JP2009029918A - 分離方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡便な操作で、特定のフィコビリン系色素を高純度で分離し得る分離方法を提供すること。
【解決手段】本発明の分離方法は、複数種のフィコビリン系色素を含有する試料中から、少なくとも１種のフィコビリン系色素を分離する方法であり、前記試料とリン酸系緩衝液とを混合して試料液を調製する調製工程と、少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された充填剤を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる装置内に試料液を供給する供給工程と、装置内にフィコビリン系色素を溶出させるための溶出用リン酸系緩衝液を供給し、装置内から流出する流出液を所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、フィコビリン系色素を分離する分画工程と、流出液に結晶化剤を添加してフィコビリン系色素を結晶化させる結晶化工程とを有し、分画工程において前記溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度を連続的または段階的に変化させる。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の分離方法は、複数種のフィコビリン系色素を含有する試料中から、少なくとも１種のフィコビリン系色素を分離する方法であり、前記試料とリン酸系緩衝液とを混合して試料液を調製する調製工程と、少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された充填剤を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる装置内に試料液を供給する供給工程と、装置内にフィコビリン系色素を溶出させるための溶出用リン酸系緩衝液を供給し、装置内から流出する流出液を所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、フィコビリン系色素を分離する分画工程と、流出液に結晶化剤を添加してフィコビリン系色素を結晶化させる結晶化工程とを有し、分画工程において前記溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度を連続的または段階的に変化させる。
【選択図】なし
Description
本発明は、分離方法、特に、複数種のフィコビリン系色素から、少なくとも１種のフィコビリン系色素を分離する分離方法に関するものである。
抗原−抗体反応を利用して、検出対象物を高感度で検出する方法として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）等が用いられている。
かかる酵素免疫測定法では、例えば、検出対象物を抗原として、この検出対象物（抗原）に特異的に結合する抗体を調製し、この抗体に標識として蛍光物質を担持（結合）させた試薬が利用される。
近年、この蛍光物質として、例えば、藻類に含まれる蛍光タンパク質を用いることが検討されている。
例えば、特許文献１には、このような蛍光タンパク質（フィコエリスリン）を、緩衝液を用いて、藻類から抽出する方法が開示されている。
しかしながら、この特許文献１に記載の方法では、抽出液中に、フィコエリスリン以外の他の蛍光タンパク質や、蛍光タンパク質以外のタンパク質等が混入するのを十分に回避するのが困難である。
本発明の目的は、簡便な操作で、特定のフィコビリン系色素を高純度で分離し得る分離方法を提供することにある。
このような目的は、下記（１）〜（１０）の本発明により達成される。
（１） 複数種のフィコビリン系色素を含有する試料中から、少なくとも１種のフィコビリン系色素を分離する分離方法であって、
前記複数種のフィコビリン系色素を含有する試料と、リン酸系緩衝液とを混合して試料液を調製する調製工程と、
少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された充填剤を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる装置内に、前記試料液を供給する供給工程と、
前記装置内に、前記フィコビリン系色素を溶出させるための溶出用リン酸系緩衝液を供給して、前記装置内から流出する流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記フィコビリン系色素を分離する分画工程と、
前記流出液に結晶化剤を添加して、前記フィコビリン系色素を結晶化させる結晶化工程とを有し、
前記分画工程において、前記溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度を連続的または段階的に変化させることを特徴とする分離方法。
これにより、簡便な操作で、特定のフィコビリン系色素を高純度で分離し得る。
（１） 複数種のフィコビリン系色素を含有する試料中から、少なくとも１種のフィコビリン系色素を分離する分離方法であって、
前記複数種のフィコビリン系色素を含有する試料と、リン酸系緩衝液とを混合して試料液を調製する調製工程と、
少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された充填剤を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる装置内に、前記試料液を供給する供給工程と、
前記装置内に、前記フィコビリン系色素を溶出させるための溶出用リン酸系緩衝液を供給して、前記装置内から流出する流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記フィコビリン系色素を分離する分画工程と、
前記流出液に結晶化剤を添加して、前記フィコビリン系色素を結晶化させる結晶化工程とを有し、
