JP2009190994A - Anti-influenza virus agent and method for producing active ingredient thereof - Google Patents
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Abstract
【課題】優れた抗インフルエンザウイルス活性を有し、かつ、実用化の可能性の高い、新たな抗インフルエンザウイルス剤、及び、前記抗インフルエンザウイルス剤の有効成分の製造方法を提供すること。
【解決手段】哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分を有効成分として含有する抗インフルエンザウイルス剤、及び、哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料をクロロホルム／メタノール混合溶液で抽出することにより得られたオリゴ糖画分を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画してタンパク質画分を得る工程を少なくとも含む抗インフルエンザウイルス活性を有する哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分の製造方法である。
【選択図】なし[PROBLEMS] To provide a novel anti-influenza virus agent having excellent anti-influenza virus activity and high possibility of practical use, and a method for producing an active ingredient of the anti-influenza virus agent.
An anti-influenza virus agent containing a protein fraction derived from mammalian colostrum as an active ingredient and a mammalian colostrum or a raw material derived from mammalian colostrum are extracted with a chloroform / methanol mixed solution. Is a method for producing a protein fraction derived from colostrum of mammals having anti-influenza virus activity, comprising at least a step of obtaining a protein fraction by fractionating the oligosaccharide fraction obtained by gel filtration chromatography .
[Selection figure] None
Description
本発明は、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有する抗インフルエンザウイルス剤、及び、その有効成分の製造方法に関する。 The present invention relates to an anti-influenza virus agent having excellent anti-influenza virus activity and a method for producing an active ingredient thereof.
現在、インフルエンザの予防又は治療方法としては、ワクチンの予防接種や、インフルエンザ薬として使用認可されているアマンタジン塩酸塩（商品名：シンメトレル、ノバルティスファーマ株式会社）、オセルタミビル（商品名：タミフル、中外製薬株式会社）及びザナミビル（商品名：リレンザ、グラクソ・スミスクライン株式会社）の投与が主である。しかしながら、これらの予防又は治療方法には、それぞれ一長一短があることが知られている。例えば、ワクチンは、ワクチンの接種により産生されたＩｇＡが、呼吸器系の粘液中に分泌されることにより、ウイルスの細胞への付着を防ぐことができるが、タイプの異なる新型ウイルスに対しては無力であることが知られている。さらに、強毒株と呼ばれるインフルエンザウイルスは、培養中に鶏卵内の細胞を死滅させるため、ワクチンの作製も困難である。また、アマンタジン塩酸塩（シンメトレル）は、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質のイオンチャンネル作用を阻害し、標的細胞に侵入した後のインフルエンザウイルスの脱殻を抑制することができるが、Ｍ２タンパク質の無いＢ型、Ｃ型ウイルスに対する効果はなく、強い副作用や耐性菌の発現が問題とされている。また、オセルタミビル（タミフル）、ザナミビル（リレンザ）は、インフルエンザウイルスのエンベロープに存在するスパイクタンパク質の１つであるノイラミニダーゼ（ＮＡ）の作用を阻害し、複製されたインフルエンザウイルスが感染した標的細胞から遊離して他の細胞に感染を広げることを抑制することができるが、その効果の発現のためには、感染初期の服用が必須とされ、また、近年、若年者に対する副作用が問題となっている。 Currently, influenza prevention and treatment methods include vaccine vaccination and amantadine hydrochloride (trade name: Symmetrel, Novartis Pharma Co., Ltd.) and oseltamivir (trade name: Tamiflu, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) that are approved for use as influenza drugs. Company) and Zanamivir (trade name: Relenza, GlaxoSmithKline Co., Ltd.). However, it is known that each of these prevention or treatment methods has advantages and disadvantages. For example, vaccines can prevent viral attachment to cells by secreting IgA produced by vaccination into the mucus of the respiratory system, but against different types of new viruses It is known to be powerless. Furthermore, since influenza viruses called virulent strains kill cells in chicken eggs during culture, it is difficult to produce vaccines. Amantadine hydrochloride (Symmetrel) inhibits the ionic channel action of the influenza virus M2 protein and can suppress the unshelling of the influenza virus after entering the target cell. There is no effect on type viruses, and strong side effects and the expression of resistant bacteria are problematic. In addition, oseltamivir (Tamiflu) and zanamivir (Relenza) inhibit the action of neuraminidase (NA), one of the spike proteins present in the envelope of influenza virus, so that the replicated influenza virus is released from the infected target cells. Although it is possible to suppress the spread of infection to other cells, it is essential to take the initial stage of infection for the manifestation of the effect, and in recent years, side effects on young people have become a problem.
前記したような従来のワクチンやインフルエンザ薬の問題点を克服するため、新たなインフルエンザの予防又は治療方法の研究開発が広く行われており、例えば、インフルエンザウイルス受容体の被認識部位を含む糖鎖を持つスフィンゴ糖脂質（例えばガングリオシド類）を有効成分とした、抗インフルエンザウイルス剤などが報告されている（特許文献１参照）。しかしながら、前記特許文献１に開示された抗インフルエンザウイルス剤は未だ実用化には至っておらず、また、前記特許文献１で抗インフルエンザウイルス剤の有効成分として開示されているガングリオシド類は、ミンククジラの脳やヒト赤血球といった原料から抽出されたものであり、インフルエンザ薬としての実用化には有効成分の大量調製が望まれる点を鑑みると、やや困難があるものと考えられる。 In order to overcome the problems of conventional vaccines and influenza drugs as described above, research and development of new influenza prevention or treatment methods have been widely conducted. For example, a sugar chain containing a recognized site of an influenza virus receptor An anti-influenza virus agent containing a glycosphingolipid (eg, ganglioside) having an active ingredient as an active ingredient has been reported (see Patent Document 1). However, the anti-influenza virus agent disclosed in Patent Document 1 has not yet been put into practical use, and gangliosides disclosed as an active ingredient of the anti-influenza virus agent in Patent Document 1 are those of minke whales. It is extracted from raw materials such as brain and human erythrocytes, and is considered to be somewhat difficult in view of the point that a large amount of active ingredient is desired for practical use as an influenza drug.
インフルエンザの流行は大きな問題であり、現在使用されているアマンタジン塩酸塩（シンメトレル）、オセルタミビル（タミフル）及びザナミビル（リレンザ）などの既存薬も、前記したようにそれぞれ副作用などの欠点を有していることから、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有し、かつ、実用化の可能性の高い新たなインフルエンザ薬について、早急な研究開発が望まれているのが現状である。 Influenza epidemic is a major problem, and existing drugs such as amantadine hydrochloride (symmetrel), oseltamivir (Tamiflu), and zanamivir (Relenza) currently have drawbacks such as side effects. Therefore, at present, rapid research and development is desired for new influenza drugs having excellent anti-influenza virus activity and high possibility of practical use.
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有し、かつ、実用化の可能性の高い、新たな抗インフルエンザウイルス剤、及び、前記抗インフルエンザウイルス剤の有効成分の製造方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to solve the conventional problems and achieve the following objects. That is, the present invention provides a new anti-influenza virus agent having excellent anti-influenza virus activity and high possibility of practical use, and a method for producing an active ingredient of the anti-influenza virus agent. With the goal.
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、哺乳動物（例えば、ウシ）の初乳由来のタンパク質画分が、既存薬のオセルタミビル（タミフル）、アマンタジン塩酸塩（シンメトレル）及びザナミビル（リレンザ）に匹敵する強い抗インフルエンザウイルス活性を有するという知見である。前記タンパク質画分は、精製度を高めても強い抗インフルエンザウイルス活性を示した（実施例１参照、後述）。また、前記タンパク質画分は、既存薬のオセルタミビル（タミフル）と併用することで、更に強い抗インフルエンザウイルス活性を示した（実施例２参照、後述）。また、前記タンパク質画分は、インフルエンザウイルスの感染後、早期に作用させることで、特に強い抗インフルエンザウイルス活性を示した（実施例３〜４参照、後述）。
前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分中に存在すると考えられる、抗インフルエンザウイルス活性を発揮する物質の詳細については不明であるが、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分が、このような優れた作用を有し、抗インフルエンザウイルス剤の有効成分として有用であることは、従来には全く知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have made extensive studies and as a result, obtained the following findings. That is, the protein fraction derived from the colostrum of mammals (eg bovine) has strong anti-influenza virus activity comparable to existing drugs oseltamivir (Tamiflu), amantadine hydrochloride (Symmetrel) and zanamivir (Relenza) It is. The protein fraction showed strong anti-influenza virus activity even when the degree of purification was increased (see Example 1, described later). The protein fraction showed stronger anti-influenza virus activity when used in combination with the existing drug oseltamivir (Tamiflu) (see Example 2 below). Moreover, the said protein fraction showed the especially strong anti- influenza virus activity by making it act early after the infection of influenza virus (refer Examples 3-4, below-mentioned).
