JP2009020037A - メタボローム解析による同定方法、薬物代謝物の同定方法、およびこれらのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】メタボローム網羅的解析におけるメタボロームの効率的な同定方法ならびに特異的バイオマーカーのハイスループットスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】生体試料から生体物質および代謝物を含む分析用サンプルを得る工程、該分析用サンプルを高分解能質量分析装置で分析して、該質量分析データが、精密質量、保持時間、およびイオン強度を含む工程、該質量分析データにおいて、該分析用サンプルごとに該精密質量および該保持時間の少なくとも一方の昇順または降順に該イオン強度を並べ替えたデータを得る工程、該並べ替えたデータについて、該分析用サンプル間で比較して、該精密質量または該保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する工程、該一致した精密質量または該保持時間の少なくとも一方について、該精密質量および該保持時間に基づいて物質名を同定する工程を含む。
【選択図】図４

Description

本発明は、メタボローム網羅的解析におけるメタボロームの同定方法、薬物代謝物の同定方法、ならびに特異的バイオマーカーのハイスループットスクリーニング方法に関する。

創薬や医療診断の基礎研究としてゲノミクスやプロテオミクスがある。ゲノミクスは、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップなどの有効な分析ツールの開発およびこれらの実用化により、ヒト遺伝子が全て解明されるなどの成果を修めている。プロテオームの網羅的解析（プロテオミクス）も、蛋白質の構造および量の異常で起こる病気に対して、その蛋白質を特定し、診断方法、治療方法、および治療薬を開発するために盛んに行われている。さらに、代謝物総体（メタボローム）を解析するメタボロミクスも、医療診断、病因解析などに有用であるが、測定対象となる化学物質が多岐にわたるため、実用化が困難な状況にある。

現在のところ、メタボロミクスでは、マススペクトル比較により差を見い出すことによって、バイオマーカー探索解析、薬物代謝物探索解析などが行われている。いずれも創薬には重要であり、多くの医薬品メーカーにおいて研究されている。

マススペクトル比較法として、現状では、（ｉ）多変量解析（主成分解析：ＰＣＡ）による解析；（ii）フルスキャン比較解析；および（iii）ＭＳ^２スペクトルのコサイン相関解析（ＰＬＳ）が開発されている（例えば、非特許文献１〜３を参照のこと）。比較法（ｉ）および（ii）は、フルスキャン（ＭＳスペクトル）を比較するものであり、データ間の差を見出して解析を行う。比較法（ｉ）は群比較が可能であり、すなわち、２つ以上のデータを使用して解析できる。比較法（ii）は２つのデータを比較できるが、多数のデータを一度に処理できないため群比較ができない。したがって、薬物代謝物探索解析に用いられることが多い。比較法（iii）は、ＭＳ^２スペクトルを比較して類似するものを抽出する手法であり、例えば、標準物質のデータと類似するデータを未知のデータから抽出することができる。「検索」的な概念を比較法に応用した手法であり、主に薬物代謝物探索解析に用いられる。

より具体的には、比較法（ｉ）のＰＣＡ解析は、３次元空間に「ｍ／ｚ」、「保持時間」、および「イオン強度」をそれぞれｘ、ｙ、およびｚとしてプロットし、相関性が強い軸を２本設定して２次元表示して解析を行っている。

比較法（ii）のフルスキャン比較には、差スペクトルを使用する方法と、データを画像化して比較する方法がある。差スペクトルを使用する方法として、代謝物検索ソフトウエア「Ｍｅｔｗｏｒｋｓ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）などが市販されている。画像化して比較する方法には、DeCyder MS（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、Progenesis LC-MS（PerkinElmer社）などが市販されている。一方、比較法（ii）の画像化して比較する方法は、ｍ／ｚ−保持時間の平面に、イオン強度（厳密にはイオン強度から算出したピーク面積または体積値）を色の濃淡で表示する方法であり、マススペクトルデータ比較は、同じ座標のイオン強度を比較して行う。この場合、専用のソフトウエアが必要であるが、直接的にデータを比較できる。
及川彰ら、生物工学会誌、2006年、第6号、pp.219-222 福崎英一郎、生物工学会誌、2006年、第6号、pp.231-234 山口真一ら、J. Mass Spectrom. Soc. Jpn.、2007年4月、第55巻2号、pp.83-89

上述のように、メタボロミクスでは、測定される化学物質の種類が非常に多いこと、そのため測定結果から得られるデータが膨大になること、さらに、プロテオミクスとは異なり有効なデータベースが存在しないことなどにより、効率的なメタボロームの解析は実現されていない。そこで、本発明は、メタボローム網羅的解析におけるメタボロームの効率的な同定方法ならびに特異的バイオマーカーのハイスループットスクリーニング方法を提供することを目的とする。

