JP2009189283A - Reagent for detecting mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacterium - Google Patents
Reagent for detecting mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacterium Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009189283A JP2009189283A JP2008032474A JP2008032474A JP2009189283A JP 2009189283 A JP2009189283 A JP 2009189283A JP 2008032474 A JP2008032474 A JP 2008032474A JP 2008032474 A JP2008032474 A JP 2008032474A JP 2009189283 A JP2009189283 A JP 2009189283A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rpob gene
- base sequence
- wild
- seq
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 title claims abstract description 49
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 title abstract description 4
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 65
- 241000186363 Mycobacterium kansasii Species 0.000 claims abstract description 21
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 155
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 63
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 claims description 63
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 claims description 63
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 55
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 47
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 45
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 25
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 108700021469 Mycobacterium tuberculosis rpoB Proteins 0.000 claims description 9
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 230000001458 anti-acid effect Effects 0.000 claims description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims description 4
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 abstract description 8
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 abstract description 5
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 29
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 238000011161 development Methods 0.000 description 15
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 241001502334 Mycobacterium avium complex bacterium Species 0.000 description 8
- AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N ethambutol Chemical compound CC[C@@H](CO)NCCN[C@@H](CC)CO AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 8
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 8
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 7
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 7
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 229960000285 ethambutol Drugs 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 108010064250 RNA polymerase beta subunit Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 3
- 239000007769 metal material Substances 0.000 description 3
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 241000513886 Mycobacterium avium complex (MAC) Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 2
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 2
- 229940072185 drug for treatment of tuberculosis Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 2
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108700043532 RpoB Proteins 0.000 description 1
- BNIYQCLQHWERAB-UHFFFAOYSA-N S1C(C=CC=CC=C1)C(=O)O.NC(=N)N Chemical compound S1C(C=CC=CC=C1)C(=O)O.NC(=N)N BNIYQCLQHWERAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006087 Silane Coupling Agent Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- FEVWXNHNUKCNMX-UHFFFAOYSA-N amino(ethoxy)silicon Chemical compound CCO[Si]N FEVWXNHNUKCNMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229920002851 polycationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QQQSFSZALRVCSZ-UHFFFAOYSA-N triethoxysilane Chemical compound CCO[SiH](OCC)OCC QQQSFSZALRVCSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YUYCVXFAYWRXLS-UHFFFAOYSA-N trimethoxysilane Chemical compound CO[SiH](OC)OC YUYCVXFAYWRXLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、抗酸菌の同定に関し、特に、結核菌と非結核性抗酸菌とを同時に同定するための検出試薬に関する。 The present invention relates to identification of acid-fast bacteria, and more particularly to a detection reagent for simultaneously identifying tuberculosis bacteria and non-tuberculous acid-fast bacteria.
非結核性抗酸菌症は、感染すると発熱、咳、痰、血痰、体重減少などの症状が現れる。非結核性抗酸菌症の症状や画像所見は、結核と似ており、両者の鑑別は困難である。現在のところ、検出された菌を同定することによって診断されている。非結核性抗酸菌は、結核と違って、ヒトからヒトへと感染せず、毒力も比較的弱い。しかし、発症するとその多くは治療が難しく、慢性的に経過しながら少しずつ肺を蝕んでいくのが特徴である。 When non-tuberculous mycobacterial infection is present, symptoms such as fever, cough, sputum, blood clot, and weight loss appear. Symptoms and image findings of nontuberculous mycobacteriosis are similar to tuberculosis, and it is difficult to distinguish between them. Currently diagnosed by identifying the detected bacteria. Unlike tuberculosis, nontuberculous mycobacteria do not infect from person to person and are relatively weak in virulence. However, many of them are difficult to treat once they develop and are characterized by eroding the lungs little by little over time.
非結核性抗酸菌症の代表的な原因菌としては、M. avium complex（ＭＡＣ）およびM. kansasiiがある。ＭＡＣは、M. aviumとM. intracellulareとを一括した名称である。従来は生化学的性状で区別できなかったが、近年、遺伝子検査により分類が可能となった。これらは、ほとんどの抗結核薬に感受性がなく、難治性の感染症と考えられている。クラリスロマイシン（ＣＡＭ）に、抗結核薬であるエタンブトール（ＥＢ）とリファンピシン（ＲＦＰ）とストレプトマイシン（ＳＭ）とを併用する治療が行われている。一方、M. kansasiiは、多くの薬剤に感受性を示し、リファンピシン（ＲＦＰ）を中心に抗結核薬を使用した治療が行われ、良好な結果が報告されている。したがって、結核菌と非結核性抗酸菌との鑑別だけでなく、菌種としてM. kansasiiを同定することは、治療方針の決定ならびに予後の予測に重要である。 Representative causative bacteria of nontuberculous mycobacteriosis are M. avium complex (MAC) and M. kansasii. MAC is a name that collectively refers to M. avium and M. intracellulare. Conventionally, it could not be distinguished by biochemical properties, but in recent years it has become possible to classify by genetic testing. These are insensitive to most anti-tuberculosis drugs and are considered refractory infections. Treatment with clarithromycin (CAM) in combination with antituberculous drugs ethambutol (EB), rifampicin (RFP) and streptomycin (SM) has been performed. On the other hand, M. kansasii is sensitive to many drugs, and treatment using anti-tuberculosis drugs, mainly rifampicin (RFP), has been performed, and good results have been reported. Therefore, identification of M. kansasii as a bacterial species as well as differentiation between tuberculosis bacteria and non-tuberculous mycobacteria is important for the determination of treatment strategy and prognosis prediction.
ところで、抗酸菌は、M. tuberculosis（結核菌）に代表される結核菌群（４種類）と非結核性抗酸菌（約１００種類）とに大別され、いずれも塗抹検査（抗酸菌染色）で赤く染まる。喀痰検査に供された試料において、抗酸菌のうち７０〜５０％が結核菌であり、３０〜５０％が非結核性抗酸菌である。非結核性抗酸菌のうち、ＭＡＣは７０〜８０％およびM. kansasiiは約２０％であり、これらが大部分を占める。したがって、喀痰検査で結核菌、ＭＡＣ、およびM. kansasiiを鑑別できることが望まれる。 By the way, mycobacteria are roughly classified into M. tuberculosis group (4 types) and non-tuberculous mycobacteria (about 100 types). It is dyed red with (bacterial staining). In samples subjected to sputum testing, 70-50% of mycobacteria are tuberculosis bacteria, and 30-50% are nontuberculous mycobacteria. Of non-tuberculous mycobacteria, MAC accounts for 70-80% and M. kansasii about 20%, which accounts for the majority. Therefore, it is desirable that tuberculosis, MAC, and M. kansasii can be differentiated by sputum testing.
従来の喀痰検査においては、喀痰を前処理し、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社のアンプリコア（登録商標）マイコバクテリウムを用いて、まず結核菌であるかどうかを同定し、結核菌陰性の場合には、さらにM. aviumおよびM. intracellulare（ＭＡＣ）について同定している。結核菌陰性の場合にのみＭＡＣ検出の保点請求が可能であるからであり、結核菌群の検出をした後にＭＡＣの検出を行っている。あるいは、ジェノスカラー・Rif TB（ニプロ株式会社）を用いて、リファンピシン（ＲＦＰ）への感受性に着目してｒｐｏＢ遺伝子の変異を検出することにより結核菌およびＲＦＰ感受性を同時に検査される。この場合も、結核菌陰性の場合には、喀痰に別の前処理をした後、上記のアンプリコア（登録商標）マイコバクテリウムを用いてＭＡＣを検出する。このように、いずれの検査においても２度の検査が必要であるが、M. kansasiiを同定することはできない。 In the conventional sputum test, the sputum is pretreated and first identified as tuberculosis using Amplicor (registered trademark) Mycobacteria from Roche Diagnostics Co. Has further identified M. avium and M. intracellulare (MAC). This is because the MAC detection can be requested only when M. tuberculosis is negative, and the MAC is detected after detecting the M. tuberculosis group. Alternatively, by using Genoscalar Rif TB (Nipro Corporation) and focusing on the sensitivity to rifampicin (RFP), the mutation of the rpoB gene is detected to simultaneously test for M. tuberculosis and RFP sensitivity. In this case as well, when M. tuberculosis is negative, after pretreatment of the cocoon, MAC is detected using the above-mentioned Amplicor (registered trademark) mycobacterium. In this way, two tests are required in any test, but M. kansasii cannot be identified.
抗酸菌の同定については種々の研究が行われており、ｒｐｏＢ遺伝子の解析と１６ＳｒＲＮＡ解析とを組み合わせて、９７．４％の抗酸菌を同定したことが報告されている（非特許文献１）。しかし、喀痰検査において、これらの検査を行うことは実用的ではない。 Various studies have been conducted on the identification of acid-fast bacteria, and it has been reported that 97.4% of acid-fast bacteria have been identified by combining the analysis of rpoB gene and 16S rRNA analysis (Non-patent Document 1). ). However, it is not practical to perform these inspections in the wrinkle inspection.
薬剤耐性菌は、特定遺伝子が変異することにより薬剤耐性を獲得することが報告されている。そのため、特定遺伝子の変異を検出することによる薬剤耐性菌の検出法が開発されている。例えば、結核治療用薬剤に感受性である野生型結核菌およびいずれかの薬剤に耐性を有する変異型結核菌における結核菌ゲノム上の結核治療用薬剤耐性関連遺伝子の塩基配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドを固定化した基板を含む結核菌診断キットが開示されている（特許文献１）。現在開発されているＤＮＡマイクロアレイキット「Oligo Array」（日清紡績株式会社）は、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＦＰ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、カナマイシン（ＫＭ）、およびエタンブトール（ＥＢ）の５薬剤に対する耐性に関与する遺伝子変異を検出し得るキットである。しかし、このキットでは、非結核性抗酸菌の同定はできない。
本発明は、結核菌と非結核性抗酸菌とを一度に判定し、同時に薬剤耐性も判定するための試薬を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a reagent for determining M. tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria at the same time and simultaneously determining drug resistance.