The details of the substance that exhibits anti-influenza virus activity, which is considered to be present in the protein fraction derived from the colostrum of the mammal, are unknown, but the protein fraction derived from the colostrum of the mammal is not Such an excellent action and useful as an active ingredient of an anti-influenza virus agent has never been known before, and is a new finding by the present inventors.
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分を有効成分として含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤である。
＜２＞ 哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が４〜４０ｋＤａの範囲内である前記＜１＞に記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜３＞ 哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分の、ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による等電点がｐＩ３．５〜５の範囲内である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜４＞ 哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分が、哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料をクロロホルム／メタノール混合溶液で抽出することにより得られたオリゴ糖画分に含まれるタンパク質画分である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜５＞ 哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分が、哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料をクロロホルム／メタノール混合溶液で抽出することにより得られたオリゴ糖画分を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画して得られるタンパク質画分である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜６＞ 哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分が、哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料をクロロホルム／メタノール混合溶液で抽出することにより得られたオリゴ糖画分を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、得られたタンパク質画分を、更に、限外ろ過により分画して得られる分子量５〜１００ｋＤａのタンパク質画分である前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜７＞ 哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分が、哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料をクロロホルム／メタノール混合溶液で抽出することにより得られたオリゴ糖画分を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、得られたタンパク質画分を、更に、限外ろ過により分画し、得られた分子量５〜１００ｋＤａのタンパク質画分を、更に、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲルろ過クロマトグラフィーにより精製して得られる精製タンパク質画分である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜８＞ 哺乳動物がウシである前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜９＞ 哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分と、オセルタミビルとを組み合わせてなる前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜１０＞ インフルエンザウイルスに感染した個体の治療に用いられる前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜１１＞ 哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料をクロロホルム／メタノール混合溶液で抽出することにより得られたオリゴ糖画分を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画してタンパク質画分を得る工程を含むことを特徴とする抗インフルエンザウイルス活性を有する哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分の製造方法である。
＜１２＞ 哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料をクロロホルム／メタノール混合溶液で抽出することにより得られたオリゴ糖画分を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画してタンパク質画分を得る工程；及び、前記工程で得られたタンパク質画分を、更に、限外ろ過により分画して分子量５〜１００ｋＤａのタンパク質画分を得る工程；を含む前記＜１１＞に記載の抗インフルエンザウイルス活性を有する哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分の製造方法である。
＜１３＞ 哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料をクロロホルム／メタノール混合溶液で抽出することにより得られたオリゴ糖画分を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画してタンパク質画分を得る工程；前記工程で得られたタンパク質画分を、更に、限外ろ過により分画して分子量５〜１００ｋＤａのタンパク質画分を得る工程；及び、前記工程で得られた分子量５〜１００ｋＤａのタンパク質画分を、更に、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲルろ過クロマトグラフィーにより精製して精製タンパク質画分を得る工程；を含む前記＜１１＞から＜１２＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス活性を有する哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分の製造方法である。
The present invention is based on the above findings by the present inventors, and means for solving the above problems are as follows. That is,
<1> An anti-influenza virus agent comprising a protein fraction derived from mammalian colostrum as an active ingredient.
<2> The anti-influenza virus agent according to <1>, wherein the protein fraction derived from mammalian colostrum has a molecular weight in the range of 4 to 40 kDa as determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
<3> The protein fraction derived from mammalian colostrum has an isoelectric point by polyacrylamide gel isoelectric focusing in the range of pI of 3.5 to 5, according to any one of <1> to <2> The anti-influenza virus agent described.
<4> The protein fraction derived from mammalian colostrum is included in the oligosaccharide fraction obtained by extracting a raw material derived from mammalian colostrum or mammalian colostrum with a chloroform / methanol mixed solution. The anti-influenza virus agent according to any one of <1> to <3>, which is a protein fraction.
<5> The protein fraction derived from mammalian colostrum is obtained by extracting the oligosaccharide fraction obtained by extracting the raw material derived from mammalian colostrum or mammalian colostrum with a chloroform / methanol mixed solution. The anti-influenza virus agent according to any one of <1> to <4>, which is a protein fraction obtained by fractionation by filtration chromatography.
<6> A protein fraction derived from mammalian colostrum is obtained by extracting an oligosaccharide fraction obtained by extracting a mammalian colostrum or a raw material derived from mammalian colostrum with a chloroform / methanol mixed solution. <1> to <5>, wherein the protein fraction obtained by fractionation by filtration chromatography is a protein fraction having a molecular weight of 5 to 100 kDa obtained by further fractionation by ultrafiltration. The anti-influenza virus agent described.
<7> A protein fraction derived from mammalian colostrum is obtained by extracting an oligosaccharide fraction obtained by extracting a mammalian colostrum or a raw material derived from mammalian colostrum with a chloroform / methanol mixed solution. Fractionation by filtration chromatography, the obtained protein fraction is further fractionated by ultrafiltration, and the obtained protein fraction having a molecular weight of 5 to 100 kDa is further anion exchange chromatography and / or gel. The anti-influenza virus agent according to any one of <1> to <6>, which is a purified protein fraction obtained by purification by filtration chromatography.
<8> The anti-influenza virus agent according to any one of <1> to <7>, wherein the mammal is a cow.
<9> The anti-influenza virus agent according to any one of <1> to <8>, wherein the protein fraction derived from mammalian colostrum and oseltamivir are combined.
<10> The anti-influenza virus agent according to any one of <1> to <9>, which is used for treatment of an individual infected with an influenza virus.
<11> The oligosaccharide fraction obtained by extracting a mammalian colostrum or a raw material derived from a mammalian colostrum with a chloroform / methanol mixed solution is fractionated by gel filtration chromatography to obtain a protein fraction. A method for producing a protein fraction derived from mammalian colostrum having anti-influenza virus activity, which comprises a step of obtaining the protein.
<12> The oligosaccharide fraction obtained by extracting a mammalian colostrum or a raw material derived from a mammalian colostrum with a chloroform / methanol mixed solution is fractionated by gel filtration chromatography to obtain a protein fraction. An anti-influenza virus according to <11>, further comprising: a step of obtaining a protein fraction having a molecular weight of 5 to 100 kDa by further fractionating the protein fraction obtained in the step by ultrafiltration. A method for producing a protein fraction derived from mammalian colostrum having activity.
<13> The oligosaccharide fraction obtained by extracting a mammalian colostrum or a raw material derived from a mammalian colostrum with a chloroform / methanol mixed solution is fractionated by gel filtration chromatography to obtain a protein fraction. A step of obtaining a protein fraction having a molecular weight of 5 to 100 kDa by further fractionating the protein fraction obtained in the step by ultrafiltration; and a protein having a molecular weight of 5 to 100 kDa obtained in the step The anti-influenza virus activity according to any one of <11> to <12>, further comprising a step of further purifying the fraction by anion exchange chromatography and / or gel filtration chromatography to obtain a purified protein fraction It is a manufacturing method of the protein fraction derived from the colostrum of the mammal which has.
本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有し、かつ、実用化の可能性の高い、新たな抗インフルエンザウイルス剤、及び、前記抗インフルエンザウイルス剤の有効成分の製造方法を提供することができる。 According to the present invention, a novel anti-influenza virus agent that can solve the above-mentioned conventional problems, achieve the above-mentioned object, has excellent anti-influenza virus activity, and has high possibility of practical use. And the manufacturing method of the active ingredient of the said anti-influenza virus agent can be provided.
（抗インフルエンザウイルス剤）
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分を有効成分として含有し、必要に応じて更にその他の成分を含有してなる。
(Anti-influenza virus agent)
The anti-influenza virus agent of the present invention contains a protein fraction derived from mammalian colostrum as an active ingredient, and further contains other ingredients as necessary.
＜哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分＞
−哺乳動物の初乳−
前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分を得るための原料としては、哺乳動物の初乳が用いられる。
前記初乳とは、哺乳動物から出産後数日間に分泌される乳汁をいい、初乳には、その後に分泌される乳汁に比べ、乳仔の成長に必要な栄養素成分が多く含まれていることが知られている。前記哺乳動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラットなどが挙げられるが、これらの中でも、ウシが特に好ましい。また、前記哺乳動物がウシである場合、前記初乳としては、出産後１〜４日間に分泌される乳汁を用いることが好ましい。
なお、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分を得るための原料としては、前記哺乳動物の初乳そのもの（原液）を使用してもよいし、前記哺乳動物の初乳を適宜加工（例えば、濃縮、希釈等）したものを使用してもよい。
<Protein fraction derived from mammalian colostrum>
-Colostrum of mammals-
As a raw material for obtaining a protein fraction derived from the mammalian colostrum, mammalian colostrum is used.
The colostrum refers to milk secreted from mammals for several days after delivery, and colostrum contains more nutrient components necessary for the growth of infants than milk secreted thereafter. It is known. The mammal is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include humans, monkeys, pigs, cows, sheep, goats, dogs, cats, mice and rats. Of these, bovine is particularly preferred. When the mammal is a cow, it is preferable to use milk secreted 1 to 4 days after delivery as the colostrum.