本発明の方法は、上記比較法（ii）の画像化して比較する方法と類似の概念である。しかし、ｍ／ｚ−保持時間を平面に記載するのではなく、１次元的に数値としてリスト形式で記載できることに着目して、複数のＳａｍｐｌｅのイオン強度を平面に並べて記載することによって、群比較ができるように、すなわち、２つ以上のデータを一度に解析できるように工夫されている。また、発明の方法ではデータ間の差を見出すことだけでなく、類似データを見出すことも可能である。なお、本発明の方法は、統計解析を使用しない点で比較法（ｉ）とは異なり、データ表示法および画像解析を使用しない点で比較法（ii）とも異なる。また、類似を見出すことが主たる目的である比較法（iii）とは概念的にも異なり、主に使用するデータがＭＳスペクトルである点でも異なる。

本発明は、メタボローム解析における生体物質および代謝物の同定方法を提供し、該方法は、
（ａ）生体試料から生体物質および代謝物を含む分析用サンプルを得る工程；
（ｂ）該分析用サンプルを高分解能質量分析装置で分析して、該分析用サンプルごとに質量分析データを得る工程であって、該質量分析データが、精密質量、保持時間、およびイオン強度を含む、工程；
（ｃ）該質量分析データにおいて、該分析用サンプルごとに該精密質量および該保持時間の少なくとも一方の昇順または降順に該イオン強度を並べ替えたデータを得る工程、または該分析用サンプルごとに該イオン強度の降順に該精密質量および該保持時間の少なくとも一方を並べ替えたデータを得る工程；
（ｄ）該並べ替えたデータについて、該分析用サンプル間で比較して、該精密質量または該保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する工程；および
（ｅ）該一致した精密質量または該保持時間の少なくとも一方について、該精密質量および該保持時間に基づいて物質名を同定する工程；
を含む。

１つの実施態様では、上記同定方法の上記工程（ｃ）において、上記精密質量および上記保持時間の少なくとも一方は、該精密質量と該保持時間とを組み合わせて作成されたｃｏｄｅである。

本発明はまた、メタボローム解析における特異的バイオマーカーのスクリーニング方法を提供し、該方法は、
（ａ）特異群および対照群の生体試料から生体物質および代謝物を含む分析用サンプルを得る工程；
（ｂ）該分析用サンプルを高分解能質量分析装置で分析して、該分析用サンプルごとに質量分析データを得る工程であって、該質量分析データが、精密質量、保持時間、およびイオン強度を含む、工程；
（ｃ）該質量分析データにおいて、該分析用サンプルごとに該精密質量および該保持時間の少なくとも一方の昇順または降順に該イオン強度を並べ替えたデータを得る工程、または該分析用サンプルごとに該イオン強度の降順に該精密質量および該保持時間の少なくとも一方を並べ替えたデータを得る工程；
（ｄ）該並べ替えたデータについて、該特異群および該対照群の各群内において該分析用サンプル間で比較して、該精密質量または該保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する工程；
（ｅ）該一致した該精密質量または該保持時間の少なくとも一方について、該特異群と該対照群との間で該精密質量または該保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する工程；および
（ｆ）該群間の不一致精密質量または保持時間の少なくとも一方について該精密質量および該保持時間に基づいて物質名を同定する工程；または、該群間の一致精密質量または保持時間の少なくとも一方のイオン強度差を算出して差の大きいものから降順に並べ、差の大きい精密質量または保持時間の少なくとも一方について、該精密質量および該保持時間に基づいて物質名を同定する工程；
を含む。

ある実施態様では、上記スクリーニング方法の上記工程（ｃ）において、上記精密質量および上記保持時間の少なくとも一方は、該精密質量と該保持時間とを組み合わせて作成されたｃｏｄｅである。

本発明によれば、多種類の生体成分および代謝物を含む試料を包括的に分析した際の膨大なデータを解析するための手法が提供され、生体成分および代謝物の候補を効率よく絞り込むことができる。本発明の方法では、従来のメタボローム解析と比較して、スクリーニングの結果の再現性および正確性が向上している。また、本発明の方法は、比較的低コストかつハイスループットでの、生体成分および代謝物の同定および特異的バイオマーカーのスクリーニングが可能である。

本発明のメタボローム解析における生体物質および代謝物の同定方法は、生体成分および代謝物の候補を効率よく絞り込むことができる。この方法は、以下の工程：
（ａ）生体試料から生体物質および代謝物を含む分析用サンプルを得る工程；
（ｂ）該分析用サンプルを高分解能質量分析装置で分析して、該分析用サンプルごとに質量分析データを得る工程であって、該質量分析データが、精密質量、保持時間、およびイオン強度を含む、工程；
（ｃ）該質量分析データにおいて、該分析用サンプルごとに該精密質量および該保持時間の少なくとも一方の昇順または降順に該イオン強度を並べ替えたデータを得る工程、または該分析用サンプルごとに該イオン強度の降順に該精密質量および該保持時間の少なくとも一方を並べ替えたデータを得る工程；
（ｄ）該並べ替えたデータについて、該分析用サンプル間で比較して、該精密質量または該保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する工程；および
（ｅ）該一致した精密質量または該保持時間の少なくとも一方について、該精密質量および該保持時間に基づいて物質名を同定する工程；
を含む。

