JP2009181088A - 共焦点ユニット、共焦点顕微鏡、および共焦点絞り - Google Patents

Abstract

【課題】より簡単に共焦点効果を高めることができるようにする。
【解決手段】共焦点絞り３３は、共焦点観察の対象である標本に照明光を照射する照明光学系と、標本からの観察光を結像させる結像光学系との共通な光学系上に配置される。共焦点絞り３３には、縦方向に間隔を空けて並べられた開口８１Ｌからなる開口列、開口８１Ｃからなる開口列、および開口８１Ｒからなる開口列が横方向に並べられて設けられている。このように、縦方向および横方向に間隔を空けて開口８１を配列することで、観察光の横方向および縦方向のクロストーク成分を除去し、共焦点効果を高めることができる。本発明は、共焦点顕微鏡に適用することができる。
【選択図】図２

Description

本発明は、より簡単に共焦点効果を高めることができるようにした共焦点ユニット、共焦点顕微鏡、および共焦点絞りに関する。

共焦点絞りにスリット状の開口を有する共焦点顕微鏡では、スリット状に集光された照明光が観察対象の標本に照射され、これにより標本の観察面で生じた観察光が、ラインセンサや２次元センサなどの光検出器により検出されて、観察面の２次元画像が得られる。

このようなスリット走査方式の共焦点顕微鏡では、照明光の走査が１方向のみで済むため、２方向への走査が必要となるピンホール走査方式の共焦点顕微鏡に比べて、標本の２次元画像を短時間で得ることができる。

ところが、スリット走査方式の共焦点顕微鏡は、スリット状の照明光の短手方向（幅方向）の共焦点効果は得られるが、照明光の長手方向についてはクロストークの発生により共焦点効果が劣るという原理的な欠点を有している。そこで、長手方向のクロストーク成分を除去する方法として、光検出器の受光面上の画素が観察光を受光することで得られる画素信号を、その画素の周囲の画素において得られた画素信号を用いて補正することが提案されている（例えば、特許文献１参照）。

なお、共焦点効果が得られるとは、共焦点顕微鏡において、共焦点顕微鏡の光軸方向のより高いセクショニング分解能が得られることや、標本の２次元画像において、観察面の平面方向のより高いコントラストが得られることをいう。

国際公開第ＷＯ ２００７／０５５０８２号パンフレット

しかしながら、上述した技術では、共焦点効果を高めることはできるが、標本の最終的な２次元画像を得るためには複雑な演算処理が必要であり、演算処理を実行させるソフトウェアが複雑かつ大規模になってしまうという問題があった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、より簡単に共焦点効果を高めることができるようにするものである。

本発明の第１の共焦点ユニットは、観察対象の標本に照明光を照射する照明光学系と、前記標本からの観察光を結像させる結像光学系との共通な光学系上に配置され、第１の方向に間隔を空けて並べられた複数の開口からなる開口列が、前記第１の方向とは異なる第２の方向に複数並べられて設けられた共焦点絞りと、前記照明光を集光して前記共焦点絞りの前記開口に入射させるビーム整形手段と、前記共焦点絞りを通過した前記照明光を反射して前記標本に照射する反射面を有し、前記反射面を駆動させて前記照明光を前記標本上で走査させるスキャナとを備え、前記共焦点絞りには、前記第２の方向から見た場合に、複数の前記開口列の全ての開口が互いに隣接して前記第１の方向に一列に並ぶ仮想の開口列が形成可能ないように並べられ、前記仮想の開口列が形成されたとき前記開口の端が隣接する開口の端とほぼ重なるように、前記開口が配列されていることを特徴とする。

本発明の第２の共焦点ユニットは、観察対象の標本に照明光を照射する照明光学系に配置され、第１の方向に間隔を空けて並べられた複数の開口からなる開口列が、前記第１の方向とは異なる第２の方向に複数並べられて設けられた第１の共焦点絞りと、前記照明光を集光して前記第１の共焦点絞りの前記開口に入射させるビーム整形手段と、前記第１の共焦点絞りを通過した前記照明光を反射して前記標本に照射する反射面を有し、前記反射面を駆動させて前記照明光を前記標本上で走査させるスキャナと、前記標本からの観察光を結像させる結像光学系に配置され、前記第１の共焦点絞りと同じ配列の開口が設けられた第２の共焦点絞りとを備え、前記第１の共焦点絞りには、前記第２の方向から見た場合に、複数の前記開口列の全ての開口が互いに隣接して前記第１の方向に一列に並ぶ仮想の開口列が形成可能ないように並べられ、前記仮想の開口列が形成されたとき前記開口の端が隣接する開口の端とほぼ重なるように、前記開口が配列されていることを特徴とする。

本発明の共焦点絞りは、標本の共焦点観察に用いる共焦点絞りであって、第１の方向に間隔を空けて並べられた複数の開口からなる開口列が、前記第１の方向とは異なる第２の方向に複数並べられて設けられており、前記第２の方向から見た場合に、複数の前記開口列の全ての開口が互いに隣接して前記第１の方向に一列に並ぶ仮想の開口列が形成可能ないように並べられ、前記仮想の開口列が形成されたとき前記開口の端が隣接する開口の端とほぼ重なるように、前記開口が配列されていることを特徴とする。