前記分画工程において、前記溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度を連続的または段階的に変化させることを特徴とする分離方法。
これにより、簡便な操作で、特定のフィコビリン系色素を高純度で分離し得る。
（２） 前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分として構成されている上記（１）に記載の分離方法。
これにより、フィコビリン系色素と他のタンパク質とを効率良く分離することができるとともに、複数種のフィコビリン系色素を相互に分離し易くなる。
（３） 前記複数種のフィコビリン系色素は、Ｒ−フィコエリスリンを含み、
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給し、
該第１の溶出用リン酸系緩衝液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収する上記（２）に記載の分離方法。
これにより、Ｒ−フィコエリスリンを確実に分離することができる。
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給し、
該第１の溶出用リン酸系緩衝液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収する上記（２）に記載の分離方法。
これにより、Ｒ−フィコエリスリンを確実に分離することができる。
（４） 前記複数種のフィコビリン系色素は、Ｒ−フィコエリスリンおよびフィコシアニンを含み、
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５ｍＭ以上７５ｍＭ未満である第２の溶出用リン酸系緩衝液とを、段階的に前記装置内に供給し、
前記第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収し、前記第２の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンおよび前記フィコシアニンをこの順で回収する上記（２）に記載の分離方法。
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５ｍＭ以上７５ｍＭ未満である第２の溶出用リン酸系緩衝液とを、段階的に前記装置内に供給し、
前記第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収し、前記第２の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンおよび前記フィコシアニンをこの順で回収する上記（２）に記載の分離方法。
これにより、Ｒ−フィコエリスリンおよびフィコシアニンを確実に分離することができる。
（５） 前記複数種のフィコビリン系色素は、Ｒ−フィコエリスリン、フィコシアニンおよびアロフィコシアニンを含み、
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５ｍＭ以上７５ｍＭ未満である第２の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が７５ｍＭ以上２５０ｍＭ未満である第３の溶出用リン酸系緩衝液とを、段階的に前記装置内に供給し、
前記第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収し、前記第２の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンおよび前記フィコシアニンをこの順で回収し、前記第３の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記アロフィコシアニンを回収する上記（２）に記載の分離方法。
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５ｍＭ以上７５ｍＭ未満である第２の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が７５ｍＭ以上２５０ｍＭ未満である第３の溶出用リン酸系緩衝液とを、段階的に前記装置内に供給し、
前記第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収し、前記第２の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンおよび前記フィコシアニンをこの順で回収し、前記第３の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記アロフィコシアニンを回収する上記（２）に記載の分離方法。
これにより、Ｒ−フィコエリスリン、フィコシアニンおよびアロフィコシアニンを確実に分離することができる。
（６） 前記複数種のフィコビリン系色素は、Ｒ−フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンおよびＹ−フィコエリスリンを含み、
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５ｍＭ以上７５ｍＭ未満である第２の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が７５ｍＭ以上２５０ｍＭ未満である第３の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５０ｍＭ以上である第４の溶出用リン酸系緩衝液とを、段階的に前記装置内に供給し、
前記第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収し、前記第２の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンおよび前記フィコシアニンをこの順で回収し、前記第３の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記アロフィコシアニンを回収し、前記第４の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｙ−フィコエリスリンを回収する上記（２）に記載の分離方法。