In addition, as a raw material for obtaining the protein fraction derived from the colostrum of the mammal, the colostrum itself (stock solution) of the mammal may be used, or the colostrum of the mammal is appropriately processed (for example, , Concentrated, diluted, etc.) may be used.
−タンパク質画分−
前記タンパク質画分としては、前記哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料から、例えば抽出等の操作を経て得ることのできるタンパク質（ペプチド）を含む画分であり、かつ、抗インフルエンザウイルス活性を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記タンパク質画分の分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量として、４〜４０ｋＤａの範囲内であることが好ましい。
また、前記タンパク質画分の等電点としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による等電点として、ｐＩ３．５〜５の範囲内であることが好ましい。
-Protein fraction-
The protein fraction is a fraction containing a protein (peptide) that can be obtained from the mammalian colostrum or a raw material derived from mammalian colostrum, for example, through an operation such as extraction, and has anti-influenza As long as it has virus activity, there is no restriction | limiting in particular, According to the objective, it can select suitably.
There is no restriction | limiting in particular as molecular weight of the said protein fraction, Although it can select suitably according to the objective, It exists in the range of 4-40 kDa as molecular weight by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). It is preferable.
The isoelectric point of the protein fraction is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. The isoelectric point by polyacrylamide gel isoelectric focusing is such that the pI is 3.5 to 5. It is preferable to be within the range.
−タンパク質画分の調製−
前記タンパク質画分の調製方法としては、前記哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料から、抗インフルエンザウイルス活性を有するタンパク質画分を得ることのできる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程を経て調製することができる。
-Preparation of protein fraction-
The method for preparing the protein fraction is not particularly limited as long as it is a method capable of obtaining a protein fraction having anti-influenza virus activity from the mammalian colostrum or a raw material derived from mammalian colostrum. Although it can select suitably according to the objective, it can prepare through the process of the following (I)-(III), for example.
−−工程（Ｉ）−−
工程（Ｉ）では、前記哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料からクロロホルム／メタノール抽出によりオリゴ糖画分を得、得られたオリゴ糖画分をゲルろ過クロマトグラフィーにより分画することにより、哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分を得ることができる。工程（Ｉ）は、具体的には、例えば後述する実施例に記載の方法に従い行うことができる。
-Step (I)-
In step (I), an oligosaccharide fraction is obtained by extraction with chloroform / methanol from the mammalian colostrum or a raw material derived from mammalian colostrum, and the obtained oligosaccharide fraction is fractionated by gel filtration chromatography. Thus, a protein fraction derived from mammalian colostrum can be obtained. Specifically, step (I) can be performed, for example, according to the method described in Examples described later.
前記クロロホルム／メタノール抽出に用いるクロロホルム／メタノール混合溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、体積比で、クロロホルム：メタノール＝２：１〜１：３の混合溶液を用いることが好ましい。
前記クロロホルム／メタノール抽出における前記クロロホルム／メタノール混合溶液の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記哺乳動物の初乳又は哺乳動物の初乳由来の原料に対する量として、体積比で、２〜５倍量の混合溶液を用いることが好ましい。
前記クロロホルム／メタノール抽出時の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、２５〜３５℃が好ましい。
なお、前記クロロホルム／メタノール抽出により得られた抽出液は、ロータリーエバポレーター等を用い、メタノールを除去した後に、凍結乾燥により水分を除去することが好ましい。
There is no restriction | limiting in particular as a chloroform / methanol mixed solution used for the said chloroform / methanol extraction, Although it can select suitably according to the objective, For example, it is chloroform: methanol = 2: 1 to 1: 3 by volume ratio. It is preferable to use a mixed solution.
There is no restriction | limiting in particular as the usage-amount of the said chloroform / methanol mixed solution in the said chloroform / methanol extraction, Although it can select suitably according to the objective, For example, derived from the colostrum of the said mammal or the colostrum of a mammal As an amount of the raw material, it is preferable to use a mixed solution having a volume ratio of 2 to 5 times.
There is no restriction | limiting in particular as temperature at the time of the said chloroform / methanol extraction, Although it can select suitably according to the objective, For example, 25-35 degreeC is preferable.
In addition, it is preferable to remove moisture by freeze-drying the extract obtained by the chloroform / methanol extraction after removing methanol using a rotary evaporator or the like.
前記ゲルろ過クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−２カラム（バイオ・ラッド社）、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−４カラム（バイオ・ラッド社）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０カラム（ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス社（旧ファルマシア））などが挙げられ、これらの中でも、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−２カラム（バイオ・ラッド社）が好ましい。
前記ゲルろ過クロマトグラフィーに用いる溶離液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられ、これらの中でも、水が好ましい。
There is no restriction | limiting in particular as a column used for the said gel filtration chromatography, According to the objective, it can select suitably, For example, Bio Gel P-2 column (Bio-Rad), Bio Gel P-4 column (Bio -Rad), Sephadex G-10 column (GE Healthcare Biosciences (former Pharmacia)), etc. Among them, Bio Gel P-2 column (Bio-Rad) is preferable.
There is no restriction | limiting in particular as an eluent used for the said gel filtration chromatography, According to the objective, it can select suitably, For example, water, a phosphate buffer, a tris-hydrochloric acid buffer etc. are mentioned, Among these, Water is preferred.
−−工程（ＩＩ）−−
工程（ＩＩ）では、前記工程（Ｉ）で得られたタンパク質画分を、限外ろ過により分画することにより、分子量５〜１００ｋＤａのタンパク質画分を得ることができる。工程（ＩＩ）は、具体的には、例えば後述する実施例に記載の方法に従い行うことができる。
--Step (II)-
In step (II), a protein fraction having a molecular weight of 5 to 100 kDa can be obtained by fractionating the protein fraction obtained in the step (I) by ultrafiltration. Specifically, step (II) can be performed, for example, according to the method described in Examples described later.
前記限外ろ過に用いる限外ろ過膜としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミコン ウルトラ（ミリポア社）、ウルトラフィルター（アドバンテック東洋社）などが挙げられ、これらの中でも、アミコン ウルトラ（ミリポア社）が好ましい。
限外ろ過は、例えば遠心法により行うことができ、分画分子量１００ｋＤａで分画した後に、５ｋＤａで分画することにより、分子量５〜１００ｋＤａのタンパク質画分（限外ろ過画分）を得ることができる。なお、前記限外ろ過後の画分であっても、分子量５ｋＤａ未満（例えば４ｋＤａ程度）の成分や、分子量１００ｋＤａを超える（例えば１１０ｋＤａ程度）成分を多少含み得るものであり、そのため、前記限外ろ過画分は、厳密に分子量５〜１００ｋＤａの範囲内の成分のみを含むものでなくともよい。
The ultrafiltration membrane used for the ultrafiltration is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include Amicon Ultra (Millipore), Ultrafilter (Advantech Toyo), Among these, Amicon Ultra (Millipore) is preferable.
Ultrafiltration can be performed, for example, by centrifugation, and after fractionation at a fractional molecular weight of 100 kDa, a protein fraction (ultrafiltration fraction) having a molecular weight of 5 to 100 kDa is obtained by fractionation at 5 kDa. Can do. Note that even the fraction after the ultrafiltration may contain a component having a molecular weight of less than 5 kDa (for example, about 4 kDa) or a component having a molecular weight of more than 100 kDa (for example, about 110 kDa). The filtration fraction does not necessarily contain only components having a molecular weight in the range of 5 to 100 kDa.
−−工程（ＩＩＩ）−−
工程（ＩＩＩ）では、前記工程（ＩＩ）で得られた分子量５〜１００ｋＤａのタンパク質画分を、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲルろ過クロマトグラフィーにより精製して精製タンパク質画分を得ることができる。工程（ＩＩＩ）は、具体的には、例えば後述する実施例に記載の方法に従い行うことができる。
--Step (III)-
In step (III), the protein fraction having a molecular weight of 5 to 100 kDa obtained in step (II) can be purified by anion exchange chromatography and / or gel filtration chromatography to obtain a purified protein fraction. . Specifically, step (III) can be performed, for example, according to the method described in Examples described later.
前記陰イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０カラム（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）などが挙げられ、これらの中でも、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）が好ましい。
前記陰イオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、水、酢酸ナトリウム水溶液が好ましい。例えば、水で素通りする成分が溶出した後に酢酸ナトリウム水溶液０〜０．７Ｍの濃度勾配で溶出し、最後の１Ｍで押し出しを行うことにより、溶出を行うことができる。
There is no restriction | limiting in particular as a column used for the said anion exchange chromatography, According to the objective, it can select suitably, For example, Q-Sepharose FF column (GE Healthcare Bioscience), DEAE-Sephadex A-50 Column (GE Healthcare Bioscience), and the like. Among these, Q-Sepharose FF column (GE Healthcare Bioscience) is preferable.
