JP2009240264A - 標的核酸の塩基配列の判定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ハイブリダイゼーション法を用いて標的核酸の塩基配列を判定する場合に、オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に関わらず、当該判定を正確かつ簡便に行うことができる方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る標的核酸の塩基配列の判定方法は、（ａ）担体に固定された２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを搭載した核酸アレイに、前記標的核酸を含む被験試料を接触させて、当該プローブと前記標的核酸とをハイブリダイズさせる工程、（ｂ）前記担体ごとに、該担体中における前記ハイブリダイズした標的核酸の分布量を検出する工程、及び（ｃ）前記検出により得られる結果に基づいて、前記標的核酸の塩基配列を判定する工程、を含むことを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸アレイを用いたハイブリダイゼーション法に基づく標的核酸の塩基配列の判定方法に関する。詳しくは、標的核酸の塩基配列が、核酸アレイに搭載されたいずれのオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に相補的なものであるかを特定する方法に関する。

近年、SNPs（一塩基多型）などの遺伝子型（すなわち遺伝子多型）と疾病等との因果関係に関する研究が数多く行われている。
SNPsなどの遺伝子多型を判定（検出）する方法としては、実際に塩基配列を読み取るシークエンス法、制限酵素による切断の有無を指標としたRFLP法、並びにポリメラーゼなどの酵素の特異性を利用した塩基伸長法及びPCR法などのほか、プローブハイブリダイゼーション法も挙げられる。
プローブハイブリダイゼーション法では、遺伝子多型の有無は、単に、塩基配列の違いによるプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの形成のしやすさを指標にして判定するため、酵素の特異性を利用した上述の方法に比較すると、正確性に劣るものである。そのため、SNPsなどの遺伝子多型を判定する目的で、プローブハイブリダイゼーション法を使用する場合は、正確性を向上させたり、正確性以外の性能を向上させる工夫がなされる場合が多い。

正確性以外の性能を向上させるために、例えば、プローブを担体に固定化することにより、複数の遺伝子多型を効率的に確認できるようにする手法が知られている。この場合、固定化されたプローブは、マイクロアレイとされていることがある。マイクロアレイを用いてSNPsなどの遺伝子多型を判定する場合は、一度に多くの多型部位について判定できるため、解析の効率が非常に高くなる。
また、マイクロ流路等を装置やアレイに組み込むことにより、ハイブリダイゼーションや洗浄の条件を厳密に制御することが可能になっている場合がある。
また、ハイブリダイゼーションやその後の洗浄方法に違いを設け、それぞれのプローブに対してより適した条件下でのデータを採用するといった方法もある（特許文献１）。
さらに、プローブを構成する塩基に関して、PNAやイノシンなど、通常とは異なった構造や特性のものを使用することにより、ハイブリダイゼーションを制御して遺伝子多型の判定精度を高める方法も考案されている（特許文献２）。

これらのうちのいくつかの技術を同時に用いることで、さらに正確性や効率性、操作性などの全体としての性能を向上させることができる場合もある。
ハイブリダイゼーション法によって、SNPsなどの遺伝子多型を含む塩基配列を判定する場合、ハイブリダイゼーションの形成量や、ハイブリダイゼーションの有無に基づいて行うことができる。この方法は、ハイブリダイゼーション効率に差が生じやすいプローブ間においては、明確に判断できる場合がある。
一方、プローブの設定条件によっては、異なるプローブ間でのハイブリダイゼーションの形成量が近接し、塩基配列を判定するための判断が困難となる場合がある。このような場合としては、例えば、約２０塩基からなるプローブと、解析対象となる標的核酸とがハイブリダイゼーションを形成する場合が考えやすい。ただ、この場合であっても、各プローブの中心付近の塩基に、検出すべき多型がある場合は、ハイブリダイゼーションの形成量を測定して比較することで、標的核酸の塩基配列中の多型を判定できる場合がある。