本発明は、結核菌および非結核性抗酸菌を検出するための試験片を提供し、該試験片には、少なくとも４つのプローブが固定されており、
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、非結核性抗酸菌M. aviumのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、結核菌および他の非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、非結核性抗酸菌M. intracellulareのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、結核菌および他の非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、そして
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、非結核性抗酸菌M. kansasiiのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、結核菌および他の非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、
該プローブは、それぞれ該試験片の異なる位置に固定されている。
The present invention provides a test piece for detecting tuberculosis bacteria and non-tuberculous mycobacteria, and at least four probes are fixed to the test piece,
At least one of the probes can hybridize with any region consisting of the wild type base sequence of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis, but consists of the wild type base sequence of the rpoB gene of nontuberculous mycobacteria Consisting of oligonucleotides that cannot hybridize to any region,
At least one of the probes can hybridize to any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the nontuberculous mycobacteria M. avium, but tuberculosis and other nontuberculous antiacids An oligonucleotide that cannot hybridize to any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the fungus,
At least one of the probes can hybridize to any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the non-tuberculous mycobacteria M. intracellulare, but tuberculosis and other non-tuberculous antiacids An oligonucleotide that cannot hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the fungus, and at least one of the probes is a rpoB gene of the nontuberculous mycobacteria M. kansasii An oligonucleotide that can hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence, but cannot hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis and other non-tuberculous mycobacteria Consists of
The probes are respectively fixed at different positions on the test piece.
ある実施態様では、さらに、上記少なくとも４つのプローブとは異なるプローブであって、上記結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１つのプローブが、上記試験片の異なる位置に固定されている。 In one embodiment, the probe further comprises at least one probe different from the at least four probes, the oligonucleotide consisting of an oligonucleotide capable of hybridizing with any region of the wild-type base sequence of the Mycobacterium tuberculosis rpoB gene. The test piece is fixed at a different position.
ある実施態様では、さらに、上記結核菌のｒｐｏＢ遺伝子のリファンピシン耐性変異を有する塩基配列の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１つのプローブが、上記試験片の異なる位置に固定されている。 In one embodiment, at least one probe consisting of an oligonucleotide capable of hybridizing with any region of a base sequence having a rifampicin resistance mutation in the Mycobacterium tuberculosis rpoB gene is immobilized at a different position on the test strip. Yes.
１つの実施態様では、上記結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補配列である。 In one embodiment, the oligonucleotide capable of hybridizing with any region consisting of the wild-type base sequence of the Mycobacterium tuberculosis rpoB gene is the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or its complementary sequence.
１つの実施態様では、上記非結核性抗酸菌M. aviumのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列またはその相補配列である。 In one embodiment, the oligonucleotide capable of hybridizing with any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the non-tuberculous mycobacteria M. avium is a base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing or Its complementary sequence.
１つの実施態様では、上記非結核性抗酸菌M. intracellulareのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列である。 In one embodiment, the oligonucleotide capable of hybridizing with an arbitrary region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the non-tuberculous mycobacteria M. intracellulare has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing or Its complementary sequence.
１つの実施態様では、上記非結核性抗酸菌M. kansasiiのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号４に記載の塩基配列またはその相補配列である。 In one embodiment, the oligonucleotide capable of hybridizing with an arbitrary region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the nontuberculous mycobacteria M. kansasii has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing or Its complementary sequence.
１つの実施態様では、上記少なくとも４つのプローブとは異なるプローブにおいて、上記結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号５、６、７、８、および９からなる群より選択される塩基配列またはその相補配列である。 In one embodiment, an oligonucleotide capable of hybridizing with an arbitrary region of the wild-type base sequence of the Mycobacterium tuberculosis rpoB gene in a probe different from the at least four probes is SEQ ID NO: 5, 6, A base sequence selected from the group consisting of 7, 8, and 9 or a complementary sequence thereof.
１つの実施態様では、上記結核菌のｒｐｏＢ遺伝子のリファンピシン耐性変異を有する塩基配列の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１０、１１、１２、および１３からなる群より選択される塩基配列またはその相補配列である。 In one embodiment, the oligonucleotide capable of hybridizing with any region of the base sequence having a rifampicin resistance mutation of the Mycobacterium tuberculosis rpoB gene is from the group consisting of SEQ ID NOs: 10, 11, 12, and 13 in the Sequence Listing. It is a selected base sequence or its complementary sequence.
本発明はまた、上記のいずれかの試験片を含む、結核菌および非結核性抗酸菌の検出用キットを提供する。 The present invention also provides a detection kit for tubercle bacilli and non-tuberculous mycobacteria comprising any of the above test pieces.
１つの実施態様では、上記キットは、さらに、発色用試薬およびｒｐｏＢ遺伝子増幅用プライマー対を含む。 In one embodiment, the kit further includes a coloring reagent and a primer pair for rpoB gene amplification.
ある実施態様では、上記ｒｐｏＢ遺伝子増幅用プライマー対は、配列表の配列番号１４、１６、１７および１９からなる群より選択されるフォワードプライマーと、配列表の配列番号１５、１８および２０からなる群より選択されるリバースプライマーである。 In one embodiment, the rpoB gene amplification primer pair is a forward primer selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14, 16, 17 and 19 in the sequence listing; and a group consisting of SEQ ID NOs: 15, 18 and 20 in the sequence listing It is a reverse primer selected more.
本発明はさらに、結核菌および非結核性抗酸菌を検出する方法を提供し、該方法は、
試料中の結核菌および非結核性抗酸菌のｒｐｏＢ遺伝子を抽出する工程、
該抽出したｒｐｏＢ遺伝子を上記のいずれかの試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
該プローブに結合したｒｐｏＢ遺伝子を発色させる工程
を含む。
The present invention further provides a method for detecting Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria, the method comprising:
Extracting the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria in the sample;
Bringing the extracted rpoB gene into contact with any of the test strips described above and binding to the probe fixed to the test strip; and developing the rpoB gene bound to the probe.
１つの実施態様では、上記ｒｐｏＢ遺伝子を抽出する工程は、
配列表の配列番号１４および１６のフォワードプライマーと配列表の配列番号１５のリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程、および
得られたＰＣＲ増幅産物について、配列表の配列番号１７および１９のフォワードプライマーと配列表の配列番号１８および２０のリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程、
を含む。
In one embodiment, the step of extracting the rpoB gene comprises
A step of performing PCR using the forward primer of SEQ ID NO: 14 and 16 of the sequence listing and the reverse primer of SEQ ID NO: 15 of the sequence listing; and the obtained PCR amplification product, the forward primer of SEQ ID NO: 17 and 19 of the sequence listing And a step of performing PCR using the reverse primers of SEQ ID NOS: 18 and 20 in the sequence listing,
including.
本発明によれば、結核菌と非結核性抗酸菌とを一度に判定することができる。さらに、同時に薬剤感受性（特に、リファンピシン感受性）も判定することもできる。したがって、検査において、簡便に治療方針の決定ならびに予後の予測を行うことができる。 According to the present invention, tuberculosis bacteria and nontuberculous mycobacteria can be determined at a time. Furthermore, drug sensitivity (particularly, rifampicin sensitivity) can also be determined. Therefore, in the examination, it is possible to easily determine the treatment policy and predict the prognosis.
本発明において、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のリファンピシン（ＲＦＰ）感受性遺伝子とは、結核治療用薬剤リファンピシン（ＲＦＰ）の作用に関連する遺伝子をいう。ＲＦＰ耐性菌では、この野生型のＲＦＰ感受性遺伝子に変異が生じ、ＲＦＰの作用に対する薬剤耐性が獲得される。具体的には、変異を持つＲＦＰ感受性遺伝子から発現した酵素では、構成するアミノ酸配列において置換、挿入および／または欠落が生じているため、酵素活性の低下や薬剤結合部位の構造変化が生じ、ＲＦＰの効果が抑制される。 In the present invention, the rifampicin (RFP) susceptibility gene of Mycobacterium tuberculosis refers to a gene related to the action of the drug for the treatment of tuberculosis rifampicin (RFP). In RFP-resistant bacteria, a mutation occurs in this wild-type RFP-sensitive gene, and drug resistance to the action of RFP is acquired. Specifically, in an enzyme expressed from an RFP-sensitive gene having a mutation, substitution, insertion, and / or deletion occurs in the constituent amino acid sequence, resulting in a decrease in enzyme activity and a structural change in the drug binding site. The effect of is suppressed.
結核菌のＲＦＰ耐性は、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子の変異により生じ得る。野生型の結核菌が保有するｒｐｏＢ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号２１に記載の塩基配列またはその相補的な配列である。配列番号２１に記載の塩基配列１位〜３位の塩基ＧＴＧはタンパク質合成の開始コドンに該当し、３５３２位〜３５３４位は終止コドンに該当する。すなわち、この１〜３５３４位はＲＮＡポリメラーゼβサブユニットのコード配列であり、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２に示すとおりである。 Mycobacterium tuberculosis resistance to RFP can be caused by mutations in the rpoB gene encoding the RNA polymerase β subunit. The base sequence of the rpoB gene possessed by the wild-type M. tuberculosis is the base sequence set forth in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing or a complementary sequence thereof. The base GTG at the 1st to 3rd positions of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 corresponds to the start codon for protein synthesis, and the positions 3532 to 3534 correspond to the stop codon. That is, positions 1 to 3534 are the coding sequence of the RNA polymerase β subunit, and the amino acid sequence of the RNA polymerase β subunit is as shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
ＲＦＰ耐性菌となり得るｒｐｏＢ遺伝子の変異の位置は、配列表の配列番号２１に記載の塩基配列のコード配列中（１位から３５３４位まで）に存在し得るｒｐｏＢ遺伝子の変異が挙げられる。ＲＦＰ耐性を誘導するｒｐｏＢ遺伝子の変異は既知のものが多数存在しており、これらは、例えば、非特許文献２に開示されている。これらの変異のうち、いずれか１つの変異があれば、ＲＦＰ耐性結核菌となり得る。
Examples of the position of the mutation of the rpoB gene that can be an RFP-resistant bacterium include the mutation of the rpoB gene that can be present in the coding sequence of the base sequence described in SEQ ID NO: 21 of the Sequence Listing (from position 1 to position 3534). There are many known mutations in the rpoB gene that induce RFP resistance, and these are disclosed in
結核菌のｒｐｏＢ遺伝子において、ＲＦＰ耐性に関与する変異を有する塩基配列があり、かつ非結核性抗酸菌のｒｐｏＢ遺伝子との相同性が比較的低い領域として、例えば、配列表の配列番号２１に記載の塩基配列のコード配列の１３２２位から１７４１位までの塩基配列（４２０塩基：配列表の配列番号２３として示す）が挙げられる。この領域に対応する非結核性抗酸菌のｒｐｏＢ遺伝子の塩基配列は、M. aviumは配列表の配列番号２４に、M. intracellulareは配列表の配列番号２５に、およびM. kansasiiは配列表の配列番号２６にそれぞれ示す。本明細書においては、非結核性抗酸菌については、代表的な原因菌であるM. avium complex（ＭＡＣ）およびM. kansasiiについて詳細に説明するが、他の非結核性抗酸菌についても、同様に任意の領域を設定できる。 In the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis, a region having a base sequence having a mutation involved in RFP resistance and having a relatively low homology with the rpoB gene of nontuberculous mycobacteria is, for example, shown in SEQ ID NO: 21 of the Sequence Listing. Examples include base sequences from position 1322 to position 1741 (420 bases: shown as SEQ ID NO: 23 in the sequence listing) of the coding sequence of the described base sequence. The base sequence of the rpoB gene of nontuberculous mycobacteria corresponding to this region is as follows: M. avium is SEQ ID NO: 24, M. intracellulare is SEQ ID NO: 25, and M. kansasii is SEQ ID NO: 24. Are shown in SEQ ID NO: 26, respectively. In this specification, the non-tuberculous mycobacteria will be described in detail with respect to representative causative bacteria M. avium complex (MAC) and M. kansasii, but other non-tuberculous mycobacteria are also described. Similarly, any area can be set.
