JP2009019031A - タンパク安定化剤 - Google Patents

Abstract

【課題】臨床診断薬として使用される標識抗体などの活性を維持するために有用な、化学合成による高性能のタンパク安定化剤の提供。
【解決手段】下記一般式（１）で表される繰り返し単位（Ａ）と、下記一般式（２）で表される繰り返し単位（Ｂ）とを有する共重合体。

【選択図】なし

Description

本発明は、例えば、臨床診断薬、臨床診断装置、バイオチップなどに用いられる各種タンパクの安定化剤に関する。

臨床診断薬として使用される標識抗体、標識抗原、酵素、一次抗体、一次抗原などのタンパクは、溶液状態でその活性を維持するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加することが一般に行われる。しかしながら、ＢＳＡを添加しても、なお、タンパクの活性低下が生じ、さらに、生体由来の安定化剤を用いる場合、ＢＳＥに代表される生物汚染の問題があることなどから、化学合成による高性能のタンパク安定化剤の開発が望まれている。

化学合成によるタンパク安定化剤としては、特開平１０−４５７９４号公報にホスホリルコリンを有する重合体、特開平１０−２７９５９４号公報にトリアシルグリセリンに代表される脂肪酸エステル膜、特開平１１−６９９７３号公報にグリセロールに代表されるポリオール、特開平７−２５５４７７号公報にグリコシド誘導体をモノマー単位として含む重合体が提案されているが、これらの安定化剤のタンパク活性維持効果は十分でなかった。
特開平１０−４５７９４号公報 特開平１０−２７９５９４号公報 特開平１１−６９９７３号公報 特開平７−２５５４７７号公報

本発明の目的は、臨床診断薬として使用される標識抗体などの活性を維持するために有用な、化学合成による高性能のタンパク安定化剤を提供することである。

本発明者らは、この課題を解決するために、特定の組成の共重合体が高いタンパク安定化効果を有することを見いだし、本発明を完成した。

本発明の一態様に係るタンパク安定化剤は、
下記一般式（１）で表される繰り返し単位（Ａ）と、下記一般式（２）で表される繰り返し単位（Ｂ）とを有する共重合体を含有する。

・・・・・（１）
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に、水素原子、または、炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基であり、Ｒ^１とＲ^２は互いに結合して環構造を形成してもよい。）

・・・・・（２）
（式中、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ^４はフェニル基または−ＣＯ_２Ｒ^５で表される基（ここで、Ｒ^５は炭素数１〜１２の置換または非置換のアルキル基、脂環式炭化水素基、または芳香族炭化水素基を示す。）を示す。）

上記タンパク安定化剤において、前記繰り返し単位（Ａ）は、上記一般式（１）において、Ｒ^１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ^２は水素原子、メチル基、およびヒドロキシエチル基から選ばれる少なくとも１種を示すものであることができる。

上記タンパク安定化剤において、前記繰り返し単位（Ｂ）は、水への溶解度が２０％未満である少なくとも１種のモノマーに由来する構造であることができる。

上記タンパク安定化剤において、前記繰り返し単位（Ｂ）は、上記一般式（２）において、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ^４が−ＣＯ_２Ｒ^５で表される基であって、Ｒ^５はメチル基、エチル基、およびメトキシエチル基から選ばれる少なくとも１種を示すものであることができる。

上記タンパク安定化剤によれば、上記一般式（１）で表される繰り返し単位（Ａ）と、上記一般式（２）で表される繰り返し単位（Ｂ）とを有する共重合体を含有することにより、高いタンパク安定化効果を有する。

以下、本発明の一実施形態に係るタンパク安定化剤について、具体的に説明する。

１．タンパク安定化剤
１．１．タンパク安定化剤の構成
本実施形態に係るタンパク安定化剤は、下記一般式（１）で表される繰り返し単位（Ａ）と、下記一般式（２）で表される繰り返し単位（Ｂ）とを有する共重合体を含有する。

・・・・・（１）
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に、水素原子、または、炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基であり、Ｒ^１とＲ^２は互いに結合して環構造を形成してもよい。）

・・・・・（２）
（式中、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ^４はフェニル基または−ＣＯ_２Ｒ^５で表される基（ここで、Ｒ^５は炭素数１〜１２の置換または非置換のアルキル基、脂環式炭化水素基、または芳香族炭化水素基を示す。）を示す。）

本実施形態に係るタンパク安定化剤は、その一部に上記共重合体を含んでいてもよく、あるいは、上記共重合体のみから構成されていてもよい。

１．１．１．繰り返し単位（Ａ）
上記共重合体において、上記一般式（１）で表される繰り返し単位（Ａ）は、高いタンパク安定化効果の発現に寄与する主体である。

上記一般式（１）において、Ｒ^１、Ｒ^２で表される炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基としては、直鎖または分岐の置換または非置換のアルキル基が挙げられ、置換アルキル基は例えば水酸基などの官能基で置換されていてもよい。また、Ｒ^１とＲ^２が互いに結合して環構造を形成してもよい。