しかしながら、当該多型に相当する塩基がプローブの末端部分の塩基に存在する場合は、ハイブリダイゼーションの形成量に有意差が認められず、多型を判定することが極めて困難となる。また、このようなプローブを用いる場合は、例えハイブリダイゼーションや洗浄方法の厳密性を向上させたとしても、プローブ間でハイブリダイゼーション形成量に明確な差が生じない場合がある。
SNPsなどの遺伝子多型の有無の判定は、個人の遺伝子型に直結し、それが疾病との関連も指摘される場合があることから、実験動植物においても、ヒトにおいても、可能な限り正確に行われるべきである。しかしながら、ハイブリダイゼーション法を用いた場合、その判定基準としては、ハイブリダイズした標的核酸の量を測定した結果しか無く、前述の通り、標的核酸の塩基配列について正確な判定を行うことが困難な場合があった。

特開2007-174986号公報 特開平8-70900号公報

そこで、本発明が解決しようとする課題は、ハイブリダイゼーション法を用いて標的核酸の塩基配列を判定する場合、特に当該塩基配列中の遺伝子多型を検出する場合に、オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に関わらず（例えば、遺伝子多型に相当する塩基の位置が当該プローブの末端（又は末端付近）であるか否かに関わらず）、上記判定（又は検出）を正確かつ簡便に行うことができる方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。
その結果、ハイブリダイゼーション法を用いて標的核酸の塩基配列を判定する場合に、単に、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション形成量のみを基準として判定を行うのではなく、プローブを固定した各担体中におけるハイブリダイゼーション形成量の分布（例えば、担体の表面近傍と内部との分布量の比）を基準として判定を行うようにすれば、前述した課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の通りである。
標的核酸の塩基配列を判定する方法であって、
（ａ）担体に固定された２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを搭載した核酸アレイに、前記標的核酸を含む被験試料を接触させて、当該プローブと前記標的核酸とをハイブリダイズさせる工程、
（ｂ）前記担体ごとに、該担体中における前記ハイブリダイズした標的核酸の分布量を検出する工程、及び
（ｃ）前記検出により得られる結果に基づいて、前記標的核酸の塩基配列を判定する工程
を含む、前記方法。
本発明の方法としては、例えば、前記担体が立体的形状（例えば円柱状）を有するものであり、かつ、前記分布量の検出は当該担体の表面近傍と内部とについて行うものが挙げられる。

本発明の方法において、前記（ｃ）工程における判定としては、例えば、前記検出により得られる前記担体の表面近傍での前記分布量と前記担体の内部での前記分布量との比に基づいて行うものが挙げられる。また、前記（ｃ）工程における判定としては、例えば、前記標的核酸の塩基配列が、前記担体のうちのいずれの担体に固定されたプローブの塩基配列と相補的な塩基配列であるかを特定するものが挙げられる。
本発明の方法において、前記２種以上のオリゴヌクレオチドプローブ間で互いに異なる塩基配列としては、例えば、前記標的核酸の塩基配列中の遺伝子多型部位に相当するものが挙げられる。ここで、遺伝子多型としては、例えば、一塩基多型（SNPs）、インサーション型多型、デリーション型多型及び塩基繰り返し多型からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。本発明の方法は、例えば、前記標的核酸の塩基配列中の遺伝子多型を検出するための方法であってもよい。

本発明によれば、ハイブリダイゼーション法を用いて標的核酸の塩基配列を判定する場合、特に当該塩基配列中の遺伝子多型を検出する場合に、例えば、遺伝子多型に相当する塩基の位置が当該プローブの末端であるか否かなど、使用するオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に関わらず、上記判定（又は検出）を正確かつ簡便に行うことができる。
すなわち、本発明を利用することにより、ハイブリダイゼーションの形成量のみに基づく判定に比較して、より正確に標的核酸の塩基配列を判定することが可能となる。併せて、従来では判定することが困難であった、各プローブの末端塩基に差異がある（例えば多型に相当する塩基がある）場合に関しても、標的核酸の塩基配列を極めて正確に判定することが可能となる。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。