There is no restriction | limiting in particular as an eluent used for the said anion exchange chromatography, Although it can select suitably according to the objective, Especially, water and sodium acetate aqueous solution are preferable. For example, elution can be carried out by eluting with a concentration gradient of 0 to 0.7 M sodium acetate aqueous solution after elution of the components that pass through with water, and extruding with the final 1 M.
前記ゲルろ過クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５カラム（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−６０カラム（バイオ・ラッド社）などが挙げられ、これらの中でも、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５カラム（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）が好ましい。
前記ゲルろ過クロマトグラフィーに用いる溶離液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられ、これらの中でも、水が好ましい。
There is no restriction | limiting in particular as a column used for the said gel filtration chromatography, According to the objective, it can select suitably, For example, Sephadex G-75 column (GE Healthcare Bioscience), Sephadex G-50 column (GE). Healthcare Biosciences), Bio Gel P-60 columns (Bio-Rad), etc. Among them, Sephadex G-75 columns (GE Healthcare Biosciences), Sephadex G-50 columns (GE Health) Care Bioscience).
There is no restriction | limiting in particular as an eluent used for the said gel filtration chromatography, According to the objective, it can select suitably, For example, water, a phosphate buffer, a tris-hydrochloric acid buffer etc. are mentioned, Among these, Water is preferred.
以上のようにして、前記抗インフルエンザウイルス剤の有効成分である哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分を得ることができる。
前記工程（Ｉ）後に得られるタンパク質画分、前記工程（ＩＩ）後に得られるタンパク質画分、前記工程（ＩＩＩ）後に得られるタンパク質画分はいずれも、抗インフルエンザウイルス活性を有する画分である限り、前記抗インフルエンザウイルス剤における有効成分として好適に利用可能である。また、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分は、前記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）により得られるものに限定されず、抗インフルエンザウイルス活性を有するものである限り、どのような調製方法により得られたものであってもよい。また、前記タンパク質画分には、前記各タンパク質画分を適宜加工したもの（例えば、前記各タンパク質画分の希釈液若しくは濃縮液、前記各タンパク質画分の乾燥物など）も含まれる。なお、前記各タンパク質画分の抗インフルエンザウイルス活性は、例えば、後述の実施例に記載の［抗インフルエンザウイルス活性の評価方法］に従い、確認することができる。
As described above, a protein fraction derived from mammalian colostrum, which is an active ingredient of the anti-influenza virus agent, can be obtained.
The protein fraction obtained after the step (I), the protein fraction obtained after the step (II), and the protein fraction obtained after the step (III) are all fractions having anti-influenza virus activity. It can be suitably used as an active ingredient in the anti-influenza virus agent. Moreover, the protein fraction derived from the colostrum of the mammal is not limited to those obtained by the steps (I) to (III), and any preparation method can be used as long as it has anti-influenza virus activity. It may be obtained. In addition, the protein fraction includes those obtained by appropriately processing each protein fraction (for example, a diluted solution or a concentrated solution of each protein fraction, a dried product of each protein fraction, etc.). In addition, the anti-influenza virus activity of each said protein fraction can be confirmed according to the [evaluation method of anti-influenza virus activity] described in the below-mentioned Example, for example.
また、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記抗インフルエンザウイルス剤中の、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分の含有量は、特に制限はなく、例えば、剤型の種類や、個体への投与量、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。また、前記抗インフルエンザウイルス剤は、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分そのものであってもよい。
Moreover, the protein fraction derived from the colostrum of the said mammal may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
The content of the protein fraction derived from the colostrum of the mammal in the anti-influenza virus agent is not particularly limited. For example, the type of dosage form, the dose to an individual, the degree of desired effect, etc. Depending on the situation, it can be appropriately selected. Further, the anti-influenza virus agent may be the protein fraction itself derived from the colostrum of the mammal.
＜既存薬との併用＞
また、前記抗インフルエンザウイルス剤は、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分と、既存のインフルエンザ薬とを組み合わせて（併用して）なるものであってもよい。前記抗インフルエンザウイルス剤が、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分と、既存のインフルエンザ薬とを組み合わせてなるものであると、より抗インフルエンザウイルス活性を高めることができる点で、有利である。
前記既存のインフルエンザ薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、オセルタミビル（商品名：タミフル、中外製薬株式会社）が好ましい。
<Combination with existing drugs>
The anti-influenza virus agent may be a combination of (combined with) a protein fraction derived from the colostrum of the mammal and an existing influenza drug. It is advantageous in that the anti-influenza virus activity can be further enhanced when the anti-influenza virus agent is a combination of the protein fraction derived from the colostrum of the mammal and an existing influenza drug. .
There is no restriction | limiting in particular as said existing influenza medicine, Although it can select suitably according to the objective, For example, oseltamivir (brand name: Tamiflu, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) is preferable.
前記抗インフルエンザウイルス剤が、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分と、前記オセルタミビルとを組み合わせてなるものである場合、前記抗インフルエンザウイルス剤中の、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分と、前記オセルタミビルとの含有量比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、質量比で、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分：前記オセルタミビル＝１０：１〜１：１０が好ましく、２：１〜１：２がより好ましい。 When the anti-influenza virus agent is a combination of the protein fraction derived from the colostrum of the mammal and the oseltamivir, the protein fraction derived from the colostrum of the mammal in the anti-influenza virus agent The content ratio of the fraction and the oseltamivir is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. For example, the protein fraction derived from the colostrum of the mammal by mass ratio: the oseltamivir = 10: 1 to 1:10 are preferable, and 2: 1 to 1: 2 are more preferable.
なお、前記抗インフルエンザウイルス剤が、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分と、前記オセルタミビルとを組み合わせてなる場合、前記抗インフルエンザウイルス剤としては、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分と、前記オセルタミビルとが混合された配合剤の状態であってもよいし、また、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分を含有する薬剤と、前記オセルタミビルを含有する薬剤とを含む（前記２種の成分が混合されていない）、キットの状態であってもよい。 When the anti-influenza virus agent is a combination of the protein fraction derived from the colostrum of the mammal and the oseltamivir, the anti-influenza virus agent is a protein fraction derived from the colostrum of the mammal. And a formulation containing a mixture of oseltamivir and a drug containing a protein fraction derived from the colostrum of the mammal and a drug containing the oseltamivir (see above) The two components may not be mixed) or in a kit state.
＜その他の成分＞
前記抗インフルエンザウイルス剤に含有され得る、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分、前記既存のインフルエンザ薬以外のその他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体などが挙げられる。前記薬学的に許容され得る担体としても、特に制限はなく、前記抗インフルエンザウイルス剤の剤型などに応じて、適宜選択することができる。
また、前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、例えば、前記抗インフルエンザウイルス剤における前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分の含有量が所望の範囲内となるように、目的に応じて適宜選択することができる。
<Other ingredients>
The protein fraction derived from the colostrum of the mammal that can be contained in the anti-influenza virus agent, and other components other than the existing influenza drug are not particularly limited and are within the range not impairing the effects of the present invention. Can be appropriately selected depending on the purpose, and examples thereof include pharmaceutically acceptable carriers. The pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the dosage form of the anti-influenza virus agent.
Further, the content of the other components is not particularly limited. For example, the content of the protein fraction derived from the colostrum of the mammal in the anti-influenza virus agent is within a desired range. It can be selected as appropriate according to the conditions.
＜剤型＞
前記抗インフルエンザウイルス剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、前記抗インフルエンザウイルス剤の投与方法などに応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、点鼻剤、吸入散剤などが挙げられる。また、前記抗インフルエンザウイルス剤は、医薬品、医薬部外品、食品などの区分に制限されるものではなく、これらのいずれにも適用が可能である。
<Dosage form>
The dosage form of the anti-influenza virus agent is not particularly limited, and can be appropriately selected according to, for example, the administration method of the anti-influenza virus agent. For example, oral solid agent, oral solution, injection, point Examples include nasal and inhaled powders. Further, the anti-influenza virus agent is not limited to a category such as a pharmaceutical, a quasi drug, and a food, and can be applied to any of these.
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分に、賦形剤、及び必要に応じて各種添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
-Oral solid agent-
Examples of the oral solid preparation include tablets, coated tablets, granules, powders, capsules and the like.
The method for producing the oral solid preparation is not particularly limited, and conventional methods can be used. For example, excipients and various additions as necessary to the protein fraction derived from the colostrum of the mammal It can be manufactured by adding an agent. Here, the excipient is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid, etc. Is mentioned. Moreover, there is no restriction | limiting in particular also as said additive, According to the objective, it can select suitably, For example, a binder, a disintegrating agent, a lubricant, a coloring agent, a flavoring / flavoring agent etc. are mentioned.
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
The binder is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxy Examples include propyl starch, methyl cellulose, ethyl cellulose, shellac, calcium phosphate, and polyvinyl pyrrolidone.
The disintegrant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, and lactose. Is mentioned.
The lubricant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include purified talc, stearate, borax, and polyethylene glycol.
The colorant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include titanium oxide and iron oxide.
The flavoring / flavoring agent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include sucrose, orange peel, citric acid, and tartaric acid.
