JP2009155284A - 精製ペンタメチレンジアミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミンを原料とする精製ペンタメチレンジアミンの製造方法であって、脱塩処理により、塩類によって惹起される種々の問題を回避した工業的に有利な製造方法を提供する。
【解決手段】不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を蒸留精製する精製ペンタメチレンジアミンの製造方法において、蒸留精製の前に上記の含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を脱塩処理して塩類の含有量を３ｗｔ％以下にする。
【選択図】なし

Description

本発明は、精製ペンタメチレンジアミン（慣用名：カダベリン、略号：ＰＭＤＡ）の製造方法に関し、詳しくは、不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミンを原料とする精製ペンタメチレンジアミンの製造方法に関する。

殆どのプラスチック原料にはいわゆる化石原料が使用されている。再生利用する場合を除き、プラスチックは廃棄される。その場合、燃焼等による廃棄は炭酸ガスの放出を招くことから近年問題となりつつある。そこで、地球温暖化防止及び循環型社会の形成に向けて、プラスチックの製造原料をバイオマス由来の原料に置き換えることが嘱望されている。このようなニーズは、フィルム、自動車部品、電気・電子部品、機械部品等の射出成型品、繊維、モノフィラメント等、多岐に亘る。

ポリアミド樹脂は、機械的強度、耐熱性、耐薬品性等に優れており、所謂エンジニアリングプラスチックスの１つとして多くの分野で使用されている。中でも、リジンから得られたペンタメチレンジアミンを原料として成る５６ナイロンや５６／６６ナイロン等は植物由来ポリマーとしての期待が大きい。

従来、ペンタメチレンジアミンの製造方法として、精製の際に晶析法を使用する方法が知られている（特許文献１及び２）。しかしながら、晶析率は４０〜４５％であり、晶析法では高い収率を期待できない。

これに対し、ペンタメチレンジアミン塩水溶液にアルカリを添加、混合してペンタメチレンジアミンを遊離させて溶媒で抽出した後に蒸留する方法が知られている（特許文献３）。斯かる方法は、高い収率でペンタメチレンジアミンを得ることが出来る。

一方、本願発明者らは、先に、ペンタメチレンジアミン塩水溶液にアルカリを添加、混合してペンタメチレンジアミン相と水相とに分液し、分取したペンタメチレンジアミン相からペンタメチレンジアミンを単離することを特徴とするペンタメチレンジアミンの製造方法を提案した（特願２００７−２４７０６５号）。この方法は、上記の方法と異なり、ペンタメチレンジアミン相と水相とに分液するため、ペンタメチレンジアミン相からのペンタメチレンジアミンの単離方法として、抽出法を経由することなく蒸留法を採用し得る利点がある。

特開２００５−６６５０号公報 特開２００４−２０８６４６号公報 特開２００４−１１４号公報

ところで、アルカリによりペンタメチレンジアミンを遊離させる上記の各方法においては、アルカリの添加によって塩（例えばペンタメチレンジアミン二塩酸塩の水溶液に水酸化ナトリウムを添加した場合は塩化ナトリウム）が生成する。

本発明者の知見によれば、上記の塩は、ペンタメチレンジアミンが遊離する際に析出するが、その一部は、少量の水と共に不純物としてペンタメチレンジアミンに溶解している。すなわち、分液後のペンタメチレンジアミン相（粗ペンタメチレンジアミン：含水ペンタメチレンジアミン）は、水とそれに溶解したペンタメチレンジアンモニウムイオン［（Ｃ５Ｈ１０（ＮＨ３＋）２］以外のイオン（以下、「不純物イオン」という）を含有する。従って、上記の粗ペンタメチレンジアミンは、そのままポリアミド樹脂の原料として使用することが出来ない。このため、ポリアミド樹脂原料として使用するには、蒸留などにより粗ペンタメチレンジアミンからペンタメチレンジアミンを単離して精製する必要がある。なお、上記の不純物イオンには、ペンタメチレンジアンモニウムイオンのカウンターアニオン（例えば塩化物イオン、硫酸イオン等）及び前記の添加したアルカリ成分が含まれる。

ところで、ペンタメチレンジアミンの単離手段として蒸留法を採用した場合、不純物イオンの多い粗ペンタメチレンジアミンは、蒸留中に塩類を析出し、特に連続蒸留の場合は析出した塩類が堆積して伝熱低下などを惹起する。また、蒸留塔の材質腐食を促進し、更には、リボイラー部において突沸現象を呈することもある。

本発明は、上記実情に鑑みなされたものであり、その目的は、不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミンを原料とする精製ペンタメチレンジアミンの製造方法であって、脱塩処理により、塩類によって惹起される種々の問題を回避した工業的に有利な製造方法を提供することにある。

すなわち、本発明の第１の要旨は、不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を蒸留精製する精製ペンタメチレンジアミンの製造方法において、蒸留精製の前に上記の含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を脱塩処理して塩類の含有量を３ｗｔ％以下にすることを特徴とする精製ペンタメチレンジアミンの製造方法に存し、第２の要旨は、上記の方法で得られるペンタメチレンジアミンを原料として使用して得られることを特徴とするポリアミド樹脂に存する。

本発明によれば、精製ペンタメチレンジアミンの製造するための蒸留精製において塩類のスケーリングやリボイラー部にける突沸現象が防止される。

以下、本発明を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、これらの内容に本発明は限定されるものではない。

本発明におけるペンタメチレンジアミンは、例えば、リジン溶液に、同溶液のｐＨがリジンの酵素的脱炭酸反応（ＬＤＣ反応）に適したｐＨに維持されるように酸を加えながら、ＬＤＣ反応を行うことにより、製造することが出来る。ここで使用する酸としては、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸、酢酸などの有機酸が挙げられる。得られた反応生成液から、本発明に従って遊離ペンタメチレンジアミンを採取することが出来る。更には、上記の酸としてジカルボン酸を使用し、ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩を採取することも可能である。なお、上記の酸として硫酸を使用した場合は塩酸を使用した場合に比し、次の様な利点がある。すなわち、後述のＬＤＣ反応の後にアルカリを添加してペンタメチレンジアミン塩水溶液からペンタメチレンジアミンを単離する操作において、アルカリの添加量を少なくすることが可能であり、また、相分離性が向上して粗ペンタメチレンジアミンの純度が高められる。

以下、酸として塩酸を使用し、ＬＤＣ反応により、ペンタメチレンジアミン二塩酸塩を製造する方法について詳細に説明する。

原料として使用するリジンとしては、通常、遊離塩基（リジンベース）であることが好ましいが、リジンの塩酸塩であってもよい。リジンは、ＬＤＣ反応によりペンタメチレンジアミンを生成するものであれば、Ｌ−リジン、Ｄ−リジンの何れであってもよいが、通常は入手のし易さからＬ−リジンが好ましい。また、リジンは、精製されたリジンであってもよく、ＬＤＣ反応により生成するペンタメチレンジアミンが塩酸と塩を形成することが可能であれば、リジンを含む発酵液であってもよい。

リジン溶液を調製する溶媒としては、好適には水が使用される。反応液のｐＨは、塩酸によって調節するため、他のｐＨ調節剤や緩衝剤を使用する必要はないが、前記の溶媒として緩衝液を使用してもよい。このような緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。但し、ペンタメチレンジアミンと塩酸との塩を形成させるという点からは、緩衝剤などは使用しないか、使用する場合であっても低濃度に抑えることが好ましい。

リジンとして遊離リジンを使用する場合は、リジン溶液に塩酸を加えてＬＤＣ反応に適したｐＨとなるように調節する。具体的なｐＨは、通常４．０〜８．０、好ましくは５．０〜７．０、更に好ましくは５．５〜６．５である。以下、このように、反応液のｐＨをＬＤＣ反応に適したｐＨに調節することを「中和」と称する場合がある。