本発明の標的核酸の塩基配列を判定する方法は、前述した通り、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことを特徴とする方法である。
（ａ）担体に固定された２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを搭載した核酸アレイに、前記標的核酸を含む被験試料を接触させて、当該プローブと前記標的核酸とをハイブリダイズさせる工程（以下、ハイブリダイゼーション工程という）。
（ｂ）前記担体の種類ごとに、該担体中における前記ハイブリダイズした標的核酸の分布量を検出する工程（以下、検出工程という）。
（ｃ）前記検出により得られる結果に基づいて、前記標的核酸の塩基配列を判定する工程（以下、判定工程という）。
以下に、本発明の判定方法の各工程、及び用途について、具体的に説明する。

１．ハイブリダイゼーション工程
ハイブリダイゼーション工程は、前述の通り、担体に固定された２種以上のオリゴヌクレオチドプローブ（キャプチャープローブ）を搭載した核酸アレイに、標的核酸を含む被験試料を接触させて、当該プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせる工程である。
本発明の方法に用いる被験試料は、標的核酸を含むものであり、当該標的核酸は、塩基配列の判定（解析）を目的として、後述するオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション反応に供される核酸である。標的核酸は、DNAやRNA等の核酸の種類及び由来は特に限定されず、例えば、PCR、逆転写反応、転写反応などを利用して調製したものであってもよい。標的核酸は、ハイブリダイゼーション反応後にプローブとの結合量（ハイブリダイズした量）がシグナルとして検出できるように、適当な標識物質を直接的又は間接的に付加して標識化したものであることが好ましい。シグナルとしては、例えば、蛍光、発光、ラジオアイソトープ及び発色等が挙げられ、検出の簡便性等から蛍光であることが好ましい。シグナルが蛍光である場合、標識物質となる蛍光物質としては、各種レポーター色素、例えばCy5、Cy3、VIC、FAM、HEX、TET、フルオレセイン、FITC、TAMRA、Texas red、Yakima Yellow、ULYSIS、ARES等を使用することができる。

標的核酸を含む被験試料は、通常、標的核酸溶液、すなわちハイブリダイゼーション溶液として調製されて使用される。ハイブリダイゼーション溶液は、SDSやSSC等の緩衝液を用いて、常法に従い、適宜調製することができる。
本発明の方法に用いる核酸アレイは、２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを搭載したものである。
オリゴヌクレオチドプローブとは、標的核酸とのハイブリダイゼーションに供される核酸をいい、その種類はDNA、RNA、PNA又はこれらの混合物であってもよく、特に限定はされない。当該プローブは、ハイブリダイゼーション反応を阻害しない範囲内において、化学的な修飾がなされているものであってもよい。

当該プローブの長さ（塩基長）は、限定はされないが、標的核酸の塩基配列（特に他の標的核酸との塩基配列の差異）を効果的に判定するという観点から、例えば100塩基以下であることが好ましく、より好ましくは10塩基〜100塩基、さらに好ましくは10塩基〜30塩基である。なお、上記塩基配列の差異としては、例えば、SNPs等の多型、点変異及びこれらの組み合わせ等が挙げられ、当該プローブを作製する段階においてその差異のバリエーションが明らかにされていることがプローブの設計上望ましい。当該プローブ中、判定対象となる標的核酸の塩基配列の差異に対応する箇所は、限定はされず、複数であってもよいが、判定の効率化及び容易さの点で、１か所であることが好ましい。また、当該箇所の塩基数は、プローブの全塩基長の１割以下であることが好ましい。

前記２種以上のオリゴヌクレオチドプローブとは、当該プローブ間で互いに異なる塩基配列部分を有するものであり、当該塩基配列は、例えば、標的核酸の塩基配列中の遺伝子多型部位に相当するものであることが好ましい。遺伝子多型としては、限定はされないが、例えば、一塩基多型（SNPs）、インサーション型多型、デリーション型多型及び塩基繰り返し多型が挙げられる。例えば、SNPsの種類が４種類（A,T,G,C）ある場合、それぞれに対応した４種類のプローブを設計して使用することが好ましく、この場合、各プローブは、多型部位に相当する差異のある塩基以外は、鎖長（塩基長）も含めてすべて同一であることが好ましい。なお、１つのプローブ内に、例えば、SNPsに相当する塩基が複数箇所存在する場合は、それに合わせた数だけのSNPsを網羅したプローブを設計することが望ましい。具体的には、例えば、４種類のSNPs ２か所を、同一のプローブ設計位置で確認する場合、作製するプローブは、4×4で表わされる16種類をすべて用意することが望ましい。

