JP2009034095A

JP2009034095A - タンパク質含有水溶液安定化剤、タンパク質含有水溶液の安定化方法及びタンパク質含有水溶液

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Publication number: JP2009034095A
Application number: JP2008133321A
Authority: JP
Inventors: Shunichiro Yamaguchi; 俊一郎山口
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2007-07-06
Filing date: 2008-05-21
Publication date: 2009-02-19

Abstract

【課題】診断・検査薬、医薬品として広く利用される、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチドなどの水溶液中のタンパク質を安定化し、タンパク質の活性を長期的に低下させないタンパク質安定化剤、および安定化方法を提供する。
【解決手段】酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含有する水溶液の安定化剤であって、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を含んでなるタンパク質含有水溶液の安定化剤、並びに、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を、タンパク質の水溶液の体積に基づいて０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有するタンパク質含有水溶液。
【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質含有水溶液に含まれるタンパク質の安定化に関する。さらに詳しくは、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチドなどのタンパク質を含有する水溶液に含まれるタンパク質の安定化剤、この安定化剤を共存させるタンパク質含有水溶液の安定化方法、および安定化剤を共存させたタンパク質含有水溶液に関する。

酵素、抗体、ペプチドなどのタンパク質は、診断・検査薬、医薬品として広く利用されており、これらの製品においては、製造工程及び保存期間中に生理活性（力価）が損なわれないことが重要である。
製造工程及び保存期間中において、安定してタンパク質を取り出し精製するための一つの方法として凍結乾燥が一般的に行われている。タンパク質の多くは熱によって失活しやすい性質を有するが、凍結乾燥法では、熱をかけずにタンパク質を安定化することができる。
しかしながら、凍結乾燥法は、脱水により変性するタンパク質には使用できないこと、凍結乾燥工程中に吸湿や酸化による変質が起こりやすいこと等の難点がある。また、凍結乾燥製剤は使用時に溶媒（溶解液）に溶解して用いられるため、溶媒（溶解液）と組み合わせて供給される場合、試薬をその都度に必要量を調製しなければならないという煩雑さの問題がある。
このような理由からタンパク質を水溶液中で安定化させる技術が公開されている。たとえば、ウレアーゼパーオキシターゼの水溶液の安定化剤として、グリセリンなどの多価アルコールを含有させたり（たとえば、特許文献１）、コレステロールオキシターゼを含む水溶液に、牛血清アルブミンやグルコース等の糖類あるいはリジン等のアミノ酸を添加する（たとえば、特許文献２）等が挙げられる。
しかし、これらはいずれも特定のタンパク質を安定化させるための方法であり汎用性があるとは言いがたく、タンパク質全般に適用して活性を長期間維持できる汎用的な安定化剤及び安定化方法はなかった。

特開平６−７０７９８号公報特開平８−１８７０９５号公報

そこで、水溶液中のタンパク質の変性、変質及び凝集を抑制し、タンパク質の水溶液を長期的に安定化させることができるタンパク質の安定化剤を提供することが課題である。

本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含有する水溶液の安定化剤であって、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を含んでなるタンパク質含有水溶液の安定化剤；その安定化剤を含有させるタンパク質含有水溶液の安定化方法；安定化剤を含有するタンパク質含有水溶液である。

本発明のタンパク質含有水溶液の安定化剤は、水溶液中のタンパク質を安定化し、水溶液中のタンパク質の生理活性が低下しないので、医薬品、および生化学の分野において有効に使用することができる。

本発明は、酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含有する水溶液の安定化剤であって、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を含んでなるタンパク質含有水溶液の安定化剤である。
すなわち、塩基性アミノ酸であるアルギニンを有機酸で中和した塩を安定化剤として使用することを要旨とする。

酵素、ペプチドなどのタンパク質を水溶液として保存する際にそのまま保存すると、これらが凝集や加水分解等を起こし力価が著しく低下するという問題点があるが、本発明では、特定の化学構造を有する上記の塩（Ａ）を水溶液の安定化剤として添加することにより解決することを見出した。

