いて試験したときにＨＩＶ−１感染阻害について陰性である、ＤＰ−１１６（配列番号９）を示す。合成ペプチドによるＨＩＶ−１の無細胞ウイルス感染の阻害を示す。合成ペプチドＤＰ１７８（配列番号１）によるＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の無細胞ウイルス感染の阻害を示す。図４Ａは、ＨＩＶ−１のプロトタイプ単離物仲介シンシチア形成のＤＰ１７８阻害を示し、データは細胞１個あたりのウイルス誘導シンシチア数を示す。図４Ｂでは、ＤＰ−１８０（配列番号２）はごちゃまぜにした対照ペプチドを表し；ＤＰ−１８５（配列番号３）ＨＩＶ−１SFZ 単離物由来のＤＰ１７８相同体を表す；対照は、ペプチドがない場合に産生される融合細胞数を意味する。ＨＩＶ−１対ＨＩＶ−２の融合阻害アッセイである。データは、１ウェル当たりのウイルス誘導シンシチア数を示す。ＮＤは実施していないことを示す。ＣＥＭ細胞におけるＤＰ１７８（配列番号１）およびＤＰ−１１６（配列番号９）の細胞毒性の研究結果である。細胞増殖のデータは示していない。ＨＩＶ−ｇｐ４１とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−ｇｐ４１との融合タンパク質を模式的に表す。点突然変異によるＭ４１のコンフォーメーションおよび抗ウイルス活性の変化を示す。ＤＰ１７８の抗ウイルス活性の排除を示す。細胞融合アッセイを、１０ｎＭのＤＰ１７８と種々の濃度のＭ４１Δ１７８またはＭ４１ＰΔ１７８の存在下において実施した。ＦＡｂ−ＤＥＬＩＺＡによって分析されたｇｐ４１のロイシンジッパーへのＤＰ１７８の結合を示す。ＨＩＶ−１ＴＭタンパク質における構造的トランジションのモデルを示す。ＨＩＶ−１ＴＭタンパク質における構造的トランジションのモデルを示す。既知のコイル化コイルのアミノ酸のヘプタッドリピート(heptad repeat) のポジショニングを用いたモチーフデザインを示す。ＤＰ１０７およびＤＰ１７８の提案されたアミノ酸のヘプタッドリピートのポジショニングを用いたモチーフデザインを示す。ＧＣＮ４とＤＰ１０７とを架橋させる(crossing)ハイブリッドモチーフデザインを示す。ＧＣＮ４とＤＰ１７８とを架橋させるハイブリッドモチーフデザインを示す。ＤＰ１０７とＤＰ１７８とを架橋させた、１０７×１７８×４、のハイブリッドモチーフデザインを示す。このモチーフは、適当なＤＰ１０７様ペプチド領域とＤＰ１７８様ペプチド領域を同定する上で最も矛盾がないことが明らかになった。ＧＣＮ４、ＤＰ１０７、およびＤＰ１７８を架橋させるハイブリッドモチーフデザインを示す。ＧＣＮ４、ＤＰ１０７，ＤＰ１７８，ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、およびＦｌｕループ３６を架橋させた、ハイブリッドモチーフデザインを示す。Ｎ−末端のプロリン−ロイシンジッパーモチーフを同定するためにデザインされたＰＬＺＩＰモチーフである。ＨＩＶ−１（ＢＲＵ単離物）のエンベロープタンパク質ｇｐ４１の検索結果を示す。ヒトＲＳウイルス(human respiratory syncytial virus, RSV)Ａ２株融合糖タンパク質Ｆ１の検索結果を示す。ｇｐ４１タンパク質につつまれたサル免疫不全ウイルス(simian immunodeficiency virus, SIV)（ＡＧＭ３単離物）の検索結果である。イヌジステンパーウイルス(canine distemper virus, Onderstepoort株) 融合糖タンパク質１の検索結果を示す。ニューキャッスル病ウイルス（newcastele disease virus, オーストラリア−ビクトリア／３２株）融合糖タンパク質Ｆ１の検索結果を示す。ヒトパラインフルエンザウイルス（human parainfluenza virus,NIH 47885 株）融合糖タンパク質Ｆ１の検索結果を示す。インフルエンザＡウイルス（influenza A virus, A/AICHI/2/68 株）ヘマグルチニン前駆体ＨＡ２の検索結果を示す。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ペプチドの抗ウイルスデータおよび二色性データを示す。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ペプチドの抗ウイルスデータおよび二色性データを示す。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ペプチドの抗ウイルスデータおよび二色性データを示す。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ペプチドの抗ウイルスデータおよび二色性データを示す。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ペプチドの抗ウイルスデータおよび二色性データを示す。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ペプチドの抗ウイルスデータおよび二色性データを示す。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）のＤＰ１７８様領域（Ｆ１）ペプチドの抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）のＤＰ１７８様領域（Ｆ１）ペプチドの抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）のＤＰ１７８様領域（Ｆ１）ペプチドの抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。ＨＰＩＶ３Ｆ１ＤＰ１０７様領域由来のペプチドを示す。抗ウイルス表記、ＣＤ表記、およびＩＣ₅₀は、図２７Ａ−Ｆに示す通りである。ＨＰＩＶ３Ｆ１ＤＰ１０７様領域由来のペプチドを示す。ＨＰＩＶ３Ｆ１ＤＰ１０７様領域由来のペプチドを示す。ＨＰＩＶ３Ｆ１ＤＰ１０７様領域由来のペプチドを示す。ＨＰＩＶ３Ｆ１ＤＰ１０７様領域由来のペプチドを示す。ＨＰＩＶ３Ｆ１ＤＰ１７８様領域由来のペプチドを示す。ペプチドの抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。抗ウイルス表記、ＣＤ表記、およびＩＣ₅₀は、図２７Ａ−Ｆに示す通りである。ＨＰＩＶ３Ｆ１ＤＰ１７８様領域由来のペプチドの抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。ＨＰＩＶ３Ｆ１ＤＰ１７８様領域由来のペプチドの抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）単離物ＭＭ２５１のエンベロープタンパク質ｇｐ４１のモチーフ検索結果を示す。エプスタインバーウイルス（Epstein-Barr virus, B95-8 株）、糖タンパク質ｇｐ１１０前駆体（ｇｐ１１５という）、ＢＡＬＦ４のモチーフ検索結果を示す。エプスタインバーウイルス（B95-8 株）、ＢＺＬＦ１トランス作用タンパク質（ＥＢ１またはＺｅｂｒａという）のモチーフ検索結果を示す。麻疹ウイルス(measeles virus, Edmonston株) 、融合糖タンパク質Ｆ１のモチーフ検索結果を示す。Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus,サブタイプAYW)、主要表面抗原前駆体Ｓのモチーフ検索結果を示す。 simian Mason-Pfizer monkey virusのエンベロープ（ＴＭ）タンパク質ｇｐ２０のモチーフ検索結果を示す。 Pseudomonas aerginosa、フィンブリアタンパク質(fimbrial protein, Pilin) のモチーフ検索結果を示す。 Neisseria gonorrhoeae フィンブリアタンパク質(Pilin) のモチーフ検索結果を示す。 Hemophilus influenzae フィンブリアタンパク質のモチーフ検索結果を示す。 Staphylococcus aureus 、毒素ショック症候群トキシン−１のモチーフ検索結果を示す。 Staphylococcus aureus のエンテロトキシンＥ型のモチーフ検索結果を示す。 Staphylococcus aureus のエンテロトキシンＡのモチーフ検索結果を示す。大腸菌(Eshedrichia coli)の熱不安定エンテロトキシンＡのモチーフ検索結果を示す。ヒトｃ−ｆｏｓプロトオンコジーンのモチーフ検索結果を示す。ヒト狼瘡(human lupus) ＫＵ自己抗原タンパク質Ｐ７０のモチーフ検索結果を示す。ヒトジンクフィンガータンパク質１０のモチーフ検索結果を示す。麻疹ウイルス（ＭｅＶ）の融合タンパク質ＤＰ１７８様領域の抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＴＭ（融合）タンパク質ＤＰ１７８様領域の抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。ＤＰ１７８様ペプチドの抗ウイルスデータを示す。ここでリストされたペプチドは、ＨＩＶ−１ＢＲＵ単離物ＤＰ１７８領域（例えば、ｇｐ４１のアミノ酸残基６１５〜７１７）を取り巻く領域に由来する。ＤＰ１７８様ペプチドの抗ウイルスデータを示す。ＤＰ１７８様ペプチドの抗ウイルスデータを示す。ＤＰ１０７およびＤＰ１０７のｇｐ４１領域末端切断型ペプチドの抗ウイルスデータを示す。エプスタイン−バーウイルスのＢ９５−８株のＢＺＬＦ１ＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似領域ペプチドのウォーキングおよび電気泳動の移動度のシフトアッセイの結果を示す。エプスタイン−バーウイルスのＢ９５−８株のＢＺＬＦ１ＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似領域ペプチドのウォーキングおよび電気泳動の移動度のシフトアッセイの結果を示す。Ｂ型肝炎ウイルスサブタイプＡＹＷの主要表面抗原前駆体Ｓタンパク質ＤＰ１７８／１０７類似領域とペプチドのウォーキングとを示す。Ｂ型肝炎ウイルスサブタイプＡＹＷの主要表面抗原前駆体Ｓタンパク質ＤＰ１７８／１０７類似領域とペプチドのウォーキングとを示す。

４．図面の説明
図１は、ＨＩＶ_LAI 由来のＤＰ１７８のアミノ酸配列（配列番号１）；ＨＩＶ−１_SF2 由来のＤＰ１７８相同体（ＤＰ−１８５；配列番号３）、ＨＩＶ−１_RF（配列番号４）、ＨＩＶ−１_MN（配列番号５）、２つのプロトタイプＨＩＶ−２単離物のアミノ酸配列由来のＤＰ１７８相同体、すなわち、ＨＩＶ−２_rod （配列番号６）およびＨＩＶ−１_NTHZ（配列番号７）；対照ペプチド：ＤＰ１７８に無関係で、ＨＩＶ−１の無細胞ウイルス感染を阻害するＤＰ−１１８（配列番号１０）；ＤＰ１７８に無関係で、やはりＨＩＶ−１の無細胞ウイルス感染を阻害するＤＰ−１２５（配列番号８）；ＤＰ１７８に無関係で、無細胞ウイルス感染アッセイをを用いて試験したときにＨＩＶ−１感染阻害について陰性である、ＤＰ−１１６（配列番号９）を示す。図面全体を通してアミノ酸は１文字表記で示す。

図２は、合成ペプチドによるＨＩＶ−１の無細胞ウイルス感染の阻害示す。ＩＣ₅₀は、未処理の対照と比較したときに感染細胞からのＲＴ産生を５０％阻害するペプチドの濃度を示す。対照は、処理培養物と同レベルのウイルスで感染させた未処理細胞によって産生されたＲＴレベルである。

図３は、合成ペプチドＤＰ１７８（配列番号１）によるＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の無細胞ウイルス感染の阻害示す。ＩＣ₅₀は、未処理の対照と比較したときに感染細胞からのＲＴ産生を５０％阻害するペプチドの濃度を示す。対照は、処理培養物と同レベルのウイルスで感染させた未処理細胞によって産生されたＲＴレベルである。

図４Ａ−Ｂは、融合阻害アッセイを示す。図４Ａは、ＨＩＶ−１のプロトタイプ単離物仲介シンシチア形成のＤＰ１７８阻害を示し、データは細胞１個あたりのウイルス誘導シンシチア数を示す。図４Ｂでは、ＤＰ−１８０（配列番号２）はごちゃまぜにした対照ペプチドを表し；ＤＰ−１８５（配列番号３）ＨＩＶ−１_SFZ 単離物由来のＤＰ１７８相同体を表す；対照は、ペプチドがない場合に産生される融合細胞数を意味する。

図５は、ＨＩＶ−１対ＨＩＶ−２の融合阻害アッセイである。データは、１ウェル当たりのウイルス誘導シンシチア数を示す。ＮＤは実施していないことを示す。

図６は、ＣＥＭ細胞におけるＤＰ１７８（配列番号１）およびＤＰ−１１６（配列番号９）の細胞毒性の研究結果である。細胞増殖のデータは示していない。

図７は、ＨＩＶ−ｇｐ４１とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−ｇｐ４１との融合タンパク質を模式的に表す。ＤＰ１０７とＤＰ１７８とは、ｇｐ４１の２つの推定ヘリックスに基づく合成ペプチドである。ＤＰ１０７のボックス中のＰの文字は、アミノ酸番号５７８におけるIle からPro への突然変異を示す。アミノ酸残基は、Meyer らの"Human Retroviruses and AIDS", 1991, Theoret. Biol. and Biophys. Group, Los Alamos Natl. Lab., Los Alamos, NM に従って番号をつけた。タンパク質は、下記8.1.1 節にさらに詳細に記載する。

図８は、点突然変異によるＭ４１のコンフォメーションおよび抗ウイルス活性の変化を示す。

図９は、ＤＰ１７８の抗ウイルス活性の排除を示す。細胞融合アッセイを、１０ｎＭのＤＰ１７８と種々の濃度のＭ４１Δ１７８またはＭ４１ＰΔ１７８の存在下において実施した。

図１０は、ＦＡｂ−ＤＥＬＩＺＡによって分析されたｇｐ４１のロイシンジッパーへのＤＰ１７８の結合を示す。

図１１Ａ−Ｂは、ＨＩＶ−１ＴＭタンパク質における構造的トランジションのモデルを示す。下記のトリガーイベント（おそらくは、ｇｐ１２０がＣＤ４に結合する）に伴う天然のオリゴマーから融合誘導状態への構造的トランジションを示す２つのモデルが提出された。これら２つのモデルに共通する特徴には、(1) 天然の状態が非共有結合的なタンパク質−タンパク質相互作用によってともに保持され、ｇｐ１２０／４１のヘテロダイマーと他の相互作用（原理的にはｇｐ４１相互作用部位を介して）を形成し、ｇｐ１２０／４１複合体のウイルス表面上でホモオリゴマーを形成する； (2)天然状態においてＮ−末端（Ｆ）で疎水性融合誘導(fusogenic) ペプチドをシールドし；そして(3) ロイシンジッパードメイン（ＤＰ１０７）が融合誘導状態においてのみホモオリゴマーコイル化コイル(coiled coil) として存在する。２つのモデルにおける主な相違は、ＤＰ１０７ドメインとＤＰ１７８ドメインとが互いに複合体を形成するという構造状態である。第一のモデル（図１１Ａ）においては、この相互作用は天然状態において生じ、そして第二のモデルにおいては融合誘導状態において生じる。トリガーがかかったときに、（Ａ）に記載されたモデル中の融合複合体は相同なＤＰ１０７ドメイン中のコイル化コイルの形成を介して生成され、伸長されたα−ヘリックスを生じる。このコンフォーメーションの変化は、細胞マクロファージとの相互作用のために融合誘導タンパク質を配置する。第二のモデル（図１１Ｂ）においては、融合誘導複合体は、ＤＰ１０７コイル化コイルとＤＰ１７８ドメインとの会合によって安定化される。

図１２は、既知のコイル化コイルのアミノ酸のヘプタッドリピート(heptad repeat) のポジショニングを用いたモチーフデザインを示す。

図１３は、ＤＰ１０７およびＤＰ１７８の提案されたアミノ酸のヘプタッドリピートのポジショニングを用いたモチーフデザインを示す。

図１４は、ＧＣＮ４とＤＰ１０７とを架橋させる(crossing)ハイブリッドモチーフデザインを示す。

図１５は、ＧＣＮ４とＤＰ１７８とを架橋させるハイブリッドモチーフデザインを示す。

図１６は、ＤＰ１０７とＤＰ１７８とを架橋させた、１０７×１７８×４、のハイブリッドモチーフデザインを示す。このモチーフは、適当なＤＰ１０７様ペプチド領域とＤＰ１７８様ペプチド領域を同定する上で最も矛盾がないことが明らかになった。

図１７は、ＧＣＮ４、ＤＰ１０７、およびＤＰ１７８を架橋させるハイブリッドモチーフデザインを示す。

図１８は、ＧＣＮ４、ＤＰ１０７，ＤＰ１７８，ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、およびＦｌｕループ３６を架橋させた、ハイブリッドモチーフデザインを示す。

図１９は、Ｎ−末端のプロリン−ロイシンジッパーモチーフを同定するためにデザインされたＰＬＺＩＰモチーフである。

図２０は、ＨＩＶ−１（ＢＲＵ単離物）のエンベロープタンパク質ｇｐ４１の検索結果を示す。配列の検索モチーフは、委員会の通りである。スペードは１０７×１７８×４、ハートはALLMOT15、クラブはＰＬＺＩＰ、ダイヤは膜貫通領域（推定膜貫通領域は、このようなペプチド領域を検索するために設計されたＰＣ／Ｇｅｎｅプログラムを用いて同定された）である。星印（＊）はＬｕｐａｓ法である。各モチーフで同定されたアミノ酸配列は、各々の文字で一括される。１０７×１７８×４の検索に基づいて選択された代表的な配列には下線をつけ、太字で示した。ＤＰ１０７配列とＤＰ１７８配列とに印をつけ、さらに二重線を付し、斜体にした。

図２１は、ヒトＲＳウイルス(human respiratory syncytial virus, RSV)Ａ２株融合糖タンパク質Ｆ１の検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図２２は、ｇｐ４１タンパク質につつまれたサル免疫不全ウイルス(simian immunodeficiency virus, SIV)（ＡＧＭ３単離物）の検索結果である。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図２３は、イヌジステンパーウイルス(canine distemper virus, Onderstepoort株) 融合糖タンパク質１の検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図２４は、ニューキャッスル病ウイルス（newcastele disease virus, オーストラリア−ビクトリア／３２株）融合糖タンパク質Ｆ１の検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図２５は、ヒトパラインフルエンザウイルス（human parainfluenza virus, NIH 47885 株）融合糖タンパク質Ｆ１の検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図２６は、インフルエンザＡウイルス（influenza A virus, A/AICHI/2/68 株）ヘマグルチニン前駆体ＨＡ２の検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図２７Ａ−Ｆは、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ペプチドの抗ウイルスデータおよび二色性データを示す。図２７Ａ−Ｃは、Ｆ２ＤＰ１７８／ＤＰ１０７様領域由来のペプチドである。抗ウイルスデータおよＣＤデータを示す。図２７Ｄ−Ｆは、Ｆ１ＤＰ１０７様領域由来のペプチドである。ペプチドおよびＣＤデータを示す。
抗ウイルス活性（ＡＶ）は、以下の定性的表記で表す。
”−”は、抗ウイルス活性がないことを表す。
”＋／−”は、抗ウイルス活性が１００μｇ／ｍＬより大きいことを表す。
”＋”は、抗ウイルス活性が５０〜１００μｇ／ｍＬの間にあることを表す。
”++”は、抗ウイルス活性が２０〜５０μｇ／ｍＬの間にあることを表す。
”+++ ”は、抗ウイルス活性が１〜２０μｇ／ｍＬの間にあることを表す。
”++++”は、抗ウイルス活性が＜１μｇ／ｍＬであるとを表す。
ＣＤデータはヘリックス性のレベルを意味し、以下の定性的表記で表す。
”−”は、ヘリックスがないことを表す。
”＋”は、２５〜５０％のヘリックスが存在することを表す。
”++”は、５０〜７５％のヘリックスが存在することを表す。
”+++ ”は、７５〜１００％のヘリックスが存在することを表す。
ＩＣ₅₀はペプチドを含まない感染された対照培養物に対して、５０％のシンシチアを産生するために必要なペプチドの濃度を意味する。ＩＣ₅₀値は、精製したペプチドのみを用いて得た。

図２８Ａ−Ｃは、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）のＤＰ１７８様領域（Ｆ１）ペプチドの抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。抗ウイルス表記、ＣＤ表記、およびＩＣ₅₀は、図２７Ａ−Ｆに示す通りである。ＩＣ₅₀値は、精製したペプチドのみを用いて得た。

図２９Ａ−Ｅは、ＨＰＩＶ３Ｆ１ＤＰ１０７様領域由来のペプチドを示す。抗ウイルス表記、ＣＤ表記、およびＩＣ₅₀は、図２７Ａ−Ｆに示す通りである。ＩＣ₅₀値に星印（＊）をつけた以外は精製したペプチドをＩＣ₅₀値を得るために使用し、この場合には、ＩＣ₅₀値は粗精製ペプチド調製物を用いて得た。

図３０Ａ−Ｃは、ＨＰＩＶ３Ｆ１ＤＰ１７８様領域由来のペプチドを示す。ペプチドの抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。抗ウイルス表記、ＣＤ表記、およびＩＣ₅₀は、図２７Ａ−Ｆに示す通りである。ＩＣ₅₀値に星印（＊）をつけた以外は精製したペプチドをＩＣ₅₀値を得るために使用し、この場合には、ＩＣ₅₀値は部分精製ペプチド調製物を用いて得た。

図３１は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）単離物ＭＭ２５１のエンベロープタンパク質ｇｐ４１のモチーフ検索結果を示す。配列検索結果は図２０に示す通りである。

図３２は、エプスタインバーウイルス（Epstein-Barr virus, B95-8 株）、糖タンパク質ｇｐ１１０前駆体（ｇｐ１１５という）、ＢＡＬＦ４のモチーフ検索結果を示す。配列検索の名称は、図２０に示すとおりである。

図３３は、エプスタインバーウイルス（B95-8 株）、ＢＺＬＦ１トランス作用タンパク質（ＥＢ１またはＺｅｂｒａという）のモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。さらに、FlemingtonおよびSpeck(Flemington, E. and Speck, S.H., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9459-9463)によって定義されたように、”＠”は周知のＤＮＡ結合ドメインを意味し、”＋”は周知の二量化ドメインを意味する。

図３４は、麻疹ウイルス(measeles virus, Edmonston株) 、融合糖タンパク質Ｆ１のモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図３５は、Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus,サブタイプAYW)、主要表面抗原前駆体Ｓのモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図３６は、simian Mason-Pfizer monkey virusのエンベロープ（ＴＭ）タンパク質ｇｐ２０のモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図３７は、Pseudomonas aerginosa 、フィンブリアタンパク質(fimbrial protein, Pilin) のモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図３８は、Neisseria gonorrhoeae フィンブリアタンパク質(Pilin) のモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図３９は、Hemophilus influenzae フィンブリアタンパク質のモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図４０は、Staphylococcus aureus 、毒素ショック症候群トキシン−１のモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図４１は、Staphylococcus aureus のエンテロトキシンＥ型のモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図４２は、Staphylococcus aureus のエンテロトキシンＡのモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図４３は、大腸菌(Eshedrichia coli)の熱不安定エンテロトキシンＡのモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図４４は、ヒトｃ−ｆｏｓプロトオンコジーンのモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図４５は、ヒト狼瘡(human lupus) ＫＵ自己抗原タンパク質Ｐ７０のモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図４６は、ヒトジンクフィンガータンパク質１０のモチーフ検索結果を示す。配列検索モチーフは、図２０に示すとおりである。

図４７は、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）の融合タンパク質ＤＰ１７８様領域の抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。抗ウイルス表記、ＣＤ表記、およびＩＣ₅₀は、図２７Ａ−Ｄに示す通りである。ＩＣ₅₀値は、精製したペプチドのみを用いて得た。

図４８は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＴＭ（融合）タンパク質ＤＰ１７８様領域の抗ウイルスデータおよびＣＤデータを示す。抗ウイルス表記、ＣＤ表記、およびＩＣ₅₀は、図２７Ａ−Ｄに示す通りである。”ＮＴ”は、試験していないことを示す。

図４９Ａ−Ｃは、ＤＰ１７８様ペプチドの抗ウイルスデータを示す。ここでリストされたペプチドは、ＨＩＶ−１ＢＲＵ単離物ＤＰ１７８領域（例えば、ｇｐ４１のアミノ酸残基６１５〜７１７）を取り巻く領域に由来する。