本発明において、上述した２種以上の各々のオリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ別の担体に固定された状態で核酸アレイに搭載される。具体的には、核酸アレイにおいて、各々のオリゴヌクレオチドプローブが混在しないようにすると、ハイブリダイゼーション反応やその後の洗浄等の実験操作が非常に簡便になるため、当該プローブは、予め所望の任意の官能基で修飾しておき、それぞれ別の担体に共有結合で固定することが好ましい。
担体は、立体的形状を有するもの、すなわち立体的にプローブを固定化できる形状のものが好ましい。当該立体的形状（特にプローブを固定化している担体領域の形状）としては、限定はされないが、例えば円柱状が好ましく、さらに当該円柱状の担体の側面にはハイブリダイゼーション反応時に標的核酸（溶液）が接触しない構造となっていることが好ましい。立体的形状を有する担体にプローブを固定化する場合、担体は、その表面付近だけでなく、その内部に固定化されたプローブにハイブリダイズした標的核酸の発するシグナルも検出することができる材料で作製されることが好ましい。また担体は、標的核酸が担体内部まで到達できるような構造及び材料からなるものであることが好ましく、例えば、そのような材料としては、多孔質の樹脂やゲルが挙げられる。ゲルの種類としては、標的核酸のシグナル強度を検出するに際して、標的核酸の担体内部での分布様式を確認できるものであればよく、限定はされないが、例えばアガロースゲルやアクリルアミドゲル等が好ましく、加熱によって溶解しにくいアクリルアミドゲルがより好ましい。

上述したような、本発明の方法に用いる核酸アレイの具体例としては、繊維型マイクロアレイ（製品名：ジェノパール^TM；掲載ウェブサイト：http://www.mrc.co.jp/genome/top.html；特許第3488456号公報、特許第3510882号公報等参照）が特に好ましい。繊維型マイクロアレイは、中空繊維等の管状体の中空部内にゲル状物を保持させたものを、プローブを固定するための担体として用いたものであり、所定のプローブをその種類毎に別々の中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるマイクロアレイである。この繊維型マイクロアレイは、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのものと説明することもできる。

以下、繊維型マイクロアレイに関して詳細に説明する。このマイクロアレイは、例えば、下記(i)〜(iv)の工程を経て作製することができる。
(i) 複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列して配列体を製造する工程
(ii) 前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
(iii) オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
(iv) 中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程

中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開2004-163211号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように３次元に配列される（工程(i)）。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平11-108928号公報参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開2001-133453号公報参照）などが挙げられる。

製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程(ii)）。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂及びエポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法のほか、繊維どうしを熱融着により接着する方法等が好ましく挙げられる。
包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液（ゲル形成溶液）を充填し、中空部内で重合反応を行う（工程(iii)）。これにより、各中空繊維の中空部に、プローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。
ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合、溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。

中空繊維内にプローブを固定した後、中空繊維の長手方向と交差する方向（好ましくは直交する方向）で、ブロック体を切断して薄片化する（工程(iv)）。このようにして得られた薄片がDNAマイクロアレイとして使用できる。当該アレイの厚みは、0.01〜1mm程度であることが好ましい。ブロック体の切断は、例えば、ミクロトーム及びレーザー等により行うことができる。
標的核酸を含むハイブリダイゼーション溶液と核酸アレイとの接触、すなわち標的核酸とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション反応は、当該標的核酸とプローブとで実質的に２本鎖を形成させるのに適切な条件下にて、上述した核酸アレイに標的核酸を含む被験試料を接触させて行う。ハイブリダイゼーション反応に適切な条件は、プローブの塩基長やＧＣ含量によって異なるが、公知のＴｍ計算式を参考にし、当業者であれば独自に設定することは通常容易である。具体的には、ハイブリダイゼーション溶液中の標的核酸が核酸アレイに搭載されたプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、pH及び温度等）を適宜設定して行うことができる。ハイブリダイゼーション反応後は、ハイブリダイズに供した標的核酸のうち、余剰の標的核酸を洗浄することが好ましい。なお、上述した「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション反応後の核酸アレイの洗浄条件を意味し、当該洗浄条件は、当業者であれば公知のＴｍ計算式を参考にして独自に設定することが容易であるが、例えば、塩（ナトリウム）濃度が48〜780mM、温度が37〜80℃である条件が好ましく、塩濃度が97.5〜390mM、温度が50〜75℃である条件がより好ましい。