−経口液剤−
前記経口液剤としては、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分に添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
-Oral solution-
Examples of the oral liquid preparation include internal liquid preparations, syrups, and elixirs.
There is no restriction | limiting in particular as a manufacturing method of the said oral liquid preparation, A normal method can be used, For example, it can manufacture by adding an additive to the protein fraction derived from the colostrum of the said mammal. Here, there is no restriction | limiting in particular as said additive, According to the objective, it can select suitably, For example, a flavoring / flavoring agent, a buffering agent, a stabilizer, etc. are mentioned.
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
The flavoring / flavoring agent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include sucrose, orange peel, citric acid, and tartaric acid.
There is no restriction | limiting in particular as said buffering agent, According to the objective, it can select suitably, For example, sodium citrate etc. are mentioned.
There is no restriction | limiting in particular as said stabilizer, According to the objective, it can select suitably, For example, tragacanth, gum arabic, gelatin, etc. are mentioned.
−注射剤−
前記注射剤としては、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
-Injection-
Examples of the injection include a solution, a suspension, and a solid agent for dissolving for use.
The method for producing the injection is not particularly limited, and a conventional method can be used. For example, a pH regulator, a buffer, a stabilizer, etc. It can be produced by adding a tonicity agent, a local anesthetic or the like. Here, there is no restriction | limiting in particular as said pH regulator and said buffer, According to the objective, it can select suitably, For example, sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate etc. are mentioned. Moreover, there is no restriction | limiting in particular as said stabilizer, According to the objective, it can select suitably, For example, sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid etc. are mentioned. The tonicity agent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include sodium chloride and glucose. The local anesthetic agent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride.
−点鼻剤−
前記点鼻剤としては、例えば、液剤、スプレー剤、軟膏剤などが挙げられる。
前記点鼻剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分に添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、クエン酸、Ｄ−ソルビトール、グリセリン、エデト酸ナトリウム、結晶セルロース、ポリソルベート８０、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、ｐＨ調節剤などが挙げられる。
-Nasal agent-
Examples of the nasal drops include liquids, sprays, ointments and the like.
The method for producing the nasal drops is not particularly limited, and a conventional method can be used. For example, the nasal drops can be produced by adding an additive to the protein fraction derived from the colostrum of the mammal. . Here, there is no restriction | limiting in particular as said additive, According to the objective, it can select suitably, For example, benzalkonium chloride, a citric acid, D-sorbitol, glycerol, sodium edetate, crystalline cellulose, polysorbate 80 , Polyvinyl alcohol, phenylethyl alcohol, pH adjuster and the like.
＜投与＞
前記抗インフルエンザウイルス剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記抗インフルエンザウイルス剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記抗インフルエンザウイルス剤の投与量としても、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記抗インフルエンザウイルス剤の個体への投与時期にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、インフルエンザウイルスの感染前に予防的に投与してもよく、インフルエンザウイルスの感染後に治療的に投与してもよいが、中でも、インフルエンザウイルスの感染後に投与することが、より強い抗インフルエンザウイルス活性を得ることができる点で、有利である。前記抗インフルエンザウイルス剤は、インフルエンザウイルスが細胞に感染した後、増殖する過程で作用するものと考えられる。
<Administration>
There is no restriction | limiting in particular as the administration method of the said anti-influenza virus agent, For example, it can select suitably according to the dosage form etc. of the said anti-influenza virus agent, and can administer orally or parenterally.
The dose of the anti-influenza virus agent is not particularly limited, and can be appropriately selected in consideration of various factors such as the age, weight, constitution, symptom, and presence / absence of administration of other drugs. .
There is no particular limitation on the timing of administration of the anti-influenza virus agent to an individual, and it can be appropriately selected according to the purpose. For example, it may be administered prophylactically before infection with influenza virus. Although it may be administered therapeutically after infection, administration after infection with influenza virus is particularly advantageous in that stronger anti-influenza virus activity can be obtained. The anti-influenza virus agent is considered to act in the process of proliferation after influenza virus infects cells.
＜対象＞
前記抗インフルエンザウイルス剤の投与対象となる動物種としては、インフルエンザウイルスに感染する可能性のある動物種であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、トリ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラットなどが挙げられる。
また、前記抗インフルエンザウイルス剤の適用対象となるインフルエンザウイルスの種類としても、特に制限されるものではなく、中でも、前記抗インフルエンザウイルス剤は、Ａ型、Ｂ型のインフルエンザウイルスについて、高い増殖抑制効果が期待できる。
<Target>
The animal species to be administered with the anti-influenza virus agent is not particularly limited as long as it is an animal species that can be infected with influenza virus, and can be appropriately selected according to the purpose. , Monkeys, pigs, cows, sheep, goats, dogs, cats, mice, rats and the like.
In addition, the type of influenza virus to which the anti-influenza virus agent is applied is not particularly limited, and among them, the anti-influenza virus agent has a high growth inhibitory effect on A-type and B-type influenza viruses. Can be expected.
（抗インフルエンザウイルス活性を有する哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分の製造方法）
本発明の抗インフルエンザウイルス活性を有する哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分の製造方法は、前記工程（Ｉ）を少なくとも含み、好ましくは更に前記工程（ＩＩ）を含み、より好ましくは更に前記工程（ＩＩＩ）を含むものである。前記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の詳細は、前記した本発明の抗インフルエンザウイルス剤の項目に記載の通りであり、これらの工程により、抗インフルエンザウイルス活性を有する哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分を効率的に得ることができる。得られた哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分は、前記した本発明の抗インフルエンザウイルス剤の有効成分として、好適に利用可能である。
(Method for producing protein fraction derived from mammalian colostrum having anti-influenza virus activity)
The method for producing a protein fraction derived from mammalian colostrum having anti-influenza virus activity of the present invention comprises at least the step (I), preferably further comprises the step (II), more preferably further comprises the step. (III) is included. The details of the steps (I) to (III) are as described in the above-mentioned item of the anti-influenza virus agent of the present invention. By these steps, a protein derived from mammalian colostrum having anti-influenza virus activity. A fraction can be obtained efficiently. The obtained protein fraction derived from mammalian colostrum can be suitably used as an active ingredient of the anti-influenza virus agent of the present invention described above.
［効果］
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、現在インフルエンザ薬として使用認可されているアマンタジン塩酸塩（シンメトレル）、オセルタミビル（タミフル）及びザナミビル（リレンザ）に匹敵する強い抗インフルエンザウイルス活性を有することから、新たなインフルエンザ薬として、臨床応用の可能性が期待されるものである。また、インフルエンザ薬としての実用化には有効成分の大量調製が望まれるが、前記抗インフルエンザウイルス剤の有効成分である前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分は、例えば、ウシの初乳から比較的大量に調製が可能であると考えられ、実用化に向けて有利であると考えられる。また、前記哺乳動物の初乳由来のタンパク質画分は、天然由来の成分であり、安全性に優れる点でも、有利であると考えられる。
[effect]
The anti-influenza virus agent of the present invention has a strong anti-influenza virus activity comparable to amantadine hydrochloride (symmetrel), oseltamivir (Tamiflu) and zanamivir (Relenza) currently approved for use as influenza drugs. As a drug, the potential for clinical application is expected. In addition, a large-scale preparation of an active ingredient is desired for practical use as an influenza drug, but the protein fraction derived from the colostrum of the mammal that is an active ingredient of the anti-influenza virus agent is, for example, from bovine colostrum It is considered that preparation in a relatively large amount is possible, and it is considered advantageous for practical use. Further, the protein fraction derived from the colostrum of the mammal is considered to be advantageous in that it is a naturally derived component and is excellent in safety.
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１：ウシ初乳由来のタンパク質画分の調製、及び、各タンパク質画分の抗インフルエンザウイルス活性の確認）
実施例１におけるウシ初乳由来のタンパク質画分の調製方法の概要を、図１に示した。ウシ初乳からクロロホルム／メタノール混合溶液で抽出（ＣＭ抽出）することにより得られたオリゴ糖画分を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、タンパク質（ペプチド）画分を得た（工程（Ｉ））。得られたタンパク質画分を、更に限外ろ過により分画し、分子量５〜１００ｋＤａのタンパク質画分を得た（工程（ＩＩ））。得られた分子量５〜１００ｋＤａのタンパク質画分を、更に陰イオン交換クロマトグラフィー、及び／又は、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した（工程（ＩＩＩ））。前記各工程の詳細を下記に示す。なお、前記各工程で得られたタンパク質画分の抗インフルエンザウイルス活性は、後述する［抗インフルエンザウイルス活性の評価方法］に従い、確認した。
(Example 1: Preparation of protein fractions derived from bovine colostrum and confirmation of anti-influenza virus activity of each protein fraction)
The outline of the method for preparing a protein fraction derived from bovine colostrum in Example 1 is shown in FIG. The oligosaccharide fraction obtained by extraction from bovine colostrum with a chloroform / methanol mixed solution (CM extraction) was fractionated by gel filtration chromatography to obtain a protein (peptide) fraction (step (I)). ). The obtained protein fraction was further fractionated by ultrafiltration to obtain a protein fraction having a molecular weight of 5 to 100 kDa (step (II)). The obtained protein fraction having a molecular weight of 5 to 100 kDa was further purified by anion exchange chromatography and / or gel filtration chromatography (step (III)). Details of each of the above steps are shown below. In addition, the anti-influenza virus activity of the protein fraction obtained at each said process was confirmed according to the [evaluation method of anti-influenza virus activity] mentioned later.