ＤＰ１７８の点突然変異を含むペプチドの例においては、突然変異したアミノ酸残基の地の部分に影を付けて示す。試験したペプチドが、付加されたかまたは除去されたアミノ末端基および／またはカルボキシ末端基を有する例においては（このようなペプチドで見出される標準的なアミノ保護基、アセチル保護基は別として）、このような修飾が見られる。図４９Ａでは、試験ペプチドの名称のすぐ右のカラムは、試験ペプチドの大きさを示し、このペプチドがＤＰ１７８領域を横切って”ウォーキング”するペプチドであるかどうかを指摘する。右側の次のカラムは、試験ペプチドが点突然変異を含むか否かを示し、その右側のカラムがあるアミノ酸配列にＤＰ１７８由来のアミノ酸配列が付加されているか、もしくは除去されているかを示す。図４９Ｂでは、試験ペプチドの名称のすぐ次のカラムは、このペプチドがＤＰ１７８の末端切断を代表するか否かを示し、その右側のカラムはこのペプチドが点突然変異を有するか否かを示し、そしてその右側のカラムは、このペプチドが、ＤＰ１７８の配列それ自身が付加されているか、もしくは除去されているアミノ酸配列を含むかどうかを示す。図４９Ｃでは、試験ペプチドの名称のすぐ次のカラムは、このペプチドが点突然変異を有するか否かを示し、そしてその右側のカラムは、このペプチドにＤＰ１７８の配列それ自身が付加されているか、もしくは除去されているかどうかを示す。ＩＣ₅₀は、図２７Ａ−Ｄで定義したとおりであり、ＩＣ₅₀値は星印（＊）をつけた以外は精製したペプチドを用いて得た。星印をつけた場合には、ＩＣ₅₀は粗精製調製物を用いて得た。

図５０は、ＤＰ１０７およびＤＰ１０７のｇｐ４１領域末端切断型ペプチドの抗ウイルスデータを示す。ＩＣ₅₀は図２７Ａ−Ｄで定義した通りであり、ＩＣ₅₀値は、星印（＊）をつけた以外は精製したペプチドを用いて得た。星印をつけた場合には、ＩＣ₅₀は粗精製調製物を用いて得た。

図５１Ａ−Ｂは、エプスタイン−バーウイルスのＢ９５−８株のＢＺＬＦ１ＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似領域ペプチドのウォーキングおよび電気泳動の移動度のシフトアッセイの結果を示す。ペプチド（Ｔ−４２３〜Ｔ−４４６、図５１Ａ；Ｔ４４７〜Ｔ４６１、図５１Ｂ）は、１個のアミノ酸残基が、アミノ酸残基１７３から２４６ヘＥＢＶＺｅｂｒａタンパク質領域を通ってウォーキングすることを表す。
この領域内のアミノ酸残基は各ペプチドの最初のアミノ酸残基に対応し、各ペプチドの左側に挙げてある。この領域の最後のアミノ酸に対応するアミノ酸は、各ペプチドの右側に挙げてある。各試験ペプチドの長さは、Ｒｅｓという見出しの下の各行の最も右側に挙げてある。
”作用する（ＡＣＴ）”は、Ｚｅｂｒａがその応答要素に結合することを阻害する試験ペプチドの能力を意味する。”＋”は目で見えるが、不完全な、応答要素／Ｚｅｂｒａホモダイマー複合体の排除を意味する。”+++ ”は、この複合体の完全な排除を意味し、”−”は複合体が破壊されないことを意味する。

図５２Ａ−Ｂは、Ｂ型肝炎ウイルスサブタイプＡＹＷの主要表面抗原前駆体Ｓタンパク質ＤＰ１７８／１０７類似領域とペプチドのウォーキングとを示す。５２ＡはドメインＩ（Ｓタンパク質のアミノ酸残基１７４〜２２０）を表し、潜在的なＤＰ１７８／１０７類似領域を含む。さらに、ドメインＩを通って”ウォーキング”するアミノ酸ペプチドを表す、あるアミノ酸を挙げてある。５２ＢにはドメインＩＩ（Ｓタンパク質のアミノ酸２３３−２９１）を示してあり、このドメインは第二のＤＰ１７８／１０７類似領域を含む。さらに、ドメインＩＩを通って”ウォーキング”するアミノ酸ペプチドを表す、あるアミノ酸を挙げてある。

５．発明の詳細な説明
抗融合活性、抗ウイルス能、および／または超らせんペプチド構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示すペプチドについて記載する。かかるペプチドとしては、第一に、ｇｐ４１由来の３６アミノ酸ペプチドであるＤＰ１７８（配列番号１）と、ＤＰ１７８の断片および類似体がある。

さらに、ここに記載する本発明のペプチドには、ＤＰ１０７の類似体であるペプチドが含まれる。ＤＰ１０７（配列番号８９）はＨＩＶ−１_LAI 膜貫通（ＴＭ）ｇｐ４１タンパク質の残基５５８から５９５に対応する３８アミノ酸からなるペプチドである。このようなＤＰ１０７類似体は抗融合能、抗ウイルス活性または超らせん構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示すことができる。

さらに、本発明のペプチドには、107x178x4 、ALLMOTI5およびPLZIP 検索モチーフにより認識されるアミノ酸配列を有するＤＰ１０７とＤＰ１７８が含まれ、それらをここに記載する。かかるモチーフについても述べる。

また、本発明ペプチドの抗融合、抗ウイルス、細胞内モジュレーターおよび診断用途についても記述する。さらに、本発明ペプチドを用いて抗融合、抗ウイルスまたは細胞内モジュレーター活性を示す化合物を同定する方法を記載する。

いかなる作用機構の理論によっても制限されないが、以下の実施例に記載した実験に一部基づいて、ＤＰ１７８の強力な抗ＨＩＶ活性を説明するために次のモデルが提案される。ＨＩＶタンパク質のｇｐ４１において、ＤＰ１７８はｇｐ４１エクトドメインのＣ末端に位置する推定上のαヘリックス領域に相当し、そしてｇｐ４１上の遠位部位と会合するらしく、その相互作用構造はＤＰ１０７と呼ばれる超らせん構造のロイシンジッパーモチーフにより影響される。これら２つのドメインの会合が融合プロセスに直接関係している分子リンケージまたは「分子クラスプ」(molecular clasp) を反映するかもしれない。ｇｐ４１のＣ末端αヘリックスモチーフ（すなわち、ＤＰ１７８ドメイン）の突然変異はｇｐ４１の融合能を高める傾向があるのに対し、ロイシンジッパー領域（すなわち、ＤＰ１０７ドメイン）の突然変異は該ウイルスタンパク質の融合能を低下または皆無にするという点には興味がもてる。ロイシンジッパーモチーフは膜融合に係わっており、一方Ｃ末端αヘリックスモチーフはウイルス誘発膜融合の際のロイシンジッパーの利用能を調節する分子安全装置として働いているのかもしれない。

前述のことに基づいて、図１１Ａ−Ｂに図式的に示されるｇｐ４１媒介膜融合の２つのモデルが提案される。２つのモデルを提案する理由は、ＤＰ１０７とＤＰ１７８により規定される領域間の相互作用の一時的な正体を、今のところはまだ正確に示すことができないためである。各モデルはｇｐ４１の２つのコンフォメーションを描写しており、一つは休止ビリオン上に見られる可能性がある「天然」状態であり、もう一つはｇｐ１２０のＣＤ４への結合後であって標的細胞膜との融合の直前に誘導されるコンフォメーション変化を反映する「融合誘導」状態である。ｇｐ１２０とＣＤ４との強い結合親和性は実際に融合プロセスの引き金となり、細胞内小胞の内部で融合するウイルスの場合に起こるようなｐＨ変化を必要のないようにしているのかもしれない。両モデルの２つの主な特徴は、(1) オリゴマーエンベロープの各鎖中のロイシンジッパー配列（ＤＰ１０７）が天然状態では離れて保持され、そして融合誘導状態ではきわめて安定した超らせんを形成するように互いに接近できること、そして(2) ＤＰ１７８部位とＤＰ１０７部位がｇｐ４１に存在するとき、それらの会合が天然状態か融合誘導状態のいずれかで起こること、である。図１１Ａは分子クラスプとしての天然状態のＤＰ１７８／ＤＰ１０７相互作用を示す。一方、エンベロープの最も安定した形態が融合誘導状態で起こると仮定するならば、図１１Ｂのモデルが考えられる。

ペプチドとして合成されたＤＰ１０７とＤＰ１７８はどちらも、おそらくはウイルスｇｐ４１と複合体を形成してその融合誘導プロセスを妨害する能力によって、ＨＩＶ感染および融合の強力な阻害剤となる。例えば、天然構造から融合誘導状態へのウイルスタンパク質の構造変化の間に、ＤＰ１７８およびＤＰ１０７ペプチドはウイルスｇｐ４１のそれぞれの結合部位に接近する機会を得る。抗ＨＩＶ活性を示すＤＰ１０７ペプチドは1994年６月23日付けの本出願人の継続中の米国特許出願第08/264,531号に記載されており、その全体を参考としてここに組み入れる。

以下の実施例に示すとおり、（ｇｐ４１の融合ペプチド、膜貫通領域および細胞質ドメインを除く）ＤＰ１０７およびＤＰ１７８の両ドメインを含むｇｐ４１のエクトドメインに対応する末端切断型組換えｇｐ４１タンパク質は、ＨＩＶ−１誘導融合を阻止しなかった。しかし、ＤＰ１０７ドメインの超らせん構造を破壊するような１つの突然変異（ＤＰ１０７ペプチドの生物学的活性を全体的に低下させる突然変異）を導入すると、その不活性組換えタンパク質はＨＩＶ−１誘導融合の活性阻害剤に変換された。この変換により、効力のあるＤＰ１７８ドメインがロイシンジッパーＤＰ１０７ドメインとの分子クラスプから解放されるのかもしれない。

論議を明快なものとするために、本発明は主にＨＩＶのＤＰ１７８ペプチド阻害剤について記載することにする。しかし、これらの原理はエンベロープのあるまたはエンベロープのない他のウイルスに、さらに他の非ウイルス生物にも同様に適用されるだろう。

5.1. ＤＰ１７８およびＤＰ１７８様ペプチド
本発明のＤＰ１７８ペプチド（配列番号１）はＨＩＶ−１_LAI 分離株由来の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸残基６３８から６７３に対応し、（アミノ末端からカルボキシ末端へと読み通して）３６アミノ酸配列を有する。

全長ＤＰ１７８（配列番号１）の３６mer のほかに、本発明のペプチドは、抗融合活性、抗ウイルス活性、および／または超らせんペプチド構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示すＤＰ１７８（配列番号１）ペプチドの末端切断体を包含する。ＤＰ１７８（配列番号１）ペプチドの末端切断体は、下記の表ＩおよびＩＡに示すような、３〜３６個のアミノ酸残基のペプチド（すなわち、トリペプチドから３６mer ポリペプチドまでの大きさのペプチド）を含むことができる。これらの表に示されるペプチド配列はアミノ末端（左）からカルボキシ末端（右）へ記載してある。「Ｘ」はアミノ基（-NH2）を、そして「Ｚ」はカルボキシル基（-COOH ）を表す。また、「Ｘ」はカルボベンジル、ダンシルまたはＴ−ブトキシカルボニルを含むがこれらに限らない疎水性基；アセチル基；９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）基；または脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコール、炭水化物またはペプチド基を含むがこれらに限らない共有結合された巨大分子基を表すことができる。さらに、「Ｚ」はアミド基；Ｔ−ブトキシカルボニル基；または脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコール、炭水化物またはペプチド基を含むがこれらに限らない共有結合された巨大分子基を表すことができる。好適な「Ｘ」または「Ｚ」巨大分子基はペプチド基である。

一文字アミノ酸表記を使用する。

さらに、
「Ｘ」はアミノ基；カルボベンゾキシル、ダンシルまたはＴ−ブチルオキシカルボニルを含むがこれらに限らない疎水性基；アセチル基；９−フルオレニルメトキシ−カルボニル基；脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコールまたは炭水化物を含むがこれらに限らない巨大分子キャリアー基を表す。

「Ｚ」はカルボキシル基；アミド基；Ｔ−ブチルオキシカルボニル基；脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコールまたは炭水化物を含むがこれらに限らない巨大分子キャリアー基を表す。

一文字アミノ酸表記を使用する。

また、本発明のペプチドはＤＰ１７８様ペプチドを包含する。本明細書中で用いる「ＤＰ１７８様」とは、第一に、ＤＰ１７８と１個以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含むＤＰ１７８末端切断体のことである。第二に、「ＤＰ１７８様」とは、ここに記載されるALLMOTI5、107x178x4 およびPLZIP 検索モチーフにより同定または認識され、かつＤＰ１７８と構造および／またはアミノ酸モチーフ類似性を有するペプチドを指す。本発明のＤＰ１７８様ペプチドは抗融合または抗ウイルス活性を示すことができ、また、超らせんペプチドが関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示すことができる。さらに、このようなＤＰ１７８様ペプチドは、例えば、増大した生物学的利用能、および／または安定性、または低減した宿主免疫認識といった、更なる有利な特徴を有する。

ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のエンベロープタンパク質は構造的に相違するが、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のＤＰ１７８に対応する領域には顕著なアミノ酸保存が存在する。アミノ酸保存はしばしば起こるものであって、構造および／または機能のいくつかの保存を示唆する。それゆえ、アミノ酸置換の可能な一クラスには、本発明のＤＰ１７８ペプチドの構造を安定化させると推定されるアミノ酸変化が含まれるだろう。ここに記載されるＤＰ１７８配列およびＤＰ１７８類似体配列を利用すると、当業者はＤＰ１７８コンセンサス配列を直ちに列挙して、それらから好適なアミノ酸置換を表すと予想される保存アミノ酸残基を突き止めることができる。

アミノ酸置換は保存された性質のものであっても保存されていない性質のものであってもよい。保存されたアミノ酸置換は、ＤＰ１７８（配列番号１）ペプチド配列の１個以上のアミノ酸を電荷、大きさおよび／または疎水性が類似したアミノ酸で置き換えることからなり、例えばグルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン酸（Ｄ）へのアミノ酸置換がある。非保存置換はＤＰ１７８（配列番号１）ペプチド配列の１個以上のアミノ酸を電荷、大きさおよび／または疎水性が類似していないアミノ酸で置き換えることからなり、例えばグルタミン酸（Ｅ）のバリン（Ｖ）へのアミノ酸置換がある。

アミノ酸挿入は１個のアミノ酸残基から成っても一続きのアミノ酸残基から成ってもよい。挿入はＤＰ１７８またはＤＰ１７８末端切断型ペプチドの内部位置ばかりでなく、該ペプチドのカルボキシまたはアミノ末端でも行われる。こうした挿入は一般的に長さが２〜１５アミノ酸の範囲である。該ペプチドのカルボキシまたはアミノ末端で行われる挿入はより広いサイズ範囲であってよく、約２個から約５０個のアミノ酸が好適である。このような挿入がここに記載される107x178x4 、ALLMOTI5またはPLZIP 検索モチーフにより依然として認識されるペプチドをもたらすか、または抗融合もしくは抗ウイルス活性を示すか、超らせんペプチド構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示すペプチドをもたらす限り、ＤＰ１７８（配列番号１）またはＤＰ１７８末端切断体に１以上の挿入を導入することができる。

好適なアミノまたはカルボキシ末端挿入体は、実際のＤＰ１７８ｇｐ４１アミノ酸配列のそれぞれアミノまたはカルボキシ末端側のｇｐ４１タンパク質領域に相当する、長さが約２個から約５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである。かくして、好適なアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸挿入体は、ｇｐ４１タンパク質のＤＰ１７８領域のアミノまたはカルボキシ末端に接して存在するｇｐ４１アミノ酸配列を含むだろう。

ＤＰ１７８（配列番号１）またはＤＰ１７８末端切断体の欠失も本発明の範囲に含まれる。このような欠失はＤＰ１７８またはＤＰ１７８様ペプチド配列からの１個以上のアミノ酸の除去から成り、その際、得られるペプチド配列の下限の長さは４〜６アミノ酸である。かかる欠失は該ペプチド配列の単一の連続部分または２以上の不連続部分を含んでいてよい。この種の欠失がここに記載される107x178x4 、ALLMOTI5またはPLZIP 検索モチーフにより依然として認識されるペプチドをもたらすか、または抗融合もしくは抗ウイルス活性を示すか、超らせんペプチド構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示すペプチドをもたらす限り、ＤＰ１７８（配列番号１）またはＤＰ１７８末端切断体に１以上の欠失を導入することができる。

ＤＰ１７８類似体については以下の第5.3 節でさらに説明する。

5.2. ＤＰ１０７およびＤＰ１０７様ペプチド
さらに、本発明のペプチドはＤＰ１０７類似体に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを包含する。ＤＰ１０７は強力な抗ウイルス活性を示し、以下に示すようなＨＩＶ−１_LAI 膜貫通（ＴＭ）ｇｐ４１タンパク質の残基５５８から５９５に対応する３８アミノ酸からなるペプチドである。

全長ＤＰ１０７（配列番号８９）の３８mer のほかに、本発明のペプチドは、抗融合活性、抗ウイルス活性、および／または超らせんペプチド構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示すＤＰ１０７（配列番号８９）ペプチドの末端切断体を包含する。ＤＰ１０７（配列番号８９）ペプチドの末端切断体は、下記の表IIおよびIIＡに示すような、３〜３８個のアミノ酸残基のペプチド（すなわち、トリペプチドから３８mer ポリペプチドまでの大きさのペプチド）を含むことができる。これらの表に示されるペプチド配列はアミノ末端（左）からカルボキシ末端（右）へ記載してある。「Ｘ」はアミノ基（-NH2）を、そして「Ｚ」はカルボキシル基（-COOH ）を表す。また、「Ｘ」はカルボベンジル、ダンシルまたはＴ−ブトキシカルボニルを含むがこれらに限らない疎水性基；アセチル基；９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）基；または脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコール、炭水化物またはペプチド基を含むがこれらに限らない共有結合された巨大分子基を表すことができる。さらに、「Ｚ」はアミド基；Ｔ−ブトキシカルボニル基；または脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコール、炭水化物またはペプチド基を含むがこれらに限らない共有結合された巨大分子基を表すことができる。好適な「Ｘ」または「Ｚ」巨大分子基はペプチド基である。

一文字アミノ酸表記を使用する。

さらに、
「Ｘ」はアミノ基；カルボベンゾキシル、ダンシルまたはＴ−ブチルオキシカルボニルを含むがこれらに限らない疎水性基；アセチル基；９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）基；脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコールまたは炭水化物を含むがこれらに限らない巨大分子キャリアー基を表す。

一文字アミノ酸表記を使用する。

本発明のペプチドはＤＰ１０７様ペプチドも包含する。本明細書中で使用する「ＤＰ１０７様」という用語は、第一に、ＤＰ１０７と、１個以上のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失したＤＰ１０７末端切断体とを指す。第二に、「ＤＰ１０７様」とは、ＤＰ１０７に対して構造および／またはアミノ酸モチーフ類似性を有する、本明細書中に説明したALLMOTI5、107x178x4およびPLZIP検索モチーフによって同定または認識されるペプチド配列を指す。本発明のＤＰ１０７様ペプチドは抗融合誘導または抗ウイルス活性を示し得るか、または超らせんペプチドが関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示し得る。さらに、このようなＤＰ１０７様ペプチドは、たとえば増大したバイオアベイラビリティ（生物学的利用能）および／または安定性または低下した宿主免疫認識のような付加的な有利な特徴を有し得る。

ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のエンベロープタンパク質は構造上異なっているが、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のＤＰ１０７対応領域内には著しく保存されたアミノ酸が存在する。このアミノ酸保存性は周期的な特徴をもっており、構造および／または機能のある程度の保存を示唆している。したがって、アミノ酸置換の１つの可能な型は、本発明のＤＰ１０７ペプチドの構造を安定化させると予想されるようなアミノ酸の変化を包含するであろう。本明細書に記載したＤＰ１０７およびＤＰ１０７類似体配列を利用することによって、当業者はＤＰ１０７コンセンサス配列を容易にまとめることができ、これらから、好ましいアミノ酸置換を表わす保存アミノ酸残基を確認することができる。

アミノ酸置換は保存性のものも非保存性のものもあり得る。保存アミノ酸置換は、たとえば、グルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）にするアミノ酸置換のように、ＤＰ１０７（配列番号８９）ペプチド配列の１個以上のアミノ酸を同様な電荷、サイズおよび／または疎水性を有するアミノ酸と置き換えることから成る。非保存置換は、たとえば、グルタミン酸（Ｅ）をバリン（Ｖ）にする置換のように、ＤＰ１０７（配列番号８９）ペプチド配列の１個以上のアミノ酸を異なる電荷、サイズおよび／または疎水性を有するアミノ酸と置き換えることから成る。

アミノ酸挿入は単一のアミノ酸残基または一連の残基から成り得る。挿入はＤＰ１０７またはＤＰ１０７末端切断ペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端で、またそのペプチドの内部のある位置で生起し得る。このような挿入は通常アミノ酸２〜１５個の長さである。対象とするペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端で生起した挿入はより広いサイズ範囲であり得ると考えられ、約２〜約５０個のアミノ酸が好ましい。このような挿入は１つまたはそれ以上、ＤＰ１０７（配列番号８９）またはＤＰ１０７末端切断体中に導入することができる。ただし、このような挿入によって得られるペプチドは、本明細書中に説明した107x178x4、ALLMOTI5またはPLZIP検索モチーフによって認識されなければならず、あるいは、抗融合誘導または抗ウイルス活性を示すか、または超らせんペプチド構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示さなければならない。

好ましいアミノ末端またはカルボキシ末端の挿入は長さが約２〜約５０個のアミノ酸残基の範囲のペプチドであり、それぞれ、実際のＤＰ１０７ｇｐ４１アミノ酸配列のアミノ側またはカルボキシ側のｇｐ４１タンパク質領域に相当する。すなわち、好ましいアミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸挿入は、ｇｐ４１タンパク質のＤＰ１０７領域のすぐアミノ側またはすぐカルボキシ側に存在するｇｐ４１アミノ酸配列を含有することになろう。

ＤＰ１０７（配列番号８９）またはＤＰ１０７末端切断体の欠失もまた本発明の範囲内である。このような欠失はＤＰ１０７またはＤＰ１０７様ペプチド配列から１個以上のアミノ酸が除去されることであり、得られるペプチド配列の下限の長さはアミノ酸４〜６個である。このような欠失はペプチド配列の単一の連続部分または１つより多くの不連続部分を含み得る。このような欠失は１つまたはそれ以上、ＤＰ１０７（配列番号８９）またはＤＰ１０７末端切断体中に導入することができる。ただし、このような欠失によって得られるペプチドは、本明細書中に説明した107x178x4、ALLMOTI5またはPLZIP検索モチーフによって認識されなければならず、あるいは、抗融合誘導または抗ウイルス活性を示すか、または超らせんペプチド構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示さなければならない。

ＤＰ１０７およびＤＰ１０７末端切断体は、１９９５年１月２７日に出願された本出願人による同時係属中の米国特許出願番号第08/374,666号（参考として全体を本明細書に組み入れる）にさらに詳しく記載されている。ＤＰ１０７類似体については下記第５．３節でさらに説明する。

５．３．ＤＰ１０７およびＤＰ１７８の類似体
上記第５．１節および第５．２節に記載した本発明のＤＰ１７８、ＤＰ１７８末端切断体、ＤＰ１０７およびＤＰ１０７末端切断体の類似体に対応するペプチドは、たとえばＨＩＶ−１_LAI以外のエンベロープウイルスや非エンベロープウイルスを始めとする他のウイルスおよび他の非ウイルス生物に見出だすことができる。

本明細書で使用する「類似体」という用語は、以下に説明する107x178x4、ALLMOTI5および／またはPLZIP検索法によって認識または同定されるペプチドを指す。さらに、そのようなペプチドは抗融合誘導能、抗ウイルス活性、または超らせん構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示し得る。

このようなＤＰ１７８類似体およびＤＰ１０７類似体は、たとえば、エンベロープウイルスのＴＭタンパク質中に存在するペプチド配列に相当し得、また非エンベロープウイルスおよび非ウイルス生物に存在するペプチド配列に相当し得る。このようなペプチドは抗融合誘導活性、抗ウイルス活性、最も特定的にはそれらの生来の配列が見出だされるウイルスに特異的な抗ウイルス活性を示し得るか、または超らせんペプチド構造が関与する細胞内プロセスをモジュレートする能力を示し得る。

ＤＰ１７８類似体は、そのアミノ酸配列が、たとえばＤＰ１７８（配列番号１）の由来元となったｇｐ４１ペプチド領域に相当する他の（すなわち、ＨＩＶ−１_LAI以外の）ウイルスのペプチド領域のアミノ酸配列からなるようなペプチドである。このようなウイルスは他のＨＩＶ−１分離株およびＨＩＶ−２分離株を包含し得るがこれらに限られるわけではない。他の（すなわち、非ＨＩＶ−１_LAI）ＨＩＶ−１分離株の相当するｇｐ４１ペプチド領域から誘導されたＤＰ１７８類似体としては、たとえば次に示すペプチド配列を挙げることができる。