２．検出工程
検出工程は、核酸アレイの洗浄後、前述の通り、各担体ごとに、該担体中におけるハイブリダイズした標的核酸の分布量を検出する工程である。
各担体に固定されたプローブにハイブリダイズした標的核酸の量の検出は、当該標的核酸に由来するシグナル強度を画像化及び／又は数値化することで行うことができる。標的核酸由来のシグナルが蛍光である場合は、検出する蛍光の波長に合わせた励起光源、フィルターセット、CCDカメラ、及び必要に応じて顕微鏡などを組み合わせて行う。担体が立体的形状（例えば円柱状）を有するものである場合は、該担体中における標的核酸が発するシグナルを簡便に且つ立体的にとらえるために、所定の励起光源やフィルターセットを用いた共焦点の顕微鏡を使用することが望ましい。なお、シグナル強度は、シグナルを発する物質の量に対応するため、シグナル強度の強弱は、ハイブリダイズした標的核酸の量の多少を示すものである。

本発明の方法において、当該検出工程は、立体的形状（例えば円柱状）を有する担体の表面近傍と内部とについて、ハイブリダイズした標的核酸の量（分布量）を検出することが好ましい。ここで、担体の表面近傍とは、構造が均一である担体において、標的核酸溶液と担体との接触する境界から、その担体の中心を通った反対方向の同境界に達するまでの長さの３分の１以内の担体の部分を意味し、担体の内部とは、担体中の上記表面近傍と定義される部分を除く残りの部分を意味する。例えば、担体が円柱状のものである場合、当該円柱の断面（円形断面）に相当する上下の２つの面からそれぞれ所定の距離（すなわち上面下面間の距離の３分の１）の範囲内の部分が、当該担体の表面近傍となり、それ以外の部分、すなわち上下の２つの面からそれぞれ上記所定の距離を越える範囲内の部分が、当該担体の内部となる。従って、当該担体の内部とは、当該担体の中心部分（重心部分）及びその近傍と言うことができる。なお、担体表面近傍及び担体内部におけるシグナル強度の検出は、それぞれ、任意の一部分を対象にして行ってもよいし、領域全体を対象にして行ってもよく、限定はされない。また、同種のプローブを用いて複数の担体でハイブリダイゼーション反応を行った場合は、担体表面近傍及び担体内部において検出されるシグナル強度としては、複数の検出値の平均値を採用してもよいし、最大値又は最小値を採用してもよく、限定はされない。

各種核酸アレイを用いた従来の検出方法において、ハイブリダイズした標的核酸のシグナルは、各担体それぞれについて、担体全体からの１つの平均的な値が検出されるものであった。これに対し、本発明の方法は、担体の所定の部分ごとにシグナルを検出し（すなわち１つの担体から複数の値を検出し）、それらを総合的に解析することで、従来法では判定が困難であった標的核酸中の塩基の種類を判定可能とするものであるため、極めて顕著な効果を有するものである。

３．判定工程
判定工程は、前述の通り、前記検出工程により得られた結果に基づいて、前記標的核酸の塩基配列を判定する工程である。
標的核酸を構成する塩基配列を判定するとは、染色体DNA中のある一定の塩基配列中に個体や生物種による塩基配列のバリエーションがあることが既知であるものの、調査対象となる個体もしくは生物種等においてそのバリエーションが不明である場合に、それを明らかにすることである。塩基配列のバリエーションとは、主にSNPs等の遺伝子多型や点変異と呼ばれるものであるが、１種類のプローブ内に、判定対象となる塩基に相当する塩基の個数は、複数あってもよい。