＜工程（Ｉ）：ゲルろ過クロマトグラフィーによる分画、及び、工程（ＩＩ）：限外ろ過による分画＞
まず、ウシ（ジャージー種）の初乳から、クロロホルム／メタノール（２：１、体積比）抽出により、オリゴ糖画分を得た。なお、前記抽出は２５℃で行い、前記クロロホルム／メタノール混合溶液は、ウシの初乳に対し、体積比で４倍量使用した。抽出液は、ロータリーエバポレーターを用い、メタノールを除去した後に、凍結乾燥により水分を除去した。得られたウシ初乳由来のオリゴ糖画分を、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−２カラム（バイオ・ラッド社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、溶離液として水を使用し、分画したところ、図２、及び、図３（左）に示すように各成分が分離されていた（図２、及び、図３（左）は、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−２カラムによる分離の様相を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認した図である）。ＴＬＣ上、原点から移動しない成分を含む画分を、高画分１とした。その成分でガングリオシドと一緒に溶出する成分を含む画分を高画分２とし、それより遅れて溶出する成分を含む画分を低画分とした。
<Step (I): fractionation by gel filtration chromatography and step (II): fractionation by ultrafiltration>
First, oligosaccharide fractions were obtained from bovine (Jersey) colostrum by extraction with chloroform / methanol (2: 1, volume ratio). The extraction was performed at 25 ° C., and the chloroform / methanol mixed solution was used in a volume ratio of 4 times that of bovine colostrum. For the extract, after removing methanol using a rotary evaporator, moisture was removed by lyophilization. The obtained oligosaccharide fraction derived from bovine colostrum was fractionated by gel filtration chromatography using a Bio Gel P-2 column (Bio-Rad) using water as an eluent. And each component was isolate | separated as shown in FIG. 3 (left) (FIG. 2 and FIG. 3 (left) are thin layer chromatography (TLC)) of the aspect of separation | separation by a Bio Gel P-2 column. This is the figure confirmed in step 1). A fraction containing a component that does not move from the origin on TLC was defined as a high fraction 1. The fraction containing the component that elutes together with the ganglioside was designated as high fraction 2, and the fraction containing the component eluting later was designated as the low fraction.
得られた各タンパク質画分（図３中、高画分１、高画分２、低画分）について抗インフルエンザウイルス活性を確認したところ、いずれの画分にも抗インフルエンザウイルス活性が確認され、中でも、限外ろ過により得られた分子量５〜１００ｋＤａの高画分２に、既存薬のオセルタミビルよりも強い抗インフルエンザウイルス活性を有する物質が含まれていることが確認された（図３（右））。なお、前記高画分２の限外ろ過は遠心法により行った。限外ろ過膜としては、アミコン ウルトラ（ミリポア社）を用い、分画分子量１００ｋＤａで分画した後に、５ｋＤａで分画した。以下、「高画分２」としては、この分子量５〜１００ｋＤａの限外ろ過画分を使用した。
更に、この高画分２をインフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型の各株に作用させたところ、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型のいずれに対しても抗インフルエンザウイルス活性を有することが確認された（図４）。また、この高画分２に含まれる抗インフルエンザウイルス活性を有する物質が、インフルエンザウイルスの増殖過程で作用することも確認された（図５）。
また、この高画分２をシアリダーゼ処理しても抗インフルエンザウイルス活性は維持されたことから、高画分２に含まれる抗インフルエンザウイルス活性を有する物質は、シアル酸含有糖鎖（例えば、特開２００１−２３３７７３号公報参照）とは異なる物質であることも確認された（図６）。
When the anti-influenza virus activity was confirmed for each obtained protein fraction (in FIG. 3, high fraction 1, high fraction 2, low fraction), anti-influenza virus activity was confirmed in any fraction, Among them, it was confirmed that the high fraction 2 having a molecular weight of 5 to 100 kDa obtained by ultrafiltration contains a substance having stronger anti-influenza virus activity than the existing drug oseltamivir (FIG. 3 (right)). ). The ultrafiltration of the high fraction 2 was performed by a centrifugal method. As an ultrafiltration membrane, Amicon Ultra (Millipore) was used and fractionated at a fractional molecular weight of 100 kDa, and then fractionated at 5 kDa. Hereinafter, as the “high fraction 2”, an ultrafiltration fraction having a molecular weight of 5 to 100 kDa was used.
Furthermore, when this high fraction 2 was allowed to act on each strain of influenza virus type A and B, it was confirmed that it has anti-influenza virus activity against both influenza virus types A and B (Fig. 4). Moreover, it was also confirmed that the substance having anti-influenza virus activity contained in the high fraction 2 acts in the growth process of influenza virus (FIG. 5).
In addition, since anti-influenza virus activity was maintained even when this high fraction 2 was treated with sialidase, the substance having anti-influenza virus activity contained in high fraction 2 was a sialic acid-containing sugar chain (for example, It was also confirmed that the substance was different from that of 2001-233773 (see FIG. 6).
＜工程（ＩＩＩ）：陰イオン交換クロマトグラフィー／ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製＞
次に、前記工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）で得られたウシ初乳由来のタンパク質画分を更に精製するため、前記工程（Ｉ）及び工程（ＩＩ）で得られた高画分（高２）を、更にＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより、溶離液として水、酢酸ナトリウム水溶液を使用し、分画した。水で素通りする成分が溶出した後に０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液で溶出し、最後の０．５Ｍで押し出しを行なった。抗インフルエンザウイルス活性は、主に、素通り画分（Ｑ１）と０．２Ｍ酢酸ナトリウム溶出画分（Ｑ２）とに観察された。Ｑ１、Ｑ２の各ピーク画分をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、溶離液として水を使用し、更に分画したところ、強い抗インフルエンザウイルス活性を有するいくつかのタンパク質画分が検出された（図７〜８、「高分子１」、「高分子２」、「低分子１」、「低分子２」等）。
<Step (III): Purification by anion exchange chromatography / gel filtration chromatography>
Next, in order to further purify the protein fraction derived from bovine colostrum obtained in the steps (I) and (II), a high fraction (high) obtained in the steps (I) and (II) is used. 2) was further fractionated by anion exchange chromatography using a Q-Sepharose FF column (GE Healthcare Bioscience) using water and an aqueous sodium acetate solution as an eluent. After elution of the components passing through with water, elution was performed with a 0.2 M aqueous sodium acetate solution, and extrusion was performed at the final 0.5 M. Anti-influenza virus activity was mainly observed in the flow-through fraction (Q1) and the 0.2M sodium acetate elution fraction (Q2). Each peak fraction of Q1 and Q2 was subjected to gel filtration chromatography using Sephadex G-75 (GE Healthcare Bioscience) and Sephadex G-50 (GE Healthcare Bioscience) using water as the eluent. When fractionated, several protein fractions having strong anti-influenza virus activity were detected (FIGS. 7-8, “Polymer 1”, “Polymer 2”, “Low Molecule 1”, “Low” Molecule 2 ").
＜各タンパク質画分の確認＞
前記で得られた各タンパク質画分（図７中の「高分子１」、図８中の「低分子１」）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認した（図９）。各タンパク質画分における主要成分のバンド（レーン１及び２）は、市販牛乳（常乳）を材料として同様の精製操作を経て得られた相当画分における主要成分のバンド（レーン３及び４）とは明らかに異なっていた。また、市販牛乳（常乳）由来の相当画分は、抗インフルエンザウイルス活性を有していなかった（図１１）。
また、前記で得られた各タンパク質画分（図７中の「高分子１」、図８中の「低分子１」）を、二次元電気泳動（一次元目：ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動、二次元目：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により確認した（図１０）。各タンパク質画分中の成分は、市販牛乳（常乳）由来の相当画分中の成分とは明らかに異なるものであることが確認された。初乳由来の「高分子１」では少なくとも６成分、初乳由来の「低分子１」では少なくとも２成分のスポットが確認され、これらの中の少なくともいずれかの成分が抗インフルエンザウイルス活性成分であると考えられる。
なお、初乳由来の「高分子１」、「低分子１」の分子量はいずれも４〜４０ｋＤａであることが確認された。また、初乳由来の「高分子１」、「低分子１」の等電点はいずれもｐＩ３．５〜５であることが確認された。（ここで、前記「高分子１」、「低分子１」はいずれも前記「高画分２」から精製した画分であり、二次元電気泳動の結果からは、双方の主要成分はいずれも、分子量約１７，０００、等電点ｐＩ３．５〜５という条件を満たしていた（図１０）。しかしながら、前記「高分子１」、「低分子１」は、精製過程におけるゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５，Ｇ−５０）操作では、明らかな高分子或いは低分子としての挙動を示しており、このような挙動をする理由の一つとして、会合体（２量体、３量体、４量体）形成が考えられた。そこで、二次元電気泳動やＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認されるマイナーな成分から、４，０００〜４０，０００という分子量範囲が推定された。この分子量範囲は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５，Ｇ−５０の分画分子量範囲を考量しても矛盾のないものである。なお、主要バンドの分子量が約１７，０００となる理由としては、定かではないが、例えば、界面活性剤（ＳＤＳのような）存在の影響である可能性が考えられる。）
<Confirmation of each protein fraction>
Each protein fraction obtained above (“polymer 1” in FIG. 7 and “small molecule 1” in FIG. 8) was confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (FIG. 9). ). The main component bands (lanes 1 and 2) in each protein fraction are the main component bands (lanes 3 and 4) in the corresponding fractions obtained through the same purification procedure using commercially available milk (normal milk) as a material. Was clearly different. Moreover, the equivalent fraction derived from commercially available milk (normal milk) did not have anti-influenza virus activity (FIG. 11).