配列番号３（ＤＰ１８５）、配列番号４および配列番号５はそれぞれＨＩＶ−１_SF2分離株、ＨＩＶ−１_RF分離株およびＨＩＶ−１_MN分離株に由来する。下線を施したアミノ酸残基はＤＰ１７８（配列番号１）ペプチド中の対応する位置とは異なる残基を指す。このようなＤＰ１７８類似体の１つ、ＤＰ１８５（配列番号３）を後記第６節に挙げる実施例に記載する。この実施例ではＤＰ１８５（配列番号３）が抗ウイルス活性を示すことが立証される。本発明のＤＰ１７８類似体はまたすでに記載したようにその末端切断体も包含し得る。さらに、本発明の類似体には、第５．１節でＤＰ１７８類似体に対して記載したもののような修飾体も包含される。本発明のＤＰ１７８類似体は、そのアミノ酸配列がｇｐ４１タンパク質のＤＰ１７８領域に相当するペプチドを表わすのが好ましい。本発明のペプチドはさらに、実際のＤＰ１７８アミノ酸配列のアミノ側またはカルボキシ側のｇｐ４１タンパク質領域に相当する、長さがアミノ酸残基約２〜約５０個の範囲のアミノ酸配列を包含し得ることも考えられる。

図１に示されているように、ＨＩＶ−１分離株とＨＩＶ−２分離株のＤＰ１７８配列に相当する領域内には顕著な類似性が存在する。ＨＩＶ−２_NIHZ分離株に由来するＤＰ１７８類似体は（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって読んで）３６個のアミノ酸配列をもっている。

表IIIおよび表IVにＨＩＶ−２_NIHZＤＰ１７８類似体の可能な末端切断体をいくつか示す。これらは３〜３６個のアミノ酸残基のペプチド（すなわち、トリペプチドから３６-merポリペプチドまでのサイズを有するペプチド）からなり得る。これらの表のペプチド配列はアミノ（左）末端からカルボキシ（右）末端に向かって示してある。「Ｘ」はアミノ基（−ＮＨ2）を表わし得、「Ｚ」はカルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を表わし得る。あるいは、「Ｘ」はカルボベンジル、ダンシルもしくはＴ‐ブトキシカルボニルを含むがこれらに限らない疎水性の基、アセチル基、９‐フルオレニルメトキシ‐カルボニル（ＦＭＯＣ）基、または脂質‐脂肪酸複合体、ポリエチレングリコール、炭水化物もしくはペプチドの残基を含むがこれらに限らない共有結合した巨大分子残基を表わし得る。また、「Ｚ」はアミド基、Ｔ‐ブトキシカルボニル基、または脂質‐脂肪酸複合体、ポリエチレングリコール、炭水化物もしくはペプチドの残基を含むがこれらに限らない共有結合した巨大分子残基を表わし得る。「Ｘ」または「Ｚ」の好ましい巨大分子残基はペプチド残基である。

一文字アミノ酸表記を使用する。

さらに、
「Ｘ」はアミノ基；カルボベンゾキシル、ダンシルもしくはＴ‐ブチルオキシカルボニルを含むがこれらに限らない疎水性基；アセチル基；９‐フルオレニルメトキシ‐カルボニル（ＦＭＯＣ）基；脂質‐脂肪酸複合体、ポリエチレングリコールまたは炭水化物を含むがこれらに限らない巨大分子キャリアー基を表す。

「Ｚ」はカルボキシル基；アミド基；Ｔ‐ブチルオキシカルボニル基；脂質‐脂肪酸複合体、ポリエチレングリコールまたは炭水化物を含むがこれらに限らない巨大分子キャリアー基を表す。

一文字アミノ酸表記を使用する。

ＤＰ１７８類似体およびＤＰ１０７類似体を認識または同定するには、たとえば、後記第９〜１６節および第１９〜２５節に挙げる実施例に記載して示す107x178x4、ALLMOTI5またはPLZIPコンピューター検索法の１つ以上を利用する。この検索法では、ＤＰ１０７および／またはＤＰ１７８と類似の構造および／またはアミノ酸配列特徴をもつと予想される別のペプチド領域が同定される。

この検索法については後記第９節に挙げる実施例で詳しく述べる。この検索法は、部分的に、ＤＰ１０７およびＤＰ１７８から推定された一次アミノ酸モチーフを基礎とするが、一次アミノ酸配列相同性を検索することのみに基づくのではない。すなわち、そのようなタンパク質の配列相同性は主要なウイルスグループ内には存在するがそのようなグループ間には存在しないからである。たとえば、ＨＩＶ−１の種々の株のＴＭタンパク質内またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の種々の分離株のＴＭタンパク質内では一次アミノ酸配列相同性が高い。しかし、ＨＩＶ−１とＳＩＶとの間では一次アミノ酸配列相同性が低いので有用ではない。したがって、構造的にせよ、その他にせよ、他のウイルス内または非ウイルス生物内で一次配列相同性のみに基づいてＤＰ１０７またはＤＰ１７８に類似のペプチド領域を見出だすのは不可能である。

また、たとえば特定のアミノ酸そのものではなくアミノ酸のさまざまなクラスの物理的・化学的性質に基づいてアミノ酸の一次配列を同定することは有用である可能性があるとはいっても、今までのところそのような検索法は不適切であることが証明されている。たとえば、タンパク質内の領域の超らせん特性を同定するためにLupasらによって設計されたコンピューターアルゴリズム(Lupas, A.ら、1991 Science 252:1162-1164) はＤＰ１０７またはＤＰ１７８に類似するタンパク質領域を同定するには適していない。

特に、Lupasのアルゴリズムを用いたＨＩＶ−１ｇｐ１６０（ｇｐ１２０とｇｐ４１の両方を含む）の解析ではＤＰ１０７内の超らせん領域は同定されない。しかし、ＤＰ１７８の開始Ｎ末端の８個のアミノ酸から始まってＣ末端から８個のアミノ酸で終わるＤＰ１７８内の領域は同定される。ＤＰ１０７ペプチドは安定な超らせんを形成することが実験的に示されている。したがって、Lupasの検索アルゴリズムに基づく検索ではＤＰ１０７の超らせん領域は同定されないであろう。逆に、ＤＰ１７８領域はLupasアルゴリズムにより潜在的な超らせんモチーフとして同定された。しかし、このＤＰ１７８領域から誘導されたペプチドは溶液中で超らせんを形成できなかった。

Lupasの検索アルゴリズムでＨＩＶ−１のＴＭ内の超らせん配列を正確に同定できないことの考えられる説明は、このLupasアルゴリズムが、ウイルスのＴＭタンパク質、すなわち本発明の目的である抗ウイルスペプチド（たとえばＤＰ１０７およびＤＰ１７８）と構造または機能的に類似しないタンパク質の超らせん構造に基づいていることである。

後記第９〜１６節および第１９〜２５節に挙げる実施例で立証されるように、本発明のコンピューター検索法ではＤＰ１０７またはＤＰ１７８に類似のタンパク質領域が首尾よく同定される。この検索法は、市販の配列データベースパッケージ、好ましくはPC/Geneで使用するように設計されたものである。

一連の検索モチーフ、すなわち107x178x4、ALLMOTI5およびPLZIPモチーフは、本節および第９節で述べるようにストリンジェンシーが厳格なものから広いものまでの範囲にわたるように設計・工学処理されたものである。107x178x4が好ましい。このような検索モチーフによって同定された配列、たとえば以下の表Ｖ〜XIVに挙げたものは、潜在的に抗ウイルス活性のような抗融合誘導活性を示し、また抗融合誘導（たとえば抗ウイルス）化合物の同定に有用であり得、そして本発明の範囲内にあると考えられるものである。

超らせん配列はヘプタッド（７つ）アミノ酸リピート(heptad amino acid repeats)から成ると考えられる。表示を容易にするために、このリピート内のアミノ酸の位置をＡ〜Ｇ、すなわち最初の位置をＡ、二番目をＢ、等々として指称することがある。本発明でＤＰ１０７様配列およびＤＰ１７８様配列を同定するのに使用したモチーフは、特にこのようなリピートを検索して同定するために設計されている。以下に記載するモチーフの各々の表示において、角括弧、すなわち［］、で囲ったアミノ酸は所定の位置で許容されるアミノ酸残基のみを表わし、中括弧、すなわち｛｝、で囲ったアミノ酸は所定のヘプタッド位置で許容されないアミノ酸のみを示す。括弧で囲った一組のアミノ酸の後に（）で括った数があるときには、表示したアミノ酸の組が保持される後続のアミノ酸位置の数を示す。たとえば（２）は、「ヘプタッドアミノ酸位置の次に続く２つのアミノ酸位置」を意味している。

ALLMOTI5は次のように書かれる。

このモチーフを翻訳すると、ヘプタッドアミノ酸位置のうちの最初の（Ａ）位置ではＣ、Ｄ、Ｇ、ＨまたはＰ以外の任意のアミノ酸残基が許容され、次の２つの（Ｂ、Ｃ）アミノ酸位置ではＣ、ＦまたはＰを除く任意のアミノ酸残基が許容され、４番目の位置（Ｄ）ではＣ、Ｄ、Ｇ、ＨまたはＰ以外の任意のアミノ酸残基が許容され、次の３つの（Ｅ、Ｆ、Ｇ）アミノ酸位置ではＣ、ＦまたはＰを除く任意のアミノ酸残基が許容されるということになる。このモチーフは５つの連続するヘプタッドリピート（したがって、第１行の５回反復）を検索するように設計されている。これは、３５-merの大きさのペプチドを検索することを意味している。また、最初のモチーフを４回だけ反復することによって２８-merを検索するようにも設計できる。ALLMOTI5モチーフの場合３５-merの検索が好ましい。このようなALLMOTI5モチーフによって同定されたウイルス（非バクテリオファージ）配列をこの節の最後に表Ｖとして挙げる。表Ｖに挙げたウイルス配列は、抗ウイルス活性を示す可能性があり、抗ウイルス化合物の同定に有用であり得、本発明の範囲内にあると考えられる。単一の遺伝子がALLMOTI5検索モチーフで認識される１つより多くの配列を示す場合には、これらの配列のアミノ酸残基数を「Area 2」、「Area 3」などとして表示する。この方式は、この節の最後に挙げる表の各々で使用する。

107x178x4モチーフは次のように書かれる。

このモチーフを翻訳すると、ヘプタッドアミノ酸位置のうちの最初の（Ａ）位置ではアミノ酸残基Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹのみが許容され、次の２つの（Ｂ、Ｃ）アミノ酸位置ではＣ、Ｆ、ＭまたはＰを除く任意のアミノ酸残基が許容され、４番目の位置（Ｄ）ではアミノ酸残基Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹのみが許容され、次の３つの（Ｅ、Ｆ、Ｇ）アミノ酸位置ではＣ、Ｆ、ＭまたはＰを除く任意のアミノ酸残基が許容されるということになる。このモチーフは４つの連続するリピート（したがって、第１行の４回反復）を検索するように設計されている。これは、２８-merの大きさのペプチドを検索することを意味している。また、最初のモチーフを５回反復することによって３５-merを検索するようにも設計できる。107x178x4モチーフの場合２８-merの検索が好ましい。

このような107x178x4モチーフによって同定されたウイルス（非バクテリオファージ）配列をこの節の最後に表VIとして挙げる。この節の最後の表VIIに挙げたウイルス（非バクテリオファージ）配列が好ましい。

またこの107x178x4検索モチーフを利用して、この節の最後の表VIIIに挙げる非ウイルス原核生物タンパク質配列も同定した。さらにこの検索モチーフを用いてたくさんのヒトタンパク質を見出だした。このヒトタンパク質107x178x4検索の結果をこの節の最後の表IXに挙げる。したがって、表VIIIおよびIXに挙げた配列は、抗融合誘導化合物として、または抗融合誘導化合物の同定に有用であり得るペプチドを明らかにし、本発明の範囲内にはいるものと考えられる。

PLZIPシリーズのモチーフは図１９に示した通りである。これらのモチーフは、少なくとも１個のプロリン残基がリピートのＮ末端からある所定距離のところに存在するようなロイシンジッパー超らせん様ヘプタッドを同定するように設計されている。これらのPLZIPモチーフは、通常膜貫通アンカーのちょうどＮ末端のところに位置しているＨＩＶ−１ＤＰ１７８と類似するタンパク質領域を見出だす。これらのモチーフは上記と同じ方式に従って翻訳できる。図１９に示した各々の線は単一の完全な検索モチーフを示している。これらのモチーフの「Ｘ」は任意のアミノ酸残基を指す。モチーフが括弧内に２つの数字を含んでいる場合、これはアミノ酸残基の数が変化し得ることを示す。たとえば、Ｘ（１，１２）は、「次の１〜１２個のアミノ酸残基が任意のアミノ酸であり得る」と解釈される。

この節の最後にある表Ｘ〜XIVに、このようなPLZIPモチーフを用いた検索によって同定された配列を示す。特に、表ＸにはPCTLZIP 、P1CTLZIPおよびP2CTLZIP検索モチーフによって同定されたウイルス配列を示し、表XIにはP3CTLZIP、P4CTLZIP、P5CTLZIPおよびP6CTLZIP検索モチーフによって同定されたウイルス配列を示し、表XIIにはP7CTLZIP、P8CTLZIPおよびP9CTLZIP検索モチーフによって同定されたウイルス配列を示し、表XIIIにはP12LZIPC検索モチーフによって同定されたウイルス配列を示し、表XIVにはP23TLZIPC検索モチーフによって同定されたウイルス配列を示す。これらの表に挙げたウイルス配列は、潜在的に抗ウイルス活性を示すペプチドを表わし、抗ウイルス化合物の同定に有用であり得、本発明の範囲内にあると考えられるものである。

後記第１７、１８、２６および２７節に挙げる実施例で、本明細書に記載したモチーフ検索によって同定されたウイルス配列が実質的な抗ウイルス特性をもつことを立証する。特に、第１７節に挙げる実施例では抗ＲＳ（呼吸シンシチアル： respiratory syncytial）ウイルス活性をもつペプチドについて記載し、第１８節に挙げる実施例では抗パラインフルエンザウイルス活性をもつペプチドについて記載し、第２６節に挙げる実施例では抗麻疹ウイルス活性をもつペプチドについて記載し、第２７節に挙げる実施例では抗サル免疫不全ウイルス活性をもつペプチドについて記載する。

ＤＰ１０７類似体およびＤＰ１７８類似体はさらに、第５．１節でＤＰ１７８について前記した追加的な基のいずれかを含有していてもよい。たとえば、これらのペプチドは「Ｘ」基について前記した別のアミノ末端基のいずれかを含んでいてもよいし、また「Ｚ」基について前記したカルボキシ末端基のいずれかを含んでいてもよい。

また、同定されたＤＰ１０７ペプチドおよびＤＰ１７８ペプチドの末端切断体が本発明のペプチドの中にはいる。さらに、このようなＤＰ１０７およびＤＰ１７８の類似体ならびにＤＰ１０７／ＤＰ１７８類似体の末端切断体は１つ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を示してもよい。ＤＰ１７８類似体のアミノ酸の置換、挿入および欠失は第５．１節でＤＰ１７８様ペプチドについて記載した通りである。ＤＰ１０７類似体のアミノ酸の置換、挿入および欠失もまた第５．２節でＤＰ１０７様ペプチドについて記載した通りである。

以下の表XV〜XXIIにこのようなＤＰ１０７／ＤＰ１７８末端切断体の代表例を示す。特に、表XVはＲＳウイルスＦ１領域のＤＰ１０７類似体のカルボキシ末端切断体を示しており、表XVIはＲＳウイルスＦ１領域のＤＰ１０７類似体のアミノ末端切断体を示しており、表XVIIはＲＳウイルスＦ１領域のＤＰ１７８類似体のカルボキシ末端切断体を示しており、表XVIIIはＲＳウイルスＦ１領域のＤＰ１７８類似体のアミノ末端切断体を示しており、表XIXはヒトパラインフルエンザウイルス３Ｆ１領域のＤＰ１７８類似体のカルボキシ末端切断体を示しており、表XXはヒトパラインフルエンザウイルス３Ｆ１領域のＤＰ１７８類似体のアミノ末端切断体を示しており、表XXIはヒトパラインフルエンザウイルス３Ｆ１領域のＤＰ１０７類似体のカルボキシ末端切断体を示しており、表XXIIはヒトパラインフルエンザウイルス３Ｆ１領域のＤＰ１０７類似体のアミノ末端切断体を示している。また、下記表XXIIIは実質的な抗ウイルス活性をもつＤＰ１０７／ＤＰ１７８類似体および類似体の末端切断体を示す。これらの抗ウイルスペプチドは、ＲＳウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス３、サル免疫不全ウイルスおよび麻疹ウイルスを始めとして、これらペプチドが阻害する特定のウイルスに従ってグループ分けされている。

一文字アミノ酸表記を使用する。

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５．４．ペプチドの合成
本発明のペプチドは、当技術に周知の手法によって合成または調製してよい。例えば、Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NYを参照されたく、これは、その全体を本明細書中に参考として援用する。例えば短いペプチドは、固体の支持体上または溶液中で合成することができる。より長いペプチドは、組換えＤＮＡの手法を用いて製造できる。ここでは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を、当業者に周知の手法に従って合成および／またはクローニングし、そして発現させてよい。例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY を参照されたい。

あるいはまた、本発明のペプチドを、該ペプチドのアミノ酸残基に連結する結合のうち一つまたはそれ以上が非ペプチド結合であるように合成してもよい。これらの代替的非ペプチド結合は、当業者に周知の反応を利用することによって形成してよく、ほんの少数を示すならば、イミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジドおよびアゾ結合を包含するが、それらに限られない。本発明の更にもう一つの実施態様では、上記の配列を含むペプチドは、それらのアミノおよび／またはカルボキシル末端に存在する追加の化学結合によって、例えば、該ペプチドの安定性、生物学的利用能および／または阻害活性が高められるように合成してよい。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシルまたは t−ブチルオキシカルボニル基のような疎水性の基を、該ペプチドのアミノ末端に付加してよい。同様に、アセチル基または９−フルオレニルメトキシ−カルボニル基を該ペプチドのアミノ末端に置いてもよい（上記の表１〜４中の「Ｘ」を参照されたい）。その上、該疎水性の基、tert−ブチルオキシカルボニルまたはアミド基を、該ペプチドのカルボキシル末端に付加してもよい（上記の表１〜４中の「Ｚ」を参照されたい）。

更に、本発明のペプチドは、それらの立体配置が変化するように合成してもよい。例えば、該ペプチドのアミノ酸残基のうち１個またはそれ以上の、通常のＬ型異性体ではなく、Ｄ型異性体を用いてもよい。

また更に、本発明のペプチドのアミノ酸残基のうち少なくとも１個を、天然には産しない周知のアミノ酸残基のうち１個で置き換えてもよい。これらのような変化は、本発明のペプチドの安定性、生物学的利用能および／または阻害作用を増大させるのに役立ち得る。

その上、上記のペプチドはいずれも、それらのアミノおよび／またはカルボキシル末端に共有結合した高分子担体の基を有してよい。そのような高分子担体基は、例えば、脂質−脂肪酸接合体、ポリエチレングリコール、炭水化物または追加のペプチドを包含し得る。したがって、上記の表１〜４での「Ｘ」は、該ペプチドのアミノ末端に共有結合した上記高分子担体基のいずれを追加的に表してもよく、追加のペプチド基が好適である。同様に、表１〜４での「Ｚ」は、上記高分子担体基のいずれを追加的に表してもよい。

５．５．抗膜融合活性についてのアッセイ
本明細書に記載されているのは、ある化合物、例えば本発明のペプチドが膜融合の現象を阻害できる能力のための方法である。具体的には、細胞融合の現象についてのアッセイを下記の第５．５．１節に記載し、抗ウイルス活性についてのアッセイを下記の第５．５．２節に記載する。

５．５．１．細胞融合の現象についてのアッセイ
細胞融合の現象についてのアッセイは、当業者に周知であり、例えば、本発明のペプチドとともに用いて、該ペプチドの抗融合誘導能力を試験し得る。

細胞融合アッセイは、一般的にはin vitroで実施される。そのようなアッセイは、いかなる処理の不在下でも、観察できるレベルのシンシチウム(syncytial)形成を生じることになる細胞を培養することを含んでよい。例えば、細胞融合を誘導するウイルスに慢性的に感染した細胞の存在下で、未感染細胞をインキュベートしてよい。そのようなウイルスは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＲＳウイルスを包含するが、それらに限られない。

アッセイのためには、検定しようとするペプチドの存在下で、細胞をインキュベートする。各ペプチドについて、ある範囲のペプチド濃度を試験してよい。この範囲は、ペプチドを全く加えなかった対照培養を包含しなければならない。

細胞を培養するための、当業者に周知の標準的条件を用いる。適切な期間（例えば、３７℃で２４時間）のインキュベートの後、細胞融合およびシンシチウム形成の表示である多核巨大細胞の存在について、培養体を顕微鏡で調べる。周知の染色、例えばクリスタルバイオレット染色を用いて、シンシチウム形成の視覚化を容易にしてよい。

５．５．２．抗ウイルス活性についてのアッセイ
本発明のペプチドが示す抗ウイルス活性は、例えば、該ペプチドがシンシチウム形成を阻害できる能力、または細胞から遊離したウイルスによる感染をそれらが阻害できる能力を試験できるin vitroアッセイ、例えば下記のそれらを容易に実施することによって、測定してよい。これらのアッセイを用いて、該ペプチドの相対的抗ウイルス活性、与えられたウイルスの系統に対する証拠、および／または該ペプチドの系統特異的阻害活性のようなパラメータを決定することができる。

細胞融合アッセイは、ウイルスで誘導される、例えばＨＩＶで誘導されるシンシチウム形成を該ペプチドが阻害できることを、in vitroで試験するのに利用してよい。そのようなアッセイは、シンシチウム誘導性ウイルスに慢性的に感染した細胞、および検定しようとするペプチドの存在下で、未感染細胞を培養することを含んでよい。各ペプチドについて、ある範囲のペプチド濃度を試験してよい。この範囲は、ペプチドを全く加えなかった対照培養を包含しなければならない。細胞を培養するための、当業者に周知の標準的条件を用いる。適切な期間（例えば、３７℃で２４時間）のインキュベートの後、細胞融合およびシンシチウム形成の表示である多核巨大細胞の存在について、培養体を顕微鏡で調べる。周知の染色、例えばクリスタルバイオレット染色を用いて、シンシチウム形成の視覚化を容易にしてよい。ＨＩＶを例にとると、そのようなアッセイは、慢性的ＨＩＶ感染細胞、および検定しようとするペプチドの存在下で培養した（例えばMoltまたはＣＥＭ細胞のような）ＣＤ−４+ 細胞を含むことになると思われる。

ペプチドの抗ウイルス能力を試験するために、ウイルス感染のその他の周知の特徴も検定してよい。再びＨＩＶを例にとると、細胞から遊離したＨＩＶによるＣＤ−４+ 細胞の感染を該ペプチドが阻害できる能力を試験するために、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを利用してよい。そのようなアッセイは、試験しようとするペプチドの存在下で、適切な濃度（すなわちTCID₅₀）のウイルスおよびＣＤ−４+ 細胞を培養することを含んでよい。当業者に周知の培養条件を用いる。上記のとおり、ペプチドを全く加えなかった対照培養に加えて、ある範囲のペプチド濃度を用いてよい。適切な培養期間（例えば７日間）のインキュベートの後、標準的手順を用いて、細胞を含まぬ上清を調製し、好成績の感染の尺度としてのＲＴ活性の存在について試験する。ＲＴ活性は、例えば、Goffら（Goff, S. et al., 1981. J. Virol. 38:239-248)および／またはWilleyら（Willey, R. et al., 1988, J. Virol. 62:139-147)が記載されたように、標準的手法を用いて試験してよい。これらの参照文献は、その全体を本明細書中に参考として援用する。

非レトロウイルス活性を検定するには、当業者に周知である標準的方法を利用してよい。例えば、ＲＳウイルスおよびパラインフルエンザウイルスの活性のアッセイ手法の考察について、Pringle ら（Pringle, C.R. et al., 1985, J. Medical Virology 17:377-386）を参照されたい。更に、例えば、そのような手法の全般的概観について、"Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W.K. et al., eds., Appleton & Lange, Norwalk, CT, 19th ed.を参照されたい。これらの参照文献は、その全体を本明細書中に参考として援用する。加えて、下記で、第１７、１８、２６および２７節に示した実施例は、それぞれ、化合物の抗ウイルス能力の試験のための追加のアッセイを提供する。

例えば、本発明のペプチドの抗ウイルス活性を試験するのに、in vivo アッセイも利用してよい。例えば、抗ＨＩＶ活性について試験するには、Barnett ら（Barnett, S.W. et al., 1994, Science 266:642-646)に記載のin vivo モデルを用いてよい。