本発明の方法における判定工程では、具体的には、前記検出工程により得られた担体表面近傍での標的核酸の分布量と担体内部での標的核酸の分布量との比に基づいて、標的核酸中の特定の塩基配列のバリエーション（SNPs等）の判定が行われる。すなわち、当該バリエーションを検出するための複数種のプローブをそれぞれ固定した担体どうしで、担体表面近傍及び担体内部での標的核酸由来のシグナル強度の値の比（具体的には、「担体表面近傍のシグナル強度の値／担体内部のシグナル強度の値」）を比較する。そして、その比の値が最も大きかった担体に固定していたプローブの相補塩基配列を、標的核酸中の判定対象としていた塩基配列として判定することである。よって、判定工程では、標的核酸の塩基配列（特に標的核酸中の判定対象となる塩基配列）が、いずれの担体に固定されたプローブの塩基配列と相補的な塩基配列であるかを特定することができる。

また、本発明の判定工程では、上述のようにシグナル強度の値の比を具体的に数値化して判定しなかったとしても、各担体の検出画像の相対比較によって、定性的に標的核酸の塩基配列を判定することも可能である。この場合、標的核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを含む担体においては、ハイブリダイズした標的核酸の分布様式が、担体内部のシグナル強度に比べ担体表面近傍のシグナル強度が相対的に大きくなるため判断が可能である。ここで、標的核酸の分布様式とは、１種類のプローブが固定化された担体領域中の異なる位置（担体表面近傍及び担体内部）における、標的核酸由来のシグナル強度の違いやその斑の特徴のことをいう。

本発明の判定方法は、使用するオリゴヌクレオチドプローブが、標的核酸中の判定対象となる塩基配列に対応する塩基配列が当該プローブの末端又は末端付近になるように設計されている場合において、特に有用である。従来の方法では、プローブがこのように設計されている場合、単に担体全体からのシグナル強度を検出するのみでは、対象の塩基配列の判定が極めて困難であったが、本発明の方法を用いれば、担体各部のシグナル強度を検出して総合的に判断することで、対象の塩基配列の判定を容易に行うことができる。

以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜標的核酸の調製＞
標的核酸として、表１に示す配列のオリゴヌクレオチドを合成した。
得られたオリゴヌクレオチド2μgを用い、ULYSIS Alexa Fluor 546（インビトロジェン社製）を用いて蛍光標識した。標識に際しては、オリゴヌクレオチド 2μgをキットに添付のラベリングバッファー 20μlに溶解し、その後、5μlのULYSIS Alexa Fluor 546のDMF溶解物を添加し、よく攪拌した後に85℃で30分間過熱することにより行った。標識後のオリゴヌクレオチドはMicroSpin G-25 Columns（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。精製後の蛍光標識済みオリゴヌクレオチドの濃度を測定し、水を加えて1ng/μlに調製した。

表２に示す液組成で、ハイブリダイゼーション溶液を150μl（×５サンプル）調製した。

＜オリゴヌクレオチドプローブの合成＞
表３に示す配列のオリゴヌクレオチドを、下記の方法に従ってプローブ（キャプチャープローブ）として合成した。
まず、プローブとなるオリゴヌクレオチドをDNA自動合成装置により合成した。合成の際、最終段階で、アミノリンクTM（PEバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された5'-O-アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、当該オリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、5'末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製した。

＜核酸アレイの製造＞
図１に示す配列固定器具を利用して、中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
まず、直径0.32mmの孔が、孔の中心間距離を0.42mmとして、縦12列、横19列で合計228個設けられた厚さ0.1mmの多孔板（２１）を2枚準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（３１）（三菱エンジニアリングプラスチック社製、カーボンブラック 1質量%添加）を１本ずつ、通過させた。
各繊維に0.1Nの張力をＸ軸方向にかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から20mmの位置と100mmの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を80mmとした。

次いで、多孔板間の空間の周囲３面を、板状物（４１）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。25℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで、多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
次に、表４に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を、核酸アレイに搭載するプローブの種類ごとにそれぞれ調製した。