ＬＤＣ反応の際には、生産速度および反応収率向上のため、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサル及びピリドキサルリン酸の群から選ばれる少なくとも１種のビタミンＢ６を配合することが好ましく、中でもピリドキサルリン酸が特に好ましい。ビタミンＢ６を添加する方法は、特に制限されず、反応中に適宜添加すればよい。

ＬＤＣ反応は、例えば、上記のようにして中和されたリジン溶液にリジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）を添加することによって行うことが出来る。ＬＤＣとしては、リジンに作用してペンタメチレンジアミンを生成させるものであれば特に制限はない。ＬＤＣとしては、精製酵素を使用してもよいし、ＬＤＣを産生する微生物の他、植物細胞、動物細胞などの細胞を使用してもよい。ＬＤＣ又はそれを産生する細胞は、２種以上を併用してもよい。また、細胞をそのまま使用してもよく、ＬＤＣを含む細胞処理物を使用してもよい。細胞処理物としては、細胞破砕液やその分画物が挙げられる。

前記の微生物としては、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス（Bacillussubtills）等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス（Serratiamarcescens）等のセラチア属細菌などの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）等の真核細胞が挙げられる。これらの中では、細菌、特にＥ．ｃｏｌｉが好ましい。

前記の微生物は、ＬＤＣを産生する限り、野生株でもよく、変異株であってもよい。また、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え株であってもよい。植物細胞または動物細胞も、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え細胞を使用することが出来る。組換え細胞については、後述する。

リジン溶液にＬＤＣを添加して反応を開始した後は、反応の進行に伴い、リジンから遊離される炭酸ガスが反応液から放出され、ｐＨが上昇する。従って、反応液のｐＨが前記範囲となるように、塩酸を反応液に添加する。塩酸は連続的に添加してもよく、ｐＨが前記範囲に維持される限り、分割して添加してもよい。反応温度は、ＬＤＣがリジンに作用してペンタメチレンジアミンを生成させる温度であれば特に制限はないが、通常２０〜６０℃、好ましくは３０〜４０℃である。

原料のリジン又はリジン塩酸塩は、反応開始時に反応液に全量添加してもよく、ＬＤＣ反応の進行に応じて、分割して添加してもよい。

ＬＤＣ反応は、バッチ式によって行うと、塩酸の添加を容易に行うことが出来る。また、ＬＤＣ、ＬＤＣを産生する細胞またはその処理物を固定化した担体を使用した移動床カラムクロマトグラフィーにより、反応を行うことも出来る。その場合は、反応系のｐＨが所定の範囲に維持されたまま反応が進行するように、リジン及び塩酸をカラムの適当な部位に注入すればよい。

上記のようにして、ＬＤＣ反応によるペンタメチレンジアミン生成に伴って上昇するｐＨを、塩酸を使用して逐次中和することにより、反応が良好に進行する。このようにして生成するペンタメチレンジアミンはジアミンであるため、反応により生成したペンタメチレンジアミンは二価の塩酸塩として反応液中に蓄積する。

ＬＤＣ反応により得られたペンタメチレンジアミン二塩酸塩は、反応液から本発明に従って単離し精製される。ペンタメチレンジアミン二塩酸塩は、使用態様に応じて、溶液のままであってもよく、結晶であってもよい。

次に、ペンタメチレンジアミン塩水溶液からペンタメチレンジアミンを遊離させて単離処理する方法について説明する。この方法としては、（１）ペンタメチレンジアミン塩水溶液にアルカリを添加、混合してペンタメチレンジアミンを遊離させて溶媒で抽出した後に蒸留する方法、（２）ペンタメチレンジアミン塩水溶液にアルカリを添加、混合してペンタメチレンジアミン相と水相とに分液し、分取したペンタメチレンジアミン相からペンタメチレンジアミンを蒸留などで単離する方法の何れであってもよい。

先ず、上記（１）の方法について説明する。

上記の（１）の方法としては、前述の特開２００４−１１４号公報に記載された方法を採用することが出来る。具体的には、ペンタメチレンジアミン塩水溶液にアルカリを添加、混合し、ｐＨを１２〜１４にし、極性有機溶媒で抽出する。抽出に使用する溶媒としては、アニリン、シクロヘキサノン、１−オクタノール、イソブチルアルコール、シクロヘキサノール、クロロホルム等の極性有機溶媒が好ましい。

次に、上記（２）の方法について説明する。

ペンタメチレンジアミン塩水溶液に一定以上のアルカリを添加して混合することにより、ペンタメチレンジアミンが遊離し、更に、ペンタメチレンジアミン相と水相とに分液する。塩類の殆どは水相側に沈殿する。

アルカリを添加する際、アルカリのアミノ基当量は、ペンタメチレンジアミン塩の種類によって相違する。例えば、ペンタメチレンジアミン二塩酸塩の場合は、通常、ペンタメチレンジアミンのアミノ基当量の１．５１倍当量以上、好ましくは２．５０倍当量以上、更に好ましくは３．５０倍当量以上である。ペンタメチレンジアミン硫酸塩の場合は、通常、ペンタメチレンジアミンのアミノ基当量の０．５０倍当量以上、好ましくは１．００倍当量以上、更に好ましくは１．５１倍当量以上である。アルカリ添加量が余りに少ない場合、ペンタメチレンジアミン相と水相とに分液しないことがある。なお、アルカリ添加量は、ペンタメチレンジアミン塩の対イオン（酸由来分）に応じて実験的に定めることが出来る。

粗ペンタメチレンジアミン中の水分濃度は、通常７０ｗｔ％以下、好ましくは５０ｗｔ％以下、更に好ましくは２５ｗｔ％以下である。水分濃度が高くなるとそれに溶け込むイオン濃度が高くなるので好ましくない。また、粗ペンタメチレンジアミン中の不純物イオンの濃度は、通常１０ｗｔ％以下、好ましくは４ｗｔ％以下である。不純物イオンの濃度が高くなると蒸留後の塩類の析出量が多くなるので好ましくない。蒸留塔などの材質としては、強度や経済性の点からも比較的安価なステンレスの使用が好ましい。塩化物イオンによるステンレスの腐食を考慮すると、粗ペンタメチレンジアミン中の塩化物イオン濃度は、通常４ｗｔ％以下、好ましくは２ｗｔ％以下である。

ペンタメチレンジアミン相と水相との分液に使用するアルカリとしては、塩基性の高いアルカリ、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等が使用される。塩基性が低いアルカリの使用ではペンタメチレンジアミン相と水相とに分液しないことがある。相分離したペンタメチレンジアミン相と水相からペンタメチレンジアミン相を分取する。分取する方法には特に制限はなく、公知の方法が使用できる。

本発明においては、蒸留精製の前に上記の含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を脱塩処理して塩類の含有量を３ｗｔ％以下にする必要があるが、塩類の含有量は好ましくは２ｗｔ％以下、更に好ましくは１．５ｗｔ％以下である。塩類の含有量が３ｗｔ％を超える場合は、リボイラー部において突沸現象を初めとする塩類によって惹起される問題を解決することが困難である。

遊離したペンタメチレンジアミンの分離方法としては、公知の液液分離法、例えば、二相に分離した一方の液相を、液液界面の上部から、または、液相底部から抜き取る方法を利用できる。アルカリ塩を液体から分離する場合、その方法としては、公知の固液分離方法、例えば、濾過、遠心分離などを採用することが出来る。