加えて、周知のマウスモデルを用いて、抗ＲＳＶ活性をin vivo で検定することができる。例えば、様々な近交系のマウスにＲＳＶを経鼻投与することができる。ウイルスは、すべての系統の肺で複製するが、最高力価は、Ｐ／Ｎ、Ｃ５７Ｌ／Ｎ、およびＤＢＡ／２Ｎのマウスで得られる。ＢＡＬＢ／ｃマウスの感染は、リンパ球浸潤物と、肺組織１ｇあたり１０⁴ 〜１０⁵ pfu の肺ウイルス力価を特徴とする、無症候性気管支梢炎を生じる（Taylor, G. et al., 1984, Infect. Immun. 43:649-655）。

ＲＳＶのコトンラットモデルも周知である。ウイルスは、コトンラットの鼻および肺で高力価にまで複製するが、あるとしても、僅かな炎症の徴候を生じるにすぎない。

５．６．本発明のペプチドの用途
本発明のペプチドは、抗融合誘導性もしくは抗ウイルス性の化合物として、または超らせんペプチド構造を伴う細胞内過程を調節する化合物として利用してよい。更に、そのような化合物は、抗融合誘導性、抗ウイルス性または細胞内調節性の活性を示す薬剤を同定するのに用いてよい。また更に、本発明のペプチドは、生物またはウイルスの型／亜型特異的診断の手段として利用してよい。

本発明のペプチドの抗融合誘導能力は、膜融合現象を伴う過程によって生じる症候を阻害または治療／改善するのに、追加的に利用してよい。そのような現象は、例えば、細胞−細胞融合によるウイルス伝播、細胞融合による異常な神経伝達物質交換、および精子−卵融合を包含し得る。更に、本発明のペプチドは、遊離ウイルス、例えばレトロウイルス、特にＨＩＶの、そのようなウイルスの感染が膜融合現象を伴うか、または細胞膜とのウイルス構造の融合を伴う、未感染細胞への伝播を阻害するのに用いてよい。本発明のペプチドが改善し得る、超らせんペプチド構造を伴う細胞内疾患のうちでは、例えば、細菌性毒素を伴う疾患が挙げられる。

抗ウイルス活性については、その伝播が本発明のペプチドによって阻害され得るウイルスは、表５〜７および９〜１４で上記に列挙したウイルスの全系統を包含するが、それらに限られない。

これらのウイルスは、例えば、ヒトレトロウイルス、特にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、ならびにヒトＴリンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ−１および２）を包含する。その伝播が本発明のペプチドによって阻害され得る非ヒトレトロウイルスは、ウシ白血症ウイルス、ネコの肉腫および白血病ウイルス、サルの免疫不全、肉腫および白血病ウイルス、ならびにヒツジ進行性肺炎ウイルスを包含するが、それらに限られない。

その伝播が本発明のペプチドによって阻害され得る非レトロウイルス系ウイルスは、ヒトＲＳウイルス、イヌのジステンパーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒトのパラインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサル・メーソン・ファイザーウイルスを包含するが、それらに限られない。

その伝播が本発明のペプチドによって阻害され得る無外皮ウイルスは、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、腸内ウイルス、エコーウイルスおよびコクサッキーウイルスのようなピコルナウイルス、乳頭種ウイルスのようなパポーバウイルス、パルボウイルス、アデノウイルスおよびレオウイルスを包含するが、それらに限られない。

下記第５．５．１節に、また下記第８節に、より充分に考察するとおり、ＤＰ１０７、ＤＰ１７８、ＤＰ１０７類似体およびＤＰ１７８類似体のペプチドは、ウイルスの正常な活性に必要とされる非共有結合のタンパク質−タンパク質相互作用を形成する。したがって、本発明のペプチドは、そのようなタンパク質−タンパク質相互作用を妨げ、そのため抗ウイルス剤として作用し得る、化合物の同定のためのアッセイの構成要素としても利用してよい。これらのアッセイは、下記で第５．５．１節に考察する。

下記で第６節に提示した実施例で立証するとおり、本発明のペプチドの抗ウイルス活性は、傑出した型および亜型特異性を示し得る。すなわち、特異的ペプチドが、特異的ウイルスのみの活性を阻害するのに効果的であり得る。本発明のこの特徴は、多くの利点を提供し得る。例えば、そのような利点の一つは診断の分野にあり、ここで、ウイルス単離物の正体を確認するのに本発明のペプチドの抗ウイルス特異性を用いることができる。ＨＩＶについては、あるウイルス単離物がＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２系統からなるか否かを容易に決定し得る。例えば、未感染ＣＤ−４+ 細胞を、ＨＩＶのＤＰ１７８（配列番号１）のペプチドを含むとして同定された単離物とともに同時感染させ、その後、細胞上清のレトロウイルス活性を、例えば、上記に第５．２節に記載の手法を用いて、検定してよい。そのレトロウイルス活性が完全に、または殆ど完全に阻害された単離物は、ＨＩＶ−１を含有する。そのウイルス活性が不変であるか、または少量だけ低下するにすぎない単離物は、ＨＩＶ−１を含有しないと考えてよい。そうして、そのような単離物を、本発明の一つまたはそれ以上の他のＤＰ１７８ペプチドで処理してよく、次いで、該ウイルス単離物の正体を決定するために、そのウイルス活性について試験してよい。本発明のＤＰ１０７およびＤＰ１７８類似体は、特異的ペプチド配列が見出されるウイルスまたは生物の型および亜型に特異的な診断能にも利用してもよい。ＤＰ１７８について上記に記載したような診断手順を、問題とされるＤＰ１０７／ＤＰ１７８類似体とともに用いてよい。

５．５．１．スクリーニングアッセイ
下記の第８節に示した実施例で立証したとおり、ＴＭタンパク質ｇｐ４１のＤＰ１０７およびＤＰ１７８の部分は、非共有結合のタンパク質−タンパク質相互作用を形成する。やはり立証されたとおり、そのような相互作用の保持は、正常なウイルス感染性に必要である。したがって、ＤＰ１０７に結合し、ＤＰ１７８に結合し、および／または正常なＤＰ１０７／ＤＰ１７８タンパク質−タンパク質相互作用を破壊するよう作用する化合物は、抗融合誘導性、抗ウイルス性または細胞性調節の薬剤として作用し得る。下記に説明するのは、そのような化合物の同定のためのアッセイである。考察を容易かつ明瞭にするため、ＤＰ１０７およびＤＰ１７８のペプチドを、記載のアッセイの構成要素として用いることになるが、上記に第５．１〜５．３節に記載のＤＰ１０７類似体ペプチドまたはＤＰ１７８類似体ペプチドのいずれをも、化合物に対するこれらのふるいの一部として用いてもよいことに留意されたい。

ＤＰ１０７、ＤＰ１７８と結合でき、および／またはＤＰ１０７／ＤＰ１７８相互作用を破壊できる能力について試験してよく、したがって、抗融合誘導性、抗ウイルス性または細胞内調節性の化合物を潜在的に示す化合物は、Ｄおよび／またはＬ型立体配置のアミノ酸で製造されたペプチド（例えばランダムペプチドライブラリーの形態；Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354:82-84を参照されたい）、ホスホペプチド（例えばランダムに、または部分的に縮重した、指向性ホスホペプチドライブラリーの形態；例えばSongyang, Z. et al., 1993, Cell 72:767-778を参照されたい）、抗体、ならびに小型の有機または無機分子を包含するが、それらに限られない。合成化合物、天然産物、および潜在的に効果的な材料のその他の源泉を、本節に記載したとおりの様々な方法でふるい分けしてよい。

同定された化合物、抗体または他の分子は、例えば、上記に第５．５節で記載したそれらのようなアッセイを利用して、例えば、細胞融合またはウイルス活性を阻害できることについて試験してよい。

試験してよいペプチドのうちでは、ＤＰ１０７および／またはＤＰ１７８のドメインを含む可溶性ペプチド、ならびにそのドメインの一方もしくは双方内に一つもしくはそれ以上の突然変異を有するＤＰ１０７および／またはＤＰ１７８のドメインを含むペプチド、例えば、下記で、第８節に提示した実施例に記載した、ＤＰ１７８配列中にイソロイシンからプロリンへの突然変異を有するＭ４１−Ｐが挙げられる。

そのようなスクリーニング法の一実施態様には、抗ウイルス能力について試験しようとする化合物を同定する方法であって：
（ａ）少なくとも１種類の化合物を、ＤＰ１０７ペプチドを含むペプチドに、該化合物をＤＰ１０７ペプチドと結合させるのに充分な時間接触させること；
（ｂ）結合しなかった化合物を除去すること；
（ｃ）ＤＰ１０７ペプチドと結合した化合物の存在を決定し、それによって抗ウイルス能力について試験しようとする薬剤を同定すること；
を含む方法がある。

そのようなスクリーニング法の第二の実施態様には、抗ウイルス能力について試験しようとする化合物を同定する方法であって：
（ａ）少なくとも１種類の化合物を、ＤＰ１７８ペプチドを含むペプチドに、該化合物をＤＰ１７８ペプチドと結合させるのに充分な時間接触させること；
（ｂ）結合しなかった化合物を除去すること；
（ｃ）ＤＰ１７８ペプチドと結合した化合物の存在を決定し、それによって抗ウイルス能力について試験しようとする薬剤を同定すること；
を含む方法がある。

そのようなＤＰ１０７結合性またはＤＰ１７８結合性化合物の単離に追求してよいこれらの形式の取組み方を利用する一つの方法は、ＤＰ１０７またはＤＰ１７８ペプチドのいずれかを、例えば、アガロースもしくはプラスチックのビーズ、微量滴定プレートのウェル、ペトリ皿、または、例えばナイロンもしくはニトロセルロースで構成された膜のような、固体基質に付着させることを包含すると思われる。そのようなアッセイ系では、ＤＰ１０７またはＤＰ１７８タンパク質のいずれかを、固体表面に固着させてよく、固着していない化合物、すなわち試験物質を直接的もしくは間接的に標識する。実施には、マイクロタイタープレートを利用するのが好都合である。固着させた成分は、非共有結合または共有結合によって固定化してよい。非共有結合は、該固体表面を該タンパク質の溶液で被覆し、乾燥することによって、簡単に達成し得る。

あるいはまた、該タンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を、タンパク質を固体表面に固着させるのに用いてもよい。該表面は、前もって調製し、保存しておいてよい。

このアッセイを実施するには、固着させたＤＰ１０７またはＤＰ１７８ペプチドを含有する被覆表面に、標識した化合物を加える。反応が完了した後、形成されたいかなる複合体も、固体表面に固定化されて存続するような条件下で、未反応成分を（例えば洗浄によって）除去する。固体表面に固着した複合体の検出は、数多くの方法で達成できる。化合物が標識済みである場合は、該表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。標識される成分が標識済みでない場合は、間接的な標識を用いて、例えば、該化合物に特異的な標識された抗体（この抗体は、次に、直接標識されるか、または標識された抗Ｉｇ抗体で間接的に標識され得る）を用いて、表面に固着した複合体を検出することができる。

あるいはまた、そのようなアッセイを液相中で実施し、反応生成物を未反応成分から分離し、例えば、ＤＰ１０７またはＤＰ１７８に特異的な、いずれも与えられたアッセイに適切である固定化抗体、または該化合物、すなわち試験物質に特異的なａｂ抗体を用いて、溶液中に形成されたいかなる複合体、および固着した複合体を検出するための複合体の他方の成員に特異的な標識された抗体も固着させて、複合体を検出することができる。

このような手順を利用することによって、非常に多数の形式の分子を、ＤＰ１０７またはＤＰ１７８結合能力について、したがってまた潜在的抗ウイルス活性について同時にスクリーニングし得る。

更に、ＤＰ１０７／ＤＰ１７８複合体の形成を阻害できるか、または、これに代えて、該複合体を破壊できる能力について、化合物をスクリーニングしてもよい。次いで、そのような化合物を、抗融合誘導、抗ウイルスまたは細胞内調節の能力について試験してよい。説明を容易にするため、ＤＰ１０７およびＤＰ１７８を「結合パートナー」と呼ぶことにする。そのような相互作用を破壊する化合物は、抗ウイルス活性を示し得る。そのような化合物は、上記の抗体、ペプチドなどのような分子を包含するが、それらに限られなくてよい。

ＤＰ１０７およびＤＰ１７８ペプチド間の相互作用を妨げる化合物を同定するのに用いられるアッセイ系の基本原理は、両ペプチドを相互作用かつ結合させ、こうして複合体を形成させるのに充分な条件および時間で、ペプチドを含有する反応混合物を調製することを必要とする。破壊の活性について化合物を試験するには、試験化合物の存在下および不在下で反応を実施する。すなわち、試験化合物を、初めに反応混合物に含ませるか、または結合パートナーの一方の添加後のある時間に加えてよく、対照は、試験化合物なしに、または偽薬とともにインキュベートする。次いで、結合パートナー間のいかなる複合体の形成も検出する。試験化合物を含有する反応混合物ではなく、対照反応での複合体の形成は、該化合物が、ＤＰ１０７およびＤＰ１７８ペプチドの相互作用を妨げることを示す。

結合パートナー間の相互作用を妨げる化合物についてのアッセイは、不均質または均質な様式で実施することができる。不均質アッセイは、結合パートナーの一方を固相に固着させ、反応の終点で固相に固着した複合体を検出することを必要とする。均質アッセイでは、反応全体を液相中で実施する。いずれの取組み方でも、反応物の添加の順序を変化させて、試験される化合物に関して異なる情報を得ることができる。例えば、結合パートナー間の相互作用を、例えば競合によって妨げる化合物は、試験物質の存在下で反応を実施すること、すなわち試験物質を結合パートナーより前か、またはそれと同時に反応混合物に加えることによって同定できる。一方、形成済みの複合体を破壊する試験化合物、例えば結合パートナーの一方を複合体から転置させる、より高い結合定数を有する化合物は、複合体が形成された後に、試験化合物を反応混合物に加えることによって試験することができる。様々な様式を下記に簡単に説明する。

不均質アッセイ系では、一方の結合パートナー、例えばＤＰ１０７またはＤＰ１７８ペプチドのいずれかを、固体表面に固着させ、固着させていないその結合パートナーを、直接または間接的のいずれかで標識する。実施には、マイクロタイタープレートを利用するのが好都合である。固着させた化学種は、非共有結合または共有結合によって固定化してよい。非共有結合は、該固体表面を該タンパク質の溶液で被覆し、乾燥することによって、簡単に達成し得る。あるいはまた、該タンパク質に特異的な固定化抗体を、タンパク質を固体表面に固着させるのに用いてもよい。該表面は、前もって調製し、保存しておいてよい。

このアッセイを実施するには、固定化された化学種の結合パートナーを、試験化合物とともに、またはそれなしで被覆表面に加える。反応が完了した後、未反応成分を（例えば洗浄によって）除去し、形成されたいかなる複合体も、固体表面に固定化されて存続することになる。この固体表面に固着した複合体の検出は、多数の方法で達成できる。結合パートナーが標識済みだった場合は、該表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。結合パートナーが標識済みでない場合は、間接的な標識を用いて、例えば、該結合パートナーに特異的な標識された抗体（この抗体は、次に、直接標識されるか、または標識された抗Ｉｇ抗体で間接的に標識され得る）を用いて、表面に固着した複合体を検出することができる。反応成分の添加の順序に応じて、複合体形成を阻害するか、または形成済みの複合体を破壊する試験化合物が検出できる。

あるいはまた、この反応を、試験化合物の存在または不在下で、液相中で実施し、反応生成物を未反応成分から分離し、例えば、一方の結合パートナーに特異的な固定化抗体を用いて、溶液中に形成されたいかなる複合体も、また固着した複合体を検出するための複合体の他方の結合パートナーに特異的な標識された抗体も固着させて、複合体を検出することができる。やはり、該液相への反応物の添加の順序に応じて、複合体形成を阻害するか、または形成済みの複合体を破壊する試験化合物を同定することができる。

本発明の代替的実施態様では、均質アッセイ系を用いることができる。この取組み方では、ＤＰ１０７およびＤＰ１８７ペプチドの形成済み複合体を調製するが、ここで、この結合パートナーの一方を標識するが、標識が発生するシグナルは、複合体形成のために消滅する（例えば、免疫アッセイにこの取組み方を利用するRubensteinによる米国特許第4,109,496 号明細書を参照されたい）。結合パートナーの一方と競合し、それを形成済み複合体から転置する試験物質の添加は、バックグラウンドを上回るシグナルの発生を招くことになる。このようにして、ＤＰ−１０７／ＤＰ−１７８のタンパク質−タンパク質相互作用を破壊する試験物質を同定することができる。

代替的スクリーニングアッセイでは、ＤＰ１７８／ＤＰ１０７複合体に特異的に反応する抗体（すなわち、ＤＰ１０７またはＤＰ１７８のいずれをも個々には認識しない抗体）を用いて免疫測定法で測定される限りで、ＤＰ１７８／ＤＰ１０７相互作用を破壊できるそれらの能力について、試験化合物を検定し得る。そのようなアッセイは、競合的アッセイとして作用し、当業者には周知の手法に基づく。

上記の競合アッセイは、ＤＰ１７８およびＭ４１Δ１７８ペプチドを用い、下記で、第８節に提示した実施例で説明するとおり、ヒト組換えＦａｂであるＦａｂ−ｄによってＤＰ１７８／Ｍ４１Δ１７８複合体を免疫測定法で視覚化することによりこれら両ペプチドが形成する複合体の破壊について試験化合物を検定することによって、例示のためであって限定のためでなく、説明され得る。Ｍ４１Δ１７８は、そのＤＰ１７８ドメインが削除されたｇｐ４１領域を含むマルトース結合性融合タンパク質であり、下記で、第８節に提示した実施例で説明する。

そのようなアッセイを利用して、Ｍ４１Δ１７８を、マイクロタイターウェルのような固体支持体に固定化してよい。次いで、試験化合物の一連の希釈物を、一定の濃度のＤＰ−１７８ペプチドの存在下で、Ｍ４１Δ１７８を含む各ウェルに加える。例えば室温で１時間の、インキュベートの後、未結合ＤＰ−１７８および試験化合物をウェルから除去し、次いで、ウェルをＤＰ１７８／Ｍ４１Δ１７８特異的Ｆａｂ−ｄ抗体とともにインキュベートする。インキュベートおよび洗浄の後、未結合Ｆａｂ−ｄをプレートから除去し、結合Ｆａｂ−ｄを定量する。阻害剤ではない対照も実施しなければならない。ＤＰ１７８／Ｍ４１Δ１７８複合体の形成を破壊できる能力を示す試験化合物は、それらのＦａｂ−ｄ結合のレベルの濃度依存性の上昇によって同定される。

そのようなアッセイの変形は、ＤＰ１７８結合の競合体についての阻害定数を有するリガンドの結合定数の決定のために、Ｍ４１Δ１７８とのＤＰ１７８の結合を直接測定できる、高速の高処理量の結合アッセイを実施するのに利用してよい。

そのようなアッセイは、許容された放射性リガンドおよび受容体結合原理を利点とする（例えば、Yamamura, H.I. et al., 1985, "Neurotransmitter Receptor Binding", 2nd ed., Raven Press, NYを参照されたい）。上記のとおり、Ｍ４１Δ１７８を、マイクロタイターウェルのような固体支持体に固定化する。次いで、Ｍ４１Δ１７８とのＤＰ１７８の結合を、 ¹²⁵Ｉ−ＤＰ１７８として結合したＤＰ１７８の分画を測定し、標識された各ＤＰ１７８調製品について決定された比活性の値（ペプチド１μg あたりのdpm)を用いて、結合した総量を算出することによって定量する。Ｍ４１Δ１７８との特異的結合は、微量滴定ウェルでの標識ＤＰ１７８調製品の結合（総結合）と、それに加えて過剰な非標識ＤＰ１７８を含む同一ウェルでの結合（非特異的結合）との差として定義される。

５．５．製剤配合物、用量、および投与の様式
本発明のペプチドは、当業者に周知の手法を用いて投与してよい。好ましくは、薬剤を配合し、全身的に投与する。配合および投与の手法は、”Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA に見出し得る。適切な経路は、ごく少数を指名するならば、経口、直腸、経粘膜または腸内投与；筋内、皮下、髄内への注射などの非経口送達、ならびに莢膜内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻内または眼内の注射を包含し得る。注射のためには、本発明の薬剤を、水溶液として、好ましくはハンクス液、リンゲル液または生理食塩水緩衝液のような生理学的に融和できる緩衝液として配合してよい。そのような経粘膜投与のためには、透過させようとする障壁に対して適切な浸透剤を配合物中に用いる。そのよう浸透剤は、当技術に一般的に公知である。

本発明のペプチドまたは他の阻害性薬剤の細胞内投与が好適である場合は、当業者に周知の手法を用いてよい。例えば、そのような薬剤をリポソームに封入し、次いで、上記のとおり投与してよい。リポソームは、水性の内部を有する球形の脂質二重層である。リポソーム形成の時点で水溶液中に存在する全ての分子が、水性の内部に組み込まれる。リポソームの内容は、外部の微環境からともに防護され、リポソームが細胞膜と融合するため、細胞の細胞質中に効果的に送達される。その上、それらが疎水性であるため、小分子を投与しようとするときは、直接の細胞内投与が達成され得る。

細胞内に投与しようとする本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当技術に周知の手法を用いて、問題の細胞で発現させ得る。例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシ乳頭種ウイルスのようなウイルスに由来する発現ベクターを、標的細胞集団へのそのようなヌクレオチド配列の送達および発現に用いてよい。そのようなベクターの構築、および構築体の発現の方法は周知である。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,NYおよびAusubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY を参照されたい。

ＨＩＶについては、本発明のペプチド、特にＤＰ１０７およびＤＰ１７８は、エイズの治療の際の治療薬として用い得る。加えて、該ペプチドは、以前は未感染であった個体の、ＨＩＶウイルスとの急性の接触後の予防手段として用いてもよい。該ペプチドのそのような予防の用途の例は、母から幼児へのウイルス伝播の予防、およびその他の、例えば作業者がＨＩＶ含有血液製品と接触する医療の状況での事故のような、ＨＩＶ伝播の可能性が存在する状況を包含するが、それらに限られない。そのような治療の好成績での使用は、そのようなペプチドに仕向けられた宿主の免疫応答の発生に頼ることがない。

投与しようとする本発明のペプチドの有効用量は、生物学的半減期、生物学的利用能および毒性のようなパラメータを扱う、当業者に周知の手順を通じて決定してよい。下記で第６節に提示されたデータからすれば、例えば、ＤＰ１７８は、１mlあたり約１〜約１０ngのペプチドという循環レベルを達成するのに要求される用量で、in vivo で有効であると判明し得る。

治療的有効用量とは、症候の改善、または生存の延長を患者に生じさせるのに充分な化合物の量を指す。そのような化合物の毒性および治療薬効は、細胞培養または実験動物での、例えばＬＤ₅₀（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ₅₀（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための標準的な製薬学的手順によって、決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀として表すことができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに用いるためのある範囲の用量を配合するのに用いることができる。そのような化合物の用量は、好ましくは、毒性が僅かしか、または全くないＥＤ₅₀を包含するある範囲の循環濃度内にある。この用量は、用いられる用量の形態、および利用する投与の経路に応じて、この範囲内で変化させてよい。本発明の方法に用いられるいかなる化合物についても、治療有効用量は、最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養で決定された限りでの、ＩＣ₅₀（例えば、融合誘導の現象の、試験化合物の不在下での該現象の量と比較した、最大値の半分の阻害、例えばウイルス感染の最大値の半分の阻害を達成する該試験化合物の濃度）を包含する循環血漿濃度の範囲を達成するように動物モデルで配合してよい。そのような情報は、ヒトで役立つ用量をより正確に決定するのに用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定してよい。

本発明のペプチドは、更に、本発明のペプチドに対して宿主が抗体を誘発し、次いでそれが、例えばＨＩＶのそれ以上の感染を阻害することによって、ＨＩＶウイルスを中和するのに役立つ、予防ワクチンの役割に役立ち得る。

したがって、予防ワクチンとしての本発明のペプチドの投与は、例えばＨＩＶの細胞に感染できる能力を阻害することによって、ＨＩＶを中和するのに充分である、免疫応答を誘発するのに効果的なある濃度のペプチドを宿主に投与することを含むと思われる。厳密な濃度は、投与しようとする特定のペプチドに依存することになるが、当業者に周知である、免疫応答の発生を検定する標準的手法を用いることによって決定してよい。ワクチンとして用いようとするペプチドは、通常は、筋内に投与される。