次に、図２に示したプローブ配置になるように、中空繊維束の対応する中空繊維の中空部に上記で作製した各核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を充填するために、該重合性溶液の入った容器及び上記で作製した中空繊維束をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の各糸の封止されていない端部を所定の前記重合性溶液の入った容器に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を70℃とし、3時間かけて重合反応を行った。
このようにしてプローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
次に、得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ0.25mmの薄片シート（核酸アレイ）を50枚得た。

＜ハイブリダイゼーション反応＞
得られた核酸アレイのうち５枚を、それぞれ独立の５個のプラスチック容器中に封入し、次に標的核酸を含む前記ハイブリダイゼーション溶液を各プラスチック容器に入れて、核酸アレイと標的核酸とを接触させた。
プラスチック容器をプラスチック製の蓋で密封し、それぞれ、35℃、40℃、45℃、50℃、65℃の温度条件下にて、ハイブリダイゼーションを形成させた。
ハイブリダイゼーション反応の終了後、それぞれの核酸アレイは、独立に以下の条件で洗浄を行った。まず、0.12M Tris-HCl、0.12M NaCl、0.05% Tween20からなる洗浄液10ml中に核酸アレイを浸漬した。浸漬中、それぞれの核酸アレイは、ハイブリダイゼーション反応時と同一の温度で20分間維持した。その後、同一の操作を繰り返し、次に0.12M Tris-HCl、0.12M NaClからなる洗浄液10ml中に核酸アレイを浸漬した。浸漬中、それぞれの核酸アレイは、ハイブリダイゼーション反応時と同一の温度で10分間維持し、洗浄を終了した。

＜標的核酸のシグナル検出、及び塩基配列の判定＞
検出操作は、冷却CCDカメラ方式の核酸アレイ自動検出装置（三菱レイヨン社製）を用いて、アレイを0.12M Tris-HCl、0.12M NaCl中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。
プローブ番号１及び５のプローブは、標的核酸の塩基配列と完全な相補鎖である。プローブ番号２、３、４のプローブは、標的核酸の塩基配列と末端一塩基が非相補の配列である。プローブ番号６、７、８のプローブは、標的核酸の塩基配列と非末端（プローブの中央部分）の一塩基が非相補の配列である。
検出されたシグナル強度を、図３及び図４に示した。シグナル強度は、各核酸アレイに搭載されている同一プローブが固定された4つの担体での平均値を示す。

図４に示すように、プローブ番号５に比較して、中央部分に非相補塩基を有するプローブ番号６、７、８が固定された担体でのシグナル強度は若干低く、洗浄温度を上げて、ハイブリダイゼーションを形成させにくくした条件では、シグナル強度のみで、一塩基の違いを検出することが可能であった。一方、図３に示すように、プローブ番号１に比較して、末端部分に非相補塩基を有するプローブ番号２、３、４が固定された担体でのシグナル強度は、プローブ番号１のそれとほぼ同等であり、洗浄温度を上げた場合においても、全体としてのシグナル強度が低下するのみで、その差が明確になることは無かった。すなわち、末端一塩基の違いに関しては、ハイブリダイゼーションのシグナル強度のみでその差を検出することは困難であった。

次に、共焦点顕微鏡を用いて、50℃の温度条件下でのハイブリダイゼーション時における、プローブ番号１、２、３、４が固定された担体での検出画像を、図５及び図６に示した。図５は、プローブが固定された担体を真上から見た際のシグナル強度の画像であり、図６は、図５に示した画像中における白線部分において、プローブが固定された担体を横から見た際のシグナル強度の分布となる。図３や図５に示すように、平均のシグナル強度は、プローブ番号１、２、３、４が固定された担体のいずれにおいてもほとんど差が無い。ところが、図６に示すように、各担体中におけるシグナル強度の分布（すなわちハイブリダイズした標的核酸の分布量）は、プローブ番号１が固定された担体と、末端一塩基が非相補のプローブ番号２、３、４が固定された担体とで大きく異なることが分かった。すなわち、担体表面近傍でのシグナル強度は、プローブ番号１が固定された担体において相対的に高く、担体内部でのシグナル強度は、末端一塩基が非相補のプローブ番号２、３、４が固定された担体において相対的に高いことが分かった。