本発明のタンパク質水溶液安定化剤において、安定化剤として作用させるために存在させるアルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）は、アルギニンを有機酸で中和したものである。

本発明における有機酸（ａ）としてはヒドロキシカルボン酸、カルボン酸、有機リン酸及び有機スルホン酸などが挙げられる。

ヒドロキシカルボン酸としては、モノヒドロキシカルボン酸（乳酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸及びサリチル酸等）、ジヒドロキシカルボン酸（オルセリン酸等）及びトリヒドロキシカルボン酸（没食子酸等）等が挙げられる。

カルボン酸としては、モノカルボン酸（蟻酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、オクタン酸、デカン酸及びオレイン酸等）、ジカルボン酸（フタル酸、シュウ酸及びアジピン酸等）、トリカルボン酸（トリメリット酸等）、テトラカルボン酸（エチレンジアミン４酢酸、ブタンテトラカルボン酸及びシクロペンタンテトラカルボン酸等）等が挙げられる。

有機リン酸としては、メチルリン酸、エチルリン酸等が挙げられる。

有機スルホン酸としては、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等が挙げられる。

これらのうち、タンパク質の安定化の観点からヒドロキシカルボン酸及びカルボン酸が好ましく、さらに好ましくはヒドロキシカルボン酸であり、次にさらに好ましくは乳酸及びクエン酸であり、最も好ましくは乳酸である。

ヒドロキシカルボン酸は、得られた酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチドなどが医薬品、食品分野で使用されることを考慮した場合、安全性の観点からも好ましい。

有機酸（ａ）による中和度は特に限定されず、部分中和塩であっても良い。例えば、２価の有機酸の場合、２価の完全中和塩であっても、１価分だけの部分中和塩であっても良い。
また、塩（Ａ）としては、１種だけを用いても複数種の塩（Ａ）の混合物を用いても良い。

本発明の安定化剤には緩衝剤及び多価アルコールを含んでもよい。
緩衝剤としては、公知（特開平０８−１８７０９５号公報等）に記載の緩衝剤を使用できる。多価アルコールとしては、グリセリン、ソルビトール及び公知（特開平０８−１８７０９５号公報等）に記載の糖類を使用できる。

アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を、酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドなどのタンパク質を含有する水溶液に含有させることでタンパク質含有水溶液のタンパク質を安定化できる。

塩（Ａ）の含有量は、長期間のタンパク質の安定化及びコストの観点から、これらのタンパク質を含有する水溶液の体積に基づいて０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有することが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜０．４ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０４〜０．２５ｍｏｌ／Ｌである。

なお、アルギニン以外の塩基性アミノ酸であるヒスチジン、リシンでも、安定化の効果は認められるが、長期安定化の観点から、アルギニンに比べて劣る。

タンパク質含有水溶液におけるタンパク質の含有量（重量％）は、タンパク質の安定化の観点からタンパク質含有水溶液の重量に基づいて、０．００１〜１０が好ましく、０．０１〜２がさらに好ましい。

タンパク質含有水溶液における塩（Ａ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定化の観点から、タンパク質の重量に基づいて８〜５，０００が好ましく、さらに好ましくは５０〜１，０００である。

本発明のタンパク質含有水溶液には、安定化効果を損なわない範囲で、緩衝剤、多価アルコール、金属塩、ゼラチン及び界面活性剤等を添加してもよい。

緩衝剤及び多価アルコールとしては前述のものが使用できる。金属塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が使用できる。ゼラチンとしては変性コラーゲンであれば特に限定することなく使用することができる。界面活性剤としては公知（特開２００７−２０４４９８号公報等）に記載の非イオン性界面活性剤等が使用でき、市販のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等が容易に入手できる。