本発明によれば、より簡単に共焦点効果を高めることができる。

以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。

図１は、本発明を適用した共焦点顕微鏡システムの一実施の形態の構成例を示す図である。なお、図中、矢印Ｓは観察対象の標本に照射される照明光の進む方向を示しており、矢印Ｋは、標本からの観察光の進む方向を示している。

共焦点顕微鏡システム１１は、光源部２１、共焦点顕微鏡２２、共焦点ユニット２３、およびコンピュータ２４から構成され、共焦点ユニット２３は共焦点顕微鏡２２に装着されている。

光源部２１は、照明光を射出する光源を備えており、光源部２１から射出された照明光は、共焦点ユニット２３および共焦点顕微鏡２２に設けられた照明光学系を通って、観察対象の標本２５に照射される。例えば、光源部２１が備える光源は、超高圧水銀ランプ、キセノンランプ、メタルハイドランプなどの白色光の光源や、レーザ光源などとされる。なお、照明光として白色光が用いられる場合には、光源部２１と共焦点ユニット２３との間に図示せぬ励起フィルタが配置される。

共焦点ユニット２３は、共焦点顕微鏡２２に対して着脱自在とされており、共焦点ユニット２３および共焦点顕微鏡２２には、標本２５に照明光を照射させる照明光学系、および標本２５からの観察光を結像させる結像光学系を構成する光学部品が設けられている。

光源部２１から共焦点ユニット２３に入射した照明光は、シリンドリカルマイクロレンズなどからなるビーム整形光学系３１により集光され、ビームスプリッタ３２を通って共焦点絞り３３に入射する。共焦点絞り３３は、複数の開口からなるスリットが設けられている絞りであり、標本２５の観察面Ｔａと光学的に共役な位置に配置される。共焦点絞り３３に入射した光は、共焦点絞り３３の開口に入射した成分だけが共焦点絞り３３を通過し、他の成分は遮蔽される。

共焦点絞り３３を通過した照明光は、照明系コリメートレンズ３４により平行光とされて反射ミラー３５に入射し、さらに反射ミラー３５において反射してスキャナ３６に入射する。スキャナ３６は、照明光を観察面Ｔａ上で走査させるスキャンミラー３６ａを有しており、スキャンミラー３６ａの両面には、反射面３６ａ−ｓおよび反射面３６ａ−ｒが設けられている。

また、スキャンミラー３６ａは、その中心を通り、照明光の光路と垂直な直線を軸として矢印Ａの方向に回動する。スキャンミラー３６ａが回動すると、反射ミラー３５から入射して反射面３６ａ−ｓにおいて反射される照明光の光路が変更され、その結果、標本２５に照射される照明光が矢印Ｂの方向に走査される。

スキャンミラー３６ａの反射面３６ａ−ｓにおいて反射された照明光は、スキャナレンズ３７および第２対物レンズ３８により集光されて対物レンズ３９に入射する。そして、照明光は、対物レンズ３９により集光されてステージ４０上に載置された標本２５に照射される。このとき、対物レンズ３９は、第２対物レンズ３８からの照明光を、標本２５の観察面Ｔａ上に集光（結像）させる。

標本２５は、例えば蛍光染色された生体試料などとされ、照明光が照射されると、観察光としての蛍光を発現する。標本２５からの観察光は、照明光の光路を逆方向に進み、共焦点絞り３３に入射する。すなわち、観察光は、対物レンズ３９乃至スキャナレンズ３７を介してスキャンミラー３６ａに入射し、反射面３６ａ−ｓにおいて反射されて反射ミラー３５に入射する。さらに、観察光は、反射ミラー３５において反射され、照明系コリメートレンズ３４により集光されて、共焦点絞り３３に入射する。

共焦点絞り３３に入射した観察光は、その一部の成分が遮蔽され、共焦点絞り３３の開口を通過した成分だけがビームスプリッタ３２に入射する。そして、ビームスプリッタ３２に入射した観察光は、ビームスプリッタ３２により反射され、フィルタ４１を通って結像系コリメートレンズ４２に入射する。

ここで、落射蛍光光学系を想定した場合、つまり標本２５を蛍光観察する場合、例えば、ビームスプリッタ３２は、照明光を透過させて観察光を反射するダイクロイックミラーとされ、フィルタ４１は、観察光の蛍光成分以外の成分を除去するバリアフィルタとされる。また、標本２５において反射した照明光を観察する場合、つまり標本２５を明視野観察する場合、例えば、ビームスプリッタ３２は、照明光および観察光の一部を反射させるハーフミラーとされ、フィルタ４１は特に設けられない。

結像系コリメートレンズ４２に入射した観察光は、結像系コリメートレンズ４２により平行光とされ、さらに反射ミラー４３において反射し、スキャンミラー３６ａに入射する。そして、スキャンミラー３６ａに入射した観察光は、反射面３６ａ−ｒにおいて反射され、集光レンズ４４により集光されて光検出器４５に入射する。

ここで、光検出器４５は、その受光面が観察光の結像面の近傍、より詳細には、受光面が観察面Ｔａと光学的に共役な位置となるように配置されている。光検出器４５は、例えば２次元ＣＣＤ（Charge Coupled Devices）を備えたＣＣＤカメラ等の２次元光検出器であり、集光レンズ４４からの観察光を受光して光電変換し、これにより得られた撮像画像を、観察光の２次元の輝度分布データとしてコンピュータ２４に供給する。