ｒｐｏＢ遺伝子上の上記変異を検出する方法としては、Nollauら, Clin. Chem., 43, 1114-1120 (1997)、「突然変異検出のための研究室プロトコル」（Landegren, U.ら, Oxford University Press (1996)）、および「ＰＣＲ」第２版（Newtonら, BIOS Scientific Publishers Limited (1997)）などに記載されている通常用いられる手段が適用できる。具体的には、例えば、ＰＣＲ断片シークエンシング法、一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ法：Orita, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(8), 2766-2770 (1989)）、ヘテロ二本鎖変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法：Sheffield, V. C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(1), 232-236 (1989)）、インベーダー法（Griffin, T. J.ら, Trend Biotech, 18, 77 (2000)）、ＳｎｉＰｅｒＴＭ法（Amersham pharmacia biotech）、タックマンＰＣＲ法（Livak, K. J., Genel. Anal., 14, 143 (1999)；Morris, T.ら, J. Clin. Microbiol., 34, 2933(1996)）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Griffin, T. J.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96(11), 6301-6 (1999)）、制限酵素長多型解析法（ＲＦＬＰ：Murray, J. C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80(19), 5951-5955 (1983)）、ＤＮＡチップハイブリダイゼーション法（Kokoris, K.ら, J. Med. Genet., 36, 730 (1999)）、ＭａｓｓｃｏｄｅＴＭ法（Qiagen Genomics）などに例示される公知の方法から選択され得るが、これらに限定されるものではない。遺伝子変異を検出する方法であれば、あらゆる手段を適用することができる。例えば、ＰＣＲ−配列特異的オリゴプローブ（ＳＳＯＰ：sequence-specific oligonucleotide probes）法を用いることもできる。ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法とは、変異部位を含む約１０〜約３０塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的なプローブを作製し、変異部位を含むＤＮＡをＰＣＲ法によりで増幅した後、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。 As a method for detecting the above mutation on the rpoB gene, Nollau et al., Clin. Chem., 43, 1114-1120 (1997), “Laboratory protocol for mutation detection” (Landegren, U. et al., Oxford University). Press (1996)), and “PCR” 2nd edition (Newton et al., BIOS Scientific Publishers Limited (1997)) and the like can be applied. Specifically, for example, PCR fragment sequencing method, single-stranded conformation polymorphism method (SSCP method: Orita, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86 (8), 2766- 2770 (1989)), heteroduplex denaturing agent gradient gel electrophoresis (DGGE method: Sheffield, VC et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86 (1), 232-236 (1989)) Invader method (Griffin, TJ et al., Trend Biotech, 18, 77 (2000)), SniPer ™ method (Amersham pharmacia biotech), Tackman PCR method (Livak, KJ, Genel. Anal., 14, 143 (1999); Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2933 (1996)), MALDI-TOF / MS method (Griffin, TJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96 (11), 6301-6 (1999)), restriction enzyme length polymorphism analysis method (RFLP: Murray, JC et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80 (19), 5951-5955 (1983)), DNA chip hybridization method ( Kokoris, K. et al., J. Med. Genet., 36, 730 (1999)), Masscode TM method (Q iagen Genomics) and the like, but can be selected from, but not limited to, known methods. Any means can be applied as long as it is a method for detecting a gene mutation. For example, the PCR-sequence-specific oligonucleotide probes (SSOP) method can also be used. The PCR-SSOP method is a method in which a probe that is completely complementary to one allele sequence of about 10 to about 30 bases including a mutation site is prepared, DNA containing the mutation site is amplified by the PCR method, and then hybridized. This is a method for discriminating gene polymorphism based on the presence or absence of hybridization.
（プローブ）
本発明の結核菌および非結核性抗酸菌ならびに必要に応じてＲＦＰ感受性を検出するための試験片に用いられるプローブとしては、結核菌および非結核性抗酸菌のそれぞれの野生型のｒｐｏＢ遺伝子の任意の領域に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「野生型プローブ」という場合がある）、ならびに結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の変異を有する領域と結合し得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「変異プローブ」という場合がある）が挙げられる。各プローブの長さは、結合（ハイブリダイズ）させる時の温度にもよるが、一般的には１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜２６ヌクレオチド長である。
(probe)
As the probe used for the tubercle bacilli and nontuberculous mycobacteria of the present invention and, if necessary, the test piece for detecting RFP sensitivity, the wild-type rpoB gene of each of tuberculosis and nontuberculous mycobacteria Oligonucleotide probe (hereinafter sometimes referred to as “wild type probe”), as well as an oligonucleotide probe capable of binding to a region having a mutation in the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis (hereinafter referred to as “mutation probe”) In some cases). The length of each probe is generally 10 to 30 nucleotides, preferably 12 to 26 nucleotides, although it depends on the temperature at which it is bound (hybridized).
本発明においては、結核菌および非結核性抗酸菌の野生型プローブは、互いに他の菌の塩基配列の領域とハイブリダイズしない。例えば、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズする野生型プローブは、非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ず；非結核性抗酸菌M. aviumのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズする野生型プローブは、結核菌および他の非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ず；非結核性抗酸菌M. intracellulareのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズする野生型プローブは、結核菌および他の非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ず；そして非結核性抗酸菌M. kansasiiのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズする野生型プローブは、結核菌および他の非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ない。言い換えれば、野生型プローブは、それぞれの菌のｒｐｏＢ遺伝子に特異的にハイブリダイズする。 In the present invention, the wild-type probes of Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria do not hybridize with each other in the region of the base sequence of other bacteria. For example, a wild-type probe that hybridizes with an arbitrary region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis hybridizes with an arbitrary region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of non-tuberculous mycobacteria. No; a wild-type probe that hybridizes with any region consisting of the wild-type base sequence of the non-tuberculous mycobacterial M. avium rpoB gene is the RpoB gene of Mycobacterium tuberculosis and other non-tuberculous mycobacteria. Unable to hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence; a wild-type probe that hybridizes to any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the non-tuberculous mycobacteria M. intracellulare is Cannot hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of other nontuberculous mycobacteria; and rpoB inheritance of nontuberculous mycobacteria M. kansasii A wild-type probe that hybridizes with any region consisting of the wild-type nucleotide sequence cannot hybridize with any region consisting of the wild-type nucleotide sequence of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis and other non-tuberculous mycobacteria. . In other words, the wild-type probe specifically hybridizes to the rpoB gene of each bacterium.
また、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズする野生型プローブは複数存在することが好ましい。１つのプローブ以外は、変異プローブの検出との対比を明確にするために、変異プローブと同じ領域またはほぼ重複する領域にハイブリダイズするように設計することが好ましい。 Moreover, it is preferable that there are a plurality of wild-type probes that hybridize with an arbitrary region consisting of the wild-type base sequence of the tuberculosis rpoB gene. In order to clarify the comparison with the detection of the mutant probe except for one probe, it is preferable that the probe is designed to hybridize to the same region or a substantially overlapping region as the mutant probe.
本発明において、変異プローブは、ＲＦＰ耐性変異を有する領域に結合（ハイブリダイズ）可能であり、このような変異を有する領域は、変異以外の塩基の配列は野生型である。この領域が野生型である場合ならびに他の変異を含む場合には、変異プローブはこの領域に結合できない。また、確実に変異を認識するために、変異プローブを構成するオリゴヌクレオチドの中程に変異の位置が存在するように設計することが好ましい。 In the present invention, the mutation probe can bind (hybridize) to a region having an RFP resistance mutation, and the region having such a mutation has a wild-type sequence other than the mutation. Mutation probes cannot bind to this region if this region is wild type as well as containing other mutations. Moreover, in order to recognize a mutation reliably, it is preferable to design so that the position of the mutation exists in the middle of the oligonucleotide constituting the mutation probe.
本発明において、野生型プローブは、野生型のｒｐｏＢ遺伝子の任意の領域と結合し得る。ＲＦＰ感受性を検出するためには、少なくともＲＦＰ耐性菌に関連する上記の変異をもれなく検出することが重要である。そこで、本発明において、好適には、野生型プローブは、変異プローブがハイブリダイズする領域のほぼ全体を網羅するように設計される。例えば、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子については、配列表の配列番号２３に記載の塩基配列の２０５位から２８１位またはこれに相補的な塩基配列のコード配列のほぼ全体を網羅するように、合計７７塩基に結合（ハイブリダイズ）可能なように設計される。 In the present invention, the wild-type probe can bind to any region of the wild-type rpoB gene. In order to detect RFP sensitivity, it is important to detect at least all the mutations associated with RFP-resistant bacteria. Therefore, in the present invention, the wild-type probe is preferably designed so as to cover almost the entire region to which the mutant probe hybridizes. For example, the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis has a total of 77 bases so as to cover almost the entire coding sequence of the base sequence 205 to 281 of the base sequence described in SEQ ID NO: 23 of the sequence listing or a base sequence complementary thereto. Designed to be capable of binding (hybridizing) to
例えば、隣接するプローブと約４〜７塩基重なるように配置すれば、その配置する領域の境界位置に変異が存在したとしても、どちらかのプローブが結合することができるので、好ましい。したがって、例えば、合計６７塩基を検出するための全プローブ数は、全てのプローブの長さを２０に統一し、各プローブが隣接するプローブと４塩基ずつ重なると想定すれば、少なくとも４個以上であり、好ましくは５個以上である。 For example, it is preferable to arrange it so that it overlaps with an adjacent probe by about 4 to 7 bases, since either probe can bind even if there is a mutation at the boundary position of the arranged region. Thus, for example, the total number of probes for detecting a total of 67 bases is at least 4 or more, assuming that all probe lengths are unified to 20 and that each probe overlaps 4 adjacent bases. Yes, preferably 5 or more.
