JP2009014524A - Allergic disease estimation marker, therapeutic effect determination marker, and methods for using them - Google Patents
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Abstract
【課題】アレルギー疾患推定マーカー及び治療効果判定マーカー、並びに、それらの利用方法を提供すること。
【解決手段】末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度の低下は、アレルギー疾患の発症と相関する。従って、Foxp3陽性CD4陽性細胞は、アレルギー体質を有する動物個体の中で、アレルギー疾患を発症しない動物個体を特定するためのマーカーや、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない動物個体において、アレルギー疾患の発症を推定するためのマーカーとして有用である。また、Foxp3陽性CD4陽性細胞は、アレルギー疾患を発症している患者の治療における治療効果を判定するためのマーカーとしても使用することができる。
【選択図】図1The present invention provides an allergic disease estimation marker, a therapeutic effect determination marker, and methods for using them.
The decrease in the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood correlates with the development of allergic diseases. Therefore, Foxp3 positive CD4 positive cells are markers for identifying animal individuals that do not develop allergic diseases among animal individuals having allergic constitutions, and animal individuals that have allergic constitutions but have not developed allergic diseases, It is useful as a marker for estimating the onset of allergic diseases. Foxp3-positive CD4-positive cells can also be used as a marker for determining the therapeutic effect in the treatment of patients with allergic diseases.
[Selection] Figure 1
Description
本発明は、Foxp3陽性CD4陽性細胞を含有する、アレルギー疾患推定マーカー及び治療効果判定マーカー、並びに、それらの利用方法に関する。 The present invention relates to an allergic disease estimation marker and a therapeutic effect determination marker containing Foxp3-positive CD4-positive cells, and methods for using them.
アレルギー疾患を診断するためには、問診、診察、血液検査が必要である。現時点において、アレルギー学的に重要な血液検査の項目は、総IgE、特異的IgE、好酸球、ヒスタミン遊離試験等である。 In order to diagnose allergic diseases, medical examinations, examinations, and blood tests are necessary. At this time, allergic important blood test items are total IgE, specific IgE, eosinophil, histamine release test and the like.
しかしながら、これらの血液検査において、末梢血中の総IgE値、特異的IgE値、又は好酸球数の増加は、アレルギー体質であることの判断基準になっているが、実際には、アレルギー疾患を発する患者だけではなく、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症しない人においても認められる（例えば、非特許文献1参照）。そのため、末梢血中の総IgE値、特異的IgE値、又は好酸球数の増加は、アレルギー疾患の発症を診断又は予見する際の特異的な検査所見であると言えなかった。
以上のような現状から、血液検査によって、アレルギー体質を有しアレルギー疾患を発症する患者と、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症しない人とを特定する方法を開発する必要があった。 From the current situation as described above, it has been necessary to develop a method for identifying patients who have allergic constitutions and develop allergic diseases and those who have allergic constitutions but do not develop allergic diseases by blood tests.
そこで、本発明は、Foxp3陽性CD4陽性細胞を含有する、アレルギー疾患推定マーカー及び治療効果判定マーカー、並びに、それらの利用方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide an allergic disease estimation marker and a therapeutic effect determination marker containing Foxp3-positive CD4-positive cells, and methods for using them.
Foxp3陽性CD4陽性細胞は、自己免疫疾患の発症に起因するTH1細胞やアレルギー疾患の発症に起因するTH2細胞の機能を抑制すると考えられている、制御性T細胞の一つである。そのため、現在まで、Foxp3陽性CD4陽性細胞密度が上昇すると、TH2細胞の機能が抑制され、その結果、IgEの産生は抑制される、と考えられていた。 Foxp3-positive CD4-positive cells are one of regulatory T cells that are thought to suppress the function of TH1 cells resulting from the development of autoimmune diseases and TH2 cells resulting from the development of allergic diseases. For this reason, up to now, it has been thought that when the density of Foxp3-positive CD4-positive cells increases, the function of TH2 cells is suppressed, and as a result, the production of IgE is suppressed.
しかしながら、本発明者らは、以下の実施例に示すように、64名の総IgE値が正常値より高いアレルギー体質の人において末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度を調べたところ、アトピー性皮膚炎、喘息、又はその両方を合併する37名の重症のアレルギー疾患を発症している患者では低下し、27名のアレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人では低下しないことを明らかにした。このように、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度はIgEの産生とは相関が低く、アレルギー疾患の発症と相関が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。 However, as shown in the following examples, the present inventors examined the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood in 64 allergic individuals whose total IgE values were higher than normal. Decreased in 37 patients with severe allergic disease complicated by atopic dermatitis, asthma, or both, and not decreased in 27 patients with allergic constitution but not developing allergic disease Revealed. Thus, the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood was found to have a low correlation with IgE production and a high correlation with the development of allergic diseases, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明にかかるマーカーは、アレルギー体質を有する動物個体の中で、アレルギー疾患を発症しない動物個体を特定するためのマーカー、又は、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない動物個体において、アレルギー疾患の発症を推定するためのマーカーであって、Foxp3陽性CD4陽性細胞を含有することを特徴とする。 That is, the marker according to the present invention is a marker for identifying an animal individual that does not develop an allergic disease among animal individuals having an allergic constitution, or an animal individual that has an allergic constitution but does not develop an allergic disease. A marker for estimating the onset of allergic diseases, characterized by containing Foxp3-positive CD4-positive cells.
ここで、前記アレルギー体質は、末梢血中の総IgE値が、正常値より高いことによって判定されることを特徴とする。なお、前記総IgE値は、100IU/mL以上であるか、又は、特定の抗原に対する特異的IgE値が、CAPスコアで2以上であることが好ましい。 Here, the allergic constitution is characterized in that the total IgE value in peripheral blood is determined by being higher than a normal value. The total IgE value is preferably 100 IU / mL or more, or the specific IgE value for a specific antigen is preferably 2 or more in CAP score.
また、本発明にかかるマーカーは、アレルギー疾患を発症している患者の治療における治療効果を判定するためのマーカーであって、Foxp3陽性CD4陽性細胞を含有することを特徴とする。前記アレルギー疾患の治療の内容は、例えば、アレルギー疾患を治療するための薬剤の投与の開始又は中止、又は投与方法の変更等が挙げられる。 The marker according to the present invention is a marker for determining a therapeutic effect in the treatment of a patient who has developed an allergic disease, and is characterized by containing Foxp3-positive CD4-positive cells. Examples of the content of treatment for the allergic disease include starting or stopping administration of a drug for treating allergic disease, or changing the administration method.