該ペプチドは、免疫学的応答を高めるために、適切なアジュバントとともに配合してよい。そのようなアジュバントは、水酸化アルミニウムのような鉱物質ゲル；リゾレシチン、プルロニックというポリオール、ポリアニオンのような界面活性物質；その他のペプチド；油の乳濁液；およびＢＣＧやコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)のような役立つ可能性のあるヒトアジュバントを包含するが、それらに限られない。多くの方法を用いて、本明細書に記載のワクチン配合物を導入してよい。これらの方法は、経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻内の経路を包含するが、それらに限られない。

あるいはまた、本発明のペプチドに対して誘発した効果的濃度のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を宿主に投与して、ＨＩＶに感染する未感染細胞を皆無にさせ得る。そのような抗体の厳密な濃度は、特定の抗体のそれぞれの調製に従って変化することになるが、当業者に周知の標準的手法を用いて決定してよい。抗体の投与は、本節に記載のそれらを包含するが、それらに限られない、様々な手法を用いて達成してよい。

上記のそのような治療の全てについて、厳密な配合、投与の経路および用量は、個々の内科医が患者の状態を考慮して選ぶことができる（例えばFingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1, p1 を参照されたい）。

主治医は、毒性や器官機能不全のために投与を終了、中断または調整する方法および時期を知っているものと思われることに留意しなければならない。逆に、主治医は、臨床的応答が（毒性を除外しても）適正でないならば、治療をより高いレベルへと調整することも知っているものと思われる。問題の発癌性疾患の管理に投与される用量の大きさは、治療しようとする状態の重篤度、および投与の経路によって変化することになる。用量、およびおそらく用量の頻度も、個々の患者の年齢、体重および応答に従って変化することになる。上記に考察したそれに匹敵するプログラムを、獣医学に用いてよい。

本発明の実施のために、本明細書に開示された化合物を全身投与に適した用量へと配合するのに製薬上許容され得る担体を用いることは、本発明の範囲内にある。担体の適正な選択、および適切な製造の実施によって、特に溶液として配合された本発明の組成物は、例えば静脈内注射によって、非経口的に投与してよい。該化合物は、当技術に周知の製薬上許容され得る担体を用いて、経口投与に適した用量へと容易に配合することができる。そのような担体は、治療しようとする患者による経口摂取のために、本発明の化合物を錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして配合するのを可能にする。

本発明に用いるのに適した製剤組成物は、活性成分が、その意図された目的を達成するのに効果的な量で含まれる、組成物を包含する。有効量の決定は、特に本明細書で提供された詳細な開示に照らして、充分に当業者の能力の範囲内にある。

活性成分に加えて、これらの製剤組成物は、製薬上用い得る調製品へと活性化合物を加工するのを容易にする、賦形剤や佐剤を含む製薬上許容され得る適切な担体を含有してよい。経口投与のために配合した調製品は、錠剤、糖衣錠、カプセルまたは溶液の形態であってよい。

本発明の製剤組成物は、例えば慣用の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、水簸、捕獲または凍結乾燥の工程を用いて、それ自体は公知である方式で製造してよい。

非経口投与のための製剤配合物は、水溶性形態での活性化合物の水溶液を包含する。その上、活性化合物の懸濁液を、油状の適切な注射懸濁液として調製してよい。適切な親油性の溶媒または媒体は、ゴマ油のような脂肪油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームを包含する。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを包含してよい。場合により、該懸濁液は、適切な安定剤、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含有してよい。

経口的用途のための製剤調製品は、活性化合物を固体の賦形剤と組合せ、場合により、得られた混合物を摩砕し、望みであれば適切な佐剤を加えた後に、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠核を得ることによって、得ることができる。適切な賦形剤は、特に、乳糖、ショ糖、マンニトールもしくはソルビトールを包含する糖類；例えばトウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、バレイショ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製品のような充填剤である。望みであれば、崩壊剤、例えば架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩を加えてもよい。

糖衣錠核には、適切な被覆を与える。このためには、場合によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含有してよい、濃縮糖溶液を用いてよい。正体確認のためか、または活性化合物の用量の異なる組合せを特徴付けるため、染料または色素を該錠剤、または糖衣錠核に添加してよい。

経口的に用いることができる製剤調製品は、ゼラチンで製造した押して嵌め込むカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセリンまたはソルビトールで製造した密閉ソフトゼラチンを包含する。押して嵌め込むカプセルは、乳糖のような充填剤、澱粉のような結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑剤、ならびに、場合により、安定剤との混合物中に活性成分を含有することができる。ソフトカプセル内では、適切な液体、例えば脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールに活性化合物を溶解もしくは懸濁させてよい。加えて、安定剤を添加してもよい。
（実施例）

６．実施例：ＤＰ１７８（配列番号１）はＨＩＶ−１感染の強力な阻害剤である
本実施例では、ＤＰ１７８（配列番号１）は、ＨＩＶ−１で仲介されるＣＤ−４+ 細胞−細胞融合、および細胞から遊離したウイルスによる感染の強力な阻害剤であることを示す。融合アッセイでは、このペプチドは、１〜１０ng/ml からの濃度で、ウイルスで誘導されるシンシチウム形成を完全に遮断する。感染性アッセイでは、阻害濃度は多少高く、９０ng/ml で感染を遮断する。ＤＰ１７８（配列番号１）は、ＤＰ１７８（配列番号１）の抗ウイルス活性がＨＩＶ−１に高度に特異的であることを示すことが、更に示される。その上、ＨＩＶ−１由来のＤＰ１７８の相同体を表す合成ペプチドである、ＤＰ−１８５（配列番号３）も、ＨＩＶ−１で仲介されるシンシチウム形成を遮断することが見出される。

６.１材料と方法
６.１.１ペプチド合成
ペプチドはApplied Biosystems Model 431A ペプチド合成機で、Fast Moc法を用いて合成した。通常、特に断らない限り、合成したペプチドはアミド化したカルボキシ末端及びアセチル化したアミノ末端を有する。アミド化したペプチドはRink樹脂(Advanced Chemtech)を用いて調製し、フリーのカルボキシ末端をもつペプチドはWang（ｐ−アルコキシ-ベンジルアルコール)樹脂(Bachem)で合成した。最初の残基は適当な樹脂に二重にカップリングさせ、それに続く残基は単回カップリングさせた。各カップリング工程後に無水酢酸でキャッピングした。トリフルオロ酢酸(TFA)(10ml)、水(0.5ml)、チオアニソール(0.5ml)、エタンジチオール(0.25ml)、及び結晶フェノール(0.75g) を用いてペプチドを樹脂から解裂させた。精製は逆相HPLCを用いて行った。粗製ペプチドの約50mgをWaters Delta Pak C18カラム(19mm x 30cm, 15μ球状)で、水/アセトニトリル(0.1%TFA)の直線グラジエントを用いてクロマトグラフィーを行った。凍結乾燥したペプチドを乾燥状態で保存し、ペプチド溶液は水で約1mg/mlとなるよう調製した。エレクトロスプレー質量分析によって次の結果を得た：DP178(配列番号１):4491.87(計算値は4491.94)； DP-180(配列番号２):4491.45(計算値は4491.94)； DP-185(配列番号３):実施せず(計算値は4546.97)。

６.１.３ウイルス
HIV-1_LAI はR.Gallo(Popovic, M.ら, 1984, Science 224:497-508)から入手し、10%ウシ胎児血清含有のRPMI 1640中で培養したCEM細胞で増殖させた。感染させたCEM細胞の上清を0.2μmのフィルターに通し、感染価をAA5細胞系統をウイルス複製の支持する微感染力(microinfectivity)アッセイで求めた。この目的のために、段階希釈したウイルス25μlを、96ウエルのマイクロタイタープレート中のAA5細胞(2 x10⁵/mlの濃度)75μlに添加した。各ウイルス希釈について３回測定した。細胞を8日間、１日おきに新鮮な培地を添加して培養した。感染後8日目に、上清に放出された逆転写酵素活性を調べることにより、ウイルスの複製を調べた。Reed及びMuenchの式(Reed, L.J.ら, 1938, Am.J.Hyg. 27:493-497)に従ってTCID₅₀を計算した。この研究に用いられたHIV-1_LAI及びHIV-1_MNストックの感染価はAA5細胞系統を用いて測定したとき、それぞれ約1.4 x 10⁵ 及び 3.8 x 10⁴ TCID₅₀/mlであった。

６.１.３細胞融合アッセイ
約7 x 10⁴ のMolt細胞を、HIV-1_LAIウイルスを長期間感染させた1 x 10⁴個のCEM細胞と96ウエルのプレート(半分の領域がクラスターのプレート; Costar, Cambridge, MA, USA))で最終液量100μlの培地中で既報(Matthews, T.J.ら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:5424-5428) の方法でインキュベートした。ペプチド阻害剤を10μl添加し、細胞の混合液を37℃で24時間インキュベートした。その時点で、一つの視野でウエルの全体がみられるように倍率を40倍とした顕微鏡で多核巨細胞を調べた。

６.１.４無細胞ウイルス感染アッセイ
合成ペプチドを37℃で、247 TCID₅₀単位（図２に述べる実験用）又は62 TCID₅₀単位（図３に述べる実験用）のHIV-1_LA1ウイルス、又は25 TCID₅₀単位のHIV-2_NIHZウイルス及びCEM CD4⁺ 細胞とをペプチドの濃度を0, 0.04, 0.4, 4.0,及び40μg/mlとして7日間インキュベートした。逆転写酵素(RT)活性を、下記の第6.1.5節に記載のアッセイ法で、カウント/分で求めた。TCID₅₀の計算法の説明についてはReed, L.J.ら、1983, Am. J. Hyg. 27:493-497を参照せよ。

６.１.５逆転写酵素アッセイ
ミクロ逆転写酵素(RT)アッセイはGoffら(Goff, S. ら, 1981, J. Virol. 38:239-248)及びWilleyら(Willey, R.ら, 1988, J. Virol. 62:139-147)の方法を改変して用いた。ウイルス/細胞培養液の上清を1% Triton-X100で調整した。上清の10μlを、96ウエルのＵ底マイクロタイタープレート中の50μlのRTカクテルに添加し、37℃で90分インキュベートした。RTカクテルは75mM KCl、2mM ジチオスレイトール、5mM MgCl₂、5μg/mlポリA (Pharmacia, cat. No.27-4110-01)、0.25単位/ml オリゴdT(Pharmacia, cat. No.27-7858-01)、0.05% NP40、50mM Tris-HCl, pH7.8、0.5μM 非放射性dTTP、及び10μCi/ml ³²P-dTTP (Amersham, cat. No. PB.10167)を含む。

インキュベーション後、反応混液40μlを、2 x SSC緩衝液(0.3M NaCl及び 0.003M クエン酸ナトリウム)で飽和させ１枚のGB003(S+S)濾紙上にS+S Minifoldで保持したSchleicher and Schuell(S+S) NA45膜(又はDE81濾紙)にアプライし、半真空状態とした。Minifoldの各ウエルを真空状態で200μlの2 x SSCで４回洗った。膜をMinifoldから取り外し、さらに２回2 x SSCの過剰量でパイレックス皿中で洗った。最後に吸収性の紙の上でその膜の水分を取り除き、Whatman #3濾紙の上に置き、サランラップで覆い、-70℃で一晩フィルムに感光させた。

６.２結果
６.２.１感染細胞誘発シンシチウム形成に対するペプチドによる阻害
抗ウイルス活性の最初のスクリーニングは、未感染のMolt4細胞と長期間HIV-1に感染させたCEM細胞とを一晩共培養することによって誘発されるシンシチウム形成に対するペプチドの阻害能を調べるものであった。数回の実験結果をここに示す。最初の実験では、DP178(配列番号１)ペプチドの10μg/mlから12.5ng/mlの間の段階濃度について細胞融合過程に対する阻害を調べた。これらの実験においては、HIV-1_LAI、HIV-1_MN、HIV-1_RF、又はHIV-1_SF2 ウイルスのいずれかを長期間感染させたCEM細胞と未感染のMolt 4細胞を一晩、共培養させた。結果(図４)は、DP178(配列番号１)は供試最低濃度においても各HIV-1に対して完全な防御能を示した。HIV-1_LAIについては供試最低濃度は12.5ng/mlであり、他の全てのHIV-1ウイルスについては本実験で用いたDP178(配列番号１)の最低濃度は100ng/mlであった。第２のペプチドDP180(配列番号２)はDP178(配列番号１)と同じアミノ酸残基を含有しているがランダムな順序に配列されており、このDP180は40μg/mlという高濃度においても抗細胞融合活性を示さなかった(図４)。これらの結果はDP178(配列番号１)の阻害効果は一次配列特異的であり、非特異的なペプチド/タンパク質相互作用に関連するものではないことを示している。DP178の阻害効果の実際のエンドポイント(すなわち最低有効阻害濃度)は1-10 ng/mlの範囲にあった。

次の実験シリーズは、DP178(配列番号１)の相同体の調製及びそのHIV-1誘発シンシチウム形成阻害能の試験である。図１に示すとおり、DP185(配列番号３)の配列はDP178(配列番号１)とわずかに異なっており、その一次配列はHIV-1_SF2分離株から取ったものでDP178(配列番号１)と比較するとN末端近辺のいくつかのアミノ酸が相異している。図４に示すとおり、DP185(配列番号３)は供試最低濃度である312.5ng/mlにおいても阻害活性を示した。

その次の実験シリーズはDP178(配列番号１)のHIV-1及びHIV-2阻害活性の比較である。図５に示すとおり、DP178(配列番号１)はHIV-1媒介シンシチウム形成を1ng/ml未満のペプチド濃度で阻害した。しかしDP178(配列番号１)は10μg/mlの高濃度においてもHIV-2媒介シンシチウム形成を阻害しなかった。この４log差のDP178(配列番号１)のHIV-1媒介細胞融合阻害剤としての選択性は、DP178(配列番号１)活性のHIV-1への予期せぬ特異性を示している。DP178(配列番号１)はHIV-1媒介細胞融合を阻害するが、このペプチドはこれらの供試濃度では同じ細胞タイプのHIV-2媒介細胞融合を阻害し得ないことはDP178(配列番号１)の抗ウイルス活性の高選択性に関するさらなる証拠を提供する。

６.２.２無細胞ウイルスによる感染に対するペプチドによる阻害
次いで無細胞HIV-1ウイルスによるCD-4⁺ CEM細胞の感染に対するDP178(配列番号１)の阻害能を調べた。図２に示す結果は、HIV-1_LAI分離株によるCEM細胞の感染に対するDP178(配列番号１)の阻害能を測定した実験から得たものである。この実験には３種類の対照ペプチドすなわちDP-116(配列番号９)、DP-125(配列番号８)、及びDP-118(配列番号１０)を用いた。DP-116(配列番号９)はこのアッセイ法で活性がないことが既に示されているペプチドであり、DP-125(配列番号８；Wild, C.ら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10,537)及びDP-118(配列番号１０)はこのアッセイ法で活性があることが既に示されているペプチドである。各濃度(0, 0.04, 0.4, 4, 及び40μg/ml)のペプチドを247 TCID₅₀単位のHIV-1_LAI及びCEM細胞とインキュベートした。７日間培養した後、無細胞上清を取り、RT活性の存在を感染が起こったことの指標として調べた。図２に示す結果は、DP178(配列番号１)はHIV-1ウイルス分離株が媒介する新規の感染プロセスを90ng/ml(ＩＣ₅₀=90ng/ml)という低濃度で阻害することを示している。これに対して、２種の陽性対照ペプチドDP-125(配列番号８)及びDP-118(配列番号１０)は、約5μg/mlという60倍以上高いＩＣ₅₀濃度であった。

別の実験でHIV-1_LAI又はHIV-2_NIHZのいずれかとCEM細胞を用いてDP178(配列番号１)のHIV-1及びHIV-2に対する阻害活性を調べた。これらの実験には62 TCID₅₀のHIV-1_LAI又は25 GCID₅₀のHIV-2_NIHZを用い、７日間インキュベートした。図３に見られるとおり、DP178(配列番号１)はHIV-1感染を約31ng/mlのＩＣ₅₀で阻害する。これに対し、DP178(配列番号１)のHIV-2_NIHZに対するＩＣ₅₀ははるかに高く、DP178(配列番号１)はHIV-1阻害剤としてはHIV-2阻害剤としてより２log強力である。この事実は上記第6.2.1節の細胞融合阻害の結果と一致するものであり、著しい選択性(すなわちHIV-1に対してはHIV-2に対するより著しく選択性が高い)を支持するものである。

７. 実施例：HIV-1阻害剤DP178(配列番号１)は細胞傷害性を有さない
本実施例では36個のアミノ酸の合成ペプチド阻害剤DP178(配列番号１)が供試濃度の内の最高濃度(40μg/ml)においても培養細胞に対して細胞傷害性をもたないことを示している。

７.１材料と方法
細胞増殖と毒性のアッセイ：各ペプチド濃度あたり約3.8x10⁵ 個のCEM細胞をT25フラスコで３日間37℃でインキュベートした。供試ペプチドは図１に述べたとおり、DP178(配列番号１)及びDP-116(配列番号９)である。ペプチドは上記第6.1節に記載の方法で合成した。ペプチド濃度は0, 2.5, 10, 及び40μg/mlとした。細胞数はインキュベーション時間の0, 24, 48,及び72時間に測定した。

７.２結果
強力なHIV-1阻害剤であるDP178(配列番号１)が細胞障害性を示すか否かを、培養細胞の増殖及び生存にそのペプチドが及ぼす影響をアッセイすることによって評価した。各種濃度のDP178(配列番号１)、及びDP-116(配列番号９)-これはHIV阻害剤としては無効であることが既に示されているペプチドであるが(Wild, C. ら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10,537-10,541)-、これらのペプチドの存在下でCEM細胞をインキュベートした。さらに細胞をどちらのペプチドも含まない条件下でもインキュベートした。

細胞傷害性試験結果からDP178(配列番号１)は培養細胞に対して細胞傷害性がないことが示された。下記の表XXIVに見られるとおり、DP178(配列番号１)の供試最高濃度(40μg/ml)の存在下で３日間培養を行った細胞の増殖と生存については、DP-116(配列番号９)又はペプチド不含の対照と著しい相異は認められなかった。細胞増殖データは図６にもグラフで示している。上記の第６節で述べた実施例で示したとおり、DP178(配列番号１)はHIV-1媒介シンシチウム形成を1〜10ng/ml の間のペプチド濃度で完全に阻害し、少なくとも90ng/ml の濃度で無細胞ウイルス感染を完全に阻害する。本研究ではHIV阻害投与量より３log高い濃度においてもDP178(配列番号１)は細胞傷害性をあらわさないことが示された。

８. 実施例：DP178とDP107の相互作用
下記の本実施例で可溶性遺伝子組替えgp41を用いることによりDP178がgp41の遠隔サイト(distal site)と会合し、その相互作用構造はDP107のロイシンジッパーモチーフによって影響を受けることが示された。ロイシンジッパーモチーフの超らせん構造を分断する単一箇所の突然変異によって、可溶性遺伝子組換えgp41タンパク質がHIV-1融合に対して不活性なものから活性のある阻害剤に形質転換された。この形質転換は、活性のあるDP178ドメインがロイシンジッパー、DP107、決定因子からなる分子の鈎から遊離することによるものであるかもしれない。この実験結果は、各種のgp41誘導体(ペプチド及び遺伝子組替えタンパク質)の抗HIV活性が、それらの誘導体がgp41と複合体を形成しHIVの融合過程を妨害することによるものである可能性を示している。

８.１材料と方法
８.１.１融合タンパク質及びgp41突然変異体の構築
図７に示す融合タンパク質及び突然変異体の構築は次のように行った：gp41の細胞外ドメイン(540-686)に対応するＤＮＡ配列は発現ベクターpMAl-p2(New England Biolab)のXmn IサイトにクローンしM41とした。gp41の配列はpgtat(Malim ら, 1988, Nature 355:181-183)から、上流プライマー5'-ATGACGCTGACGGTACAGGCC-3'(プライマーA)及び下流プライマー5'-TGACTAAGCTTAATACCACAGCCAATTTGTTAT-3'(プライマーB)を用いてポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって増幅した。M41-PはUnited States Biochemicals(USB)のT7-Gen in vitro 突然変異誘発キットを用い、キット供給者の使用説明書に従って構築した。突然変異誘発性のプライマー(5'-GGAGCTGCTTGGGGCCCCAGAC-3')はM41の578の位置のイソロイシンをプロリンに置き換える突然変異を導入する。M41Δ107、これはDP107領域を除去したものであるが、これを除去突然変異誘発性プライマー 5'-CCAAATCCCCAGGAGCTGCTCGAGCTGCACTATACCAGAC-3'(プライマーC)を用いUSB T7-Gen突然変異誘発プロトコールに従って作製した。M41Δ178、これはDP-178領域を除去したものだが、これはgp41のアミノ酸540-642に対応するＤＮＡ断片をpMal-p2のXmn Iサイトにクローニングすることにより作製した。挿入されたＤＮＡを生成させるためにプライマーA及び5'-ATAGCTTCTAGATTAATTGTTAATTTCTCTGTCCC-3'(プライマーD)を鋳型pgtatとともに用いてPCRを行った。M41-PΔ178を生成させるためにM41-PをプライマーA及びDと共に用い、PCRを行った。挿入した配列及び突然変異させた残基は全て制限酵素分析でチェックし、ＤＮＡ配列分析で確認した。

８.１.２融合タンパク質の精製及び特性分析
融合タンパク質はNew England Biolabs(NEB)から入手したタンパク質融合及び精製システムを用い、製造者による説明書に記載のプロトコールに従って精製した。融合タンパク質(10 ng)は8% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。ウエスタンブロッティング分析はSambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, ch.18, pp64-75に記載の方法によって行った。融合タンパク質と反応させるために1000倍希釈のHIV-1陽性血清又はレパートリークローニングから得られたヒトFabを用いた。二次抗体はHRP結合抗ヒトFab抗体(ヤギ)を用いた。結合した抗体の検出にはECL ウエスタンブロッティング検出システム(Amersham)を用いた。この検出システムの詳細なプロトコールは製造者から供給された。融合タンパク質の大きさを求めるためにRainbow分子量マーカー(Amersham)を用いた。

８.１.３抗HIV活性測定のための細胞融合アッセイ
細胞融合アッセイは既報の方法(Matthews ら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5424-5481)で行った。7 x10⁴個のCEM 細胞を、HIV-1_IIIB を長期間感染させたCEM細胞(10⁴個)と96ウエルの平底半領域プレート(Costar)で100μlの培地中でインキュベートした。各種の濃度のペプチド及び融合タンパク質を10μlの培地中に含むものを細胞混合液と37℃で24時間インキュベートした。顕微鏡によって多核のシンシチウムを観察した。図８に示すとおり、M41及びM41-Pのいずれも供試濃度で細胞傷害性を示さなかった。

HIV-1で誘発される細胞-細胞融合に対する阻害活性を、図９に示すとおり10 nM DP178及び種々の濃度のM41Δ178又はM41-PΔ178の存在下で調べた。10 nM DP178の存在下ではシンシチウムは認められなかった。対照のサンプルにはペプチド又は融合タンパク質は添加しなかった。

８.１.４ gp41のロイシンジッパーモチーフへのDP178の結合のELISA分析
用いたDP178のアミノ酸配列は次のとおり：YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF。ELISA分析のため、M41Δ178又はM41-PΔ178(5μg/ml)を0.1N NaHCO3, pH 8.6中に含む液で96ウエルのLinbro ELISAプレート(Flow Lab, Inc.)を一晩コートした。各ウエルを蒸留水で３回洗い、3%ウシ血清アルブミン(BSA), 2時間でブロックした。ブロック後、TBST(40 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)中に0.5%BSAとペプチドを含む液をELISAプレートに添加し室温で1時間インキュベートした。TBSTで３回洗った後、Fab-d(10 ng/mlの濃度, 0.5%BSAを含むTBST中)を添加した。室温で1時間インキュベートした後TBSTでプレートを３回洗った。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を結合させた抗ヒトFab抗血清(ヤギ)の2000倍希釈をTBST中に0.5%のBSAと共に含む液を各ウエルに添加し、室温で45分インキュベートした。次いでプレートをTBSTで４回洗った。ペルオキシダーゼの基質としてo-フェニレンジアミン(2.5 mg/ml)及び0.15% H₂O₂を添加し発色させた。室温で10分間インキュベーションした後、等量の4.5 N H₂SO₄を添加し反応を停止させた。反応を停止した混液の吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Design)で測定した。結果を図10に示す。

