JP2009162660A - 検出方法及び検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】試料の目詰まりを防止すると共に、濃度が高い複数の試料を高精度でかつ短時間に検出することができる検出方法及び検出装置を提供する。
【解決手段】内部に軸方向に対して垂直な断面が矩形状の流路が設けられたフローセル１に、複数の微小粒子４を含有するサンプル液２を、シース液３ａ，３ｂで両側から挟み込むようにして通流させ、通流方向５に対して垂直な断面が横長である帯状の層流を形成する。そして、層流状態のサンプル液２に対して、その幅方向ｗに走査しながらレーザ光６を照射し、微小粒子４から発せられた蛍光及び／又は散乱光を検出する。
【選択図】図１

Description

本発明は、微小粒子等の試料を検出する方法及びこの方法を利用した検出装置に関する。より詳しくは、試料を含むサンプル液で層流を形成し、その中に含まれる試料を検出する技術に関する。

一般に、細胞、微生物及びリポソーム等の生体関連微小粒子を識別する場合は、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学的測定方法が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各微小粒子から発せられた蛍光又は散乱光を検出することで、複数の微小粒子を１個ずつ識別する方法である。

具体的には、フローセル内において、測定対象の微小粒子を含むサンプル液と、その周囲を流れるシース（鞘）液とで層流を形成し、更に、サンプル液とシース液との間にわずかな圧力差を生じさせることで、サンプル液中に含まれる複数の微小粒子を１列に並べる。その状態でフローセルにレーザ光を照射すると、微小粒子がレーザービームを横切るように１個ずつ通過する。このとき、レーザ光により励起されて各微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を、電気光学検出器を用いて測定する。

また、従来、微小粒子に波長の異なる複数のレーザ光を照射するフローサイトメーターも提案されている（特許文献１参照）。図１２は特許文献１に記載の従来のフローサイトメーターの構成を模式的に示す図である。図１２に示すように、特許文献１に記載のフローサイトメーター１０１は、蛍光色素で修飾された細胞をフローセル内で１列に配列するための流体（フロー）系１０２と、各細胞に波長の異なる複数のレーザ光を照射し、散乱光及び蛍光等の検出対象光を検出するための光学系１０３と、光学系１０３から出力された散乱光及び蛍光に関する電気信号を制御・処理する信号処理装置１０４とで構成されている。

そして、この従来のフローサイトメーター１０１では、光源１０６ａ，１０６ｂ，１０６ｃから互いに異なる波長を有する複数のレーザ光を、所定の周期及び互いに異なる位相で照射し、更に、導光部材１０７によりこの複数のレーザ光を同一の入射光路上に導光して、細胞１０５に集光することで、複数の蛍光色素で修飾された微小粒子から発せられる複数の蛍光を検出可能にしている。

更に、従来、フローセルを使用せず、微細な流路が形成された基板を使用する方法も提案されている（例えば、特許文献２及び３参照。）。図１３は特許文献２に記載された平板状フローセル装置の構成を示す斜視図である。図１３に示す平板状フローセル装置１１０では、透明基板１１１に、細胞や粒子を含むサンプル液を貯留するサンプル液ポート１１２と、シース液を貯留するシース液ポート１１３ａ，１１３ｂとが形成されている。また、サンプル液ポート１１２及びシース液ポート１１３ａ，１１３ｂには、それぞれ流路１１４，１１５ａ，１１５ｂが連設されている。

これら流路１１３，１１５ａ，１１５ｂは、合流して１本の流路１１７となっている。これにより、各流路を通流する液は、合流点１１６においてサンプル液がシース液に挟まれるように合流し、サンプル液が層流を形成する。そして、この流路１１７においてレーザ光が照射され、測定が行われる。更に、流路１１７の末端には廃液ポート１１８が形成されている。

一方、特許文献３に記載の細胞分析分離装置においては、サンプル液導入流路と、その両側に形成された２本のシース流形成流路とが、一旦合流した後２以上の流路に分岐している。この細胞分析装置では、合流部分が測定部となり、分岐した各流路が微量粒子を分離・回収するための微小粒子分別流路となる。

特開２００７−０４６９４７号公報 特開２００３−３０２３３０号公報 特開２００４−８５３２３号公報 中内啓光監修，「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行