上記の各プローブは、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社）を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。 Each of the above probes can be obtained by using a standard program and primer analysis software such as Primer Express (Perkin Elmer), and can be synthesized using a standard method such as an automated oligonucleotide synthesizer. .
さらに、各プローブは、以下で詳述するように、試験片に固定するために５’または３’末端のいずれか一方が修飾されていてもよい。 In addition, each probe may be modified at either the 5 'or 3' end for immobilization to a test strip, as described in detail below.
（試験片）
本発明の、結核菌および非結核性抗酸菌ならびに必要に応じてＲＦＰ感受性を検出するための試験片は、少なくとも４つのプローブが固定されている。固定されているプローブのうちの少なくとも１つのプローブは、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域と特異的にハイブリダイズし得、少なくとも１つのプローブは、非結核性抗酸菌M. aviumのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域と特異的にハイブリダイズし得、少なくとも１つのプローブは、非結核性抗酸菌M. intracellulareのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域と特異的にハイブリダイズし得、少なくとも１つのプローブは、非結核性抗酸菌M. kansasiiのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域と特異的にハイブリダイズし得、そして各プローブは、それぞれ試験片の異なる位置に固定されている。
(Test pieces)
At least four probes are fixed to the test piece for detecting M. tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria and, if necessary, RFP sensitivity of the present invention. At least one of the immobilized probes can specifically hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis, and at least one probe is non-tuberculous mycobacteria It can hybridize specifically with any region consisting of the wild-type base sequence of the M. avium rpoB gene, and at least one probe consists of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the nontuberculous mycobacteria M. intracellulare Can hybridize specifically with any region, at least one probe can specifically hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the nontuberculous mycobacteria M. kansasii, and Each probe is fixed at a different position on the test piece.
上記のように、好適には、試験片に固定された結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の野生型プローブは、上記の少なくとも４つのプローブとは異なるプローブであって、ＲＦＰ耐性変異を有する領域のほぼ全体を網羅するように設計されており、より好適には、プローブは、結合する塩基配列の順に上流側または下流側から一定の間隔で配置されている。さらに、発色を確認するためのコントロールまたはマーカーが固定されていてもよい。 As described above, preferably, the wild-type probe of the Mycobacterium tuberculosis rpoB gene fixed to the test piece is a probe different from the above-mentioned at least four probes, and covers almost the entire region having an RFP resistance mutation. More preferably, the probes are arranged at regular intervals from the upstream side or the downstream side in the order of the base sequences to be bound. Furthermore, a control or marker for confirming color development may be fixed.
さらに好適には、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子のＲＦＰ耐性変異を有する塩基配列の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１つのプローブが、試験片の異なる位置に固定されている。 More preferably, at least one probe composed of an oligonucleotide capable of hybridizing with any region of the base sequence having an RFP resistance mutation of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis is immobilized at a different position on the test piece.
本発明の試験片は、上記プローブを担体表面上に物理的または化学的に固定して作成することができる。担体としては、ビニル系ポリマー、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ニトロセルロースなどの有機材料；ガラス、シリカなどの無機材料；金、銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されない。成形加工性が容易である点で、有機材料が好ましく、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類がより好ましい。これらの担体は、発色法での検知において、その発色を視認しやすくするために白色であることが好ましい。 The test piece of the present invention can be prepared by physically or chemically fixing the probe on the surface of the carrier. Examples of the carrier include organic materials such as vinyl polymer, nylon, polyester, polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene terephthalate, and nitrocellulose; inorganic materials such as glass and silica; metal materials such as gold and silver, and the like. Not. An organic material is preferable in terms of easy molding processability, and polyesters such as polyethylene terephthalate are more preferable. These carriers are preferably white in order to make the color development easily visible in the detection by the color development method.
上記プローブは、種類ごとに一定間隔で上記担体に配置される。これらの担体表面にプローブを物理的に固定化する方法としては、公知の種々の方法が用いられる。例えば、担体表面をポリリジンなどのポリカチオン性の高分子で被覆する方法があり、この方法によれば、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる。プローブの末端に無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、固定されるプローブ自体の分子量を増大させることによって、固定化の効率を上げる方法もある。例えば、ポリチミン付加オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液をディスペンサからニトロセルロース膜上に吐出して、紫外線を照射することによって、比較的容易に種々のプローブを固定化することができる。具体的には、各プローブをそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．５〜１．０μＬ／分の量を吐出させながら２．５〜８．５ｍｍ／秒の塗布速度で、それぞれ一定の間隔をあけてニトロセルロース膜上に塗布すると、各プローブが、一定の間隔で並んだ約１〜２ｍｍの幅のストライプとして塗布される。このプローブのストライプが塗布された担体に紫外線を照射することによって、プローブが担体上に固定される。さらに、必要に応じて、これらのストライプを横断するように細く切断すると、各プローブが順に配置された多数の試験片を一挙に得ることができる。 The probes are arranged on the carrier at regular intervals for each type. As a method for physically immobilizing the probe on the surface of these carriers, various known methods are used. For example, there is a method of coating the carrier surface with a polycationic polymer such as polylysine. According to this method, the efficiency of immobilization can be increased by electrostatic interaction with a probe that is a polyanion. There is also a method of increasing the efficiency of immobilization by adding an irrelevant base sequence (such as a polythymine chain) to the end of the probe and increasing the molecular weight of the immobilized probe itself. For example, various probes can be immobilized relatively easily by discharging a solution containing a polythymine-added oligonucleotide probe from a dispenser onto a nitrocellulose membrane and irradiating with ultraviolet rays. Specifically, each probe is placed in a dispenser equipped with a 24-gauge needle, and an amount of 0.5 to 1.0 μL / min is discharged at a coating speed of 2.5 to 8.5 mm / sec. When applied on the nitrocellulose membrane at regular intervals, each probe is applied as a stripe having a width of approximately 1 to 2 mm arranged at regular intervals. The probe is fixed on the carrier by irradiating the carrier coated with the stripe of the probe with ultraviolet rays. Furthermore, if necessary, if a thin cut is made so as to cross these stripes, a large number of test pieces in which the probes are arranged in sequence can be obtained at a time.
担体表面が金などの金属材料である場合には、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで担体表面を処理することにより、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用を介して固定化の効率がよくなることも知られている。 When the carrier surface is a metal material such as gold, the surface of the carrier is treated with a thiol having an amino group such as 2-aminoethanethiol or a disulfide compound, thereby causing electrostatic interaction with the probe which is a polyanion. It is also known that the efficiency of immobilization is improved.
プローブに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、公知の種々の方法が用いられる。例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、プローブの末端をトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基で修飾する方法があり、修飾プローブを含む溶液に担体を２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することにより試験片が得られる。あるいは、ガラス、シリコンなどの無機材料担体をアミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、担体の表面をアミノ化し、次いで、末端にカルボン酸を導入したプローブとアミノカップリング反応させることにより、プローブを固定化する方法もある。さらに、担体の材料が金、銀などの金属材料の場合には、プローブの末端をチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基で修飾し、この修飾プローブを含む溶液に担体を２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することにより固定化することができる。 As a method for chemically immobilizing a probe by introducing a functional group, various known methods are used. For example, when the carrier material is an inorganic material such as glass or silicon, there is a method of modifying the end of the probe with a functional group capable of silane coupling reaction such as trimethoxysilane or triethoxysilane. A test piece is obtained by immersing the carrier in the solution to be contained for 24 to 48 hours, taking it out, and washing it. Alternatively, by treating an inorganic material carrier such as glass or silicon with a silane coupling agent having an amino group such as aminoethoxysilane, the surface of the carrier is aminated, and then a probe having an carboxylic acid introduced at the terminal and an aminocup There is also a method of immobilizing the probe by ring reaction. Further, when the carrier material is a metal material such as gold or silver, the end of the probe is modified with a functional group capable of binding to a metal such as a thiol group or a disulfide group, and the carrier is added to a solution containing the modified probe. It can be fixed by immersing for ~ 48 hours, taking out and then washing.
また、合成されたプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、所望の配列を有するプローブを担体表面上で直接合成する方法も知られている。 There is also known a method of directly synthesizing a probe having a desired sequence on the surface of a carrier using a lithography technique instead of fixing the synthesized probe.
（試験片を用いた結核菌および非結核性抗酸菌ならびにＲＦＰ感受性の検出方法）
１．検体
本発明において、「検体」は、通常、非結核性抗酸菌検査および結核菌の薬剤感受性検査に用いる検体であればよい。例えば、喀痰、咽頭ぬぐい液、胃液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、喉からの拭取物および／または組織生検物などの体液、ならびにこれらから培養して得られた培養物などが挙げられる。
(Method for detecting M. tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria using the test piece and RFP sensitivity)
1. Specimen In the present invention, the “specimen” may generally be a specimen used for nontuberculous mycobacteria testing and tuberculosis drug susceptibility testing. For example, body fluids such as sputum, pharyngeal swab, gastric fluid, bronchoalveolar lavage fluid, intratracheal aspirate, throat wipes and / or tissue biopsy, and cultures obtained from these cultures Can be mentioned.
２．検体の前処理（ＤＮＡの抽出）
上記検体からのＤＮＡの抽出は、公知の方法で行うことができる。例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法などが挙げられる。検体を前処理したものを本明細書において「試料」という。
2. Sample pretreatment (DNA extraction)
Extraction of DNA from the specimen can be performed by a known method. Examples thereof include a phenol extraction method, a guanidine thiocinate extraction method, and a vanadyl ribonucleoside complex extraction method. A sample that has been pretreated is referred to as a “sample” in this specification.