本発明のタンパク質含有水溶液の安定化剤の使用方法及び本発明の安定化方法の例を以下に説明するが、アルギニンと有機酸との塩（Ａ）又は本発明の安定化剤をそのまま、あるいは水に溶かしてタンパク質含有水溶液に加えてもよいし、タンパク質をアルギニンと有機酸との塩（Ａ）の水溶液又は本発明の安定化剤の水溶液に加えてもよいし、タンパク質と、アルギニンと有機酸との塩（Ａ）又は本発明の安定化剤と、水とを同時に混ぜてもよい。
分離精製工程で分離された酵素の安定化水溶液を作成する場合の一例を以下に挙げる。
１．アルギニンと有機酸との塩（Ａ）又は本発明の安定化剤を水に加え、水溶液を作製する。
２．分離精製後の酵素水溶液を上記水溶液に加える。
３．常温（１０〜２５℃）もしくは冷蔵（４℃〜１０℃程度）で密封保存する。

本発明のタンパク質水溶液安定化剤が適用できるタンパク質としては、酵素（Ｐ１）、組み換えタンパク質（Ｐ２）、抗体（Ｐ３）及びペプチド（Ｐ４）などが含まれる。

酵素（Ｐ１）としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素及び脱離酵素などが含まれる。
加水分解酵素としては、リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。

組み換えタンパク質（Ｐ２）としては、タンパク製剤、ワクチン等が含まれる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、カルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン及びインフルエンザワクチン等が挙げられる。

抗体（Ｐ３）としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体等が挙げられる。モノクローナル抗体には、パーオキシターゼやアルカリ性フォスファターゼで標識した酵素標識抗体も含まれる。

ペプチド（Ｐ４）としては、アミノ酸の個数が２〜５０個の化合物であり、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド、トリペプチドなどが含まれる。

これらのうち、本発明は、タンパク質の安定化の観点から、酵素（Ｐ１）及び組み換えタンパク質（Ｐ２）に好適に適用され、特に（Ｐ１）に適している。

以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１（アルギニン・乳酸塩の合成）
２００ｍＬコルベンにアルギニン（和光純薬製）８．７ｇ（０．０５モル）を入れ、イオン交換水１００ｇに溶解させた。ここに９０％乳酸（和光純薬製）を５．０ｇ（０．０５モル）を少しずつ加え、６０℃で１時間加熱攪拌して反応させた。エバポレーターで濃縮後、水から再結晶して０．２Ｔｏｒｒで３時間減圧乾燥し、アルギニン・乳酸塩１１．９ｇ（収率９９％）を得た。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）で測定した純度は９９％であった。

実施例２（アルギニン・クエン酸塩の合成）
実施例１において、乳酸をクエン酸１水和物３．５ｇ（０．０１７モル）に変更する以外は実施１と同様におこない、アルギニン・クエン酸塩１１．０ｇ（収率９８％）を得た。純度は９９％であった。

実施例３（アルギニン・酢酸塩の合成）
実施例１において、乳酸を酢酸３．０ｇ（０．０５モル）に変更する以外は実施例１と同様におこない、アルギニン・酢酸塩１０．７ｇ（収率９８％）を得た。純度は９９％であった。

実施例４（アルギニン・蟻酸塩の合成）
実施例１において、乳酸を蟻酸２．３ｇ（０．０５モル）に変更する以外は実施例１と同様におこない、アルギニン・蟻酸塩１０．０ｇ（収率９７％）を得た。純度は９９％であった。

実施例５
リゾチーム（市販品「リゾチーム」和光純薬製、力価２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）１０ｍｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）０．９ｍＬに溶解させ、さらに、予め実施例１のアルギニン・乳酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液０．１ｍＬを加え、１分間かき混ぜ本発明のタンパク質含有水溶液（Ｒ−１）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・乳酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４１ｍｏｌ／Ｌであった。
この（Ｒ−１）の酵素活性（力価）を後述の方法で測定した。

