JP2009029731A

JP2009029731A - 膵癌の新規腫瘍マーカー

Info

Publication number: JP2009029731A
Application number: JP2007193328A
Authority: JP
Inventors: Masaya Ono; 野雅哉尾; Tetsuji Yamada; 田哲司山; Akio Hirohashi; 橋説雄廣
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2007-07-25
Filing date: 2007-07-25
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2027-07-25
Also published as: US20110112278A1; EP2182061A4; US8017732B2; JP5140809B2; EP2182061A1; WO2009014160A1; EP2182061B1; ATE536407T1

Abstract

【課題】膵癌の腫瘍マーカーとして有用な修飾α−フィブリノゲンタンパク質およびその断片の提供。
【解決手段】酸化されたアミノ酸残基を含む修飾α−フィブリノゲンタンパク質または同アミノ酸残基を含むその断片であって、酸化されたアミノ酸残基が、特定のアミノ酸配列中の特定のプロリン残基、および別の特定のアミノ酸配列中の特定のプロリン残基からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基である、修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。
【選択図】なし

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は、膵癌の診断において腫瘍マーカーとして用いることのできる新規タンパク質およびその断片、ならびにこれを利用した膵癌の診断法に関する。

背景技術
膵癌は膵臓から発生する癌であり、その９０％以上は、外分泌に関係する細胞、特に膵液を運ぶ膵管の細胞から発生する膵管癌であることが知られている。膵臓は、胃、十二指腸、脾臓、小腸、大腸、肝臓、胆嚢などの多くの臓器に囲まれているため、膵癌はその発見が非常に困難である。他方で、膵癌は、初期の段階から他の臓器に拡がりやすく、転移を起こしやすいという性質を有する。よって、膵癌の治療には、その早期発見が不可欠である。

一般に、癌の早期発見には、血液検査による診断を可能とする腫瘍マーカーが有用である。膵癌の腫瘍マーカーとしては、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、Ｄｕｐａｎ−２等が知られている。しかし、これらの腫瘍マーカーを用いても膵癌の早期発見は困難であることが多い。よって、膵癌の新たな腫瘍マーカーの開発が望まれている。

フィブリノゲンは血液によって運ばれる糖タンパク質であり、３つの異なるポリペプチド鎖からなっている。血管傷害が生じると、フィブリノゲンはトロンビンにより開裂され、血餅の主成分であるフィブリンを形成する。また、フィブリノゲンおよびフィブリンの様々な開裂産物は、細胞接着および細胞分散に関与し、血管収縮活性および走化活性を示し、さらには幾つかの細胞型に対する分裂促進因子として働くことが知られている。さらに、フィブリノゲンの血漿濃度は、冠状動脈疾患のリスクに関与することが知られている（非特許文献１：J. Thromb. Haemost. 4 (10), 2204-2209, 2006）。また、フィブリノゲンのα鎖（α−フィブリノゲン）の遺伝子における突然変異は、異常フィブリノゲン血症、低フィブリノゲン血症、無フィブリノゲン血症、腎アミロイドーシスなどの疾患に関与することが知られている（非特許文献２：Thromb. Haemost. 96 (2), 231-232, 2006；非特許文献３：Blood 80 (8), 1972-1979, 1992）。

J. Thromb. Haemost. 4 (10), 2204-2209, 2006 Thromb. Haemost. 96 (2), 231-232, 2006 Blood 80 (8), 1972-1979, 1992

発明の概要

本発明者らは、膵癌患者からの血漿サンプルにおいて、特定のアミノ酸残基が酸化された新規なα−フィブリノゲンタンパク質を検出した。そして、このタンパク質の濃度が膵癌患者と健常者との間で有意な差を示し、よって、このタンパク質が膵癌の腫瘍マーカーとして有用であることを見出した。本発明は、これら知見に基づくものである。

従って、本発明は、膵癌の腫瘍マーカーとして有用な新規タンパク質およびその断片を提供することを目的とする。

そして、本発明によるタンパク質およびその断片は、酸化されたアミノ酸残基を含む修飾α−フィブリノゲンタンパク質または同アミノ酸残基を含むその断片であって、酸化されたアミノ酸残基が、
（ａ）配列番号２中の５３０番目のプロリン残基に相当するプロリン残基、および
（ｂ）配列番号２中の５６５番目のプロリン残基に相当するプロリン残基
からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基である、修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片である。