３．核酸の増幅
ＰＣＲ法で核酸を増幅する場合、例えば、以下の工程で行われる：（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約３０秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程；（２）該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約２０秒〜１分間の反応条件で、少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程；（３）約７０〜７５℃を約２０秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程；ならびに（１）〜（３）の工程を通常の方法により２０〜４０回繰り返す工程。ｒｐｏＢ遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマー対として、任意の変異部位を含むｒｐｏＢ遺伝子を増幅し得るように、該変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と該部位よりも下流の配列とを含む、同一または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましいプライマー対の例としては、結核菌については、配列表の配列番号１７および１８のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、一方、非結核性抗酸菌については、例えば、配列表の配列番号１９および２０のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。なお、非結核性抗酸菌については、その種類によって異なる塩基配列に応じて、適切なプライマーを設計し得るが、非結核性抗酸菌用のプライマー対のうちの片側が、結核菌についてのプライマーの片側であってもよい。例えば、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の配列表の配列番号２３に記載の塩基配列の２０５位から２７１位に対応する非結核性抗酸菌M. kansasiiの塩基配列は、結核菌のフォワードプライマー（配列番号１７）と非結核性抗酸菌のリバースプライマー（配列番号２０）とのプライマー対によって増幅される。
3. Amplification of nucleic acid When nucleic acid is amplified by PCR, for example, the following steps are performed: (1) By heat-treating double-stranded genomic DNA under reaction conditions of about 92 to 95 ° C. for about 30 seconds to 1 minute. (2) PCR reaction by binding at least two kinds of amplification primers to each of the single-stranded DNAs under reaction conditions of about 50 to 65 ° C. for about 20 seconds to 1 minute. An annealing step for producing a double-stranded portion serving as a starting point; (3) a strand extension step in which a DNA polymerase is reacted at about 70 to 75 ° C. under reaction conditions for about 20 seconds to 5 minutes; and (1) to ( The process of repeating the process of 3) 20-40 times by a normal method. As a primer pair used to amplify the rpoB gene by PCR, a sequence upstream from the sequence site containing the mutation site and a sequence downstream from the site so that the rpoB gene containing any mutation site can be amplified. And oligonucleotides having the same or complementary base sequence. Examples of preferred primer pairs include, for Mycobacterium tuberculosis, the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 17 and 18 in the Sequence Listing or oligonucleotides having complementary sequences thereof, while for non-tuberculous mycobacteria, for example, And oligonucleotides having SEQ ID NOs: 19 and 20 in the Sequence Listing or their complementary sequences. In addition, for nontuberculous mycobacteria, appropriate primers can be designed according to the base sequence that differs depending on the type, but one side of the primer pair for nontuberculous mycobacteria is It may be one side of the primer. For example, the base sequence of the nontuberculous mycobacteria M. kansasii corresponding to positions 205 to 271 of the base sequence described in SEQ ID NO: 23 of the sequence listing of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis is the forward primer (SEQ ID NO: 17) and a primer pair of non-tuberculous mycobacteria reverse primer (SEQ ID NO: 20).
また、測定の感度を向上させるために、例えば、検体から直接ＤＮＡを増幅させる場合、上記ＰＣＲ反応の前にさらにNestedＰＣＲ法（特公平６−８１６００号公報）などで核酸を増幅してもよい。NestedＰＣＲ法におけるプライマーは、上記ＰＣＲ反応において用いたプライマーよりも外側の配列を選択することができる。例えば、ｒｐｏＢ遺伝子の増幅の場合には、結核菌については、配列表の配列番号１４および１５のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、一方、非結核性抗酸菌については、配列表の配列番号１６および１５のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。 In order to improve the sensitivity of the measurement, for example, when DNA is directly amplified from a specimen, the nucleic acid may be further amplified by the Nested PCR method (Japanese Patent Publication No. 6-81600) before the PCR reaction. As a primer in the Nested PCR method, a sequence outside the primer used in the PCR reaction can be selected. For example, in the case of amplification of the rpoB gene, for Mycobacterium tuberculosis, the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 14 and 15 in the Sequence Listing or oligonucleotides having a complementary sequence thereof can be mentioned, while for nontuberculous mycobacteria Includes oligonucleotides having SEQ ID NOs: 16 and 15 in the sequence listing or oligonucleotides having complementary sequences thereof.
上記のプローブおよびプライマーの配列は、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社製）を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。 The above probe and primer sequences can be obtained using standard programs and primer analysis software such as Primer Express (Perkin Elmer) and synthesized using standard methods such as automated oligonucleotide synthesizers. can do.
４．結核菌および非結核性抗酸菌ならびにＲＦＰ感受性の検出方法
本発明において、結核菌および非結核性抗酸菌ならびにＲＦＰ感受性は、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法によって検出することができる。より簡便には、固定されたプローブの位置と、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出されたスポットの位置を比較することにより検出することもできる。例えば、上記のプローブが固定された試験片を使用する場合、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法におけるハイブリダイズは、非特異吸着反応が起きにくい点で、約６０〜６５℃の温度で行うことが好ましい。検出されたスポットの位置が、結核菌が固定されたプローブの位置と同じ位置であれば、結核菌であり、検出スポットの位置がいずれかの非結核性抗酸菌が固定された位置と同じであれば、いずれかの非結核性抗酸菌であると判断することができる。また、結核菌の複数の野生型プローブのすべてが検出されれば、ＲＦＰ感受性であると判定され、固定された野生型プローブのうち検出されないものがある場合、あるいは固定された変異型プローブと同じ位置にスポットが検出された場合には、ＲＦＰ耐性であると判定される。
4). Method for detecting tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria and RFP sensitivity In the present invention, tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria and RFP sensitivity can be detected by the PCR-SSOP method. More simply, it can be detected by comparing the position of the fixed probe and the position of the spot detected by the PCR-SSOP method. For example, when using a test piece on which the above probe is immobilized, hybridization in the PCR-SSOP method is preferably performed at a temperature of about 60 to 65 ° C. in that nonspecific adsorption reaction is unlikely to occur. If the position of the detected spot is the same as the position of the probe to which Mycobacterium tuberculosis is immobilized, it is Mycobacterium tuberculosis, and the position of the detected spot is the same as the position to which any nontuberculous mycobacteria are immobilized If it is, it can be judged that it is any non-tuberculous mycobacteria. Further, if all of the plurality of wild-type probes of Mycobacterium tuberculosis are detected, it is determined that the probe is sensitive to RFP, and when there is a fixed wild-type probe that is not detected, or the same as the fixed mutant probe. When a spot is detected at a position, it is determined that the spot is resistant to RFP.
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出されたスポットを容易に検出するためには、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などの標識物質を修飾したプライマー対を用いて遺伝子を増幅することが好ましい。上記標識物質を用いた検出方法のうち、比較的安価で容易に実施できる点で、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色法が好ましい。具体的には、以下のとおりに行われる。まず、上記プライマーの３’または５’末端にビオチンを修飾したプライマー対を用いて、末端にビオチンを有する遺伝子を増幅する。次いで、増幅した遺伝子と試験片に固定されたプローブとのハイブリダイゼーションによってプローブに結合させ、さらにアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンに接触させて、プローブと結合している遺伝子の末端に存在するビオチンに結合させる。さらに、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えてアルカリホスファターゼと反応させることにより、プローブに結合しているアルカリホスファターゼが存在する位置で発色させる。この発色は視認可能である。 In order to easily detect a spot detected by the PCR-SSOP method, it is preferable to amplify a gene using a primer pair in which a labeling substance such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a chemiluminescent substance is modified. Among the detection methods using the above-mentioned labeling substances, nitroblue tetrazolium (NBT) / 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidinyl salt (BCIP) color development is relatively inexpensive and can be easily carried out. The method is preferred. Specifically, it is performed as follows. First, a gene having biotin at the end is amplified using a primer pair in which biotin is modified at the 3 'or 5' end of the primer. Subsequently, the amplified gene and the probe immobilized on the test piece are bound to the probe by hybridization, and further contacted with alkaline phosphatase-labeled streptavidin to bind to biotin present at the end of the gene bound to the probe. . Furthermore, by adding NBT / BCIP and reacting with alkaline phosphatase, color is developed at the position where alkaline phosphatase bound to the probe is present. This color development is visible.
（試験片を含む検出用キット）
本発明の検出用キットは、上記の試験片を含む。好適には、結核菌および非結核性抗酸菌ならびにＲＦＰ感受性を検出するために適切な任意の試薬類を含み得る。例えば、上記のＤＮＡの抽出のための試薬、遺伝子増幅用試薬、プローブへの遺伝子の結合を検出するための試薬などが挙げられる。具体的なキットとして、上記のＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を実施するためのキットを例示する。
(Detection kit including test piece)
The detection kit of the present invention includes the above-described test piece. Suitably, it may include tubercle bacilli and non-tuberculous mycobacteria and any reagents suitable for detecting RFP sensitivity. For example, a reagent for extracting the above DNA, a reagent for gene amplification, a reagent for detecting the binding of the gene to the probe, and the like can be mentioned. As a specific kit, a kit for carrying out the PCR-SSOP method is exemplified.
本発明のキットに含まれ得るＤＮＡの抽出のための試薬は、上記の任意の手法で用いられる試薬である。 The reagent for DNA extraction that can be included in the kit of the present invention is a reagent used in any of the above-described techniques.
薬剤感受性遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマー対も、本発明のキットに含まれ得る。プライマー対は、任意の変異部位を含むｒｐｏＢ遺伝子を増幅し得るように、変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と、該部位よりも下流の配列とを含む、同一または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ＲＦＰ感受性の検出には、好ましいプライマー対の例としては、結核菌については、配列表の配列番号１７および１８のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、一方、非結核性抗酸菌については、配列表の配列番号１９および２０のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。測定の感度を向上させるためのNestedＰＣＲ法におけるプライマー対はとしては、例えば、結核菌については、配列表の配列番号１４および１５のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、一方、非結核性抗酸菌については、配列表の配列番号１６および１５のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。 Primer pairs for amplifying drug susceptibility genes by PCR can also be included in the kits of the invention. The primer pair is the same or complementary base sequence containing a sequence upstream from the sequence site containing the mutation site and a sequence downstream from the site so that the rpoB gene containing any mutation site can be amplified. Is an oligonucleotide. For detection of RFP sensitivity, examples of preferred primer pairs include, for M. tuberculosis, the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 17 and 18 in the sequence listing or oligonucleotides having complementary sequences thereof, while non-tuberculous Examples of the acid-fast bacterium include the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 19 and 20 in the sequence listing or oligonucleotides having complementary sequences thereof. As a primer pair in the Nested PCR method for improving the sensitivity of measurement, for example, for Mycobacterium tuberculosis, oligonucleotides having SEQ ID NOs: 14 and 15 in the sequence listing or oligonucleotides having complementary sequences thereof may be mentioned. Examples of the nontuberculous mycobacteria include oligonucleotides having SEQ ID NOs: 16 and 15 in the sequence listing or oligonucleotides having complementary sequences thereof.