前記の（１）の方法の場合は、不純物として塩類を含む粗ペンタメチレンジアミン（含水ペンタメチレンジアミン）の抽出溶液が得られ、上記の（２）の方法の場合は、不純物として塩類を含む粗ペンタメチレンジアミン（含水ペンタメチレンジアミン）が得られる。

本発明の特徴は、上記のような不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を蒸留精製する精製ペンタメチレンジアミンの製造方法において、蒸留精製の前に上記の含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を脱塩処理して塩類の含有量を３ｗｔ％以下にする点にある。

本発明における塩類とは、ペンタメチレンジアミン塩にアルカリを添加して塩交換した際に生じるアルカリ塩と、過剰にアルカリを添加した場合には塩交換に消費されなかったアルカリの双方のことである。例えば、ペンタメチレンジアミン二塩酸塩にペンタメチレンジアミンのアミノ基当量を超える過剰の水酸化ナトリウムを添加した場合の塩類とは、塩化ナトリウムと塩交換に消費されなかった水酸化ナトリウムの双方である。この場合、分析では、ナトリウムイオンと塩化物イオンを定量することが可能であり、塩化物イオン濃度から塩化ナトリウム濃度を算出することが出来、ナトリウムイオン濃度と算出した塩化ナトリウム濃度から水酸化ナトリウム濃度を算出することが出来る。上記の場合、請求項１における塩類の含有量とは塩化ナトリウム濃度と水酸化ナトリウム濃度の合計量に相当する。

脱塩処理の方法としては、特に制限されないが、以下の（Ａ）〜（Ｃ）に示す方法が推奨される。

（Ａ）不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液にアルカリを添加、混合し、水相を相分離させた後に除去する方法。

上記の方法において、アルカリとしては、ペンタメチレンジアミン塩水溶液からペンタメチレンジアミンを遊離させる際に使用したのと同様のアルカリを使用することが出来る。水相を相分離させるのに必要なアルカリの添加量は、上記のペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液とでは異なることがあるが、通常、ペンタメチレンジアミンの０．１倍当量以上の量が必要であり、アルカリの具体的な添加量は実験的に定めることが出来る。

（Ｂ）不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液に貧溶媒を添加、混合し、析出した塩類を除去する方法。

上記の方法において、貧溶媒とは、それの添加によって塩類を析出し得る溶媒を意味する。例えば、上記のペンタメチレンジアミンに添加する場合の貧溶媒としては、例えば、アセトン、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム、１、４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコールの群から選択される溶媒が挙げられる。これらは、適宜に組合せて使用することが出来る。貧溶媒の使用量は、通常、ペンタメチレンジアミンの０．１倍重量以上の量が必要であり、貧溶媒の具体的な添加量は実験的に定めることが出来る。上記の方法は、貧溶媒を選択することにより、上記のペンタメチレンジアミンの抽出溶液にも適用し得るが、主として、上記のペンタメチレンジアミンに好適に使用される。

（Ｃ）不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を脱水蒸留し、析出した塩類を除去する方法。

上記の方法において、脱水蒸留は、ペンタメチレンジアミンの精製目的でないため、単蒸留装置、薄膜蒸留装置などの蒸留段数の小さい設備を使用することが出来る。通常、脱水蒸留は減圧条件で行われる。また、必要に応じて、共沸剤を添加することも出来る。塩類の析出に必要な脱水蒸留の程度は実験的に定めることが出来る。

ところで、ペンタメチレンジアミンが遊離する際に析出する塩類には無視できない量のペンタメチレンジアミンが付着している。従って、精製ペンタメチレンジアミンの収率を少しでも高める観点から、上記の遊離したペンタメチレンジアミンを分離した後に析出したアルカリ塩を洗浄液で処理してアルカリ塩に付着したペンタメチレンジアミンを回収し、回収したペンタメチレンジアミンと上記の含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液とを合体して蒸留精製するのが好ましい。

上記のアルカリ塩は、ペンタメチレンジアミン二塩酸塩の水溶液に水酸化ナトリウムを添加した場合は塩化ナトリウムであり、ペンタメチレンジアミン硫酸塩の水溶液に水酸化ナトリウムを添加した場合は硫酸ナトリウムである。

アルカリ塩の洗浄液としては、アルカリ塩に付着したペンタメチレンジアミンを分離して回収し得る限り特に制限されない。アルカリ塩を全く溶解しない液体である必要はないが、洗浄処理温度におけるアルカリ塩の溶解量が析出量の５０ｗｔ％以下である液体が好ましい。アルカリ塩の洗浄液の具体例としては次のようなものが挙げられる。

（ｉ）洗浄処理温度におけるアルカリ塩の濃度が飽和溶解度の５０％以上のアルカリ塩水溶液を使用する。飽和溶解度に対するアルカリ塩の濃度は、好ましくは７０％、更に好ましくは９０％以上である。

（ii）洗浄処理温度におけるアルカリの濃度が飽和溶解度の５０％以上のアルカリ水溶液を使用する。飽和溶解度に対するアルカリの濃度は、好ましくは７０％、更に好ましくは９０％以上である。

（iii）洗浄処理温度におけるアルカリ塩の濃度が飽和溶解度の５０％以上で且つ洗浄処理温度におけるアルカリの濃度が飽和溶解度の５０％以上のアルカリ塩含有アルカリ水溶液を使用する。アルカリ塩およびアルカリの濃度範囲は上記の通りである。

（iv）有機溶媒を使用する。有機溶媒としては、例えば、前述の抽出溶媒に使用したのと同様の有機溶媒の他、メタノール、エタノール、プロパノール、ヘキサノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトン等が挙げられる。

上記のアルカリ水溶液は、洗浄目的のために調製されたものである必要はなく、アルカリの添加によりペンタメチレンジアミン相と水相とに分液する方法において、ペンタメチレンジアミン相から相分離によって回収されたアルカリ水溶液を利用して調製することが出来る。洗浄目的のために調製されたアルカリ水溶液の場合、洗浄後にペンタメチレンジアミン相を相分離し、ペンタメチレンジアミン塩水溶液に添加するアルカリとして使用することが出来る。回収されたアルカリ水溶液を使用する場合、ペンタメチレンジアミン塩水溶液にアルカリを添加し、相分離した際に、（１）先ず、析出したアルカリ塩を回収した後、液相部を二相に分離させてペンタメチレンジアミン相を回収し、その上で、分離後の水相と先に回収したアルカリ塩とを撹拌処理してアルカリ塩の洗浄を行うか、または、（２）液相を相分離してペンタメチレンジアミン相を回収した後、沈殿したアルカリ塩を含む水相側としてのアルカリ水溶液をそのまま撹拌処理することにより、アルカリ塩の洗浄を引き続き行うことが出来る。なお、アルカリにより遊離したペンタメチレンジアミンを溶媒で抽出する方法におけるアルカリ塩の洗浄には上記の有機溶媒が好ましく、通常、抽出溶媒と同種の溶媒が使用される。

洗浄方法としては、振り掛け洗浄、懸濁洗浄などの方法を採用することが出来る。洗浄温度は、通常０〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃である。洗浄液の使用量は、洗浄方法なとどによって異なるため一概には決定し得ないが、洗浄するアルカリ塩に対する割合として、通常０．１〜５重量倍程度、好ましくは１〜３重量倍程度である。

次に、ＬＤＣ活性が上昇するように微生物を改質する方法について例示するが、他の細胞についても、それに適するように下記の方法を適宜改変することによって、同様にＬＤＣ活性を上昇させることが出来る。

ＬＤＣ活性は、例えば、ＬＤＣをコードする遺伝子（ＬＤＣ遺伝子）の発現を増強することによって上昇する。ＬＤＣ遺伝子の発現の増強は、ＬＤＣ遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、ＬＤＣ遺伝子断片を、微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結し、組換えＤＮＡを作製し、これを適当な宿主に導入して形質変換すればよい。