しかしながら、前述した従来の技術はいずれも、測定対象となる試料を含む液が通流する流路が微細であるため、試料が目詰まりしやすく、メンテナンスを頻繁に行わなければならないという問題点がある。また、従来の方法では、細胞及び微小粒子等の試料を１列に並べ、１個ずつ測定を行っているため、試料の濃度が高くなるに従い、測定時間も長くなり、流路の目詰まりも発生しやすくなるという問題点もある。

更に、従来の方法には、サンプル液に複数の試料が含まれていると、近傍を通流する試料から発せられた光が、測定対象の試料から発せられた光に漏れ込み、検出信号にクロストークが生じてしまい、試料の検出精度が低下するという問題点もある。

そこで、本発明は、試料の目詰まりを防止すると共に、濃度が高い複数の試料を高精度でかつ短時間に検出することができる検出方法及び検出装置を提供することを主目的とする。

本発明に係る検出方法は、流路内を通流する試料に光を照射し、前記試料から発せられた光を検出する方法であって、前記試料を含むサンプル液で帯状の層流を形成し、この層流状態のサンプル液の幅方向に光を走査しながら照射する。
本発明においては、サンプル液で帯状の層流を形成しているため、試料が目詰まりしにくい。また、照射光をその層流状態のサンプル液の幅方向に走査しているため、一度の走査で複数の試料を検出することができる。
この検出方法において、前記試料が微小粒子である場合、層流状態のサンプル液中において前記微小粒子が面内方向に二次元的に配置されることが望ましい。
また、層流状態のサンプル液に波長が異なる複数の光を時分割で照射することもできる。
更に、前記試料から発せられる蛍光及び／又は散乱光を検出してもよい。
更にまた、帯状の層流は、例えば前記サンプル液をシース液で挟み込み、その状態で前記流路を通流させることにより形成することができる。
更にまた、前記流路の側壁にも光を照射し、前記側壁に由来する検出光に基づいて、前記試料の通流位置を特定してもよい。
その場合、前記通流位置情報及び前記試料に照射した光の強度分布に基づいて、検出信号を補正することができる。
又は、前記通流位置情報及び前記サンプル液の流速分布に基づいて、前記光の走査速度を調節してもよい。
一方、前記試料に照射する主照射光の周囲に、補正用の複数の補助照射光を照射し、それぞれの検出信号を演算処理して、周囲を通流する試料からの漏れ込み信号を除去することもできる。

本発明に係る他の検出方法は、帯状の層流を形成し、この層流中に含まれる試料を、前記層流の幅方向に検出手段を走査しながら検出する。
本発明においては、帯状の層流を形成しているため、試料の目詰まりが発生しにくく、また、層流の幅方向に検出しているため、一度に複数の試料が検出可能となる。
この検出方法における前記検出手段としては、例えば磁場又は電場が挙げられる。
また、前記試料が微小粒子である場合は、層流状態のサンプル液中において前記微小粒子が面内方向に二次元的に配置されることが望ましい。
更に、前記サンプル液をシース液で挟み込み、その状態で前記流路を通流させることにより、帯状の層流を形成してもよい。

本発明に係る検出装置は、流路内を通流する試料に光を照射し、前記試料から発せられた光を検出する検出装置であって、試料を含むサンプル液で帯状の層流を形成する層流形成部と、層流状態のサンプル液に対してその幅方向に走査しながら光を照射する光照射部と、前記試料から発せられた光を検出する検出部とを有するものである。
本発明においては、サンプル液で帯状の層流を形成しているため、試料が目詰まりしにくくなる。また、サンプル液の幅方向に走査しながら光を照射しているため、一度の走査で複数の試料を検出することができる。
この検出装置では、前記試料が微小粒子である場合は、前記層流形成部において、前記サンプル液中の微小粒子が面内方向に二次元的に配置される。
また、層流状態のサンプル液に、波長が異なる複数の光を時分割で照射することもできる。
更に、前記検出部において、前記試料から発せられる蛍光及び／又は散乱光を検出してもよい。
更にまた、前記サンプル液をシース液で挟み込み、その状態で前記流路を通流させることにより、帯状の層流を形成することもできる。
一方、この検出装置では、前記流路の側壁にも光を照射することができ、その場合、前記側壁に由来する検出光に基づいて、前記試料の通流位置を特定することもできる。
そして、前記通流位置情報及び前記試料に照射した光の強度分布に基づいて、検出信号を補正したり、又は、前記通流位置情報及び前記サンプル液の流速分布に基づいて、前記光の走査速度を調節したりすることができる。
また、前記試料に照射される主照射光の周囲に、補正用の複数の補助照射光を照射することもでき、その場合、それぞれの検出信号を演算処理することにより、周囲を通流する試料からの漏れ込み信号を除去することができる。