また、本発明のメタボローム解析における特異的バイオマーカーのスクリーニング方法は、種々の要因（例えば、病態、薬物への曝露など）によって代謝が特異的に変動する生体成分を特定するために特に有用な方法である。この方法は、上記生体物質および代謝物の同定方法とは、
工程（ａ）で、特異群および対照群の生体試料から生体物質および代謝物を含む分析用サンプルを得る点；
工程（ｄ）において、該並べ替えたデータについて、該特異群および該対照群の各群内において該分析用サンプル間で比較して、該精密質量または該保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する点；
工程（ｅ）において、該一致した該精密質量または該保持時間の少なくとも一方について、該特異群と該対照群との間で該精密質量または該保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する点；および
工程（ｆ）該群間の不一致精密質量または保持時間の少なくとも一方について該精密質量および該保持時間に基づいて物質名を同定する工程；または、該群間の一致精密質量または保持時間の少なくとも一方のイオン強度差を算出して差の大きいものから降順に並べ、差の大きい精密質量または保持時間の少なくとも一方について、該精密質量および該保持時間に基づいて物質名を同定する工程、をさらに含む点が異なる。

以下、本発明のこれらの方法を工程の順に詳細に説明する。

工程（ａ）：
本発明の方法では、まず、工程（ａ）において、生体試料から生体物質および代謝物を含む分析用サンプルを得る。

本発明において、「生体試料」とは、メタボローム解析対象となる生体由来成分をいう。例えば、血液（血清、血漿）、尿、体液、培養液、細胞または組織抽出物などが挙げられる。「細胞または組織」とは、単離された細胞または組織をいう。例えば、培養細胞、バイオプシーにより体内から取り出された組織または細胞などが挙げられる。

このような生体試料は、質量分析装置に応じて、適切に前処理されて分析用サンプルが調製される。前処理としては、濾過、抽出、誘導体化、これらの組み合わせなどが挙げられる。誘導体化は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）と組み合わせた質量分析装置を用いる場合に必要な場合がある。あるいは、組織または細胞を、適切な緩衝液中で、ホモジナイザーなどの当業者が通常用いる手段を用いて破砕した後、上清あるいは溶媒抽出物を分析用サンプルとしてもよい。

本発明において、「特異群」とは、スクリーニングの対象となる群をいい、種々の要因（例えば、病態、薬物への曝露など）によって代謝が特異的に変動する生体成分の存在が予想される群をいう。例えば、特定の病態群；化学物質、光、温度などの特定の条件への曝露群が挙げられる。「対照群」とは、上記特異群と比較するための群であり、例えば、特定の病態ではない群（例えば、正常群）；種々の条件の曝露などを受けていない群が挙げられる。また、本発明において、特異群において、種々の要因（例えば、病態、薬物への曝露など）によって代謝が特異的に変動する生体成分を、「特異的バイオマーカー」という。ここで、変動とは、増加および減少の両方を意図する。

工程（ａ）において、試料のｎ数は、特に限定されないが、試料の個体差の影響を除くことができる点で、ｎ数が多い方が好ましい。

工程（ｂ）：
工程（ｂ）では、上記分析用サンプルを高分解能質量分析装置で分析して、該分析用サンプルごとに質量分析データを得る。

「質量分析」（ＭＳ）とは、分析する試料をイオン化させて導入し、電気力や磁気力により質量ごとの差をつくり、イオンの質量を分析することである。ＭＳの測定原理としては、イオントラップ型ＭＳ法、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ／ＭＳ）法、イオンスキャン法、Ｑ−ＴＯＦ型ＭＳ法などが挙げられ、それぞれの原理に基づく質量分析計が存在する。本発明の方法においては、１方法だけ（すなわち、１つの質量分析計のみ）で分析してもよく、あるいは複数の質量分析計を連結させて分析（以下ＭＳ／ＭＳ解析）してもよい。

「高分解能質量分析」とは、小数点以下４桁以上の精度で測定可能な質量分析をいう。例えば、保持時間が同一の物質について、精密質量ｍ／ｚの小数点以下３桁が一致すれば、同一組成の物質である確率は非常に高い。

Ｒａｗデータには、ノイズデータと重複するデータ（重複データ）とがあり、これらは事前に排除することが好ましい。質量分析により得られるＲａｗデータは、質量分析から出力される形式のデータであり、質量分析計のメーカーごとに形式が異なる。また、一般的には、そのＲａｗデータのファイル構造などは開示されていない。本発明の方法の実現には、Ｒａｗデータを、一般的にアクセス可能である形式（例えば、テキスト形式）に抽出するためのツールを用いることが必要である。このようなツールの作成は、質量分析計のメーカーの協力を得て行うことができる。本発明においては、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社の協力により開発された、Ｒａｗデータを一般的にアクセスすることが可能なテキスト形式（厳密にはｃｓｖ形式）に抽出するツールであるRaw Filtering Writerを使用した。それにより、Ｒａｗデータへのアクセスが可能である。Raw Filtering Writerで出力されるデータは、例えば、図１に示すとおりである。

質量分析データは、「ｍ／ｚ」、「保持時間（ＲＴ）」および「イオン強度」の３つの要素からなる。Raw Filtering Writerで出力されるデータには、それらに加えて、Scan No.が記載される。Scan No.とは、そのスペクトルが、測定開始から何番目に取得されたスペクトルであるかを表す数値である。