８.２結果
８.２.１. gp41のエクトドメインの発現と特性分析
gp41の構造と機能における２つのヘリカル領域の役割を理解するための過程の一つとしてgp41のエクトドメインをマルトース結合融合タンパク質(M41)として発現させた(図７)。gp41のN末端にある融合誘導性のペプチド配列を溶解性の改善のためにこの遺伝子組換えタンパク質及びその誘導体から除去した。タンパク質にマルトースを結合させることによって融合タンパク質の精製を比較的穏やかな非変性条件下で行うことができた。M41可溶性遺伝子組換えgp41は糖鎖を持たず、膜貫通タンパク質のいくつかの領域(すなわち融合ペプチド、膜スパンニング、及び細胞質ドメイン)が欠如しており、gp120を欠いた状態で発現しているので、このものが天然のHIV-1ウイルス粒子上のgp41の構造を正確に反映しているとは期待し得ない。だが、精製M41は、ヒトモノクローナル抗体98-6、126-6、および50-69、これらは真核細胞中で発現させた天然のgp41のコンフォメーショナルなエピトープと結合することが既に示されているが(Xu ら, 1991, J. Virol. 65:4832-4838; Chen, J. Virol. 68:2002-2010)、これらのモノクローナル抗体との反応性が示すように、不連続なエピトープを保存するように折り畳まれている。少なくとも天然gp41の内、これらの抗体によって定義される一定の領域については遺伝子組替え融合タンパク質M41内で再生産されているものと考えられる。さらに、gp41上のコンフォメーショナルエピトープを認識しかつFACSで分析したときHIV-1ウイルス粒子及びHIV-1感染細胞と結合するが未感染細胞とは結合しないヒト遺伝子組替えFab(Fab-d)と、M41とは反応した。M41融合タンパク質のヘリックスモチーフ、すなわちDP107又はDP178を除去すると、Fab-dとの反応性が失われた。これらの結果は、一次配列中の60個のアミノ酸で分離される２つのヘリカル領域は、Fab-dエピトープを維持するために必要であることを示している。

８.２.２. 遺伝子組換えgp41エクトドメインの抗HIV活性
野生型M41融合タンパク質の抗HIV-1活性を調べた。上記説明のとおり、ロイシンジッパー(DP107)及びC末端ヘリックス(DP178)と推定されるものに対応する合成ペプチドは強力な抗HIV活性を示した。これらの２つの領域を含んでいるにも関わらず遺伝子組換えM41タンパク質は50μMという高濃度においてもHIV-1が誘発する膜融合に影響を及ぼさなかった(下記の表XXV)。

抗ウイルス感染性アッセイ：ウイルスを段階希釈した液20μlを、10%ウシ胎児血清及び抗生物質を含有するRPMI 1640中に指示された濃度の精製遺伝子組換え融合タンパク質を含む液20μlと96ウエルのマイクロタイタープレート中で常温でインキュベートした。6 x10⁵ 個/mlのCEM4細胞20μlを各ウエルに添加し、培養液を加湿したCO2インキュベーター中で37℃でインキュベートした。2-3日ごとに新鮮な培地を添加して9日間細胞を培養した。感染後5、7、及び9日目に、ウイルスの複製をモニターするために、上清を取り逆転写酵素(RT)活性を下記のとおり調べた。各条件での50%組織培養感染価(TCID₅₀)はReed & Muenchの計算式(1937, Am. J. Hyg. 27:493-497)に従って求めた。RT活性はGoffら(1981, J. Virol. 38:239-248)及びWilleyら(1988, J. Virol. 62:139-147)が公表した方法を改変して、Chenらが1993, AIDS Res. Human Retroviruses 9:1079-1086で述べている方法で測定した。

驚くべきことに、ロイシンジッパーモチーフの中央のイソロイシンをプロリンにするという１個のアミノ酸の置換によって抗ウイルス活性を示す融合タンパク質(M41-P)を得られる(表XXV及び図８)。表XXVに見られるようにM41-Pは約85 nMでシンシチウム形成を90%ブロックし、約70 nMの濃度でHIV-1_IIIB 感染を90%中和した。M41-Pの抗HIV-1活性はC末端のヘリカル配列によって媒介されるものと考えられる。何故ならばM41-Pからその領域を除去すると不活性な融合タンパク質M41-PΔ178が得られるからである(表XXV)。この説明は、DP178配列の欠如した、先端を切り取った融合タンパク質M41Δ178が、DP178ペプチドの強力な抗融合活性を濃度依存性に妨害することを示した実験結果によって強く支持された(図９)。これと同じ先端を切り取った融合タンパク質でプロリン突然変異を含みロイシンジッパーを分断したM41-PΔ178は、上記と同様の競合実験において活性を示さなかった(図９)。これらの結果はDP178ペプチドはgp41上の第２のサイト、その相互作用構造は野生型のロイシンジッパー配列に依存しているものであるが、そのサイトと会合していることを示している。同様の相互作用は野生型の融合タンパク質M41にも起こりうるものであり、DP178領域を埋没させ抗ウイルス活性が得られないようにする分子の鈎を形成するように働きうる。

これらの２つのドメイン間の特異的な会合についてはヒトモノクローナルFab-d抗体を用いた他の研究によっても示されている。例えば、Fab-dはDP178ペプチド、融合タンパク質M41Δ178のいずれにも結合しないが、そのエピトープはこれら２つの試薬をただ混合するのみで再構成された(図１０)。さらにまた、これと同様の混合実験において、融合タンパク質M41-PΔ178のロイシンジッパードメイン中のプロリンの突然変異があると、エピトープの再構成が起こらなかった。

９．実施例：ＤＰ１０７様及びＤＰ１７８様配列のコンピュータ支援同定方法
多くの公知超らせん配列が文献に十分に記述されており、これには各アミノ酸を位置付けるヘプタッドリピートが含まれる。超らせんの命名法ではヘプタッドリピートの各アミノ酸はＡないしＧと名付けられ、アミノ酸Ａ及びＤは疎水性位にある傾向がある。アミノ酸Ｅ及びＧは荷電する傾向にある。これらの４つの位置（Ａ、Ｄ、Ｅ及びＧ）は単量体αへリックスの両親媒性バックボーンを形成する。２つ以上の両親媒性へリックスのバックボーンは互いに相互作用して二、三、四量体等の超らせん構造を形成する。コンピュータ検索モチーフの設計を開始するため、酵母転写因子ＧＣＮ４、インフルエンザウイルス血球凝集素ループ３６、及びヒトガン原遺伝子ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、及びｃ−Ｊｕｎを含めて十分に特徴付けられている一連の超らせんを選択した。各ペプチド配列について、Ａ及びＤ位置に対する厳密な相同性、及びＢ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧ位置について排除することが可能なアミノ酸（それらがこれらの位置に観察されない理由で）のリストを決定した。超らせん構造を有することが知られているＨＩＶ−1 ＢｒｕＤＰ１０７及び未だに構造的に定義されていないＨＩＶ−1 ＢｒｕＤＰ１７８のアミノ酸の７個の位置取りについて最もありそうな可能性を推測することにより、モチーフをＤＰ１０７及びＤＰ１７８配列にあつらえた。これらの配列の各々の分析を図１２に示す。例えば、ＧＣＮ４のモチーフは次のように設計した。
１．ＧＣＮ４のＡ又はＤ位置に見出される（標準一文字アミノ酸コードを用いる）アミノ酸は［ＬＭＮＶ］であった。
２．｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝を除く全てのアミノ酸がＢ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧ位置で見出された。
３．したがって、ＰＥＳＥＡＲＣＨモチーフは次のように記述された。
［ＬＭＮＶ］−｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝（２）−［ＬＭＮＶ］−｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝（３）−［ＬＭＮＶ］−｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝（２）−［ＬＭＮＶ］−｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝（３）−［ＬＭＮＶ］−｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝（２）−［ＬＭＮＶ］−｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝（３）−［ＬＭＮＶ］−｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝（２）−［ＬＭＮＶ］−｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝（３）−
このモチーフの翻訳もしくは読み方は、“最初のＡ位置ではＬ、Ｍ、Ｎ、もしくはＶのいずれかが存在しなければならず；Ｂ及びＣ位置（次の２つの位置）ではＣ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｔ、もしくはWを除く全てが許容され；Ｄ位置ではＬ、Ｍ、Ｎ、もしくはＶのいずれかが存在しなければならず；Ｅ、Ｆ及びＧ位置（次の３つの位置）ではＣ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｔ、もしくはWを除く全てが許容される。”である。この文は、２８ｍｅｒモチーフには４回、３５ｍｅｒモチーフには５回含まれる。このように、基本モチーフキーは［ＬＭＮＶ］−｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝である。十分に記述されている超らせん配列のモチーフキーを図１２にまとめる。

ＤＰ１０７及びＤＰ１７８のモチーフ設計は、ヘプタッドリピート位置が定義されておらず、これらのペプチドが両者とも２８残基を上回る長さであるため、上述の２８ｍｅｒモデル配列とは僅かに異なっていた。図１３はＤＰ１０７及びＤＰ１７８の両者について可能性のある配列の並びの幾つかを示し、２８ｍｅｒ、３５ｍｅｒ、及び完全長ペプチドに基づくモチーフ設計も含む。ペプチドが伸長される場合にのみモチーフに僅かな相違が生じることに注意されたい。一般には、基礎ペプチドを伸長させるとモチーフの厳密性が低下する。これは、この文書において“ヒット”と呼ばれるＤＰ１０７様もしくはＤＰ１７８様一次アミノ酸配列を同定する可能性を広げる上において非常に重要である。

検索しようとする各タイプのペプチド配列に高度に特異的なモチーフを作成することに加えて、“ハイブリッド”モチーフを作成することも可能である。これらのモチーフは、２つ以上の非常に厳密なモチーフを“交差”させて両“親”モチーフ配列だけではなくその一方、その他方、又は両方の“親”に類似するペプチド配列も見出す新しい検索アルゴリズムを作成することにより作成される。例えば、図１４においては、ＧＣＮ４の“親”配列をＤＰ１０７の可能性のある“親”モチーフと交差させている。ここで、このハイブリッドモチーフは、両方の親のＡ及びＤ位置に見出される全てのアミノ酸を含み、かついずれかの親においてそれ以外の位置で見出されない全てのアミノ酸が排除されなければならない。ＧＣＮ４すなわち［ＬＭＮＶ］｛ＣＦＧＩＭＰＴＷ｝とＤＰ１０７（Ｄ位置に最初のＬを有する２８ｍｅｒ）すなわち［ＩＬＱＴ］｛ＣＤＦＩＭＰＳＴ｝との交差から得られるハイブリッドは、［ＩＬＭＮＱＴＶ］｛ＣＦＩＭＰＴ｝である。ここで、親ＤＰ１０７分子の全ペプチド長に加えて、両方の枠組みの可能性をカバーする僅かに２つの基本的なハイブリッドモチーフが存在することに注意されたい。図１５はＧＣＮ４とＤＰ１７８との“ハイブリダイゼーション”を表す。図１６はＤＰ１０７とＤＰ１７８との“ハイブリダイゼーション”を表す。ここで示されるモチーフ、両方の親及びハイブリッドはモチーフキーであり、コンピュータ検索を実際に行うために必要な完全長モチーフの描写ではないことを心に留めることが重要である。

２つ以上のいかなる組み合わせに対してもハイブリダイゼーションを行うことができる。図１７には、ＧＣＮ４、ＤＰ１０７（両フレーム）、及びＤＰ１７８（同様に両フレーム）を含む幾つかの３モチーフハイブリダイゼーションがまとめられている。得られるモチーフは、互いにより類似するようになっていることに注意されたい。実際、第１及び第３ハイブリッドモチーフは、それぞれ、第２及び第４ハイブリッドモチーフのサブセットである。これは、第１及び第３ハイブリッドモチーフが第２及び第４のものよりも僅かに厳密であることを意味する。これらの４つのモチーフに些少な変更を加えるだけで、あるいはそれらをハイブリダイズすることにより、それらの配列の全てを見出す単一のモチーフを得ることができることにも注意するべきである。しかしながら、厳密性も低下することは覚えているべきである。最後に、最もスペクトルが広く、かつ最も厳密性が低いハイブリッドモチーフを図１８に示す。これは、ＧＣＮ４、ＤＰ１０７（両フレーム）、ＤＰ１７８（両フレーム）、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、及びＦｌｕループ３６のハイブリダイゼーションをまとめたものである。

ＤＰ−１７８がｇｐ４１の膜内外スパンニング領域の約１０アミノ酸上流及びＤＰ１０７とＤＰ１７８とを分離するプロリンのちょうどＣ−末端にのみ位置するという事実に基づいて、モチーフの特別な組を設計した。膜が関与する場合にはＤＰ１７８は両親媒性ヘリックスであり得、かつプロリンがヘリックス形成の開始を助けることが仮定されている。同じ並びがＲＳウイルス（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｃｙｔｉｃａｌＶｉｒｕｓ）で観察されているが、このウイルスのＤＰ１７８様領域はプロリンのちょうどＣ−末端にロイシンジッパも有している。したがって、Ｎ−末端プロリン−ロイシンジッパモチーフを設計して他のウイルスがこれと同じパターンを有するかどうかを分析した。これらのモチーフを図１９にまとめる。

ＰＣ／Ｇｅｎｅタンパク質データベースには５８７９のウイルスアミノ酸配列が収容されている（ライブラリファイルＰＶＩＲＵＳＥＳ；ＣＤ−ＲＯＭリリース１１．０）。これらのうち、１０９２はウイルスエンベロープもしくは糖タンパク質配列である（ライブラリファイルＰＶＩＲＵＳＥ１）。表ＶからＸＩＶまでには、検索された全てのモチーフのタンパク質配列名及びモチーフヒット位置のリストが収められている。

１０．実施例：ヒト免疫不全ウイルスにおけるＤＰ１０７及びＤＰ１７８様配列のコンピュータ支援同定方法
図２０は、ＨＩＶ−１ＢＲＵ単離体ｇｐ４１（ＰＣ／Ｇｅｎｅタンパク質配列ＰＥＮＶ＿ＨＶ１ＢＲ）の検索結果を表す。ＤＰ１０７及びＤＰ１７８を交差するハイブリッドモチーフ（すなわち、１０７×１７８×４；図１６に見出されるものと同じモチーフ）が、アミノ酸５５０−５９９、６３６−６８８、及び７９６−８２３を含む３つのヒットを見出したことに注意されたい。これらの区域には、ＤＰ−１０７と８個のＮ−末端及び４個のＣ−末端アミノ酸；ＤＰ−１７８と７個のＮ−末端及び１０個のＣ−末端アミノ酸；並びに膜貫通領域の内側の区域（細胞質）が含まれる。図２０には、そのキーが図１７に見出される（｛ＣＤＧＨＰ｝｛ＣＦＰ｝×５）、ＡＬＬＭＯＴＩ５と名付けられるモチーフを用いた検索から得られる結果も含まれる。このモチーフは、ＤＰ１０７（アミノ酸５１０−５９９）、ＤＰ１７８（６１５−７１７）、及び細胞質領域（７７２−８４１）を含む３つのヒットも見出した。これらのヒットは、アミノ及びカルボキシ末端の両者に多くの配列をさらに含むモチーフ１０７×１７８×４によって見出されるヒットと重複する。これは驚くようなことではなく、１０７×１７８×４はＡＬＬＭＯＴＩ５ハイブリッドモチーフのサブセットである。重要なことには、ＡＬＬＭＯＴＩ５の厳密性が１０７×１７８×４よりもかなり低いとしても、これが依然としてＨＩＶ−１の阻害ペプチドの配列を含むことが示されるＤＰ１０７及びＤＰ１７８領域を選択的に同定する。これらの２つのモチーフ検索の結果を、ＰＣ／Ｇｅｎｅタンパク質配列名ＰＥＮＶＨＶ１ＢＲの下で表Ｖにまとめる。プロリン−ロイシンジッパモチーフも、ｇｐ１２０のまさにＣ−末端の５０３−５２５、開裂部位のすぐ上流（Ｐ７ＬＺＩＰＣ及びＰ１２ＬＺＩＰＣ）；及びｇｐ４１の細胞質ドメインの７３５−７６８（Ｐ２３ＬＺＩＰＣ）を含む幾つかのヒットをＨＩＶ−１ＢＲＵに示す。これらの結果は、表ＶＩＩＩ、ＩＸ、及びＸに、上述のものと同じ配列名の下に見出される。Ｌｕｐａｓアルゴリズムによって超らせん領域を有することが推定されるＨＩＶ−１ＢＲＵの唯一の区域がアミノ酸６３５−６７０からのものであることに注意されたい。これは、ＤＰ１７８の開始のＮ−末端の８個のアミノ酸で始まり、その終止のＮ−末端の８個のアミノ酸で終わる。ＤＰ１０７は、それが公知の超らせんであるという事実にも関らず、Ｌｕｐａｓ法を用いた場合には超らせん領域を有するものとは推定されない。

１１．実施例：ヒトＲＳウイルスにおけるＤＰ−１０７様及びＤＰ−１７８様配列のコンピュータ支援同定方法
図２１は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ；Ａ２株）の融合糖タンパク質Ｆ１（ＰＣ／Ｇｅｎｅタンパク質配列名ＰＶＧＬＦ＿ＨＲＳＶＡ）の検索結果を表す。モチーフ１０７×１７８×４は、アミノ酸１５２−２０２、２１３−２４３、及び４８８−５１５を含む３つのヒットを見出す。これらのヒットの並びは、このモチーフがＤＰ１７８との類似性を有する２つの領域、ＤＰ１０７領域と呼ばれるもののすぐ下流のものすなわちアミノ酸２１３−２４３、及び膜貫通領域のすぐ上流のもの（ＤＰ１７８にも類似）すなわちアミノ酸４８８−５１５を見出すことを除いて、ＨＩＶ−１において見出されるものに類似する。モチーフＡＬＬＭＯＴＩ５も、アミノ酸１１６−２０２、２６７−３０２、及び５０６−５４９を含む３つの区域を見出す。プロリン−ロイシンジッパモチーフも、アミノ酸２０５−２２１及び２６５−２８７（Ｐ１ＬＺＩＰＣ２６５−２８０、Ｐ１２ＬＺＩＰＣ）、及び４８４−５１３（Ｐ７ＬＺＩＰＣ及びＰ１２ＬＺＩＰＣ４８４−５０６、Ｐ２３ＬＺＩＰＣ）を含む幾つかのヒットを示す。ＰＬＺＩＰモチーフもＨＩＶ−１のＤＰ１７８と位置類似性を共有する領域を同定することに注意されたい。

１２．実施例：サル免疫不全ウイルスにおけるＤＰ１０７様及びＤＰ１７８様配列のコンピュータ支援同定方法
サル免疫不全ウイルスｇｐ４１（ＡＧＭ３単離体；ＰＣ／Ｇｅｎｅタンパク質配列名ＰＥＮＶ＿ＳＩＶＡＧ）のモチーフヒットを図２２に示す。モチーフ１０７×１７８×４は、アミノ酸５６６−５９３、５９７−６２４、及び７０３−７３０を含む３つのヒットを見出す。最初の２つのヒットはそれらの間に３個のアミノ酸を置くだけであり、おそらく５６６−６２４からの１つのヒットに合わせることが可能である。これはＤＰ１０７様のヒットを表す。アミノ酸７０３ないし７３０はＤＰ１７８様のヒットを表す。ＡＬＬＭＯＴＩ５も、アミノ酸５５６−６２８（ＤＰ１０７様）、６５１−６９９（ＤＰ１７８様）、及び膜貫通スパンニング領域を表す８０８−８５２を含む３つのヒットを見出す。ＳＩＶも、Ｌｕｐａｓアルゴリズムによって推定されるように、超らせんを形成する高い傾向を有する６５５−６９２からの１つの領域を有する。１０７×１７８×４及びＡＬＬＭＯＴＩ５モチーフは同じ領域を見出す。ＳＩＶには、ｇｐ４１におけるいかなるＰＬＺＩＰモチーフヒットもない。

第２のＳＩＶ単離体（ＭＭ２５１）のＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体の同定は下記１９項の実施例に示されている。

１３．実施例：イヌジステンパーウイルスにおけるＤＰ１０７様及びＤＰ１７８様配列のコンピュータ支援同定方法
イヌジステンパーウイルス（オンダーステプールト（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）株）融合タンパク質Ｆ１（ＰＣ／Ｇｅｎｅタンパク質配列名ＰＶＧＬＦ＿ＣＤＶＯ）は、ＤＰ１０７様及びＤＰ１７８様であることが推定されるヒトＲＳＶに類似の領域を有する（図２３）。モチーフ１０７×１７８×４はアミン酸２５２−２９３の融合タンパク質のちょうどＣ−末端の１つの区域を強調する。また、アミノ酸２５２−２８６は、Ｌｕｐａｓアルゴリズムを用いて、超らせんであるとも推定される。第１の領域のアミノ酸約１００個のＣ末端は、残基３４０−３６７のＤＰ１７８様区域である。ＡＬＬＭＯＴＩ５は、Ｌｕｐａｓ推定及びＤＰ１０７様１０７×１７８×４ヒットの両者と完全に重複するアミノ酸２２８−２９７；第２の１０７×１７８×４ヒットと重複する残基３４０−３８１；及び膜貫通領域のちょうどＮ−末端に位置するＤＰ１７８様であるアミノ酸５６８−６０２を含む、関心のある区域を強調する。また、これは、Ｌｕｐａｓ法によって超らせんを形成する高い傾向を有することが推定される別の領域（残基５７０−６０２）と重複する。幾つかのＰＬＺＩＰが、それぞれ残基３３６−３５７及び３３６−３６１を強調するＰ６及びＰ１２ＬＺＩＰＣ；残基３９８−４１４を見出すＰ１及びＰ１２ＬＺＩＰＣ；並びにそれぞれ残基５６２−５８９及び５６２−５９２を見出すＰ１２及びＰ１２ＬＺＩＰＣを含む、関心のある区域をうまく同定した。

１４．実施例：ニューカッスル病ウイルスにおけるＤＰ１０７様及びＤＰ１７８様配列のコンピュータ支援同定方法
図２４は、ニューカッスル病ウイルス（オーストラリア−ビクトリア／３２株；ＰＣ／Ｇｅｎｅタンパク質配列名ＰＶＧＬＦ＿ＮＤＶＡ）に見出されるモチーフヒットを示す。モチーフ１０７×１７８×４は、アミノ酸１５１−１７８のＤＰ１０７様ヒット及び残基４２６−５１２のＤＰ１７８様ヒットを含む２つの区域を見出す。ＡＬＬＭＯＴＩ５は、残基１１７−１８２、２３１−２７２、及び４２６−５１２を含む３つの区域を見出す。４２６−５１２からのヒットには、Ｌｕｐａｓ法によって高い超らせん傾向を有するものと推定される領域が含まれる（４６０−５０３）。ＰＬＺＩＰモチーフは、アミノ酸２７３−２８９の関心のある１つの領域だけを同定する（Ｐ１及び１２ＬＺＩＰＣ）。

１５．実施例：ヒトパラインフルエンザウイルスにおけるＤＰ１０７様及びＤＰ１７８様配列のコンピュータ支援同定方法
モチーフ１０７×１７８×４及びＡＬＬＭＯＴＩ５の両者は、同じ領域、１１５−１８２及び１１７−１８２のそれぞれに、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＮＩＨ４７８８５株；ＰＣ／Ｇｅｎｅタンパク質配列名ＰＶＧＬＦ＿ｐ１３Ｈ４）のＤＰ１０７様ヒットを示す（図２５）。加えて、この２つのモチーフは、アミノ酸２０７−２４１の僅かにＣ末端にかかるＤＰ１７８様ヒットを有する。また、両モチーフは、それぞれアミノ酸４５７−４９７及び４６２−５１２を含む膜貫通領域に近いＤＰ１７８様ヒットも有する。２８３−３０３（Ｐ５ＬＺＩＰＣ）、２８３−３１０（Ｐ１２ＬＺＩＰＣ）、４５３−４７４（Ｐ６ＬＺＩＰＣ）、及び４５３−４８１（Ｐ２３ＬＺＩＰＣ）を含む幾つかのＰＬＺＩＰモチーフヒットも観察される。Ｌｕｐａｓアルゴリズムは、アミノ酸１２２−１７６が超らせんを形成する傾向を有し得ることを推定する。