例えば、上記一般式（１）において、上記一般式（１）において、Ｒ^１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ^２は水素原子、メチル基、およびヒドロキシエチル基から選ばれる少なくとも１種を示すものであることが好ましい。

１．１．２．繰り返し単位（Ｂ）
上記共重合体において、上記一般式（２）で表される繰り返し単位（Ｂ）は、
共重合体の親水／疎水バランスを疎水側にずらすことにより、より高いタンパク安定化効果の発現に寄与する。

上記一般式（２）において、Ｒ^５で表される炭素数１〜１２の置換または非置換のアルキル基としては、直鎖または分岐の置換または非置換のアルキル基が挙げられ、置換アルキル基は例えばアルコキシ基などの官能基で置換されていてもよい。

また、上記一般式（２）において、Ｒ^５で表される脂環式炭化水素基としては、例えば、イソボニル基、シクロヘキシル基が挙げられ、Ｒ^４で表される芳香族炭化水素基としては、例えばベンジル基が挙げられる。

例えば、上記一般式（２）において、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ^４が−ＣＯ_２Ｒ^５で表される基であって、Ｒ^５はメチル基、エチル基、およびメトキシエチル基から選ばれる少なくとも１種を示すものであるのが好ましい。

また、繰り返し単位（Ｂ）は、水への溶解度が２０％未満である少なくとも１種のモノマー（ｂ）に由来する構造であるのが好ましい。

また、上記共重合体において、繰り返し単位（Ａ）および繰り返し単位（Ｂ）をそれぞれ、少なくとも１種以上含有していてもよい。なお、上記共重合体は、繰り返し単位（Ａ）および繰り返し単位（Ｂ）以外のその他の繰り返し単位（Ｃ）を含有していてもよい。

１．２．タンパク安定化剤の製造
次に、上記共重合体を製造するために使用するモノマーの組成について説明する。

１．２．１．モノマー（ａ）
モノマー（ａ）は、繰り返し単位（Ａ）を形成するための成分である。モノマー（ａ）は、アクリルアミドおよびアクリルアミドのＮ−置換モノマーから選ばれる少なくとも１種のモノマーであることが好ましい。

アクリルアミドのＮ−置換モノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、ダイアセトンアクリルアミドなどを挙げることができる。

モノマー（ａ）として、より好ましくは、アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドから選ばれる少なくとも１種であり、さらに好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドである。

１．２．２．モノマー（ｂ）
モノマー（ｂ）は、繰り返し単位（Ｂ）を形成するための成分である。モノマー（ｂ）は、水への溶解度が２０％未満である少なくとも１種のモノマーである。

モノマー（ｂ）としては、例えば、（メタ）アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ラウリル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸イソボニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、スチレンなどを挙げることができる。モノマー（ｂ）としてより好ましくは、メタクリル酸メチル、アクリル酸エチル、およびアクリル酸メトキシエチルから選ばれる少なくとも１種である。

本発明において、「水への溶解度が２０％未満であるモノマー」とは、２５℃の水におけるモノマー濃度が２０％になるようにモノマーを添加して攪拌した後に、モノマーが水相から分離することを目視で確認できるモノマーのことをいう。

１．２．３．モノマーの組成および重合
モノマー（ｃ）は、その他の繰り返し単位（Ｃ）を形成するための成分である。その他のモノマー（ｃ）として、１〜１０重量％のアニオン性モノマー、特に、スチレンスルホン酸、イソプレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などを、モノマー（ａ）およびモノマー（ｂ）と共重合して共重合体を製造することにより、免疫診断薬の希釈液として用いた場合に非特異検体のシグナル抑制効果が得られる場合がある。

本実施形態に係るタンパク安定化剤である共重合体を製造するためのモノマーの組成は、全モノマーを１００重量％として、好ましくは、モノマー（ａ）３０〜９９重量％、モノマー（ｂ）１〜７０重量％、およびその他のモノマー（ｃ）０〜４９重量％であり、より好ましくは、モノマー（ａ）４０〜９５重量％、モノマー（ｂ）５〜６０重量％、およびその他のモノマー（ｃ）０〜２０重量％である。

使用するモノマーは、工業用原料として入手することができるものを精製して、あるいは、未精製のまま、共重合に使用することができる。

重合は、例えば、ラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合など公知の重合法で行うことができ、製造が容易であることから、好ましくはラジカル重合である。