さらに、上記プライマー対は、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出を容易にするために、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などで修飾されていることが好ましい。 Furthermore, the primer pair is preferably modified with a radioisotope, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or the like in order to facilitate detection in the PCR-SSOP method.
また、遺伝子の増幅は、ＰＣＲ法以外にも、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などの公知の技術が挙げられる。本発明においては、これらのいずれかの手法を用いてもよく、本発明にはこれらの手法で用いられる任意の試薬を含むキットも含まれる。 In addition to the PCR method, gene amplification includes known techniques such as the LAMP method and the ICAN method. In the present invention, any of these methods may be used, and the present invention also includes a kit containing any reagent used in these methods.
さらに、本発明のキットは、検出のための試薬類を含み得る。例えば、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法を採用する場合は、ストレプトアビジン修飾アルカリホスファターゼ、ＮＢＴ、およびＢＣＩＰが挙げられる。 Furthermore, the kit of the present invention may contain reagents for detection. For example, when the NBT / BCIP color development method is employed, streptavidin-modified alkaline phosphatase, NBT, and BCIP are exemplified.
（実施例１：試験片の作製）
１．プローブの設計
３種の非結核性抗酸菌（M. avium、M. intracellulare、およびM. kansasii）および結核菌のそれぞれの野生型ｒｐｏＢ遺伝子のみを検出し得るプローブとして以下に示すプローブａｖｉ、ｉｎｔｒａ、ｋａｎ、およびＴＢ（それぞれ配列番号２、３、４および１に対応）を構築した。また、結核菌のＲＦＰ感受性を検出し得るプローブとして以下に示すプローブＳ１〜Ｓ５（それぞれ配列番号５〜９に対応）を構築した。さらに、結核菌のＲＦＰ耐性を検出し得るプローブとして以下に示すプローブＲ２、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、およびＲ５（それぞれ配列番号１０〜１３に対応）を構築した。図１に、これらのプローブの位置関係を示す。なお、図１において、非結核性抗酸菌の塩基配列中のハイフン「−」で表される位置は、結核菌と同じ塩基であることを示す。
(Example 1: Preparation of test piece)
1. Probe design Probes avi and intra shown below as probes capable of detecting only the wild-type rpoB gene of each of three types of nontuberculous mycobacteria (M. avium, M. intracellulare, and M. kansasii) and M. tuberculosis , Kan, and TB (corresponding to SEQ ID NO: 2, 3, 4 and 1 respectively) were constructed. In addition, the following probes S1 to S5 (corresponding to SEQ ID NOs: 5 to 9, respectively) were constructed as probes that can detect the RFP sensitivity of Mycobacterium tuberculosis. Further, probes R2, R4a, R4b, and R5 (corresponding to SEQ ID NOs: 10 to 13, respectively) shown below were constructed as probes that can detect the resistance to RFP of Mycobacterium tuberculosis. FIG. 1 shows the positional relationship between these probes. In FIG. 1, the position represented by a hyphen “-” in the base sequence of nontuberculous mycobacteria indicates that it is the same base as that of tuberculosis.
プローブａｖｉ tccgtccagt cgtggcggc （配列番号２）
プローブｉｎｔｒａ ggccggtcgt cgccg （配列番号３）
プローブｋａｎ gccagctctc ccagttcat （配列番号４）
プローブＴＢ gtggaggcga tcacacc （配列番号１）
プローブＳ１ gccagctgag ccaattcat （配列番号５）
プローブＳ２ ttcatggacc agaacaaccc g （配列番号６）
プローブＳ３ ccgctgtcgg ggttgacc （配列番号７）
プローブＳ４ gacccacaag cgccgact （配列番号８）
プローブＳ５ cgactgtcgg cgctgggg （配列番号９）
プローブＲ２ aattcatggt ccagaacaac cc（配列番号１０）
プローブＲ４ａ gttgacctac aagcgccga （配列番号１１）
プローブＲ４ｂ ttgaccgaca agcgccgact （配列番号１２）
プローブＲ５ cgactgttgg cgctggg （配列番号１３）
Probe avi tccgtccagt cgtggcggc (SEQ ID NO: 2)
Probe intra ggccggtcgt cgccg (SEQ ID NO: 3)
Probe kan gccagctctc ccagttcat (SEQ ID NO: 4)
Probe TB gtggaggcga tcacacc (SEQ ID NO: 1)
Probe S1 gccagctgag ccaattcat (SEQ ID NO: 5)
Probe S2 ttcatggacc agaacaaccc g (SEQ ID NO: 6)
Probe S3 ccgctgtcgg ggttgacc (SEQ ID NO: 7)
Probe S4 gacccacaag cgccgact (SEQ ID NO: 8)
Probe S5 cgactgtcgg cgctgggg (SEQ ID NO: 9)
Probe R2 aattcatggt ccagaacaac cc (SEQ ID NO: 10)
Probe R4a gttgacctac aagcgccga (SEQ ID NO: 11)
Probe R4b ttgaccgaca agcgccgact (SEQ ID NO: 12)
Probe R5 cgactgttgg cgctggg (SEQ ID NO: 13)
２．プローブの固定化
上記の各プローブ（配列番号２〜４、１、および５〜１３に記載の塩基配列）のそれぞれの５’末端にターミナルトランスフェラーゼ（Promega社）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（３０ｕｎｉｔ／μＬ）を０．４μＬ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μＬ）を２μＬ、オリゴヌクレオチドプローブ（５０ｍＭ）を２μＬ、製品添付の反応緩衝液を２μＬ、および精製水３．６μＬを混合して反応溶液を調製し、３７℃で４時間反応させた後、１０×ＳＳＣ緩衝液９０μＬを加えることにより、ポリチミン付加されたオリゴヌクレオチドプローブ１ｐｍｏｌ／μＬを得た。
2. Immobilization of probe Polythymine was added to each 5 ′ end of each of the probes described above (base sequences described in SEQ ID NOs: 2 to 4, 1, and 5 to 13) using terminal transferase (Promega). . Specifically, 0.4 μL of terminal transferase (30 units / μL), 2 μL of thymidine triphosphate (10 pmol / μL), 2 μL of oligonucleotide probe (50 mM), 2 μL of reaction buffer attached to the product, and purified water 3.6 μL was mixed to prepare a reaction solution, reacted at 37 ° C. for 4 hours, and then 90 μL of 10 × SSC buffer solution was added to obtain 1 pmol / μL of a polythymine-added oligonucleotide probe.
次いで、ポリチミン付加されたプローブをそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．７μＬ／分の量を吐出させながら２．５ｍｍ／秒の塗布速度で、２ｍｍの幅のストライプになるようにニトロセルロース膜（縦７５ｍｍ×横１５０ｍｍ：Whatman社）上に２ｍｍ間隔で縦方向に塗布した。その後、ニトロセルロース膜に３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して、プローブを固定化した。次いで、ニトロセルロース膜を、全てのストライプを含むように切断して、５ｍｍ×１５０ｍｍの試験片を作成した。 Next, the polythymine-added probe is placed in a dispenser equipped with a 24 gauge needle, and a stripe of 2 mm width is formed at a coating speed of 2.5 mm / second while discharging an amount of 0.7 μL / min. It apply | coated to the nitrocellulose film | membrane (75 mm long x 150 mm wide: Whatman) in the vertical direction at 2 mm intervals. Thereafter, the probe was immobilized by irradiating the nitrocellulose membrane with ultraviolet rays of 312 nm for 2 minutes. Next, the nitrocellulose membrane was cut so as to include all the stripes, thereby preparing a test piece of 5 mm × 150 mm.
（実施例２：試験片を用いた結核菌および非結核性抗酸菌ならびにＲＦＰ感受性の検出）
１．ｒｐｏＢ遺伝子の増幅
本実施例では、結核菌および３種の非結核性抗酸菌（M. avium、M. intracellulare、およびM. kansasii）のそれぞれの培養物を検体とし、これらの菌の同定ならびに結核菌のＲＦＰ感受性の検出を行った。用いた検体の結核菌および非結核性抗酸菌はすべて野生型であった。ＲＦＰ感受性を検出するために、検体中に存在し得るｒｐｏＢ遺伝子を増幅する必要がある。そこで、まず、NestedＰＣＲ法によって、検体からｒｐｏＢ遺伝子を増幅した。NestedＰＣＲのプライマーとして、以下のものを使用した（図１を参照のこと）。
(Example 2: Detection of M. tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria using a test piece and RFP sensitivity)
1. Amplification of rpoB gene In this example, the cultures of M. tuberculosis and three non-tuberculous mycobacteria (M. avium, M. intracellulare, and M. kansasii) were used as specimens to identify and identify these bacteria. The RFP sensitivity of Mycobacterium tuberculosis was detected. The samples used were all wild-type Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria. In order to detect RFP sensitivity, it is necessary to amplify the rpoB gene that may be present in the specimen. Therefore, first, the rpoB gene was amplified from the specimen by the nested PCR method. The following were used as primers for Nested PCR (see FIG. 1).
結核菌用外側プライマーＦ tacggtcggc gagctgatcc（配列番号１４）
非結核性抗酸菌用外側プライマーＦ gagctgatcc agaaccagat c（配列番号１６）
結核菌／非結核性抗酸菌用外側プライマーＲ tacaccgaca gcgagccgat cag（配列番号１５）
Mycobacterium tuberculosis outer primer F tacggtcggc gagctgatcc (SEQ ID NO: 14)
Outer primer F gagctgatcc agaaccagat c for non-tuberculous mycobacteria (SEQ ID NO: 16)
Outer primer for tuberculosis / non-tuberculous mycobacteria R tacaccgaca gcgagccgat cag (SEQ ID NO: 15)
NestedＰＣＲの反応条件は、変性工程を９０℃、６０秒、アニール工程を５５℃、６０秒、鎖伸長工程を２７℃、６０秒とし、これらの工程を３０サイクル行って、ｒｐｏＢ遺伝子の一部の領域の遺伝子を増幅した。 Nested PCR reaction conditions were 90 ° C. for 60 seconds, annealing step at 55 ° C. for 60 seconds, chain extension step at 27 ° C. for 60 seconds, 30 cycles of these steps, and a part of the rpoB gene. The region gene was amplified.