実施例６
実施例５において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例２のアルギニンクエン酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・クエン酸塩水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例５と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−２）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・クエン酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０１６ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例７
実施例５において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例３のアルギニン・酢酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・酢酸塩水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例５と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−３）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・酢酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４６ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例８
実施例５において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例４のアルギニン・蟻酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・蟻酸塩水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例５と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−４）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・蟻酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０５０ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例９
実施例５において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例１のアルギニン・乳酸塩０．１ｇをイオン交換水４９．９ｇに撹拌混合して溶解させておいた０．２重量％アルギニン・乳酸塩水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例５と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−５）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・乳酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．００１ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例１０
実施例５において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、実施例１のアルギニン・乳酸塩０．１２３ｇをそのまま使用する以外は実施例５と同様に行い、本発明のリゾチーム含有水溶液（Ｒ−６）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に１．０重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・乳酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．５０ｍｏｌ／Ｌであった。

比較例１
実施例５において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させた牛血清アルブミン（和光純薬製）の水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例５と同様に行い、リゾチーム含有水溶液（Ｒ’−１）を得た。

比較例２
実施例５において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグルコース（和光純薬製）の水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例５と同様に行い、リゾチーム含有水溶液（Ｒ’−２）を得た。

比較例３
実施例５において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグリセリン（和光純薬製）の水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例５と同様に行い、リゾチーム含有水溶液（Ｒ’−３）を得た。

比較例４
実施例５において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたアルギニン・塩酸塩（和光純薬製）の水溶液０．１ｍＬを使用する以外は実施例５と同様に行い、リゾチーム含有水溶液（Ｒ’−４）を得た。

＜リゾチーム含有水溶液の酵素活性（力価）の測定＞
実施例５〜１０及び比較例１〜４で得られたリゾチーム含有水溶液（Ｒ−１）〜（Ｒ−６）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−４）が入った容積１．５ｍＬのエッペンドルフチューブを８０℃に温調した振とう器付き恒温槽で３０分インキュベートし、各溶液５０μＬを、２％枯草菌懸濁液（２０％枯草菌懸濁液２ｍＬに５０ｍＭリン酸緩衝液１８ｍＬを加えて前もって調製したもの）１ｍＬと５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍＬとが入った試験管に加えた。加えた直後の４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ₀）を分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらに測定開始から５分後にもう一度吸光度（Ａ₅）を測定し、これらの４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ΔＡ）を以下の式で算出した。

ΔＡ＝Ａ₅−Ａ₀

また、実施例５〜１０及び比較例１〜４のリゾチーム水溶液のリゾチーム濃度と同濃度の市販品「リゾチーム」の水溶液で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて、インキュベートしないこと以外は上記と同様に測定し、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ΔＡ_b）を測定し算出した。

ΔＡ_b＝Ａ_b5−Ａ_b0

８０℃で３０分間保管後の各リゾチーム含有水溶液の「力価の保持率」は以下の式を用いて算出した。

力価の保持率（％）＝（ΔＡ／ΔＡ_b） ×１００

上記実施例及び比較例の力価の保持率を表１に示す。

従来から使用されている安定化剤を用いた比較例１〜３は、酵素含有水溶液の安定化効果がまだ不十分であることがわかる。また、アルギニンの無機酸塩を使用した比較例４では、安定化効果が高まり、比較例１〜３に比べて力価の保持率が改善されるものの、依然として十分な効果が得られなかった。一方、アルギニンを有機酸で中和した本発明のアルギニンと有機酸との塩を使用した実施例５〜１０の安定化剤の力価の保持率は非常に高いことがわかる。

実施例１１
遺伝子組換えインターフェロンβ（和光純薬工業製、マウス由来）１００μｇをイオン水１００μＬに溶解させ、この水溶液１００μＬに、予め実施例１のアルギニン・乳酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液１０μＬを加えて軽く振り混ぜて均一化して本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−１）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・乳酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０３７ｍｏｌ／Ｌであった。
この（Ｉ−１）の活性（力価）を後述の方法で測定した。