本発明によれば、困難とされていた膵癌の早期発見が可能となり、また、そのための診断用試薬の開発が可能となる。

発明の具体的説明

本明細書において「α−フィブリノゲンタンパク質」とは、フィブリノゲンを構成する３種の鎖のうちのα鎖を意味する。α−フィブリノゲンタンパク質としては、様々な動物に由来するものが知られており、そのいずれかに限定されるものではないが、好ましくはヒト由来のα−フィブリノゲンタンパク質とされる。ヒトα−フィブリノゲンタンパク質としては、選択的スプライシングによる２つのアイソフォームが知られており、それぞれのアミノ酸配列は配列番号２（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＰ＿０６８６５７）および配列番号４（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＰ＿０００４９９）に示す通りである。これらのアミノ酸配列において、Ｎ末端の１９残基はシグナルペプチドである。

本発明によるタンパク質では、（ａ）配列番号２中の５３０番目のプロリン残基に相当するプロリン残基、および（ｂ）配列番号２中の５６５番目のプロリン残基に相当するプロリン残基のいずれか一方または両方が酸化されている。配列番号２以外の配列において酸化されるプロリン残基の位置は、配列番号２との配列比較などによって、当業者であれば容易に決定することが可能である。

酸化されたアミノ酸残基の具体的な構造は、生体内におけるタンパク質の部分的酸化について知られるいずれの構造であってもよい。このような構造の好ましい例としては、対応する天然のアミノ酸残基と比較して１個の酸素原子が付加されたものが挙げられ、より好ましくは、対応する天然のアミノ酸残基と比較して１個の水酸基が付加されたものとされる。

本発明によるタンパク質では、上記（ａ）および上記（ｂ）のいずれかのアミノ酸残基が酸化されていればよいが、好ましくはこれらの両方のアミノ酸残基が酸化されている。

本発明の好ましい実施態様によれば、α−フィブリノゲンタンパク質は配列番号２で表されるアミノ酸配列中の第２０〜６４４残基を含んでなるものとされ、同アミノ酸配列中の５３０番目のプロリン残基および５６５番目のプロリン残基のいずれか一方または両方が酸化されている。さらに好ましい実施態様によれば、５３０番目のプロリン残基および５６５番目のプロリン残基の両方が酸化されている。この実施態様では、α−フィブリノゲンタンパク質は配列番号２で表されるアミノ酸配列中の第１〜１９残基で表されるシグナルペプチドをさらに含んでいてもよい。

本発明の他の好ましい実施態様によれば、α−フィブリノゲンタンパク質は配列番号４で表されるアミノ酸配列中の第２０〜８６６残基を含んでなるものとされ、同アミノ酸配列中の５３０番目のプロリン残基および５６５番目のプロリン残基のいずれか一方または両方が酸化されている。さらに好ましい実施態様によれば、５３０番目のプロリン残基および５６５番目のプロリン残基の両方が酸化されている。この実施態様では、α−フィブリノゲンタンパク質は配列番号４で表されるアミノ酸配列中の第１〜１９残基で表されるシグナルペプチドをさらに含んでいてもよい。

本発明によるタンパク質は、タンパク質の製造法として知られる一般的な方法によって製造することができる。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列番号１（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＭ＿０２１８７１）に示され、配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列番号３（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＭ＿０００５０８）に示されている。当業者であれば、これらの配列を参照することにより適切な発現ベクターを構築し、適当な宿主細胞中で本発明によるタンパク質を製造することができる。特定のアミノ酸残基の酸化反応も、当技術分野において知られる一般的な方法によって行うことができる。あるいは、本発明によるタンパク質は、膵癌患者の血漿サンプルから単離することも可能である。

本発明はまた、上記タンパク質の断片をも包含する。このような断片は、上記（ａ）および上記（ｂ）のいずれか一方または両方の酸化されたアミノ酸残基を含む。本発明によるタンパク質断片は、膵癌の診断用試薬を開発する上で特に有用である。例えば、膵癌の診断用試薬としては本発明によるタンパク質に特異的に結合する試薬が考えられる。そのような試薬の開発に用いるためには、本発明によるタンパク質断片は、本発明によるタンパク質に特異的な特異的断片であることが好ましい。ここで「特異的」とは、本発明によるタンパク質の検出に用いられる反応系において、その断片の構造が本発明によるタンパク質中にのみ存在することを意味する。このような特異的断片の配列および構造は、当技術分野において利用可能なデータベースなどを用いて決定することができる。さらに、本発明によるタンパク質に特異的に結合する試薬としては、抗体、特にモノクローナル抗体が挙げられる。このような抗体の開発に用いるためには、本発明によるタンパク質断片は、抗体の製造に用いることのできる免疫原性断片であることが好ましい。本発明によるタンパク質断片は、完全長のタンパク質について上述した方法によって製造してもよいし、ペプチド合成法として一般的に知られる方法によって製造してもよい。

本発明によるタンパク質およびその断片は、膵癌の診断用試薬の開発に用いることができる。このような診断用試薬としては、本発明によるタンパク質またはその断片に特異的に結合するものが挙げられ、特に、ＥＬＩＳＡ等に用いられる特異的抗体とすることが好ましい。このような特異的抗体は、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、ＳｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ断片）、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）または抗体の最小認識単位としてもよい。