次いで、上記NestedＰＣＲ法で増幅した遺伝子をテンプレートとして、以下のプライマーを用いて（図１を参照のこと）、ＰＣＲ法でさらにｒｐｏＢ遺伝子を増幅し、ＤＮＡ溶液を得た。配列表の配列番号１７に記載の塩基配列からなる結核菌用内側プライマーＦおよび配列番号１９に記載の塩基配列からなる非結核性抗酸菌用内側プライマーＦ、配列番号１８に記載の塩基配列からなりかつ５’末端にビオチンを結合させた結核菌用内側プライマーＲおよび配列番号２０に記載の塩基配列からなりかつ５’末端にビオチンを結合させた非結核性抗酸菌用内側プライマーＲ、ならびにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いたＰＣＲ法により、ｒｐｏＢ遺伝子の増幅を行った。各プライマーの塩基配列は以下に示すとおりである。 Next, using the gene amplified by the Nested PCR method as a template, the following primers were used (see FIG. 1) to further amplify the rpoB gene by the PCR method to obtain a DNA solution. From the inner primer F for Mycobacterium tuberculosis consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing, the inner primer F for non-tuberculous mycobacteria consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18. An inner primer R for Mycobacterium tuberculosis having biotin bound to the 5 ′ end and an inner primer R for non-tuberculous mycobacteria comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 20 and biotin bound to the 5 ′ end, and The rpoB gene was amplified by a PCR method using Taq DNA polymerase (Roche Diagnostics). The base sequence of each primer is as shown below.
結核菌用内側プライマーＦ ggatggagcg ggtggtccgg ga（配列番号１７）
非結核性抗酸菌用内側プライマーＦ gtcgtccgcg agcggatgac ca（配列番号１９）
結核菌用内側プライマーＲ gcacgtcgcg gacctccagc （配列番号１８）
非結核性抗酸菌用内側プライマーＲ ttgggaccct ccggggtctc ga（配列番号２０）
Inner primer for tuberculosis F ggatggagcg ggtggtccgg ga (SEQ ID NO: 17)
Inner primer F for nontuberculous mycobacteria F gtcgtccgcg agcggatgac ca (SEQ ID NO: 19)
Inner primer R gcacgtcgcg gacctccagc for Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO: 18)
Inner primer R ttgggaccct ccggggtctc ga (SEQ ID NO: 20) for nontuberculous mycobacteria
ＰＣＲの反応条件は、変性工程を９４℃、３０秒、アニール工程を５５℃、２０秒、鎖伸長工程を７２℃、２０秒とし、これらの工程を３０サイクル行って、ｒｐｏＢ遺伝子を増幅した。これにより増幅されたＤＮＡには、末端にビオチンが結合している。 The PCR reaction conditions were 94 ° C. for 30 seconds for the denaturation step, 55 ° C. for 20 seconds for the annealing step, 72 ° C. for 20 seconds for the strand extension step, and 30 cycles of these steps were performed to amplify the rpoB gene. Biotin is bound to the terminal of the amplified DNA.
２．プローブを用いた検出
増幅したＤＮＡ溶液１０μＬに、水酸化ナトリウム（５Ｍ）、エチレンジアミン四酢酸（０．０５Ｍ）の溶液（１０μＬ）を加えてよく攪拌し、５分間放置して、増幅したＤＮＡを１本鎖に変性した。この試料溶液中に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）、クエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）の溶液（１ｍＬ）、および上記実施例１で作成した試験片を加え、反応温度６２℃の下で３０分間振とうして反応させた。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、試験片上の各プローブと結合している遺伝子の末端に存在するビオチンに結合させた。さらに、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を加えて、試験片上の各プローブに結合したアルカリホスファターゼが存在する位置で発色させた。結果を図２に示す。
2. Detection using probe To 10 μL of amplified DNA solution, a solution (10 μL) of sodium hydroxide (5 M) and ethylenediaminetetraacetic acid (0.05 M) is added and stirred well, and left for 5 minutes. Denatured to a main chain. In this sample solution, a solution of sodium dodecyl sulfate (0.01 w / v%), sodium chloride (1.8 w / v%), sodium citrate (1.0 w / v%) (1 mL), and the above example The test piece prepared in 1 was added and reacted by shaking for 30 minutes at a reaction temperature of 62 ° C. Thereafter, alkaline phosphatase-labeled streptavidin was added and bound to biotin present at the end of the gene bound to each probe on the test piece. Further, nitro blue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidinyl salt (BCIP) are added to cause color development at the position where alkaline phosphatase bound to each probe on the test piece exists. It was. The results are shown in FIG.
野生型結核菌が検体である場合については、上記実施例１で調製した試験片のプローブＴＢおよびプローブＳ１〜Ｓ５のすべての位置で発色が確認されたが、非結核性抗酸菌のプローブおよび変異プローブの位置には発色を確認できなかった。したがって、検体が結核菌であり、ＲＦＰ感受性であると判定できた。また、３種の非結核性抗酸菌が検体である場合には、それぞれの非結核性抗酸菌に対応するプローブおよびプローブＳ２の位置に発色を確認した。このように、上記の試験片を用いることにより、結核菌および非結核性抗酸菌ならびにＲＦＰ感受性について正しい判定を行うことができた。 In the case where the wild-type tuberculosis bacterium is a specimen, color development was confirmed at all positions of the probe TB and the probes S1 to S5 of the test piece prepared in Example 1 above, but the non-tuberculous mycobacteria probe and Color development could not be confirmed at the position of the mutation probe. Therefore, it was possible to determine that the specimen was Mycobacterium tuberculosis and sensitive to RFP. In addition, when three types of nontuberculous mycobacteria were specimens, color development was confirmed at the position of the probe and probe S2 corresponding to each nontuberculous mycobacteria. As described above, by using the above-mentioned test pieces, it was possible to correctly determine tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria and RFP sensitivity.
（実施例３：試験片を用いた結核菌のＲＦＰ耐性の検出）
本実施例では、ＲＦＰ耐性を有する結核菌のそれぞれの培養物を検体とし、上記実施例２と同様に操作してｒｐｏＢ遺伝子を増幅し、実施例１で調製した試験片を用いて、結核菌のＲＦＰ耐性の検出を行った。ＲＦＰ耐性を有する結核菌は、図１のプローブＲ２、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、およびＲ５の領域内に変異を有するＲＦＰ耐性結核菌ならびにプローブＳ１およびＳ３の領域内に変異を有するＲＦＰ耐性結核菌であった。ＲＦＰ感受性を検出するために、検体中に存在し得るｒｐｏＢ遺伝子を増幅する必要がある。そこで、まず、NestedＰＣＲ法によって、検体からｒｐｏＢ遺伝子を増幅した。結果を図３に示す。
(Example 3: Detection of RFP resistance of Mycobacterium tuberculosis using a test piece)
In this example, each culture of Mycobacterium tuberculosis having RFP resistance was used as a specimen, the rpoB gene was amplified by the same operation as in Example 2 above, and the test piece prepared in Example 1 was used. RFP resistance was detected. The Mycobacterium tuberculosis having resistance to RFP was an RFP-resistant Mycobacterium tuberculosis having a mutation in the regions of probes R2, R4a, R4b, and R5 in FIG. 1 and an RFP-resistant Mycobacterium tuberculosis having a variation in the regions of probes S1 and S3. . In order to detect RFP sensitivity, it is necessary to amplify the rpoB gene that may be present in the specimen. Therefore, first, the rpoB gene was amplified from the specimen by the nested PCR method. The results are shown in FIG.
プローブＲ２、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、およびＲ５の領域内に変異を有するＲＦＰ耐性結核菌の場合は、結核菌の検出プローブＴＢの位置で発色が見られ、変異プローブについては、それぞれの変異プローブの位置のみに発色が見られた。しかし、変異を有する領域に対応する野生型プローブの位置には発色は見られなかった。非結核性抗酸菌のプローブの位置にも発色はなかった。なお、変異のない領域については、野生型プローブの位置にも発色が見られた。 In the case of RFP-resistant Mycobacterium tuberculosis having mutations in the regions of the probes R2, R4a, R4b, and R5, color development is observed at the position of the detection probe TB of Mycobacterium tuberculosis. Color development was seen. However, no color was observed at the position of the wild-type probe corresponding to the region having the mutation. There was no coloration at the probe position of the nontuberculous mycobacteria. In the region without mutation, coloring was also observed at the position of the wild type probe.
また、プローブＳ１およびＳ３の領域内に変異を有するＲＦＰ耐性結核菌の場合は、野生型のＲＦＰ感受性結核菌と同様に、プローブＴＢの位置で発色が見られ、プローブＳ１〜Ｓ５プローブのうち、変異に対応するプローブＳ１またはＳ３の位置においてのみ発色が見られなかった。なお、変異プローブの位置には、発色は見られなかった。非結核性抗酸菌のプローブの位置にも発色はなかった。 Further, in the case of the RFP-resistant tuberculosis having a mutation in the region of the probes S1 and S3, as in the wild-type RFP-sensitive tuberculosis, color development is seen at the position of the probe TB, and among the probes S1 to S5, Color development was not observed only at the position of the probe S1 or S3 corresponding to the mutation. In addition, color development was not seen in the position of the mutation probe. There was no coloration at the probe position of the nontuberculous mycobacteria.
このように、上記の試験片を用いることにより、ＲＦＰ耐性結核菌について正しい判定を行うことができた。 Thus, by using the above-mentioned test piece, it was possible to correctly determine RFP-resistant Mycobacterium tuberculosis.
（実施例４：臨床検査用検体における検出の検討）
結核感染患者５０症例および非結核性抗酸菌症患者７２症例のそれぞれの喀痰を検体として、上記実施例１で調製した試験片を用いて結核菌および非結核性抗酸菌についての同定を行った。なお、これらの検体として、アキュプローブ（極東製薬工業株式会社）により、予め原因菌が特定されたものを用いた。
(Example 4: Examination of detection in specimen for clinical examination)
Identification of tuberculosis bacteria and nontuberculous mycobacteria was carried out using the specimens prepared in Example 1 above, using specimens from 50 cases of tuberculosis infected patients and 72 cases of nontuberculous mycobacterial patients. It was. As these specimens, those in which the causative bacteria were previously identified by Accuprobe (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) were used.