工程（ｃ）：
工程（ｃ）では、該質量分析データにおいて、該分析用サンプルごとに該精密質量および該保持時間の少なくとも一方の昇順または降順に該イオン強度を並べ替えたデータを得るか、あるいは該分析用サンプルごとに該イオン強度の降順に該精密質量および該保持時間の少なくとも一方を並べ替えたデータを得る。

マススペクトルデータの比較において重要となるのは、「ｍ／ｚ」、「保持時間」および「イオン強度」の３次元の要素をできるだけ情報量を落とさずに、２次元の要素で表示することである。例えば、分析用サンプルごとに、まず「ｍ／ｚ」および「保持時間」のいずれか一方の昇順または降順にイオン強度を並べ替えて、他方の要素を考慮しない２次現データを得ることができる。この場合は、以下の工程（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の後、「ｍ／ｚ」および「保持時間」のいずれか一方の考慮されていないデータを照合することになる。

Ｒａｗデータは、非常に膨大であるが、その多くが不要なデータである。不要なデータとは、主にノイズデータおよび重複データである。

ノイズデータは、機械的にそれを判断することは困難であり、予備実験などを行うことによってノイズデータを排除することが好ましい。例えば、Raw Filtering Writerで閾値を設定すれば、ノイズデータの一部は排除できる。

重複データとは、全く同じ化合物のデータを指す。例えば、ＬＴＱ ＦＴ ＭＳの場合、１分間に１００近くのスペクトルを測定することができるが、その１分間に溶出する化合物の数は、さほど多くはない。すなわち、１００のうちのいくつかは同じ化合物を測定していることになる。そこで、重複データを排除することが必要となる。これも非常に労力を要する作業である。しかし、プログラムを作成して、このような重複データを排除することができる。

あるいは、例えば、「ｍ／ｚ」と「保持時間」とを組み合わせた数字を新しく作成することにより、３次元データを２次元で表記することができる。例えば、８桁の数字（ｃｏｄｅ）を設定し、ｍ／ｚを最初の６桁で表示し、保持時間を後の２桁で表示する。この８桁の数字を１列目に表示するようにデータを作成する（図２）。具体的には、保持時間１５分のｍ／ｚ１２３４．５６の場合は、ｃｏｄｅは１２３４５６１５となる。この作成は、非常に労力を要するが、例えば、以下の示すデータ選択と同時にマクロで作成することができる（図３参照）。ｃｏｄｅは、ｍ／ｚと保持時間とを組み合わせたものであり、重複しない方が望ましい。ｃｏｄｅが重複しても、解析が煩雑になるだけであり、エラーは出ない。

得られたｃｏｄｅのすべてについて、分析用サンプルごとにイオン強度を並べ替えたデータを得るか、または分析用サンプルごとにイオン強度の降順に該ｃｏｄｅを並べ替えたデータを得る。

より具体的には、データ作成が終了した各マススペクトルデータについて、ｃｏｄｅごとにイオン強度を記載する必要がある。例えば、１列目にｃｏｄｅ、２列目にＳａｍｐｌｅ１のイオン強度、３列目にＳａｍｐｌｅ２のイオン強度、以降、各列に各Ｓａｍｐｌｅのイオン強度を並べる（図４）。

ｃｏｄｅごとに各Ｓａｍｐｌｅのデータのイオン強度を整理するために、本発明においては、プログラムを用いてデータを並べた。このソフトウエアは、結果が出るまでの時間が短く、取り扱い可能なデータ数が多いという利点がある。表示される結果は、同じＳａｍｐｌｅのイオン強度が縦に並び、すぐ横に別のＳａｍｐｌｅのデータが並ぶことから、画像比較ソフトの結果と比較しても、視覚的に比較しやすい。

工程（ｄ）：
工程（ｄ）では、並べ替えたデータについて、分析用サンプル間で比較して、精密質量または保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する。なお、特異的バイオマーカーのスクリーニングの場合は、特異群および対照群の各群内において分析用サンプル間で比較して、精密質量または保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する。

解析結果が表形式で表示されるため、Microsoft Excel（登録商標）などの表計算ソフトで表示し、横の列に解析用の関数を入力することにより、より詳細な比較解析を行うことができる。

例えば、図４に示すように、精密質量および保持時間から作成されたｃｏｄｅごとにＳａｍｐｌｅのデータ数を数え、その数を解析関数として表示する列を設定すれば、Ｓａｍｐｌｅに共通のｃｏｄｅが明確にわかる。

工程（ｅ）：
工程（ｅ）では、一致した精密質量または保持時間の少なくとも一方について、精密質量および保持時間に基づいて物質名を同定する。

Raw Filtering Writerには、ＭＳ^２スペクトルを測定したイオンのリストを作成する機能がある。ＭＳ^２スペクトルが測定されたイオンとは、測定の設定にも依存するが、イオン強度が比較的高く、ノイズとは考えにくいイオンであることが多いため、このイオンを対象として解析を行うことは、効率的である。