Each protein fraction obtained above ("polymer 1" in FIG. 7 and "small molecule 1" in FIG. 8) is subjected to two-dimensional electrophoresis (first dimension: polyacrylamide gel isoelectric focusing). Electrophoresis, second dimension: SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) (FIG. 10). It was confirmed that the components in each protein fraction were clearly different from the components in the equivalent fraction derived from commercially available milk (normal milk). In the “polymer 1” derived from colostrum, spots of at least 6 components are observed, and in the “small molecule 1” derived from colostrum, at least 2 spots are identified, and at least one of these is an anti-influenza virus active component it is conceivable that.
In addition, it was confirmed that the molecular weights of “polymer 1” and “low molecule 1” derived from colostrum are both 4 to 40 kDa. In addition, it was confirmed that the isoelectric points of “polymer 1” and “low molecule 1” derived from colostrum are both pI 3.5 to 5. (Here, “polymer 1” and “low molecule 1” are both fractions purified from “high fraction 2”. From the results of two-dimensional electrophoresis, both major components are both The molecular weight of about 17,000 and the isoelectric point pI of 3.5 to 5 were satisfied (FIG. 10) However, the “polymer 1” and “low molecule 1” were subjected to gel filtration (Sephadex G) in the purification process. -75, G-50) shows a clear behavior as a polymer or low molecule, and one of the reasons for such behavior is the association (dimer, trimer, tetramer). Therefore, a molecular weight range of 4,000 to 40,000 was estimated from minor components confirmed by two-dimensional electrophoresis and SDS-PAGE, and this molecular weight range was determined by Sephadex G- 75, G-50 minutes There is no contradiction even if the molecular weight range is considered, although the reason why the molecular weight of the main band is about 17,000 is not clear, for example, the influence of the presence of a surfactant (such as SDS) It is possible that
前記で得られたウシ初乳由来の各タンパク質画分のインフルエンザウイルス阻害濃度（ＩＣ５０）を図１２に示す。ウシ初乳由来のタンパク質画分は、精製度を高めても、既存薬のオセルタミビル（タミフル）、ザナミビル（リレンザ）に匹敵する強い抗インフルエンザウイルス活性を有していることが確認された。 FIG. 12 shows the influenza virus inhibitory concentration (IC 50 ) of each protein fraction derived from bovine colostrum obtained above. It was confirmed that the protein fraction derived from bovine colostrum has strong anti-influenza virus activity comparable to existing drugs oseltamivir (Tamiflu) and zanamivir (Relenza), even if the degree of purification is increased.
以上、実施例１の結果から、前記したような調製方法により得られるウシ初乳由来のタンパク質画分は、いずれの精製段階においても、強い抗インフルエンザウイルス活性を有することが確認された。この抗インフルエンザウイルス活性は、同様の精製操作で得られた市販牛乳（常乳）由来のタンパク質画分からは見出せず（図１１）、したがって、ウシ初乳由来のタンパク質画分中に存在する抗インフルエンザウイルス活性を示す物質は、精製操作で使用した試薬やクロマト担体由来のものではなく、ウシ初乳に特異的な成分であることが確認された。なお、本実施例１ではジャージー種の初乳由来のタンパク質画分について検討したが、ホルスタイン種の初乳由来のタンパク質画分についても同様な結果が確認できた（図１３）。 As described above, from the results of Example 1, it was confirmed that the protein fraction derived from bovine colostrum obtained by the preparation method as described above has strong anti-influenza virus activity at any purification stage. This anti-influenza virus activity was not found in the protein fraction derived from commercially available milk (ordinary milk) obtained by the same purification operation (FIG. 11), and therefore, the anti-influenza present in the protein fraction derived from bovine colostrum. It was confirmed that the substance exhibiting viral activity was not derived from the reagent or chromatographic carrier used in the purification operation, but a component specific to bovine colostrum. In Example 1, the protein fraction derived from Jersey colostrum was examined, but the same result was confirmed for the protein fraction derived from Holstein colostrum (FIG. 13).
（実施例２：ウシ初乳由来のタンパク質画分とオセルタミビルとの相乗効果）
実施例１で得られたウシ初乳由来のタンパク質画分（「高分子１」、「低分子１」）と、既存薬であるオセルタミビル（商品名：タミフル、中外製薬株式会社）とを組み合わせて用いた場合の抗インフルエンザウイルス活性の相乗効果について検討した。
図１４に示す各濃度で、実施例１で得られたウシ初乳由来のタンパク質画分（「高分子１」、「低分子１」）と、オセルタミビルとを組み合わせ、後述する［抗インフルエンザウイルス活性の評価方法］に従い、それぞれを組み合わせて用いた際の抗インフルエンザウイルス活性を評価した。
結果、ウシ初乳由来のタンパク質画分（「高分子１」、「低分子１」）と、既存薬であるオセルタミビルとを組み合わせて用いることで、抗インフルエンザウイルス活性を顕著に高めることができることが確認された（図１４）。
(Example 2: Synergistic effect of protein fraction derived from bovine colostrum and oseltamivir)
The protein fraction derived from bovine colostrum obtained in Example 1 (“Polymer 1”, “Low Molecule 1”) and oseltamivir (trade name: Tamiflu, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), which is an existing drug, are combined. The synergistic effect of anti-influenza virus activity when used was examined.
At each concentration shown in FIG. 14, the protein fractions derived from bovine colostrum obtained in Example 1 (“polymer 1”, “small molecule 1”) and oseltamivir are combined, and described below [anti-influenza virus activity The anti-influenza virus activity when used in combination with each other was evaluated.
As a result, the anti-influenza virus activity can be remarkably enhanced by using a protein fraction derived from bovine colostrum (“polymer 1”, “small molecule 1”) and oseltamivir, which is an existing drug. It was confirmed (FIG. 14).
（実施例３：ウシ初乳由来のタンパク質画分の作用機構の検討１）
ノイラミニダーゼ阻害剤である既存薬のオセルタミビル（タミフル）及びザナミビル（リレンザ）はウイルスの宿主細胞からの出芽時に作用すること、また、Ｍ２イオンチャンネル阻害剤である既存薬のアマンタジン塩酸塩はウイルスの脱殻時に作用することを、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系で確認した（図１５）。更に、限外ろ過素材（高画分２）の各溶出画分について、インフルエンザウイルス感染の生活環における作用を検討した結果、いずれの溶出画分もウイルスの宿主細胞からの出芽時に作用していることを確認した（図５）。そこで、実施例１で得られた精製度を高めたウシ初乳由来のタンパク質画分（「高分子１」、「低分子１」）が、インフルエンザウイルス感染の生活環におけるいずれの過程において作用するものであるかを検討した。
後述する［抗インフルエンザウイルス活性の評価方法］に記載の通り、インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）をＭＤＣＫ細胞に１時間感作させ、ウイルスを細胞に取り込ませることで感染が成立する。この感染時、若しくは感染後、又は、感染時及び感染後に、ウシ初乳由来のタンパク質画分（試料）を添加し、いずれの時期の添加によりウイルスを抑制する効果を発揮するかを調べた。図１５中、「（＋）・（−）」は感染時に試料添加、感染後に試料無添加とした群を示し、「（−）・（＋）」は感染時に試料無添加、感染後に試料添加とした群を示し、「（＋）・（＋）」は感染時に試料添加、感染後にも試料添加とした群を示す。
結果、ウシ初乳由来のタンパク質画分は、感染後に添加することで、より強い抗インフルエンザウイルス活性を示すことが確認された（図１５）。このことから、ウシ初乳由来のタンパク質画分は、インフルエンザウイルスが細胞に感染する過程ではなく、インフルエンザウイルスが細胞に感染した後の、増殖（脱殻以降）の過程において作用するものと考えられる。
(Example 3: Examination of action mechanism of protein fraction derived from bovine colostrum 1)
The neuraminidase inhibitors oseltamivir (Tamiflu) and zanamivir (Relenza) act at the time of budding from the host cells of the virus, and the amantadine hydrochloride, an M2 ion channel inhibitor, acts during the unshelling of the virus. The action was confirmed in an in vitro system (FIG. 15). Furthermore, as a result of examining the action of each elution fraction of the ultrafiltration material (high fraction 2) in the life cycle of influenza virus infection, all elution fractions act at the time of budding from the host cell of the virus. This was confirmed (FIG. 5). Thus, the protein fraction derived from bovine colostrum obtained in Example 1 (“polymer 1”, “small molecule 1”) acts in any process in the life cycle of influenza virus infection. We examined whether it was a thing.