ＬＤＣ遺伝子のコピー数を高めることは、ＬＤＣ遺伝子を微生物の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レベティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインパーテッド・リピートが利用できる。または、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。

ＬＤＣ活性の上昇は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上またはプラスミド上のＬＤＣ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりＬＤＣ遺伝子の発現が強化され、ＬＤＣ活性が上昇する。これら発現調節配列の改変は、遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。

発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを使用した遺伝子置換と同様にして行うことが出来る。Ｅ．ｃｏｌｉの温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばＷＯ９９／０３９８８号国際公開パンフレットに記載のプラスミドｐＭＡＮ９９７等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した方法（Datsenko,K.A.,PNAS(2000)97(12),6640-6645）によっても、発現調節配列の置換を行うことが出来る。

ＬＤＣ遺伝子としては、コードされるＬＤＣがＬＤＣ反応に有効利用できるものであれば、特に制限されないが、例えば、バクテリウム カダベリス、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌、ガラス豆などの植物、更には、特開２００２−２２３７７０号公報に記載の微生物のＬＤＣ遺伝子が挙げられる。

宿主微生物としてＥ．ｃｏｌｉを使用する場合は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＬＤＣ遺伝子が好ましい。Ｅ．ｃｏｌｉのＬＤＣ遺伝子としては、米国特許第５，８２７，６９８号明細書によりｃａｄＡ遺伝子およびＬＤＣ遺伝子が知られているが、これらの中ではｃａｄＡ遺伝子が好ましい。Ｅ．ｃｏｌｉのｃａｄＡ遺伝子の配列が知られており（N.Watson et al.,Journalofbacteriology(1992)vol.174,p.530-540;S.Y.Meng et al.Journalofbacteriology(1992)vol.174,p.2659-2668;GenBankaccession M76411）、その配列に基づいて作成したプライマーを使用したＰＣＲにより、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡから単離することが出来る。このようなプライマーとしては、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。

取得されたＬＤＣ遺伝子とベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、ＬＤＣ遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを使用して前記遺伝子とベクターを連結すればよい。Ｅ．ｃｏｌｉ用のベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＳＴＶ２９、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ２１９等が挙げられる。

ＬＤＣ遺伝子は、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。例えばｃａｄＡ遺伝子は、コードされるＬＤＣの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むＬＤＣをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、通常２〜５０個、好ましくは２〜３０個、更に好ましくは２〜１０個である。

上記のようなＬＤＣと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、部位特異的変異法により、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むようにｃａｄＡ遺伝子の塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、変異処理前のＤＮＡを保持する微生物（例えばエシェリヒア属細菌）を、紫外線、または、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等の通常変異処理に使用されている変異剤によって処理する方法が挙げられる。

上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、ＬＤＣと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するＬＤＣをコードするＤＮＡ又はこれを保持する細胞から、例えばｃａｄＡ遺伝子（GenBank accessionM76411）のコード領域の配列（又は同配列の一部）を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＬＤＣと同等の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それにより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、または、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

プローブとしてｃａｄＡ遺伝子の一部の配列を使用することも出来る。そのようなプローブは、公知のｃａｄＡ遺伝子の塩基配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ｃａｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することが出来る。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を使用する場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。

ＬＤＣと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、公知のｃａｄＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列に対し、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつＬＤＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。

組換えＤＮＡを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.andHiga,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルスを調製してＤＮＡを導入する方法（Ducan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,153(1997)）がある。また、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラスト又はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.andChoen,S.N.,Molec,Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.andFink,G.R.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,751929(1978)）も応用できる。更に、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報）によっても、微生物の形質転換を行うことが出来る。

ＬＤＣを産生する微生物または細胞を得るための培養は、使用する微生物または細胞に応じ、ＬＤＣの産生に適した方法によって行えばよい。

例えば、培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトール等のアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸などの有機酸類を使用することが出来る。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することが出来る。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ１等のビタミン類、アデニンやＲＮＡ等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが好ましい。これらの他に、必要に応じ、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

培養は、Ｅ．ｃｏｌｉの場合は、好気的条件下で１６〜７２時間程度行うのがよく、培養温度は３０〜４５℃に、培養中のｐＨは５〜８に制御する。なお、ｐＨ調節には無機もしくは有機の酸性またはアルカリ性物質、アンモニアガス等を使用することが出来る。なお、ＬＤＣ遺伝子の発現が誘導可能なプロモーターによって調節されている場合には、誘導剤を培地に添加する。

培養後、細胞は、遠心分離機や膜により集めることにより、培養液から回収することが出来る。細胞は、そのまま使用してもよいが、ＬＤＣを含むそれらの処理物を使用する場合は、超音波、フレンチプレス又は酵素的処理により細胞を破砕し、酵素を抽出させて無細胞抽出液とし、更に、ＬＤＣを精製する場合には、常法に従い、硫安塩折、各種クロマトグラフィーを使用することが出来る。

原料として前記のペンタメチレンジアミンを使用して成る本発明のポリアミド樹脂は、ペンタメチレンジアミン単位とジカルボン酸単位を構成成分として含むが、本発明の効果を損なわない範囲において、それ以外の共重合成分が含有されていてもよい。

上記の共重合成分としては、６−アミノカプロン酸、１１−アミノウンデカン酸、１２−アミノドデカン酸、パラアミノメチル安息香酸などのアミノ酸、ε−カプロラクタム、ω−ラウロラクタム等のラクタム、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、ブラシリン酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、オクタデカン二酸などの脂肪族ジカルボン酸、シクロヘキサンジカルボン酸などの脂環式ジカルボン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸などの芳香族ジカルボン酸、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１１−ジアミノウンデカン、１，１２−ジアミノドデカン、１，１３−ジアミノトリデカン、１，１４−ジアミノテトラデカン、１，１５−ジアミノペンタデカン、１，１６−ジアミノヘキサデカン、１，１７−ジアミノヘプタデカン、１，１８−ジアミノオクタデカン、１，１９−ジアミノノナデカン、１，２０−ジアミノエイコサン、２−メチル−１，５−ジアミノペンタン等の脂肪族ジアミン、シクロヘキサンジアミン、ビス−（４−アミノヘキシル）メタン等の脂環式ジアミン、キシリレンジアミン等の芳香族ジアミンが挙げられる。これらの共重合成分は２種以上を併用してもよい。

ポリアミド樹脂の製造方法としては、公知の方法が使用でき、具体的には「ポリアミド樹脂ハンドブック」（日刊工業社出版：福本修編）等に開示されている。例えば、ポリアミド５６の製造方法としては、ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩を、水の共存下で混合し、加熱して脱水反応を進行させる方法（加熱重縮合）が好ましい。ここで、加熱重縮合とはポリアミド樹脂の製造における重合反応物の最高到達温度を２００℃以上に上昇させる製造プロセスである。最高到達反応温度の上限としては、重合反応時の熱安定性を考慮して、通常３００℃以下である。重合方式には、特に制限は無く、回分式または連続方式が採用できる。

上記の加熱重縮合後で製造されたポリアミド樹脂は更に固相重合することが出来る。これにより、ポリアミド樹脂の分子量を高くすることが出来る。固相重合は、例えば、１００℃以上融点以下の温度で真空中または不活性ガス中で加熱することにより行うことが出来る。