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５ｍＭ以上７５ｍＭ未満である第２の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が７５ｍＭ以上２５０ｍＭ未満である第３の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５０ｍＭ以上である第４の溶出用リン酸系緩衝液とを、段階的に前記装置内に供給し、
前記第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収し、前記第２の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンおよび前記フィコシアニンをこの順で回収し、前記第３の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記アロフィコシアニンを回収し、前記第４の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｙ−フィコエリスリンを回収する上記（２）に記載の分離方法。
これにより、Ｒ−フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンおよびＹ−フィコエリスリンを確実に分離することができる。
（７） 前記調製工程において、前記複数種のフィコビリン系色素を含む試料は、主として紅藻類、藍藻類およびクリプト藻類のうちの少なくとも１種を含む上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の分離方法。
本発明によれば、紅藻類、藍藻類およびクリプト藻類を由来とする試料中に含まれる複数種のフィコビリン系色素から、特定のフィコビリン系色素を確実に分離することができる。
（８） 前記分画工程において、前記溶出用リン酸系緩衝液のｐＨは、６〜８である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の分離方法。
これにより、フィコビリン系色素の変質・劣化を防止しつつ、溶出用リン酸系緩衝液中にフィコビリン系色素をより確実に溶出（回収）することができる。
（９） 前記分画工程において、前記溶出用リン酸系緩衝液の温度は、３０〜５０℃である上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の分離方法。
これにより、不必要なタンパク質が溶出用リン酸系緩衝液中に溶出するのをより確実に防止することができる。すなわち、目的とするフィコビリン系色素の回収率（純度）をより向上することができる。
（１０） 前記結晶化剤は、硫酸アンモニウムを主成分として構成されている上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の分離方法。
これにより、フィコビリン系色素を確実に結晶化させることができる。
これにより、フィコビリン系色素を確実に結晶化させることができる。
本発明によれば、簡便な操作で、特定のフィコビリン系色素（蛍光タンパク質）を高純度で分離し得る。
また、用いる溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度を適宜調製することにより、目的とする特定のフィコビリン系色素をより確実に分離することができる。
以下、本発明の分離方法を添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
まず、本発明の分離方法について説明するのに先立って、本発明で用いられる吸着装置分離装置）の一例について説明する。
まず、本発明の分離方法について説明するのに先立って、本発明で用いられる吸着装置分離装置）の一例について説明する。
図１は、本発明で用いる吸着装置の一例を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
ここで、流入側とは、目的とするフィコビリン系色素を分離（精製）する際に、例えば、試料液（試料を含む液体）、溶出用リン酸系緩衝液（溶出液）等の液体を、吸着装置内に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記液体が吸着装置内から流出する側のことを言う。
図１に示す吸着装置１は、カラム２と、粒状の吸着剤（充填剤）３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。
カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。
カラム本体２１は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。
カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。
このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０の少なくとも一部に（本実施形態では、ほぼ満量で）、吸着剤３が充填されている。
吸着剤充填空間２０の容積は、試料液の容量に応じて適宜設定され、特に限定されないが、試料液１ｍＬに対して、０．０５〜１０ｍＬ程度が好ましく、０．５〜２ｍＬ程度がより好ましい。
吸着剤充填空間２０の寸法を上記のように設定し、かつ後述する吸着剤３の寸法を後述のように設定することにより、複数種のフィコビリン系色素を相互にかつ確実に分離することができる。
また、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
各キャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、前記液体が供給される。また、吸着剤３に供給された液体は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。このとき、試料液（試料）に含まれる複数種のフィコビリン系色素は、吸着剤３に対する吸着性の差異およびリン酸系緩衝液に対する親和性の差異に基づいて分離される。
各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、それぞれ、例えば、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等で構成されている。
吸着剤３は、その少なくとも表面が、リン酸カルシウム系化合物で構成されている。かかる吸着剤３には、複数種のフィコビリン系色素（蛍光タンパク質）が特異的に吸着し、この吸着剤３に対する吸着性の差異およびリン酸系緩衝液に対する親和性の差異に基づいて、それぞれを分離することができる。
リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、例えば、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、ＴＣＰ（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２、ＤＣＰＤ（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
中でも、リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分として構成されるものが好ましい。かかる吸着剤３を用いることにより、フィコビリン系色素と他のタンパク質と効率良く分離することができるとともに、後述するように、溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度を連続的または段階的に変化させことにより、複数種のフィコビリン系色素からの特定のフィコビリン系色素の分離をより容易に行うことができる。
前述の吸着剤３の形態（形状）は、図１に示すように、粒状（顆粒状）のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状）等とすることもできる。なお、吸着剤３を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、フィコビリン系色素に対する分離特性の向上を図ることができる。
粒状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、０．５〜１５０μｍ程度であるのが好ましく、１０〜８０μｍ程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。
なお、吸着剤３は、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであってもよく、担体（基体）の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆したものであってもよい。
また、本実施形態のように、吸着剤３を吸着剤充填空間２０にほぼ満量充填する場合には、吸着剤３は、吸着剤充填空間２０の各部において、ほぼ同一の組成をなしているのが好ましい。これにより、吸着装置１は、フィコビリン系色素の分離（精製）能が特に優れたものとなる。
なお、吸着剤充填空間２０の一部（例えば流入管２４側の一部）に吸着剤３を充填し、その他の部分には他の吸着剤を充填するようにしてもよい。
次に、このような吸着装置１を用いたフィコビリン系色素の分離方法（本発明の分離方法）について説明する。
［１］ 調製工程
まず、複数種のフィコビリン系色素を含む試料と、リン酸系緩衝液とを混合して、試料液を調製する。
まず、複数種のフィコビリン系色素を含む試料と、リン酸系緩衝液とを混合して、試料液を調製する。
ここで、フィコビリン系色素としては、例えば、Ｒ−フィコエリスリン、Ｙ−フィコエリスリン、Ｂ−フィコエリスリンのようなフィコエリスリン、Ｃ−フィコシアニン、アロフィコシアニンのようなフィコシアニン等が挙げられる。なお、本実施形態では、複数種のフィコビリン系色素を含む試料として、Ｒ−フィコエリスリン、Ｙ−フィコエリスリン、フィコシアニンおよびアロフィコシアニンを含む場合を一例として説明する。
なお、かかる複数種のフィコビリン系色素を取り出す（抽出する）試料としては、例えば、紅藻類、藍藻類およびクリプト藻類等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。本発明の分離方法によれば、これらに由来とする試料中に含まれる複数種のフィコビリン系色素から、特定のフィコビリン系色素を確実に分離することができる。
また、これらの試料は、そのまま（生のまま）用いてもよいし、例えば、凍結乾燥等した乾燥物またはその粉砕物を用いるようにしてもよい。
リン酸系緩衝液には、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸リチウム等が挙げられる。
試料液の調製に用いるリン酸系緩衝液は、その塩濃度が後述する第１の溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度と等しいか低いのが好ましい。これにより、調製される試料液中から、不要なタンパク質をより確実に除去することができる。
試料液を調製する際に用いるリン酸系緩衝液の量は、特に限定されないが、試料の質量に対して、５〜３００倍程度であるのが好ましく、５０〜１５０倍程度であるのがより好ましい。
また、このリン酸系緩衝液のｐＨは、特に限定されないが、６〜８程度であるのが好ましく、６．５〜７．５程度であるのがより好ましい。
さらに、リン酸系緩衝液の温度も、特に限定されないが、３０〜５０℃程度であるのが好ましく、３５〜４５℃程度であるのがより好ましい。