また、重合は、公知の溶媒、開始剤、連鎖移動剤などと共に攪拌・加熱することにより実施される。重合時間は、通常３０分〜２４時間、重合温度は、０〜１２０℃程度である。

１．３．タンパク安定化剤の物性および用途
本実施形態に係るタンパク安定化剤（共重合体）の数平均分子量は、通常１，０００〜１，０００，０００であり、好ましくは２，０００〜１００，０００であり、より好ましくは３，０００〜５０，０００である。また、本実施形態に係るタンパク安定化剤（共重合体）の分子量分布は、典型的には、重量平均分子量／数平均分子量が１．５〜３である。

本実施形態に係るタンパク安定化剤が含有する共重合体は水溶性である。本発明において、「水溶性である」とは、２５℃で１％のポリマー固形分となるように水に共重合体を添加・混合したときに、目視で透明に溶解することをいう。

本実施形態に係るタンパク安定化剤は、例えば、臨床診断薬として使用される標識抗体、標識抗原、酵素、一次抗体、一次抗原の安定化剤；血漿製剤に含まれるタンパクの安定化剤；コンタクトレンズの洗浄に使用される酵素などの安定化剤などとして、タンパク溶液中に添加することにより、タンパクの活性を長期間にわたり維持させることができる。さらに、本実施形態に係るタンパク安定化剤は、容器・器具などにコーティングしてタンパクの非特異吸着を抑制する効果、ならびに、免疫診断薬の希釈液として用いて非特異検体のシグナル抑制する効果を有する。

２．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。

２．１．実施例１
モノマー（ａ）としてジメチルアクリルアミド９０ｇ、モノマー（ｂ）としてメタクリル酸メチル１０ｇ、および連鎖移動剤としてシステアミン塩酸塩４ｇを水９００ｇに混合して攪拌機付きセパラブルフラスコに入れた。これに窒素を吹き込みながら７０℃まで昇温し、開始剤として２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド１ｇを添加した後、２時間重合を続け、さらに８０℃に昇温して３時間エージングした後、室温まで冷却した。得られた共重合体溶液を透析により精製し、さらに凍結乾燥することにより、本実施例のタンパク安定化剤（Ｓ−１）８２ｇを得た。

タンパク安定化剤（Ｓ−１）のＧＰＣによる数平均分子量は５，０００であり、重量平均分子量は１０，０００であった。

西洋ワサビパーオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体（ミリポア社製ＡＰ１２４Ｐ）を１％のタンパク安定化剤（Ｓ−１）水溶液で１０万倍に希釈し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジデン）／過酸化水素水／硫酸で発色させて４５０ｎｍの吸光度を測定した（保存前の吸光度の測定）。また、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体（ミリポア社製「ＡＰ１２４Ｐ」）を１％のタンパク安定化剤（Ｓ−１）水溶液で１０万倍に希釈した後、４℃で１０日間保存した後、同様の方法にて吸光度を測定した（保存後の吸光度の測定）。その結果、保存前の西洋ワサビパーオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体によるＴＭＢの発色の吸光度を１００％としたとき、タンパクの活性維持率の指標となる保存後の吸光度は８９％であった。

２．２．実施例２
実施例１において、モノマー（ａ）としてジメチルアクリルアミド９０ｇ、モノマー（ｂ）としてメタクリル酸メチル１０ｇ、および連鎖移動剤としてシステアミン塩酸塩４ｇを用いる代わりに、モノマー（ａ）としてＮ−ヒドロキシエチルアクリルアミド５０ｇ、モノマー（ｂ）としてアクリル酸メトキシエチル５０ｇ、および連鎖移動剤としてシステアミン塩酸塩２ｇを用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、タンパク安定化剤（Ｓ−２）を得た。

タンパク安定化剤（Ｓ−２）のＧＰＣによる数平均分子量は５，８００であり、重量平均分子量は１１，０００であった。

また、タンパク安定化剤（Ｓ−２）を使用した以外は実施例１と同様の方法にて、保存前の吸光度および保存後の吸光度をそれぞれ測定した結果、保存前の吸光度（１００％）に対する保存後の吸光度は８３％であった。

２．３．実施例３
実施例１において、モノマー（ａ）としてジメチルアクリルアミド９０ｇ、モノマー（ｂ）としてメタクリル酸メチル１０ｇ、および連鎖移動剤としてシステアミン塩酸塩４ｇを用いた代わりに、モノマー（ａ）としてアクリルアミド５０ｇ、モノマー（ｂ）としてアクリル酸メトキシエチル５０ｇ、および連鎖移動剤としてシステアミン塩酸塩８ｇを用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、タンパク安定化剤（Ｓ−３）を得た。