元のデータからＭＳ^２スペクトルが測定されたイオンを選択するには、ＭＳ^２スペクトルを測定したイオンのリストと、Microsoft Access（登録商標）を用いて比較すればよい。しかし、この場合は、例えば、図５に示すように、上で例示したｃｏｄｅとは別のｃｏｄｅを設定する必要がある。

さらに、図５のＭＳ^２スペクトルを測定したイオンのリストの代わりに、種々の化合物についてのデータベースのリストを利用することも可能である。この場合、データベース検索を行うことができる。

なお、特異的バイオマーカーのスクリーニングの場合は、この工程（ｅ）において、一致した精密質量または保持時間について、特異群と対照群との群間で精密質量または保持時間の一致または不一致を検索する。この検索は、上記工程（ｄ）と同様に行われる。

工程（ｆ）：
工程（ｆ）では、群間の不一致精密質量または保持時間の少なくとも一方について精密質量および保持時間に基づいて物質名を同定するか、または、群間の一致精密質量または保持時間の少なくとも一方のイオン強度差を算出して差の大きいものから降順に並べ、差の大きい精密質量または保持時間の少なくとも一方について、精密質量および保持時間に基づいて物質名を同定する。

例えば、Ｓａｍｐｌｅ１〜３のイオン強度の平均値とＳａｍｐｌｅ４〜６のイオン強度の平均値との差を解析関数として表示するように設定すると、群間でのイオン強度の差が大きな精密質量または保持時間を容易に選定できる。

このように、本発明の方法では、複雑な統計学的処理を行わずに、単純比較によって、多種類の生体成分および代謝物を含む試料を包括的に分析した際の膨大なデータを解析することができる。本発明の方法では、単純比較にもかかわらず、スクリーニングの結果の再現性および正確性が良好である。また、本発明の方法では、比較的低コストかつハイスループットでの、生体成分および代謝物の同定および特異的バイオマーカーのスクリーニングが可能であり、生体成分および代謝物の候補を効率よく絞り込むことができる。

以下の実施例において、ミクロソーム試料または尿試料の質量分析には、ＬＣ／ＥＳＩ／ＬＴＱ ＦＴ ＭＳ高分解能質量分析装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いた。

（実施例１：ミクロソームによる薬物メタボロームの検索）
肝ミクロソームにおける主な代謝反応は、第１相（酸化、還元、脱メチル化など）および第２相（グルコース抱合、グルクロン酸抱合など）である。本実施例では、抗うつ薬であるイミプラミン（Ｃ_１９Ｈ_２４Ｎ_２；精密質量ｍ／ｚ：２８１．２０１２３）をモデル薬物として用いた。肝ミクロソームによるイミプラミンの代謝物としては、４４種の組成式が予想される。本実施例においては、主な代謝物である１０種（本実施例ではＭ１〜Ｍ１０と記載する）について、代謝物を正確に検索できるかどうかについて、従来の解析ソフトと本発明の方法とによる解析結果を比較した。

ＮＡＤＰＨ再生系を含む８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にラット肝ミクロソーム（XenoTech）を終濃度１ｍｇ／ｍLとなるように加え、３７℃にて５分間プレインキュベートした。次いで、塩酸イミプラミンを、０、１０、または１００μＭになるように加え、３７℃にて１５または６０分間インキュベートした。各反応条件について、６サンプルずつ行った。アセトニトリルの添加によって反応を停止し、遠心分離によって除タンパクして、上清をサンプルとして高速液体クロマトグラフ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）に供した。測定条件は、以下のとおりである。

（１）高速液体クロマトグラフの条件
カラム：Xterra MS C18、２．１×１５０ｍｍ、５μｍ（Waters）
移動相：溶媒Ａ＝水／酢酸（１０００：１，v/v）
溶媒Ｂ＝アセトニトリル／酢酸（１０００：１，v/v）
グラジエント：０〜２０分でＡ／Ｂ＝９０／１０（v/v）→０／１００（v/v）；２０〜２５分でＡ／Ｂ＝０／１００（v/v）；２５〜２６分でＡ／Ｂ＝０／１００（v/v）→９０／１０（v/v）；２６〜４０分でＡ／Ｂ＝９０／１０（v/v）
流速：０．２ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
オートサンプラー温度：４℃
（２）質量分析の条件
イオン化：ＥＳＩ
測定モード：ポジティブ

なお、各代謝条件（濃度および反応時間）で生じる代謝物Ｍ１〜Ｍ１０については、これらの代謝物のｍ／ｚおよび保持時間に基づいてマスクロマトグラムを比較することによって、以下の表１に白丸で示すように、条件により生じる代謝物が異なることがわかった。

得られたマススペクトルＲａｗデータについて、まず、質量分析装置の解析部に組込み可能な市販の２種類の代謝物検索ソフトウエアMetWorks（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて解析を行った。その結果、表２に黒丸で示す代謝物が検出された。同代謝物検索ソフトウエアの検索設定を変更し、１０μＭ−１５分の試料で代謝物Ｍ６が検出される条件で検索したところ、３００個以上の代謝物候補ピークがヒットし、代謝物を絞り込むことができなかった。