かかるｐＨ範囲および温度範囲のリン酸系緩衝液を用いることにより、フィコビリン系色素をリン酸系緩衝液中に、より確実に溶出させる（抽出する）ことができる。その結果、目的とするフィコビリン系色素の回収率の向上を図ることができる。
なお、調製した試料液中に固形物が含まれる場合には、試料液中から固形物を除去するのが好ましい。これにより、カラム２の目詰まりを確実に防止することができる。この固形物を除去する方法は、特に限定されないが、例えば、試料液を遠心分離した後、上清液を回収し、この上清液から残存する固形物をフィルタにより濾別する方法等が挙げられる。
［２］ 供給工程
次に、この試料液を、流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給して、カラム２（吸着装置１）内を通過させて、吸着剤３に接触させる。
次に、この試料液を、流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給して、カラム２（吸着装置１）内を通過させて、吸着剤３に接触させる。
これにより、吸着剤３に対して吸着能の低い成分（例えば、フィコビリン系色素以外のタンパク質等）は、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出する。そして、吸着剤３に対して吸着能が高いフィコビリン系色素や、フィコビリン系色素以外のタンパク質の中でも吸着剤３に対して比較的吸着能の高いタンパク質は、カラム２内に保持される。
［３］ 分画工程
次に、流入管２４からカラム２内に、フィコビリン系色素を溶出させるための溶出用リン酸系緩衝液を供給して、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、所定量ずつ分画（採取）する。
次に、流入管２４からカラム２内に、フィコビリン系色素を溶出させるための溶出用リン酸系緩衝液を供給して、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、所定量ずつ分画（採取）する。
本発明では、溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度を連続的または段階的に変化させる。なお、溶出用リン酸系緩衝液には、前記調整工程において用いるリン酸系緩衝液と同種のものが好適に用いられる。
ここで、複数種のフィコビリン系色素や、フィコビリン系色素以外のタンパク質が吸着剤３に吸着している場合、吸着剤３に溶出用リン酸系緩衝液が接触すると、まず、フィコビリン系色素よりも吸着剤３に対する吸着能が低いフィコビリン系色素以外のタンパク質が吸着剤３から離脱し、流出管２５から流出する。その後、吸着剤３に吸着したフィコビリン系色素は、その種類毎に、溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度に応じて吸着剤３から離脱する。そして、溶出用リン酸系緩衝液中に混入し、流出管２５から流出する流出液中に回収される。そのため、流出管２５から流出する流出液を所定量ずつ分画すれば、複数種のフィコビリン系色素を含む試料液中から特定のフィコビリン系色素を分離することができる。
すなわち、複数種のフィコビリン系色素を含む試料液中から、Ｒ−フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンおよびＹ−フィコエリスリンのうちの少なくとも１種を分離することができる。
本発明では溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度を連続的または段階的に変化させるが、本実施形態では、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５ｍＭ以上７５ｍＭ未満である第２の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が７５ｍＭ以上２５０ｍＭ未満である第３の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５０ｍＭ以上である第４の溶出用リン酸系緩衝液とを、この順で、段階的にカラム２内に供給するのが好ましい。
この場合、第１の溶出用リン酸系緩衝液中に、Ｒ−フィコエリスリンが回収され、第２の溶出用リン酸系緩衝液中に、Ｒ−フィコエリスリンおよびフィコシアニンが回収され、第３の溶出用リン酸系緩衝液中に、アロフィコシアニンが回収され、第４の溶出用リン酸系緩衝液中に、Ｙ−フィコエリスリンが回収される。
なお、第１の溶出用リン酸系緩衝液は、その塩濃度が１〜１０ｍＭ程度であるのがより好ましく、第２の溶出用リン酸系緩衝液は、その塩濃度が３５〜６５ｍＭ程度であるのがより好ましく、第３の溶出用リン酸系緩衝液は、その塩濃度が８５〜１２５ｍＭ程度であるのがより好ましく、第４の溶出用リン酸系緩衝液は、その塩濃度が４５０〜６５０ｍＭ程度であるのがより好ましい。また、第１の溶出用リン酸系緩衝液は、その塩濃度が１〜５ｍＭ程度であるのがさらに好ましく、第２の溶出用リン酸系緩衝液は、その塩濃度が４５〜５５ｍＭ程度であるのがさらに好ましく、第３の溶出用リン酸系緩衝液は、その塩濃度が９５〜１０５ｍＭ程度であるのがさらに好ましく、第４の溶出用リン酸系緩衝液は、その塩濃度が４９０〜５１０ｍＭ程度であるのがさらに好ましい。
このような塩濃度の溶出用リン酸系緩衝液を用いて、カラム２内に段階的に供給することにより、目的とするフィコビリン系色素をより確実に分離することができる。
第１〜第４の溶出用リン酸系緩衝液のｐＨは、それぞれ、６〜８程度であるのが好ましく、６．５〜７．５程度であるのがより好ましい。溶出用リン酸系緩衝液のｐＨを、前記範囲に設定することにより、フィコビリン系色素の変質・劣化を防止しつつ、溶出用リン酸系緩衝液中にフィコビリン系色素をより確実に溶出（回収）することができる。