図７は、図６に示した画像に基づき、縦方向におけるシグナル強度の分布を示したグラフである。図７からも分かるように、担体の表面近傍にシグナル強度の極大値があり、極大値に挟まれた担体内部に極小値があることが認められた。そして、プローブ番号１が固定された担体においては、他のプローブが固定された担体に比較して、当該極大値が大きく、当該極小値が小さいことが分かった。従って、２つの極大値のうちの大きい方と極小値との比を算出し、その比の値の最も大きいものが、標的核酸と相補的な塩基配列を有するものと判断できると考えられた。なお、ここで言う極大値と極小値との比は、「極大値／極小値」の値として算出した。
プローブ番号１、２、３、４が固定された各担体における、シグナル強度分布の極大値及び極小値の値、並びに極大値と極小値との比の値を、表５に示した。

プローブ番号１が固定された担体においては、他のプローブが固定された担体に比較して、担体表面近傍におけるシグナル強度と担体内部におけるシグナル強度との比の値が明らかに大きいことが分かった。すなわち、プローブ番号１〜４のうち、プローブ番号１の塩基配列が標的核酸に相補的な塩基配列であることを、明確に判定することができた。
本発明の判定方法を用いることにより、平均のシグナル強度だけでは判別が困難な、末端一塩基が非相補のプローブを用いた場合についても、標的核酸の塩基配列を明確に判定することが可能となった。

中空繊維束（中空繊維配列体）の製造用の配列固定治具を示す概略図である。 核酸アレイのデザインを示す図である。各数値は、表３中に示すプローブの配列番号に対応する。 各プローブ（プローブ番号１〜４）にハイブリダイズした標的核酸のシグナル強度（平均値）の検出結果を示すグラフである。縦軸はシグナル強度を示す。 各プローブ（プローブ番号５〜８）にハイブリダイズした標的核酸のシグナル強度（平均値）の検出結果を示すグラフである。縦軸はシグナル強度を示す。 図５は、各プローブ（プローブ番号１〜４）が固定された担体を真上から見た際のシグナル強度を示す画像の写真である。 図５に示した画像中における白線部分において、各プローブ（プローブ番号１〜４）が固定された担体を横から見た際のシグナル強度の分布を示す画像の写真である。 図６に示した画像に基づき、各プローブ（プローブ番号１〜４）が固定された担体の縦方向におけるシグナル強度の分布を示したグラフである。縦軸はシグナル強度を示す。

符号の説明

１１ 孔
２１ 多孔板
３１ 中空繊維
４１ 板状物

配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA

Claims (8)

1. 標的核酸の塩基配列を判定する方法であって、
   （ａ）担体に固定された２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを搭載した核酸アレイに、前記標的核酸を含む被験試料を接触させて、当該プローブと前記標的核酸とをハイブリダイズさせる工程、
   （ｂ）前記担体ごとに、該担体中における前記ハイブリダイズした標的核酸の分布量を検出する工程、及び
   （ｃ）前記検出により得られる結果に基づいて、前記標的核酸の塩基配列を判定する工程
   を含む、前記方法。
2. 前記担体が立体的形状を有するものであり、かつ、前記分布量の検出は当該担体の表面近傍と内部とについて行うものである、請求項１記載の方法。
3. 前記立体的形状が円柱状である、請求項２記載の方法。
4. 前記（ｃ）工程における判定は、前記検出により得られる前記担体の表面近傍での前記分布量と前記担体の内部での前記分布量との比に基づいて行うものである、請求項記２又は３記載の方法。
5. 前記（ｃ）工程における判定は、前記標的核酸の塩基配列が、前記担体のうちのいずれの担体に固定されたプローブの塩基配列と相補的な塩基配列であるかを特定するものである、請求項記１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記２種以上のオリゴヌクレオチドプローブ間で互いに異なる塩基配列が、前記標的核酸の塩基配列中の遺伝子多型部位に相当するものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記標的核酸の塩基配列中の遺伝子多型を検出するための方法である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記遺伝子多型が、一塩基多型、インサーション型多型、デリーション型多型及び塩基繰り返し多型からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６又は７記載の方法。