本発明に係る他の検出装置は、帯状の層流を形成し、この層流中に含まれる試料を、前記層流の幅方向に検出手段を走査しながら検出するものである。
本発明においては、帯状の層流を形成しているため、試料の目詰まりが発生しにくい。また、層流の幅方向に検出しているため、１回の走査で複数の試料が検出可能である。
この検出装置では、前記検出手段として、磁場又は電場を適用することができる。
また、前記試料が微小粒子である場合、層流状態のサンプル液中において前記微小粒子が面内方向に二次元的に配置されていることが望ましい。
更に、帯状の層流を形成する際は、前記サンプル液をシース液で挟み込み、その状態で前記流路を通流させればよい。

本発明によれば、帯状の層流を形成し、その幅方向に検出しているため、試料の目詰まりを防止できると共に、１度の走査で複数の試料を検出することができるようになり、その結果、メンテナンス回数を低減することができると共に、測定時間を大幅に短縮することが可能となる。また、複数の試料からの漏れ込み信号を除去することで、より正確な検出信号を得ることができる。

以下、本発明を実施するための最良の形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す実施形態に限定されるものではない。

先ず、本発明の第１の実施形態に係る検出方法について、細胞及びマイクロビーズ等の微小粒子を検出する場合を例にして説明する。図１（ａ）は本実施形態の検出方法におけるサンプル液の通流状態を示す断面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）に示すＡ−Ａ線による断面図である。図１（ａ）及び（ｂ）に示すように、本実施形態の検出方法では、先ず、内部に軸方向に対して垂直な断面が矩形状の流路が設けられたフローセル１に、複数の微小粒子４を含有するサンプル液２を、シース液３ａ，３ｂで両側から挟み込むようにして通流させ、通流方向５に対して垂直な断面が横長である帯状の層流を形成する。

このとき、本実施形態のようにサンプル液中に複数の微小粒子４が含まれており、これらを個別に検出する必要がある場合には、例えば、層流状態のサンプル液２の厚さｄを調節する等して、複数の微小粒子４を面内方向に二次元的に配置することが望ましい。このように、帯状層流となっているサンプル液２において、その厚さ方向で微小粒子４が重なり合わないようにすることにより、後述する検出工程における微小粒子４の検出精度を向上させることができる。

そして、本実施形態の検出方法においては、層流状態のサンプル液２に対して、その幅方向ｗに走査しながらレーザ光６を照射し、微小粒子４から発せられた蛍光及び／又は散乱光を検出する。図２は本実施形態の検出方法における光学系の構成の一例を模式的に示す図である。本実施形態の検出方法を実現するための光学系としては、例えば、図２に示すように、フローセル１の一方の面側に、レーザ光６を照射するための光照射部、及び微小粒子４から発せられた散乱光１０を検出する散乱光検出部を設けると共に、フローセル１の他方の面側に、微小粒子４から発せられた蛍光１１を検出する蛍光検出部を設けた構成とすることができる。

図２に示す光学系における光照射部は、例えば、レーザ発振器、ミラー及び集光レンズ７等を備えており、レーザ発振器から出射され、ミラーによりフローセル１の方向に反射されたレーザ光６を、集光レンズ７で集光してサンプル液２に照射する。その際、レーザ発振器は、測定内容等に応じて適宜選択することができるが、例えば、ＹＡＧレーザ等の固体レーザ、半導体レーザ及びフェムト秒レーザ等を使用することができる。なお、照射するレーザ光６の大きさは、測定する試料の大きさと略同じにすることが望ましい。これにより、近傍を通流する試料に起因する漏れ込み信号を低減することができる。

また、レーザ光６を走査する方法としては、例えば、音響光学素子（Acousto-Optic Modulator；ＡＯＭ）やＭＥＭＳ（micro electro mechanical systems）により光ビームを操作させる方法、光学系のうち集光レンズ部分のみを機械的に走査させる方法等を適用することが可能である。