第１〜第４の溶出用リン酸系緩衝液の温度は、３０〜５０℃程度であるのが好ましく、３５〜４５℃程度であるのがより好ましい。溶出用リン酸系緩衝液の温度を、前記範囲に設定することにより、不必要なタンパク質が溶出用リン酸系緩衝液中に溶出するのをより確実に防止することができる。すなわち、目的とするフィコビリン系色素の回収率（純度）をより向上することができる。
また、第１〜第４の溶出用リン酸系緩衝液の通液速度は、特に限定されないが、１〜１０ｍＬ／ｍｉｎ程度であるのが好ましく、１〜５ｍＬ／ｍｉｎ程度であるのがより好ましい。
第１〜第４の溶出用リン酸系緩衝液の通液時間は、特に限定されないが、それぞれ、５〜６０ｍｉｎ程度であるのが好ましく、１０〜３０ｍｉｎ程度であるのがより好ましい。
［４］ 結晶化工程
次に、分画された各画分の流出液毎に結晶化剤を添加して、フィコビリン系色素を結晶化する。これにより、目的とするフィコビリン系色素を、高純度で容易に回収することができる。
次に、分画された各画分の流出液毎に結晶化剤を添加して、フィコビリン系色素を結晶化する。これにより、目的とするフィコビリン系色素を、高純度で容易に回収することができる。
結晶化剤としては、特に限定されないが、硫酸アンモニウムを主成分とするものを用いるのが好適である。かかる結晶化剤を用いることにより、フィコビリン系色素の変質・劣化を防止しつつ、フィコビリン系色素の確実な結晶化が可能である。
また、結晶化剤は、流出液中の濃度が、好ましくは３０〜９０％飽和濃度程度、より好ましくは４０〜６０％飽和濃度程度となるように、流出液中に添加する量が適宜設定される。
なお、前記の結晶化剤は、そのまま流出液に添加してもよいし、適当な溶媒に溶解した溶解液として流出液に添加するようにしてもよい。
ところで、本実施形態では、それぞれ１種の第１〜第４の溶出用リン酸系緩衝液を用意し、これらを第１〜第４の溶出用リン酸系緩衝液の順で、カラム２内に供給する場合について説明したが、例えば、Ｒ−フィコエリスリンを選択的に回収することを目的とする場合には、第１の溶出用リン酸系緩衝液と、この第１の溶出用リン酸系緩衝液より塩濃度が高い溶出用リン酸系緩衝液との２種類を用意し、これらをこの順でカラム２に供給した後、第２〜第４の溶出用リン酸系緩衝液をカラム２内に供給するようにしてもよい。
また、同様に、回収目的のフィコビリン系色素に応じて、第１〜第４の溶出用リン酸系緩衝液のうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。
例えば、第１および第２の溶出用リン酸系緩衝液を用いて、第１の溶出用リン酸系緩衝液をカラム２に供給している際に、カラム２から流出する流出液中からＲ−フィコエリスリンを回収し、第２の溶出用リン酸系緩衝液中をカラム２に供給している際に、カラム２から流出する流出液中からＲ−フィコエリスリンおよびフィコシアニンを回収してもよい。
また、例えば、第１〜第３の溶出用リン酸系緩衝液を用いて、第１の溶出用リン酸系緩衝液をカラム２に供給している際に、カラム２から流出する流出液中からＲ−フィコエリスリンを回収し、第２の溶出用リン酸系緩衝液をカラム２に供給している際に、カラム２から流出する流出液中から、Ｒ−フィコエリスリンおよびフィコシアニンを回収し、第３の溶出用リン酸系緩衝液をカラム２に供給している際に、カラム２から流出する流出液中からアロフィコシアニンを回収してもよい。
上述したように、本発明の分離方法によれば、複数種のフィコビリン系色素を含む試料中から特定のフィコビリン系色素を分離する際に、カラム等の吸着装置を分離する前記フィコビリン系色素の種類に応じて交換する必要がなく、吸着装置に供給するリン酸系緩衝液の塩濃度を連続的または段階的に変化させるという簡便な操作で、特定のフィコビリン系色素を分離し得る。
以上、本発明の分離方法について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。例えば、任意の目的で、１以上の工程を追加することができる。
また、例えば、前記実施形態では、吸着装置として、カラム中に粒状の吸着剤（充填剤）を充填したものを用いる場合について説明したが、例えば、吸着剤を平板状に形成し、この平板状の吸着剤を収納した吸着装置を用いることができる。
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
（実施例１）
−１− まず、１ｇの乾燥海苔（試料）を用意し、この試料を、グラインダーを用いて粉末状に粉砕した。
（実施例１）
−１− まず、１ｇの乾燥海苔（試料）を用意し、この試料を、グラインダーを用いて粉末状に粉砕した。
−２− 次に、この粉体に、１ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加して、３７℃で２４時間攪拌した。
−３− 次に、攪拌後の混合液を遠心分離（２０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）した後、上清液を回収し、この上清液を、平均細孔径０．４μｍのフィルタを通過させた。これにより、試料液を得た。
−４− 次に、６０ｍＬの試料液（Ｓａｍｐｌｅ）を、Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｂｉｏ−ｓｃａｌｅ カラム ＭＴ５（吸着装置）内に、２ｍＬ／ｍｉｎの速度で３０ｍｉｎ間供給した。なお、カラムの充填空間の容積は、５ｍＬであった。
また、カラム内に充填する充填剤には、カルシウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃａ−ＨＡＰ）（粒子径４０μｍ、Ｔｙｐｅ−II、ペンタックス社製）を用いた。なお、カルシウムハイドロキシアパタイトビーズ（Ｃａ−ＨＡＰ）とは、Ｃａが他の金属元素で置換されていない、通常のハイドロキシアパタイトビーズを表す。