なお、図１においては、ビーム整形光学系３１乃至スキャナレンズ３７、およびフィルタ４１乃至集光レンズ４４が共焦点ユニット２３に設けられており、第２対物レンズ３８乃至ステージ４０、および光検出器４５が共焦点顕微鏡２２に設けられている。また、照明光学系は、照明光の光路上に配置された光学部品から構成され、結像光学系は、観察光の光路上に配置された光学部品から構成されている。

コンピュータ２４は、操作部４６、制御部４７、および表示部４８を備えており、共焦点顕微鏡システム１１の全体を制御する。

操作部４６は、例えば、マウスやキーボードからなり、観察者の操作に応じた操作信号を制御部４７に供給する。制御部４７は、操作部４６からの操作信号などに応じた処理を行う。例えば、制御部４７は、光源部２１を制御して、光源部２１に照明光を射出させたり、スキャナ３６を制御して、スキャンミラー３６ａを回動させたりする。また、制御部４７は、光検出器４５から２次元の輝度分布データを取得し、取得した２次元の輝度分布データに基づいて、観察面Ｔａの２次元画像を生成したり、表示部４８を制御して、生成した２次元画像を表示部４８に表示させたりする。表示部４８は、例えばＬＣＤ（Liquid Crystal Display）などからなり、制御部４７から供給された２次元画像を表示する。

ところで、照明光の結像面に配置された共焦点絞り３３には、例えば、図２に示すように、開口が図中、縦方向に等間隔で並べられてできる開口列が、横方向に複数並べられて設けられている。

図２では、共焦点絞り３３には、１辺がＤ１の長さの正方形の開口８１Ｌ−１乃至開口８１Ｌ−ｎ、開口８１Ｃ−１乃至開口８１Ｃ−ｎ、および開口８１Ｒ−１乃至開口８１Ｒ−ｎが設けられている。

そして、ｎ個の開口８１Ｌ−１乃至開口８１Ｌ−ｎは、図中、縦方向に所定の間隔で並べられて開口列を構成している。同様にｎ個の開口８１Ｃ−１乃至開口８１Ｃ−ｎは、縦方向に所定の間隔で並べられて開口列を構成しており、ｎ個の開口８１Ｒ−１乃至開口８１Ｒ−ｎも、縦方向に所定の間隔で並べられて開口列を構成している。また、これらの３つの開口列は、図中、横方向に所定の間隔で並べられている。

なお、以下、開口８１Ｌ−１乃至開口８１Ｌ−ｎのそれぞれを個々に区別する必要のない場合、単に開口８１Ｌと称する。また、開口８１Ｃ−１乃至開口８１Ｃ−ｎのそれぞれを個々に区別する必要のない場合、単に開口８１Ｃと称し、開口８１Ｒ−１乃至開口８１Ｒ−ｎのそれぞれを個々に区別する必要のない場合、単に開口８１Ｒと称する。さらに、以下、開口８１Ｌ、開口８１Ｃ、および開口８１Ｒのそれぞれを個々に区別する必要のない場合、単に開口８１と称する。

共焦点絞り３３では、図中、左側から右側に開口８１Ｌの列、開口８１Ｃの列、および開口８１Ｒの列が順番に並べられている。ここで、開口８１Ｃの列は、開口８１Ｌの列よりも距離Ｄ１だけ図中、上側に位置しており、開口８１Ｒの列は、開口８１Ｃの列よりも距離Ｄ１だけ図中、上側に位置している。

また、各開口列における図中、縦方向に隣り合う２つの開口８１の相手に近い方の端同士の距離は、２Ｄ１とされている。つまり、開口列において、開口８１は距離２Ｄ１だけ間隔が空けられて配列されている。したがって、例えば開口８１Ｌ−１の図中、下側の端から、開口８１Ｌ−２の図中、上側の端までの距離は２Ｄ１とされる。

さらに、図中、横方向に隣り合う２つの開口列の開口８１の相手に近い方の端同士の距離は、Ｄ２とされている。つまり、各開口列は距離Ｄ２だけ間隔が空けられて配列されている。したがって、例えば開口８１Ｌ−１の図中、右側の端から、開口８１Ｃ−１の図中、左側の端までの距離はＤ２とされる。

共焦点絞り３３上に設けられた開口８１からなるスリットは、例えば図３に示すように、スリット状の開口を分割して、その開口の分割された一部をスリット状の開口の短手方向に移動させたものとされる。

具体的には、点線で囲まれるスリット状（長方形状）の領域１２１を１辺がＤ１である３ｎ個の正方形の領域に分割し、分割された領域のうち、図中、上から３（ｉ−１）＋１番目（但し、１≦i≦ｎ）の領域を図中、右側に（Ｄ１＋Ｄ２）だけ移動させる。そして、その移動後のｎ個の領域に開口を設けて、それらの開口を開口８１Ｒとする。

また、領域１２１が分割されてできた正方形の領域のうち、図中、上から３（ｉ−１）＋２番目（但し、１≦i≦ｎ）の領域に開口を設けて、それらの開口を開口８１Ｃとする。さらに、領域１２１が分割されてできた正方形の領域のうち、図中、上から３（ｉ−１）＋３番目（但し、１≦i≦ｎ）の領域を図中、左側に（Ｄ１＋Ｄ２）だけ移動させる。そして、その移動後のｎ個の領域に開口を設けて、それらの開口を開口８１Ｌとする。