一つの実施態様によれば、前記特異的抗体は、モノクローナル抗体とすることができる。モノクローナル抗体は、当技術分野において知られる標準的な技術によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体の製造法として、”Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”,H.Zola(CRC Press,1988)および”Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications”,J.G.R.Hurrell(CRC Press,1982)に記載の方法が挙げられる。さらに、適切に作製された非ヒト抗体は、公知の手法により、例えばヒト抗体のフレームワーク中へマウス抗体のＣＤＲ領域を挿入することにより、「ヒト化」することもできる。このようにして作製されたモノクローナル抗体を用いることにより、サンプル中の本発明によるタンパク質を簡便かつ正確に検出することができ、これにより、膵癌の迅速な診断が可能となる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

例１：膵癌マーカーとしてのタンパク質の同定
膵臓癌患者４３例および健常者４３例からの血漿サンプルを、各症例について２０μｌ用い、コンカナバリンＡ（concanavalin A）に吸着する糖タンパク画分を抽出した。それぞれの糖タンパク画分について、複数サンプルのLC/MSデータの比較を可能とする2DICAL法（Ono et al., Mol. Cell Proteomics, 5, 1338, 2006)による解析を行った。修飾配列を有するペプチドに由来する３つのピークについて、膵癌患者と健常者とを比較した結果を図１に示す。

図１Ａは、保持時間（ＲＴ）８．３分におけるM/Z（質量電荷比）５５２の強度を比較した棒グラフである。図１Ｂは、保持時間（ＲＴ）８．３分におけるM/Z（質量電荷比）８２７の強度を比較した棒グラフである。図１Ｃは、保持時間（ＲＴ）２９．０分におけるM/Z（質量電荷比）１１４１の強度を比較した棒グラフである。それぞれのグラフの下に記載したＵ検定によるＰ値が示すように、これらのピークは膵臓癌患者と健常者との間で有意差を示した。

また、これらのピークによる判別率およびＲＯＣ曲線下面積は、M/Z 552、M/Z 827、M/Z 1141の順に、83％および0.85、83％および0.83、76％および0.82であったが、質量分析のばらつきが少ない同一時期に測定されたものでは、81％および0.83、89％および0.92、86％および0.91であった。

上記３つのピークについてタンデムマスデータを取り、蛋白質同定ソフト（マスコット）を用いて翻訳後修飾を含めたペプチド配列解析を行った。その結果、ＲＴ８．３分におけるM/Z 552およびM/Z 827はともにESSSHHPGIAEFPSR（配列番号５）の配列に由来することが分かった。また、ＲＴ２９．０分におけるM/Z 1141はTFPGFFSPMLGEFVSETESR（配列番号６）の配列に由来することが分かった。これらのアミノ酸配列はともにフィブリノゲン由来のものであった。また、これらのペプチドは予想配列に対して１６分子量重い翻訳後修飾を持つペプチドであった。

こうして同定された翻訳後修飾ペプチドに対応する未修飾のペプチドについて、上記と同様に、膵臓癌患者と健常者との間での発現の差を2DICAL法により比較した。その結果を図２に示す。

図２Ａは、保持時間（ＲＴ）８．５分におけるM/Z（質量電荷比）５４７の強度を比較した棒グラフである。図２Ｂは、保持時間（ＲＴ）８．５分におけるM/Z（質量電荷比）８１９の強度を比較した棒グラフである。図２Ｃは、保持時間（ＲＴ）３０．０分におけるM/Z（質量電荷比）１１３３の強度を比較した棒グラフである。これらの修飾の無いペプチドに由来するピークの強度は、膵臓癌患者と健常者との間で差を示さなかった。

次いで、同定された上記２つの修飾ペプチドの修飾形式を確定するために、精密質量分析器オービトラップ（サーモフィッシャー、San Jose、CA）を用いて解析した。

精密質量分析器オービトラップを用い、修飾を有するペプチド（827m/z、1141m/z）と修飾を有しないペプチド（819m/z、1133m/z）の質量数を小数点以下有効数字3桁まで測定したところ、両者の差が15.995Daであることから、酸素原子１個分の差であることを確定した（図３）。

修飾を有するペプチド（827m/z、1141m/z）と修飾を有しないペプチド（819m/z、1133m/z）に対して、タンデムマス測定を行った。その結果を図４に示す。図４によれば、両者のフラグメントで酸素原子１個分の差が認められるのが図中に示されるプロリンの部位であることが確認でき、よって、このプロリン残基が酸化されていることが証明された。

