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JP2009282044A - 特定リポ蛋白中の脂質測定法 - Google Patents

特定リポ蛋白中の脂質測定法 Download PDF

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祥子 山本
Mitsuaki Yamamoto
光章 山本
Kazuo Nakanishi
一夫 中西
Kazunori Saito
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Abstract

【課題】簡便な操作で効率良く種々の自動分析装置に適用できる特定画分中の脂質測定法の提供。
【解決手段】本発明は特定リポ蛋白中の脂質測定法において、少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程で、多環型ポリオキシアルキレン誘導体を用いることを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、少ない試料で簡便な操作により効率良く特定画分に存在する脂質を分離定量する方法及び試薬に関する。
コレステロ−ル、中性脂肪、リン脂質は、血漿中においてアポ蛋白と結合し、リポ蛋白を形成している。リポ蛋白は物理的な性状の違いにより、カイロミクロン、超低比重リポ蛋白(ＶＬＤＬ)、低比重リポ蛋白(ＬＤＬ)、高比重リポ蛋白(ＨＤＬ) 等に分類される。ＬＤＬは更に中間型リポ蛋白（ＩＤＬ）とＬＤＬに細分される場合があり、またリポ蛋白の分解産物（レムナント）もリポ蛋白の一つとして取り扱われることがある。これらのリポ蛋白のうち、ＬＤＬは動脈硬化を引き起こす原因物質の一つであり、一方ＨＤＬは抗動脈硬化作用を示す事が知られている。
疫学的には、ＬＤＬ中のアポ蛋白やコレステロール値は、動脈硬化性疾患の発症頻度と正相関を示し、一方、ＨＤＬ中のアポ蛋白やコレステロール値は動脈硬化性疾患の発症頻度と逆相関を示す事が知られており、今日では、虚血性心疾患の予防や診断を目的としてＬＤＬ中やＨＤＬ中のアポ蛋白やコレステロールの測定が行われている。
ＬＤＬやＨＤＬ中の脂質の測定法としては、例えば超遠心分離によってＬＤＬやＨＤＬを、他のリポ蛋白と分離した後、それぞれの脂質測定に供する方法や、電気泳動によって分離した後に脂質染色を行って、その発色強度を測定する方法が知られている。しかしながら、これらの方法は、いずれも、操作が煩雑で多数の検体を処理できないなどの問題があり、日常的にはほとんど用いられていなかった。
リポ蛋白中の脂質測定で最も一般的なものは、ＨＤＬ中のコレステロールの測定である。ＨＤＬコレステロール測定方法として、臨床検査の領域で用いられている方法には、検体に沈殿剤を加えてＨＤＬ以外のリポタンパクを凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたＨＤＬのみを含む上清中のコレステロールを測定する沈殿法がある。この方法は比較的多量の検体量を要し、全分析工程を完全に自動化する事はできなかった。近年、酵素的にＨＤＬコレステロールを分別定量する方法も検討されている。例えば、胆汁酸塩及び非イオン系界面活性剤の存在下に、酵素反応を行う方法（特許文献１）、ＨＤＬ以外のリポ蛋白をあらかじめ凝集させておき、ＨＤＬ中のコレステロールのみを酵素的に反応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集を再溶解して吸光度を測定する方法（特許文献２）、ＨＤＬ以外のリポタンパクを沈殿させる沈殿試薬とコレステロール測定試薬を組み合わせて使用し、沈殿しないＨＤＬ中のコレステロールを測定する方法（特許文献３）、抗体を使用するもの（特許文献４）、糖化合物を使用するもの（特許文献５）、第一反応中に、特殊な界面活性剤の存在下でコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼをＨＤＬ以外のリポ蛋白に作用させ、これらに含まれるコレステロールを、優先的に作用させたのち、ＨＤＬ以外のコレステロールに対する反応を抑制しながらＨＤＬ中のコレステロールを測定する方法（特許文献６）、特定の群から選ばれる界面活性剤とコレステロール測定用酵素試薬を使用して、ＨＤＬ中のコレステロールがコレステロール測定用酵素試薬と優先的に反応する時間内に測定する方法（特許文献７）、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼをＨＤＬ中のコレステロールに特異的に作用する界面活性剤と組み合わせる方法（特許文献８）がある。
ＨＤＬコレステロールに次いで測定されるＬＤＬコレステロール測定においては、臨床的な意義は大規模疫学研究を通じ広く知られていたものの、ＨＤＬコレステロール測定における沈殿法のような方法が開発されなかったことから、超遠心分離法の結果を基に考案された「推定値」を求める換算式法（Freidewald法。以下Ｆ式法と略）が利用されていた。Ｆ式法のＬＤＬコレステロールは総コレステロールからＨＤＬコレステロールとＶＬＤＬコレステロールを差し引いて算出され、ＶＬＤＬコレステロールとして中性脂肪濃度の１／５の値が使用されている。ＶＬＤＬコレステロールを中性脂肪から推定するため、中性脂肪濃度が４００mg/dlを越える人や、III型高脂血症患者には使用できず、また食事により一過性に中性脂肪が増加している時には負の影響が出るなどの問題があった。これに対し、ＬＤＬコレステロールの酵素法も開発され、ＬＤＬコレステロールを含む試料からＨＤＬコレステロールを消去したのち、残存するＬＤＬコレステロールを測定する方法(特許文献９)、糖化合物及び又は蛋白可溶化剤の存在下、試料中のＬＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献１０）がある。特定構造を有する界面活性剤を使用する方法（特許文献１１）やアミンを含む緩衝液中でＬＤＬ以外に作用する界面活性剤を使用する方法（特許文献１２）もある。
中性脂肪は、血漿中の多くがＶＬＤＬ中に存在する事から先述のＦ式法によるＬＤＬコレステロール推定においてＶＬＤＬコレステロール値推定に用いられている（ＶＬＤＬコレステロール＝ＴＧ／５）。一般に中性脂肪測定は、第一反応で遊離グリセロールを消費した後、第二反応でリポ蛋白リパーゼにより生成する遊離グリセロールをリン酸化し、更にグリセロリン酸酸化酵素を作用させ生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、トリンダー色素と反応させて発色させる方法が用いられる。遊離グリセロールの消費にはいわゆる無色発色法が用いられ、パーオキシダーゼとその基質の一方やカタラーゼ、及びその組み合わせが汎用される。特定リポ蛋白中の中性脂肪測定は、従来超遠心分離法や凝集剤を用いた分画法、ゲル濾過による分画法などが知れられている、また特定リポ蛋白以外のリポ蛋白の反応を阻害する界面活性剤やＨＬＢ１５以上の界面活性剤を用いる方法（特許文献１３）がある。