したがって、共焦点絞り３３に設けられた複数の開口列のうちの任意の開口列の開口８１を、その開口８１が他の何れかの開口列上に位置するように図中、横方向に移動させた場合、移動された開口８１の端（上側または下側の端）は、移動先の開口列の図中、縦方向に隣接する開口８１の端と重なる。つまり、共焦点絞り３３に設けられた複数の開口列の全ての開口８１が、例えば領域１２１内で図中、縦方向（第１の方向）に並ぶように、開口８１を横方向（第２の方向）に移動させた場合、開口８１は互いに隣接して縦方向に一列（仮想の開口列）に並べられることになる。

この状態は、共焦点絞り３３を第２の方向である横方向から見た場合に、複数の開口８１からなる開口列の全ての開口８１が互いに隣接して第１の方向である縦方向に一列に並べられ、開口８１の端が隣接する開口８１の端とほぼ重なるように開口８１が配列されている。

さらに、共焦点絞り３３を通過した照明光および観察光は、開口８１の配列と同じパターンの光となる。つまり、開口８１を通過した照明光および観察光（スポット光）が、開口８１の配列と同じように並んだものとなる。換言すれば、共焦点絞り３３を通過した照明光および観察光は、スポット光が並べられてできるスリット形状の光束となる。

このように、共焦点絞り３３においては、間隔を空けて並べられた開口８１により、長方形状のスリットが構成される。そして、共焦点絞り３３では、スリットを短手方向、すなわち図２中、横方向（第２の方向）から見た場合に、複数の開口列の全ての開口８１がスリットの第１の方向である長手方向（図２中、縦方向）に互いに隣接して一列に並べられ、開口８１の端が隣接する開口８１の端と重なるように、開口８１が配列されている。

そのため、標本２５の観察面Ｔａに照射されるスリット形状の照明光を、スキャンミラー３６ａにより、スリット形状の短手方向に走査させると、観察面Ｔａは、照明光で隙間なく塗り潰されるように、照明光により走査（照明）されることになる。

共焦点絞り３３は、一見してマルチピンホール型の共焦点絞りのようでありながら、実際にはスリット型の共焦点絞りとして機能する。つまり、マルチピンホール型の共焦点絞りを用いる場合は、２方向への照明光の走査が必要であるのに対して、共焦点絞り３３を用いた場合には、照明光を１方向に走査させればよい。

また、共焦点絞り３３が図２に示す構成とされる場合、ビーム整形光学系３１は、例えば図４に示すように、図中、奥行き方向に長いシリンドリカルマイクロレンズ１５１−１乃至シリンドリカルマイクロレンズ１５１−３からなる。なお、図中、矢印Ｓは照明光の進む方向を示しており、矢印Ｋは観察光の進む方向を示している。

図中、上側からビーム整形光学系３１に入射した照明光は、シリンドリカルマイクロレンズ１５１−１乃至シリンドリカルマイクロレンズ１５１−３のそれぞれにより集光されて、開口８１Ｌの列乃至開口８１Ｒの列のそれぞれとほぼ同形状（スリット状）の３つの光束に整形される。そして、シリンドリカルマイクロレンズ１５１−１乃至シリンドリカルマイクロレンズ１５１−３により集光された照明光は、ビームスプリッタ３２を透過して、開口８１Ｌの列乃至開口８１Ｒの列のそれぞれを通過する。

ここで、シリンドリカルマイクロレンズ１５１−１乃至シリンドリカルマイクロレンズ１５１−３により集光された照明光は、観察面Ｔａと共役な位置、つまり開口８１が設けられている位置に集光される。また、このとき、共焦点絞り３３は、照明光学系側の共焦点絞りとして機能する。

さらに、標本２５からの観察光は、照明光の光路を逆方向に通って共焦点絞り３３に入射するため、観察光はスリット状の３つの光束に整形されて、開口８１が設けられている位置に集光され、図中、下から上方向に開口８１を通過する。そして、開口８１を通過した観察光は、ビームスプリッタ３２により図中、左方向に反射されてフィルタ４１に入射する。このとき、共焦点絞り３３は、結像光学系側の共焦点絞りとして機能する。

なお、図４の例では、開口８１Ｌの列乃至開口８１Ｒの列のそれぞれに対応するシリンドリカルマイクロレンズ１５１−１乃至シリンドリカルマイクロレンズ１５１−３により、照明光が集光されると説明したが、照明光が開口８１のそれぞれに対応するレンズにより集光されてもよい。

そのような場合、ビーム整形光学系３１は、例えば開口８１のそれぞれに対応するレンズのそれぞれが並べられて設けられたフライアイレンズ（レンズアレイ）から構成される。そして、照明光は、レンズのそれぞれにより集光されてスポット光とされ、レンズに対応する開口８１のそれぞれに入射する。

また、照明光がビーム整形光学系３１によりスリット形状（長方形状）に集光されて、そのスリット形状の照明光のうち、開口８１に入射した光だけが共焦点絞り３３を通過するようにしてもよい。