次に、得られたＲａｗデータをテキスト形式（ｃｓｖ形式）に変換した。必要に応じて、変換したデータをデータベースソフトまたは表計算ソフトに取り込み、以下のような処理を行った。（１）保持時間およびｍ／ｚについて、四捨五入または切捨てなどを行って、数値の画一化を行った。（２）ピークを代表する数値、例えば、ｍ／ｚの値やｍ／ｚと保持時間とを組み合わせた数値を用いた。この「ピークを代表する数値」を「ｃｏｄｅ」と称する。（３）同じｃｏｄｅが重複する場合は適宜削除した。この（１）〜（３）の工程はプログラムにより自動化した。

具体的には、ｍ／ｚ２８１．２０１２３（イミプラミン）は、約１３．２分に溶出するので、（１）の操作において、それぞれの値をｍ／ｚ２８１．２０および１３分と四捨五入し、ｃｏｄｅを「２８１２０１３」とした。１０μＭ−１５分の試料には、ｃｏｄｅが２８１２０１３となるピークは約６００個あったため、イオン強度が最も高いものを残し、その他を削除した。

次いで、（４）ｃｏｄｅごとに各試料のイオン強度を整理した。例えば、上記（１）〜（３）の操作により、１０μＭ−１５分の試料について、１列目にｃｏｄｅおよび２列目にイオン強度が表示されたリストを作成した。そのリストの３列目に、０μＭ−１５分の試料（未代謝試料）のイオン強度を表示した。例えば、２８１２０１３は１０μＭ−１５分には含まれているが、０μＭ−１５分には含まれていないため、３列目が空欄となった。つまり、２列目に数値が表示されているが、３列目が空欄であるｃｏｄｅにより示されるピークは、代謝物であると同定される。また、３列目が空欄でなくとも２列目と３列目との差が大きい場合も同様である。この（４）での操作はプログラムにより自動化した。

その結果、上記表１に示した既知代謝物のうち１０μＭ−１５分の試料のＭ３以外の全ての代謝物を検出した（以下の表３の黒丸を参照）。他に、代謝物候補ピークが数十種〜百種程度ヒットしたが、そのほとんどが炭素同位体のピークなどの代謝物関連のピークまたは化学種は不明であるが未代謝試料には観察されず、１０μＭ−１５分の試料のみに観察されるピークであった。このように、ｃｏｄｅを設定して比較することにより、従来の代謝物検索ソフトウエアよりも確実に、代謝物を見い出すことができることがわかった。

（実施例２：ヒト尿中代謝物の検索）
１０名の健常成人男性群のヒト尿および５名の健常成人男女群のヒト尿について、全生体成分および全代謝物（メタボローム）の精密質量を測定した。

尿試料は、０．２２μｍフィルターでろ過後、分析用サンプルとしてＬＣ−ＭＳに供した。１０名の健常人男性群の尿の測定条件（Ａ）および５名の健常成人男女群の尿の測定条件（Ｂ）は、それぞれ以下のとおりである。

（Ａ）１０名の健常人男性群の尿の測定条件
（Ａ−１）高速液体クロマトグラフの条件
カラム：Mightysil RP-18 GP、２．０×２５０ｍｍ、３μｍ（関東化学株式会社）
移動相：溶媒Ａ＝水／メタノール（９５：５，v/v）（終濃度１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む）
溶媒Ｂ＝水／メタノール（９：９５，v/v）（終濃度１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む）
グラジエント：０〜２０分でＡ／Ｂ＝１００／０（v/v）；２０〜１１０分でＡ／Ｂ＝１００／０（v/v）→２０／８０（v/v）；１１０〜１２０分でＡ／Ｂ＝２０／８０（v/v）；１２０〜１２１分でＡ／Ｂ＝２０／８０（v/v）→１００／０（v/v）
流速：０．１５ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
オートサンプラー温度：４℃
（Ａ−２）質量分析の条件
イオン化：ＥＳＩ
測定モード：ポジティブおよびネガティブ

（Ｂ）５名の健常成人男女群の尿の測定条件
（Ｂ−１）高速液体クロマトグラフの条件
カラム：Inertsil ODS-3、３μｍ、２．１×１００ｍｍ（GL Sciences)
移動相：溶媒Ａ＝１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ３．７５）
溶媒Ｂ＝アセトニトリル
グラジエント：０〜５分でＡ／Ｂ＝９０／１０（v/v）；５〜２５分でＡ／Ｂ＝９０／１０（v/v）→５／９５（v/v）；２５〜３０分でＡ／Ｂ＝５／９５（v/v）；３０〜３１分でＡ／Ｂ＝５／９５（v/v）→９０／１０（v/v）；３１〜４０分でＡ／Ｂ＝９０／１０（v/v）
流速：０．２ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
オートサンプラー温度：４℃
（Ｂ−２）質量分析の条件
イオン化：ＥＳＩ
測定モード：ポジティブおよびネガティブ

得られたＲＡＷデータをテキスト形式（ｃｓｖ形式）に変換し、表計算ソフトに取り込み、ｍ／ｚを四捨五入してその値を「ｃｏｄｅ」とした。また、ＲＡＷデータとは別に、０．０１毎にｍ／ｚ５０から１０００までの数値一覧（９５０００種のｃｏｄｅを全部記載したリスト）を作成した。