特開昭６３−１２６４９８号公報 特開平６−２４２１１０号公報 特許第２６０００６５号公報 特開平９−９６６３７号公報 特開平７−３０１６３６号公報 特開平９−２９９号公報 特開平１１−５６３９５号公報 特開２００１−１０３９９８号公報 特再平８−８２８７３４号公報 特再平８−８２９５９９号公報 特開平９−３１３２００号公報 特開平１０−３８８８８号公報 国際公開第００／４３５３７号
しかしながら、従来用いられている添加剤では特定リポ蛋白に対する特異性や脂質測定に用いられる酵素活性への影響などの点で十分満足できるものではなかった。また条件に適った添加剤を探索するためには、超遠心分離装置のような高価な機器を用いて新鮮な人血液から少なくとも主要なリポ蛋白であるＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬを分離調製して、それぞれを評価、選抜する必要があり、多くの時間と経費を必要としていた。
したがって、本発明の目的は、簡便な操作で効率良く種々の自動分析装置に適用できる特定画分中の脂質測定法を提供することにある。
そこで、本発明者は、鋭意研究を行った結果、少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程において特定の界面活性剤を用いることによって試料中の測定対象リポ蛋白中の脂質が特異的に測定できること、更にこれらの界面活性剤が共通の構造的特徴を有していることを見出して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、特定リポ蛋白中の脂質測定法において、少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程で多環型ポリオキシアルキレン誘導体を用いることを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定法を提供するものである。
また本発明は、特定リポ蛋白に作用する多環型ポリオキシアルキレン誘導体及び目的脂質測定試薬を含有することを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定試薬を提供するものである。
本発明によれば、数多くの界面活性剤の中から効率よく有用な界面活性剤を選択でき、これを用いて遠心分離などの前処理の必要がなく、簡便な操作で効率良く特定画分中の脂質を定量する事ができる。また、少ない試料で、簡便な操作により、特異的な測定が可能であるため、種々の分析方法に適用でき、臨床検査の領域においても極めて有用である。
図１は、本発明方法と従来法（コレステストＮ ＨＤＬ使用）との相関関係を示す図である。 図２は、本発明方法と従来法（コレステストＬＤＬ使用）との相関関係を示す図である。 図３は、本発明方法と従来法（コレステストＮ ＨＤＬ使用）との相関関係を示す図である。 図４は、本発明方法と従来法（コレステストＬＤＬ使用）との相関関係を示す図である。 図５は、本発明方法によるＬＤＬ中性脂肪の測定結果を示す図である。 図６は、本発明によるＨＤＬ中性脂肪の測定結果を示す図である。 図７は、本発明の界面活性剤のＨＬＢと相関係数の関係を示す図である。 図８は、本発明の界面活性剤のアリール基数と相関係数の関係を示す図である。
本発明で用いられる多環型ポリオキシアルキレン誘導体としては、多環型、すなわち２個以上のアリール基を有する非イオン性又は陰イオン性の界面活性剤が挙げられる。当該アリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アルキルフェニル基、フェニルアルキル基、フェニルアルケニル基等が挙げられる。アルキルフェニル基としては、ノニルフェニル基等のＣ1−Ｃ20アルキルフェニル基が挙げられる。フェニルアルキル基としては、ベンジル基等のフェニル−Ｃ1−Ｃ6アルキル基が挙げられる。フェニルアルケニル基としては、スチリル基等のフェニルＣ2−Ｃ6アルケニル基が挙げられる。これらのアリール基の数は２〜１０、特に２〜８が好ましい。但し、縮合物の場合はこの限りでない。
また多環性基の好ましい例としては、フェニル基上にフェニル基、ナフチル基、アルキルフェニル基、フェニルアルキル基及びスチリル基から選ばれるアリール基が１〜５個、より好ましくは１〜３個が置換した基が挙げられる。
当該界面活性剤のポリオキシアルキレン基としては、ポリオキシエチレン基、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン基、ポリオキシプロピレン基などが挙げられ、ポリオキシエチレン基が特に好ましい。ポリオキシアルキレン付加モル数は、測定対象である目的脂質、ポリオキシアルキレン基の種類によっても異なるが２〜１００、更に５〜５０、特に１０〜５０が好ましい。
多環型ポリオキシアルキレン誘導体のうち、非イオン性界面活性剤としてはポリオキシアルキレンエーテル系非イオン性界面活性剤が好ましい。また非イオン性界面活性剤の場合、そのＨＬＢは１２〜１８が好ましい。また陰イオン性界面活性剤としてはスルホン酸エステル系、リン酸エステル系又はスルホサクシネート系の陰イオン性界面活性剤が好ましい。
また、目的脂質がコレステロールの場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、特定のリポ蛋白に作用するＨＬＢ１２〜１８の非イオン性界面活性剤であって、目的脂質に対する特異性が該界面活性剤のＨＬＢ値に依存せず、専らアリール基の数に支配される界面活性剤を使用するのが好ましい。
また、目的脂質がコレステロールの場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、特定のリポ蛋白に作用するＨＬＢ１２〜１８の非イオン性界面活性剤であって、アリール基を２個以上有する界面活性剤（但し、ＬＤＬ中のコレステロールを測定した際に緩衝液により測定の特異性が影響されるＨＬＢ１３〜１５のものを除く）を使用するのが好ましい。