さらに、827m/zのペプチドが上記のプロリン残基において修飾されていることを裏付けるために、精密質量分析器オービトラップでタンデムマス測定を行った。その結果、15.995Daの差がある修飾を有するペプチド由来の171.0762ｍ/zと修飾を有さないペプチド由来の155.0808ｍ/ｚとは、それぞれ一義的にＣ_７Ｈ_１１Ｏ_３Ｎ_２およびＣ_７Ｈ_１１Ｏ_２Ｎ_２の化学構造式で表されることが証明された（図６）。このような構造式を取りうるペプチド配列はＰ（Ｏ）ＧとＰＧしかなく、従って、ESSSHHP*GIAEFPSRがP*の部位で酸化されていることが証明された。

図１Ａは、血漿サンプル中の糖タンパク画分のＬＣ／ＭＳデータのうち、修飾ペプチドに由来する、保持時間（ＲＴ）８．３分におけるM/Z（質量電荷比）５５２の強度を複数サンプル間で比較した棒グラフである。図１Ｂは、血漿サンプル中の糖タンパク画分のＬＣ／ＭＳデータのうち、修飾ペプチドに由来する、保持時間（ＲＴ）８．３分におけるM/Z（質量電荷比）８２７の強度を複数サンプル間で比較した棒グラフである。図１Ｃは、血漿サンプル中の糖タンパク画分のＬＣ／ＭＳデータのうち、修飾ペプチドに由来する、保持時間（ＲＴ）２９．０分におけるM/Z（質量電荷比）１１４１の強度を複数サンプル間で比較した棒グラフである。図２Ａは、血漿サンプル中の糖タンパク画分のＬＣ／ＭＳデータのうち、未修飾ペプチドに由来する、保持時間（ＲＴ）８．５分におけるM/Z（質量電荷比）５４７の強度を複数サンプル間で比較した棒グラフである。図２Ｂは、血漿サンプル中の糖タンパク画分のＬＣ／ＭＳデータのうち、未修飾ペプチドに由来する、保持時間（ＲＴ）８．５分におけるM/Z（質量電荷比）８１９の強度を複数サンプル間で比較した棒グラフである。図２Ｃは、血漿サンプル中の糖タンパク画分のＬＣ／ＭＳデータのうち、未修飾ペプチドに由来する、保持時間（ＲＴ）３０．０分におけるM/Z（質量電荷比）１１３３の強度を複数サンプル間で比較した棒グラフである。図３は、オービトラップにより、修飾を有するペプチド（827m/z、1141m/z）と修飾を有しないペプチド（819m/z、1133m/z）の質量数を小数点以下有効数字3桁まで測定した結果を示すマススペクトルである。図４は、修飾を有するペプチド（827m/z、1141m/z）と修飾を有しないペプチド（819m/z、1133m/z）に対してタンデムマス測定を行った結果を示すマススペクトルである。図５は、修飾を有するペプチド（827m/z）と修飾を有しないペプチド（819m/z）に対してオービトラップによるタンデムマス測定を行った結果を示すマススペクトルである。

Claims

酸化されたアミノ酸残基を含む修飾α−フィブリノゲンタンパク質または同アミノ酸残基を含むその断片であって、酸化されたアミノ酸残基が、
（ａ）配列番号２中の５３０番目のプロリン残基に相当するプロリン残基、および
（ｂ）配列番号２中の５６５番目のプロリン残基に相当するプロリン残基
からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基である、修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。
酸化されたアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸残基と比較して１個の酸素原子が付加されたものである、請求項１に記載の修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。
酸化されたアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸残基と比較して１個の水酸基が付加されたものである、請求項１に記載の修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。
前記（ａ）および前記（ｂ）の両方のアミノ酸残基が酸化されている、請求項１に記載の修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。
α−フィブリノゲンタンパク質が配列番号２で表されるアミノ酸配列中の第２０〜６４４残基を含んでなるものであり、同アミノ酸配列中の５３０番目のプロリン残基および５６５番目のプロリン残基のいずれか一方または両方が酸化されている、請求項１に記載の修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。
５３０番目のプロリン残基および５６５番目のプロリン残基の両方が酸化されている、請求項５に記載の修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。
α−フィブリノゲンタンパク質が配列番号４で表されるアミノ酸配列中の第２０〜８６６残基を含んでなるものであり、同アミノ酸配列中の５３０番目のプロリン残基および５６５番目のプロリン残基のいずれか一方または両方が酸化されている、請求項１に記載の修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。
５３０番目のプロリン残基および５６５番目のプロリン残基の両方が酸化されている、請求項７に記載の修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。
前記断片が特異的断片である、請求項１に記載の修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。
前記断片が、抗体の製造に用いることのできる免疫原性断片である、請求項１に記載の修飾α−フィブリノゲンタンパク質またはその断片。