データベースソフトを用いて、ＲＡＷデータとは別に作成した全ｃｏｄｅのリストを１列目に表示し、次いで、２列目から１１列目にそのｃｏｄｅに対応する各試料のイオン強度を表示した。この表を表計算ソフトに出力した後、（Ａ）１０名の健常人男性群の尿の測定の例では１２列目にカウント関数を用いて２列目から１１列目のデータ数を数えるように設定し、その値が７以上のものを選択した。また、（Ｂ）５名の健常成人男女群の尿の測定の例では、１２列目に２列目から６列目（男性試料のデータ）のデータ数を数える設定、１３列目に７列目から１１列目（女性試料のデータ）のデータ数を数えるように設定し、１２列目および１３列目ともに４以上のｃｏｄｅについては男女間で差が見られなかったと判定し、１２列目および１３列目のうちいずれかが４以上、他方が０または１であるｃｏｄｅについては男女間で差があったと判定した。

上記操作で選択されたｃｏｄｅの示すｍ／ｚから、その精密分子量を計算し、データベース検索を行った。

１０名の健常人男性群の尿のデータベース検索結果を、以下の表４に示す。

ネガティブモードで測定した場合、健常成人男子１０名に共通に存在する尿中代謝物を、１４３個検出できた。

データベース検索によりヒットした化合物について、一致および不一致を検索した結果、以下の数の化合物が各尿中で特徴的であることがわかった。データベース検索では、測定で検出された１つの化合物に対して異性体などの複数の化合物がヒットすることも多いので、それら異性体を差し引いた時の数ならびに差し引く前の数（カッコ内）を示した。

＜男女で尿中含量が同程度であると推定された化合物＞
データベース検索でヒットした化合物数（ポジティブ）：３３個（７４個）
データベース検索でヒットした化合物数（ネガティブ）：１６個（７４個）
＜男性に多いと推定された化合物＞
データベース検索でヒットした化合物数（ポジティブ）：３個（１４個）
データベース検索でヒットした化合物数（ネガティブ）：４個（９個）
＜女性に多いと推定された化合物＞
データベース検索ではヒットしなかった。なお、用いたデータベースには登録されていないが、ネガティブモードでは、プレグナンジオールグルクロニドと同じ質量の化合物が女性に多いと推定された。後の詳細な解析により、これがプレグナンジオールグルクロニドであることを確認した。

（実施例３：マウス尿中代謝物の検索）
ヒト尿の代わりに、３匹の有機カチオントランスポーター（ＯＣＴ）ノックアウトマウス群のマウス尿および３匹の野生型マウス群のマウス尿を用いたこと以外は、上記実施例２と同様の手順で、全生体成分および全代謝物（メタボローム）の精密質量を測定し、得られた質量分析データを処理した。得られたデータについて、上記実施例２と同様に、データベース検索を行って、マウス尿中代謝物を分析した。

これとは別に、約１０万（正確には９９，２８２）の物質について、プロトン化分子、脱プロトン化分子、アンモニア付加体、ナトリウム付加体、およびカリウム付加体のそれぞれの精密質量ｍ／ｚ、ならびに分子量・分子式・物質名のデータベースをMicrosoft Excel（登録商標）で作成した。

各群の個別の全生体成分および全代謝物（メタボローム）の精密質量ｍ／ｚ、イオン強度（％）、および保持時間をMicrosoft Excel（登録商標）にコピーし、イオン強度の降順にｍ／ｚを比較した。その結果、各群に共通する精密質量ｍ／ｚおよび共通しない精密質量ｍ／ｚが多く存在した。精密質量ｍ／ｚの小数点以下３桁が一致すれば、同一組成の物質であると識別できる。同一組成の物質は、上記データベースに複数個存在するものもあった。それらは、標準物質の保持時間の一致により識別した。

各群の個別の全生体成分および全代謝物（メタボローム）の精密質量ｍ／ｚを、Microsoft Excel（登録商標）からMicrosoft Access（登録商標）にトランスポートして、不一致クエリを使って、不一致精密質量ｍ／ｚおよび一致精密質量ｍ／ｚを検索した。一致する精密質量ｍ／ｚが記載されている各セルは、背景または数値をそれぞれ同じ色で示すように設定した。

各群の個別の全生体成分および全代謝物（メタボローム）の精密質量ｍ／ｚのエクセルデータ、ならびに予め作成した約１０万の物質のデータベースのエクセルデータをMicrosoft Excel（登録商標）からMicrosoft Access（登録商標）にトランスポートして、不一致クエリを使って、不一致精密質量ｍ／ｚおよび一致精密質量ｍ／ｚを検索した。一致精密質量ｍ／ｚからデータベースの物質名を同定した。次いで、各群間の不一致精密質量ｍ／ｚおよび一致精密質量ｍ／ｚを検索し、不一致精密質量ｍ／ｚからデータベースの物質名を同定した。次いで、各群間の一致精密質量ｍ／ｚの強度差を計算し、差の大きいものから降順に並べ、差の大きい物質を同定した。