更に、目的脂質がＨＤＬ中のコレステロールである場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、ＨＤＬに優先的に作用するＨＬＢ１４．１〜１８、特にＨＬＢ１４．３〜１８の非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。また、目的脂質がＬＤＬ中のコレステロールである場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、ＬＤＬ以外に優先的に作用するＨＬＢ１５．１〜１８、特にＨＬＢ１５．３〜１８の非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。また、目的脂質が特定のリポ蛋白中の中性脂肪である場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、ＬＤＬ以外に優先的に作用するＨＬＢが１２〜１８であって２個以上のアリール基を有する非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。目的脂質がＬＤＬ中の中性脂肪である場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体がＬＤＬ以外に優先的に作用するＨＬＢが１２〜１５であって２個以上のアリール基を有する非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。ここで、優先的に作用するとは、特定のリポ蛋白に対して他のリポ蛋白に優先して作用することをいう。
特に好ましいポリオキシアルキレン誘導体としては、複数のフェニル基を有するポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンポリスチリルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンフェニルフェノールエーテル、ポリオキシアルキレンポリスチリルフェニルエーテル縮合物、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル縮合物、ポリオキシアルキレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンスチリル化フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアリルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレン多環フェニルスルホサクシネートなどが挙げられる。
これらポリオキシアルキレン誘導体の市販品としては、ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルとしてペグノール００５（ＨＬＢ１４．６、東邦化学工業社製）；ニューコール６１０（ＨＬＢ１３．８）、ニューコール７１０（ＨＬＢ１３．６）、ニューコール７１０Ｆ（ＨＬＢ１３．５）、ニューコール７１４（ＨＬＢ１５．０）、ニューコール７１４Ｆ（ＨＬＢ１４．４）、ニューコール７４０（ＨＬＢ１７．９）、ニューコール２６００ＦＢ（ＨＬＢ１３．４）、ニューコール２６０８Ｆ（ＨＬＢ１３．０）、ニューコール２６０９（ＨＬＢ１３．０）（以上、日本乳化剤社製）；ポリオキシアルキレンポリスチリルフェニルエーテルとしてパイオニンＤ−６１１２Ｗ（ＨＬＢ１３．０）、パイオニンＤ−６１１５Ｘ（ＨＬＢ１４．５）、パイオニンＤ−６１１５Ｚ（ＨＬＢ１５．５）（以上、竹本油脂社製）；ポリオキシアルキレンフェニルフェノールエーテルとしてソルポールＴ−１５（ＨＬＢ１２．０）、ソルポールＴ−２０（ＨＬＢ１３．３）、ソルポールＴ−２６（ＨＬＢ１４．４）（以上、東邦化学工業社製）；ポリオキシアルキレンポリスチリルフェニルエーテル縮合物としてパイオニンＤ−６３２０（ＨＬＢ１３．０）（竹本油脂社製）；ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル縮合物としてパイオニンＤ−６４０（ＨＬＢ１４．３）（竹本油脂社製）、Ｒ−１０２０（ＨＬＢ１８．０）（日光ケミカルズ）；ポリオキシアルキレンジスチレン化フェニルエーテルとしてエマルゲンＡ−９０（ＨＬＢ１４．５）（花王社製）；ポリオキシアルキレンスチリル化フェニルエーテルとしてサンモール２ＳＰ−１８０（ＨＬＢ１４．５）（日華化学社製）；ＴＳＰ−１６（ＨＬＢ１２．７）（青木油脂社製）；ポリオキシアルキレンアリルフェニルエーテルとしてはニューカルゲンＦＳ−１２（ＨＬＢ１３）（竹本油脂社製）；ポリオキシアルキレン多環フェニルスルホサクシネートとしてエアロールＴ−１５００（東邦化学工業社製）などがある。
これらの多環型ポリオキシアルキレン誘導体は単独でも、混合しても、他の界面活性剤と組み合わせても用いることができる。また、本発明の多環型ポリオキシアルキレン誘導体は複数の多環型ポリオキシアルキレン誘導体の混合体であってもよい。例えばベンジル基を有するフェニルエーテルでは、モノベンジル、ジベンジル、トリベンジルの形態のものが単独でもあるいは混合していてもよい。またスチリル基を有するフェニルエーテルでは、モノスチリル、ジスチリル、トリスチリルの形態のものが単独でもあるいは混合していてもよい。各形態の混合比も特に制限はないが、モノ体が１〜２０％、ジ体が１０〜４０％、トリ体が４０〜９０％が好適であり、更にモノ体が２〜１５％、ジ体が１０〜４０％、トリ体が５０〜９０％が好適で、これらの混合物の市販品の例としてはペグノール００５（およその混合比の中心はモノ体が７％、ジ体が２０％、トリ体が７３％）がある。これらの各成分の使用量は化合物によってことなり、特に制限されるものではないが０．０００１質量％〜１０質量％（以下、単に％で示す）で、好ましくは０．００１％〜５％で使用される。また本発明の多環型ポリオキシアルキレン誘導体は少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程にあればよい。
本発明は特定リポ蛋白中の目的脂質を測定する方法及びその試薬であり、特定リポ蛋白にはＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン及びこれらの分解物が含まれる。また目的脂質にはコレステロール、中性脂肪、リン脂質が含まれる。従って測定対象としてはＨＤＬ中のコレステロール、ＬＤＬ中のコレステロール、ＶＬＤＬ中のコレステロール、ＩＤＬ中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール、これらの分解物中のコレステロール、ＨＤＬ中の中性脂肪、ＬＤＬ中の中性脂肪、ＶＬＤＬ中の中性脂肪、ＩＤＬ中の中性脂肪、カイロミクロン中の中性脂肪、これらの分解物中の中性脂肪、ＨＤＬ中のリン脂質、ＬＤＬ中のリン脂質、ＶＬＤＬ中のリン脂質、ＩＤＬ中のリン脂質、カイロミクロン中のリン脂質、これらの分解物中のリン脂質が挙げられる。これらの多くは動脈硬化性疾患との関連が深く分離定量する必要性が高い。
本発明の方法は目的脂質を測定する工程及び目的脂質測定の特異性を決定する工程を有するが、目的脂質測定の特異性を決定する工程は目的脂質を測定する工程と別個に行なわれても、同時に行なわれても良い。またこれらの工程は試薬等を段階に分けて用いることを示すものではなく、系中でこれらが進行すれば良い。目的脂質測定の特異性を決定する工程としては、特定リポ蛋白以外のリポ蛋白を前処理する工程、予め前処理された反応液中から目的リポ蛋白中の目的脂質を測定用酵素に反応させる工程等が挙げられる。また、目的脂質を測定する工程には、目的脂質測定用試薬が用いられ、当該試薬にはリポ蛋白から目的脂質を遊離させる酵素、例えばエステル分解酵素が含まれる。