一方、蛍光検出部及び散乱光検出部は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）及びＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）等の光検出装置、分光素子、ミラー及び集光レンズ等を備えた構成とすることができる。図２に示す光学系の場合は、複数の集光レンズ８ａがマトリクス状に配置されたフライアイレンズ８と、集光レンズ８ａよりも大径の集光レンズ９とが、各レンズの光軸が相互に並行になるように配置されている。そして、フローセル１から出射した蛍光１１は、フライアイレンズ８のいずれかの集光レンズ８ａで集光された後、更に、フライアイレンズ８よりも外側に配置された集光レンズ９で集光される。このような構成にすることにより、レーザ光６を層流の幅方向に走査することによりその光軸が幅方向に変化した場合でも、効率よく蛍光１１を集光することができる。

更に、フローセル１の集光レンズ８側の内面、即ち、蛍光１１が出射する側の内面にダイクロイックフィルター１２を設けてもよい。これにより、試料に照射したレーザ光６の波長をダイクロイックフィルター１２で除去することができるため、ＣＣＤ又はＰＭＴ等の光検出装置に、試料から発せられる光のみを入射させることができる。

図３は図２に示す光学系で蛍光強度を測定した結果を示す図である。図３に示すように、上述した構成の検出装置により、微小粒子４の蛍光強度を測定すると、１回の走査で複数の微小粒子４から発せられた蛍光１１を検出することができる。そして、この測定データを解析することで、各微小粒子４の大きさ、形状、内部状態、表面状態及び表面抗体反応等を識別することができる。

なお、本実施形態の検出方法においては、波長の異なる複数のレーザ光を時分割で照射してもよい。これにより、１回の走査で励起波長が異なる微小粒子４を検出することができるため、測定効率を更に向上させることができる。

上述の如く、本実施形態の検出方法においては、測定対象の微小粒子４を含むサンプル液２で、通流方向５に垂直な断面が横長である帯状の層流を形成しているため、従来の検出方法よりも流路の軸方向（液通流方向）に垂直な断面の面積が大きくなる。これにより、微小粒子４が目詰まりしにくくなり、メンテナンス回数を低減することができる。

また、本実施形態の検出方法では、従来の検出方法のようにレーザ光の照射位置を固定するのではなく、サンプル液２の幅方向にレーザ光６を走査しているため、１回の走査で複数の微小粒子４を測定することが可能である。そして、波長が異なる複数のレーザ光を時分割照射することにより、測定効率を更に向上させることができる。その結果、従来の検出方法に比べて、測定に要する時間を大幅に短縮することができる。

更に、本実施形態の検出方法では、従来の検出方法よりもサンプル液の流量を多くすることができるため、検出結果に基づいて行う微小粒子の分取の速度も向上する。更に、従来の検出方法よりも流量を多くして、流体圧力を下げることが可能であるため、微小粒子にかかる圧力を下げ、微小粒子に与えるダメージを低減することができる。この効果は、細胞等の生体物質を測定する場合に、特に有効である。

本実施形態の検出方法においては、各種方法で近傍を通流する試料に起因する試料からの漏れ込み信号を除去することで、より正確な検出信号を得ることができる。また、走査している照射光から得られる通流位置情報を用いることで、検出信号の強度補正及び試料の通流調整が可能となる。その結果、試料を更に高精度に検出することができると共に、より詳細に解析を行うことができる。

なお、本実施形態の検出方法では、試料が細胞及びビーズ等の微小粒子である場合について述べたが、本発明はこれに限定されるものではなく、ＤＮＡ、タンパク質、血液及び組織片等の検出に適用することが可能である。本実施形態の検出方法は、特に、フィルタ等によって大きさ毎の分別を行っていないＤＮＡ、タンパク質、血液及び組織片を測定する場合に好適である。

また、試料に照射する光もレーザ光に限定されるものではなく、可視光、赤外光及び紫外光等各種波長の光を照射することが可能であり、その際検出する光も、照射光及び試料の特性に応じて適宜選択することができる。特に、照射光として、レーザ又は発光ダイオード（Light Emitting Diode：ＬＥＤ）から発せられる光を用いることが好ましい。

更に、流路の形状も、軸方向（通流方向）に垂直な断面形状が矩形の場合に限定されるものではない。図４（ａ）及び（ｂ）は流路の断面形状を示す図である。具体的には、軸方向に垂直な断面形状が矩形状の流路以外に、例えば、図４（ａ）に示すフローセル１３のように軸方向に垂直な断面形状が正方形状、又は、図４（ｂ）に示すフローセル１４ように軸方向に垂直な断面形状が円形状でもよく、更には、軸方向に垂直な断面形状が楕円形状の流路等を適用することもできる。