１６．実施例：インフルエンザＡウイルスにおけるＤＰ１０７様及びＤＰ１７８様配列のコンピュータ支援同定方法
図２６は、アミノ酸３８７−４５３の１０７×１７８×４モチーフヒット及び残基３８０−４５６のＡＬＬＭＯＴＩ５モチーフヒットに加えて、残基３７９−４３６のインフルエンザＡウイルス（Ａ／アイチ／２／６８（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８）株）における超らせんについてのＬｕｐａｓ推定を示す。残基３８３−４７１（ＨＡ２の３８−１２５）は、Ｃａｒｒ及びＫｉｍによって、酸性ｐＨの場合に広がった超らせんであることが示されている（ＣａｒｒａｎｄＫｉｍ，１９９３，Ｃｅｌｌ７３；８２３−８３２）。Ｌｕｐａｓアルゴリズムは残基３７９−４３６の超らせんを推定する。３つの方法の全てが実際に超らせん構造を有することが示される領域をうまく推定したが、ＡＬＬＭＯＴＩ５は８８残基伸長したより大きな部分を推定した。

１７．実施例：潜在的なＲＳウイルスＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体：ＣＤ及び抗ウイルス性の特徴付け
ここに提示される実施例において、上記９項及び１１項に提示される実施例において説明されるコンピュータ支援検索モチーフによって同定されるＲＳウイルス（ＲＳＶ）を抗ＲＳＶ活性について試験した。加えて、以下のように、これらのペプチドに対して円偏光二色性（ＣＤ）構造解析を行った。同定されたペプチドの幾つかが強力な抗ウイルス活性を現すことが示される。加えて、これらのペプチドの幾つかが実質的ならせんの特徴を現すことが示される。

１７．１材料及び方法
構造解析：ＣＤスペクトルは、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０、約１０ｍＭの濃度のバッファ中で、Ｊｏｂｉｎ／Ｙｖｏｎオートジクログラフ・マークＶＣＤ分光光度計に１ｃｍ経路長セルを用いて行った。ペプチドは、上記６．１項に説明される方法に従って合成した。ペプチドの濃度は、エドレホック法（Ｅｄｌｅｈｏｃｈ’ｓｍｅｔｈｏｄ）を用いてＡ₂₈₀から決定した（１９６７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６：１９４８）。

抗ＲＳＶ抗ウイルス活性検定：ここで用いられる検定は、それらのペプチドの、ＲＳＶに急激に感染したＨＥｐ２細胞（すなわち、２回を上回る複数回の感染で感染した細胞）の融合する能力を崩壊させ、Ｈｅｐ−２細胞の非感染系の単層に多核形成を引き起こす能力を試験した。観察される融合のレベルが低いほど、そのペプチドの抗ウイルス活性は高いものと決定される。

Ｈｅｐ−２細胞の非感染集密単層を、マイクロタイターウェルにおいて、仔ウシ血清［ＦＢＳ；これは５６℃で３０分間加熱不活性化されている；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＣａｔ．Ｎｏ．１４−５０１Ｆ）が３％補足され、抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＣａｔ．Ｎｏ．１７−６０２Ｅ）が１％添加され、かつグルタミンが１％添加されている３％ＥＭＥＭ（Ｌ−グルタミンを含まないイーグル最少必須培地［ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＣａｔ．Ｎｏ．１２−１２５Ｆ］中で増殖させた。

非感染細胞に添加するためのＨｅｐ２細胞を調製するため、急性感染Ｈｅｐ２細胞の培養物をＤＰＢＳ（カルシウムもしくはマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＣａｔ．Ｎｏ．１７−５１２Ｆ）で洗浄し、細胞単層をバーセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）（１：５０００；ＧｉｂｃｏＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣａｔ．Ｎｏ．１５０４０−０１７）で取り出した。これらの細胞を１０分間回転させ、３％ＦＢＳに再懸濁した。血球計算盤を用いて細胞を計数した。残存細胞を非感染Ｈｅｐ−２細胞に添加した。

抗ウイルス検定は、まず、非感染Ｈｅｐ−２細胞を収容するウェルから全ての培地を除去し、次いで、３％ＥＭＥＭ中のペプチド（下記の希釈率の）及びウェル当たり１００個の急性ＲＳＶ感染Ｈｅｐ２細胞を添加することにより行った。その後、ウェルを３７℃で４８時間インキュベートした。

インキュベーションの後、対照ウェルの細胞を融合中心についてチェックし、ウェルから培地を除去して、各ウェルにクリスタルバイオレット染料又はＸＴＴのいずれかを添加した。クリスタルバイオレットに関しては、メタノール中約５０μｌの０．２５％クリスタルバイオレット染料を各ウェルに添加した。各ウェルを直ちにすすいで過剰の染料を除去し、乾燥させた。その後、解剖顕微鏡を用いて、ウェル当たりの融合細胞の数を計数した。

ＸＴＴ（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド分子内塩）に関しては、５０μｌのＸＴＴ（１００ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２−７．４で緩衝したＲＰＭＩ及び５％ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。ＯＤ_450/690を（細胞又は試薬なしの成長培地、及び試薬に対してブランキングを行った後）標準手順に従って測定した。

ペプチド：ここに提示される研究において特徴付けられたペプチドは以下のようなものであった。

１）図２７Ａ−Ｂに示されるペプチドＴ−１４２ないしＴ−１５５及びＴ−５７５、並びに図２７Ｃに示されるペプチドＴ−２２ないしＴ−２７、Ｔ−６８、Ｔ−３３４及びＴ−３７１ないしＴ−３７５及びＴ−５７５；
２）図２７Ｄ−Ｅに示されるペプチドＴ−１２０ないしＴ−１４１及びＴ−５７６、並びに図２７Ｆに示されるペプチドＴ−１２、Ｔ−１３、Ｔ−１５、Ｔ−１９、Ｔ−２８ないしＴ−３０、Ｔ−６６、Ｔ−６９、Ｔ−７０及びＴ−５７６；及び
３）図２８Ａ−Ｂに示されるペプチドＴ−６７及びＴ−１０４ないしＴ−１１９及びＴ−３８４、並びに図２８Ｃに示されるペプチドＴ−７１、Ｔ−６１３ないしＴ−６１７、Ｔ−６６２ないしＴ−６７６及びＴ−７３０。

グループ１のペプチドはＲＳＶＦ２タンパク質のＤＰ１７８／１０７様領域の部分を表す。グループ２のペプチドはＲＳＶＦ１タンパク質のＤＰ１０７様領域の部分を表す。グループ３のペプチドはＲＳＶＦ１タンパク質のＤＰ１７８様領域の部分を表す。

各ペプチドを、１００μｇ／ｍｌないし約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の２倍連続希釈で試験した。これらの検定の各々について、ペプチドを含まないウェルも用いた。各ペプチドのＩＣ₅₀データは、そのペプチドを用いて行った幾つかの実験の平均を表す。

１７．２結果
図２７Ａ−Ｆ及び２８Ａ−Ｃにまとめられているデータは、ＲＳＶＦ２ＤＰ１７８／ＤＰ１０７様Ｆ２領域（図２７Ａ−Ｃ）、ＲＳＶＦ１ＤＰ１０７様領域（図２７Ｄ−Ｆ）及びＲＳＶＤＰ１７８様Ｆ２領域（図２８Ａ−Ｃ）を起源とするペプチドから得られる抗ウイルス性及び構造情報を表す。

図２７Ａ−Ｆに示されるように、多くのＲＳＶＤＰ１７８／ＤＰ１０７様ペプチドが検出可能なレベルの抗ウイルス活性を現した。ＲＳＶＤＰ１７８／ＤＰ１０７様Ｆ２領域（図２７Ａ−Ｃ）からのペプチド、例えば、Ｔ−１４２ないしＴ−１４５及びＴ−３３４精製ペプチドは、それらのＩＣ₅₀値によって立証されるように、検出可能なレベルの抗ウイルス活性を現した。さらに、ＲＳＶＦ１ＤＰ１０７様ペプチド（図２７Ｄ−Ｆ）は，それらの低いＩＣ₅₀値によって示されるように、かなりのレベルの抗ウイルス活性を、例えばペプチドＴ−１２４ないしＴ−１２７、Ｔ−１３１、Ｔ−１３５及びＴ−１３７ないしＴ−１３９を含む精製ペプチドとして現した。加えて、ＣＤ分析（図２７Ａ−Ｂ、２７Ｄ−Ｅ）は、多くのペプチドが幾つかの検出可能なレベルのらせん構造を現すことを明らかにする。

図２８Ａ−Ｃにまとめられる結果は、多くのＤＰ１７８様精製ペプチドが強力な抗ウイルス活性の範囲を現すことを示す。これらのペプチドには、例えば、図２８Ａ−Ｂに列挙されるＴ−６７、Ｔ−１０４、Ｔ−１０５及びＴ−１０７ないしＴ−１１９、並びに図２８Ｃに列挙されるＴ−６６５ないしＴ−６６９及びＴ−６７１ないしＴ−６７３が含まれる。加えて、ＤＰ１７８様ペプチドの幾つかは多少のレベルのらせん性を現した。

このように、上に説明されるコンピュータ支援検索は、非常に見込みのある抗−ＲＳＶ抗ウイルス性化合物を表すウイルスペプチドドメインをうまく同定した。

１８．実施例：潜在的なヒト・パラインフルエンザウイルスタイプ３
ＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体：ＣＤ及び抗ウイルス特性付け
本実施例において、前記第９節及び第１５節で提示した実施例に記載したコンピュータ検索モチーフを利用して同定したヒト・パラインフルエンザウイルスタイプ３（ＨＰＩＶ３）ペプチドの抗ＨＰＩＶ３活性を試験した。さらに、以下に記載するように、ペプチドの円二色性（ＣＤ）構造解析を実施した。同定されたペプチドの幾つかは効力のある抗ウイルス能を示すことが確認された。また、これらのペプチドの幾つかは実質的ならせん特性を示すことがわかった。

18.1 材料及び方法
構造解析：構造解析は円二色性（ＣＤ）分析による。１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０の緩衝液中で約１０ｍＭ濃度にて、Jobin/Yvon Autodichrograph Mark V ＣＤ分光光度計で、光路長１cmのセルを使用してＣＤスペクトルを測定した。ペプチドの濃度は、Edlehoch's法 (1967, Biochemistry 6:1948)を使用してＡ₂₈₀から決定した。

抗ＨＰＩＶ３抗ウイルス活性アッセイ：ここで用いたアッセイにより、ＨＰＩＶ３を慢性感染させたＨｅｐ２細胞が融合してＣＶ−１Ｗ細胞の未感染株の単層にシンシチウムを形成する能力をペプチドが破壊できるかを試験した。融合の観察レベルが低くなればなるほど効力が上がり、ペプチドの抗ウイルス活性が大きくなる。

ＣＶ−１Ｗ細胞の未感染の集密的単層を、マイクロタイターウェルにおいて、ウシ胎児血清［FBS；５６℃で３０分間熱不活性化した；Bio Whittaker Cat. No. 14-501F］を３％補充し、抗生物質／抗真菌剤（Gibco BRL Life Technologies Cat. No. 15040-017) を１％添加し、グルタミンを１％添加した、３％ＥＭＥＭ（L-グルタミンを含まないイーグル最少必須培地［Bio Whittaker Cat. No. 12-125F］中で増殖させた。

未感染細胞へ添加するＨｅｐ２細胞を調製するため、慢性感染させたＨｅｐ２細胞の培養物をＤＰＢＳ（カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝溶液；Bio Whittaker Cat. No. 17-512F）で洗って、細胞単層をベルセン(Versene)（１：5000；Gibco Life Technologies Cat. No. 15040-017）で分離した。細胞を１０分間遠心し、３％のＦＢＳに再懸濁させた。血球計算盤を使用して細胞の数を数えた。残存している細胞を未感染ＣＶ−１Ｗ細胞に添加した。

抗ウイルスアッセイを行うにあたって、最初に、未感染のＣＶ−１Ｗ細胞を含むウェルから全培地を除去し、ついで、３％のＥＭＥＭにペプチド（下記の希釈物）及びウェル当りＨＰＩＶ３を慢性感染させたＨｅｐ２細胞５００個を添加した。ついで、ウェルを３７℃で２４時間インキュベートした。

２日目、対照ウェル中の細胞の融合中心を検査した後、ウェルから培地を除去し、ついで各ウェルにメタノ−ル中の０．２５％クリスタルバイオレット約５０μｌを添加した。直ちにウェルを洗浄し、過剰量の染料を除去し、乾燥させた。ついで、解剖用顕微鏡を使ってウェル当りのシンシチウムの数を計算した。

また、クリスタルバイオレットの代わりに、細胞を前記第１７．１節で記載したＸＴＴでアッセイした。

ペプチド：ここに示した研究において特性付けられたペプチドは次のものである。

１）図２９Ａ−Ｃに示したペプチド１５７から１８８、及び図２９Ｄ−Ｅに示したペプチドＴ−３８からＴ−４０、Ｔ−４２からＴ−４６、及びＴ−５８２．これらのペプチドは（図２９Ａ−Ｃに示したＨＰＦ３１０７で表される）ＨＰＩＶ３Ｆ１融合タンパク質のＤＰ１０７領域に由来する；及び
２）図３０Ａ−Ｂに示したペプチド１８９から２１０、及び図３０Ｃに示したＴ−２６９、Ｔ−６２６、Ｔ−３８３、及びＴ−５７７からＴ−５７９。これらのペプチドは（図３０Ａ−Ｂに示したＨＰＦ３１７８で表される）ＨＰＩＶ３Ｆ１融合タンパク質のＤＰ１７８領域に主に由来する。ペプチドＴ−６２６は（陰影を付けたバックグラウンドで表される）２つの変異アミノ酸残基を有している。さらに、ペプチドＴ−５７７はＦ１アミノ酸６５−１００に相当し、Ｔ−５７８はＦ１アミノ酸２０７−２４２に相当し、そしてＴ−５７９はＦ１アミノ酸２７１−３０９に相当する。

各ペプチドを、５００μg/ml〜約５００ng/mlの範囲で２倍連続希釈してテストした。各アッセイにおいて、ペプチドを含まないウェルも使用した。

18.2 結果
図２９Ａ−Ｃ及び３０Ａ−Ｃに要約したデータは、ＨＰＩＶ３融合タンパク質ＤＰ１０７様領域（図２９Ａ−Ｃ）及びＨＰＩＶ３融合タンパク質ＤＰ１７８様領域（図３０Ａ−Ｃ）に由来するペプチドから得られた抗ウイルス及び構造に関する情報を表している。

図２９Ａ−Ｃに示したように、多数のＨＰＩＶ３ＤＰ１０７様ペプチドは顕著な抗ウイルス活性レベルを示した。これらのペプチドとしては、例えば、ペプチドＴ−４０、Ｔ−１７２からＴ−１７５、Ｔ−１７８、Ｔ−１８４及びＴ−１８５が挙げられる。

図３０Ａ−Ｃに要約したデータは、テストした多数のＤＰ１７８様ペプチドがある範囲の抗ウイルス活性を示すことを実証する。これらのペプチドとしては、低ＩＣ₅₀値から証明されるように、例えば、ペプチド１９４から２１１がある。事実、ペプチド２０１から２０５はナノグラム／ml範囲のＩＣ₅₀値を示した。さらに、多くのＤＰ１７８様ペプチドがあるレベルのらせん性を示した。

こうして、上述したコンピュータ検索によって、非常に有望な抗ＨＰＩＶ３抗ウイルス化合物であるウイルスペプチドドメインが成功裏に同定された。

１９．実施例：サル免疫不全ウイルスのＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体のコンピュータ検索
図３１は、ＳＩＶ分離株ＭＭ２５１（PC／Gene(登録商標)タンパク質配列PENV SIVM2)の検索結果を表している。107x178x4 及びALLMOTI5検索モチーフはどちらも、ＤＰ１０７及び／又はＤＰ１７８に類似した２つの領域を同定した。

107x178x4 で見いだされたペプチド領域は、アミノ酸残基１５６−２１５及び２７７−２８９に位置していた。ALLMOTI5で見いだされたペプチド領域は、アミノ酸残基１５６−２１９及び２４５−２８６に位置していた。従って、両モチーフとも類似の領域を同定する。

興味のあることに、第１のＳＩＶペプチド領域（即ち、アミノ酸残基１５６からおよそアミノ酸残基２１９まで）はＤＰ１０７領域と関係があり、一方同定された第２の領域（即ち、およそアミノ酸残基２４５からおよそアミノ酸残基２８９まで）は、ＨＩＶのＤＰ１７８領域と関係があった。事実、ＳＩＶ分離株ＭＭ２５１及びＨＩＶ分離株ＢＲＵのアライメント後に、ＨＩＶＤＰ１０７とＤＰ１７８に最もマッチしたペプチドを選択すると、その最もマッチしたペプチドは107x178x4 及びALLMOTI5検索モチ−フで同定されたペプチド領域内に存在することが明らかである。

アミノ酸残基２４２−２８２の潜在的な超らせん領域は、Lupas プログラムで予告されることに注目すべきである。これは、Lupas プログラムで超らせんがＤＰ１０７領域よりもＤＰ１７８領域にあると予告されるＨＩＶの観察に類似している。それゆえ、ＳＩＶがＤＰ１０７領域に超らせん構造を含むという点において、かかる構造がLupas アルゴリズムで間違ったにもかかわらず、ＨＩＶに似ている可能性がある。同様に、ＳＩＶのＤＰ１７８類似体に対応する領域が、Lupas プログラムで超らせん構造を予告しているにもかかわらず、未規定の構造を示すこともあり得る。

２０．実施例：エプスタイン- バーウイルスのＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体のコンピュータ支援同定
ここに示される結果は、２つの異なるエプスタイン- バーウイルスのタンパク質内のＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体の同定を記載する。エプスタイン- バーは、例えば、伝染性の単核細胞症（ＩＭ）、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、バーキットリンパ腫、及びその他の疾病の原因となるヒトヘルペスウイルスである。このウイルスは主として潜伏形態で存在し、種々の刺激によって活性化される。

図３２は、エプスタイン- バーウイルス（株Ｂ９５−８；ＰＣ／Gene(登録商標)タンパク質配列 PVGLB EBV ）糖タンパク質ｇｐ１１０前駆物質（ｇｐ１１５）の検索モチーフ結果を示す。107x178x4 モチーフは対象となる２つの領域、即ちアミノ酸残基９５−１２２及び６３１−６５８でカバーされる領域を同定した。１つのPZIP領域は、該タンパク質の細胞質領域である可能性が最も高いアミノ酸残基７３２−７５２で同定された。Lupas アルゴリズムはアミノ酸６５７−６８４の超らせん構造を予告する。ALLMOTI5領域はまったく同定されなかった。

図３３は、上記のように同定したエプスタイン- バーウイルスのゼブラ(Zebra)（またはＥＢ１）トランスアクチベータータンパク質（ＢＺＬＦ１）の検索モチーフ結果を示している。このタンパク質は、ウイルス再活性化の主要メディエーターに相当する転写因子である。これは転写因子のｂ−ＺＩＰファミリーの一員で、細胞オンコジーンｃ−ｆｏｓ及びＣ／ＥＢＰの塩基性ＤＮＡ結合ドメイン及び二量体化ドメインと顕著な相同性を共有する。ゼブラ(Zebra)タンパク質はホモ二量体として機能する。

検索結果から、ゼブラ(Zebra)タンパク質はＤＰ１０７又はＤＰ１７８との類似性を予告された単一の領域を示し、該領域が該タンパク質の既知のＤＮＡ結合領域と二量体化領域の間に存在することがわかる。特に、この領域は、図３３に示したように、アミノ酸残基１９３−２２０に位置している。Lupas プログラムはひとつの超らせん領域も予告しなかった。

２１．実施例：麻疹ウイルスのＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体のコンピュータ支援同定
図３４は、ＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体をうまく同定する、麻疹ウイルスのEdmonston 株の融合タンパク質Ｆ１（PC Gene(登録商標)タンパク質配列 PVGLF MEASE）のモチ−フ検索結果を示している。

107x178x4 モチーフはアミノ酸残基２２８−２６２の単一領域を同定する。ALLMOTI5検索モチーフは、アミノ酸残基１１６−１８４、２２８−２６９及び４５２−５００の３つの領域を同定する。ロイシンジッパー様配列が後に続くプロリン残基を含む３つの領域は、プロリン残基２１４、２８６及び４５１で始まることがわかった。

Lupas プログラムはアミノ酸残基１４１−１７２及び４４４−４８３を含む２つの領域を同定し、それは超らせん構造であることを予告した。

２２．実施例：Ｂ型肝炎ウイルスのＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体のコンピュータ支援同定
図３５は、Ｂ型肝炎ウイルスのサブタイプＡＹＷに対して行なったPZIPモチーフ検索の結果を示している。主要表面抗原前駆物質Ｓタンパク質内に対象となる２つの領域が同定された。第１の領域はアミノ酸残基１７４−１９１に存在する主要表面抗原（Ｈｂｓ）の提案された融合ペプチドの丁度Ｃ末端側にある。第２の領域はアミノ酸残基２３３−２６７に位置する。Lupas プログラムは超らせんリピート領域をひとつも予告しなかった。

これらＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体領域の潜在的な抗ＨＢＶ抗ウイルス活性をテストするため、類似体領域の周辺領域から誘導されるペプチドを図５２Ａ−Ｂに示したように合成した。これらのペプチドは、推定のＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体領域を通る１アミノ酸ペプチド「ウォーキング」を表す。カルボキシ末端をブロックするRinkamide MBHA樹脂上での標準Ｆｍｏｃ化学に従ってペプチドを合成した (Chang, C.D. & Meinhofer, J., 1978, Int. J. Pept. Protein Res. 11:246-249; Fields, G.B. & Noble, R.L., 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35;161-214) 。完全に合成した後、自動アセチル化によってペプチドのアミノ末端をブロックし、ペプチドをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び適当なスカベンジャーで切り離した（King, D.S.ら, 1990, Int. J. Pept. Res. 36:255-266)。切り離した後、ペプチドをエーテルで沈殿させ、２４時間真空乾燥した。

標準的なアッセイを用いてペプチドの抗ＨＢＶ活性をテストし、ＨＢＶウイルス接種物にさらされた細胞によって形成されるウイルス子孫の量の許容される減少（例えば、９０％）を起こさせるのに必要な試験ペプチド濃度を決定した。候補抗ウイルスペプチドは、ヒトで試験する前に、ウッドチャック(wood chuck)組織培養物や動物系などの標準系でさらに特性付けた。

２３．実施例：シミアンメゾンファイザーモンキーウイルスのＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体のコンピュ−タ支援同定
ここに記載する結果は、シミアンメゾンファイザーモンキーウイルスに対する検索モチ−フの結果を示す。モチーフは、図３６に示したように、エンベロープ（ＴＭ）タンパク質ｇｐ２０内のＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体を明らかにする。

107x178x4 モチーフはアミノ酸残基４２２−２７０の領域を同定した。ALLMOTI5はアミノ酸残基４０８−４７４の領域を同定した。Lupas プログラムはアミノ酸４２４−４５９に超らせん構造を予告した。

２４．実施例：細菌のタンパク質におけるＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体のコンピュータを用いる同定
ここで示した結果より、種々の細菌種のタンパク質に存在する配列に対応してＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体が同定されたことが証明された。

図３７は、Pseudomonas aerginosa のフィンブリンタンパク質（ピリン）についての検索モチーフの結果を表す。２つの領域が、モチ−フ１０７×１７８×４、及びＡＬＬＭＯＴＩ５によって同定された。アミノ酸残基３０〜６７、及び８０〜１４４の領域に位置する領域は、１０７×１７８×４によって確認された。アミノ酸残基３０〜６８、及び８０〜１２５の領域が、ＡＬＬＭＯＴＩ５によって確認された。

図３８は、Pseudomonas gonorrhoeae のフィンブリンタンパク質（ピリン）についての検索モチ−フ結果を表す。１０７×１７８×４、及びＡＬＬＭＯＴＩ５モチ−フの両者によって単一の領域が同定された。アミノ酸残基６６〜９７に位置する領域は、１０７×１７８×４モチ−フで同定した。アミノ酸残基６６〜１２５に位置する領域は、ＡＬＬＭＯＴＩ５検索モチーフで同定した。Lupas のプログラムでは、超らせん領域は予測されなかった。

図３９は、Hemophilus Influenzaのフィンブリンタンパク質（ピリン）の検索モチ−フを表す。単一の領域を、１０７×１７８×４、及びＡＬＬＭＯＴＩ５モチ−フの両方によって同定した。アミノ酸残基１０２〜１２９に位置する領域は、１０７×１７８×４モチ−フで同定した。アミノ酸残基１０２〜１４８に位置する領域は、ＡＬＬＭＯＴＩ５検索モチ−フで確認した。Lupas のプログラムでは、超らせん領域は予測されなかった。