検体としては、ヒトを含む動物、特に哺乳類の体液、体成分を用いることができるが、全血、血清、血漿、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、特に血清、血漿が好ましい。検体はそのままでも希釈してもよく、また分離のための装置で分離されたものでも、乾燥したものでも良い。
特定リポ蛋白以外のリポ蛋白とは、例えば目的脂質がＨＤＬ中の脂質の場合には、ＨＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、カイロミクロン及びこれらの分解物であり、目的リポ蛋白がＬＤＬの場合はＨＤＬ，ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、カイロミクロン及びこれらの分解物である。本発明の界面活性剤は、特定リポ蛋白に高い親和性を有する場合と反対に特定リポ蛋白に対して他のリポ蛋白より低い親和性を有する場合があり、目的脂質により使い分けることができる。
本発明において、目的脂質測定用試薬に用いられるエステル分解酵素は、リポ蛋白を構成する脂質測定に用いられる酵素で、例えばコレステロールエステラーゼ、リポ蛋白リパーゼ、リン脂質リパーゼなどエステル結合分解酵素ならばいずれでも差し支えない。これらは、微生物由来、動物由来、植物由来など、いずれでも、また遺伝子操作により作られたものでも良い。また化学修飾の有無も問わない。これらは溶液状でも乾燥状態でも、不溶性担体に保持或いは結合されていても良い。
これらの酵素は必要に応じて、目的脂質測定のために他の酵素、補酵素、発色剤を組み合わせて使用することができる。他の酵素としてはコレステロール脱水素酵素、コレステロール酸化酵素、グリセロールリン酸化酵素、グリセロールリン酸酸化酵素、グリセロールリン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、ピルビン酸リン酸化酵素、乳酸脱水素酵素、コリン酸化酵素、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、カタラーゼ、ジアホラーゼなどが用いられる。これらは、微生物由来、動物由来、植物由来など、いずれでも、また遺伝子操作により作られたものでも良い。また化学修飾の有無も問わない。これらは溶液状でも乾燥状態でも、不溶性担体に保持或いは結合されていても良い。補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型リン酸（ＮＡＤＰＨ）、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰなどが、発色剤としてはＰＯＤやジアホラーゼの作用で色素を形成するものならいずれでもよく、４−アミノアンチピリン、トリンダー色素類、ホルマザン色素類などが使用できる。これらの酵素は、単独で、或いは２種以上を組み合わせて用いる事ができ、またその使用量は酵素によって異なり、特に制限されるものではないが０．００１単位〜１０００単位／mLで、好ましくは０．１単位〜１０００単位／mLで使用される。本発明における２つの工程は、それぞれ個別に実施されても、同一試薬内で実施されてもよい。
本発明における酵素を含む試薬には、測定の特異性を損なわず酵素の作用を調整する目的で他の酵素や塩、pH調整のための緩衝剤、界面活性剤類、防腐剤、アルブミンなどの蛋白質類、抗生物質、サポニン、レクチン、ポリアニオン類（リンタングステン酸の塩、デキストラン硫酸、ポリビニル硫酸、硫酸化シクロデキストリンなど）、２価金属の塩、ポリエチレングリコール類、リン脂質など特定のリポ蛋白に親和性を有する試薬、防腐剤やカタラーゼ阻害剤としてアジ化物の塩も配合できる。このうち、ポリアニオン類又は２価金属の塩は、目的脂質測定試薬の反応を制御する成分であり、特定リポ蛋白に作用する界面活性剤である多環型ポリオキシアルキレン誘導体と併用してもよい。
緩衝剤としては、グッドの緩衝剤、リン酸、トリス、フタル酸、クエン酸塩をはじめ、一般にpH５〜９の範囲で使用できる緩衝液及びこの範囲で緩衝作用を有するものなら何れも使用できる。その使用量は、特に制限されるものではないが０．００５Ｍ〜２Ｍ、特に０．０１〜１Ｍが好ましい。本発明で用いる多環型ポリオキシアルキレン誘導体は、例えばその反応性が緩衝液に依存するものではない。反応温度は、前記２つの工程が同一でも異なっても良く、本発明の試薬が溶液状態である温度、例えば１０〜４０℃が好ましい。
多環型ポリオキシアルキレン誘導体と併せて使用する界面活性剤は、例えば多環型ポリオキシアルキレン誘導体により、既に目的以外のリポ蛋白中脂質が前処理された後に、目的脂質を測定するために使用されるもの、測定の特異性を損なわず酵素の作用を調整して目的脂質測定試薬の反応を制御するものなどである。これらは特異性を決定する工程で用いられる前記多環型ポリオキシアルキレン誘導体のような特異性は必要ない。これらの界面活性剤としては、アリール基を持たない界面活性剤、アリール基を１個しか持たない界面活性剤を使用できる。これらは非イオン性でもイオン性でもよく、非イオン性としてはアリール基を持たないポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、フェニル基１個を持つポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類が使用できる。ポリオキシエチレンアルキルエーテル類としてはエマルゲン７０９（花王社製）など、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としてはトリトンＸ１００（シグマ社製）など、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物類としてはプルロニックＦ−１０８（旭電化社製）などが用いられる。イオン性としては胆汁酸類が使用できる。これらの界面活性剤は０．０００１〜５％、特に０．００１〜５％となるように使用するのが好ましい。
これらの脂質測定用酵素試薬を添加した後、最終的に目的脂質を検出する方法は特に制限されず、例えばパーオキシダーゼやジアホラーゼと色原体を更に組み合わせて行う吸光度分析、補酵素や過酸化水素を直接検出する方法、金属等の酸化還元を測定する方法なども利用することができる。また本発明の試薬は、溶液状態だけでなく、乾燥状態、ゲル状態でも提供できる。各製剤は、ガラスビン、プラスチック容器ほか、様々な不溶性担体、例えばラテックス、ガラス、コロイドなど粒子・球状担体、半導体やガラスなど平板状、紙やニトロセルロースなど膜状担体、繊維状担体への塗布、含浸など様々な形態で提供できる。