−５− 次に、第１の溶出用リン酸系緩衝液として、１ｍＭのリン酸緩衝液（リン酸ナトリウム：ｐＨ７．０）および５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を、第２の溶出用リン酸系緩衝液として、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を、第３の溶出用リン酸系緩衝液として、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を、第４の溶出用リン酸系緩衝液として５００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用意し、それぞれ、この順で、各溶出用リン酸系緩衝液（６０ｍＬ）を４ｍＬ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ間供給した。そして、カラムから流出する流出液を４ｍＬずつ（１ｍｉｎ毎）に分けて回収（分画）した。
なお、最初に分画した４ｍＬの流出液を画分（フラクション）１とし、順次分画される４ｍＬ毎の流出液に画分（フラクション）Ｎｏ．を付与した。すなわち、１ｍＭのリン酸緩衝液を供給している際に回収される流出液を画分１〜１５（Ｆ１〜Ｆ１５）とし、５ｍＭのリン酸緩衝液を供給している際に回収される流出液を画分１６〜３０（Ｆ１６〜Ｆ３０）とし、５０ｍＭのリン酸緩衝液を供給している際に回収される流出液を画分３１〜４５（Ｆ３１〜Ｆ４５）とし、１００ｍＭのリン酸緩衝液を供給している際に回収される流出液を画分４６〜６０（Ｆ４６〜Ｆ６０）とし、５００ｍＭのリン酸緩衝液を供給している際に回収される流出液を画分６１〜７５（Ｆ６１〜Ｆ７５）とした。
−６− 次に、各画分の流出液に、５０ｗｔ％の硫酸アンモニウム水溶液を添加した。これにより、フィコビリン系色素を結晶化させた。
ここで、前記−５−の工程において、図２に試料液に含まれる複数種のフィコビリン系色素を吸着装置を用いて分離した際に測定された吸光度曲線を示す。なお、図３〜図７は、図２の吸光度曲線において、吸光度の変化が認められた領域における部分拡大図である。
図２および図３〜図７に示した吸光度曲線から明らかなように、画分２（各図中１〜２ｍｉｎ）、画分７（各図中６〜７ｍｉｎ）、画分１７（各図中１６〜１７ｍｉｎ）、画分１８（各図中１７〜１８ｍｉｎ）、画分３２（各図中３１〜３２ｍｉｎ）、画分３３（各図中３２〜３３ｍｉｎ）、画分３４（各図中３３〜３４ｍｉｎ）、画分３５（各図中３４〜３５ｍｉｎ）、画分４８（各図中４７〜４８ｍｉｎ）および画分６２（各図中６１〜６２ｍｉｎ）において、５６５ｎｍおよび６２０ｎｍの吸光度曲線のうちの少なくとも一方に吸光度の変化が認められた。
このように吸光度の変化が認められた各画分と、試料液（Ｓａｍｐｌｅ）とについて、図８に、それぞれの色を確認するための写真を示す。
また、図９〜図２０に、図８に示す試料液および各画分の波長３００〜７００ｎｍにおける吸光度曲線を示す。
さらに、図２１に、試料液（Ｓａｍｐｌｅ）、および、前記−５−の工程で分画した画分（フラクション）７（Ｆ７）、１７（Ｆ１７）、３２（Ｆ３２）、３３（Ｆ３３）、３４（Ｆ３４）、３５（Ｆ３５）、４８（Ｆ４８）に、５０ｗｔ％の硫酸アンモニウム水溶液を添加した後の結晶の写真を示す。
図８に示すように、Ｆ２、Ｆ７、Ｆ１７およびＦ１８は、赤色を呈し、Ｆ３２は、青色が若干含まれるようになり、Ｆ３３、Ｆ３４、Ｆ３５およびＦ４８は、青紫色を呈し、Ｆ６２は、赤色を呈する結果であった。
また、図９〜図２０に示すように、Ｆ２、Ｆ７、Ｆ１７、Ｆ１８およびＦ３２では、４９５ｎｍ付近および５６５ｎｍ付近にピークが確認され、Ｆ３３、Ｆ３４およびＦ３５では、６２０ｎｍ付近にピークが確認された。また、Ｆ４８では、６５０ｎｍ付近のピークがメインピークとなり、Ｆ６２では、４９５ｎｍ付近のピークがメインピークとなった。
ここで、４９５ｎｍ付近（第２ピーク）および５６５ｎｍ付近（メインピーク）に吸収ピークを有するフィコビリン系色素は、赤色を呈するＲ−フィコエリスリンである。また、６２０ｎｍ付近に吸収ピークを有するフィコビリン系色素は、青色を呈するフィコシアニンである。６５０ｎｍ付近にメインピークを有するフィコビリン系色素は、青色を呈するアロフィコシアニンである。さらに、４９５ｎｍ付近にメインピークを有するフィコビリン系色素は、赤色を呈するＹ−フィコエリスリンである。
したがって、図８および図９〜図２０の結果から、１ｍＭおよび５ｍＭのリン酸緩衝液（第１の溶出用リン酸系緩衝液）を吸着装置に供給している際に流出した流出液からは、Ｒ−フィコエリスリン（Ｆ２、Ｆ７、Ｆ１７およびＦ１８）を回収することができ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（第２の溶出用リン酸系緩衝液）を吸着装置に供給している際に流出した流出液からは、まず、Ｒ−フィコエリスリン（Ｆ３２）を、その後に、フィコシアニン（Ｆ３３、Ｆ３４およびＦ３５）を回収することができ、１００ｍＭのリン酸緩衝液（第３の溶出用リン酸系緩衝液）を吸着装置に供給している際に流出した流出液からは、アロフィコシアニン（Ｆ４８）を回収することができ、５００ｍＭのリン酸緩衝液（第４の溶出用リン酸系緩衝液）を吸着装置に供給している際に流出した流出液からは、Ｙ−フィコエリスリン（Ｆ６２）を回収することができることが判った。
また、これに対応して、図２１に示すように、絶対量が少ないために不明確な写真もあるが、各フィコビリン系色素を純粋な結晶として得ることができた。
（実施例２）
吸着装置のサイズを大きく（スケールアップ）した以外は、前記実施例１と同様にして、フィコビリン系色素の分離を行った。
吸着装置のサイズを大きく（スケールアップ）した以外は、前記実施例１と同様にして、フィコビリン系色素の分離を行った。
その結果、前記実施例１と同様に、フィコビリン系色素の分離を行うことができた。
なお、実施例２で用いた吸着装置には、Ｂｉｏ−ｒａｄ ｇｅｌｔｅｃ カラム（直径２０ｃｍ×長さ１０ｃｍ）、充填剤には、ＣＨＴ ｔｙｐｅ−２（平均粒径６０μｍ）を用いた。
なお、実施例２で用いた吸着装置には、Ｂｉｏ−ｒａｄ ｇｅｌｔｅｃ カラム（直径２０ｃｍ×長さ１０ｃｍ）、充填剤には、ＣＨＴ ｔｙｐｅ−２（平均粒径６０μｍ）を用いた。