実施例１２
実施例１１において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例２のアルギニン・クエン酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・クエン酸塩水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１１と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−２）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・クエン酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０１４ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例１３
実施例１１において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例３のアルギニン・酢酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・酢酸塩水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１１と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−３）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・酢酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４２ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例１４
実施例１１において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例４のアルギニン・蟻酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・蟻酸塩水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１１と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−４）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・蟻酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４５ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例１５
実施例１１において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例１のアルギニン・乳酸塩０．２ｇをイオン交換水４９．８ｇに撹拌混合して溶解させておいた０．２重量％アルギニン・乳酸塩水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１１と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−５）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・乳酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０１ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例１６
実施例１１において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、実施例１のアルギニン・乳酸塩０．００１８ｇをそのまま使用する以外は実施例１１と同様に行い、本発明のインターフェロンβ水溶液（Ｉ−６）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・クエン酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．５０ｍｏｌ／Ｌであった。

比較例５
実施例１１において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させた牛血清アルブミン（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１１と同様に行い、インターフェロンβ水溶液（Ｉ’−１）を得た。

比較例６
実施例１１において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグルコース（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１１と同様に行い、インターフェロンβ水溶液（Ｉ’−２）を得た。

比較例７
実施例１１において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグリセリン（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１１と同様に行い、インターフェロンβ水溶液（Ｉ’−３）を得た。

比較例８
実施例１１において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたアルギニン・塩酸塩（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１１と同様に行い、インターフェロンβ水溶液（Ｉ’−４）を得た。

＜インターフェロンβ水溶液の活性（力価）の測定＞
実施例１１〜１６及び比較例５〜８で得られたインターフェロン水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）及び（Ｉ’−１）〜（Ｉ’−４）を恒温槽中で３７℃、３時間インキュベートし、この水溶液５０μＬを、インターフェロンβ ＥＬＩＳＡキット（「インターフェロンβ ＥＬＩＳＡキット」、鎌倉テクノサイエンス社製）を用いて、力価を測定した。力価はインターフェロンに作用する酵素標識抗インターフェロンモノクローナル抗体の酵素活性で評価した。酵素活性はキットに添付の説明書に従い、分光光度計で吸光度を読み取り検量線を作成し、検量線から各サンプルの力価を算出した。
また、インターフェロン水溶液（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）及び（Ｉ’−１）〜（Ｉ’−４）を恒温槽でインキュベートする前に上記と同様に測定し、別途力価を算出した。
力価の保持率は、以下の式で計算した。

力価の保持率＝（インキュベート後の力価）／（インキュベート前の力価）×１００

上記実施例及び比較例の力価の保持率を表２に示す。

従来から使用されている安定化剤を用いた比較例５〜７は、組換えタンパク質含有水溶液の安定化効果がまだ不十分であることがわかる。また、アルギニンの無機酸塩を使用した比較例８では、安定化効果が高まり、比較例５〜７に比べて力価の保持率が改善されるものの、依然として十分な効果が得られなかった。一方、アルギニンを有機酸で中和した本発明のアルギニンと有機酸との塩を使用した実施例１１〜１６の安定化剤の力価の保持率は非常に高いことがわかる。

実施例１７
西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ標識抗ヒトインターフェロンβマウスモノクローナル抗体溶液（鎌倉テクノサイエンス社製）１００μＬに、予め実施例１のアルギニン・乳酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液を１０μＬを加えて軽く振り混ぜて均一化して本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−１）を得た。
この（Ｍ−１）の活性（力価）を後述の方法で測定した。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・乳酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０３７ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例１８
実施例１７において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例２のアルギニン・クエン酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・クエン酸塩水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１７と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−２）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・クエン酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０１４ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例１９
実施例１７において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例３のアルギニン・酢酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・酢酸塩水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１７と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−３）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・酢酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４２ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例２０
実施例１７において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例４のアルギニン・蟻酸塩１ｇをイオン交換水９ｇに撹拌混合して溶解させておいた１０重量％アルギニン・蟻酸塩水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１７と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−４）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・蟻酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０４５ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例２１
実施例１７において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、予め実施例１のアルギニン・乳酸塩０．１ｇをイオン交換水４９．９ｇに撹拌混合して溶解させておいた０．２重量％アルギニン・乳酸塩水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１７と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−５）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・乳酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．０１ｍｏｌ／Ｌであった。