ここで、前記アレルギー疾患を発症している患者における末梢血中の総IgE値は、正常値より高いことを特徴とする。なお、前記総IgE値は、100IU/mL以上であるか、又は、特定の抗原に対する特異的IgE値が、CAPスコアで2以上であることが好ましい。 Here, the total IgE value in the peripheral blood in the patient who develops the allergic disease is characterized by being higher than the normal value. The total IgE value is preferably 100 IU / mL or more, or the specific IgE value for a specific antigen is preferably 2 or more in CAP score.
さらに、本発明にかかるアレルギー疾患発症推定方法は、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していないヒト又はヒト以外の脊椎動物において、アレルギー疾患の発症を推定する方法であって、前記脊椎動物に対して、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度を測定することを特徴とする。 Furthermore, the allergic disease onset estimation method according to the present invention is a method for estimating the onset of allergic disease in a human or non-human vertebrate having an allergic constitution but not developing allergic disease, On the other hand, the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood is measured.
ここで、前記アレルギー疾患発症推定方法は、前記脊椎動物に対して、末梢血中の総IgE値又は特定の抗原に対する特異的IgE値を測定する工程を包含してもよい。 Here, the allergic disease onset estimation method may include a step of measuring a total IgE value in peripheral blood or a specific IgE value for a specific antigen for the vertebrate.
また、本発明にかかる薬効判定方法は、アレルギー疾患を発症しているヒト又はヒト以外の脊椎動物において、アレルギー疾患を治療するための薬剤の薬効を判定する方法であって、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度を、前記脊椎動物に対して薬剤を投与する前後で測定して、投与前後の密度を比較することを特徴とする。 The method for determining the efficacy of the present invention is a method for determining the efficacy of a drug for treating an allergic disease in a human or non-human vertebrate that has developed an allergic disease, comprising Foxp3 in peripheral blood. The density of the positive CD4 positive cells is measured before and after the drug is administered to the vertebrate, and the density before and after the administration is compared.
ここで、前記薬効判定方法は、前記脊椎動物に対して、末梢血中の総IgE値又は特定の抗原に対する特異的IgE値を測定する工程を包含してもよい。 Here, the drug efficacy determination method may include a step of measuring a total IgE value in peripheral blood or a specific IgE value for a specific antigen for the vertebrate.
さらに、本発明にかかるスクリーニング方法は、アレルギー疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、アレルギー疾患を発症しているヒト又はヒト以外の脊椎動物に対し、候補となる薬剤を投与する前後に末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度を測定し、前記薬剤の投与前後の前記Foxp3陽性CD4陽性細胞の密度を比較する工程を包含することを特徴とする。 Furthermore, the screening method according to the present invention is a screening method for a therapeutic agent for allergic diseases, wherein peripheral blood is administered before and after administering a candidate drug to a human or non-human vertebrate that has developed allergic disease. And measuring the density of Foxp3 positive CD4 positive cells in the medium, and comparing the density of Foxp3 positive CD4 positive cells before and after administration of the drug.
ここで、前記スクリーニング方法は、前記脊椎動物に対して、末梢血中の総IgE値又は特定の抗原に対する特異的IgE値を測定する工程を包含してもよい。 Here, the screening method may include a step of measuring a total IgE value in peripheral blood or a specific IgE value for a specific antigen for the vertebrate.
また、本発明にかかるキットは、アレルギー体質を有する動物個体の中で、アレルギー疾患を発症しない動物個体を特定するためのキット、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない動物個体において、アレルギー疾患の発症を推定するためのキット、又は、アレルギー疾患の治療における治療効果を判定するためのキットであって、抗Foxp3抗体と、抗CD4抗体と、を含むことを特徴とする。ここで、前記キットは、抗IgE抗体を含んでいてもよい。 The kit according to the present invention is a kit for identifying an animal individual who does not develop an allergic disease among animal individuals having an allergic constitution, an allergy in an animal individual that has an allergic constitution but does not develop an allergic disease. A kit for estimating the onset of a disease or a kit for determining a therapeutic effect in the treatment of an allergic disease, comprising an anti-Foxp3 antibody and an anti-CD4 antibody. Here, the kit may contain an anti-IgE antibody.
なお、アレルギー疾患の発症は、通常、アレルギーの自他覚所見によって判断され、アレルギー疾患には、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹等のアレルギーも含まれる。 The onset of allergic diseases is usually determined based on allergic findings, and allergic diseases include allergies such as asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, anaphylaxis, urticaria and the like.
また、アレルギー体質を有することは、末梢血中の総IgE値、特異的IgE値、又は好酸球数の増加によって判断される。
IgE値とは、IgEの量を測定した時の測定値のことをいう。
Also, having an allergic constitution is determined by an increase in the total IgE value, specific IgE value, or eosinophil count in peripheral blood.
The IgE value is a measured value when the amount of IgE is measured.
本発明によって、Foxp3陽性CD4陽性細胞を含有する、アレルギー疾患推定マーカー、及び治療効果判定マーカー、並びに、それらの利用方法を提供することができるようになった。 According to the present invention, it is possible to provide an allergic disease estimation marker, a therapeutic effect determination marker, and methods for using them, which contain Foxp3-positive CD4-positive cells.
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Standard Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for illustration or explanation. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
＝＝血液中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の測定方法＝＝
ヒト又はヒト以外の脊椎動物において、ヒト又はヒト以外の脊椎動物から血液（例えば、末梢血中）を採取し、蛍光でラベルされた抗体を用いて、血液中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度をフローサイトメトリー等（ここで、末梢血中のFoxp3陽性細胞を同定する技術は2005年に開発されている（Roncador G,ほかEur J Immunol 2005; 35:1681-1691.））を用いて測定し、これらの細胞の密度が所定の密度よりも高いのかそれとも低いのかを測定する。
== Method for measuring Foxp3-positive CD4-positive cells in blood ==
In human or non-human vertebrates, blood (eg, in peripheral blood) is collected from human or non-human vertebrates, and fluorescence-labeled antibodies are used to determine the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in the blood. (Here, a technique for identifying Foxp3-positive cells in peripheral blood was developed in 2005 (Roncador G, et al. Eur J Immunol 2005; 35: 1681-1691.)) Measure whether the density of these cells is higher or lower than a predetermined density.