本発明におけるＨＤＬ或いはＬＤＬコレステロール測定においては、多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下、例えばコレステロールオキシダーゼとコレステロールエステラーゼを反応させる。また、多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下でＨＤＬ或いはＬＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを前処理し、次工程で残っているＨＤＬ或いはＬＤＬにコレステロールオキシダーゼとコレステロールエステラーゼを反応させても良い。
またＨＤＬ或いはＬＤＬ中性脂肪測定においては第一工程で遊離グリセロールを前処理し、次工程でリポ蛋白リパーゼを作用させ、一般の中性脂肪測定試薬を反応させて測定する。このとき、多環型ポリオキシアルキレン誘導体は、第一工程に用いても第二工程に用いてもよい。好ましい態様としては、遊離のグリセロールが反応に関与しないように前処理する工程と特定のリポ蛋白にリポ蛋白リパーゼを作用させる工程からなる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定系において、多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下でリポ蛋白リパーゼと特定リポ蛋白の中性脂肪を反応させる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定方法；及び遊離のグリセロールが反応に関与しないように前処理する工程と特定のリポ蛋白にリポ蛋白リパーゼを作用させる工程からなる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定系において、ＨＬＢ１２〜１５の多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下で遊離のグリセロールと特定リポ蛋白以外の中性脂肪を前処理する特定リポ蛋白中の中性脂肪測定方法が挙げられる。なお、遊離グリセロールを前処理する工程は、検体中の遊離グリセロールを別途測定する場合や検体中のグリセロールが特定リポ蛋白中の中性脂肪に比べて無視できる場合、遊離グリセロールを前処理する工程或はその試薬類を省略しても差し支えない。
これらの基本的な工程は、血清中ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、中性脂肪などの測定法として既に一般化しているものである。
次に、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、実施例においては多環型ポリオキシアルキレン誘導体を本発明の界面活性剤ということがある。
実施例１（ＨＤＬコレステロールの測定）
本発明方法により、ＨＤＬコレステロールを日立７１７０形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のＨＤＬコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清１５例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清２．４μＬに、０．０１％ ４−アミノアンチピリン、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を含む試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分加温後、本発明の界面活性剤 １％、１単位／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ（オリエンタル酵母）、１単位／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（旭化成）、１単位／ｍＬ パーオキシダーゼ、０．０４％ Ｎ，Ｎ−ジスルホブチルメタトルイジン、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を含む試薬８０μＬを加え、３７℃で副波長７００ｎｍ／主波長６００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。市販のＨＤＬコレステロール測定試薬としては、コレステストＮ ＨＤＬ（第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定し、本発明の方法との相関係数を求めた。この結果を表１に示す。表１に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法の間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に代えフェニル基を１個有する界面活性剤（トリトンＸ１００）を用いて同様に測定した。
Figure 2009282044
実施例２（ＨＤＬコレステロールの測定）
本発明方法により、ＨＤＬコレステロールを日立７１７０形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のＨＤＬコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清１５例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清２．４μＬに、０．０１％ ４−アミノアンチピリン、４５μＭ ジギトニン（東京化成）、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を含む試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分加温後、本発明の界面活性剤１％、１単位／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ（オリエンタル酵母）、１単位／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（旭化成）、１単位／ｍＬ パーオキシダーゼ、０．０４重量％ Ｎ，Ｎ−ジスルホブチルメタトルイジン、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を含む試薬８０μＬを加え３７℃で副波長７００ｎｍ／主波長６００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。市販のＨＤＬコレステロール測定試薬としては、コレステストＮ ＨＤＬ（第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定し、本発明の方法との相関係数を求めた。この結果を表１に示す。表２に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法の間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に変えフェニル基を１個有する界面活性剤（トリトンＸ１００）を用いて同様に測定した。