本発明のポリアミド樹脂の重合度は、特に制限されず、濃度０．０１ｇ／ｍＬとした９８％硫酸溶液の２５℃における相対粘度として、通常１．５〜８．０、好ましくは２．０〜５．５である。相対粘度が１．５未満の場合は実用的強度が不十分であり、一方、８．０を超える場合は、流動性が低下し、成形加工性が損なわれる。成形性の観点から、相対粘度は、フィルム、繊維、モノフィラメント等の押出成形では３．０〜５．５、射出成形では２．０〜３．５が特に好ましい。

本発明におけるポリアミド樹脂には本発明の効果を損なわない範囲で他の成分、例えば酸化防止剤や熱安定剤（ヒンダードフェノール系、ヒドロキノン系、ホスファイト系およびこれらの置換体、ハロゲン化銅、ヨウ素化合物など）、耐候剤（レゾルシノール系、サリシレート系、ベンゾトリアゾール系、ベンゾフェノン系、ヒンダードアミン系など）、離型剤および滑剤（脂肪族アルコール、脂肪族アミド、脂肪族ビスアミド、ビス尿素、ポリエチレンワックス等）、顔料（フタロシアニン、カーボンブラック等）、染料（ニグロシン、アニリンブラック等）、可塑剤（ｐ−オキシ安息香酸オクチル、Ｎ−ブチルベンゼンスルホンアミド等）、帯電防止剤（アルキルサルフェート型アニオン系帯電防止剤、４級アンモニウム塩型カチオン系帯電防止剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレートのような非イオン系帯電防止剤、ベタイン系両性帯電防止剤等）、難燃剤（メラミンシアヌレート、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の水酸化物、ポリリン酸アンモニウム、臭素化ポリスチレン、臭素化ポリフェニレンオキシド、臭素化ポリカーボネート、臭素化エポキシ樹脂、これらの臭素系難燃剤と三酸化アンチモンとの組み合わせ等）、他の重合体（他のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、液晶ポリマー、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ＡＢＳ樹脂、ＳＡＮ樹脂、ポリスチレン等）を配合することが出来る。配合は、樹脂の重合から成形までの任意の段階で行うことが出来るが、ドライブレンド法または押出機を使用した溶融混練法が好ましい。

本発明におけるポリアミド樹脂は、射出成形、フィルム成形、溶融紡糸、ブロー成形、真空成形などの任意の成形方法により、所望の形状に成形することが出来、例えば、射出成形品、フィルム、シート、フィラメント、テーパードフィラメント、繊維などとすることが出来る。また、本発明におけるポリアミド樹脂は、接着剤、塗料などにも使用することが出来る。

本発明におけるポリアミド樹脂の具体的な用途例としては、自動車・車両関連部品としては次の部品が挙げられる。すなわち、インテークマニホールド、ヒンジ付きクリップ（ヒンジ付き成形品）、結束バンド、レゾネーター、エアークリーナー、エンジンカバー、ロッカーカバー、シリンダーヘッドカバー、タイミングベルトカバー、ガソリンタンク、ガソリンサブタンク、ラジエータータンク、インタークーラータンク、オイルリザーバータンク、オイルパン、電動パワステギヤ、オイルストレーナー、キャニスター、エンジンマウント、ジャンクションブロック、リレーブロック、コネクター、コルゲートチューブ、プロテクター等の自動車用アンダーフード部品、ドアハンドル、フェンダー、フードバルジ、ルーフレールレグ、ドアミラーステー、バンパー、スポイラー、ホイールカバー等の自動車用外装部品、カップホルダー、コンソールボックス、アクセルペダル、クラッチペダル、シフトレバー台座、シフトレバーノブ等の自動車用内装部品が挙げられる。

更に、本発明におけるポリアミド樹脂は、釣り糸、漁網などの漁業関連資材、スイッチ類、超小型スライドスイッチ、ＤＩＰスイッチ、スイッチのハウジング、ランプソケット、結束バンド、コネクタ、コネクタのハウジング、コネクタのシェル、ＩＣソケット類、コイルボビン、ボビンカバー、リレー、リレーボックス、コンデンサーケース、モーターの内部部品、小型モーターケース、ギヤ・カム、ダンシングプーリー、スペーサー、インシュレーター、キャスター、端子台、電動工具のハウジング、スターターの絶縁部分、ヒューズボックス、ターミナルのハウジング、ベアリングリテーナーの他、スピーカー振動板、耐熱容器、電子レンジ部品、炊飯器部品、プリンタリボンガイド等に代表される電気・電子関連部品、家庭・事務電気製品部品、コンピューター関連部品、ファクシミリ・複写機関連部品、機械関連部品などの各種用途に使用することが出来る。

以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。

＜物性測定法＞
（１）ペンタメチレンジアミン、塩化物イオン及び硫酸イオンの各濃度の測定：
イオンクロマトグラフィーを使用し、各測定項目に作成された以下の表１に記載の濃度範囲の検量線に基づいて濃度を求めた。

（２）ナトリウムイオン濃度の測定：
パーキンエルマージャパン社製の「ＡＡｎａｌｙｓｔ １００」を使用し、原子吸光分析によって測定した。試料中のナトリウムイオン濃度は予め作成した検量線の範囲（０．１〜１ｐｐｍの範囲）に調節した。

（３）水分測定：
カールフィッシャー型水分測定器（三菱化学社製「ＣＡ−０６」）を使用し、ペンタメチレンジアミン相中の水分濃度を測定した。

（４）相対粘度の測定：
試料を９８％濃硫酸に溶解して濃度０．０１ｇ／ｍＬの溶液とし、２５℃でオストワルド式粘度計を使用して測定を行った。（試料溶液の落下時間）／（濃硫酸の落下時間）を相対粘度とした。

（５）ＤＳＣ（示差走査熱量測定）：
セイコー電子工業製ロボットＤＳＣを使用し、窒素雰囲気下、試料を約５ｍｇを採取し、次の要領で測定した。すなわち、ポリアミド樹脂を完全に融解させて３分間保持した後、２０℃／分の降温速度で、３０℃まで降温したときに現れる発熱ピークの温度（降温結晶化温度Ｔｃ）と、これに続いて、３０℃で３分間保持した後、３０℃から２０℃／分の昇温速度で昇温したときに観測される吸熱ピークの温度（融点Ｔｍ）を求めた。吸熱ピークが複数の場合は、最も高い温度を融点Ｔｍとした。

＜ＬＤＣ遺伝子（ｃａｄＡ）増強株の作製＞
（Ａ）大腸菌ＤＮＡ抽出：
ＬＢ培地（組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解）１０ｍＬに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を、１０ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含む１０ｍＭ：ＮａＣｌ／２０ｍＭ、トリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。

次いで、上記の懸濁液にプロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。更に、ドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５ｗｔ％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加えて混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ：ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。

（Ｂ）ｃａｄＡのクローニング：
大腸菌ｃａｄＡの取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の当該遺伝子の配列（Genbank DatabaseAccession No.Ｕ00096）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を使用したＰＣＲによって行った。

反応液組成：
鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ：ＭｇＳО_４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。

反応温度条件：
ＤＮＡサーマルサイクラーとして、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製「ＰＴＣ−２００」を使用し、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２．５分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は１０分とした。

ＰＣＲ終了後、増幅産物をエタノール沈殿により精製した後、制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断した。このＤＮＡ標品を、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することによりｃａｄＡを含む約２．６ｋｂの断片を検出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を使用して目的ＤＮＡ断片の回収を行った。

回収したＤＮＡ断片を、大腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造製）を制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断して調節したＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を使用して連結後、得られたプラスミドＤＮＡを使用し、大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を、５０μｇ／ｍＬ：アンピシリン、０．２ｍＭ：ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）及び５０μｇ／ｍＬ：Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。