次に、共焦点顕微鏡システム１１の動作について説明する。

光源部２１が制御部４７の制御の基に照明光を射出すると、ビーム整形光学系３１は、光源部２１からの照明光を集光して、照明光を図１中、奥行き方向に長いスリット状（ライン状）の光束に整形する。

そして、スリット状に整形された照明光は、共焦点絞り３３乃至反射ミラー３５を通ってスキャンミラー３６ａに入射する。スキャンミラー３６ａは、制御部４７の制御にしたがって回動するとともに、反射ミラー３５から入射した照明光を反射面３６ａ−ｓにおいて反射する。ここで、スキャンミラー３６ａは、その中心を通り、反射面３６ａ−ｓに入射したスリット状の照明光の長手方向に平行な直線を軸として回動する。

また、反射面３６ａ−ｓで反射された照明光は、スキャナレンズ３７乃至対物レンズ３９により標本２５の観察面Ｔａに集光される。

例えば、図５に示すように、照明光により観察面Ｔａの領域Ｑが照明されるとする。なお、図５において、観察視野Ｆは共焦点顕微鏡２２により観察される観察面Ｔａ上の視野の領域を示している。

図５では、領域Ｑ内の四角形のそれぞれは、開口８１を通り観察面Ｔａに照射された照明光（スポット光）のそれぞれを表しており、領域Ｑがスポット光からなる長方形状の照明光により照明される。また、スポット光を表す四角形のそれぞれは、共焦点絞り３３に設けられた開口８１の配列と同じように、図中、縦方向に３列に並べられている。

標本２５の共焦点観察時においてスキャンミラー３６ａが回動すると、長方形状の照明光は、その長手方向とほぼ垂直な方向、つまり図中、左右方向（矢印Ｂの方向）に走査され、観察視野Ｆを含む照明エリアＥが照明光により隙間なく照明される。

このようにして、標本２５の観察面Ｔａが照明されると、観察面Ｔａからの観察光は、対物レンズ３９乃至照明系コリメートレンズ３４を通って共焦点絞り３３に入射する。さらに、共焦点絞り３３に入射した観察光は、開口８１を通過してビームスプリッタ３２に入射する。

ここで、共焦点絞り３３には、観察面Ｔａからの光だけでなく、標本２５における観察面Ｔａから図１中、上下方向にずれた位置からの光、つまり焦点外れの拡散した光（クロストーク成分）も観察光として入射する。共焦点ユニット２３では、共焦点絞り３３が観察面Ｔａと共役な位置に配置されているため、共焦点絞り３３に入射した観察光のうちのクロストーク成分の殆どは、開口８１を通過することなく遮蔽されることになる。

例えば、図６Ａに示すように、観察光のクロストーク成分のうち、開口８１近傍の斜線が施された領域に入射した光は、開口８１を通過せずに共焦点絞り３３により遮蔽される。図６Ａにおいて、開口８１近傍の左下方向の斜線が施された領域、すなわち各開口８１の図中、左右に位置する領域は、共焦点絞り３３だけでなく、従来のスリット走査方式の共焦点絞りによっても遮蔽することのできたクロストーク成分が入射する領域である。

一方、開口８１近傍の右下方向の斜線が施された領域、すなわち各開口８１の図中、上下に位置する領域は、共焦点絞り３３により遮蔽されるクロストーク成分が入射する領域であり、このクロストーク成分は、従来のスリット走査方式の共焦点絞りでは遮蔽することができない成分である。

つまり、従来のスリット走査方式の共焦点絞りは、スリット状の開口を有しているため、開口の短手方向についてはクロストーク成分を遮蔽することができるが、長手方向については、クロストーク成分を遮蔽することができない。

これに対して、本発明の共焦点絞り３３では、各開口列において開口８１が、長さ２Ｄ１の間隔が空けられて並べられているため、スリット状の観察光の長手方向のクロストーク成分も遮蔽することができる。

例えば、図６Ｂに示すように、共焦点絞り３３に入射した観察光のうち、開口８１Ｒと、隣接する他の開口８１Ｒとの間の部分に入射した光は遮蔽される。なお、図６Ｂは、共焦点絞り３３を図６Ａ中、右から左方向に見た図を示しており、斜線部分は、焦点外れの観察光を表している。

図６Ｂでは、標本２５における観察面Ｔａよりも対物レンズ３９からより遠い部分からの焦点外れの観察光が、共焦点絞り３３の手前側（図６Ｂにおける右側）で集光されて共焦点絞り３３に入射している。そして、図６Ｂ中、右側から開口８１Ｒ−１乃至開口８１Ｒ−３のそれぞれの近傍に入射した観察光のうちの殆どが共焦点絞り３３により遮蔽され、わずかな光だけが開口８１Ｒに入射する。

このように、従来の共焦点絞りでは、スリット状の観察光の短手方向のクロストーク成分しか遮蔽することができなかったが、本発明の共焦点絞り３３によれば、観察光の短手方向だけでなく、長手方向のクロストーク成分も遮蔽することができ、共焦点効果をより高めることができる。

このようにして共焦点絞り３３を通過した観察光は、フィルタ４１乃至スキャナ３６を通って集光レンズ４４に入射し、集光レンズ４４により集光されて光検出器４５により受光される。光検出器４５は、集光レンズ４４からの観察光を受光し、その結果得られた撮像画像を、観察光の２次元の輝度分布データとして制御部４７に供給する。