更にまた、流路内を通流する試料を検出する手法も光照射に限定されるものではなく、例えば、試料が磁気ビーズ又は磁気修飾された細胞等のように磁場で検出可能なものである場合には、ホール素子若しくは磁気的光素子等の磁場検出素子で検出する方法を適用することができる。また、試料が微小導電体等のように電場で検出可能なものである場合は、微小対向電極素子等の電場検出素子で、例えば電気抵抗の変化等を検出する方法を適用することができる。図５は電場又は磁場によって試料を検出する方法を模式的に示す図である。その場合、図５に示すように、磁気検出素子又は電場検出素子からなる検出素子３３ａを、複数個配列した磁気検出素子アレイ又は電場検出素子アレイ３３を、各検出素子３３ａが流路の幅方向に並ぶように配置することで、磁場又は電場を流路の幅方向に走査することができる。

次に、本発明の第２の実施形態に係る検出方法について説明する。前述した第１の実施形態の検出方法ではフローセルを使用して試料を検出しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、微細流路が形成された基板等を使用することもできる。そこで、本実施形態の検出方法においては、基板に形成された微細流路内で帯状の層流を形成し、その中に含まれる試料を検出する。

図６は本実施形態の検出方法において、帯状の層流を形成するための流路構造の一例を模式的に示す斜視図であり、図７は図６に示す流路内をサンプル液が流れる状態を模式的に示す斜視図である。基板に形成された流路内で帯状の層流を形成する場合、例えば基板内に図６に示す流路構造を設ければよい。具体的には、基板内に、サンプル液導入流路２１の両側から２本のシース液導入流路２２ａ，２２ｂが合流して１本の流路となった後、サンプル液導入方向ｘに同一平面上で直交する方向ｙに屈曲する第１屈曲部２３、方向ｘ及び方向ｙに対して垂直な方向ｚに屈曲する第２屈曲部２４、サンプル液導入方向ｘに屈曲する第３屈曲部２５がこの順に設けられた構造の流路を形成すればよい。この流路構造の場合、第３屈曲部２５よりも下流の任意の位置に測定部２６が設けられる。

この図６に示す流路にサンプル液２７及びシース液２８ａ，２８ｂを通流させると、図７に示すように、サンプル液導入流路２１とシース液導入流路２２ａ，２２ｂとの合流部において、サンプル液２７は両側からシース液２８ａ，２８ｂに挟み込まれて帯状の流れを形成する。このとき、各液は方向ｘに向かい、方向ｙに対してシース液２８ａ，サンプル液２７及びシース液２８ｂの順に通流している。その後、第１屈曲部２３において通流方向が同一平面上で略９０°回転して方向ｙとなり、更に第２屈曲部２４では垂直方向に９０°回転して方向ｚになる。更に、第３屈曲部２５において、通流方向はサンプル液導入流路２１と同じ方向ｘとなり、各液の配置は方向ｚに向かってシース液２８ａ、サンプル液２７及びシース液２８ｂの順となる。そして、この第３屈曲部２５を通過したサンプル液２７は、通流方向に対して垂直な断面が横長である帯状の層流となる。

また、本実施形態の検出方法においても、前述した第１の実施形態の検出方法と同様に、層流状態のサンプル液２７に対して、その幅方向に走査しながら光を照射し、その中に含まれる試料から発せられた光を検出する。例えば、図６に示す流路構造が設けられた基板を使用する場合は、測定部２６において、サンプル液２７の幅方向、即ち、方向ｙに平行な方向に走査しながらレーザ光等の光を照射する。

なお、基板に設けられる流路の構造は図６及び図７に示す構造に限定されるものではなく、帯状の層流を形成することができる構造であればよい。図８（ａ）は帯状の層流を形成するための流路の他の構造例を模式的に示す斜視図であり、図８（ｂ）は図８（ａ）に示す流路内をサンプル液が流れる状態を模式的に示す斜視図である。例えば、図６及び図７に示す構造以外にも、図８（ａ）及び（ｂ）に示すように、屈曲部が１つしかない構造の流路でも、帯状の層流を形成することが可能である。この流路構造の場合、屈曲部２９よりも下流の任意の位置に測定部２６が設けられる。