実施例２２
実施例１７において、１０重量％アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、実施例１のアルギニン・乳酸塩０．００１４ｇをそのまま使用する以外は実施例１７と同様に行い、本発明のモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−６）を得た。
得られたタンパク質含有水溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質含有水溶液の重量を基準に０．０９１重量％であった。得られたタンパク質含有水溶液中のアルギニン・クエン酸塩の濃度は、タンパク質含有水溶液の体積を基準に０．５０ｍｏｌ／Ｌであった。

比較例９
実施例１７において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させた牛血清アルブミン（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１７と同様に行い、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ’−１）を得た。

比較例１０
実施例１７において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグルコース（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１７と同様に行い、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ’−２）を得た。

比較例１１
実施例１７において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたグリセリン（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１７と同様に行い、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ’−３）を得た。

比較例１２
実施例１７において、アルギニン・乳酸塩水溶液の代わりに、１０重量％となるようにイオン交換水で予め溶解させたアルギニン・塩酸塩（和光純薬製）の水溶液１０μＬを使用する以外は実施例１７と同様に行い、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ’−４）を得た。

＜モノクローナル抗体水溶液の活性（力価）の測定＞
実施例１７〜２２及び比較例９〜１２で得られたモノクローナル抗体水溶液（Ｍ−１）〜（Ｍ−６）及び（Ｍ’−１）〜（Ｍ’−４）を恒温槽中で３７℃、３時間インキュベートし、この水溶液５０μＬを、インターフェロンβ ＥＬＩＳＡキット（「インターフェロンβ ＥＬＩＳＡキット」、鎌倉テクノサイエンス社製）を用いて、力価を測定した。力価はインターフェロン標準液（キットに付属）に作用する酵素標識抗インターフェロンモノクローナル抗体の酵素活性で評価した。酵素活性はキットに添付の説明書に従い、分光光度計で吸光度を読み取り検量線を作成し、検量線から各サンプルの力価を算出した。
また、モノクローナル抗体水溶液（Ｍ−１）〜（Ｍ−６）及び（Ｍ’−１）〜（Ｍ’−４）を恒温槽でインキュベートする前に上記と同様に測定し、別途力価を算出した。
力価の保持率は、以下の式で計算した。

力価の保持率＝（インキュベート後の力価）／（インキュベート前の力価）×１００

上記実施例及び比較例の力価の保持率を表３に示す。

従来から使用されている安定化剤を用いた比較例９〜１１は、抗体含有水溶液の安定化効果がまだ不十分であることがわかる。また、アルギニンの無機酸塩を使用した比較例１２では、安定化効果が高まり、比較例９〜１１に比べて力価の保持率が改善されるものの、依然として十分な効果が得られなかった。一方、アルギニンを有機酸で中和した本発明のアルギニンと有機酸との塩を使用した実施例１７〜２２の安定化剤の力価の保持率は非常に高いことがわかる。

本発明のタンパク質含有水溶液のの安定化剤は、タンパク質を安定化し活性を長期間低下させないので、医薬品、食品、および生化学の分野において有効に使用することができる。たとえば、タンパク医薬品液体製剤、酵素液体製剤、工業用酵素水溶液、液体洗剤、飲料、診断薬用の測定試薬、タンパク質の標準液などに使用できる。

Claims

酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含有する水溶液の安定化剤であって、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を含んでなるタンパク質含有水溶液の安定化剤。
有機酸（ａ）がヒドロキシカルボン酸である請求項１に記載のタンパク質含有水溶液の安定化剤。
有機酸（ａ）が乳酸である請求項１又は２に記載のタンパク質含有水溶液の安定化剤。
酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含有する水溶液に、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を、タンパク質を含有する水溶液の体積に基づいて０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有させることからなるタンパク質含有水溶液の安定化方法。
酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含有する水溶液であり、アルギニンと有機酸（ａ）との塩（Ａ）を、タンパク質の水溶液の体積に基づいて０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有するタンパク質含有水溶液。