そして、制御部４７は、光検出器４５からの２次元の輝度分布データに基づいて、観察面Ｔａの２次元画像を生成し、２次元画像を表示部４８に供給して表示させる。例えば、制御部４７は、照明光が照明エリアＥの端から端まで走査される間に得られた２次元の輝度分布データを用いて、１枚（１コマ）分の２次元画像を生成する。

これにより、観察者は、表示部４８に表示される２次元画像を見て観察視野Ｆ、つまり標本２５の観察面Ｔａを観察することができる。また、観察者は、操作部４６等を操作して、ステージ４０を対物レンズ３９の光軸と平行な方向に移動させることで、標本２５の任意の部位を観察面Ｔａとして観察することができる。

以上のように、複数の開口からなる開口列が並べられた共焦点絞り３３を用いることで、観察光の短手方向だけでなく、長手方向のクロストーク成分も遮蔽することができ、簡単に共焦点効果、例えばセクショニング分解能やコントラストを高めることができる。

すなわち、共焦点顕微鏡システム１１によれば、画素信号を補正する演算処理、つまり２次元画像からクロストーク成分を除去する演算処理等を必要とせずに、光検出器４５による観察光の受光前に、観察光の長手方向のクロストーク成分を物理的に除去することができるので、簡単に共焦点効果を高めることができる。しかも画素信号の補正の演算処理が必要ないので、迅速に２次元画像を得ることができ、スリット走査方式の特徴である高速性が損なわれることもない。また、演算処理を実行させるプログラムの開発のためのコストや時間も不要である。

なお、以上においては、照明光学系および結像光学系における、ビームスプリッタ３２と標本２５との間が共通な光学系とされ、共焦点絞り３３が照明光学系側の共焦点絞りとしても、結像光学系側の共焦点絞りとしても機能すると説明したが、共焦点絞りが複数設けられてもよい。

そのような場合、共焦点絞り３３は照明光学系側の共焦点絞りとされ、結像光学系には、結像光学系側の共焦点絞りとして、共焦点絞り３３とは異なる他の共焦点絞りが配置される。そして観察光は、照明光とは異なる光路を通って他の共焦点絞りに入射し、他の共焦点絞りを通過した観察光は、図１とは異なる位置に配置されたフィルタ４１乃至集光レンズ４４を通って光検出器４５に受光される。この場合、他の共焦点絞りは、共焦点絞り３３と同じもの、つまり他の共焦点絞りは、共焦点絞り３３と同じ配列の開口が設けられたものとされ、他の共焦点絞りは、観察面Ｔａと共役な位置に配置される。

また、図１では、スキャンミラー３６ａには、反射面３６ａ−ｓおよび反射面３６ａ−ｒが設けられているが、スキャンミラー３６ａに反射面３６ａ−ｓだけが設けられ、反射ミラー４３からの観察光を反射する他のスキャンミラーが別に設けられてもよい。

さらに、共焦点絞り３３を開口８１からなるスリットの短手方向から見た場合、長手方向に隣接する開口８１同士の端が重なるように、開口８１が設けられると説明したが、厳密には開口８１同士の端がほぼ重なっていればよい。

つまり、短手方向から見て開口８１同士（の一部）が重なれば、２次元画像の開口８１の境界に対応する部分には受光量の増加に起因する白線が入り、開口８１同士が離れていれば、２次元画像の開口８１の境界に対応する部分には受光量の減少に起因する黒線が入る。そして、２次元画像上のそれらの白線や黒線の太さは、開口８１同士の重なり具合、離れ具合によって変化する。そのため、短手方向から見た隣接する開口８１の端同士の距離は、２次元画像上の線の太さが観察者にとって標本２５を観察するために許容される太さとなる距離であればよい。

例えば、図７に示すように、共焦点絞り３３に設けられる開口が円形状であるとし、開口からなるスリットの短手方向から見て、長手方向に互いに隣接する開口１８１と開口１８２とが重なっていたとする。つまり、共焦点絞り３３の所定の開口列上の開口１８１を他の開口列上に移動させたときに、その開口列上の開口１８２と開口１８１とが重なったとする。また、開口１８１および開口１８２のそれぞれの直径をＸとし、開口１８１と開口１８２とが重なる部分の、スリットの短手方向の長さがＰであるとする。

照明光で標本２５を走査するときに、標本２５において、最も走査時間の長い部分は、各開口の直径の部分を通過する照明光により走査される部分である。また、開口１８１と開口１８２とが重なる部分の長さＰの２倍の値２Ｐが直径Ｘを超えると２次元画像上の明るさのむらが大きくなり、白線の太さが太くなる。したがって、標本２５をできるだけ均一に照明しようとすると、例えば２Ｐ≦Ｘが満たされることが望ましい。

なお、２Ｐ＝Ｘである場合には、開口同士が重なっている部分の開口１８１の図中、下側の端から開口１８２の図中、上側の端までの距離は、０．１４Ｘとなる。

また、以上においては、共焦点絞り３３に正方形状の開口８１からなる３つの開口列が並べられて設けられている例について説明したが、開口列の数は複数であればいくつでもよく、また開口８１の形状も正方形状に限らず、円形状など他の形状であってもよい。