タンパク安定化剤（Ｓ−３）のＧＰＣによる数平均分子量は４，８００であり、重量平均分子量は９，６００であった。

また、タンパク安定化剤（Ｓ−３）を使用した以外は実施例１と同様の方法にて、保存前の吸光度および保存後の吸光度をそれぞれ測定した結果、保存前の吸光度（１００％）に対する保存後の吸光度は８１％であった。

２．４．比較例１
実施例１において、モノマー（ａ）としてジメチルアクリルアミド９０ｇ、モノマー（ｂ）としてメタクリル酸メチル１０ｇ、および連鎖移動剤としてシステアミン塩酸塩４ｇを用いた代わりに、モノマー（ａ）としてジメチルアクリルアミド１００ｇおよび連鎖移動剤としてシステアミン塩酸塩２ｇを用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、共重合体（Ｔ−１）を得た。

共重合体（Ｔ−１）のＧＰＣによる数平均分子量は７，８００であり、重量平均分子量は１６，０００であった。

また、共重合体（Ｔ−１）を使用した以外は実施例１と同様の方法にて、保存前の吸光度および保存後の吸光度をそれぞれ測定した結果、保存前の吸光度（１００％）に対する保存後の吸光度は１７％であった。

２．５．比較例２
比較例１において、モノマー（ａ）としてジメチルアクリルアミド１００ｇを用いた代わりに、モノマー（ａ）としてＮ−ヒドロキシエチルアクリルアミド１００ｇを用いた以外は、比較例１と同様の方法にて、共重合体（Ｔ−２）を得た。

共重合体（Ｔ−２）のＧＰＣによる数平均分子量は５，８００であり、重量平均分子量は１１，０００であった。

また、共重合体（Ｔ−２）を使用した以外は実施例１と同様の方法にて、保存前の吸光度および保存後の吸光度をそれぞれ測定した結果、保存前の吸光度（１００％）に対する保存後の吸光度は２４％であった。

２．６．比較例３
比較例１において、モノマー（ａ）としてジメチルアクリルアミド１００ｇを用いた代わりに、モノマー（ａ）としてアクリルアミド１００ｇを用いた以外は、比較例１と同様の方法にて、共重合体（Ｔ−３）を得た。

共重合体（Ｔ−３）のＧＰＣによる数平均分子量は７，６００であり、重量平均分子量は１５，０００であった。

また、共重合体（Ｔ−３）を使用した以外は実施例１と同様の方法にて、保存前の吸光度および保存後の吸光度をそれぞれ測定した結果、保存前の吸光度（１００％）に対する保存後の吸光度は７％であった。

２．７．比較例４
共重合体として、市販の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／メタクリル酸ブチル共重合体を用いた以外は、比較例１と同様の方法にて、保存前の吸光度および保存後の吸光度をそれぞれ測定した結果、保存前の吸光度（１００％）に対する保存後の吸光度は７０％であった。

２．８．比較例５
タンパク安定化剤（Ｓ−１）の替わりにＢＳＡを用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、保存前の吸光度および保存後の吸光度をそれぞれ測定した結果、保存前の吸光度（１００％）に対する保存後の吸光度は７１％であった。

Claims (4)

1. 下記一般式（１）で表される繰り返し単位（Ａ）と、下記一般式（２）で表される繰り返し単位（Ｂ）とを有する共重合体を含有する、タンパク安定化剤。
   

   

   ・・・・・（１）
   （式中、Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に、水素原子、または、炭素数１〜８の置換または非置換のアルキル基であり、Ｒ^１とＲ^２は互いに結合して環構造を形成してもよい。）
   

   

   ・・・・・（２）
   （式中、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ^４はフェニル基または−ＣＯ_２Ｒ^５で表される基（ここで、Ｒ^５は炭素数１〜１２の置換または非置換のアルキル基、脂環式炭化水素基、または芳香族炭化水素基を示す。）を示す。）
2. 前記繰り返し単位（Ａ）は、上記一般式（１）において、Ｒ^１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ^２は水素原子、メチル基、およびヒドロキシエチル基から選ばれる少なくとも１種を示すものである、請求項１に記載のタンパク安定化剤。
3. 前記繰り返し単位（Ｂ）は、水への溶解度が２０％未満である少なくとも１種のモノマーに由来する構造である、請求項１または２に記載のタンパク安定化剤。
4. 前記繰り返し単位（Ｂ）は、上記一般式（２）において、Ｒ^３は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ^４が−ＣＯ_２Ｒ^５で表される基であって、Ｒ^５はメチル基、エチル基、およびメトキシエチル基から選ばれる少なくとも１種を示すものである、請求項１ないし３のいずれかに記載のタンパク安定化剤。