その結果、ＯＣＴノックアウト群マウスの尿中代謝物として平均１６１０個の化合物を検出し、このうち、データベース検索でヒットした化合物数は５７５であった。また、野生型マウスでは尿中代謝物として平均８４１５個の化合物を検出し、データベース検索でヒットした化合物数は、６２８個であった。

イオン強度の強い代謝物は、両群の尿試料に共通して観測された。７０％以上の尿試料において共通する代謝物も多数存在した。したがって、類似ｍ／ｚを有する代謝物が多いが、精密質量により別の物質として識別できた。同じ組成で代謝部位の異なる物質も多く、カラム分離およびフラグメント解析が重要であり、標準物質での保持時間およびフラグメント解析による同定も必要であった。

測定条件に関して、ポジティブモードよりもネガティブモードのほうが、多くの代謝物をより強い強度で測定することができ、測定された物質は数万に及んだ。したがって、尿試料のメタボローム解析には、ネガティブモードのほうが適すると思われる。また、移動相は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル系と０．１％(v/v)ギ酸／アセトニトリル系のグラジエントとで、検出パターンが異なった。そのため、同じ組成で代謝部位の異なる物質の解析には、分離条件を変えて測定することが有効と思われる。

本発明の方法によれば、多種類の生体成分および代謝物を含む試料を包括的に分析した際の膨大なデータを解析するための手法が提供され、生体成分および代謝物の候補を効率よく絞り込むことができる。本発明のメタボローム解析における特異的バイオマーカーのスクリーニング方法は、種々の要因（例えば、病態、薬物への曝露など）によって代謝が特異的に変動する生体成分を特定するために特に有用な方法である。本発明の方法では、従来のメタボローム解析と比較して、スクリーニングの結果の再現性および正確性が向上している。また、本発明の方法は、比較的低コストかつハイスループットでのスクリーニングが可能である。

Raw Filtering Writerで出力されるデータの形式を示す概略図である。 本発明の方法によるｃｏｄｅの設定方法を示す概念図である。 本発明の方法によるｃｏｄｅの設定後のデータの形式を示す概略図である。 本発明の方法によるデータの比較解析の一例を示す概念図である。 本発明の方法によるＭＳ^２スペクトルを有するイオンのリスト作成方法の一例を示す概念図である。

Claims (4)

1. メタボローム解析における生体物質および代謝物の同定方法であって、
   （ａ）生体試料から生体物質および代謝物を含む分析用サンプルを得る工程；
   （ｂ）該分析用サンプルを高分解能質量分析装置で分析して、該分析用サンプルごとに質量分析データを得る工程であって、該質量分析データが、精密質量、保持時間、およびイオン強度を含む、工程；
   （ｃ）該質量分析データにおいて、該分析用サンプルごとに該精密質量および該保持時間の少なくとも一方の昇順または降順に該イオン強度を並べ替えたデータを得る工程、または該分析用サンプルごとに該イオン強度の降順に該精密質量および該保持時間の少なくとも一方を並べ替えたデータを得る工程；
   （ｄ）該並べ替えたデータについて、該分析用サンプル間で比較して、該精密質量または該保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する工程；および
   （ｅ）該一致した精密質量または該保持時間の少なくとも一方について、該精密質量および該保持時間に基づいて物質名を同定する工程；
   を含む、方法。
2. 前記工程（ｃ）において、前記精密質量および前記保持時間の少なくとも一方が、該精密質量と該保持時間とを組み合わせて作成されたｃｏｄｅである、請求項１に記載の方法。
3. メタボローム解析における特異的バイオマーカーのスクリーニング方法であって、
   （ａ）特異群および対照群の生体試料から生体物質および代謝物を含む分析用サンプルを得る工程；
   （ｂ）該分析用サンプルを高分解能質量分析装置で分析して、該分析用サンプルごとに質量分析データを得る工程であって、該質量分析データが、精密質量、保持時間、およびイオン強度を含む、工程；
   （ｃ）該質量分析データにおいて、該分析用サンプルごとに該精密質量および該保持時間の少なくとも一方の昇順または降順に該イオン強度を並べ替えたデータを得る工程、または該分析用サンプルごとに該イオン強度の降順に該精密質量および該保持時間の少なくとも一方を並べ替えたデータを得る工程；
   （ｄ）該並べ替えたデータについて、該特異群および該対照群の各群内において該分析用サンプル間で比較して、該精密質量または該保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する工程；
   （ｅ）該一致した該精密質量または該保持時間の少なくとも一方について、該特異群と該対照群との間で該精密質量または該保持時間の少なくとも一方の一致または不一致を検索する工程；および
   （ｆ）該群間の不一致精密質量または保持時間の少なくとも一方について該精密質量および該保持時間に基づいて物質名を同定する工程；または、該群間の一致精密質量または保持時間の少なくとも一方のイオン強度差を算出して差の大きいものから降順に並べ、差の大きい精密質量または保持時間の少なくとも一方について、該精密質量および該保持時間に基づいて物質名を同定する工程；
   を含む、方法。
4. 前記工程（ｃ）において、前記精密質量および前記保持時間の少なくとも一方が、該精密質量と該保持時間とを組み合わせて作成されたｃｏｄｅである、請求項３に記載の方法。

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