図８および図９は、共焦点絞り３３の他の構成例を示す図である。

例えば、図８Ａに示す共焦点絞り３３では、１辺の長さＤ１の正方形状の開口８１が図中、縦方向に２Ｄ１だけ間隔が空けられて、かつ横方向にＤ２だけ間隔が空けられて並べられている。つまりｎ個の開口８１Ｌの列、ｎ個の開口８１Ｃの列、およびｎ個の開口８１Ｒの列が、図中、横方向に並べられて設けられている。さらに、開口８１Ｌの列は、開口８１Ｃの列よりも距離２Ｄ１だけ図中、下側に位置しており、開口８１Ｒの列は、開口８１Ｃの列よりも距離Ｄ１だけ下側に位置している。

また、図８Ｂに示す例では、共焦点絞り３３には、１辺の長さＤ１の正方形状の開口８１が図中、縦方向に２Ｄ１だけ間隔が空けられて、かつ横方向に隣接するように並べられている。つまりｎ個の開口８１Ｌの列、ｎ個の開口８１Ｃの列、およびｎ個の開口８１Ｒの列が互いに間隔を空けずに隣接して図中、横方向に並べられて設けられている。さらに、開口８１Ｌの列は、開口８１Ｃの列よりも距離Ｄ１だけ図中、下側に位置しており、開口８１Ｃの列は、開口８１Ｒの列よりも距離Ｄ１だけ下側に位置している。

さらに、図８Ｃに示す例では、共焦点絞り３３には、直径Ｄ１の円形状の開口２１１Ｌ−１乃至開口２１１Ｌ−ｎ、開口２１１Ｃ−１乃至開口２１１Ｃ−ｎ、および開口２１１Ｒ−１乃至開口２１１Ｒ−ｎのそれぞれが、図２の開口８１Ｌ−１乃至開口８１Ｌ−ｎ、開口８１Ｃ−１乃至開口８１Ｃ−ｎ、および開口８１Ｒ−１乃至開口８１Ｒ−ｎのそれぞれと同じ配置で並べられている。つまり、図２に示す例と、図８Ｃに示す例とでは、共焦点絞り３３に設けられた開口の形状だけが異なる。

また、図９Ａに示す例では、共焦点絞り３３には、１辺の長さＤ１の正方形状の開口２３１Ｌ−１乃至開口２３１Ｌ−ｎが、距離Ｄ１だけ間隔が空けられて図中、縦方向に並べられている。また、共焦点絞り３３には、１辺の長さＤ１の正方形状の開口２３１Ｒ−１乃至開口２３１Ｒ−ｎが、距離Ｄ１だけ間隔が空けられて図中、縦方向に並べられている。

なお、以下、開口２３１Ｌ−１乃至開口２３１Ｌ−ｎのそれぞれを個々に区別する必要のない場合、単に開口２３１Ｌと称し、開口２３１Ｒ−１乃至開口２３１Ｒ−ｎのそれぞれを個々に区別する必要のない場合、単に開口２３１Ｒと称する。

また、図９Ａに示す共焦点絞り３３では、開口２３１Ｌの列と、開口２３１Ｒの列とが距離Ｄ２だけ間隔が空けられて図中、横方向に並べられている。さらに、開口２３１Ｌの列は、開口２３１Ｒの列よりも距離Ｄ１だけ図中、下側に位置している。

さらに、図９Ｂに示す例では、共焦点絞り３３において、図９Ａに示した開口２３１Ｌの列と、開口２３１Ｒの列との間の距離Ｄ２が０とされ、開口２３１Ｌの列と開口２３１Ｒの列とが互いに間隔を空けずに隣接して並べられている。

このように、共焦点絞り３３に設けられる開口列の数や開口の形状、隣り合う開口列の間隔などは適宜、変更することが可能である。

例えば、開口列の数（例えば、図２の例では３列）を増やすと、開口列における隣り合う開口と開口との間の距離を長くすることができるので、クロストーク成分を減らすという点でより有利になる。その反面、スリット状に整形される照明光の短手方向の長さが長くなるので、照明光の単位面積当たりのパワー（強度）が弱くなり、また標本２５の所定の部位を観察するために照明光を走査させる距離が、開口列数が増えた分だけ長くなる。したがって、クロストーク成分の除去と、照明光の走査距離および照明光の強度との両方のバランスによって、開口列の数を定めるとよい。

また、開口列と開口列との間の距離Ｄ２を長くするほどクロストーク成分を減らすことができる。しかしながら、距離Ｄ２を長くすると、その分だけスリット状に整形される照明光の短手方向の長さが長くなるので、標本２５の所定の部位を観察するために照明光を走査させる距離が長くなる。また、共焦点絞り３３に入射させる照明光の幅をビーム整形でより広げる必要がある。したがって、開口列と開口列との間の距離Ｄ２も、共焦点ユニット２３の性能と実用性の兼ね合いで定めればよい。

さらに、例えば、図８Ｂや図９Ｂに示した例のように、共焦点絞り３３の開口列と開口列との間の距離Ｄ２が０である場合には、開口列同士の距離が短いため、クロストーク成分の除去の面では不利になるが、照明光の走査範囲が少なく、スリット状に整形された照明光の単位面積当たりの強度はより強くなる。