なお、上記方法に追加して、末梢血中の総IgE値や、特定の抗原に対する特異的IgE値を測定してもよい。この場合、末梢血中の総IgE値が正常値より高くなった場合（例えば、100IU/mL以上）や、特定の抗原に対する特異的IgE値が正常値より高くなった場合（例えば、CAPスコアで2以上）に、アレルギー体質であると判断される。 In addition to the above method, a total IgE value in peripheral blood or a specific IgE value for a specific antigen may be measured. In this case, when the total IgE value in the peripheral blood is higher than the normal value (for example, 100 IU / mL or more), or when the specific IgE value for a specific antigen is higher than the normal value (for example, with a CAP score) 2 or more), it is judged to be allergic.
＝＝Foxp3陽性CD4陽性細胞及びその有用性＝＝＝
（１）アレルギー疾患を発症する人を推定するためのマーカー
上述したように、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人の中には、末梢血中に総IgE値の増加や、特定の抗原に対する特異的IgE値の増加が認められても、アレルギー疾患を発症しない人がいる。本発明者らは、末梢血におけるFoxp3陽性CD4陽性細胞の濃度の低下とアレルギー疾患の発症との相関を明らかにした。このことから、Foxp3陽性CD4陽性細胞は、アレルギー体質を有する患者の中で、アレルギー疾患を発症しない患者を特定したり、アレルギー疾患を発症する人を予見したりするためのマーカーとして有用である。従って、例えば、本発明のマーカーを用いれば、従来特定できなかった、アレルギー体質を有するにもかかわらず、アレルギー疾患を発症する患者と、アレルギー疾患を発症しない人とを識別することができる。
== Foxp3-positive CD4-positive cells and their usefulness ===
(1) Markers for estimating the person who develops allergic disease As mentioned above, some people who have allergic constitution but have not developed allergic disease may have increased total IgE levels in peripheral blood or specified Some people do not develop allergic disease, even if an increase in specific IgE levels against other antigens is observed. The present inventors have revealed a correlation between a decrease in the concentration of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood and the development of allergic diseases. Thus, Foxp3-positive CD4-positive cells are useful as markers for identifying patients who do not develop allergic diseases among patients with allergic constitutions or foreseeing those who develop allergic diseases. Therefore, for example, by using the marker of the present invention, it is possible to distinguish a patient who develops an allergic disease from a person who does not develop an allergic disease despite having an allergic constitution, which could not be specified conventionally.
具体的には、本発明者らは、アレルギー体質を有しアレルギー疾患を発症している患者と、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人とにおける、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度のカットオフ値は3.6％であることを明らかにした（表2を参照のこと）。これより、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人における末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が3.6％以下の場合は、近い将来、アレルギー疾患を発症する確率が高いと推定することができる。 Specifically, the present inventors have confirmed that Foxp3 positive CD4 positive in peripheral blood in patients who have an allergic constitution and have developed allergic disease and those who have allergic constitution but have not developed allergic disease. The cut-off value of cell density was found to be 3.6% (see Table 2). Based on this, it is estimated that the probability of developing allergic disease is high in the near future if the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood is 3.6% or less in people who have allergic constitution but have not developed allergic disease. be able to.
従って、例えば、花粉症等で、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人に対して、発症以前から投与する必要のある抗アレルギー剤（トラニラストやアンレキサノクス等）を早期から投与する必要があるかどうかを判断することができる。 Therefore, it is necessary to administer antiallergic agents (tranilast, amlexanox, etc.) that need to be administered from the early stage to those who have allergic constitutions but have not developed allergic diseases, such as hay fever. It can be determined whether there is.
なお、アレルギー疾患発症の推定の際は、本発明のマーカーの他に、皮膚反応試験（プリックテスト、スクラッチテスト、皮内テスト等）、試験管内検査法（RIST法、RAST法、ヒスタミン遊走試験、リンパ球増殖反応等）等を組み合わせてもよい。具体的にいうと、例えば、本発明のマーカーの他に、鼻腔内誘発試験、呼吸機能検査、ピークフローの測定、血液ガス分析、気道過敏性反応、抗原吸入誘発試験、吸入（アスピリン、トルメチン）誘発試験、運動負荷試験、気道炎症検査法、皮膚反応（皮内反応、プリックテスト等）、パッチテスト、リンパ球幼若化試験（LTT）、マクロファージ遊走阻止試験（MIT）等を、組み合わせてもよい。 In addition, when estimating the onset of allergic diseases, in addition to the marker of the present invention, skin reaction tests (prick test, scratch test, intradermal test, etc.), in vitro test methods (RIST method, RAST method, histamine migration test, Lymphocyte proliferation reaction etc.) may be combined. Specifically, for example, in addition to the marker of the present invention, intranasal provocation test, respiratory function test, peak flow measurement, blood gas analysis, airway hypersensitivity reaction, antigen inhalation provocation test, inhalation (aspirin, tolmetin) Combination of induction test, exercise test, airway inflammation test, skin reaction (intradermal reaction, prick test, etc.), patch test, lymphocyte rejuvenation test (LTT), macrophage migration inhibition test (MIT), etc. Good.
（２）アレルギー疾患以外の疾病を有する患者を特定するためのマーカー
喘息やCOPDは、呼吸困難、喘鳴等の自他覚所見が認められるため、自他覚所見からは、アレルギー疾患である喘息なのか、それともアレルギー疾患ではないCOPDなのか確定診断を行うことができない。同様に、アレルギー性鼻炎や感冒症状は、鼻汁、鼻閉等の自他覚所見が、アトピー性皮膚炎や汗疹、脂漏性皮膚炎は、皮膚掻痒や湿疹の自他覚所見が、アナフィアラキシーショックや他のショック（心原性ショック、出血性ショック、神経原性ショック等）は、血圧低下の自他覚所見が認められるため、これらも自他覚所見からはアレルギー疾患かどうかの確定診断を行うことが難しい場合がある。
(2) Markers for identifying patients with diseases other than allergic diseases Asthma and COPD are found to have asthma, which is an allergic disease, from self-other findings such as dyspnea and wheezing. Whether or not it is COPD that is not an allergic disease cannot be confirmed. Similarly, allergic rhinitis and cold symptoms are symptomatic findings such as nasal discharge and nasal congestion, atopic dermatitis and sweat rash, and seborrheic dermatitis are irritated signs of skin pruritus and eczema. Sea shock and other shocks (cardiogenic shock, hemorrhagic shock, neurogenic shock, etc.) have self-awareness findings of decreased blood pressure. It may be difficult to make a diagnosis.