Figure 2009282044
実施例３（ＨＤＬコレステロールの測定）
本発明方法により、ＨＤＬコレステロールを日立７１７０形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のＨＤＬコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清１５例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清２．４μＬに、０．０１％ ４−アミノアンチピリン、０．０４％ リンタングステン酸Ｎａ（キシダ）、０．２％ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を含む試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分加温後、本発明の界面活性剤１％、１単位／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ（オリエンタル酵母）、１単位／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（旭化成）、１単位／ｍＬ パーオキシダーゼ、０．０４重量％ Ｎ，Ｎ−ジスルホブチルメタトルイジン、１００ｍＭ
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を含む試薬８０μＬを加え、３７℃で副波長７００ｎｍ／主波長６００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。市販のＨＤＬコレステロール測定試薬としては、コレステストＮ ＨＤＬ（第一化学薬品社製）を使用して、添付の使用法に従って測定し本発明の方法との相関係数を求めた。この結果を表３に示す。表３に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法の間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に代えフェニル基を１個有する界面活性剤（トリトンＸ１００）を用いて同様に測定した。
Figure 2009282044
実施例４（ＬＤＬコレステロールの測定）
本発明方法により、ＬＤＬコレステロールを日立７１７０形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のＬＤＬコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清１５例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清２．４μＬに、１単位／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ（東洋紡）、１単位／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（旭化成）、１単位／ｍＬ パーオキシダーゼ、０．０２％ Ｎ，Ｎ−ジスルホブチルメタトルイジン、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、本発明の界面活性剤１％からなる第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で１０分加温後に、０．０２％ ４−アミノアンチピリン、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、１％ エマルゲン７０９を含む試薬８０μＬを加え３７℃で副波長６６０ｎｍ／主波長５４６ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。市販のＬＤＬコレステロール測定試薬としては、コレステストＬＤＬ（第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を表４に示す。表４に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法との間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に代えフェニル基を１個有する界面活性剤（トリトンＸ１００）を用いて同様に測定した。
Figure 2009282044
実施例５（ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールの測定）
本発明方法により、ＨＤＬコレステロールを日立７１７０形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のＨＤＬコレステロール測定試薬の測定値と比較した。試料として血清５０例を用いた。本発明の試薬は、血清２．４μＬに、１単位／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ（東洋紡）、１単位／ｍＬ パーオキシダーゼ、０．０２％ Ｎ，Ｎ−ジスルホブチルメタトルイジン、０．２ｍＭ フルフェナム酸（シグマ）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６）を含む試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分加温後、１単位／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（旭化成）、１％ ペグノール００５、０．０２％ ４−アミノアンチピリン、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６）を含む試薬８０μＬを加え３７℃で副波長７００ｎｍ／主波長６００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。市販のＨＤＬコレステロール測定試薬としては、コレステストＮ ＨＤＬ（第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を図１に示す。図１に示したように本発明の方法は、相関係数ｒ＝０．９９９と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。