また、図６及び図７示す流路の第３屈曲部２５、又は図８に示す流路の屈曲部２９よりも下流側に、シース液導入流路を設け、帯状の層流を形成しているサンプル液をその幅方向から挟み込むようにシース液を導入する構造にすることもできる。これにより、帯状の層流の幅を容易に調節することが可能となる。

本実施形態の検出方法においても、サンプル液２７で帯状の層流を形成し、その幅方向に走査しながら光を照射しているため、試料の目詰まりを防止すると共に、複数の試料を短時間で検出することができる。これにより、フロー系のメンテナンス回数を低減することができると共に、測定時間を大幅に短縮することが可能となる。また、本実施形態の検出方法では、基板に形成された流路内において層流を形成しているため、容易にかつ安定して帯状の層流を形成することができる。

更に、本実施形態の検出方法は、レーザ光の入射方向を基板面に対して垂直にすることができるため、光学系の設置が容易、複数の基板上の点で検出可能、及び光学顕微鏡等の観察装置と組み合わせ可能等の特徴がある。更にまた、本実施形態の検出方法では、上述した流路を基板上に複数形成し、更にこれらを並列化することにより、更なる高速化が可能となる。

なお、本実施形態の検出方法における上記以外の構成及び効果は、前述した第１の実施形態の検出方法と同様である。

一方、前述した第１及び第２の実施形態の検出方法のように、帯状の層流を形成し、レーザ光照射により検出を行う場合、光を走査するためのＡＯＭ素子への光の入射位置により、レーザ光に強度分布が生じてしまうため、ＡＯＭを透過した後のレーザスポットの光量が、流路の中央部では大きく、端に近づくに従い減少するため、流路の側面近傍を通流する試料に由来する検出信号が、中央部を通流する試料に由来する検出信号に比べて小さくなることがある。このような場合、流路内における各試料の通流位置と、ＡＯＭ透過後のレーザ強度の分布とに基づいて、蛍光及び散乱光等の検出光の信号量や感度を補正することが望ましい。

図９（ａ）は横軸に流路内での幅方向の位置、縦軸に信号強度をとって、補正前の検出信号を示す図であり、図９（ｂ）はその際の幅方向におけるＡＯＭ透過後のレーザ光の強度分布を示す図である。また、図１０（ａ）は横軸に流路内での幅方向の位置、縦軸に信号強度をとって、補正後の検出信号を示す図であり、図１０（ｂ）はＡＯＭ透過後のレーザ強度の補正係数を示す図である。なお、図９（ａ）及び図１０（ａ）に示す各検出信号のうち、幅方向の位置が最も外側の信号が側壁からの検出信号であり、それよりも内側の信号が微小粒子からの信号である。

具体的には、サンプル液で帯状の層流を形成し、その幅方向に走査しながらレーザ光を照射する際に、サンプル液だけでなく、流路の側壁にもレーザ光を照射し、この部分からの散乱光、回折光、反射光又は透過光等を検出する。そして、この流路側壁に由来する検出信号に基づいて、流路内におけるレーザスポットの位置を算出すると共に、ＡＯＭ透過後のレーザ強度の補正係数を読み出し、図９（ａ）に示す各検出信号を、対応する試料の位置情報に基づいて、図１０（ｂ）に示す補正係数で補正する。これにより、図１０（ａ）に示す検出信号が得られる。

また、帯状層流の流速は、いわゆるハーゲンポアイズユ分布により、中央部分が最も早く、端になるほど遅くなるため、流路の側面近傍を通流する試料に由来する検出信号が、中央部を通流する試料に由来する検出信号に比べて大きくなることがある。このような場合は、レーザ光の走査速度を、流路内での試料の通流速度に合わせて補正することが望ましい。これにより、検出信号の強度、検出感度及び精度等を向上させることができる。

その場合も同様に、サンプル液で帯状の層流を形成し、その幅方向に走査しながらレーザ光を照射する際に、サンプル液だけでなく、流路の側壁にもレーザ光を照射し、この部分から発せられる蛍光又は散乱光を検出する。そして、流路側壁に由来する検出信号に基づき、流路内におけるレーザスポットの位置を算出すると共に、流路内での試料の通流速度係数を読み出し、各検出信号を、対応する試料の位置情報に基づいて、流速補正係数で補正すればよい。