前述の通り、本発明者らは、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度の低下は、アレルギー疾患の発症と相関することを明らかにした。従って、上記症状を呈する患者において、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞数を測定することにより、もし、その密度が正常値以上であれば、その症状の原因がアレルギー疾患ではないという結論することができる。 As described above, the present inventors have revealed that a decrease in the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood correlates with the onset of allergic diseases. Therefore, by measuring the number of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood in patients with the above symptoms, if the density is above normal, conclude that the cause of the symptoms is not allergic disease Can do.
以上をまとめると、表１のようになる。
なお、Foxp3陽性CD4陽性細胞の密度、総IgE値、自他覚所見は、将来変動する可能性がある。そのため、適宜、本発明のマーカーを用いて、診断を行うことが好ましい。
The density of Foxp3-positive CD4-positive cells, total IgE values, and self-intentional findings may change in the future. Therefore, it is preferable to diagnose using the marker of this invention suitably.
（３）アレルギー疾患の治療における治療効果を判定する方法、及びアレルギー疾患の治療薬をスクリーニングする方法
前述の通り、本発明者らは、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度の低下はアレルギー疾患の発症と相関し、発症するかどうかの判定をするためのFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度のカットオフ値は3.6％であることを明らかにした。
(3) Method of determining therapeutic effect in treatment of allergic disease and method of screening for therapeutic agent for allergic disease As described above, the present inventors have found that the decrease in the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood is allergic. It was revealed that the cut-off value of the density of Foxp3-positive CD4-positive cells to correlate with the onset of the disease and determine whether to develop it is 3.6%.
従って、Foxp3陽性CD4陽性細胞は、アレルギー疾患の治療における治療効果を判定するためのマーカーとして有用である。例えば、アレルギー疾患に対する治療効果を判定するためには、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において、アレルギー疾患を治療する薬剤を投与する前後で血液（例えば、末梢血）を採取し、血液中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度をフローサイトメトリー等を用いて測定し、アレルギー疾患を治療する薬剤を投与する前後での変化を比較すればよい。そして、アレルギー疾患を治療する薬剤を投与後に、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が上昇すれば、そのアレルギー疾患を治療する薬剤は有効であると判定し、一方、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が低下すれば、そのアレルギー疾患を治療する薬剤は無効であると判定する。ここで、その判定の閾値を、3.6％に設定してもよい。なお、上記方法において、末梢血中の総IgE値や、特定の抗原に対する特異的IgE値を測定してもよい。この場合、末梢血中の総IgE値が正常値より低くなった場合（例えば、100IU/mL以下）や、特定の抗原に対する特異的IgE値が低くなった場合（例えば、CAPスコアで2以下）に、治療効果があると判定すればよい。 Therefore, Foxp3-positive CD4-positive cells are useful as markers for determining the therapeutic effect in the treatment of allergic diseases. For example, in order to determine the therapeutic effect on allergic disease, blood (eg, peripheral blood) is collected before and after administration of a drug for treating allergic disease in humans or non-human vertebrates, and Foxp3 positive in the blood The density of CD4 positive cells may be measured using flow cytometry or the like, and the changes before and after administration of a drug for treating allergic diseases may be compared. If the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood increases after administration of a drug that treats allergic diseases, the drug that treats allergic diseases is determined to be effective, while Foxp3 in peripheral blood If the density of positive CD4 positive cells decreases, it is determined that the drug for treating the allergic disease is ineffective. Here, the threshold value for the determination may be set to 3.6%. In the above method, a total IgE value in peripheral blood or a specific IgE value for a specific antigen may be measured. In this case, when the total IgE value in the peripheral blood is lower than the normal value (for example, 100 IU / mL or less), or when the specific IgE value for a specific antigen is decreased (for example, the CAP score is 2 or less) Therefore, it may be determined that there is a therapeutic effect.
この応用として、Foxp3陽性CD4陽性細胞は、アレルギーを治療する薬剤による治療を選択する上で有用なマーカーともなり得る。例えば、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が比較的高いときは、アレルギーが発症していても、効果の弱い抗ヒスタミン薬又は抗アレルギー薬を投与し、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が低いときは、効果の強いステロイド薬を投与する、という選択をすることができる。 For this application, Foxp3-positive CD4-positive cells can also be useful markers in selecting treatment with agents that treat allergies. For example, when the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood is relatively high, even if allergies develop, administer a less effective antihistamine or anti-allergic agent, and Foxp3-positive CD4 positive in peripheral blood When the density of the cells is low, a choice can be made of administering a highly effective steroid drug.
また、アレルギーを治療する薬剤を投与している間に、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が変化した場合、それに応じて、薬剤の種類や投与量を変更することもできる。例えば、抗ヒスタミン薬又は抗アレルギー薬による効果が不十分で、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が低いままの場合は、ステロイド薬の投与を考えることができる。 In addition, when the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood changes during administration of a drug for treating allergy, the type and dosage of the drug can be changed accordingly. For example, administration of a steroid drug can be considered when the effects of antihistamines or antiallergic drugs are insufficient and the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood remains low.
さらに、この系を用いてアレルギー疾患の治療薬をスクリーニングすることができ、例えば、候補となる薬剤を投与した後に、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が薬剤投与前よりも上昇すれば、その候補薬はアレルギー疾患を治療する薬剤として有効であると判定し、一方、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が薬剤投与前よりも低下すれば、その候補薬はアレルギー疾患を治療する薬剤として無効であると判定する。ここで、その判定の閾値を、3.6％に設定してもよい。 Furthermore, this system can be used to screen for therapeutic agents for allergic diseases. For example, if the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood is higher than that before drug administration after administration of a candidate drug. If the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood is lower than that before drug administration, the candidate drug treats allergic disease. It is determined that the medicine is invalid. Here, the threshold value for the determination may be set to 3.6%.