この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断することにより、約２．５ｋｂの挿入断片が認められることを確認し、これをｐＣＡＤ１、ｐＣＡＤ１を含む大腸菌株をＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１とそれぞれ命名した。

＜ペンタメチレンジアミン二塩酸塩水溶液の調製＞
以下の参考例１及び２で使用した反応液（ペンタメチレンジアミン二塩酸塩水溶液）は、ｃａｄＡ増幅株を使用し、リジン塩酸塩を原料とし、以下の方法で調製した。

（１）ｃａｄＡ増幅株の培養：
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１をＬＢ培地入りフラスコで前培養した後、３mＬの培養液を１００ｍＬの２倍濃度のＬＢ培地が入った１Ｌ容フラスコに接種し、３５℃、２５０ｒｐｍで撹拌培養を行った。培養開始４時間目に、滅菌したＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度で０．５ｍＭになるように添加し、その後１４時間培養を継続した。

（２）菌体の分離および保存：
培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間で遠心分離して上清を廃棄し、菌体を回収した。得られた湿菌体は、培養液体積の１／２０になるように５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで懸濁して反応に必要となるまで４℃で保存した。

（３）ペンタメチレンジアミン二塩酸塩の製造：
５０％（ｗ／ｖ）リジンベース溶液（協和醗酵工業株式会社製）にｐＨが６．０となるように塩酸を添加し、さらに脱塩水を添加してリジン濃度で１４０ｇ／Ｌとなるように基質溶液（３Ｌ）を作成した。基質溶液全量を５Ｌ容培養タンクにはり込み、ピリドキサルリン酸を０．１ｍＭとなるように添加した。さらにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１の菌体をＯＤ６６０が０．５になるように添加して反応を開始した。反応条件は、３７℃、０．５ｖｖｍ通気、２００ｒｐｍとした。溶液のｐＨは、２．５Ｍの塩酸を添加することで６．５になるように制御して反応を３０時間継続させた。反応終了時には、リジン残存濃度が０．０５ｇ／Ｌ以下であった。反応後の溶液は、菌体の不活化処理（１２１℃、２０分）を実施した。

＜ペンタメチレンジアミン硫酸塩水溶液の調製＞
以下の参考例３及び４で使用した反応液（ペンタメチレンジアミン硫酸塩水溶液）は、ｃａｄＡ増幅株を使用し、リジン硫酸塩を原料とし、以下の方法で調製した。

（１）ｃａｄＡ増幅株の培養：
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１をＬＢ培地入りフラスコで前培養した後、３m
Ｌの培養液を１００ｍＬの２倍濃度のＬＢ培地が入った１Ｌ容フラスコに接種し、３５℃、２５０ｒｐｍで撹拌培養を行った。培養開始４時間目に、滅菌したＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度で０．５ｍＭになるように添加し、その後１４時間培養を継続した。

（２）菌体の分離および保存：
培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間で遠心分離して上清を廃棄し、菌体を回収した。得られた湿菌体は、培養液体積の１／２０になるように５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで懸濁して反応に必要となるまで４℃で保存した。

（３）ペンタメチレンジアミン硫酸塩の製造：
５０％（ｗ／ｖ）リジンベース溶液（協和醗酵工業株式会社製）にｐＨが６．０となるように濃硫酸および脱塩水を添加してリジン濃度で１４０ｇ／Ｌとなるように基質溶液（３Ｌ）を作成した。基質溶液全量を５Ｌ容培養タンクにはり込み、ピリドキサルリン酸を０．１ｍＭとなるように添加した。さらにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１の菌体をＯＤ６６０が０．５になるように添加して反応を開始した。反応条件は、３７℃、通気なし、４００ｒｐｍとした。溶液のｐＨは、１Ｍの硫酸を添加することで６．５になるように制御して反応を３０時間継続させた。反応終了時には、リジン残存濃度が０．０５ｇ／Ｌ以下であった。反応後の溶液は、菌体の不活化処理（１２１℃、２０分）を実施した。

参考例１：
＜ペンタメチレンジアミンの精製・単離＞
（１）濃縮：
ペンタメチレンジアミン二塩酸塩水溶液を柴田科学社製ロータリーエバポレーター（Ｒ２０５Ｖ−０）にて処理し、ペンタメチレンジアミン濃度４０ｗｔ％の濃縮液を調製した。濃縮条件は、オイルバス温度６５℃、回転数１００ｒｐｍ、減圧度１００Ｔｏｒｒである。

（２）ペンタメチレンジアミン相の分取：
予め、水酸化ナトリウム（林純薬社製試薬特級：パール状、純度９９％）１１８．６ｇ（水酸化ナトリウム純分：１１７．４ｇ）を水１２６．０ｇに溶解して調製した４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液２４４．６ｇを、上記の濃縮液１５０ｇと共に撹拌容器に入れて十分に混合して固体を析出させ濾過によって分離した。そして、濾過後の液体を分液ロートに入れて十分に混合した後、静置しペンタメチレンジアミン相と水相とに相分離した。その後、軽液のペンタメチレンジアミン相のみを分取した。

（３）ペンタメチレンジアミンの単離：
分取したペンタメチレンジアミン相から蒸留によりペンタメチレンジアミンを単離した。先ず、オイルバス温度９０℃、減圧度５０Ｔｏｒｒにて水を留去し、次いで、オイルバス温度１１０℃、減圧度２０Ｔｏｒｒの条件で精製ペンタメチレンジアミンを単離した。

（４）濃度測定と重量計算：
濃縮後のペンタメチレンジアミン二塩酸塩水溶液の重量およびペンタメチレンジアミン濃度、蒸留物の重量およびペンタメチレンジアミン濃度を測定した。その後、濃縮液（濃縮後のペンタメチレンジアミン二塩酸塩水溶液）中のペンタメチレンジアミン重量および蒸留物中のペンタメチレンジアミン重量を算出した。更に、ペンタメチレンジアミンの精製収率を算出した。

＜ポリアミド樹脂の製造＞
上記で調製した精製ペンタメチレンジアミン８．２ｇに水１９．５ｇを添加した後、アジピン酸（本州化学工業製）１１．８ｇを加えてｐＨを８．８〜８．９に調節し、亜燐酸（和光純薬工業製試薬和光特級）を使用して予め調製した０．２％亜燐酸水溶液０．５ｇを添加し、７０℃に加温して混合物を完全に溶解させ、原料水溶液を得た。調製した原料水溶液４０ｇをオートクレーブに入れて窒素置換を行い窒素雰囲気とした。オートクレーブを温度２７０℃のオイルバスに浸し、内圧１．５７ＭＰａで２時間保持した。次いで、オートクレーブ内の圧力を徐々に放圧した後、更に、４６０Ｔｏｒｒまで減圧し、１時間保持して反応終了とした。反応終了後、減圧状態のまま放冷し、放冷後に内容物を取り出して分析を行った。相対粘度は３．１、融点は２５５℃であった。参考例１の結果を表３に示す。

参考例２：
参考例１において、水酸化ナトリウム（パール状、純度９９％）１６６．４ｇ（水酸化ナトリウム純分：１６４．７ｇ）を水１７６．７ｇに溶解して調製した４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を使用した以外は、参考例１と同様にして、ペンタメチレンジアミンの精製・単離、ポリアミド樹脂の製造を行った。得られたポリアミド樹脂の相対粘度は３．１、融点は２５５℃であった。参考例２の結果を表３に示す。

比較参考例１：
参考例１において、水酸化ナトリウム（パール状、純度９９％）４７．６ｇ（水酸化ナトリウム純分：４７．１ｇ）を水５０．５ｇに溶解して調製した４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を使用した以外は、参考例１と同様にして混合・静置したが、ペンタメチレンジアミン相と水相とに相分離せず、ペンタメチレンジアミン相を分取することが出来なかった。比較参考例１の結果を表３に示す。