さらに、また、共焦点ユニット２３に、開口８１の大きさや配列の異なる複数の共焦点絞り３３が設けられるようにしてもよい。そのような場合、共焦点ユニット２３は、共焦点観察時に用いられる対物レンズ３９や標本２５に応じて、複数の共焦点絞り３３のうちの適切なものを選択し、照明光および観察光の光路上に配置する。また、この場合、各共焦点絞り３３に適した複数のビーム整形光学系３１を設けて、共焦点ユニット２３が、照明光および観察光の光路上に配置された共焦点絞り３３に対して適切なビーム整形光学系３１を選択し、照明光の光路上に配置するようにしてもよい。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

本発明を適用した共焦点顕微鏡システムの一実施の形態の構成例を示す図である。 共焦点絞りの構成例を示す図である。 共焦点絞りにおける開口の配列を説明する図である。 ビーム整形光学系の構成例を示す図である。 照明光の走査を説明する図である。 共焦点絞りで遮蔽されるクロストーク成分について説明する図である。 開口同士の距離について説明する図である。 共焦点絞りの他の構成例を示す図である。 共焦点絞りの他の構成例を示す図である。

符号の説明

１１ 共焦点顕微鏡システム， ２１ 光源部， ２２ 共焦点顕微鏡， ２３ 共焦点ユニット， ２４ コンピュータ， ２５ 標本， ３１ ビーム整形光学系， ３３ 共焦点絞り， ３６ スキャナ， ３６ａ スキャンミラー， ３９ 対物レンズ， ４５ 光検出器， ８１Ｌ−１乃至８１Ｌ−ｎ，８１Ｃ−１乃至８１Ｃ−ｎ，８１Ｒ−１乃至８１Ｒ−ｎ 開口， ２１１Ｌ−１乃至２１１Ｌ−ｎ，２１１Ｃ−１乃至２１１Ｃ−ｎ，２１１Ｒ−１乃至２１１Ｒ−ｎ 開口， ２３１Ｌ−１乃至２３１Ｌ−ｎ，２３１Ｒ−１乃至２３１Ｒ−ｎ 開口

Claims (6)

1. 観察対象の標本に照明光を照射する照明光学系と、前記標本からの観察光を結像させる結像光学系との共通な光学系上に配置され、第１の方向に間隔を空けて並べられた複数の開口からなる開口列が、前記第１の方向とは異なる第２の方向に複数並べられて設けられた共焦点絞りと、
   前記照明光を集光して前記共焦点絞りの前記開口に入射させるビーム整形手段と、
   前記共焦点絞りを通過した前記照明光を反射して前記標本に照射する反射面を有し、前記反射面を駆動させて前記照明光を前記標本上で走査させるスキャナと
   を備え、
   前記共焦点絞りには、前記第２の方向から見た場合に、複数の前記開口列の全ての開口が互いに隣接して前記第１の方向に一列に並ぶ仮想の開口列が形成可能なように並べられ、前記仮想の開口列が形成されたとき前記開口の端が隣接する開口の端とほぼ重なるように、前記開口が配列されている
   ことを特徴とする共焦点ユニット。
2. 前記ビーム整形手段は、前記開口列のそれぞれに対応するレンズのそれぞれからなり、前記レンズは、前記照明光を前記開口列とほぼ同じ形状に集光して、対応する前記開口列に入射させる
   ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点ユニット。
3. 前記ビーム整形手段は、前記開口のそれぞれに対応するレンズのそれぞれからなり、前記レンズは、前記照明光を集光して、対応する前記開口に入射させる
   ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点ユニット。
4. 請求項１乃至請求項３の何れか一項に記載の共焦点ユニットを備えることを特徴とする共焦点顕微鏡。
5. 観察対象の標本に照明光を照射する照明光学系に配置され、第１の方向に間隔を空けて並べられた複数の開口からなる開口列が、前記第１の方向とは異なる第２の方向に複数並べられて設けられた第１の共焦点絞りと、
   前記照明光を集光して前記第１の共焦点絞りの前記開口に入射させるビーム整形手段と、
   前記第１の共焦点絞りを通過した前記照明光を反射して前記標本に照射する反射面を有し、前記反射面を駆動させて前記照明光を前記標本上で走査させるスキャナと、
   前記標本からの観察光を結像させる結像光学系に配置され、前記第１の共焦点絞りと同じ配列の開口が設けられた第２の共焦点絞りと
   を備え、
   前記第１の共焦点絞りには、前記第２の方向から見た場合に、複数の前記開口列の全ての開口が互いに隣接して前記第１の方向に一列に並ぶ仮想の開口列が形成可能なように並べられ、前記仮想の開口列が形成されたとき前記開口の端が隣接する開口の端とほぼ重なるように、前記開口が配列されている
   ことを特徴とする共焦点ユニット。
6. 標本の共焦点観察に用いる共焦点絞りであって、
   第１の方向に間隔を空けて並べられた複数の開口からなる開口列が、前記第１の方向とは異なる第２の方向に複数並べられて設けられており、
   前記第２の方向から見た場合に、複数の前記開口列の全ての開口が互いに隣接して前記第１の方向に一列に並ぶ仮想の開口列が形成可能なように並べられ、前記仮想の開口列が形成されたとき前記開口の端が隣接する開口の端とほぼ重なるように、前記開口が配列されている
   ことを特徴とする共焦点絞り。

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