（５）キット
抗Foxp3抗体及び抗CD4抗体は、上述した方法に用いるためにキット化してもよい。すなわち、これらの抗体を、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人を特定するためのキット、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人において、アレルギー疾患の発症を推定するためのキット、又はアレルギー疾患の治療における治療効果を判定するためのキットに含ませてもよい。また、アレルギー体質かどうかを判定するために、上記キットに、抗IgE抗体を含ませてもよい。
(5) Kit The anti-Foxp3 antibody and the anti-CD4 antibody may be made into a kit for use in the above-described method. That is, these antibodies are used to identify a person who has an allergic constitution but has not developed an allergic disease, or to estimate the onset of an allergic disease in a person who has an allergic constitution but has not developed an allergic disease. Or a kit for determining a therapeutic effect in the treatment of allergic diseases. In addition, in order to determine whether or not allergic constitution, an anti-IgE antibody may be included in the kit.
ここでキット化する抗Foxp3抗体、抗CD4抗体は、フローサイトメトリーに使用することができる抗体であることが望ましい。また、抗IgE抗体は、ELISA、RIA等に使用することができる抗体であることが望ましい。これらの抗体は、市販のものでも、当業者に公知の技術によって作製したものでもよい。 The anti-Foxp3 antibody and anti-CD4 antibody to be kitted here are preferably antibodies that can be used for flow cytometry. The anti-IgE antibody is preferably an antibody that can be used for ELISA, RIA, and the like. These antibodies may be commercially available or produced by techniques known to those skilled in the art.
以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。 Hereinafter, although the embodiment described above will be specifically described using examples, this is an exemplification, and the present invention is not limited to these examples.
＜実施例1：末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度の低下とアレルギー疾患の発症との相関関係＞
（１）対象
アトピー性皮膚炎、喘息、又はその両方を合併する37名の重症のアレルギー疾患を発症している患者（男性：24名、女性：13名、平均年齢23.5歳±2.7歳）の末梢血と、27名のアレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人（男性：19名、女性：8名、平均年齢24.8歳±3.8歳）の末梢血を用いて以下の実験を行った。
<Example 1: Correlation between decrease in density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in peripheral blood and development of allergic disease>
(1) Subjects Of 37 patients with severe allergic disease who have atopic dermatitis, asthma, or both (male: 24, female: 13, average age 23.5 years ± 2.7 years) The following experiments were conducted using peripheral blood and peripheral blood of 27 people who had allergic constitutions but did not develop allergic diseases (male: 19; female: 8; average age: 24.8 ± 3.8 years) It was.
なお、患者、対照群とも、末梢血中の総IgE値は正常より高く、アレルギー疾患を発症している患者37名全ての末梢血において、ダニやスギ花粉に対する特異的IgE値の上昇が認められた。また、対照群27名中23名の末梢血において、ダニやスギ花粉に対する特異的IgE値の上昇が認められた。 In both patients and controls, total IgE levels in peripheral blood were higher than normal, and increased specific IgE levels against mites and cedar pollen were observed in the peripheral blood of all 37 patients with allergic disease. It was. In addition, specific IgE levels against mites and cedar pollen were increased in the peripheral blood of 23 of 27 control groups.
また、アレルギー疾患を発症している患者37名全てに対して、Foxp3の発現をアップレギュレートすることが知られている経口コルチコステロイドの投与は行われていなかった（Karagiannidis C, Akdis M, Holopainen P, Woolley NJ, Hense G, Ruckert B, et al., Glucocorticoids upregulate FOXP3 expression and regulatory T cells in asthma., J Allergy Clin Immunol, 114, 1425-1433 (2004)）。 In addition, oral corticosteroids known to up-regulate Foxp3 expression were not administered to all 37 patients with allergic disease (Karagiannidis C, Akdis M, Holopainen P, Woolley NJ, Hense G, Ruckert B, et al., Glucocorticoids upregulate FOXP3 expression and regulatory T cells in asthma., J Allergy Clin Immunol, 114, 1425-1433 (2004)).
（２）フローサイトメトリーによる解析
（i）末梢血の調製
アレルギー疾患を発症している患者、及びアレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人の静脈より末梢血5mlを採取し、ヘパリン入りのチューブに入れ、末梢血とヘパリンとを軽く混ぜた。
採取した末梢血をPBS(Phosphate-buffered saline)で2倍希釈した後、LSM(登録商標)Lymphocyte Separation Medium(ICN Biomedical)に静かに重層して、比重遠心分離（24℃、400g、32分間）を行った。遠心分離後、中間層の末梢血を回収し、PBSで洗浄し、遠心分離（4℃、400g、10分間）を行って細胞を沈殿させた。
(2) Analysis by flow cytometry (i) Preparation of peripheral blood 5ml of peripheral blood is collected from the veins of patients who have developed allergic disease and those who have allergic disease but have not developed allergic disease and enter heparin The peripheral blood and heparin were mixed lightly.
The collected peripheral blood was diluted 2-fold with PBS (Phosphate-buffered saline), and then gently layered on LSM (registered trademark) Lymphocyte Separation Medium (ICN Biomedical), and centrifuged at 24 ° C, 400 g for 32 minutes. Went. After centrifugation, peripheral blood in the intermediate layer was collected, washed with PBS, and centrifuged (4 ° C., 400 g, 10 minutes) to precipitate cells.