比較参考例２：
参考例１において、水酸化ナトリウム（パール状、純度９９％）７１．１ｇ（水酸化ナトリウム純分：７０．４ｇ）を水７５．６ｇに溶解して調製した４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を使用した以外は、参考例１と同様にして混合・静置したが、ペンタメチレンジアミン相と水相とに相分離せず、ペンタメチレンジアミン相を分取することが出来なかった。比較参考例２の結果を表３に示す。

参考例３：
＜ペンタメチレンジアミンの精製・単離＞
（１）濃縮：
ペンタメチレンジアミン硫酸塩水溶液を柴田科学社製ロータリーエバポレーター（Ｒ２０５Ｖ−０）にて処理し、ペンタメチレンジアミン濃度１６．３ｗｔ％の濃縮液を調製した。濃縮条件は、オイルバス温度６５℃、回転数１００ｒｐｍ、減圧度１００Ｔｏｒｒである。

（２）ペンタメチレンジアミン相の分取：
予め、水酸化ナトリウム（林純薬社製試薬特級：パール状、純度９９％）１２．９ｇ（水酸化ナトリウム純分：１２．８ｇ）を水１３．７ｇに溶解して調製した４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液２６．６ｇを、上記の濃縮液１００ｇと共に撹拌容器に入れて十分に混合して固体を析出させ濾過によって分離した。そして、濾過後の液体を分液ロートに入れて十分に混合した後、静置しペンタメチレンジアミン相と水相とに相分離した。その後、軽液のペンタメチレンジアミン相のみを分取した。

（３）ペンタメチレンジアミンの単離：
参考例１と同様に操作して精製ペンタメチレンジアミンを単離した。

（４）濃度測定と重量計算：
参考例１と同様に濃度測定と重量計算を行い、ペンタメチレンジアミンの精製収率を算出した。

＜ポリアミド樹脂の製造＞
参考例１同様に操作してポリアミド樹脂を製造し、分析した。相対粘度は３．１、融点は２５５℃であった。参考例３の結果を表４に示す。

参考例４：
＜ペンタメチレンジアミンの精製・単離＞
（１）濃縮：
ペンタメチレンジアミン硫酸塩水溶液を柴田科学社製ロータリーエバポレーター（Ｒ２０５Ｖ−０）にて処理し、ペンタメチレンジアミン濃度３８．８ｗｔ％の濃縮液を調製した。濃縮条件は、オイルバス温度６５℃、回転数１００ｒｐｍ、減圧度１００Ｔｏｒｒである。

（２）ペンタメチレンジアミン相の分取：
予め、水酸化ナトリウム（林純薬社製試薬特級：パール状、純度９９％）６４．８ｇ（水酸化ナトリウム純分：６４．２ｇ）を水６９．０ｇに溶解した調製した４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液１３３．８ｇを、上記の濃縮液６０．２ｇと共に撹拌容器に入れて十分に混合して固体を析出させ濾過によって分離した。そして、濾過後の液体を分液ロートに入れて十分に混合した後、静置しペンタメチレンジアミン相と水相とに相分離した。その後、軽液のペンタメチレンジアミン相のみを分取した。

（３）ペンタメチレンジアミンの単離：
参考例１と同様に操作して精製ペンタメチレンジアミンを単離した。

（４）濃度測定と重量計算：
参考例１と同様に濃度測定と重量計算を行い、ペンタメチレンジアミンの精製収率を算出した。

＜ポリアミド樹脂の製造＞
参考例１同様に操作してポリアミド樹脂を製造し、分析した。相対粘度は３．１、融点は２５５℃であった。参考例４の結果を表４に示す。

なお、上記の各例において、ペンタメチレンジアミン相の分取工程での分液ロートによる相分離の際に次の要領で「相分離性」を評価した。すなわち、完全に相分離するまでの時間を測定し、所要時間が５分以内の場合を「◎」、５分を超え３０分以内の場合を「○」として評価した。なお、相分離の判定は目視によった。

比較参考例１及び２は、ペンタメチレンジアミン相と水相とに相分離しないのに対し、参考例１及び２と参考例３及び４は相分離する。そして、ペンタメチレンジアミン二塩酸塩を使用した場合（参考例１及び２）とペンタメチレンジアミン硫酸塩を使用した場合（参考例３及び４）とを比較すると次の相違があることがわかる。参考例３に示す様に、硫酸塩の場合は「アミノ基当量比」が１．００と小さいにも拘わらず、相分離が良好である。因に、塩酸塩の場合は「アミノ基当量比」が１．００では相分離しない（比較参考例１参照）。そして、参考例４に示す様に、硫酸塩を使用し且つ「アミノ基当量比」を高めた場合は、塩酸塩を使用し且つ上記と同程度に「アミノ基当量比」を高めた場合（参考例２）に比して相分離性が顕著に改良される。そして、この場合、残留無機イオン（硫酸イオン）の濃度も低く、精製後のペンタメチレンジアミンの品質も良好である。

参考例５：
参考例１と同様にしてペンタメチレンジアミン二塩酸塩水溶液の濃縮液（ペンタメチレンジアミン濃度４０ｗｔ％）を調製した。一方、水酸化ナトリウム（林純薬社製試薬特級：パール状、純度９９％）１６６．４ｇ（水酸化ナトリウム純分：１６４．７ｇ）を水１７６．７ｇに溶解して４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を調製した。

上記の濃縮液１５０ｇを撹拌容器に入れ、４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液３４３．１ｇを添加して十分に混合し固体を析出させた。析出した固体を濾過によって分離した。濾過後の液体を分液ロートに入れて十分に混合した後、静置してペンタメチレンジアミン相と水相とに相分離し、ペンタメチレンジアミン相と水相を得た。

次いで、上記の固体５０．０ｇと、洗浄液として上記の水相（塩化ナトリウム飽和の水酸化ナトリウム水溶液）１３４．４ｇを撹拌容器に入れて撹拌し、固体に付着したペンタメチレンジアミンを洗浄し、再び濾過によって固体を分離した。固体分離後の液体は水相と少量のペンタメチレンジアミン相に分液した。固体の洗浄前後の表５に示す各項目について測定した。結果を表５に示す。

前記の固体析出の際に分液したペンタメチレンジアミン相と上記の固体洗浄の際に分液したペンタメチレンジアミン相とを合体し、参考例１における「ペンタメチレンジアミンの単離」と同様にして精製ペンタメチレンジアミンを回収した。そして、この精製ペンタメチレンジアミンを使用し、参考例１と同様にしてポリアミド樹脂を製造した。得られたポリアミド樹脂の相対粘度は３．１、融点は２５５℃であった。

参考例６：
参考例５において、洗浄液として、水酸化ナトリウム（林純薬社製試薬特級：パール状、純度９９％）６５．２ｇ（水酸化ナトリウム純分：６４．５ｇ）を水６９．２ｇに溶解して調製した４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を使用した以外は、参考例５と同様にして、固体の洗浄、ペンタメチレンジアミンの単離を行って精製ペンタメチレンジアミンを回収した。参考例５と同様に固体の洗浄前後の表５に示す各項目について測定した。結果を表５に示す。

参考例７：
参考例５において、洗浄液として、塩化ナトリウム（キシダ化学社製試薬特級、純度９９．５％）３５．７ｇ（塩化ナトリウム純分３５．５ｇ）を水９８．７ｇに溶解して調製した２６．４ｗｔ％の塩化ナトリウム水溶液を使用した以外は、参考例５と同様にして、固体の洗浄、ペンタメチレンジアミンの単離を行って精製ペンタメチレンジアミンを回収した。参考例５と同様に固体の洗浄前後の表５に示す各項目について測定した。結果を表５に示す。