次に、本発明方法により、ＬＤＬコレステロールを日立７１７０形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のＬＤＬコレステロール測定試薬の測定値と比較した。試料として血清５０例を用いた。本発明の試薬は、血清２．４μＬに、１単位／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ（旭化成）、１単位／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（旭化成）、１％ ペグノール００５（東邦化学工業）、１単位／ｍＬ パーオキシダーゼ、０．０１％ ４−アミノアンチピリン、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）からなる第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分加温後に、０．０４％ Ｎ，Ｎ−ジスルホブチルメタトルイジン、１％ エマルゲン７０９、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を含む試薬８０μＬを加え３７℃で副波長６６０ｎｍ／主波長５４６ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。市販のＬＤＬコレステロール測定試薬としては、コレステストＬＤＬ（第一化学薬品社製）を使用して、添付の使用法に従って測定した。この結果を図２に示す。図２に示したように本発明の方法は相関係数Ｒ＝０．９９９と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。
以上の結果は、本発明の界面活性剤が複数の特定リポ蛋白中の脂質測定に使用できる性質を有していることを示している。
実施例６（ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールの測定）
本発明方法により、ＨＤＬコレステロールを日立７１７０形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のＨＤＬコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清２０例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清２．４μＬに、０．０１％ ４−アミノアンチピリン、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を含む試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分加温後、１単位／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ（オリエンタル酵母）、１単位／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（旭化成）、１％ エマルゲンＡ９０、１単位／ｍＬ パーオキシダーゼ、０．０４％ Ｎ，Ｎ−ジスルホブチルメタトルイジン、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を含む試薬８０μＬを加え、３７℃で副波長７００ｎｍ／主波長６００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。市販のＨＤＬコレステロール測定試薬としては、コレステストＮ ＨＤＬ（第一化学薬品社製）を使用して、添付の使用法に従って測定した。この結果を図３に示す。図３に示したように本発明の方法は本発明の方法は相関係数ｒ＝０．９５２と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。
次に、本発明方法により、ＬＤＬコレステロールを日立７１７０形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のＬＤＬコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清２０例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清２．４μＬに、１単位／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ（東洋紡）、１単位／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（旭化成）、１単位／ｍＬ パーオキシダーゼ、０．０２％ Ｎ，Ｎ−ジスルホブチルメタトルイジン、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、１％ エマルゲンＡ９０からなる第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で１０分加温後に、０．０２％ ４−アミノアンチピリン、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、１％ エマルゲン７０９を含む試薬８０μＬを加え、３７℃で副波長６６０ｎｍ／主波長５４６ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。市販のＬＤＬコレステロール測定試薬としては、コレステストＬＤＬ（第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を図４に示す。図４に示したように本発明の方法は本発明の方法は相関係数ｒ＝０．９８７と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。
以上の結果は、本発明の界面活性剤が複数の特定脂質中の脂質測定に使用できる性質を有していることを示している。
実施例７（ＬＤＬコレステロールの測定）
各種緩衝液を用いて本発明方法のＬＤＬコレステロール試薬を調製し、その測定値を比較した。測定は日立７１７０形自動分析装置を用い、ヒト血清１５例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清２．４μＬに、１単位／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ（東洋紡）、１単位／ｍＬ コレステロールエステラーゼ（旭化成）、１単位／ｍＬ パーオキシダーゼ、０．０２％ Ｎ，Ｎ−ジスルホブチルメタトルイジン、１％ ペグノール００５を含む１００ｍＭ 各種緩衝液からなる第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分加温後に、０．０２％ ４−アミノアンチピリン、１％ エマルゲン７０９、１００ｍＭ 各種緩衝液を含む試薬８０μＬを加え、３７℃で副波長６６０ｎｍ／主波長５４６ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。市販のＬＤＬコレステロール測定試薬としては、コレステストＬＤＬ（第一化学薬品社製）を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を表５に示す。表５に示したように本発明の方法は緩衝液の種類によらず従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。