（ii）細胞表面抗原の染色
前述の方法によって沈殿させた細胞をFix/Permeabilizeし、一次抗体として、4倍希釈の抗ヒトFoxp3抗体（ab20034; 236A/EA, Abcam, Cambridge, UK）10μlを加え、4℃暗所にて30分間反応させた。次いで、二次抗体として、5倍希釈のFITC標識ヤギ抗マウス抗体（BD PharMingen, San Diego, CA）10μlを加え4℃暗所にて30分間反応させた。さらに、8倍希釈の抗マウスIgG1抗体（Sigma）10μlでブロッキングをし、PE-Cy5標識抗ヒトCD4抗体（BD PharMingen, San Diego, CA）10μlを加え、4℃暗所にて30分間反応させた。
なお、上記抗体の細胞への非特異的な結合に対するコントロールとして、8倍希釈の抗マウスIgG1抗体（Sigma）及びPE-Cy5標識抗マウスIgG1抗体（BD PharMingen）10μlを用い、前述の方法と同様に反応させた。
(Ii) Staining of cell surface antigen Fix / Permeabilize cells precipitated by the method described above, and add 10 μl of anti-human Foxp3 antibody (ab20034; 236A / EA, Abcam, Cambridge, UK) diluted 4-fold as the primary antibody. , And allowed to react for 30 minutes in the dark at 4 ° C. Next, 10 μl of 5-fold diluted FITC-labeled goat anti-mouse antibody (BD PharMingen, San Diego, Calif.) Was added as a secondary antibody, and the mixture was reacted at 4 ° C. in the dark for 30 minutes. Block with 10 μl of 8-fold diluted anti-mouse IgG 1 antibody (Sigma), add 10 μl of PE-Cy5-labeled anti-human CD4 antibody (BD PharMingen, San Diego, Calif.), And react at 4 ° C. in the dark for 30 minutes I let you.
As a control for non-specific binding of the above antibody to cells, 10 μl of 8-fold diluted anti-mouse IgG 1 antibody (Sigma) and PE-Cy5-labeled anti-mouse IgG 1 antibody (BD PharMingen) were used. It was made to react similarly.
（iii）フローサイトメトリーを用いた解析
フローサイトメトリー（FACSCaliburTM (BD Biosciences)）を用いて、染色した細胞を解析した。なお、解析には、FlowJoTM (TreeStar, San Carlos, CA)を用いた。
まず、前方散乱光（forwaord scatter）及び側方散乱光（side scatter）のパラメータより、得られた細胞集団から混在する赤血球を取り除くため、リンパ球集団にgateを設定した。次に、CD4及びside scatterパラメータを用いて、得られたリンパ球集団からCD4陽性細胞集団にgateを設定した。最後に、Foxp3を画面に展開し、取り込んだ全CD4陽性T細胞における、Foxp3陽性CD4陽性T細胞の密度を計測した。各細胞の密度は、コントロールを差し引いた値から求めた。
(Iii) Analysis using flow cytometry The stained cells were analyzed using flow cytometry (FACSCalibur ™ (BD Biosciences)). For the analysis, FlowJoTM (TreeStar, San Carlos, CA) was used.
First, in order to remove erythrocytes mixed from the obtained cell population from the parameters of forward scatter and side scatter, gate was set in the lymphocyte population. Next, using the CD4 and side scatter parameters, a gate was set from the obtained lymphocyte population to the CD4 positive cell population. Finally, Foxp3 was developed on the screen, and the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in all the incorporated CD4-positive T cells was measured. The density of each cell was determined from the value obtained by subtracting the control.
図１に示す通り、アレルギー疾患を発症している患者の末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、全CD4陽性T細胞に対して2.46 ±1.52％であり、一方、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人（対照群）の末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、全CD4陽性T細胞に対して4.43 ± 1.39％であった。
これより、アレルギー疾患を発症している患者の末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、対照群の割合と比べて有意に低下していることが明らかになった。
As shown in FIG. 1, the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in the peripheral blood of patients suffering from allergic diseases is 2.46 ± 1.52% of the total CD4-positive T cells, while having allergic constitution. The density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in the peripheral blood of people who did not develop allergic diseases (control group) was 4.43 ± 1.39% of the total CD4-positive T cells.
This revealed that the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in the peripheral blood of patients with allergic diseases was significantly reduced compared to the proportion of the control group.
（３）末梢血における総IgE値、好酸球数、及びIFN−γ濃度の測定
（i）総IgE値の測定方法
血清用採血tubeに末梢血全血5mlを入れ、30分間放置後、遠心分離（4℃、400g、10分間）を行い血清を分離した。総IgE値は、当業者に公知のCAP−FEIA (Pharmacia’s CAP system Fluorescence enzyme-linked immunoassay)を用いて測定した。
(3) Measurement of total IgE value, eosinophil count, and IFN-γ concentration in peripheral blood (i) Measurement method of total IgE value Put 5 ml of peripheral blood in a blood blood sampling tube, leave it for 30 minutes, and centrifuge Separation (4 ° C., 400 g, 10 minutes) was performed to separate serum. The total IgE value was measured using CAP-FEIA (Pharmacia's CAP system Fluorescence enzyme-linked immunoassay) known to those skilled in the art.
（ii）好酸球数の測定方法
EDTA2K入りtubeに末梢血全血1mlを入れ当業者に公知の血球自動測定装置にて測定した。
(Ii) Measuring method of eosinophil count
1 ml of peripheral blood was placed in a tube containing EDTA2K, and measurement was performed using an automatic blood cell measuring device known to those skilled in the art.
（iii）IFN−γ濃度の測定方法
血清用採血tubeに末梢血全血5mlを入れ、30分間放置後、遠心分離（4℃、400g、10分間）を行い血清を分離した。血清IFN-γ値は、当業者に公知のCAP−FEIA (Pharmacia’s CAP system Fluorescence enzyme-linked immunoassay)を用いて測定した。
(Iii) Method for measuring IFN-γ concentration 5 ml of peripheral blood was placed in a serum blood collection tube, allowed to stand for 30 minutes, and then centrifuged (4 ° C., 400 g, 10 minutes) to separate the serum. Serum IFN-γ value was measured using CAP-FEIA (Pharmacia's CAP system Fluorescence enzyme-linked immunoassay) known to those skilled in the art.
（iv）結果
図１に示す通り、アレルギー疾患を発症している患者の末梢血中の総IgE値、好酸球数、及びIFN−γの濃度は、対照群の値と比べて、12.35倍、2.07倍、及び1.13倍高かった。ここで、前述（２）の結果より、アレルギー疾患を発症している患者の末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人（対照群）の密度と比べて、有意に低下していることが明らかになっている。
(Iv) Results As shown in FIG. 1, the total IgE value, the number of eosinophils, and the concentration of IFN-γ in the peripheral blood of patients who develop allergic diseases are 12.35 times the values in the control group. 2.07 times, and 1.13 times higher. Here, from the results of (2) above, the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in the peripheral blood of patients who have developed allergic disease is the person who has allergic constitution but has not developed allergic disease (control group) It is clear that it is significantly lower than the density of).