As described in [Method for evaluating anti-influenza virus activity] described later, infection is established by sensitizing an influenza virus (A / PR / 8/34) to MDCK cells for 1 hour and incorporating the virus into the cells. A protein fraction (sample) derived from bovine colostrum was added at the time of infection, after infection, or at the time of infection and after infection, and it was examined whether the effect of suppressing the virus was exhibited by any addition. In FIG. 15, “(+) · (−)” indicates a group in which the sample was added at the time of infection and no sample was added after the infection. “(+) · (+)” Indicates a group to which a sample was added at the time of infection and a sample was added after the infection.
As a result, it was confirmed that the protein fraction derived from bovine colostrum exhibits stronger anti-influenza virus activity when added after infection (FIG. 15). From this, it is considered that the protein fraction derived from bovine colostrum acts not in the process of infecting cells with influenza virus but in the process of proliferation (after shelling) after the infection of cells with influenza virus.
（実施例４：ウシ初乳由来のタンパク質画分の作用機構の検討２）
前記したように、既存薬のオセルタミビル（タミフル）及びザナミビル（リレンザ）は選択的ノイラミニダーゼ阻害剤であり、成熟ウイルスが感染細胞から遊離する、増殖の最後の過程に作用することが報告されている。前記実施例３の結果から、実施例１で得られたウシ初乳由来のタンパク質画分（「高分子１」、「低分子１」）は、インフルエンザウイルスの感染後に添加することで、より強い抗インフルエンザウイルス活性を示すことが確認されたことから、本実施例４では、更に、実施例１で得られたウシ初乳由来のタンパク質画分（「高分子１」、「低分子１」）の感染後の添加時間の変化が、抗インフルエンザウイルス活性に与える影響について検討した。
後述する［抗インフルエンザウイルス活性の評価方法］に従い、インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）をＭＤＣＫ細胞に１時間感作させてウイルスを細胞に感染させた後、図１６に示すように感染後の各時間帯でウシ初乳由来のタンパク質画分（試料）を添加し、いずれの時期の添加によりウイルスを抑制する効果を発揮するかを調べた。図１６中、「（−）・（＋）」は感染時に試料無添加、感染後に試料添加としたことを示す。
結果、ウシ初乳由来のタンパク質画分は、感染後、早期に添加するほど、強い抗インフルエンザウイルス活性を示す傾向にあることが確認された（図１６）。
オセルタミビルは、動物での薬効試験で感染後４８時間〜６０時間までの投与で効果があること、ザナミビルは、細胞での効果試験で感染後４時間までの投与ではウイルスを完全に抑制し、それ以降１２時間までは効果が持続することが報告されていることを考慮すると、本発明におけるウシ初乳由来のタンパク質画分の作用機構は、オセルタミビル、ザナミビルと類似していることが考えられる。
(Example 4: Study 2 on the mechanism of action of protein fraction derived from bovine colostrum)
As described above, the existing drugs oseltamivir (Tamiflu) and zanamivir (Relenza) are selective neuraminidase inhibitors, and have been reported to act on the final process of growth in which mature viruses are released from infected cells. From the results of Example 3, the protein fraction derived from bovine colostrum obtained in Example 1 (“polymer 1”, “small molecule 1”) is stronger when added after infection with influenza virus. Since it was confirmed that anti-influenza virus activity was exhibited, in Example 4, protein fractions derived from bovine colostrum obtained in Example 1 (“polymer 1”, “small molecule 1”) were further obtained. The effects of changes in the addition time after infection on anti-influenza virus activity were examined.
In accordance with [Method for evaluating anti-influenza virus activity] to be described later, influenza virus (A / PR / 8/34) is sensitized to MDCK cells for 1 hour to infect the cells with the virus, and then as shown in FIG. A protein fraction (sample) derived from bovine colostrum was added at each subsequent time zone, and it was examined which addition of the protein fraction exhibited the effect of suppressing the virus. In FIG. 16, “(−) · (+)” indicates that the sample was not added at the time of infection and the sample was added after the infection.
As a result, it was confirmed that the protein fraction derived from bovine colostrum tended to exhibit stronger anti-influenza virus activity as it was added earlier after infection (FIG. 16).
Oseltamivir is effective when administered for 48 to 60 hours after infection in a medicinal effect test in animals, and zanamivir completely suppresses virus when administered for 4 hours after infection in a cell effect test. Considering that it is reported that the effect lasts for 12 hours thereafter, it is considered that the action mechanism of the protein fraction derived from bovine colostrum in the present invention is similar to that of oseltamivir and zanamivir.
［抗インフルエンザウイルス活性の評価方法］
前記各実施例において、各タンパク質画分（被検試料）の抗インフルエンザウイルス活性は、プラック測定（ＰＦＵ Ａｓｓａｙ）により評価した。マイクロプレート上で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養したＭＤＣＫ細胞（イヌ腎上皮細胞）モノレーヤーに、１０倍希釈法で調整したインフルエンザウイルス株を加え、１時間インキュベートして感染させた。感染後、感染に使用したウイルス液を除去し、被検試料を０．１〜１００μｇ／ｍｌの範囲で加えたアガロースをプレートに重層し、完全に凝固した後、３日間培養した。なお、実施例３で、感染時に被検試料を添加する場合には、被検試料を０．１〜１００μｇ／ｍｌの範囲で加えたウイルス液を用い、感染させた。また、実施例３では、感染時及び感染後の両段階で被検試料を添加する条件でも実施した（実施例１の図５に関しても同様）。なお、対照試料として、オセルタミビル（商品名：タミフル、中外製薬株式会社）、ザナミビル（商品名：リレンザ、グラクソ・スミスクライン株式会社）、アマンタジン（商品名：Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ＳＩＧＭＡ製）を適宜使用した。
被検試料（対照試料）無添加時の平均プラック数に対する、被検試料（対照試料）添加時の平均プラック数の割合を算出し、ウイルス抑制率（％）を求めた。なお、ウイルス抑制率（％）が５０％を示す被検試料（対照試料）の濃度をＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）とした。
ウイルス抑制率（％）＝１００−（被検試料（対照試料）添加時のプラック数／被検試料（対照試料）無添加時のプラック数）×１００
[Method for evaluating anti-influenza virus activity]
In each of the above Examples, the anti-influenza virus activity of each protein fraction (test sample) was evaluated by plaque measurement (PFU Assay). Influenza virus strains prepared by a 10-fold dilution method were added to MDCK cells (canine kidney epithelial cells) monolayers cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 on a microplate, and incubated for 1 hour for infection. After the infection, the virus solution used for the infection was removed, and agarose added with a test sample in the range of 0.1 to 100 μg / ml was overlaid on the plate, completely coagulated, and cultured for 3 days. In addition, in Example 3, when adding a test sample at the time of infection, it infected using the virus liquid which added the test sample in the range of 0.1-100 microgram / ml. Moreover, in Example 3, it implemented also on the conditions which add a test sample at both the stage at the time of infection and after infection (same also about FIG. 5 of Example 1). As control samples, oseltamivir (trade name: Tamiflu, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), zanamivir (trade name: Relenza, GlaxoSmithKline Co., Ltd.), and amantadine (trade name: manufactured by Amantadine hydrochloride SIGMA) were used as appropriate.
The ratio of the average number of plaques when the test sample (control sample) was added to the average number of plaques when the test sample (control sample) was not added was calculated to determine the virus inhibition rate (%). The concentration of the test sample (control sample) having a virus inhibition rate (%) of 50% was defined as IC 50 (μg / ml).
Virus inhibition rate (%) = 100− (number of plaques when test sample (control sample) is added / number of plaques when test sample (control sample) is not added) × 100
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、現在インフルエンザ薬として使用認可されているアマンタジン塩酸塩（シントメル）、オセルタミビル（タミフル）及びザナミビル（リレンザ）に匹敵する強い抗インフルエンザウイルス活性を有するものであり、新たなインフルエンザ薬として、臨床応用の可能性が期待されるものである。 The anti-influenza virus agent of the present invention has a strong anti-influenza virus activity comparable to amantadine hydrochloride (Sintomer), oseltamivir (Tamiflu), and zanamivir (Relenza) currently approved for use as influenza drugs. As an influenza drug, the possibility of clinical application is expected.
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