参考例８：
参考例５と同様にしてペンタメチレンジアミン二塩酸塩水溶液の濃縮液（ペンタメチレンジアミン濃度４０ｗｔ％）を調製した。一方、水酸化ナトリウム（林純薬社製試薬特級：パール状、純度９９％）４７．６ｇ（水酸化ナトリウム純分：４７．１ｇ）を水５０．５ｇに溶解して４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を調製した。

上記の濃縮液１５０ｇを撹拌容器に入れ、４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液９８．１ｇを添加して十分に混合し固体を析出させた。析出した固体を濾過によって分離した。濾過後の液体はペンタメチレンジアミン相と水相とに相分離していないため、クロロホルム（和光純薬社製）による抽出によってペンタメチレンジアミンを回収した。

次いで、上記の固体５０．０ｇと、洗浄液としてクロロホルム（和光純薬社製）５０．０ｇを撹拌容器に入れて撹拌し、固体に付着したペンタメチレンジアミンを洗浄し、再び濾過によって固体を分離した。固体分離後のクロロホルムは少量のペンタメチレンジアミンを含有していた。参考例５と同様に固体の洗浄前後の表５に示す各項目について測定し、結果を表５に示す。前記の抽出操作後のクロロホルムと上記の固体洗浄後のクロロホルムとを合体し、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することによりペンタメチレンジアミンを単離した。参考例５と同様に固体の洗浄前後の表５に示す各項目について測定した。結果を表５に示す。

実施例１：
参考例１と同様にしてペンタメチレンジアミン二塩酸塩水溶液の濃縮液（ペンタメチレンジアミン濃度４０ｗｔ％）を調製した。一方、水酸化ナトリウム（林純薬社製試薬特級：パール状、純度９９％）１６６．４ｇ（水酸化ナトリウム純分：１６４．７ｇ）を水１７６．７ｇに溶解して４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を調製した。

上記の濃縮液１５０ｇを撹拌容器に入れ、４８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液３４３．１ｇを添加して十分に混合し固体を析出させた。析出した固体を濾過によって分離した。濾過後の液体を分液ロートに入れて十分に混合した後、静置してペンタメチレンジアミン相と水相とに相分離し、ペンタメチレンジアミン相と水相を得た。以下、液液分離によって回収されたペンタメチレンジアミン（ペンタメチレンジアミン濃度：７７．４％）を「粗ＰＭＤＡ」と称する。粗ＰＭＤＡ中の不純物イオン濃度、水分濃度および塩類濃度を表６に示す。

上記の粗ＰＭＤＡ７．３ｇ（０．０６２ｍｏｌ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液１８．６ｇ（０．２２３ｍｏｌ）を分液ロートに入れて十分に混合し、しばらく静置させてペンタメチレンジアミン相と水相とに分離し、軽液のペンタメチレンジアミン相のみを分取した。このペンタメチレンジアミン中のイオン濃度および水分濃度を表６に示す。次いで、オイルバス１１０℃、減圧度２０Ｔｏｒｒの条件で上記のペンタメチレンジアミンを蒸留精製し、精製ペンタメチレンジアミンを単離し、その時の突沸の様子を観察した。その結果を表６に示す。そして、この精製ペンタメチレンジアミンを使用し、参考例１と同様にしてポリアミド樹脂を製造した。得られたポリアミド樹脂の相対粘度は３．１、融点は２５５℃であった。

なお、突沸の様子は１分間当たりの突沸回数を指標として次の３段階の基準で評価した。突沸０〜４回／分：○、突沸５〜２０回／分：×、突沸２１回以上／分：××

実施例２：
実施例１で使用したのと同様の粗ＰＭＤＡ１１．２ｇに１，４−ジオキサン１０．２ｇを加え、十分に混合して固体を析出させた。この固体をろ別し、ペンタメチレンジアミンを分取した。このペンタメチレンジアミン中のイオン濃度および水分濃度を表６に示す。次いで、オイルバス１１０℃、減圧度２０Ｔｏｒｒの条件で上記のペンタメチレンジアミンを蒸留精製し、精製ペンタメチレンジアミンを単離し、その時の突沸の様子を観察した。その結果を表６に示す。

実施例３：
実施例１で使用したのと同様の粗ＰＭＤＡ１０．２ｇをオイルバス温度９０℃、減圧度５０Ｔｏｒｒで減圧脱水し、析出した塩をろ別し、ペンタメチレンジアミン相を分取した。このペンタメチレンジアミン中のイオン濃度および水分濃度を表６に示す。次いで、オイルバス１１０℃、減圧度２０Ｔｏｒｒの条件で上記のペンタメチレンジアミンを蒸留精製し、精製ペンタメチレンジアミンを単離し、その時の突沸の様子を観察した。その結果を表６に示す。

比較例１：
実施例１で使用したのと同様の粗ＰＭＤＡをそのまま使用し、オイルバス１１０℃、減圧度２０Ｔｏｒｒの条件で蒸留精製し、精製ペンタメチレンジアミンを単離し、その時の突沸の様子を観察した。その結果を表６に示す。

比較例２：
別途に調製した、ナトリウムイオン濃度６．６４ｗｔ％、塩素イオン濃度１０．０４ｗｔ％、水濃度５４．４３ｗｔ％のペンタメチレンジアミンをそのまま使用し、オイルバス１１０℃、減圧度２０Ｔｏｒｒの条件で蒸留精製し、精製ペンタメチレンジアミンを単離し、その時の突沸の様子を観察した。その結果を表６に示す。

ＬＤＣ遺伝子（ｃａｄＡ）増強株の作製工程図

Claims (10)

1. 不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を蒸留精製する精製ペンタメチレンジアミンの製造方法において、蒸留精製の前に上記の含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を脱塩処理して塩類の含有量を３ｗｔ％以下にすることを特徴とする精製ペンタメチレンジアミンの製造方法。
2. 不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミンが、ペンタメチレンジアミン塩水溶液にアルカリを添加、混合し、ペンタメチレンジアミンを遊離させると共にアルカリ塩を析出させた後に回収されたものである請求項１に記載の製造方法。
3. ペンタメチレンジアミン塩水溶液が、アルカリを添加、混合してペンタメチレンジアミン相と水相とに分液して得られたものである請求項２に記載の製造方法。
4. ペンタメチレンジアミン塩が、ペンタメチレンジアミン塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩、硝酸塩の何れかである請求項１〜３の何れかに記載の製造方法。
5. アルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化カルシウムである請求項１〜４の何れかに記載の製造方法。
6. 脱塩処理が、不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液にアルカリを添加、混合し、水相を相分離させた後に行われる請求項１〜５の何れかに記載の製造方法。
7. 脱塩処理が、不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液に貧溶媒を添加、混合し、析出した塩類を除去する方法によって行われる請求項１〜５の何れかに記載の製造方法。
8. 脱塩処理が、不純物として塩類を含む含水ペンタメチレンジアミン又はこれの抽出溶液を脱水蒸留し、析出した塩類を除去する方法によって行われる請求項１〜５の何れかに記載の製造方法。
9. ペンタメチレンジアミンが、リジン脱炭酸酵素、リジン脱炭酸酵素活性の向上した組み換え微生物、リジン脱炭酸酵素を産生する細胞または当該細胞の処理物の群から選ばれる少なくとも１種を使用し、リジンから産出されたものである請求項１〜８の何れかに記載の製造方法。
10. 請求項１〜９の何れかに記載の方法で得られるペンタメチレンジアミンを原料として使用して得られることを特徴とするポリアミド樹脂。

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