（４）matched pair解析を用いたcase control study
前述の結果より、末梢血中の総IgE値、好酸球数、IFN−γの濃度が低いために、Foxp3陽性CD4陽性T細胞の密度が高くなった、という可能性を除外するために、同等のレベルの総IgE値、好酸球数、及びIFN−γの濃度を有する、アレルギー疾患を発症している患者とアレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人（対照群）を抽出し、これらにおける末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度を測定した。
(4) Case control study using matched pair analysis
From the above results, in order to exclude the possibility that the density of Foxp3 positive CD4 positive T cells was increased because the total IgE value in peripheral blood, the number of eosinophils, and the concentration of IFN-γ were low, Extract patients with allergic disease who have similar total IgE levels, eosinophil counts, and IFN-γ levels, and those who have allergic disease but do not develop allergic disease (control group) Then, the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in peripheral blood was measured.
具体的には、図1（図1−A、B、及びC）に示すように、同等のレベルの総IgE値、好酸球数、及びIFN−γの濃度を有する、アレルギー疾患を発症している患者と対照群に対して、pairを線で結んでmatched pairを作成し、case control studyを行った。なお、matched pair解析に用いられたアレルギー疾患を発症している患者の全ては、局所グルココルチコイド、H1−ヒスタミン受容体アンタゴニスト、又はβ2アドレナリン性気管支拡張薬による治療を受けていた。 Specifically, as shown in FIG. 1 (FIGS. 1-A, B, and C), developing an allergic disease having comparable levels of total IgE value, eosinophil count, and IFN-γ concentration. A matched pair was created by connecting the pair with a line for a patient and a control group, and a case control study was performed. All patients who developed allergic diseases used in the matched pair analysis had been treated with topical glucocorticoids, H 1 -histamine receptor antagonists, or β 2 adrenergic bronchodilators.
その結果、アレルギー疾患を発症している患者の末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、対照群の末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度に比べて、有意に低いことが明らかになった。これにより、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、総IgE値、好酸球数、IFN−γの濃度と直接相関しないことが示された。 As a result, the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in the peripheral blood of patients with allergic disease is significantly lower than the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in the peripheral blood of the control group. It was revealed. This showed that the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in peripheral blood did not directly correlate with the total IgE value, the number of eosinophils, and the concentration of IFN-γ.
また、matched pair解析に用いられたアレルギー疾患を発症している患者の全ては、Foxp3の発現をアップレギュレートするといわれている局所コルチコステロイド（グルココルチコイド）の投与を受けていた。しかしながら、アレルギー疾患を発症している患者の末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、対照群の末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度に比べて、有意に低いことが分かった。これより、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、コルチコステロイドの投与に影響を受けないことが示された。 In addition, all patients with allergic diseases used in the matched pair analysis received topical corticosteroid (glucocorticoid), which is said to up-regulate Foxp3 expression. However, the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in the peripheral blood of patients with allergic disease was found to be significantly lower than the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in the peripheral blood of the control group It was. This indicates that the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in peripheral blood is not affected by the administration of corticosteroids.
（５）末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度と総IgE値との相関性
次に、図1−Aについて、アレルギー疾患を発症している患者と、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人（対照群）とに分けて、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度と総IgE値との相関について解析を行った（図2）。統計解析は、Stata/SE 8.2 for Windows (StataCorp, College Station, TX)を用いてMann-WhitneyのU検定、単回帰分析を行った。
(5) Correlation between the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in peripheral blood and total IgE levels Next, with respect to Fig. 1-A, patients with allergic disease and allergic disease but allergic disease The analysis was performed on the correlation between the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in peripheral blood and the total IgE value separately from those who did not develop (control group) (FIG. 2). Statistical analysis was performed by Mann-Whitney U test and single regression analysis using Stata / SE 8.2 for Windows (StataCorp, College Station, TX).
その結果、アレルギー疾患を発症している患者のみでは、総IgE値が高値であるほどFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は低下する傾向が認められたが、対照群では、総IgE値が高値であるほどFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は上昇する傾向が認められた。 As a result, only patients with allergic disease tended to decrease the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells as the total IgE value increased, but in the control group, the total IgE value increased. The density of Foxp3-positive CD4-positive T cells tended to increase.
つまり、アレルギー疾患を発症している患者と対照群とを合わせて解析すると、Foxp3陽性CD4陽性T細胞の密度と総IgE値とは逆相関していたが、アレルギー疾患を発症している患者と対照群とを別々に解析すると、Foxp3陽性CD4陽性T細胞の密度と総IgE値とは相関していないことが分かった。 In other words, the analysis of patients with allergic diseases and the control group showed that the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells and total IgE values were inversely correlated. When analyzed separately from the control group, it was found that the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells was not correlated with the total IgE value.
以上より、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、疾患の発症と直接相関があることが示された（図2）。 From the above, it was shown that the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in peripheral blood was directly correlated with the onset of the disease (Fig. 2).
なお、アレルギー疾患を発症している患者と対照群における末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、特に総IgE値が高値（100IU/mL以上）である場合に大きな差が認められた。 The density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in peripheral blood between patients with allergic disease and the control group showed a significant difference, especially when the total IgE level was high (100 IU / mL or higher). .
＜実施例2：アレルギー体質及びアレルギー疾患発症の判定又は予測のための、各測定値に対する閾値＞
アレルギー疾患を発症している患者とアレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人とを特定するために、以下の実験を行なった。
<Example 2: Threshold for each measurement value for determination or prediction of allergic constitution and allergic disease onset>
In order to identify patients who have developed allergic diseases and those who have allergic constitutions but have not developed allergic diseases, the following experiments were conducted.