更に、前述した第１及び第２の実施形態の検出方法のように、流路内を複数の微小粒子が通流していると、検出レーザ光が１つの場合、近傍を通流する複数の試料からの蛍光又は散乱光が重なり合い、検出信号にクロストークが発生することがある。この場合、試料に照射する主照射光の周囲に、補正用の複数の補助照射光を照射し、それぞれの検出信号を演算処理して、周囲を通流する試料からの漏れ込み信号を除去することが望ましい。

具体的には、主レーザ光に加えて、その周囲に複数の補助レーザ光を照射し、主レーザ光による検出信号と、補助レーザ光による検出信号とをそれぞれ演算することにより、漏れ込み信号を除去すればよい。これにより、主レーザ光による検出信号のＳＮ比を向上させることができる。

図１１は補助レーザ光の照射位置の一例を示す図である。具体的には、図１１に示すように、サンプル液２で帯状の層流を形成し、その幅方向に走査しながら主レーザ光３１を照射すると共に、その周囲に複数の補助レーザ光３２を照射し、各微小粒子４から発せられた蛍光又は散乱光を検出する。このとき、サンプル液２だけでなく、流路の側壁３０にも各レーザ光３１，３２を照射する。そして、流路側壁に由来する検出信号に基づき、流路内におけるレーザスポットの位置を算出し、各検出信号を、対応する試料の位置情報に基づいて、主レーザ光３１による検出信号と、補助レーザ光３２による検出信号とをそれぞれ演算すればよい。

その際の演算処理方法は、各種信号処理方法を適用することができるが、例えば、主レーザ光の検出信号をＡ、補助レーザ光の検出信号をＢ、適応係数をα（０＜α＜１）としたとき、クロストーク補正後の信号Ｃは下記数式１により求めることができる。

なお、図８においては、補助レーザ光３２を４つ設けた場合を示しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、補助レーザ光の数、配置及び強度並びに演算方法は、微小粒子の密度及び流速等に応じて適宜設定することができる。

（ａ）は本発明の第１の実施形態の検出方法におけるサンプル液の通流状態を示す断面図であり、（ｂ）は（ａ）に示すＡ−Ａ線による断面図である。 本発明の第１実施形態の検出方法における光学系の構成の一例を模式的に示す図である。 図２に示す光学系で蛍光強度を測定した結果を示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は流路の断面形状を示す図である。 電場又は磁場によって試料を検出する方法を模式的に示す図である。 本発明の第２の実施形態の検出方法において、帯状の層流を形成するための流路構造の一例を模式的に示す斜視図である。 図６に示す流路内をサンプル液が流れる状態を模式的に示す斜視図である。 （ａ）は帯状の層流を形成するための流路の他の構造例を模式的に示す斜視図であり、（ｂ）は（ａ）に示す流路内をサンプル液が流れる状態を模式的に示す斜視図である。 （ａ）は横軸に流路内での幅方向の位置、縦軸に信号強度をとって、補正前の検出信号を示す図であり、（ｂ）はその際の幅方向におけるＡＯＭ透過後のレーザ強度分布を示す図である。 （ａ）は横軸に流路内での幅方向の位置、縦軸に信号強度をとって、補正後の検出信号を示す図であり、（ｂ）はＡＯＭ透過後のレーザ強度の補正係数を示す図である。 補助レーザ光の照射位置の一例を示す図である。 特許文献１に記載の従来のフローサイトメーターの構成を模式的に示す図である。 特許文献２に記載された平板状フローセル装置の構成を示す斜視図である。

符号の説明

１、１３、１４ フローセル
２、２７ サンプル液
３ａ、３ｂ、２８ａ、２８ｂ シース液
４ 微小粒子
５ 通流方向
６ レーザ光
７、８ａ、９ 集光レンズ
８ フライアイレンズ
１０ 散乱光
１１ 蛍光
１２ ダイクロイックフィルター
２１ サンプル液導入流路
２２ａ、２２ｂ シース液導入流路
２３、２４、２５、２９ 屈曲部
２６ 測定部
３０ 側壁
３１ 主レーザ光
３２ 補助レーザ光
３３ 検出素子アレイ
３３ａ 磁場検出素子又は電場検出素子
１０１ フローサイトメーター
１０２ 流体
１０３ 光学系
１０４ 信号処理装置
１０５ 細胞
１０６ａ、１０６ｂ、１０６ｃ 光源
１０７ 導光部材
１１０ フローセル装置
１１１ 透明基板
１１２ サンプル液ポート
１１３ａ、１１３ｂ シース液ポート
１１４、１１５ａ、１１５ｂ、１１７ 流路
１１６ 合流点
１１８ 廃液ポート

Claims (26)

1. 流路内を通流する試料に光を照射し、前記試料から発せられた光を検出する方法であって、
   前記試料を含むサンプル液で帯状の層流を形成し、この層流状態のサンプル液の幅方向に光を走査しながら照射する検出方法。
2. 前記試料が微小粒子であり、層流状態のサンプル液中において前記微小粒子が面内方向に二次元的に配置されることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
3. 層流状態のサンプル液に波長が異なる複数の光を時分割で照射することを特徴とする請求項１又は２に記載の検出方法。
4. 前記試料から発せられる蛍光及び／又は散乱光を検出することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の検出方法。
5. 前記サンプル液をシース液で挟み込み、その状態で前記流路を通流させることにより、帯状の層流を形成することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の検出方法。
6. 前記流路の側壁にも光を照射し、前記側壁に由来する検出光に基づいて、前記試料の通流位置を特定することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
7. 前記通流位置情報及び前記試料に照射した光の強度分布に基づいて、検出信号を補正することを特徴とする請求項６に記載の検出方法。
8. 前記通流位置情報及び前記サンプル液の流速分布に基づいて、前記光の走査速度を調節することを特徴とする請求項６に記載の検出方法。
9. 前記試料に照射する主照射光の周囲に、補正用の複数の補助照射光を照射し、それぞれの検出信号を演算処理して、周囲を通流する試料からの漏れ込み信号を除去することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
10. 帯状の層流を形成し、この層流中に含まれる試料を、前記層流の幅方向に検出手段を走査しながら検出する検出方法。
11. 前記検出手段が、磁場又は電場であることを特徴とする請求項１０に記載の検出方法。
12. 前記試料が微小粒子であり、層流状態のサンプル液中において前記微小粒子が面内方向に二次元的に配置されることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の検出方法。
13. 前記サンプル液をシース液で挟み込み、その状態で前記流路を通流させることにより、帯状の層流を形成することを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の検出方法。
14. 流路内を通流する試料に光を照射し、前記試料から発せられた光を検出する検出装置であって、
    試料を含むサンプル液で帯状の層流を形成する層流形成部と、
    層流状態のサンプル液に対してその幅方向に走査しながら光を照射する光照射部と、
    前記試料から発せられた光を検出する検出部と、を有する検出装置。
15. 前記試料が微小粒子であり、前記層流形成部において、前記サンプル液中の微小粒子が面内方向に二次元的に配置されることを特徴とする請求項１４に記載の検出装置。
16. 層流状態のサンプル液に、波長が異なる複数の光が時分割で照射されることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の検出装置。
17. 前記検出部において、前記試料から発せられる蛍光及び／又は散乱光が検出されることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか１項に記載の検出装置。
18. 前記サンプル液をシース液で挟み込み、その状態で前記流路を通流させることにより、帯状の層流が形成されることを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれか１項に記載の検出装置。
19. 前記流路の側壁にも光が照射され、前記側壁に由来する検出光に基づいて、前記試料の通流位置が特定されることを特徴とする請求項１４に記載の検出装置。
20. 前記通流位置情報及び前記試料に照射した光の強度分布に基づいて、検出信号が補正されることを特徴とする請求項１９に記載の検出装置。
21. 前記通流位置情報及び前記サンプル液の流速分布に基づいて、前記光の走査速度が調節されることを特徴とする請求項１９に記載の検出装置。
22. 前記試料に照射される主照射光の周囲に、補正用の複数の補助照射光が照射され、それぞれの検出信号を演算処理することにより、周囲を通流する試料からの漏れ込み信号が除去されることを特徴とする請求項１４に記載の検出装置。
23. 帯状の層流を形成し、この層流中に含まれる試料を、前記層流の幅方向に検出手段を走査しながら検出する検出装置。
24. 前記検出手段が、磁場又は電場であることを特徴とする請求項２３に記載の検出装置。
25. 前記試料が微小粒子であり、層流状態のサンプル液中において前記微小粒子が面内方向に二次元的に配置されていることを特徴とする請求項２３又は２４に記載の検出装置。
26. 前記サンプル液をシース液で挟み込み、その状態で前記流路を通流させることにより、帯状の層流が形成されることを特徴とする請求項２３乃至２５のいずれか１項に記載の検出装置。
    

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