また、実施例１および実施例２よりも、それぞれ、カラム長が長いものを用いた以外は前記実施例１および実施例２と同様にした場合では、５０ｍＭのリン酸緩衝液（第２の溶出用リン酸系緩衝液）中において、Ｒ−フィコエリスリンとフィコシアニンとがより明確に分離される傾向を示した。
１ 吸着装置
２ カラム
２０ 吸着剤充填空間
２１ カラム本体
２２、２３ キャップ
２４ 流入管
２５ 流出管
３ 吸着剤
４、５ フィルタ部材
２ カラム
２０ 吸着剤充填空間
２１ カラム本体
２２、２３ キャップ
２４ 流入管
２５ 流出管
３ 吸着剤
４、５ フィルタ部材
Claims (10)
- 複数種のフィコビリン系色素を含有する試料中から、少なくとも１種のフィコビリン系色素を分離する分離方法であって、
前記複数種のフィコビリン系色素を含有する試料と、リン酸系緩衝液とを混合して試料液を調製する調製工程と、
少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された充填剤を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる装置内に、前記試料液を供給する供給工程と、
前記装置内に、前記フィコビリン系色素を溶出させるための溶出用リン酸系緩衝液を供給して、前記装置内から流出する流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記フィコビリン系色素を分離する分画工程と、
前記流出液に結晶化剤を添加して、前記フィコビリン系色素を結晶化させる結晶化工程とを有し、
前記分画工程において、前記溶出用リン酸系緩衝液の塩濃度を連続的または段階的に変化させることを特徴とする分離方法。 - 前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分として構成されている請求項１に記載の分離方法。
- 前記複数種のフィコビリン系色素は、Ｒ−フィコエリスリンを含み、
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給し、
該第１の溶出用リン酸系緩衝液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収する請求項２に記載の分離方法。 - 前記複数種のフィコビリン系色素は、Ｒ−フィコエリスリンおよびフィコシアニンを含み、
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５ｍＭ以上７５ｍＭ未満である第２の溶出用リン酸系緩衝液とを、段階的に前記装置内に供給し、
前記第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収し、前記第２の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンおよび前記フィコシアニンをこの順で回収する請求項２に記載の分離方法。 - 前記複数種のフィコビリン系色素は、Ｒ−フィコエリスリン、フィコシアニンおよびアロフィコシアニンを含み、
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５ｍＭ以上７５ｍＭ未満である第２の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が７５ｍＭ以上２５０ｍＭ未満である第３の溶出用リン酸系緩衝液とを、段階的に前記装置内に供給し、
前記第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収し、前記第２の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンおよび前記フィコシアニンをこの順で回収し、前記第３の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記アロフィコシアニンを回収する請求項２に記載の分離方法。 - 前記複数種のフィコビリン系色素は、Ｒ−フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンおよびＹ−フィコエリスリンを含み、
前記分画工程において、塩濃度が１ｍＭ以上２５ｍＭ未満である第１の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５ｍＭ以上７５ｍＭ未満である第２の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が７５ｍＭ以上２５０ｍＭ未満である第３の溶出用リン酸系緩衝液と、塩濃度が２５０ｍＭ以上である第４の溶出用リン酸系緩衝液とを、段階的に前記装置内に供給し、
前記第１の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンを回収し、前記第２の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｒ−フィコエリスリンおよび前記フィコシアニンをこの順で回収し、前記第３の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記アロフィコシアニンを回収し、前記第４の溶出用リン酸系緩衝液を前記装置内に供給している際に、前記装置内から流出する流出液中に、前記Ｙ−フィコエリスリンを回収する請求項２に記載の分離方法。 - 前記調製工程において、前記複数種のフィコビリン系色素を含む試料は、主として紅藻類、藍藻類およびクリプト藻類のうちの少なくとも１種を含む請求項１ないし６のいずれかに記載の分離方法。
- 前記分画工程において、前記溶出用リン酸系緩衝液のｐＨは、６〜８である請求項１ないし７のいずれかに記載の分離方法。
- 前記分画工程において、前記溶出用リン酸系緩衝液の温度は、３０〜５０℃である請求項１ないし８のいずれかに記載の分離方法。
- 前記結晶化剤は、硫酸アンモニウムを主成分として構成されている請求項１ないし９のいずれかに記載の分離方法。
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