Figure 2009282044
実施例８（ＬＤＬ中性脂肪の測定）
血清を試料として超遠心分離法で各リポ蛋白画分に分離して、各分画中の総コレステロールを測定し図５にプロットした。また本発明方法により、同一の試料の中性脂肪を測定し図５にプロットした。測定は日立７１５０形自動分析装置を用いて行い、総コレステロール測定にはピュアオートＳ Ｔ-ＣＨＯ（第一化学薬品製）を用いた。本発明のＬＤＬ中性脂肪測定試薬は、血清３μＬに０．５単位／ｍＬ グリセロールキナーゼ（旭化成）、３単位／ｍＬ グリセロ３リン酸オキシダーゼ（東洋紡）、１．５単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（東洋紡）、１単位／ｍＬ ＬＰＬ（東洋紡）、１％ ペグノール００５（東邦化学工業）、３ｍＭ 塩化マグネシウム、０．５ｍＭ 塩化カルシウム、２．５ｍＭ ＡＴＰ、０．０２％ エチルスルホブチルメタトルイジン、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．３）からなる第一試薬３００μＬを加え、３７℃で５分加温後に、０．０１％ ４−アミノアンチピリン、１％ エマルゲン７０９、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．３）を含む試薬１００μＬを加え、３７℃で副波長７００ｎｍ／主波長５４６ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。図５に示したように本発明の方法はＬＤＬ中のＴＧを特異的に測定している。
実施例９（ＨＤＬ中性脂肪の測定）
血清を試料として超遠心分離法で各リポ蛋白画分に分離して、各分画中の総中性脂肪を測定し図６にプロットした。また本発明方法により、同一の試料の中性脂肪を測定し図６にプロットした。測定は日立７１７０形自動分析装置を用いて行い、総中性測定にはピュアオートＳ ＴＧ−Ｎ（第一化学薬品製）を用いた。本発明のＨＤＬ中性脂肪測定試薬は、血清２．８μＬに３単位／ｍＬ グリセロールキナーゼ（旭化成）、３単位／ｍＬ グリセロ３リン酸オキシダーゼ（東洋紡）、５００単位／ｍＬ カタラーゼ、３ｍＭ 塩化マグネシウム、３ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ エチルスルホブチルメタトルイジン、１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）からなる第一試薬２１０μＬを加え、３７℃で５分加温後に、５００単位／ｍＬ リパーゼ（旭化成）、１単位／ｍＬ モノグリセリドリパーゼ（旭化成）、１０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（東洋紡）、１．５％ ペグノール００５（東邦化学工業）、０．０４％ ４−アミノアンチピリン、１ｍＭ 塩化カルシウム、１００ｍＭＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）を含む試薬７０μＬを加え、３７℃で副波長７００ｎｍ／主波長５４６ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。図６に示したように本発明の方法はＨＤＬ中のＴＧを特異的に測定している。
実施例１０（界面活性剤のＨＬＢと相関係数の関係）
本発明の界面活性剤については、ＨＬＢ値は特に重要な意味を持たないが、好ましくは１２以上としている。図７は本発明の実施例１から実施例４に示した相関係数と本発明の界面活性剤のＨＬＢの関係を示したものである。図７は本発明の界面活性剤のＨＬＢ値と相関係数の関係に一定の傾向を認めないことを示している。
実施例１１（界面活性剤のアリール基数と相関係数の関係）
本発明の界面活性剤は、２個以上のアリール基を有することを特徴の１つとしている（表６）。図８は本発明の実施例１から実施例４に示した相関係数と本発明の界面活性剤のアリール基数の関係を示したものである。なお本発明の界面活性剤のうち縮合物系のものは除外している。図８は界面活性剤のアリール基数が２個以上の場合、１個の対照法より良好な相関係数が得られることを示している。なお本発明においてアリール基を数える際は、共通の構造的特徴であるベンゼン環を有するものの代表としてフェニル基の数として表している。
Figure 2009282044

Claims (8)

  1. ＬＤＬ以外に優先的に作用するＨＬＢ１５．１〜１８の非イオン性界面活性剤である多環型ポリオキシアルキレン誘導体を用いてＬＤＬコレステロール測定の特異性を決定する工程を有するものであるＬＤＬコレステロールの測定法。
  2. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が２個以上のアリール基を有する請求項１記載の測定法。
  3. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、フェニル基上にフェニル基、ナフチル基、アルキルフェニル基、フェニルアルキル基及びスチリル基から選ばれる１〜５個が置換した多環性基を有するポリオキシアルキレンエーテル系非イオン性界面活性剤である請求項１又は２記載の測定法。
  4. 目的脂質測定の特異性を決定する工程と目的脂質を測定する工程を有するものである請求項１〜３のいずれか１項記載の測定法。
  5. 目的脂質を測定する工程が、特定リポ蛋白に作用する界面活性剤と目的脂質測定試薬の反応を制御する成分の存在下に行なわれるものである請求項４記載の測定法。
  6. ＬＤＬ以外に優先的に作用するＨＬＢ１５．１〜１８の非イオン性界面活性剤である多環型ポリオキシアルキレン誘導体及び目的脂質測定試薬を含有することを特徴とするＬＤＬコレステロール測定試薬。
  7. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が２個以上のアリール基を有する請求項６記載の測定試薬。
  8. 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、フェニル基上にフェニル基、ナフチル基、アルキルフェニル基、フェニルアルキル基及びスチリル基から選ばれる１〜５個が置換した多環性基を有するポリオキシアルキレンエーテル系非イオン性界面活性剤である請求項６又は７記載の測定試薬。
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