まず、検体である喀痰の一部を前処理してＤＮＡを抽出し、上記実施例２と同様の操作を行ってｒｐｏＢ遺伝子を増幅し、実施例１で調製した試験片を用いて、結核菌および非結核性抗酸菌の検出を行った。結果を表１に示す。 First, a part of the sputum as a specimen is pretreated to extract DNA, the rpoB gene is amplified by the same operation as in Example 2 above, and the test piece prepared in Example 1 is used to And non-tuberculous mycobacteria were detected. The results are shown in Table 1.
表１から明らかなように、本発明の試験片による検査結果は、既存の手段の結果と一致した。ＭＡＣについては、２種を明らかに区別することが可能であった。また、M. kansasiiについても、確実に同定することができることがわかった。 As is apparent from Table 1, the test results using the test piece of the present invention were consistent with the results of the existing means. For MAC, it was possible to clearly distinguish between the two. It was also found that M. kansasii could be identified reliably.
本発明によれば、結核菌と非結核性抗酸菌とを一度に判定することができる。さらに、同時に薬剤感受性（特に、リファンピシン感受性）も判定することもできる。したがって、検査において、治療方針の決定ならびに予後の予測を簡便に行うことができる。その結果、患者に、適切な治療を提供することができる。したがって、不要な薬剤投与や検査を防ぐことができ、患者の負担が軽減化され、さらに無駄な医療費を削減することができる。 According to the present invention, tuberculosis bacteria and nontuberculous mycobacteria can be determined at a time. Furthermore, drug sensitivity (particularly, rifampicin sensitivity) can also be determined. Therefore, in the examination, it is possible to easily determine the treatment policy and predict the prognosis. As a result, appropriate treatment can be provided to the patient. Therefore, unnecessary drug administration and testing can be prevented, the burden on the patient can be reduced, and unnecessary medical expenses can be reduced.
Claims (14)
少なくとも４つのプローブが固定されており、
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、非結核性抗酸菌M. aviumのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、結核菌および他の非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、非結核性抗酸菌M. intracellulareのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、結核菌および他の非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、そして
該プローブのうちの少なくとも１つのプローブが、非結核性抗酸菌M. kansasiiのｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得るが、結核菌および他の非結核性抗酸菌の該ｒｐｏＢ遺伝子の野生型塩基配列からなる任意の領域とハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドからなり、
該プローブが、それぞれ該試験片の異なる位置に固定されている、
試験片。 A test strip for detecting tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria,
At least four probes are fixed,
At least one of the probes can hybridize with any region consisting of the wild type base sequence of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis, but consists of the wild type base sequence of the rpoB gene of nontuberculous mycobacteria Consisting of oligonucleotides that cannot hybridize to any region,
At least one of the probes can hybridize to any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the nontuberculous mycobacteria M. avium, but tuberculosis and other nontuberculous antiacids An oligonucleotide that cannot hybridize to any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the fungus,
At least one of the probes can hybridize to any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the non-tuberculous mycobacteria M. intracellulare, but tuberculosis and other non-tuberculous antiacids An oligonucleotide that cannot hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of the fungus, and at least one of the probes is a rpoB gene of the nontuberculous mycobacteria M. kansasii An oligonucleotide that can hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence, but cannot hybridize with any region consisting of the wild-type base sequence of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis and other non-tuberculous mycobacteria Consists of
The probes are respectively fixed at different positions on the specimen;
Test pieces.
試料中の結核菌および非結核性抗酸菌のｒｐｏＢ遺伝子を抽出する工程、
該抽出したｒｐｏＢ遺伝子を請求項１から９のいずれかの項に記載の試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
該プローブに結合したｒｐｏＢ遺伝子を発色させる工程
を含む、方法。 A method for detecting tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria comprising:
Extracting the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria in the sample;
The extracted rpoB gene is brought into contact with the test piece according to any one of claims 1 to 9 to bind to the probe fixed to the test piece, and the rpoB gene bound to the probe is colored. A method comprising the steps.
配列表の配列番号１４および１６のフォワードプライマーと配列表の配列番号１５のリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程、および
得られたＰＣＲ増幅産物について、配列表の配列番号１７および１９のフォワードプライマーと配列表の配列番号１８および２０のリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程、
を含む、請求項１３に記載の方法。 Extracting the rpoB gene comprises:
A step of performing PCR using the forward primer of SEQ ID NO: 14 and 16 of the sequence listing and the reverse primer of SEQ ID NO: 15 of the sequence listing; and the obtained PCR amplification product, the forward primer of SEQ ID NO: 17 and 19 of the sequence listing And a step of performing PCR using the reverse primers of SEQ ID NOS: 18 and 20 in the sequence listing,
14. The method of claim 13, comprising:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008032474A JP2009189283A (en) | 2008-02-13 | 2008-02-13 | Reagent for detecting mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacterium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008032474A JP2009189283A (en) | 2008-02-13 | 2008-02-13 | Reagent for detecting mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacterium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009189283A true JP2009189283A (en) | 2009-08-27 |
Family
ID=41071939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008032474A Pending JP2009189283A (en) | 2008-02-13 | 2008-02-13 | Reagent for detecting mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacterium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2009189283A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011177186A (en) * | 2011-04-18 | 2011-09-15 | Nipro Corp | Qualitative reaction test plate |
| WO2011140237A3 (en) * | 2010-05-04 | 2012-04-05 | The Government Of The Usa Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Process for detection of multidrug resistant tuberculosis using real-time pcr and high resolution melt analysis |
| CN110273015A (en) * | 2019-07-31 | 2019-09-24 | 四川省疾病预防控制中心 | A kind of mycobacterium kansasii visible detection method based on LAMP technology |
| CN110551607A (en) * | 2019-09-25 | 2019-12-10 | 张阳 | mycobacterium tuberculosis drug-resistant gene multiple detection method based on RCA amplification |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10500857A (en) * | 1994-06-09 | 1998-01-27 | イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | Method for detecting antibiotic resistance spectrum of Mycobacterium species |
| JP2003534810A (en) * | 2000-05-30 | 2003-11-25 | バイオメドラボ カンパニー リミテッド | Diagnostic kit for identification of mycobacterium species and detection of drug resistance and method for producing the kit |
-
2008
- 2008-02-13 JP JP2008032474A patent/JP2009189283A/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10500857A (en) * | 1994-06-09 | 1998-01-27 | イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | Method for detecting antibiotic resistance spectrum of Mycobacterium species |
| JP2003534810A (en) * | 2000-05-30 | 2003-11-25 | バイオメドラボ カンパニー リミテッド | Diagnostic kit for identification of mycobacterium species and detection of drug resistance and method for producing the kit |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6012060915; Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．８（１９９８）ｐ．４３５-４４８ * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011140237A3 (en) * | 2010-05-04 | 2012-04-05 | The Government Of The Usa Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Process for detection of multidrug resistant tuberculosis using real-time pcr and high resolution melt analysis |
| JP2011177186A (en) * | 2011-04-18 | 2011-09-15 | Nipro Corp | Qualitative reaction test plate |
| CN110273015A (en) * | 2019-07-31 | 2019-09-24 | 四川省疾病预防控制中心 | A kind of mycobacterium kansasii visible detection method based on LAMP technology |
| CN110273015B (en) * | 2019-07-31 | 2023-10-13 | 四川省疾病预防控制中心 | LAMP technology-based visual detection method for mycobacterium kansasii |
| CN110551607A (en) * | 2019-09-25 | 2019-12-10 | 张阳 | mycobacterium tuberculosis drug-resistant gene multiple detection method based on RCA amplification |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5276648B2 (en) | Methods and kits for identifying antibiotic-resistant microorganisms | |
| EP3957753B1 (en) | Polymerase chain reaction primers and probes for mycobacterium tuberculosis | |
| CN102154527A (en) | Method for rapidly detecting multi-drug resistant tuberculosis | |
| JP5716758B2 (en) | Test strip for detecting drug sensitivity in Mycobacterium tuberculosis | |
| JP2009189283A (en) | Reagent for detecting mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacterium | |
| JP2010515451A (en) | DNA chip for E. coli detection | |
| JP3565752B2 (en) | Identification and specific detection of slow-growing mycobacteria using characteristic nucleotide sequences present in DNA gyrase gene | |
| JP5982810B2 (en) | Kit containing test piece | |
| US20060211002A1 (en) | Antibiotic susceptibility and virulence factor detection in Pseudomonas aeruginosa | |
| JP5700385B2 (en) | Method and test piece for determining drug resistance of Mycobacterium tuberculosis | |
| JP5904432B2 (en) | Method and specimen for detecting isoniazid sensitivity in Mycobacterium tuberculosis | |
| RU2636457C2 (en) | Oligonucleotide biochip for identification of genetic determinant of neisseria gonorrhoeae resistance to antimicrobial preparations, set of oligonucleotides used for immobilisation on biochip | |
| JP4666460B2 (en) | Probe set for detection of pyrazinamide-resistant bacteria | |
| JP2010515452A (en) | DNA chip for detection of Staphylococcus aureus | |
| JP2016059338A (en) | Kit and method comprising a marker for identifying drug sensitivity | |
| WO2010001923A1 (en) | Method and specimen for detecting sensitivity to isoniazid in tubercle bacillus | |
| JP2006180753A (en) | PncA gene containing a novel mutation | |
| JP6070246B2 (en) | Kit containing test piece | |
| TW202204640A (en) | Method for determining single base mutation of erm (41) gene of acid-fast bacillus belonging to mycobacteroides abscessus complex, and primer set and probe used in said method | |
| JP6876988B2 (en) | Method for predicting the risk of bloodstream infection of MRSA using single nucleotide polymorphism of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) cna gene | |
| Fluit | Genetic methods for detecting bacterial resistance genes | |
| US20070059714A1 (en) | Detection of presence and antibiotic susceptibility of enterococci | |
| JP2004147550A (en) | Nucleic acid fragment, microorganism detection method and microorganism detection kit | |
| JP2007289170A (en) | Probe, probe set, probe fixing carrier, and inspection method | |
| WO2010041444A1 (en) | Method for detecting integron, method for detecting integron pollution in the environment, and primer pair |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101111 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20110204 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121127 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130326 |