図４０は、Staphylococcus aureus 毒性ショック症候群Hemophilus Influenzaのフィンブリンタンパク質（ピリン）についての検索モチ−フ結果を表す。単一領域を、１０７×１７８×４及びＡＬＬＭＯＴＩ５モチ−フの両方で同定した。アミノ酸残基１０２〜１２９に位置する領域は、１０７×１７８×４モチ−フで同定した。アミノ酸残基１０２〜１４８に位置する領域は、ＡＬＬＭＯＴＩ５検索モチ−フで同定した。Lupas のプログラムでは、超らせん領域は予測されなかった。

図４１は、Staphylococcus aureus エンテロトキシンＥ型のタンパク質について行なったモチ−フ検索結果を要約したものである。これらの結果は、下記に示すように、このタンパク質内のペプチド配列に対応するＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体がうまく同定されたことを証明している。

ＡＬＬＭＯＴＩ５モチ−フにより、アミノ酸残基２２〜２７の領域を同定した。１０７×１７８×４モチ−フにより、２つの領域、即ちアミノ酸残基２６〜６９にある第１領域、及びアミノ酸残基８８〜１１５にある第２領域を同定した。Ｐ１２ＬＺＩＰＣモチ−フ検索により、アミノ酸残基１６３〜１８１、及び２３０〜２５０にある２つの領域が同定された。

Lupas のプログラムにより、アミノ酸残基２５〜５４にコイルを巻く強い傾向を有する領域があることが予測された。この配列は、１０７×１７８×４とＡＬＬＭＯＴＩ５モチ−フの両方で同定された第１領域内に完全に含まれていた。

図４２は、第２のStaphylococcus aureus 毒素である、エンテロトキシンＡについて行なった検索モチ−フを表す。ＡＬＬＭＯＴＩ５モチーフによって、アミノ酸残基２２〜７０及びアミノ酸残基１６４〜２０５にある２つの領域が同定された。１０７×１７８×４モチ−フによって、２つの領域、すなわち、アミノ酸残基２６〜６９にある第１領域とアミノ酸残基１６５〜１９２にある第２領域とが同定された。Ｐ２３ＬＺＩＰＣモチ−フ検索は、アミノ酸残基２１６〜２５０にある領域を表していた。Lupas のプログラムでは、超らせん領域は予測されなかった。

図４３は、大腸菌の熱不安定エンテロトキシンＡタンパク質について行なったモチ−フ検索結果を示しており、このタンパク質内に位置するペプチドに対応するＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体を同定したことを証明している。

ＡＬＬＭＯＴＩ５モチ−フにより、２つの領域、すなわち、アミノ酸残基５５〜１１５にある第１領域とアミノ酸残基２１６〜２５４にある第２領域とを同定した。１０７×１７８×４モチ−フにより、アミノ酸残基７８〜１０５にある単一の領域を確認した。Lupas のプログラムでは、超らせん領域は予測されなかった。

２５．実施例２５：種々のヒトタンパク質内のＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体のコンピュ−タによる同定
ここで示した結果は、種々のヒトタンパク質内に存在するペプチド配列に対応するＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体の同定を示す。

図４４は、ヒトｃ−ｆｏｓ腫瘍タンパク質に対して行なった検査モチーフの結果を表す。ＡＬＬＭＯＴＩ５モチーフによって、アミノ酸残基１５５〜１９３にある単一領域が同定された。１０７×１７８×４モチ−フによって、アミノ酸残基１６２〜１９３にある１つの領域が同定された。Lupas のプログラムでは、アミノ酸残基１４８〜２０１の領域に超らせん構造があることが予測された。

図４５は、ヒト狼瘡ＫＵ自己抗原タンパク質に対して行なった検査モチ−フの結果を表している。ＡＬＬＭＯＴＩ５によって、アミノ酸残基２２９−２８０に単一領域を同定した。１０７×１７８×４モチ−フによって、アミノ酸残基２３５〜２９２に１つの領域を同定した。Lupas のプログラムでは、アミノ酸残基２３２〜２６７の領域に超らせん構造があることが予測された。

図４６は、ヒトジンクフィンガータンパク質１０に対して行なった検索モチ−フの結果を表している。ＡＬＬＭＯＴＩ５モチーフによって、アミノ酸残基２９〜８１にある単一領域が同定された。１０７×１７８×４モチ−フによって、アミノ酸残基２９〜５６にある１つの領域が同定された。Ｐ２３ＬＺＩＰＣモチ−フ検査によって、アミノ酸残基４２０〜４５７にある単一領域が観察された。Lupas ル−パスプログラムでは、超らせん領域は予測されなかった。

２６．実施例：潜在性麻疹ウイルスＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体：ＣＤ、及び抗ウイルス特性
本実施例では、前記第９節及び２節の実施例で記載したコンピュ−タによる検索モチ−フを利用して同定した麻疹ウイルス（ＭｅＶ）ＤＰ１７８様ペプチドの抗ＭｅＶ活性を試験した。さらに、下記の方法によって、円偏光二色性（ＣＤ）構造分析を前記ペプチドに対して実施した。同定されたペプチドの幾つかが、顕著な抗ウイルス力を示すことが証明された。また、これらのペプチドは、実質的にらせん特性を示さなかった。

２６．１材料と方法
構造解析：円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０の緩衝液を約１０ｍＭ濃度で使用し、Jobin/Yvonのオートジクログラフィー(Autodichrograph)マ−クＶＣＤ分光光度計で、長さ１cmのセルを利用して測定した。ペプチドの濃度は、Edlehoch法（1967年、Biochemistry ６；1948）を使用してＡ₂₈₀から決定した。

抗ＭｅＶ抗ウイルス活性シンシチウム減少分析：ここで利用した分析により、ペプチドが、ＭｅＶで急性感染させたベロ(Vero)細胞（即ち、２〜３のｍｏｉで感染させた細胞）を破壊して融合し、Vero細胞の非感染系の単層にシンシチウムを形成するペプチドの能力をテストした。ペプチドの能力が上がれば上がる程、融合の観察レベルは低くなり、ペプチドの抗ウイルス性活性は大きくなった。

Vero細胞の非感染の融合単層を、胎児牛血清［FBS；５６℃で３０分間熱不活性化し；(Bio Whittaker Cat.No.14-501F)を３％補充し、抗生物質／抗真菌物質（Bio Whittaker Cat.No.17-602E) を１％添加し、さらにグルタミンを１％添加した、１０％ＦＢＳＥＭＥＭ（Eagleの最小必須培地（Ｌ−グルタミンを含まない；Ｗ／Ｏ）(Bio Whittaker Cat.No.12-125F)）を含有するマイクロタイターウェル中で増殖させた。

非感染細胞へ添加する急性感染させたＶｅｒｏ細胞を調製するため、急性感染させたＶｅｒｏ細胞の培養物を、ＨＢＳＳ（Bio Whittaker Cat.No.10-543F) で２回洗って、細胞の単層をトリプシン(Bio Whittaker Cat.No.17-161E)で除去した。細胞が剥離された後、培地を添加し、残存している細胞の凝集物が分散され、血球計算盤を使用して細胞の数を数えた。

最初に、非感染のＶｅｒｏ細胞を含むウェルから培地を除去し、ついで、10％ＦＢＳのＥＭＥＭにペプチド（下記の希釈度）及び１ウェル当りＭｅＶで急性感染させた５０〜１００個のＶｅｒｏ細胞を添加することにより、抗ウイルスアッセイを実施した。ついで、培養用縦穴を３７℃で最大１８時間培養した。

２日目、対照ウェル中の細胞の融合中心を確認した後、ウェルから培地を除去し、ついで、各ウェルに０．２５％クリスタルバイオレットを含むメタノ−ル約５０μｌを添加した。直ちに、ウェルを２回水洗し、過剰量の染料を除去し、乾燥させた。ついで、解剖顕微鏡を使用して、１ウェル当りのシンシチウムの数を計算した。

抗ＭｅＶ抗ウイルス活性プラ−ク減少分析：ここで利用した分析により、ペプチドが、非感染の許容Ｖｅｒｏ細胞を感染させるＭｅＶの能力を破壊し、感染細胞を非感染の細胞と融合させ、シンシチウムを形成する能力をペプチドテストした。シンシチウム形成の観察レベルが低下すればする程、ペプチドの抗ウイルス活性が大きくなった。

非感染のVero細胞の単層を、上述したようにして増殖させた。

抗ウイルス活性を、最初に、非感染のＶｅｒｏ細胞を含む培養用縦穴から全ての培地を除去し、ついで、１０％のＦＢＳＥＭＥＭに、ペプチド（下記の希釈）及びウェル当り３０プラ−ク形成単位（ＰＦＵ）の最終濃度でＭｅＶ株ウイルスを添加した。ついで、培養用縦穴を３７℃で最少３６時間、最大４８時間培養した。

２日目、ウェル中の細胞の融合量を検査した後、培養用縦穴から培地を除去し、ついで、各培養用縦穴に０．２５％クリスタルバイオレットを含むメタノ−ル約５０μｌを添加した。直ちに、ウェルを２回水洗し、過剰量の染料を除去し、乾燥させた。ついで、解剖顕微鏡を使用して、１ウェル当りのシンシチウムの数を計算した。

ペプチド：本実施例で研究したペプチドは、図４７に示したＴ−２５２Ａ０〜Ｔ−２５６Ａ０、Ｔ−２５７Ｂ１／Ｃ１、及びＴ−２５８Ｂ１〜Ｔ−２６５Ｂ０、及びＴ−２６６Ａ０〜Ｔ−２６８Ａ０である。これらのペプチドは、ＭｅＶ融合タンパク質のＤＰ１７８様領域全体でウォーキングを表していた。

各ペプチドを１００μg/mlから約１００ng/mlの範囲で２倍の連続希釈により希釈した。各々を分析するため、ペプチドを含まないウェルも使用した。

２６．２結果
図４７に要約したデ−タは、ＭｅＶ融合タンパク質のＤＰ１７８様領域を通っての”ペプチドのウオーキング”(peptide walk)によって得られた抗ウイルス情報、および構造情報を表す。

図４７に示したように、ＭｅＶのＤＰ１７８様ペプチドが、粗精製ペプチドと同程度の抗ウイルス性活性の範囲を示した。これらのペプチドの幾つかを選択して精製し、さらに抗ウイルス性特性を評価した。図４７に示すように、かかるペプチドのＩＣ₅₀値は、１．３５μg/ml（Ｔ−２５７Ｂ１／Ｃ１）から０．０７２μg/ml（Ｔ−２６５Ｂ１）の範囲であった。ＣＤ分析によって、ＤＰ１７８様ペプチドは、検出可能なレベルのヘリックス性を示した。

したがって、上述したようにコンピュ−タを用いた検索は、例えば、第９節に記載した実施例に示したように、非常に有望な抗−ＭｅＶ抗ウイルス化合物を表すウイルスのペプチドドメインを同定することができた。

２７．実施例：ＳＩＶのＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体：抗ウイルス性特性
本実施例において、前記第９、第１２、および第１９節の実施例で記載したコンピュ−タを用いる検索モチ−フを利用して、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＤＰ１７８様ペプチドの抗ＳＩＶ活性を、確認した。確認したペプチドの幾つかが、顕著な抗ウイルス能を示した。

２７．１材料と方法
抗ＳＩＶ抗ウイルスアッセイ：ここで利用したアッセイは、(Langolis)等の文献により報告されたものである（Langolis, A.J.ら, 1991, AIDS Research and Human Retroviruses 7: 713-720).
ペプチド：この実験で疾特徴づけしたペプチドは、図４８に示したように、Ｔ−３９１〜Ｔ−４００である。これらのペプチドは、ＳＩＶのＴＭタンパク質のＤＰ１７８様領域を通ってウオーキングすることを示した。

各ペプチドを、１００μg/mlから約１００ng/mlの範囲で２倍の連続希釈を行って試験した。各アッセイのためにペプチドを含まないウェルも使用した。

２７．２結果
図４８に要約したデ−タは、ＳＩＶのＴＭタンパク質のＤＰ１７８様領域を通って" ペプチドのウォーキング" により得られた抗ウイルス活性を表す。

図４８に示すように、ペプチドＴ−３９１〜Ｔ−４００を試験したところ、粗精製ペプチドと同程度の強い抗ウイルス活性を示した。

したがって、例えば、上述したようなコンピュータを用いた検索により、第９節の実施例に表すように、例えば、非常に有望な抗ＳＩＶ抗ウイルス化合物を表すウイルスペプチドドメインを確認することができた。

２８．実施例：ＤＰ１０７およびＤＰ１７８ペプチドの末端切断体および変異体の抗ウイルス活性
この節において表される本実施例は、ＤＰ１０７およびＤＰ１７８ペプチドの末端切断体および変異体の抗ウイルス活性の実験を示す。これらのＤＰ１０７およびＤＰ１７８修飾ペプチドのいくつかは、実質的な抗ウイルス性活性を示すことが証明された。

２８．１材料と方法
抗ＨＩＶアッセイ；抗ウイルスアッセイは、前記第６．１．節に記載した方法によって行った。アッセイには、ＨＩＶ−１／IIIｂおよび／またはＨＩＶ−２ＮＩＨＺ単離物を使用した。図４９Ａ−Ｃに記載したものを除いて、精製ペプチドを使用した。

ペプチド：本実施例で使用したペプチドの特徴は下記の通りである。

１）図４９Ａ−Ｃは、ＨＩＶ−１ＢＲＵ単離物のＤＰ１７８領域周辺およびＤＰ１７８を含む領域に由来するペプチドを表す。特に、この領域はｇｐ４１アミノ酸残基の６１５〜アミノ酸残基７１７までの範囲にわたっている。リストに挙げたペプチドは、ＤＰ１７８配列のアミノ酸配列から変化するこの領域の末端切断体および／または変異体を含む。さらに、図示したように、ある種のペプチドは、付加または欠失したアミノ末端基および／またはカルボキシ末端基を有する；
２）図５０は、ＤＰ１０７の末端切断体および／またはＨＩＶ−１ＢＲＵ単離体のＤＰ１０７アミノ酸配列を取り巻くｇｐ４１領域を表すペプチドを示している。ある種のペプチドは、図示したように、末端が保護されていないか、或いはビオチニル化されているものである。

２８．２結果
図４９Ａ−Ｃに挙げたグル−プ１のＤＰ１７８由来ペプチドの抗ＨＩＶ抗ウイルスデータを得た。全長の、突然変異していないＤＰ１７８ペプチド（図４９Ａ−ＣでＴ２０として記載）での結果は、４ng/mlであった。

図４９Ａにおいて、低いＩＣ₅₀値によって証明されたように、多数のＤＰ１７８末端切断体が高いレベルの抗ウイルス活性を示した。これらは、例えば、被験ペプチドＴ−５０、Ｔ−６２４、Ｔ−６３６〜Ｔ−６４１、Ｔ−６４５〜Ｔ６５０、Ｔ−６５２〜Ｔ−６５４、およびＴ−６５６である。Ｔ−５０は、図において残基に陰をつけて示したような、点変異を含む被験ペプチドを表す。ＨＩＶ−１由来の被験ペプチドは、明確な株特異的抗ウイルス活性を示した。このことはＨＩＶ−２ＮＩＨＺ単離物で試験したペプチドは、いずれも、目に見えるような抗ＨＩＶ−２抗ウイルス活性を示さなかった。

図４９Ｂに挙げたペプチドの中で、ＤＰ１７８のアミノ（Ｔ−４）およびカルボキシ（Ｔ−３）末端の半分を表すペプチドを被験ペプチドとして試験した。アミノ末端ペプチドは活性ではなかった（ＩＣ₅₀＞４００μg/ml）が、一方カルボキシ末端ペプチドは、顕著な抗ウイルス活性（ＩＣ₅₀＝３μg/ml）を示した。多くの被験ペプチドもまた、高い抗ウイルス活性を示した。このようなペプチドとしては、例えば、Ｔ−６１／Ｔ−１０２、Ｔ−２１７〜Ｔ−２２１、Ｔ−２３５、Ｔ−３８１、Ｔ−６７７、Ｔ−３７７、Ｔ−５９０、Ｔ−３７８、Ｔ−５９１、Ｔ−２７１〜Ｔ−２７２、Ｔ−６１１、Ｔ−２２２〜Ｔ−２２３、およびＴ−６０／Ｔ−２２４などがある。ある種の抗ウイルスペプチドは、ＤＰ１７８アミノ酸配列から変化する、点変異体および／またはアミノ酸残基付加体を含む。

図４９Ｃにおいて、点変異および／またはアミノ末端の修飾および／またはカルボキシ末端の修飾が、ＤＰ１７８アミノ酸配列自体に導入される。図示したように、リストに挙げた被験ペプチドの大部分が顕著な抗ウイルス活性を示した。

図５０に示すように、ＤＰ１０７ペプチドの末端切断体（図５０においてＴ２１と表示）を製造して試験した。図５０はまた、ＤＰ１０７配列が存在しているｇｐ４１領域から付加的なアミノ酸残基を含む保護されたペプチド、および保護されていないペプチドに関するデ−タを表す。これらのペプチドの多くは、それらの低いＩＣ₅₀から明らかなように、抗ウイルス活性を示した。

かくて、本節で得た結果は、全長のＤＰ１０７およびＤＰ１７８ペプチドが顕著な抗ウイルス活性を示すだけではなく、これらのペプチドの末端切断体および／または突然変異体も実質的な抗ウイルス特性を有していることを証明している。

２９：実施例：潜在的なエプスタイン−バーのＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体：抗ウイルス特性
本実施例では、前記第２０節の実施例で同定した、Ｚｅｂｒａタンパク質のエプスタイン−バー（ＥＢＶ）のＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体領域に由来するペプチドを記載し、その抗ＥＢＶ活性を試験した。これらのペプチドの中の幾つかのものが、顕著な抗ウイルス活性を示すことが証明された。

２９．１材料と方法
電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）：
簡単にいえば、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのin vitroで転写と小麦胚芽のin vitro翻訳系を用いて、ＥＢＶのＺｅｂｒａタンパク質を合成した（Promega Corporation recommendations; Butler, E.T. とChamberlain, M.J.,1984,J.Biol.Chem. 257: 5772; Pelham, H.R.B. と Jackson, R.J.,1976, Eur.J.Biochem. 67:247) 。ついで、in vitro翻訳されたＺｅｂｒａタンパク質を、10,000〜20,000c.p.m.の³²Ｐ標識Ｚｅｂｒａ応答要素のＤＮＡ断片を添加する前に、２５０ng/mlまでの量のペプチドとともにプレインキュベーションした。この応答要素の存在下において２０分インキュベーションした後に、４％の未変性ポリアクリルアミドゲル上で反応を分析し、次いで標準的なゲル−シフト手順を利用してオートラジオグラフィーにかけた。被験ペプチドのＺｅｂｒａのホモ二量体ＤＮＡ結合阻害能を、タンパク質結合核酸分子の応答要素ゲル移動遅延特性を破壊するこのペプチドの能力によって分析した。

ペプチド：この実験において特徴づけたペプチドは、前記第２０節の実施例で確認し、かつ図３３に示したＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体領域を含む領域、および両側にその領域が隣接している領域を通って、ウォーキングするペプチドを表す。特に、このペプチドのウオーキングは、ＥＢＶのＺｅｂｒａタンパク質のアミノ酸残基１７３〜アミノ酸残基２４６の範囲をカバーしていた。

各被験ペプチドを濃度範囲で分析したところ、いずれかのペプチドが阻害効果を発揮する最低濃度は１５０ng/mlであった。

２９．２結果
ＥＢＶのＺｅｂｒａタンパク質転写要因子は、前記第２０節の実施例で証明したように、ＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体領域を含む。このタンパク質は、ウイルスの再活性化能に関与する主要な要素であることが分かった。したがって、ＺｅｂｒａウイルスのＤＮＡ結合機能を破壊する方法は、効果的な抗ウイルス技術を表す。それ故、潜在的な抗ＥＢＶＤＰ１７８／ＤＰ１０７ペプチドを同定するため、前記第２０節で確認した領域に由来するペプチドの、Ｚｅｂｒａタンパク質ＤＮＡの結合阻害能を試験した。

被験ペプチドのＺｅｂｒａタンパク質ＤＮＡが結合阻害能を、第２８．１節で記載したＥＭＳＡアッセイによってアッセイした。図５１Ａ−Ｂに要約したデ−タは、リストに挙げたＥＢＶ被験ペプチドのＥＭＳＡアッセイの結果を表す。これらのペプチドは、前記第２０節の実施例で確認し、かつ図３３に示したＤＰ１７８／ＤＰ１０７類似体領域を含む領域、および両側にその領域が隣接している領域を通って１個のアミノ酸が”ウオーキングする”ことを示している。図５１Ａ−Ｂに示したように、これらのペプチドからの領域は、ＥＢＶのＺｅｂｒａタンパク質のアミノ酸残基１７３〜２４６に存在する。４３９、４４１、４４４、および４４５を含めて、多数のアッセイした被験ペプチドが、Ｚｅｂｒａタンパク質ホモ二量体ＤＮＡの結合を阻害する能力を示した。

Ｚｅｂｒａタンパク質のＤＮＡの結合を阻害する能力を示したこれらのペプチドは、抗ＥＢＶ抗ウイルス性性化合物であり、これらのＥＢＶ感染阻害能についてさらに特徴づけを行った。

本発明は、本発明の個別の特徴を説明する目的で記載した特定の実施態様に限定されるものではなく、機能的に均等な方法および構成要件は本発明の精神に包含される。事実、当業者には、前述した記載および添付した図面から、本発明に関する多くの改良、変形が可能であることは自明であろう。かかる改良は、本発明の請求の範囲に包含される。

Claims

下記のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなる、抗HIV-1活性を示す単離されたペプチド：
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNAF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLANWF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLQLDKWASLWNWF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNQQELLQLDKWASLWNWF-Z;
X-YTSLIHSLIEQSQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z;
X-YTSLIHSLIQESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKEASLWNWF-Z;
X-YTSLIQSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLFNFF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNLQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKLEQELLELDKWASLWNWF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEFDKWASLWNWF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASPWNWF-Z;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNSF-Z;
X-LRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAV-Z;
X-LEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQE-Z;
X-EQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK-Z;
X-QIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN-Z;
X-WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ-Z;
X-NNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE-Z;
X-NMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-Z;
X-TWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-Z;
X-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-Z;
X-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-Z;
X-WMEWDREINNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQELLE-Z;
X-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD-Z;
X-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-Z;及び
X-WDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKW-Z、
［上記配列において、アミノ酸残基は一文字表記で表されており、さらに、前記ペプチドはアミノ末端Xおよびカルボキシ末端Zを含み、ここにおいて、Xはアミノ基またはアセチル基であり、Zはカルボキシル基またはアミド基である]。
Xがアミノ基で、Zがカルボキシル基である、請求項1に記載のペプチド。
Xがアセチル基である、請求項1に記載のペプチド。
Zがアミド基である、請求項1に記載のペプチド。
Xがアセチル基で、Zがアミド基である、請求項4に記載のペプチド。
HIV-1感染の治療において抗ウイルス剤として使用するための、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
HIV-1感染の治療において抗ウイルス剤として用いるための医薬の製造における、請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチドの使用。
HIV-1ウイルスの細胞への伝播を阻止するために、前記ペプチドを細胞の存在下に有効濃度で十分な期間にわたり該ウイルスと接触させる、請求項７に記載の使用。
有効成分としての請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチドおよび製薬上許容される担体を含有する、HIV-1ウイルスの細胞への伝播を阻止するための医薬組成物。
請求項1に記載のペプチド（ただし、Xがアミノ基で、Zがカルボキシル基である）をコードする単離された核酸。
請求項10に記載の核酸を含むベクター。
請求項1に記載のペプチドをコードする核酸を含むベクターの発現により産生されるペプチド。
下記のアミノ酸配列からなる群より選択される配列からなる、抗HIV-1活性を示す単離されたペプチド：
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNAF;
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLANWF;
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF;
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLQLDKWASLWNWF;
YTSLIHSLIEESQNQQEKNQQELLQLDKWASLWNWF;
YTSLIHSLIEQSQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF;
YTSLIHSLIQESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF;
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKEASLWNWF;
YTSLIQSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF;
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLFNFF;
YTSLIHSLIEESQNLQEKNEQELLELDKWASLWNWF;
YTSLIHSLIEESQNQQEKLEQELLELDKWASLWNWF;
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEFDKWASLWNWF;
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASPWNWF;
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNSF;
LRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAV;
LEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQE;
EQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK;
QIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN;
WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ;
NNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE;
NMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL;
TWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE;
WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL;
WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE;
WMEWDREINNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQELLE;
MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD;
EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK;及び
WDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKW。