JP2009162558A - イムノクロマト分析法及びイムノクロマト分析キット - Google Patents

Abstract

【課題】 発色等を均等に底上げすることができ、共鳴プラズモン効果による増感を確実に発現させることが可能なイムノクロマト分析法を提供する。
【解決手段】 試料中の被検物質を標識物質により標識するとともに固定化された捕捉物質により捕捉して検出するイムノクロマト分析法である。標識物質を含み被検物質を認識して結合する第１標識試薬により被検物質を標識するとともに、標識物質を含み捕捉物質と同様の認識部位若しくは捕捉物質自体を認識する抗体を含む第２標識試薬により増感する。第２標識試薬は、均等に集積され、発色や発光の底上げレベルも均等になる。また、第２標識試薬は、第１標識試薬と近い位置に結合するので、標識物質間の距離も近接し、共鳴プラズモン効果が確実に発揮されて十分な増感効果が得られる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、捕捉物質を固定化した支持体（ストリップ）の一端から毛細管現象を利用して試料を含む溶液を展開し、標識した被検物質を捕捉して検出するイムノクロマト分析法及びイムノクロマト分析キットに関するものである。

イムノクロマト分析法は、妊娠検査やインフルエンザ検査において、簡易検査キットとして広く用いられる技術であり、目視のみで検出可能という簡便性を有することから利用分野も拡大する傾向にある。例えば、アレルギー患者のアレルゲンを決定するための一次スクリーニングへの適用等もその一例である。

前記イムノクロマト分析法としては、いわゆるサンドイッチ法を利用したイムノクロマトが代表的である。サンドイッチ法を利用したイムノクロマトでは、先ず、被検物質の異なる部位を認識する２種類の抗体とストリップとを用意し、一方の抗体（捕捉抗体）はストリップのテストラインと呼ばれる領域に固定化しておき、他方の抗体は例えば金コロイド粒子を標識して金コロイド標識抗体とする。そして、試料溶液を金コロイド標識抗体と混合した後、ストリップの一端に吸収させ、展開する。試料溶液中に被検物質が含まれる場合、被検物質と金コロイド標識抗体とが反応して被検物質−金コロイド標識抗体複合体が形成され、この複合体がテストライン上を通過する際に捕捉抗体に捕捉され、捕捉抗体−被検物質−金コロイド標識抗体複合体が形成される。その結果、テストラインにおいて、金コロイド標識抗体の赤色の発色が観察される。

ただし、前述の金コロイド標識抗体等を用いたイムノクロマト法では、被検物質の濃度が低い場合、その検出が困難となることがある。試料溶液中の被検物質濃度が低いと、テストラインに集積する金コロイド標識抗体量も少なくなるため、捕捉抗体が固定化された領域における金コロイド標識抗体由来のシグナル（発色）強度が例えば肉眼で認識可能なレベルに到達しないからである。

このような状況から、イムノクロマト法の検出感度を高めることを目的とした研究が各方面で進められており、例えば特許文献１において、テストラインにおける発色強度を増強する方法が提案されている。特許文献１記載の発明では、前記テストラインに予め標識物質（例えば金コロイド）を固定化しておくことで、発色強度や発光強度の底上げを図り、低濃度の被検物質の検出を可能にしている。
ＷＯ／２００７／０６１０９８

しかしながら、特許文献１記載の技術では、金コロイド等の標識物質を各ストリップに均等に固定することが難しく、底上げレベルのバラツキに繋がって誤検出の原因となるおそれがある。また、特許文献１記載の技術の場合、必ずしも十分な増感効果が得られないことがある。その原因としては、予め固定化された標識物質と、被検物質を標識する標識物質の間にある程度の距離があり、そのため共鳴プラズモン効果が十分に発揮されないのではないかと推測される。

本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、発色等を均等に底上げすることができ、また共鳴プラズモン効果による増感を確実に発現させることが可能なイムノクロマト分析法を提供することを目的とし、さらにはイムノクロマト分析キットを提供することを目的とする。

前述の課題を解決するために、本発明に係るイムノクロマト分析法は、試料中の被検物質を標識物質により標識するとともに固定化された捕捉物質により捕捉して検出するイムノクロマト分析法であって、標識物質を含み前記被検物質を認識して結合する第１標識試薬により被検物質を標識するとともに、標識物質を含み前記捕捉物質と同様の認識部位若しくは捕捉物質自体を認識する抗体を含む第２標識試薬により増感することを特徴とする。

また、本発明に係るイムノクロマト分析キットは、捕捉物質が所定の位置に固定された検出用ストリップと、標識物質を含み試料中の被検物質を認識して結合する第１標識試薬と、標識物質を含み前記捕捉物質と同様の認識部位若しくは捕捉物質自体を認識する抗体を含む第２標識試薬とを備えることを特徴とする。

例えば捕捉物質として捕捉抗体が固定化されたストリップを用いてイムノクロマト分析を行う場合、捕捉抗体が固定化された領域（判定部）においては、捕捉抗体と被検物質、第１標識試薬が複合体を形成することで、標識物質が判定部に集積される。そして、判定部に集積された標識物質が一定量を超えた場合、発色又は発光を肉眼で認識可能又は機器で検出可能となり、被検物質の存在を知ることができる。ただし、被検物質が極めて低濃度である場合、標識物質の集積も不十分となるため、発色又は発光が弱くなり、肉眼で認識できないことや、機器分析で検出できないことがある。

本発明においては、第２標識試薬を前記判定部に集積させることで増感を行いこれを解消している。前記第２標識試薬は、捕捉抗体と同様の認識部位、あるいは捕捉抗体自体と結合することで、判定部に集積される。これにより、判定部における発色又は発光の強度は、判定部に集積した第１標識試薬由来の標識物質の発色又は発光の強度と、第２標識試薬由来の標識物質の発色又は発光の強度との和となる。すなわち、判定部における発色強度又は発光強度が底上げされる。したがって、被検物質の濃度が低濃度であっても、容易に識別される。例えば、標識物質が１００個以上集積することでその発色が検知可能となる場合（目視による検出の閾値が１００個である場合）、８０個の標識物質を第２標識試薬の結合により集積することができれば、被検物質を標識する第１標識試薬による標識物質が２０個以上集積することで前記閾値を越え、目視により発色を検知できることになる。

また、前記判定部においては、捕捉物質（捕捉抗体）の数により、概ね捕捉される被検物質等の数（すなわち捕捉物質が認識する認識部位の数）が決まる。前記第２標識試薬は、捕捉物質が認識する認識部位の数や捕捉物質の数に応じて集積するので、固定化された捕捉物質の数が一定であれば、均等に集積され、発色や発光の底上げレベルも均等になる。さらに、第２標識試薬は、第１標識試薬と近い位置に結合するので、標識物質間の距離も近接し、共鳴プラズモン効果が確実に発揮されて十分な増感効果が得られる。

本発明によれば、イムノクロマト分析において、発色等を均等に底上げ（増感）することができ、また共鳴プラズモン効果による増感を確実に実現することが可能である。したがって、簡単な操作により確実に被検物質の検出を行うことが可能である。

以下、本発明を適用したイムノクロマト分析法及びイムノクロマト分析キットについて、図面を参照しながら詳細に説明する。

本発明のイムノクロマト分析法は、前述の通り、試料中の被検物質を標識物質により標識するとともに捕捉物質により固定化して検出するイムノクロマト分析法であり、例えばサンドイッチ法による免疫分析等、イムノクロマト分析全般に適用することが可能である。

サンドイッチ法による免疫分析においては、被検物質（抗原）上の異なる部位をそれぞれ認識する２種類の抗体を用いる。２種類の抗体のうち一方の抗体（捕捉物質）は、支持体であるストリップ上に固定する。捕捉物質が固定化された領域が、判定部となる。他方の抗体（標識抗体）は、ストリップには固定化せず、標識物質で標識して第１標識試薬とする。サンドイッチ法では、第１標識試薬で標識された被検物質を捕捉物質で捕捉し、検出を行う。

あるいは、単に標識試薬と捕捉物質とでサンドイッチした状態の複合体を形成して検出を行うのではなく、被検物質と特定反応物質とを結合させるとともに、被検物質に標識試薬を結合させ、前記特定反応物質に捕捉物質を結合させることで、標識された被検物質の捕捉及び検出を行うイムノクロマト分析（以下、改良イムノクロマト分析と称する。）にも適用可能である。

この場合、試料に対して、被検物質及び捕捉物質とそれぞれ特異的に結合する特定反応物質と、標識物質を含み前記被検物質の前記特定反応物質の結合部位とは異なる部位に特異的に結合する第１標識試薬とを作用させるとともに、被検物質と結合した特定反応物質を前記捕捉物質と結合させるようにする。これにより、第１標識試薬−被検物質−特定反応物質複合体が形成され、さらに、この第１標識試薬−被検物質−特定反応物質複合体が捕捉物質と結合して、第１標識試薬−被検物質−特定反応物質−捕捉物質複合体が形成される。前記捕捉物質は、支持体であるストリップ等にストライプ状に固定され、先のサンドイッチ法の場合と同様、この捕捉物質が固定された部分が判定部となる。判定部に前記第１標識試薬−被検物質−特定反応物質−捕捉抗体複合体が集積することで標識物質が視認され、試料中における被検物質の存在が検出される。

前記改良イムノクロマト分析では、被検物質に応じて特定反応物質を選択することで、多様な被検物質に対応することが可能になる。例えば、アレルゲン等の抗原を認識する抗体を被検物質とする分析も可能である。

本発明において、検出対象となる被検物質としては、免疫反応性物質を含有するものであれば任意の物質に適用することができ、例えば各種抗体や抗原等を挙げることができる。ここで、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ等）としては、抗ＤＮＡ抗体、抗ＥＮＡ抗体、抗カルジオリビン抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗平滑筋抗体等に代表される自己抗体や各種免疫グロブリン等を挙げることができ、例えばアレルゲンを特異的に認識する特異的免疫グロブリン（特異的ＩｇＥ等）の分析等にも適用することが可能である。また、抗原としては、糖タンパク質や複数のサブユニットから構成される特定タンパク質、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）等のタンパク質複合体等を挙げることができる。

サンドイッチ法では、前記被検物質の種類に応じて、第１標識試薬の標識抗体や捕捉物質（捕捉抗体）を選定すればよい。改良イムノクロマト分析では、前記被検物質の種類に応じて、特定反応物質を選定すればよく、例えば被検物質が前記自己抗体（例えば抗ＤＮＡ抗体）である場合には、当該抗ＤＮＡ抗体が認識する特定のＤＮＡを特定反応物質として用いれば良い。被検物質がγグロブリンクラスがＩｇＧである自己抗体である場合には、特定反応物質として当該ＩｇＧが認識する特定のタンパク質やタンパク質複合体等の抗原を用いればよい。被検物質がアレルゲンを特異的に認識する免疫グロブリン（ＩｇＥやＩｇＧ等）である場合には、アレルゲンを特定反応物質とすればよい。被検物質が、糖タンパク質や特定タンパク質、タンパク質複合体等の抗原である場合には、所定のタンパク質部分を認識する抗体を特定反応物質として用いれば良い。特定反応物質としては、前記各抗原自体や抗体自体を用いても良いし、それらの断片（フラグメント）を用いても良い。これら被検物質と特定反応物質の組み合わせにより、多様な被検物質についてイムノクロマト分析が可能となる。

改良イムノクロマト分析において、前記被検物質と結合しこれを標識する第１標識試薬としては、例えば被検物質を抗原として認識する標識抗体と標識物質とが結合したものを用いることができる。改良イムノクロマト分析においては、被検物質を抗原として認識する標識抗体が、被検物質の前記特定反応物質との反応部位とは異なる部位を認識するものであれば、特定反応物質と結合した被検物質に対してさらに結合することが可能である。係る標識試薬を用いれば、被検物質に対して標識物質が標識抗体を介して結合し、これを標識する。

前記標識物質としては、発色物質や発光物質等を標識物質として用いることできるが、迅速且つ簡便な検出を可能とするためには、発色物質を用いることが好ましい。ここで、発色物質としては、金属微粒子、ラテックス微粒子、有機高分子微粒子、無機微粒子、発色剤を包含したリポソーム等の発色微粒子等を用いることができる。金属微粒子としては、金微粒子、銀微粒子、白金微粒子等の貴金属微粒子、チタン微粒子、鉄微粒子、ニッケル微粒子等が例示される。金属微粒子は、粒径１ｎｍ〜１００ｎｍのコロイド状の金属微粒子であってもよい。すなわち、金コロイド粒子、銀コロイド粒子、白金コロイド粒子等の貴金属コロイド粒子や、チタンコロイド粒子、鉄コロイド粒子、ニッケルコロイド粒子を用いてもよい。ラテックス微粒子としては、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等から選ばれる少なくとも１種を含む微粒子が例示される。有機高分子微粒子としては、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等から選ばれる少なくとも１種を含む微粒子が例示される。無機微粒子としては、シリカ、アルミナ等が例示される。これらの中でも、汎用性の高い貴金属コロイド粒子、ラテックス微粒子等を用いることが好ましく、特に、明瞭な発色が得られることから、金コロイド粒子を用いることが好ましい。

第２標識試薬も、第１標識試薬と同様の標識物質を含有するが、第１標識試薬とは異なり、捕捉物質や特定反応物質を認識する抗体を標識抗体として固定化したものを用いる。当該第２標識試薬は、捕捉物質や特定反応物質に均等に結合し、第１標識試薬に含まれる標識物質による標識の底上げを図る。

支持体であるストリップに固定される捕捉物質としては、例えばサンドイッチ法の場合、被検査物質を抗原として認識する捕捉抗体が用いられる。あるいは、捕捉抗体に代えて、被検物質（抗体）に特異的に結合する捕捉抗原を捕捉物質としてストリップに固定しておくことも可能である。改良イムノクロマト分析の場合には、前記特定反応物質及び標識試薬が結合した標識試薬−被検物質−特定反応物質複合体を捕捉するものであり、前記特定反応物質を抗原と認識して結合する抗体が使用可能である。この場合、前記捕捉抗体が直接的に特定反応物質を認識するものであってもよいし、特定反応物質表面に固定された抗原を認識するものであってもよい。

例えば、特定反応物質が抗原（例えばアレルゲン）である場合、前記捕捉抗体はアレルゲンを抗原として認識する抗体であってもよいし、アレルゲン表面に付着されたビオチンを抗原として認識する抗体であってもよい。後者の場合、ビオチンが付着したアレルゲンが特定反応物質に相当することになる。アレルゲン表面にビオチンを付着し、アレルゲン表面の認識部位をビオチンとした場合、ビオチンをアレルゲンに複数個付着することで確実に固定する部分を確保でき、感度を上げることもできる。アレルゲン自体を捕捉抗体で固定すると、捕捉抗体の認識部位と近い部位を認識する被検物質（例えばＩｇＥ）の測定を阻害することになり、感度の低下を招くおそれがある。アレルゲン表面の認識部位をビオチンとすれば、これを防ぐことができ、感度を上げることができる。

被検物質を含む試料溶液としては、例えば血液、血清、尿等の生体由来の溶液や、自然環境から採取した水や土壌等を含む溶液、さらにはこれらを用いて調製して得た溶液等、任意のものを用いることができる。そして、生体物質や合成物質等、あらゆる物質を被検物質とすることができる。

試料溶液中の被検物質を検出するには、例えばサンドイッチ法においては、先ず、試料溶液と標識抗体を混合し、被検物質と標識抗体との複合体を形成させた後、捕捉物質を固定したストリップの一端側から浸透させる。イムノクロマトグラフィー法では、毛細管現象を利用して試料溶液を展開する。なお、試料溶液と標識抗体を含む溶液は、この順に個別にストリップに流すようにしてもよい。試料溶液中に被検物質が存在する場合、ストリップに固定された捕捉物質と標識抗体とがサンドイッチ状に被検物質に対して結合し、結果として被検物質に応じた量の標識抗体が判定部に集積する。

分析者は、前記判定部の発色の有無を目視により確認することで、あるいはデンシトメーター等の機器を用いて発色を検出することで、被検物質の有無を簡単に判定することができるが、被検物質の濃度が低濃度であると、必ずしも十分な発色強度が得られない場合がある。そこで、本発明では、被検物質の捕捉の後、第２標識試薬を流して、いわゆる増感を行う。第２標識試薬は、ストリップ上に固定されている捕捉物質と結合し、やはり判定部に集積する。その結果、判定部に集積した第１標識試薬の標識物質と第２標識試薬の標識物質の共鳴プラズモン効果により発色が増強され、検出感度が向上する。第２標識試薬は、前記の通り、捕捉物質と結合して第１標識試薬と近接した位置に捕捉されるので、前記共鳴プラズモン効果が確実に発揮される。また、第２標識試薬の集積量は、固定される捕捉物質の数によって概ね決まるので、発色が均等に底上げされ、増感のバラツキを抑えることができる。

改良イムノクロマト分析の場合には、先ず、試料溶液と特定反応物質及び標識試薬を混合し、第１標識試薬−被検物質−特定反応物質複合体を形成させた後、捕捉物質を固定した支持体（検出用ストリップ）に供給する。供給された試料溶液（混合液）は検出用ストリップに浸透し、毛細管現象により展開される。試料溶液中に被検物質が存在する場合、検出用ストリップに固定された捕捉物質が前記複合体の特定反応物質と結合し、結果として被検物質に応じた量の標識物質が判定部（捕捉物質が固定された部分）に集積されて可視化される。

改良イムノクロマト分析においても、被検物質の濃度が低濃度である場合には、第２標識試薬により増感を図り、発色強度を増強することが可能である。すなわち、第１標識試薬−被検物質−特定反応物質複合体を捕捉物質で捕捉した後、第２標識試薬を流して増感する。第２標識試薬は、前記捕捉物質や、捕捉物質に捕捉された第１標識試薬−被検物質−特定反応物質複合体の特定反応物質を認識して結合し、判定部に集積する。したがって、サンドイッチ法の場合と同様、判定部に集積した第１標識試薬の標識物質と第２標識試薬の標識物質の共鳴プラズモン効果により発色が増強され、検出感度が向上する。

なお、改良イムノクロマト分析においては、試料によっては阻害効果によって感度が低下する場合がある。例えば、被検物質が特定のアレルゲンを認識する特異的免疫グロブリンである場合、試料（検体）中には当該特異的免疫グロブリンの他、非特異的免疫グロブリンも含まれる。このように非特異的免疫グロブリンと分析対象である特異的免疫グロブリンが混在している場合、第１標識試薬が非特異的免疫グロブリンとも結合してしまい、特異的免疫グロブリンの検出感度が低下する。そのような場合には、阻害効果を避けるための対策を講ずることが好ましい。

前記非特異的免疫グロブリンの混在による阻害効果を回避するためには、第１標識試薬が非特異的免疫グロブリンと結合するのを避ける方法（以下、回避法と称する。）や、捕捉物質で捕捉された被検物質を再度第１標識試薬で標識する方法（以下、再標識法と称する。）等を挙げることができる。

ここで、前記回避法は、前記の通り、第１標識試薬が非特異的免疫グロブリンと結合するのを避ける方法であり、特定反応物質と結合した被検物質を捕捉物質で固定化した後に、第１標識試薬を作用させる方法である。回避法では、試料に対して特定反応物質を作用させ、被検物質と結合した特定反応物質を捕捉物質により捕捉した後、第１標識試薬を作用させて被検物質を標識する。これを実現するためには、所定の位置に捕捉物質が固定された検出用ストリップに対し、試料を特定反応物質とともに流した後、展開液により第１標識試薬を流せばよい。

前記回避法では、阻害物質（例えば非特異的免疫グロブリン）が流れてしまった後に第１標識試薬を作用させ、捕捉された被検査物質に第１標識試薬を選択的に結合するようにしているので、阻害物質による阻害効果を受けることなく被検物質を検出することができ、感度を向上することができる。この時、第１標識試薬に第２標識試薬を混合して作用させれば、被検物質の標識における阻害回避と前述の第２標識試薬による増感を併せて実現することが可能である。

一方、再標識法は、展開時に第１標識試薬で標識されなかった被検物質を再度標識し、発色を増強する方法である。再標識法では、試料に対して、前記特定反応物質及び第１標識試薬を作用させ、被検物質と結合した特定反応物質を捕捉物質により捕捉した後、前記第１標識試薬を再度作用させる。これを実現するためには、所定の位置に捕捉物質が固定された検出用ストリップに対し、試料を特定反応物質及び第１標識試薬とともに流した後、展開液により再度第１標識試薬を流せばよい。

前記再標識法では、阻害物質（例えば非特異的免疫グロブリン）の影響で第１標識試薬と結合できなかった被検物質も再度の標識で第１標識試薬と結合し、発色が増強される。したがって、検出感度を高めることが可能である。さらに、再度の標識の際に、第１標識試薬に第２標識試薬を混合して作用させれば、再標識による発色の増強と前述の第２標識試薬による増感を併せて実現することが可能である。

前述のイムノクロマト分析法は、前記第１標識試薬や特定反応物質を含むパッドや、捕捉物質を固定した検出用ストリップ、さらには展開液等から構成されるイムノクロマト分析キットを用いることにより、簡便に実施することが可能である。第１標識試薬と第２標識試薬は、別途添付してもよく、この場合、イムノクロマト分析キットは、捕捉物質が所定の位置に固定された検出用ストリップと、標識物質を含み試料中の被検物質を認識して結合する第１標識試薬と、標識物質を含み前記捕捉物質と同様の認識部位若しくは捕捉物質自体を認識する抗体を含む第２標識試薬とを備えていればよい。第１標識試薬と第２標識試薬は、展開液に混合して増感液として供することも可能である。

改良イムノクロマト分析を行うためのイムノクロマト分析キットの構成としては、捕捉物質が所定の位置に固定された検出用ストリップと、被検物質及び捕捉物質とそれぞれ特異的に結合する特定反応物質を保持する第１パッドと、第１標識物質を含み前記被検物質の前記特定反応物質の結合部位とは異なる部位に結合する標識試薬を保持する第２パッド、さらには第２標識試薬を含む増感液を備えていればよい。例えば、第１パッド、第２パッド、検出用ストリップの順に配列してこれらを結合し、イムノクロマト分析キットとすれば、前記一連の分析を当該イムノクロマト分析キットに試料溶液を第１パッドに滴下するだけで、迅速に行うことができる。

前記構成のイムノクロマト分析キットの第１パッドに試料溶液を滴下すると、第１パッドに浸透し、試料溶液に含まれる被検物質が第パッドに含まれる特定反応物質と反応する。さらに、試料溶液は第２パッドへと浸透し、特定反応物質が結合した被検物質は、第２パッドに含まれる第１標識試薬と反応する。これにより、第１標識試薬−被検物質−特定物質複合体が形成される。この複合体を含む溶液は、検出用ストリップへと浸透し展開される。検出用ストリップでは、固定された捕捉物質により前記複合体が捕捉され、標識物質が集積されることにより可視化される。前記複合体の捕捉の後、増感液を流せば、第２標識試薬による増感が行われ、発色強度が増強される。

なお、前記回避法を実施するためのイムノクロマト分析キットでは、第２パッド、第１パッド、検出用ストリップの順に配列する必要がある。イムノクロマト分析キットは、前記第１パッド、第２パッド及び検出用ストリップをプラスチック等からなる容器内に収容した状態で提供されることが多いが、この場合、当該容器には、第１パッド及び第２パッドに対応した位置にそれぞれ溶液供給孔を形成しておく。分析に際しては、第１パッドに対応する溶液供給孔から試料溶液を滴下した後、第２パッドに対応する溶液供給孔から展開液を滴下する。第１パッドに対応する溶液供給孔から試料溶液を滴下すれば、試料に対して特定反応物質のみが反応し、被検物質と結合した特定反応物質が捕捉抗体により捕捉される。次いで、第２パッドに対応する溶液供給孔から展開液を滴下すれば、捕捉された被検物質と標識試薬が接触し標識される。その後、第２標識試薬を含む増感液を流せば、第２標識試薬による増感が行われる。

再標識法を実施するためのイムノクロマト分析キットでは、前記回避法の場合とは異なり、第１パッド、第２パッド、検出用ストリップの順に配列されていればよい。これら第１パッド、第２パッド及び検出用ストリップを容器内に収容し、容器の第１パッドに対応した位置に溶液供給孔を形成する。また、第１標識試薬及び第２標識試薬を含む展開液を添付する。分析に際しては、先ず、前記溶液供給孔から試料溶液を滴下して通常通り展開を行い、第１標識試薬−被検物質−特定物質複合体を捕捉抗体で固定化した後、第１標識試薬及び第２標識試薬を含む展開液を滴下する。これにより、第１標識試薬による前記複合体の標識の増強、及び第２標識試薬による発色の底上げが行われる。

次に、アレルゲンを認識する特異的ＩｇＥを被検物質とする改良イムノクロマト分析（再標識法）を例に挙げて、本発明のイムノクロマト分析法及びイムノクロマト分析キットをより具体的に説明する。

図１は、本実施形態のイムノクロマト分析法及びイムノクロマト分析キットを説明する模式図である。本実施形態では、被検物質がアレルゲンを認識する特異的ＩｇＥであり、したがって、アレルゲン（ここではビオチンが付着したアレルゲン）が特定反応物質に相当する。標識試薬は、金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体である。アレルゲンの表面にはビオチンが付着されており、捕捉物質（捕捉抗体）としてビオチンを認識する抗ビオチン抗体を用いる。

イムノクロマト分析キットは、短冊状の検出用ストリップ１と、当該検出用ストリップ１の端部に結合された第１パッド２及び第２パッド３とから構成されており、さらに増感液が添付されている。第１パッド２や第２パッド３の配列順序は、上流側から第１パッド２、第２パッド３、検出用ストリップ１の順である。なお、検出用ストリップ１の下流側に、展開後の試料溶液を吸収する吸収パッドを備えていてもよい。

前記第１パッド２や第２パッド３には、例えばグラスウール等の上面に吸水性に優れたろ紙等が積層されたもの等が用いられ、第１パッド２には特定反応物質（ビオチンが付着したアレルゲン４）が保持されている。第２パッド３には第１標識試薬である金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５が保持されている。金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５は、発色物質である金コロイド５ａの表面に抗ＩｇＥ抗体５ｂが固定されたものである。したがって、この金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５は、ＩｇＥを抗原として認識し、これと結合する。

検出用ストリップ１には、この種のイムノクロマト法に用いられるメンブレンであれば制限無く使用することができ、例えばニトロセルロース等を用いることができる。検出用ストリップ１の中途位置には、捕捉抗体である抗ビオチン抗体６が固定されており、判定部を構成している。判定部は、検出用ストリップ１における展開方向と直交する方向の線状パターンとして形成されている。

以上の構成のイムノクロマト分析キットを用いて特異的ＩｇＥ（被検物質）の検出を行う場合、図１（ａ）に示すように、検体である血清を展開液で希釈した試料溶液７を第１パッド２に滴下する。試料溶液７中には、被検物質である特異的ＩｇＥ８の他、アレルゲンを認識しない非特異的ＩｇＥ９も含まれている。

第１パッド２に試料溶液７を滴下すると、試料溶液７は、第１パッド２、第２パッド３、さらには検出用ストリップ１へと浸透する。この過程において、各パッドからアレルゲン４や金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５が溶出し、試料溶液７中の特異的ＩｇＥ８と抗原抗体反応により結合する。すなわち、図１（ｂ）に示すように、特異的ＩｇＥ８にアレルゲン４や金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５が結合した複合体１０が形成される。なお、金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５は、非特異的ＩｇＥ９にも結合する。したがって、アレルゲン４と結合した特異的ＩｇＥ８の一部は、金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５と結合することなくそのまま展開される。

前記試料溶液７は、前記反応の後、検出用ストリップ１において毛細管現象により図中左から右に向かって展開され、図１（ｃ）に示すように、判定部においてアレルゲン４と抗ビオチン抗体６の結合によって複合体１０が捕捉される。この時、複合体１０のみならず、金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５で標識されていないアレルゲン４のみと結合した特異的ＩｇＥ８や、過剰なアレルゲン４も捕捉される。

以上により、検出用ストリップ１の判定部には、特異的ＩｇＥ８の濃度に依存して金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５が結合し、金コロイド５ａが集積される。この金コロイド５ａの集積により判定部（テストライン）が線状に発色し、目視によりアレルギーの有無を判定することができる。

ただし、図１（ａ）〜図１（ｃ）に示す手順によりイムノクロマト分析を行った場合、図１（ｃ）にも示す通り、判定部に金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５で標識されていない特異的ＩｇＥ８も捕捉され、検出感度が低下する。特に、非特異的ＩｇＥ９が試料中に多く存在している場合、試料溶液や展開液の適用後、複合体１０形成の際に、標識試薬である金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５と特異的ＩｇＥ８の結合を競合的に妨げる。その結果、判定部にトラップされた特異的ＩｇＥ８のうち、標識されない特異的ＩｇＥ８の割合が増え、テストラインの発色が抑制される。

そこで、本実施形態では、阻害物質（非特異的ＩｇＥ９）の影響で金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５と結合できなかった特異的ＩｇＥ８を再度標識するとともに、第２標識試薬である金コロイド標識抗ビオチン抗体を作用させることで発色の増強を行う。

すなわち、複合体１０のトラップの後、図１（ｄ）に示すように、金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５及び金コロイド標識抗ビオチン抗体１１を含む増感液１２を第１パッド２に滴下し、再度の展開を行う。増感液には、第１標識試薬である金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５と、第２標識試薬である金コロイド標識抗ビオチン抗体１１とを含む展開液を用いる。第２標識試薬である金コロイド標識抗ビオチン抗体１１は、金コロイド１１ａの表面に抗ビオチン抗体１１ｂが固定されたものであり、捕捉抗体と同様、アレルゲン表面のビオチンを認識し結合する。

この時点では、第１パッド２や第２パッド３には何も保持されておらず、図１（ｅ）に示すように、前記展開によって金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５及び金コロイド標識抗ビオチン抗体１１のみが流れていく。判定部に流れた金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５は、図１（ｆ）に示すように、金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５と結合していない特異的ＩｇＥ８と結合し、これを標識する。また、金コロイド標識抗ビオチン抗体１１は、捕捉抗体である抗ビオチン抗体６によって捕捉された複合体１０に含まれるアレルゲン４の表面に存在するビオチンを認識し結合する。

このように、試料溶液７の展開が終わった後に金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５及び金コロイド標識抗ビオチン抗体１１を含む増感液１２を展開することで、非特異的ＩｇＥ９の影響で標識されなかった特異的ＩｇＥ８に金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５が結合し、発色が増強されて検出感度が向上する。また、アレルゲン４の表面に金コロイド標識抗ビオチン抗体１１が結合して発色の底上げがなされ、より一層検出感度が向上する。この時、金コロイド標識抗ビオチン抗体１１は、捕捉されたアレルゲン４の数（すなわち固定された抗ビオチン抗体６の数）に比例して集積し、均一な発色増強がなされる。加えて、金コロイド標識抗ビオチン抗体１１の結合位置がアレルゲン４表面であり、金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５の結合位置と近いことから、共鳴プラズモン効果も確実に発現され、確実に発色の底上げがなされる。

さらに、図１（ｇ）に示すように、増感液１２中の金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５は、既に特異的ＩｇＥ８を介して固定化されている金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体５と結合する非特異的ＩｇＥ９にも結合し、テストラインにおける金コロイド５ａの集積度を上げる効果もあり、これも検出感度を高める効果に寄与している。

以下、本発明の具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。

（スギ花粉特異的ＩｇＥの検出）
スギ花粉をアレルゲンとして認識する特異的ＩｇＥを被検物質とし、図１に示す再標識法法によりイムノクロマト分析を行った。ただし、図１（ｃ）までの操作によりイムノクロマト分析を行った場合を比較例、図１（ｆ）までの操作によりイムノクロマト分析を行った場合を実施例とする。

試料としては陽性血清サンプル２０μＬあるいは陰性血清サンプル２０μＬを用い、これを希釈溶液（１％ＢＳＡリン酸緩衝液）２０μＬで希釈して試料溶液とした。展開液としては、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ）を０．２％含むリン酸緩衝液３０μＬを用いた。検出用ストリップには、抗ビオチン抗体を固定して線状の判定部を形成し、第１パッドにはビオチンで修飾したアレルゲンを担持させた。第２パッドには、金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体を担持させた。また、実施例においては、１０％金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有したＰＢＳ３０μＬに金コロイド標識抗ビオチン抗体（ＯＤ５２０＝０．０００６）を３０μＬ加え、増感液とした。

試料溶液（陽性コントロール血清サンプル及び陰性コントロール血清サンプル）について１５分間展開した後、増感液による増感の有無よる判定部の色の濃さ（発色強度）の相違をデンシトメーターにより測定した。結果を図２に示す。

図２から明らかなように、増感を行った実施例では、増感を行っていない比較例と比べて、陽性である場合と陰性である場合の発色強度の差が大きく、発色の識別が容易であることがわかる。

本発明を適用した実施形態（再標識法）におけるイムノクロマト分析法の基本原理を説明する模式図であり、（ａ）は試料溶液の滴下、（ｂ）は展開過程、（ｃ）は捕捉抗体による捕捉、（ｄ）は第１パッドへの増感液の滴下、（ｅ）は増感液の展開過程、（ｆ）及び（ｇ）は再標識及び増感状態をそれぞれ示す。 陽性コントロール血清及び陰性コントロール血清のイムノクロマト分析において、実施例及び比較例における発色強度の差を示す特性図である。

符号の説明

１ 検出用ストリップ、２ 第１パッド、３ 第２パッド、４ アレルゲン、５ 金コロイド標識抗ＩｇＥ抗体、５ａ 金コロイド、５ｂ 抗ＩｇＥ抗体、６ 抗ビオチン抗体、７ 試料溶液、８ 特異的ＩｇＥ、９ 非特異的ＩｇＥ、１０ 複合体、１１ 金コロイド標識抗ビオチン抗体、１１ａ 金コロイド、１１ｂ 抗ビオチン抗体、１２ 増感液

Claims (13)

1. 試料中の被検物質を標識物質により標識するとともに固定化された捕捉物質により捕捉して検出するイムノクロマト分析法であって、
   標識物質を含み前記被検物質を認識して結合する第１標識試薬により被検物質を標識するとともに、標識物質を含み前記捕捉物質と同様の認識部位若しくは捕捉物質自体を認識する抗体を含む第２標識試薬により増感することを特徴とするイムノクロマト分析法。
2. 前記試料に対して、当該被検物質及び捕捉物質と特異的に結合する特定反応物質を作用させるとともに、第１標識試薬を作用させ、
   被検物質と結合した特定反応物質を前記捕捉物質と結合させて固定化し、
   固定化された前記特定反応物質に対して前記第２標識試薬を結合させて増感することを特徴とする請求項１記載のイムノクロマト分析法。
3. 前記試料に対して、前記特定反応物質及び第１標識試薬を作用させ、被検物質と結合した特定反応物質を捕捉物質により捕捉した後、第１標識試薬と第２標識試薬を作用させることを特徴とする請求項２記載のイムノクロマト分析法。
4. 所定の位置に捕捉物質が固定された検出用ストリップに対し、試料を特定反応物質及び第１標識試薬とともに流した後、第１標識試薬及び第２標識試薬を含む増感液を流すことを特徴とする請求項３記載のイムノクロマト分析法。
5. 前記特定反応物質が抗原を含み、前記被検物質が前記抗原に反応する特異的免疫グロブリンであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載のイムノクロマト分析法。
6. 前記試料は、前記抗原に反応する特異的免疫グロブリンと、前記抗原に反応しない非特異的免疫グロブリンを含むことを特徴とする請求項５記載のイムノクロマト分析法。
7. 前記特異的免疫グロブリンが特異的ＩｇＥであり、前記非特異的免疫グロブリンが非特異的ＩｇＥであることを特徴とする請求項６記載のイムノクロマト分析法。
8. 前記抗原の表面にビオチンが固定されており、前記捕捉物質は抗原表面のビオチンと結合することを特徴とする請求項５から７のいずれか１項記載のイムノクロマト分析法。
9. 前記第２標識試薬は、前記抗原表面のビオチンを認識し結合することを特徴とする請求項８記載のイムノクロマト分析法。
10. 前記第１標識試薬及び第２試薬は、標識物質として金コロイドを含むことを特徴とする請求項１から９のいずれか１項記載のイムノクロマト分析法。
11. 捕捉物質が所定の位置に固定された検出用ストリップと、標識物質を含み試料中の被検物質を認識して結合する第１標識試薬と、標識物質を含み前記捕捉物質と同様の認識部位若しくは捕捉物質自体を認識する抗体を含む第２標識試薬とを備えることを特徴とするイムノクロマト分析キット。
12. 前記第１標識試薬と第２標識試薬を混合した増感液を備えることを特徴とする請求項１１記載のイムノクロマト分析キット。
13. 前記検出用ストリップに対して、被検物質及び捕捉物質と特異的に結合する特定反応物質を保持する第１パッドと、第１標識試薬を保持する第２パッドが結合されていることを特徴とする請求項１１または１２記載のイムノクロマト分析キット。

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