前述の「実施例1（1）対象」に記載の患者又は人に対して、ダニに対する特異的IgE値がCAPスコアで2以上であり（ここで、「CAPスコア」はアレルギー体質を有する健常者の判定検査法として広く認められている）、血清総IgE値が100IU/mL（全国調査のmedian近似値）以上の患者又は人のみに解析対象を絞り込んだ。そして、これらの患者又は人に対して、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度が3.6%のところをカットオフ値とし、「3.6％」はアレルギー疾患の診断として設定してよい値なのかどうか、その臨床検査法の有用性についてROC解析（receiver operating characteristic analysis）を行った。ROC解析は、当業者に公知の方法を用いた。結果を表２に示す。
ダニに対する特異的IgE値がCAPスコアで2以上、血清総IgE値が100IU/mL以上の、アレルギー疾患を発症した患者とアレルギー疾患を発症していない人の、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度が3.6％のところをカットオフ値とした場合、アレルギー疾患を発症した患者は、症例数が少ないにも関わらず、Az値87.5%、適中率83%、特異度87%、感度75%であり、高い信頼性を示した（表２下段）。 Foxp3-positive CD4-positive T in peripheral blood of patients with and without allergic disease who have a specific IgE value for ticks of CAP score of 2 or higher and serum total IgE value of 100 IU / mL or higher When the cell density is 3.6%, the patient who developed allergic disease has an Az value of 87.5%, a predictive value of 83%, a specificity of 87%, and a sensitivity of 75, despite the small number of cases. %, Indicating high reliability (Table 2, bottom).
以上より、アレルギー体質を有するがアレルギー疾患を発症していない人における末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が3.6％以下で、血清総IgE値が100IU/mL以上で、ダニに対する特異的IgE値がCAPスコアで2以上の場合は、アレルギー疾患の発症を抑制する制御性T細胞が低下しているので、近い将来、アレルギー疾患を発症する確率が高いことが示された。 Based on the above, the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood is 3.6% or less and the total serum IgE value is 100 IU / mL or more in people who have allergic constitutions but have not developed allergic diseases. When the value was 2 or more in the CAP score, it was shown that the regulatory T cells that suppress the onset of allergic diseases are low, and thus the probability of developing allergic diseases is high in the near future.
また、アレルギー疾患の治療を開始後、患者の末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度が3.6％以上に上昇すれば、アレルギー疾患は寛解する可能性が高いことも示された。 It was also shown that if the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in the patient's peripheral blood rose to 3.6% or higher after starting treatment for allergic disease, the allergic disease is likely to be ameliorated.
ここで、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性T細胞の密度は、自己免疫疾患等他の免疫疾患において変動する（J Neurosci Res. 2005 Jul 1;81(1):45-52、Annu Rev Immunol. 2006;24:209-26）ことが知られている。従って、他の免疫疾患の可能性を除外する意味でも、ダニに対する特異的IgE値がCAPスコアで2以上、血清総IgE値が100IU/mL以上という条件設定は、アレルギー疾患の発症を診断する上で好ましいことが示された。 Here, the density of Foxp3-positive CD4-positive T cells in peripheral blood varies in other immune diseases such as autoimmune diseases (J Neurosci Res. 2005 Jul 1; 81 (1): 45-52, Annu Rev Immunol. 2006; 24: 209-26). Therefore, in order to exclude the possibility of other immune diseases, the condition setting that the specific IgE value for mites is 2 or more in the CAP score and the total serum IgE value is 100 IU / mL or more is useful for diagnosing the onset of allergic diseases. Was shown to be preferable.
Claims (18)
Foxp3陽性CD4陽性細胞を含有することを特徴とするマーカー。 Among animal individuals having an allergic constitution, a marker for identifying an animal individual that does not develop an allergic disease,
A marker characterized by containing Foxp3-positive CD4-positive cells.
Foxp3陽性CD4陽性細胞を含有することを特徴とするマーカー。 In an animal individual having an allergic constitution but not developing an allergic disease, a marker for estimating the onset of an allergic disease,
A marker characterized by containing Foxp3-positive CD4-positive cells.
Foxp3陽性CD4陽性細胞を含有するマーカー。 A marker for determining a therapeutic effect in treatment of a patient having an allergic disease,
A marker containing Foxp3 positive CD4 positive cells.
前記脊椎動物に対して、末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度を測定すること、
を特徴とするアレルギー疾患発症推定方法。 In a non-human vertebrate having an allergic constitution but not developing an allergic disease, a method for estimating the onset of allergic disease,
Measuring the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood for the vertebrate,
A method for estimating the onset of allergic diseases.
末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度を、前記脊椎動物に対して薬剤を投与する前後で測定して、投与前後の密度を比較すること、
を特徴とする薬効判定方法。 A method for determining the efficacy of a drug for treating an allergic disease in a non-human vertebrate that has developed an allergic disease,
Measuring the density of Foxp3-positive CD4-positive cells in peripheral blood before and after administering the drug to the vertebrate, and comparing the density before and after administration;
A method for determining the efficacy of a drug.
アレルギー疾患を発症しているヒト以外の脊椎動物に対し、候補となる薬剤を投与する前後に末梢血中のFoxp3陽性CD4陽性細胞の密度を測定し、前記薬剤の投与前後の前記Foxp3陽性CD4陽性細胞の密度を比較する工程を包含すること、
を特徴とするスクリーニング方法。 A screening method for a therapeutic drug for allergic diseases,
For non-human vertebrates that develop allergic diseases, measure the density of Foxp3 positive CD4 positive cells in peripheral blood before and after administering the candidate drug, and the Foxp3 positive CD4 positive before and after the drug administration Comparing the density of the cells,
A screening method characterized by
抗Foxp3抗体と、
抗CD4抗体と、
を含むことを特徴とするキット。 A kit for identifying an animal individual who does not develop an allergic disease among animal individuals having an allergic constitution,
An anti-Foxp3 antibody,
An anti-CD4 antibody;
A kit comprising:
抗Foxp3抗体と、
抗CD4抗体と、
を含むことを特徴とするキット。 In an animal individual having an allergic constitution but not developing an allergic disease, a kit for estimating the onset of an allergic disease,
An anti-Foxp3 antibody,
An anti-CD4 antibody;
A kit comprising:
抗Foxp3抗体と、
抗CD4抗体と、
を含むことを特徴とするキット。 A kit for determining the therapeutic effect in the treatment of allergic diseases,
An anti-Foxp3 antibody,
An anti-CD4 antibody;
A kit comprising:
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